CN116891551A - 一种星型聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种星型聚合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明实施例提供了一种星型聚合物及其制备方法和应用，其中，所述星形聚合物包括交联纳米水凝胶基质和线性聚合物刷，所述线性聚合物刷接枝于交联纳米水凝胶基质的表面。所述星型聚合物的制备方法包括：将功能单体和温敏性单体N‑异丙基丙烯酰胺超声溶解在超纯水中得到混合液；向混合液加入含可逆加成‑断裂链转移聚合活性位点的纳米水凝胶微球，混合均匀后，加入引发剂，在氮气气氛下反应1～30h迅速冷却至室温后，转移至透析袋中，纯水透析1～15天，得到星型聚合物。所述星型聚合物在检测补体蛋白C4d中的应用方法包括：用所述星型聚合物对补体蛋白C4d进行吸附，吸附完成后在预定温度下释放蛋白，通过比色法或紫外分光光度计对星型聚合物吸附的蛋白含量进行检测，具有简便快捷、检测灵敏的特点。所述星型聚合物的制备过程简单、成本低，可用于作为抗体的非生物替代品，对补体蛋白C4d特异性识别和检测。

Description

一种星型聚合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种星型聚合物及其制备方法和应用。
背景技术
目前肾移植失败的最大障碍来自排异导致的移植肾失功，而在排异过程中免疫因素导致的抗体介导的排斥反应(antibody-mediated rejection，AMR)是移植肾衰竭的最主要因素之一。补体蛋白C4是一种存在于血浆中的多功能β1-球蛋白，通常情况下以无活性的状态存在。当发生肾排异时，补体各成分依次被激活，其中补体蛋白C4裂解形成C4d，C4d硫酯位点凭借共价键与管周毛细血管内皮或基底膜结合，可以作为急性体液性排斥反应的标志物。因此，通过检测C4d判断移植肾是否发生排斥、排斥程度、指导临床防治以及预后评估等都具有重要意义。
现有技术中对于沉积在移植肾肾小管周围毛细血管中C4d的检测方法主要是活检组织的免疫组织化学染色，包括冰冻切片免疫荧光组织化学染色和石蜡切片免疫组织化学两种方法。前者应用单克隆抗体，最为敏感快速，但缺点是可能会出现非特异性染色；后者使用兔抗鼠多克隆抗体，不会出现非特异性染色，但缺点是制片过程中可能会有C4d抗原部分丢失，染色结果偏弱。并且以上两种方法所采用的单克隆抗体/多克隆抗体，在大规模应用中价格昂贵。对于血清中的C4d的检测方法，主要采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)，该测定法精确、定量，灵敏性高，但操作程序繁琐，耗时长，无法满足急诊的需求。
发明内容
本申请旨在提供一种星型聚合物及其制备方法和应用，以解决现有补体蛋白C4d的检测方法中染色不稳定、检测成本高、检测步骤繁琐等问题。
为了解决上述问题，本发明是通过如下技术方案实现的：
根据本发明的一个方面，提供一种星形聚合物，其特征在于，包括交联纳米水凝胶基质和线性聚合物刷，所述线性聚合物刷接枝于交联纳米水凝胶基质的表面。
所述星型聚合物由于兼具水凝胶网络的交联网状结构以及线性聚合物的柔性链，因此能够对补体蛋白C4d有较高的亲和性和特异性。
在一些实施方式中，所述交联纳米水凝胶基质为含可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)活性位点的纳米水凝胶微球。
进一步的，所述星型聚合物的制备方法，具体包括：
将功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺超声溶解在超纯水中得到混合液；
向混合液加入含RAFT活性位点的纳米水凝胶微球，混合均匀后，加入引发剂，在氮气气氛下反应1～30h迅速冷却至室温后，转移至透析袋中，纯水透析1～15天，得到星型聚合物。
进一步的，所述含RAFT活性位点的纳米水凝胶微球的制备方法包括：将功能单体、温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺与交联剂超声溶解在超纯水中得到混合液；
向混合液中依次加入引发剂、链转移剂和表面活性剂，在氮气气氛下反应1～30h迅速冷却至室温后，转移至透析袋中，纯水透析1～15天，得到含RAFT活性位点的纳米水凝胶微球。
根据本发明的另一个方面，还提供一种星型聚合物，其由上述方法制备得到。
所述星型聚合物能够特异性吸附补体蛋白C4d，对蛋白的吸附率达到80％以上，40min就能达到吸附平衡。
根据本发明的另一个方面，还提供一种星型聚合物在检测补体蛋白C4d中的应用方法，其特征在于，包括：用所述星型聚合物对补体蛋白C4d进行吸附，吸附完成后在预定温度下释放蛋白，通过比色法或紫外分光光度计对星型聚合物吸附的蛋白含量进行检测。
在一些实施方式中，通过比色法对星型聚合物吸附的蛋白含量进行检测具体包括：加入Ellmann试剂(5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸))和释放的蛋白进行反应，溶液颜色发生变化，采用比色法测定蛋白含量。
早期的免疫分析技术如免疫电泳、补体结合实验、免疫扩散等具有成本低、结果易判断等优点，但同时也具有操作方法繁琐、耗时较长，精确度和灵敏度较差的缺点；后期应用的免疫比浊法在全自动生化分析仪上直接批量分析样本，操作简单，但其抗体在保存过程中易出现絮状或片状沉淀，直接造成试剂检测结果不准确，而且增加过滤步骤，影响检测效果，对患者造成一定影响。现有技术中对C4d的检测，主要采用生物大分子抗体蛋白作检测物质来进行定性定量分析，但蛋白的使用增加了检测成本，并且检测的前处理也比较繁琐，至少需要2-3天。目前临床多采用基于兔抗/鼠抗的免疫组化法定性检测C4d。然而由于AMR病变表现程度不一、C4d染色不稳定、抗体检测水平局限等因素，造成检测成本高，假阳性多，经常会误导诊断。
与现有技术相比，本发明实施例包括以下优点：
本发明实施例中，所提供的星型聚合物粒径均一，并且在水溶液中表现出一定的稳定性，星型聚合物综合了聚合物链的柔性以及凝胶网络对于补体蛋白C4d较为牢固的吸附性，二者协同作用，对C4d表现出高亲和性。利用所述星型聚合物对C4d进行亲和吸附，40min即达到吸附平衡，能够替代蛋白抗体对补体C4d蛋白进行特异性定量检测。
所提供的星型聚合物的制备方法，具有制备过程简单、原料易得、成本低廉的特点，作为非生物蛋白亲和试剂用于肾移植排异的判断具有良好前景。
所提供的补体蛋白C4d的检测方法，模拟抗原-抗体的亲和作用，用所述星型聚合物对C4d特应性吸附后利用星型聚合物的温敏性，改变温度调整粒径释放C4d，测定C4d的含量，相较于传统的免疫检测法，操作简单、且检测时间大为缩短。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本申请。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明实施例1制备的星型聚合物的扫描电镜图；
图2是本发明实施例1制备的星型聚合物的红外光谱图；
图3是本发明实施例2的不同浓度补体蛋白C4d与Ellmann试剂反应后的颜色变化图；
图4是本发明实施例2的补体蛋白C4d的紫外全波长扫描图和标准曲线图；
图5是本发明实施例2的星型聚合物对补体蛋白C4d的吸附动力学曲线图；
图6是本发明实施例2的星型聚合物对补体蛋白C4d的等温吸附曲线图；
图7是本发明实施例6的星型聚合物对不同蛋白吸附率比较图。
具体实施方式
下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
为克服现有技术中补体蛋白C4d的检测成本高、操作复杂且耗时较长等缺陷，本申请提供一种星型聚合物及其制备方法，模拟抗原-抗体的亲和作用，将所述星型聚合物作为非生物蛋白亲和试剂应用于补体蛋白C4d的检测中。
根据本发明的一个方面，提供一种星形聚合物，其特征在于，包括交联纳米水凝胶基质和线性聚合物刷，所述线性聚合物刷接枝于交联纳米水凝胶基质的表面。
在一些实施方式中，所述交联纳米水凝胶基质为含RAFT活性位点的纳米水凝胶微球。
进一步的，所述星型聚合物的制备方法，具体包括：
将功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺超声溶解在超纯水中得到混合液；
向混合液加入含RAFT活性位点的纳米水凝胶微球，混合均匀后，加入引发剂，在氮气气氛下反应1～30h迅速冷却至室温后，转移至透析袋中，纯水透析1～15天，得到星型聚合物。
其中，所述功能单体优选为丙烯酸、2-氯丙烯酸、2-溴丙烯酸、α-甲基丙烯酸、三氟甲基丙烯酸、甲基丙烯酸、3-乙氧基丙烯酸、(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化铵、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐、N-叔丁基丙烯酰胺、N-苄基丙烯酰胺、N-苯基丙烯酰胺、N-丁基甲基丙烯酰胺、N-苯基甲基丙烯酰胺中的至少一种；和/或
所述引发剂优选为过硫酸铵、过硫酸钾、过硫酸钠、偶氮二异丁腈中的至少一种。
所选功能单体均具备碳碳双键，可以参与聚合反应，并且单体的取代基具有疏水性或电负性，通过疏水作用和静电作用，能与补体蛋白C4d亲和。
所选引发剂溶解性较好，容易受热分解成自由基，能引发单体进行聚合反应。
进一步的，所述功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺加入量优选分别为所述功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数的1％～60％和5％～80％；所述含RAFT活性位点的纳米水凝胶微球加入量优选为10～180mg；所述引发剂的加入量优选为所述功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数的1％～7％。
单体和含RFAT活性位点的纳米水凝胶微球用量不同会导致聚合物的亲疏水性和亲电性也不同，在上述用量下，合成的星型聚合物对蛋白的吸附效果较好。引发剂用量会影响聚合反应的程度，在上述用量下，星型聚合物球型大小合适、粒径均一、分散性好。
进一步的，所述反应的反应温度优选为25～100℃，搅拌转速优选为200～600r/min。
反应温度会影响聚合反应的程度，搅拌速度影响聚合物的分散性和粒径大小，在上述条件下能成功制备聚合物，并且聚合物粒径大小合适。
进一步的，所述含RAFT活性位点的纳米水凝胶微球的制备方法包括：将功能单体、温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺与交联剂超声溶解在超纯水中得到混合液；
向混合液中依次加入引发剂、链转移剂和表面活性剂，在氮气气氛下反应1～30h迅速冷却至室温后，转移至透析袋中，纯水透析1～15天，得到含可逆加成-断裂链转移聚合活性位点的纳米水凝胶微球。
其中，所述功能单体优选为丙烯酸、2-氯丙烯酸、2-溴丙烯酸、α-甲基丙烯酸、三氟甲基丙烯酸、甲基丙烯酸、3-乙氧基丙烯酸、(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化铵、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐、N-叔丁基丙烯酰胺、N-苄基丙烯酰胺、N-苯基丙烯酰胺、N-丁基甲基丙烯酰胺、N-苯基甲基丙烯酰胺中的至少一种；和/或
所述交联剂优选为二乙烯基苯、二异氰酸酯、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、二甲基丙烯酸乙二醇酯中的至少一种；和/或
所述引发剂优选为过硫酸铵、过硫酸钾、过硫酸钠、偶氮二异丁腈中的至少一种；和/或
所述链转移剂优选为十二烷基三硫代碳酸酯、二甲基乙酸三硫代碳酸酯、叔丁基苯并碳二硫酸酯、4-氰基戊酸二硫代苯甲酸中的至少一种；和/或
所述表面活性剂优选为十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基二甲基苄基氯化铵中的至少一种。
所选功能单体均具备碳碳双键，可以参与聚合反应，并且单体的取代基具有疏水性或电负性，通过疏水作用和静电作用，能与补体蛋白C4d亲和。
所选交联剂含有多个碳碳双键，能使线型聚合物相互连在一起，形成网状结构。
所选引发剂溶解性较好，容易受热分解成自由基，能引发单体和交联剂进行聚合反应。
所选链转移剂是一类具有RAFT特性的化合物，能够迅速地捕捉聚合体系中的增长自由基并且发生加成反应，起到控制聚合物分子量的作用。形成的大分子链转剂同样也具有RAFT试剂的性质，在聚合过程中可以继续作RAFT试剂使用。
所选表面活性剂能够保持聚合过程的稳定性，使纳米粒子在溶液中保持均匀且稳定分散。
进一步的，所述功能单体、温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺和交联剂的加入量优选分别为所述功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数的1～60％、5％～80％和5％～15％；所述引发剂的加入量优选为所述功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数的1％～7％；所述链转移剂的加入量优选为所述功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数的0.1％～5％；所述表面活性剂的质量优选为1～20mg。
单体用量不同会导致聚合物的亲疏水性和亲电性也不同，在上述用量下，合成的聚合物对蛋白的吸附效果较好。引发剂、链转移剂和表面活性剂的用量会影响聚合物的分散性、稳定性和聚合物大小，在上述用量下，聚合物球型大小合适、粒径均一、分散性好。
进一步的，所述反应的反应温度优选为25～100℃，搅拌转速优选为200～600r/min。
反应温度会影响聚合反应的程度，搅拌速度影响聚合物的分散性和粒径大小，在上述条件下能成功制备聚合物，并且聚合物粒径大小合适。
根据本发明的另一个方面，还提供一种星型聚合物，其由上述方法制备得到。
根据本发明的另一个方面，还提供一种星型聚合物在检测补体蛋白C4d中的应用方法，其特征在于，包括：用所述星型聚合物对补体蛋白C4d进行吸附，吸附完成后在预定温度下释放蛋白，通过比色法或紫外分光光度计对星型聚合物吸附的蛋白含量进行检测。
在一些实施方式中，通过比色法对星型聚合物吸附的蛋白含量进行检测具体包括：加入Ellmann试剂和释放的蛋白进行反应，溶液颜色发生变化，采用比色法测定蛋白含量。
如下将结合若干实施例及附图对本发明的技术方案进行更为详细的说明。需要指出的是，若非特别说明，如下实施例中采用的各原材料、化学试剂及设备等均可以通过市场购买等途径获取，而其中的表征方法等均可以依据本领域已知的方式实施。
实施例1
一种星型聚合物，包括交联纳米水凝胶基质和线性聚合物刷。
所述交联纳米水凝胶基质制备方法包括：
将加入量分别为功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数34％的功能单体N-苯基丙烯酰胺、36％功能单体丙烯酸、30％温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺和6％交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺加入超纯水超声使固体完全溶解，得到混合液；然后向混合液中依次加入摩尔数与功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数的比例分别为3％的引发剂偶氮二异丁腈、3％链转移剂十二烷基三硫代碳酸酯和7mg表面活性剂十二烷基硫酸钠，在80℃，搅拌速度450r/min，氮气气氛下加热聚合26h迅速冷却至室温后，转移至透析袋中于超纯水透析7天除去未被反应的物质，得到含RAFT活性位点的纳米水凝胶微球。
所述星型聚合物的制备方法包括：
将加入量分别为功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数34％的功能单体N-苯基丙烯酰胺、36％功能单体丙烯酸以及30％温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺加入超纯水超声使固体完全溶解，得到混合液；向混合液加入上一步合成的37mg含有RAFT活性位点的纳米水凝胶微球和与功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数的比例为3％的引发剂偶氮二异丁腈，在80℃，搅拌速度450r/min，氮气气氛下加热聚合26h迅速冷却至室温后，转移至透析袋中于超纯水透析7天除去未被反应的物质，得到星型聚合物。
本实施例提供的星型聚合物的合成方法简单、成本较低、容易保存。
采用扫描电镜对星型聚合物进行表征，结果见图1，合成的星型聚合物粒径为100nm左右，具有粒径均一、分散性好的特点。从图中可以看出，星形聚合物表面略为粗糙，考虑是外部聚合物链段由于温度降低的物理相互作用引起的收缩。
采用红外光谱仪对星型聚合物进行表征，结果见图2，在红外光谱图中，3303cm-1处为N-H键的伸缩振动峰，2970cm-1处为饱和C-H的伸缩振动峰，1650cm-1处为C＝O伸缩振动峰，1546cm-1处为酰胺中N-H弯曲振动峰，1446cm-1处为酰胺中C-N伸缩振动峰，1170cm-1处为C＝S的伸缩振动峰，758cm-1处为C-S-C的伸缩振动峰，说明合成的星型聚合物具有单体及链转移剂十二烷基三硫代碳酸酯。
实施例2
实施例1制备的星型聚合物对补体蛋白C4d的吸附表征，包括：
(1)比色法
将缓冲液、蛋白溶液和实施例1制备的星型聚合物溶液混合均匀，对补体蛋白C4d进行吸附，吸附完成后，将混匀后的溶液在转速20000rpm下离心。取上清液与Ellmann试剂反应，通过蛋白与Ellmann试剂反应后溶液颜色的变化以及深浅测量蛋白的含量，该反应迅速，有利于裸眼观察。结果如图3所示，反应溶液颜色随着蛋白浓度(0.0～0.2mM)的增加而逐渐变深。
通过比色法检测上清液中蛋白浓度来计算吸附量，从而得到吸附率。实施例1提供的星型聚合物吸附率达到80％以上。
(2)紫外分光光度计法
采用紫外分光光度计对补体蛋白C4d含量进行测定，如图4所示，选择最大吸收波长为200nm。在蛋白浓度范围(0.05μg/mL～5μg/mL)内，浓度与吸光度之间呈现线性关系，线性关系方程为y＝0.16876x+0.01287，R2＝0.998，线性关系良好。
将缓冲液、蛋白溶液和实施例1制备的星型聚合物溶液混合均匀，对补体蛋白C4d进行吸附，吸附完成后，将混匀后的溶液在转速20000rpm下离心。取上清液至石英比色皿中测定溶液吸光度，根据紫外分光光度计法所建立的标准曲线得到上清液中蛋白浓度来计算吸附量，从而得到吸附率。实施例1提供的星型聚合物吸附率达到80％以上。
(3)吸附动力学实验
将缓冲液、蛋白溶液和实施例1制备的星型聚合物溶液混合均匀，放置于恒温混匀仪中，吸附震荡不同时间(1min/3min/5min/15min/30min/60min)，将混匀后的溶液在转速20000rpm下离心。取上清液至石英比色皿中测定溶液吸光度，根据紫外分光光度计法所建立的标准曲线得到上清液中蛋白浓度来计算吸附量。
图5示出了本发明实施例1提供的星型聚合物的吸附动力学曲线图，星型聚合物对补体蛋白C4d的吸附量在10min内快速增长，随后缓慢增长，在40min时达到了平衡。
(4)等温吸附实验
将缓冲液、不同浓度蛋白溶液(1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL)和实施例1制备的星型聚合物溶液混合均匀，放置于恒温混匀仪中吸附震荡，将混匀后的溶液在转速20000rpm下离心，取上清液转移至石英比色皿中测定溶液吸光度，根据紫外分光光度计法所建立的标准曲线得到上清液中蛋白浓度来计算吸附量。
图6示出了本发明实施例1提供的星型聚合物的等温吸附曲线图，星型聚合物对于补体C4d蛋白的吸附均呈先快速增长后慢速平衡的趋势，最大吸附量为14.5μg/mg。
实施例3
一种星型聚合物，包括交联纳米水凝胶基质和线性聚合物刷。
所述交联纳米水凝胶基质制备方法包括：
将加入量分别为功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数1％的功能单体N-苯基丙烯酰胺、19％功能单体丙烯酸、80％温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺和5％交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺加入超纯水超声使固体完全溶解，得到混合液；然后向混合液中依次加入摩尔数与功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数的比例分别为1％的引发剂偶氮二异丁腈、0.1％链转移剂十二烷基三硫代碳酸酯和1mg表面活性剂十二烷基硫酸钠，在25℃，搅拌速度200r/min，氮气气氛下加热聚合26h迅速冷却至室温后，转移至透析袋中于超纯水透析7天除去未被反应的物质，得到含RAFT活性位点的纳米水凝胶微球。
所述星型聚合物的制备方法包括：
将加入量分别为功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数1％的功能单体N-苯基丙烯酰胺、19％功能单体丙烯酸以及80％温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺加入超纯水超声使固体完全溶解，得到混合液；向混合液加入上一步合成的10mg含有RAFT活性位点的纳米水凝胶微球和与功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数的比例为1％的引发剂偶氮二异丁腈，在25℃，搅拌速度200r/min，氮气气氛下加热聚合26h迅速冷却至室温后，转移至透析袋中于超纯水透析7天除去未被反应的物质，得到星型聚合物。
本实施例提供的星型聚合物对补体蛋白C4d的吸附率为5％。
实施例4
一种星型聚合物，包括交联纳米水凝胶基质和线性聚合物刷。
所述交联纳米水凝胶基质制备方法包括：
将加入量分别为功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数60％的功能单体N-苯基丙烯酰胺、35％功能单体丙烯酸、5％温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺和15％交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺加入超纯水超声使固体完全溶解，得到混合液；然后向混合液中依次加入摩尔数与功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数的比例分别为7％的引发剂偶氮二异丁腈、5％链转移剂十二烷基三硫代碳酸酯和20mg表面活性剂十二烷基硫酸钠，在100℃，搅拌速度600r/min，氮气气氛下加热聚合26h迅速冷却至室温后，转移至透析袋中于超纯水透析7天除去未被反应的物质，得到含RAFT活性位点的纳米水凝胶微球。
所述星型聚合物的制备方法包括：
将加入量分别为功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数60％的功能单体N-苯基丙烯酰胺、35％功能单体丙烯酸以及5％温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺加入超纯水超声使固体完全溶解，得到混合液；向混合液加入上一步合成的180mg含有RAFT活性位点的纳米水凝胶微球和与功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数的比例为7％的引发剂偶氮二异丁腈，在100℃，搅拌速度600r/min，氮气气氛下加热聚合26h迅速冷却至室温后，转移至透析袋中于超纯水透析7天除去未被反应的物质，得到星型聚合物。
本实施例提供的星型聚合物对补体蛋白C4d的吸附率为7.5％。
实施例5
一种补体蛋白C4d的检测方法
将缓冲液、未知浓度补体蛋白C4d溶液和实施例1制备的星型聚合物溶液混合均匀，放置于恒温混匀仪中吸附震荡，将混匀后的溶液在转速20000rpm下离心，去除溶液中未吸附的蛋白。然后改变温度，调整星型聚合物的大小，将吸附的蛋白进行释放，接着将释放的蛋白溶液放至石英比色皿中测定溶液吸光度，根据紫外分光光度计法所建立的标准曲线得到星型聚合物吸附的蛋白浓度为2.1μg/mL。
实施例6
星型聚合物的选择性评价
将缓冲液、不同的蛋白溶液(补体蛋白C4d、人血清白蛋白HSA、γ-球蛋白Glb、卵清蛋白OVA)和实施例1制备的星型聚合物溶液混合均匀，放置于恒温混匀仪中吸附震荡，将混匀后的溶液在转速20000rpm下离心。取上清液转移至石英比色皿中测定溶液吸光度，根据紫外分光光度计法所建立的标准曲线得到上清液中蛋白浓度来计算吸附量，从而得到吸附率。
图7示出了星型聚合物对不同蛋白吸附率比较图，星型聚合物对补体蛋白C4d的吸附率达到80％以上，其他蛋白的吸附率都低于10％，具有良好的选择性。
综上所示，在本实施例中，所提供的星型聚合物的制备方法简单高效，成本低廉。所制备的星型聚合物粒径均一、分散性好，且易保存，在水溶液中有一定的稳定性，可以牢固的吸附补体蛋白C4d，从而替代蛋白抗体对C4d进行特异性定量检测。将所述星型聚合物应用于补体蛋白C4d的检测中，操作简单、快速，具有较高的检测灵敏度和准确度，有效解决了现有技术检测C4d的成本高昂、操作繁琐、假阳性多、检测所需时间长等问题。
尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所述权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。
以上对本发明所提供的一种星型聚合物及其制备方法和应用，进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (12)

1.一种星形聚合物，其特征在于，包括交联纳米水凝胶基质和线性聚合物刷，所述线性聚合物刷接枝于交联纳米水凝胶基质的表面。
2.根据权利要求1所述的星型聚合物，其特征在于，所述交联纳米水凝胶基质为含可逆加成-断裂链转移聚合活性位点的纳米水凝胶微球。
3.一种权利要求2所述的星型聚合物的制备方法，其特征在于，具体包括：
将功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺超声溶解在超纯水中得到混合液；
向混合液加入含可逆加成-断裂链转移聚合活性位点的纳米水凝胶微球，混合均匀后，加入引发剂，在氮气气氛下反应1～30h迅速冷却至室温后，转移至透析袋中，纯水透析1～15天，得到星型聚合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述功能单体为丙烯酸、2-氯丙烯酸、2-溴丙烯酸、α-甲基丙烯酸、三氟甲基丙烯酸、甲基丙烯酸、3-乙氧基丙烯酸、(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化铵、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐、N-叔丁基丙烯酰胺、N-苄基丙烯酰胺、N-苯基丙烯酰胺、N-丁基甲基丙烯酰胺、N-苯基甲基丙烯酰胺中的至少一种；和/或
所述引发剂为过硫酸铵、过硫酸钾、过硫酸钠、偶氮二异丁腈中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺加入量分别为所述功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数的1％～60％和5％～80％；所述含可逆加成-断裂链转移聚合活性位点的纳米水凝胶微球加入量为10～180mg；所述引发剂的加入量为所述功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数的1％～7％。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述反应的反应温度为25～100℃，搅拌转速为200～600r/min。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述含可逆加成-断裂链转移聚合活性位点的纳米水凝胶微球的制备方法包括：
将功能单体、温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺与交联剂超声溶解在超纯水中得到混合液；
向混合液中依次加入引发剂、链转移剂和表面活性剂，在氮气气氛下反应1～30h迅速冷却至室温后，转移至透析袋中，纯水透析1～15天，得到含可逆加成-断裂链转移聚合活性位点的纳米水凝胶微球。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述功能单体为丙烯酸、2-氯丙烯酸、2-溴丙烯酸、α-甲基丙烯酸、三氟甲基丙烯酸、甲基丙烯酸、3-乙氧基丙烯酸、(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化铵、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐、N-叔丁基丙烯酰胺、N-苄基丙烯酰胺、N-苯基丙烯酰胺、N-丁基甲基丙烯酰胺、N-苯基甲基丙烯酰胺中的至少一种；和/或
所述交联剂为二乙烯基苯、二异氰酸酯、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、二甲基丙烯酸乙二醇酯中的至少一种；和/或
所述引发剂为过硫酸铵、过硫酸钾、过硫酸钠、偶氮二异丁腈中的至少一种；和/或
所述链转移剂为十二烷基三硫代碳酸酯、二甲基乙酸三硫代碳酸酯、叔丁基苯并碳二硫酸酯、4-氰基戊酸二硫代苯甲酸中的至少一种；和/或
所述表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基二甲基苄基氯化铵中的至少一种。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述功能单体、温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺和交联剂的加入量分别为所述功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数的1～60％、5％～80％和5％～15％；所述引发剂的加入量为所述功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数的1％～7％；所述链转移剂的加入量为所述功能单体和温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺总摩尔数的0.1％～5％；所述表面活性剂的质量为1～20mg。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述反应的反应温度为25～100℃，搅拌转速为200～600r/min。
11.一种权利要求1或2所述的星型聚合物在检测补体蛋白C4d中的应用方法，其特征在于，包括：用所述星型聚合物对补体蛋白C4d进行吸附，吸附完成后在预定温度下释放蛋白，通过比色法或紫外分光光度计对星型聚合物吸附的蛋白含量进行检测。
12.根据权利要求11所述的应用方法，其特征在于，通过比色法对星型聚合物吸附的蛋白含量进行检测具体包括：加入5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)和释放的蛋白进行反应，溶液颜色发生变化，采用比色法测定蛋白含量。
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