WO2018084340A1 - 효소 모방 나노자임에 기반한 면역학적 분석에 의한 ig e 검출 및 알러지 진단법 - Google Patents

효소 모방 나노자임에 기반한 면역학적 분석에 의한 ig e 검출 및 알러지 진단법 Download PDF

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allergen
nanoparticles
enzyme
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이상표
이상민
김문일
신호연
이진우
김민수
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가천대학교 산학협력단
포항공과대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to an allergy diagnostic enzyme-mimicking nanoparticles, lateral flow immunochromatic chip using allergy diagnostic enzyme-mimetic nanoparticles, and a manufacturing method, an allergy diagnostic Immunoplate method and kit using allergy diagnostic enzyme-mimetic nanoparticles.
  • Allergy is a word derived from the Greek word “allos”, which means “transformed,” which means hypersensitivity. In Korea, allergy and English pronunciation allergy are used interchangeably, but the standard language is allergy. In this specification, “allergy” is a word that includes both allergy and allergy.
  • Allergies are those in which most people develop several symptoms of immune hypersensitivity to environmental factors that have little or no effect.
  • Types of allergy include hay fever, food allergies, atopic dermatitis, allergic asthma, and anaphylaxis.
  • Symptoms of allergies include redness of the eyes, itching, runny nose, shortness of breath, and swelling.
  • allergens such as constitutional factors and acquired environmental factors appear to interact.
  • environmental factors are called allergens.
  • allergens such as pollen, certain foods, insect stings, and medicines are present. When allergen enters our body, it acts as an antigen, resulting in an antigen-antibody reaction as an immune response, resulting in allergic symptoms.
  • Fc ⁇ RII is always expressed in B cells, and expression is induced in macrophages, eosinophilic cells, platelets, and some T cells by IL-4 secreted from basophils. .
  • Fc ⁇ RI has a high affinity for IgE, while Fc ⁇ RII has a low affinity for IgE. It is hypothesized that the concentration of IgE is regulated by the involvement of Fc ⁇ RII with low affinity for IgE at the stage of differentiation of B cells into plasma cells that secrete IgE.
  • Allergy tests include total IgE test in serum, specific IgE test, blood eosinophil and eosinophil cationic protein test, skin reaction test, and antigen test.
  • skin test tests identify the causative agent with or without reactivity. It is a simple, economical and diagnostic value that can be done, or it is often burdensome or painful to the subject.
  • a method of measuring IgE antibodies in serum has been preferred.
  • a person with atopic dermatitis may increase the amount of the total IgE antibody by up to 10 times. Therefore, the amount of the total IgE antibody in the serum is measured to determine the presence of allergy.
  • total IgE antibody is present in the smallest concentration among the total immunoglobulin isotypes and is only 0.05%. Therefore, conventional techniques for detecting allergy by detecting total IgE antibodies in serum have problems in terms of sensitivity.
  • Recently, many studies have been developed to use allergen-specific IgE antibodies in serum, but the amount of allergen-specific IgE antibodies is significantly smaller than that of total IgE antibodies.
  • the method of identifying allergen-specific IgE antibody also has a problem in terms of sensitivity.
  • Such a prior art is an "antibiotic allergy diagnostic kit comprising an antibiotic-human serum protein conjugate" (Korean Patent Publication No. 10-2012-0058842).
  • an antibiotic-human serum protein conjugate comprising an antibiotic-human serum protein conjugate
  • IgE antibody when allergies occur, there have been attempts to diagnose allergies using expression of genes or proteins that increase in the body specifically.
  • Such a prior art is the use of the CTCF gene in atopic and allergic diseases (Korean Patent Publication No. 10-2016-0115645).
  • Another object of the present invention is to provide an allergic diagnostic side flow immunochromic chip using allergy diagnostic enzyme-mimicking nanoparticles.
  • Another object of the present invention is to provide a method for manufacturing a side flow immunochromic chip for allergy diagnosis.
  • Another object of the present invention is to provide an allergen diagnostic Immunoplate method using allergen diagnostic nanoparticles.
  • an aspect of the present invention for diagnosing allergy characterized in that the first anti-IgE antibody is labeled on the surface by a physical bond, monodisperse, and comprises an inorganic metal catalyst for oxidizing the chromogenic substrate Enzyme-mimicking nanoparticles.
  • the inorganic metal catalyst is characterized in that it has an enzyme mimic activity of peroxidase or oxidase, the inorganic metal catalyst is characterized in that to precipitate or insolubilize the color substrate. It is preferable.
  • the inorganic metal catalyst preferably includes iron oxide (Fe 3 O 4), and more preferably, the inorganic metal catalyst has magnetic properties. .
  • the inorganic metal catalyst preferably includes platinum (Pt), and more specifically, the inorganic metal catalyst is synthesized in a hierarchical structure. More preferably.
  • the allergic diagnosing enzyme mimic nanoparticle having the monodispersity is uniformly controlled in a organic solvent environment using a surfactant to be synthesized monodispersely.
  • the allergy diagnostic enzyme-mimicking nanoparticle replaces the surface of the nanoparticle with a carboxylic acid, and the first anti-IgE antibody reacts with the carboxyl group of the carboxylic acid to form the nanoparticle. It is preferred that the inorganic nanoparticles and the substituted anti-IgE antibodies are bound to the particles and uniformly dispersed and fixed in physiological saline.
  • the target material of the sample is a total IgE antibody
  • the fixing material is preferably a second anti-IgE antibody
  • the allergy diagnostic enzyme-mimicking nanoparticles The allergy by binding the first anti-IgE antibody labeled on the surface of the sample with the total IgE antibody which is a target substance of the sample and the total IgE antibody with the second anti-IgE antibody which is a fixed substance of the reaction part. More preferably, the diagnostic enzyme-mimicking nanoparticles are immobilized on the reaction part and react with the color substrate to amplify the detection signal.
  • the target substance of the sample is an allergen-specific IgE antibody
  • the immobilizing substance is allergen.
  • the allergy diagnostic enzyme The first anti-IgE antibody labeled on the surface of the mimic nanoparticles binds to the allergen-specific IgE antibody that is a target material of the sample, and the allergen-specific IgE antibody binds to the allergen, which is a fixed substance of the reaction part. It is more preferable that the allergy diagnostic enzyme-mimicking nanoparticles are immobilized on the reaction part and react with the color substrate to amplify the detection signal.
  • the allergen is grass, bark, animal epithelium or hair, insect, mite, house dust, parasite, microorganism, bee venom, drug, occupational allergen, fruit, vegetable, seed, Nuts, spices, fish, shellfish, eggs, poultry, meat, dairy products, food additives and the like is preferably at least one selected from the group consisting of, the sample is tissue, cells, whole blood, serum, plasma, It is preferred to include saliva, sputum, cerebrospinal fluid or urine.
  • the allergy diagnostic enzyme-mimicking nanoparticles are monodisperse inorganic nanoparticles, and the allergic diagnostic enzyme-mimetic nanoparticles having the monodispersity are sized using a surfactant in an organic solvent environment. It is preferable that it is uniformly adjusted and synthesize
  • the allergy diagnostic enzyme-mimicking nanoparticle comprising the first anti-IgE antibody replaces the surface of the nanoparticle with carboxylic acid
  • the first anti-IgE antibody comprises Reaction with the carboxyl group of the carboxylic acid is preferably characterized in that bonded to the nanoparticles.
  • the first anti-IgE antibody labeled on the surface of the allergy diagnostic enzyme-mimetic nanoparticle comprising the first anti-IgE antibody is bound to the fixation material immobilized on the support of the reaction part. .
  • the allergy diagnostic enzyme-mimetic nanoparticles comprising the first anti-IgE antibody is preferably characterized in that it comprises any one or more selected from the group consisting of iron oxide, platinum, and allergy diagnostic enzymes containing platinum More preferably, the nanoparticles are synthesized in a hierarchical structure.
  • the allergy diagnostic enzyme-mimicking nanoparticles have enzyme-simulating activity of peroxidase or oxidase and are preferably oxidation catalysts of the chromogenic substrate, and more specifically, The allergy diagnostic enzyme-mimicking nanoparticles are more preferably characterized by precipitation or insolubilization of the chromogenic substrate, wherein the chromogenic substrate is 3-amino-9-ethylcarbazole. It is more preferable to set it as.
  • the allergic diagnostic side flow immunochromic chip includes a sample portion into which a sample containing a target substance is injected, and an allergic diagnostic enzyme-mimicking nanoparticle including a first anti-IgE antibody.
  • the first anti-IgE antibody of the nanoparticles conjugated with the target material can be bonded to the binding portion
  • the reaction portion is present a fixed material that can bind to the target material of the sample
  • the control material is present to confirm the error
  • a control unit includes an absorbing unit capable of absorbing a liquid sample by capillary action, and the sample moves from the sample unit to the absorbing unit through the reaction unit and the control unit on the support by capillary action through the bonding unit.
  • control unit Ig as a control material More preferably characterized in that the E antibody is immobilized, the immobilizing material is allergen, the target material contained in the sample is an allergen-specific IgE antibody, the reaction part is divided into several sections each section It is characterized in that different types of allergens are immobilized every time, and that the presence of the allergen-specific IgE antibody contained in the sample for each allergen in the various sections can be detected simultaneously by one test. It is more preferable to characterize.
  • the allergic edema, anaphylaxis, allergic dermatitis, atopic dermatitis, contact dermatitis, urticaria, insect allergy, food allergy Allergies, allergic asthma (allergic asthma) or drug allergy is characterized in that it is any one selected from the group consisting of allergic diseases.
  • an allergy diagnostic enzyme-mimicking nanoparticle characterized in that the first anti-IgE antibody is labeled on the surface by physical binding and contains an inorganic metal catalyst for oxidizing a chromogenic substrate.
  • Synthesizing particles (2) a sample portion into which a sample containing a target substance is introduced, a junction portion in which the allergic diagnostic enzyme-mimetic nanoparticle including the first anti-IgE antibody is located, and a target substance of the sample introduced into the sample portion Assembling a reaction part having a fixed substance present therein, a control part having an IgE antibody fixed as a control material for checking errors on the side of the reaction part, and an absorbing part capable of absorbing a liquid sample by capillary action on a support; It provides a method for producing a side flow immunochromatic chip for allergy diagnosis comprising a.
  • another aspect of the present invention (1) fixing a fixing material capable of binding to the target material of the sample in the well of the immunoplate; (2) dispensing a sample in which the target material is present into each well of the Immunoplate to bind the fixed material and the target material; (3) binding the allergy diagnostic enzyme-mimicking nanoparticles labeled with the first anti-IgE antibody on the surface with a target substance dispensed into each well of the Immunoplate; And (4) after the first anti-IgE antibody binds to the fixation material through the target material, the allergy diagnostic enzyme-mimicking nanoparticle reacts with a chromogenic substrate to amplify the detection signal; Immunoplate method for allergic diagnosis comprising a.
  • the target material of the sample is a total IgE antibody
  • the fixed material is preferably a second anti-IgE antibody, wherein the target material of the sample is an allergen-specific IgE.
  • the fixing material is allergen (allergen) and more specifically the allergen is grasses, bark, animal epithelium or hair, insects, mites, house dust, parasites, microorganisms, bee venom, drugs, More preferably, it is at least one substance selected from the group consisting of occupational allergens, fruits, vegetables, seeds, nuts, spices, seafood, eggs, poultry, meat, dairy products, food additives and the like.
  • a different type of allergen is immobilized in each well of the immunoplate so that the presence of the allergen-specific IgE antibody for each allergen can be detected simultaneously by one test.
  • the sample preferably includes tissue, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid or urine.
  • the allergy diagnostic enzyme-mimicking nanoparticles are preferably one or more selected from the group consisting of iron oxide and platinum, and more specifically, the allergy diagnostic enzyme. More preferably, the nanoparticles containing platinum in the mimic nanoparticles are synthesized in a hierarchical structure.
  • the allergic diagnostic enzyme-mimicking nanoparticles have an enzyme mimic activity of peroxidase or oxidase, and are preferably an oxidation catalyst of the chromogenic substrate, and more specifically,
  • the allergy diagnostic enzyme-mimicking nanoparticles are more preferably characterized by precipitation or insolubilization of the chromogenic substrate, wherein the chromogenic substrate is 3-amino-9-ethylcarbazole. It is more preferable to set it as.
  • the stability of the diagnostic kit is increased by using an inorganic metal catalyst-based diagnostic immunoassay that improves the instability and variability of enzymes caused by temperature and pH changes, which are problematic in conventional enzyme-based diagnostic immunoassays.
  • Figure 1 is a schematic diagram (top) of the conventional allergy diagnosis process has been compared with the schematic diagram (bottom) of the diagnostic process according to an embodiment of the present invention.
  • TEM 2 is a transmission electron microscope (TEM) photograph of H-Pt nanoparticles mimicking peroxidase activity according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a graph showing the results of comparing the stability of the temperature and pH conditions by confirming the enzyme activity of the organic peroxidase (HRP) and H-Pt nanoparticles according to an embodiment of the present invention.
  • HRP organic peroxidase
  • HRP organic peroxidase
  • FIG. 5 is a graph showing a result of measuring a calibration curve for total IgE concentration and specific IgE concentration according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a table listing data comparing the concentration values obtained by detecting and quantitatively analyzing total IgE in human serum with actual IgE concentration values provided by Gachon University Gil Hospital.
  • FIG. 7 is a table summarizing data comparing concentration values obtained by detecting and quantitating specific IgE in human serum with actual IgE concentration values provided by Gachon University Gil Hospital, according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a schematic diagram showing the configuration and principle of the side flow allergy diagnostic kit, according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention relates to an in vitro diagnostic technology that can analyze specific indicators using a sample derived from the human body such as blood, urine, saliva, and more specifically, using an immune response (antigen-antibody response).
  • the present invention relates to a method for detecting and quantifying IgE in blood to diagnose allergies.
  • the diagnostic technique using the antigen-antibody reaction shows the presence of an antigen-antibody reaction at high sensitivity by the reaction between the substrate and the enzyme when the antibody to which the enzyme is bound reacts with a specific antigen.
  • Technology Over the last few decades, research on immunodiagnostic technology using protein-based organic enzyme activity has been extensively conducted, and various products have been commercialized.
  • organoenzyme-based diagnostic techniques have the advantage of being able to diagnose specific and sensitive target substances, but the enzyme's activity is gradually changed depending on the reaction environment and storage time, which may cause problems in the reliability of the diagnostic results. There is this.
  • Phadia's ImmunoCAP test the most commonly used diagnostic method for allergy, is a proven immunodiagnostic method that can clinically measure allergy by quantitatively measuring IgE in human serum or plasma samples.
  • the use of the organic enzyme ⁇ -galactosidase in the test process has the disadvantages that the enzyme activity is reduced according to the surrounding environment and storage time and the diagnostic method is limited to the fluorescence detection method. Therefore, the demand for alternative materials that can supplement the disadvantages of the organic enzyme and maintain the enzyme activity has increased rapidly, and many studies have been continued until recently.
  • the present invention maximizes stability and catalytic activity through a strategy of binding enzyme-mimetic nanoparticles to anti-IgE globulinE antibodies instead of organic enzymes, and a high sensitivity allergy to specifically detect and quantitate IgE antibodies. Suggest a diagnostic.
  • the first anti-IgE to be used for allergy diagnosis is immobilized on the nanoparticles of iron oxide (Fe 3 O 4 ) and platinum (Pt) in the inorganic metal.
  • Nanoparticles provided by the present invention can be carried out by two or more methods.
  • the first is to diagnose allergic reactions to specific allergens.
  • Each allergen is immobilized on the underside of the reaction section of the diagnostic kit, and passing a blood sample thereon binds allergen-specific IgE antibodies to each allergen.
  • the first anti-IgE antibody having nanoparticles bound thereon binds to the allergen-specific IgE antibody, and the color development substrate is colored by the enzyme mimic function of the nanoparticles, thereby the presence of allergen-specific IgE antibody.
  • the second is to diagnose allergic reactions by detecting an increase in total IgE antibody in the blood.
  • the second anti-IgE antibody is immobilized on the bottom of the reaction section of the diagnostic kit, and passing the blood sample thereon causes the total IgE antibody in the blood sample to bind to the second anti-IgE antibody.
  • the first anti-IgE antibody having nanoparticles bound thereon binds to the total IgE antibody, and the coloring substrate is colored by the enzyme mimic function of the nanoparticles, thereby identifying the quantitative increase in the total IgE antibody. Can be diagnosed.
  • Allergic disease means edema, anaphylaxis, allergic dermatitis, atopic dermatitis, contact dermatitis, urticaria, insect allergy, food allergies ), Allergic asthma (allergic asthma) and drug allergy is one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • allergen means an allergen that causes allergy, grasses, bark, animal epithelium or hair, insects, mites, house dust, parasites, microorganisms, bee venom, drugs, occupational Allergens, fruits, vegetables, seeds, nuts, spices, fish, shellfish, eggs, poultry, meat, dairy products, food additives and the like is preferably any one selected from the group consisting of, but not limited thereto.
  • the four representative allergens in our country are house dust mite, wormwood pollen, cat hair and alternaria fungus. The types of allergens are summarized in Table 1 below.
  • Table 1 Types of allergens Classification Allergen Grass pollens Reed, forsythia, sageweed, oat, broadleaf laver, wheat, bahia grass, barley, oat, syriasus, wild rye grass, mud barley, duckling, orchardgrass, saltweed, corn, kingpofoam, Umbrella grass, canary grass, blackjack grass, big fern, scented grass, rye, rye grass, white eared, white haired bird, fake horseradish, dog flower, long eared greens, maple leaf, pips, lizard, ragweed, French chrysanthemum Marguerite, tusks, seaweed, dandelion, lupine, amaranth, sugar beet, ragweed, grasshopper, pine needles, nettle, mugwort, bitter orange, baby swimming, rapeseed, alfalfa, plantain,
  • diagnosis means to confirm the presence or characteristics of the pathological state, for the purpose of the present invention the diagnosis is to determine whether the allergic disease.
  • allergic disease diagnosis may be made by a method of confirming the presence of 'allergen-specific IgE' or 'total IgE' included in blood samples collected from a test subject.
  • an antibody refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site.
  • an antibody means an antibody that specifically binds to a marker of the present invention, and more specifically, an antibody that specifically binds to IgE (Immunoglobulin E, immunoglobulin E).
  • IgE immunoglobulin E, immunoglobulin E
  • the monoclonal antibody to the protein is cloned into an expression vector according to a monoclonal antibody production method conventional in the art to obtain a protein encoded by the marker gene, and then produced and used by a conventional method from the obtained protein. It is also possible to use a commercially available one.
  • a polyclonal antibody that recognizes the protein may be used instead of the monoclonal antibody, which may be manufactured and used through a conventional antiserum production method in the art.
  • the antibody in the present invention also includes a partial peptide that can be made from the protein, and the partial peptide of the present invention includes at least 7 amino acids, preferably 9 amino acids, more preferably 12 or more amino acids. do.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited and, if it is a polyclonal antibody, a monoclonal antibody or antigen-binding, a part thereof is included in the antibody of the present invention and all immunoglobulin antibodies are included.
  • Aptamers consisting of non-nucleotide sequences are also included in the concept of antibodies in the present invention.
  • the antibody of this invention also contains special antibodies, such as a humanized antibody.
  • Antibodies used for IgE detection of the present invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least antigen binding function and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.
  • IgE immunoglobulin E
  • IgE immunoglobulin E
  • allergen specific IgE is an immunoglobulin that is expressed against a specific antigen during type 1 hypersensitivity, and an IgE-class antibody specific for the antigen is induced by binding to mast cells or basophils. This induction response can occur locally or systemically, depending on the type and amount of mediator these cells produce. This reaction is also called immediate hypersensitivity because it occurs within an hour of the antigen's arrival. This immediate hypersensitivity reaction is strongly systemic, called anaphylaxis, and can even cause asphyxiation and circulatory death. However, even when exposed to the same allergen, this reaction may or may not appear well in some people, so this reaction is called atopy, which means a specific constitution.
  • the "sample” includes, but is not limited to, tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid or urine, and the like, which differ in the expression level of the IgE antibody.
  • the serum of blood collected from the test subject is used, but is not limited thereto.
  • antigen-antibody complex means a combination of a marker protein and an antibody specific thereto, and the amount of antigen-antibody complex formation can be quantitatively measured through the size of a signal of a detection label.
  • ELISA in addition to the method of visually confirming to measure the quantitative level of IgE, ELISA can be used.
  • ELISA is a direct ELISA using a labeled antibody that recognizes an antigen attached to a solid support, an indirect ELISA using a labeled antibody that recognizes a capture antibody in a complex of antibodies that recognize an antigen attached to a solid support, attached to a solid support
  • Various ELISA methods include indirect sandwich ELISA using secondary antibodies.
  • an allergen is attached to a solid support (bottom of the reaction kit of the diagnostic kit) and the sample is reacted, and then labeled onto an enzyme-mimicking nanoparticle that recognizes the antigen (allergen-specific IgE contained in the sample) of the antigen-antibody complex.
  • the first anti-IgE antibody labeled with the enzyme-mimicking nanoparticles can be detected and developed by the enzyme catalytic reaction. Allergic diseases can be diagnosed by confirming the detected degree of antigen-antibody complex formation.
  • diagnostic kit means a set of compositions and accessories necessary for a specific purpose.
  • the diagnostic kit of the present invention is to determine whether the allergic disease.
  • the kit of the present invention includes an enzyme-mimicking nanoparticle having an enzymatic activity including a first anti-IgE antibody for measuring an allergic disease, a solid support including a reaction portion to which each allergen or a second anti-IgE antibody is attached, Reagents capable of measuring enzymatic activity, such as peroxidase, may be included, in addition to one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method.
  • side flow immunochromic chip is a kit showing a color signal upon detection so that the liquid sample containing the target material is fixed while moving through the porous medium and reacts with the detection material. Means.
  • inorganic nanoparticles means nanoparticles containing an inorganic component.
  • the inorganic material may be an inorganic material, an oxide of an inorganic material, or an inorganic composite.
  • the inorganic composite may be, for example, a composite material in which a non-metal, ceramic, plastic, polymer, biological material, semiconductor, and quantum dots are combined with a metal, and the composite material may be, for example, a ceramic or a polymer.
  • the same non-metallic nucleating agent is contained and the outside may be particles coated with an inorganic material, and a reactive functional group or molecular sieve may be present on the surface of the inorganic particles.
  • “enzyme-mimicking nanoparticles” are inorganic nanoparticles capable of oxidizing a chromogenic substrate, preferably consisting of iron oxide (Fe 3 O 4 ), platinum (Pt), mixtures thereof, and the like. Particles.
  • the chromogenic substrate amplifies the detection signal while the enzyme mimics ksh particles as an oxidation catalyst and precipitates and insolubles at the position where the inorganic nanoparticles are present after oxidation.
  • the chromogenic substrate may be 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) when the peroxide enzyme mimics nanoparticles.
  • the nanoparticles are monodispersed nanoparticles contained in the liquid phase so that they can move to the junction of the lateral flow immunochromic chip through a capillary path of several micrometers in diameter.
  • the synthesis of the monodisperse nanoparticles may be prepared using a synthesis method to improve the monodispersity using a surfactant in an organic solvent.
  • a coloring reagent consisting of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), 3,3 ′, 5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) and sodium acetate buffer solution (pH 4.0)
  • the total IgE antibody and specific IgE antibody concentration data in serum provided by the actual site were compared with the data obtained through the immunodiagnostic based on the nanozyme of the present invention.
  • standard deviation and coefficient of variation were analyzed to verify the diagnostic reliability of each data.
  • the coefficient of variation indicating the measurement accuracy was low (2.3-10.9%) for five different blood samples, and the recovery value was also reliable (95.4-104.7%) (Figs. 6 and 7). .
  • Iron oxide nanoparticles were synthesized using a co-precipitation method. 0.4 g of ferrous chloride and 1.1 g of ferric chloride were added to 20 mL of distilled water and mixed in a hot stirrer and heated up to 80 ° C. After adding 5 mL of 28% ammonium hydroxide solution at 80 ° C., the reaction was carried out for one hour. The produced magnetic nanoparticles were attracted using a magnet, the supernatant was removed, and washed three times with ethanol and distilled water, respectively.
  • Magnetic nanoparticles synthesized by the above method has the advantage that it can be easily separated and recovered using a magnet without a separate centrifugation process due to the magnetic properties.
  • the organic peroxidase such as horseradish peroxidase (HRP) has the property of oxidizing the peroxidase substrate in the presence of H 2 O 2 It can effectively replace the organic enzyme used in the enzyme immunoassay method using the existing color substrate It is in the spotlight as a material that can be
  • Platinum nanoparticles were synthesized via seed-growth synthesis. 18 mL of 0.2% chloroplatinic acid hexahydrate was added to 232 mL of boiling distilled water. After 1 minute, 5.5 mL of a solution containing 1% sodium citrate and 0.05% citric acid was added. After 30 seconds, 2.75 mL of a solution containing 0.08% sodium borohydrate, 1% sodium citrate, and 0.05% citric acid was added thereto, and reacted for 10 minutes. A seed solution containing platinum nanoparticle seeds having a size of 5 nm was obtained.
  • Platinum nanoparticles synthesized by the above method have oxidase activity capable of oxidizing color substrate only with dissolved oxygen even when H 2 O 2 is not present. Above all, it has the strongest peroxidase activity among the metal nanoparticles discovered so far, and when applied to various color diagnosis methods, the color development can be visually confirmed. In addition, it can be synthesized into nanoparticles that show stronger activity than when used alone by synthesizing in a hierarchical structure.
  • H-Pt nanoparticles (1.0 mg / mL) are washed twice with distilled water and dispersed in the same concentration in 1 mL of distilled water. 250 ⁇ L of H-Pt nanoparticle solution (1 mg / ml) dispersed in distilled water and 250 ⁇ L of anti-IgE antibody (200 ⁇ g / mL) are mixed. Then 500 ⁇ L of blocking agents (phosphate buffered saline containing 0.1% Tween-20 and 3% bovine serum albumin) are added to the mixture. In order to promote physical binding between the anti-IgE antibody and the H-Pt nanoparticles, they are reacted in a shaker for 24 hours at 4 ° C. Rinse three times with storage solution (phosphate buffered saline solution containing 0.1% Tween-20 and 3% bovine serum albumin), disperse in the same storage solution and store at 4 °C.
  • storage solution phosphate buffered saline solution containing 0.
  • centrifugation was used to separate the H-Pt nanoparticles and the unmodified anti-IgE antibodies before washing.
  • the supernatant in which the anti-IgE antibody was dissolved was analyzed by BCA protein assay, and it was confirmed that about 90% of the anti-IgE antibody was modified in H-Pt nanoparticles.
  • a lateral flow immunoassay chip was prepared as shown in the schematic diagram of FIG. 8.
  • the allergen antigen protein (fixed material, 620) was used as a test line of the reaction part, and IgE antibody was used as a control line of the control part.
  • the allergen antigen protein was diluted to 1 mg / ml in phosphate buffered saline (pH 7.4) and coated using a dispenser to the reaction portion of the nitrocellulose membrane, which is the support 600.
  • the allergen antigen protein may be an anti-IgE antibody when the target material is a total IgE antibody, and an allergen may be used when the target material is an allergen-specific IgE antibody.
  • the anti-IgE antibody bound to the nanoparticles and the anti-IgE antibody used as the immobilizing material have different epitopes with respect to the IgE antibody and can simultaneously bind to each other with IgE interposed.
  • the anti-IgE antibody in the nanoparticles will be referred to as the first anti-IgE antibody
  • the anti-IgE antibody used as the immobilizing material will be referred to as the second anti-IgE antibody.
  • the sprayed nitrocellulose membrane was dried for 12 hours in a desiccator equipped with a dehumidifier.
  • IgE antibody solution diluted to a concentration of 1 mg / mL in the control line was coated and dried in the same manner as above.
  • the anti-IgE antibody-H-Pt nanoparticle 520 prepared in Example 1 was diluted to a concentration of 1 mg / mL in phosphate buffered saline (pH 7.4) containing sucrose and bovine serum albumin, and After coating, it was dried to prepare a joint. At the junction, the nanoparticle 520 and the total IgE antibody or allergen-specific IgE antibody, which are the target material 720 in the sample 700, are conjugated to each other.
  • sample pad 300 sample pad 300
  • absorbent part absorbent part
  • the sample pad 300 and the absorbent pad 400 were manufactured by drying so that the reaction solution could be absorbed well. After the sample 700 is injected into the sample pad 300, the sample 700 passes from the sample part 300 to the reaction part on the support 600 by capillary action through the junction part 500. The absorber 400 is moved to the absorber 400 through the checker.
  • the presence of total IgE antibody or allergen-specific IgE antibody in the sample is provided, and information on diagnosis of allergic disease is provided. If the IgE is fixed as a control material in addition to the control part, even if there is no IgE antibody in the sample, the first anti-IgE antibody of the nanoparticles is combined with the IgE, which is a control material, so that the signal is amplified and displayed. You can check whether the lateral flow immunochromic chip is working properly or not.
  • An allergen-immobilized Immunoplate was prepared for enzyme-immunoassay to diagnose specific IgE antibodies in blood.
  • Anti-IgE antibody-H-Pt nanoparticle conjugate that binds the target material (allergen-specific IgE, 720) in the sample 700 to the immobilizing material 620 attached to the Immunoplate and then selectively binds to the IgE antibody.
  • (520) was prepared by diluting to a concentration of 1 mg / ml. The sample (serum or plasma, etc.) was dispensed on an Immunoplate, and then reacted at 37 ° C. for about 6 hours and washed. The prepared solution was dispensed and reacted at 37 ° C. for about 6 hours.
  • washing was performed, and reagents for color diagnosis were prepared.
  • the allergy diagnostic Immunoplate kit is used to detect total IgE antibodies or allergen-specific IgE antibodies, which are the target substances in the sample.
  • the total IgE antibody or allergen-specific IgE antibody in the sample binds to the second anti-IgE antibody or allergen, which is a fixed substance in each well of the Immunoplate, and the allergy diagnostic enzyme-mimicking nanoparticles are labeled on the nanoparticle surface.
  • the enzyme-mimicking nanoparticles react with a chromogenic substrate to amplify the detection signal.
  • the presence of total IgE antibody or allergen-specific IgE antibody in the sample is provided, and information on diagnosis of allergic disease is provided. If the IgE antibody is immobilized in place of the sample as a control substance, even if there is no IgE antibody in the sample, the first anti-IgE antibody of the nanoparticles is combined with the IgE antibody as the control substance and the signal is amplified so that the allergy diagnostic Immunoplate kit You can check whether it is working correctly or not.
  • allergen-specific IgE antibody can be identified easily and easily, instead of the skin test that causes the subject to suffer, and to provide information on the diagnosis of the allergic disease in the subject. Done.

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Abstract

본 발명은 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자, 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자를 이용한 측면 유동 면역 발색칩 및 제조 방법, 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자를 이용한 알러지 진단용 Immunoplate 방법 및 키트에 관한 것이다. 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 표면에 제1 항-IgE 항체가 물리적 결합에 의해 표지되고, 단분산성이며, 발색 기질을 산화시키는 무기 금속 촉매를 포함하는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자이다. 본 발명에 따르면, 종래의 효소 기반의 진단 면역법에서 문제가 되는 온도 변화와 pH 변화에 의한 효소의 불안정성 및 가변성을 개선한 무기 금속 촉매 기반의 진단 면역법을 사용함으로써 진단 키트의 안정성을 증가시켰으며, 검사 소요 시간을 단축시키고 제작, 이송, 보관, 검사의 각 과정에 들이는 비용을 절감하여 경제성을 향상시킨 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩 및 알러지 진단용 Immunoplate 키트를 제공할 수 있다.

Description

효소 모방 나노자임에 기반한 면역학적 분석에 의한 IG E 검출 및 알러지 진단법
본 발명은 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자, 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자를 이용한 측면 유동 면역 발색칩 및 제조 방법, 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자를 이용한 알러지 진단용 Immunoplate 방법 및 키트에 관한 것이다.
알러지는 “변형된 것”을 의미하는 그리스어 “allos”에서 유래한 단어로 과민반응을 의미하며, 한국에서는 영어식 발음인 알러지, 독일어식 발음인 알레르기 모두 혼용되어 사용하나, 표준어는 알레르기이다. 본 명세서에서, “알러지”(allergy)는 알러지와 알레르기 모두를 포함하는 단어이다.
알러지는 대부분의 사람들에게는 거의 문제가 없거나 아주 작은 영향만 있는 환경적 요인에 대하여 면역적으로 과민반응(hepersensitivity)으로 인한 여러 증상이 나타나는 것을 말한다. 알러지의 종류에는 꽃가루 알러지(hay fever), 음식 알러지(food allergies), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 알러지성 천식(allergic asthma), 아나필락시스 쇼크(anaphylaxis) 등이 있다. 알러지의 증상으로는 눈이 충혈되고 가려움증이 나타나며 콧물이 흐르고 숨이 가빠지며 부기가 생기는 등의 증상이 있다.
일반적으로 알러지는 부모로부터 물려받은 체질적 요인과 후천적인 환경적 요인이 상호작용을 일으켜 나타난다. 특히 환경적 요인을 알러젠(allergen)이라고 한다. 일반적으로 꽃가루나 특정 음식, 곤충의 침(sting), 약품류 등의 알러젠이 존재한다. 알러젠은 우리 몸에 들어오면 항원으로 작용하여 면역반응으로써 항원항체반응이 일어나게 되고 이로 인하여 알러지의 증상이 나타난다.
알러젠에 의한 면역반응에는 IgE (Immunoglobulin E antibodies)라는 항체가 관여한다. IgE의 수용체는 Fc 수용체로 FcεRI, FcεRII(CD23)이 알려져 있다. FcεRI은 비만 세포, 호염기성 세포, 항원제시 수지상세포(antigen-presenting dendritic cells)에서 발현이 되며, IgE는 비만 세포의 FcεRI에 결합한 상태로 존재한다. 알러젠과 IgE가 항원항체반응으로 결합하면, 결합된 IgE와 그 주위에 모여든 FcεRI 수용체들 사이에 서로 교차결합(cross-linking)이 일어나게 되고, 비만 세포에서 degranulation 현상이 일어나면서 면역 매개 물질들이 분비된다. 호염기성 세포의 경우에는 IL-4(interleukin-4) 등의 면역 매개 물질들이 분비된다. FcεRII는 B 세포(B cells)에 항상 발현이 되어 있으며, 호염기성 세포 등에서 분비된 IL-4에 의해 대식 세포, 호산성 세포, 혈소판(platelets), 일부 T 세포(T cells) 등에서 발현이 유도된다. FcεRI은 IgE에 친화성(affinity)이 높지만, FcεRII는 IgE에 친화성이 낮다. B 세포가 IgE를 분비하는 형질 세포(plasma cells)로 분화하는 단계에서 IgE에 친화성이 낮은 FcεRII가 관여하여 IgE의 농도가 조절이 된다는 가설이 있다.
알러지에 대한 검사로서는 혈청(serum) 내의 총 IgE 검사, 특이 IgE 검사, 혈액 호산구와 호산구 양이온 단백질 검사, 피부반응검사, 항원유발검사 등이 있으며, 이 중 피부 반응 검사는 반응성 유무로 원인물질을 규명할 수 있는 간편하면서도 경제적이고 진단적 가치가 높은 검사법이나, 피검자에게 부담이 되거나 고통을 초래하는 경우가 많다.
피검자에게 부담이 되지 않는 알러지 검사로는 혈청 내의 IgE 항체를 측정하는 방법이 선호되어 왔다. 가령, 아토피성 피부염이 있는 사람은 총 IgE 항체의 양이 최대 10배까지 증가할 수도 있으므로, 혈청 내의 총 IgE 항체의 양을 측정하여 알러지 유무를 판별하는 방법이다. 그런데, 총 IgE 항체는 전체 Immunoglobulin isotypes 중에 가장 적은 농도로 존재하며 0.05% 밖에 되지 않는다. 따라서 혈청 내의 총 IgE 항체를 감지하여 알러지를 진단하는 종래 기술들은 민감도 측면에서 문제가 있다. 최근에는 혈청 내의 알러젠-특이적 IgE 항체를 이용하기 위한 연구들이 많이 개발되었으나, 알러젠-특이적 IgE 항체는 총 IgE 항체에 비하여 그 양이 현저히 더 적을 수 밖에 없다. 따라서 알러젠-특이적 IgE 항체를 확인하는 방법도 민감도 측면에서는 문제가 있을 수 밖에 없다. 이러한 종래 기술로는 “항생제-인혈청 단백질 접합체를 포함하는 항생제 알레르기 진단 키트”(대한민국 등록특허 공보 제10-2012-0058842호)가 있다. 그 외에 이러한 IgE 항체를 이용하는 방법과 무관하게 특정 알러지가 발생했을 때 특이적으로 신체 내에서 증가하는 유전자의 발현이나 단백질의 발현을 이용하여 알러지를 진단하려는 시도가 있었다. 이러한 종래 기술로는 “아토피 및 알러지 질환에서의 CTCF 유전자의 용도”(대한민국 공개특허 공보 제10-2016-0115645호)가 있다.
한편, 진단에 많이 사용하는 방법 중에서 유동 면역발색칩 검사법이 있다. 이 검사법에서는 발색 물질로서 금 나노입자를 표지하는 방법을 주로 사용하는데, 금 나노입자가 고유의 플라즈몬 현상에 의하여 붉은 색으로 발색된 것을 육안으로 식별하여 진단에 이용한다. 그런데, 금 나노입자의 경우 분석 감도가 낮기 때문에 체액에 다량 존재하는 분석물에만 적용할 수 있다는 단점이 있다. 그것을 개선하고자, 금 나노입자에 제1 항체나 제1 결합부위(리간드)를 결합시킨 후에, 다시 형광물질을 포함하는 제2 항체나 제2 특이적 결합물질을 결합시켜 신호를 증폭시키려는 시도(대한민국 특허 공개 제2010-118550호)가 있었다.
본 발명자들 중 이진우는 상기 금 나노입자 방법과 상기 신호증폭방법을 개선하여, “효소 모방 무기 나노입자를 이용한 고감도 측면유동 면역 발색칩 및 이를 이용한 검출 방법”(대한민국 등록특허 공보 제10-1597413호)를 발명한 바 있다. 이는 금 대신에 철산화물(Fe3O4)과 백금(Pt)을 사용한 나노입자에 분석물을 감지할 수 있는 항체를 고정하고, 효소-기질 반응을 이용하여 발색 시그널을 증폭시키는 방법으로 감도를 개선시킨 방법으로, 육안으로 분석물을 파악하여 진단할 수 있다는 장점이 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명은 종래의 알러지 진단에 사용되었던 효소 기반 조성물을 대체하여 사용될 수 있는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자를 제공하는 것을 일 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자를 이용한 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩을 제조하는 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩을 이용하여 시료 내의 총 IgE 항체를 검출하는 방법과 알러젠-특이적 IgE 항체를 검출하는 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩을 이용하여 알러젠-특이적인 알러지 질환 진단에 관한 정보를 제공하는 방법 또는 알러젠-특이적인 알러지 질환 진단법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자를 이용한 알러지 진단용 Immunoplate 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 포함된 알러지 진단용 Immunoplate 키트를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 알러지 진단용 Immunoplate 키트를 이용하여 알러젠-특이적인 알러지 질환 진단에 관한 정보를 제공하는 방법 또는 알러젠-특이적인 알러지 질환 진단법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 표면에 제1 항-IgE 항체가 물리적 결합에 의해 표지되고, 단분산성이며, 발색 기질을 산화시키는 무기 금속 촉매를 포함하는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자이다.
본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 무기 금속 촉매는 과산화효소 또는 산화효소의 효소 모방 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하고, 상기 무기 금속 촉매는 상기 발색 기질을 침전하거나 불용화시키는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 무기 금속 촉매는 산화철(Fe3O4)를 포함하는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하며, 더욱 구체적으로는 상기 무기 금속 촉매는 자성을 가지는 것을 특징으로 하는 것이 더욱 바람직하다.
또한 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 무기 금속 촉매는 백금(Pt)을 포함하는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하며, 더욱 구체적으로는 상기 무기 금속 촉매는 계층 구조를 이루는 형태로 합성된 것을 특징으로 하는 것이 더욱 바람직하다.
또한 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 단분산성을 가지는 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 유기용매환경에서 계면활성제를 사용하여 크기가 균일하게 조절되어 단분산성으로 합성되는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 상기 나노 입자의 표면을 카르복실산으로 치환하고, 상기 제1 항-IgE 항체는 상기 카르복실산의 카르복실기와 반응하여 상기 나노 입자에 결합되며, 치환된 무기 나노 입자와 상기 제1 항-IgE 항체를 생리 식염수에 고르게 분산시켜 고정시키는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 접합부에 제1 항-IgE 항체를 포함하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 존재하고, 반응부에 시료의 표적 물질과 결합할 수 있는 고정 물질이 존재하는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩이다.
본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 시료의 표적 물질은 총 IgE 항체이고, 상기 고정 물질은 제2 항-IgE 항체인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하고, 더욱 구체적으로는 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자의 표면에 표지된 상기 제1 항-IgE 항체는 상기 시료의 표적 물질인 상기 총 IgE 항체와 결합하고 총 IgE 항체는 상기 반응부의 고정 물질인 상기 제2 항-IgE 항체와 결합함에 의하여, 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 반응부에 고정되고, 발색기질과 반응하여 검출 신호를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 시료의 표적 물질은 알러젠-특이적 IgE 항체이고, 상기 고정 물질은 알러젠(allergen)인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하고, 더욱 구체적으로는 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자의 표면에 표지된 상기 제1 항-IgE 항체는 상기 시료의 표적 물질인 상기 알러젠-특이적 IgE 항체와 결합하고 알러젠-특이적 IgE 항체는 상기 반응부의 고정 물질인 상기 알러젠과 결합함에 의하여, 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 반응부에 고정되고, 발색기질과 반응하여 검출 신호를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 알러젠은 목초류, 나무 껍질, 동물 상피나 털, 곤충, 진드기, 집먼지, 기생충, 미생물, 벌독, 약물, 직업성 알러젠류, 과일, 채소, 씨, 견과류, 향신료, 어패류, 알, 가금류, 육류, 유제품, 식품첨가물 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 물질인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하고, 상기 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 단분산성 무기 나노 입자이고, 상기 단분산성을 가지는 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 유기용매환경에서 계면활성제를 사용하여 크기가 균일하게 조절되어 단분산성으로 합성되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 제1 항-IgE 항체를 포함하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 상기 나노 입자의 표면을 카르복실산으로 치환하고, 상기 제1 항-IgE 항체는 상기 카르복실산의 카르복실기와 반응하여 상기 나노 입자에 결합된 것을 특징으로 하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 제1 항-IgE 항체를 포함하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자의 표면에 표지된 상기 제1 항-IgE 항체가 반응부의 지지체 위에 고정된 상기 고정 물질에 결합되는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 제1 항-IgE 항체를 포함하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 산화철, 백금으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하고, 상기 백금을 포함한 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 계층 구조를 이루는 형태로 합성된 것을 특징으로 하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 과산화효소 또는 산화효소의 효소 모방 활성을 가지며, 상기 발색 기질의 산화 촉매인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하고, 더욱 구체적으로는 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 상기 발색 기질을 침전 또는 불용화시키는 것을 특징으로 하는 것이 더욱 바람직하며, 상기 발색 기질은 3-아미노-9-에틸카바졸(3-amino-9-ethylcarbazole)인 것을 특징으로 하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩은 표적 물질을 포함하는 시료가 투입되는 샘플부, 제1 항-IgE 항체를 포함하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 존재하며 상기 나노 입자의 상기 제1 항-IgE 항체가 상기 표적물질과 접합하여 결합할 수 있는 접합부, 시료의 표적 물질과 결합할 수 있는 고정 물질이 존재하는 반응부, 오류 확인을 위하여 대조군 물질이 존재하는 대조부, 액체 시료를 모세관 현상에 의하여 흡수할 수 있는 흡수부를 포함하고 있으며, 상기 시료는 상기 샘플부로부터 상기 접합부를 거쳐서 모세관 현상에 의하여 지지체 위의 상기 반응부와 상기 대조부를 거쳐서 상기 흡수부로 이동하는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하고, 더욱 구체적으로는 상기 대조부에는 대조군 물질로 IgE 항체가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 것이 더욱 바람직하며, 상기 고정 물질은 알러젠이고, 상기 시료에 포함된 표적 물질은 알러젠-특이적 IgE 항체이며, 상기 반응부는 여러 구간으로 구획이 나뉘어져 있어서 각 구간마다 다른 종류의 알러젠이 고정되어 있는 것을 특징으로 하며, 상기 여러 구간에 있는 각각의 상기 알러젠에 대한 상기 시료에 포함된 상기 알러젠-특이적 IgE 항체의 존재를 한 번의 검사로써 동시에 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 알러지는 부종, 과민증(anaphylaxis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염, 두드러기, 곤충 알러지, 음식 알러지(food allergies), 알러지성 천식(allergic asthma) 또는 약품 알러지 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 알러지 질환인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, (1) 상기 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩을 이용하여 시료 속의 표적 물질인 총 IgE 항체를 검출하는 단계; 및 (2) 상기 총 IgE 항체와 결합된 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 발색기질과 반응하여 검출 신호를 증폭시키는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 총 IgE 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, (1) 상기 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩을 이용하여 시료 속의 표적 물질인 알러젠-특이적 IgE 항체를 검출하는 단계; 및 (2) 상기 알러젠-특이적 IgE 항체와 결합된 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 발색기질과 반응하여 검출 신호를 증폭시키는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 알러젠-특이적 IgE 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, (1) 상기 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩을 이용하여 시료 속의 표적 물질인 알러젠-특이적 IgE 항체를 검출하는 단계; (2) 상기 알러젠-특이적 IgE 항체와 결합된 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 발색기질과 반응하여 검출 신호를 증폭시키는 단계; (3) 증폭된 상기 검출 신호로부터 상기 알러젠-특이적 IgE 항체와 결합된 고정 물질인 알러젠을 확인하는 단계; 및 (4) 상기 알러젠의 정체(identity)를 확인하여 알러지 질환을 판정하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 알러젠-특이적인 알러지 질환 진단법 또는 알러젠-특이적인 알러지 질환 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, (1) 표면에 제1 항-IgE 항체가 물리적 결합에 의해 표지되고, 발색 기질을 산화시키는 무기 금속 촉매를 포함하는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자를 합성하는 단계; (2) 표적 물질을 포함하는 시료가 투입되는 샘플부, 제1 항-IgE 항체를 포함하는 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 위치하는 접합부, 상기 샘플부에 투입된 상기 시료의 표적 물질과 결합할 수 있는 고정 물질이 존재하는 반응부, 상기 반응부 측면에 오류 확인을 위하여 대조군 물질로 IgE 항체가 고정되어 있는 대조부, 액체 시료를 모세관 현상에 의하여 흡수할 수 있는 흡수부를 지지체 위에 조립하는 단계; 를 포함하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩의 제조 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 (1) Immunoplate의 well에 시료의 표적 물질과 결합할 수 있는 고정 물질을 고정시키는 단계; (2) 표적 물질이 존재하는 시료를 상기 Immunoplate의 각 well에 분주하여 상기 고정 물질과 상기 표적 물질을 결합시키는 단계; (3) 표면에 제1 항-IgE 항체가 표지된 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자를 상기 Immunoplate의 각 well에 분주된 표적물질과 결합시키는 단계; 및 (4) 상기 제1 항-IgE 항체가 상기 표적 물질을 통하여 상기 고정 물질과 결합한 후, 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 발색기질과 반응하여 검출 신호를 증폭시키는 단계; 를 포함하는 알러지 진단용 Immunoplate 방법이다.
본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 시료의 표적 물질은 총 IgE 항체이고, 상기 고정 물질은 제2 항-IgE 항체인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하며, 상기 시료의 표적 물질은 알러젠-특이적 IgE이고, 상기 고정 물질은 알러젠(allergen)인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하고 더욱 구체적으로는 상기 알러젠은 목초류, 나무 껍질, 동물 상피나 털, 곤충, 진드기, 집먼지, 기생충, 미생물, 벌독, 약물, 직업성 알러젠류, 과일, 채소, 씨, 견과류, 향신료, 어패류, 알, 가금류, 육류, 유제품, 식품첨가물 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 물질인 것을 특징으로 하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, Immunoplate의 각 well마다 다른 종류의 알러젠이 고정되어 있어서 각각의 상기 알러젠에 대한 상기 알러젠-특이적 IgE 항체의 존재를 한 번의 검사로써 동시에 검출할 수 있는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 단분산성 무기 나노 입자이고, 상기 단분산성 무기 나노 입자는 유기용매환경에서 계면활성제를 사용하여 크기가 균일하게 조절되어 단분산성으로 합성되는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 제1 항-IgE 항체를 포함하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 상기 나노 입자의 표면을 카르복실산으로 치환하고, 상기 제1 항-IgE 항체는 상기 카르복실산의 카르복실기와 반응하여 상기 나노 입자에 결합된 것을 특징으로 하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 산화철, 백금으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하며, 더욱 구체적으로는 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자 중 상기 백금을 포함하는 나노 입자는 계층구조를 이루는 형태로 합성되는 것을 특징으로 하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 과산화효소 또는 산화효소의 효소 모방 활성을 가지며, 상기 발색 기질의 산화 촉매인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하며, 더욱 구체적으로는 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 상기 발색 기질을 침전 또는 불용화시키는 것을 특징으로 하는 것이 더욱 바람직하고, 상기 발색 기질은 3-아미노-9-에틸카바졸(3-amino-9-ethylcarbazole)인 것을 특징으로 하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 알러지는 부종, 과민증(anaphylaxis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염, 두드러기, 곤충 알러지, 음식 알러지(food allergies), 알러지성 천식(allergic asthma) 또는 약품 알러지 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 알러지 진단용 Immunoplate 방법을 수행하기 위한 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자와, 시료의 표적 물질과 결합할 수 있는 상기 고정 물질을 포함하고 있는 조성물을 포함하는 알러지 진단용 Immunoplate 키트를 제공하는 것이 바람직하다. 더욱 구체적으로는, Immunoplate의 각 well마다 다른 종류의 상기 알러젠이 고정되어 있어서 각각의 상기 알러젠에 대한 상기 알러젠-특이적 IgE 항체의 존재를 한 번의 검사로써 동시에 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 Immunoplate를 더 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, (1) 상기 알러지 진단용 Immunoplate 키트를 이용하여 시료 속의 표적 물질인 알러젠-특이적 IgE 항체를 검출하는 단계; (2) 상기 알러젠-특이적 IgE 항체와 결합된 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 상기 발색기질과 반응하여 검출 신호를 증폭시키는 단계; (3) 증폭된 상기 검출 신호로부터 상기 알러젠-특이적 IgE 항체와 결합된 고정 물질인 알러젠을 확인하는 단계; 및 (4) 상기 알러젠의 정체(identity)를 확인하여 알러지 질환을 판정하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 알러젠-특이적인 알러지 질환 진단법 또는 알러젠-특이적인 알러지 질환 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 종래의 알러지 진단에 사용되었던 효소 기반 조성물을 대체하여 사용될 수 있는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자를 제공할 수 있으며, 이를 이용한 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩, 알러지 진단용 Immunoplate 키트를 제공할 수 있다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 종래의 효소 기반의 진단 면역법에서 문제가 되는 온도 변화와 pH 변화에 의한 효소의 불안정성 및 가변성을 개선한 무기 금속 촉매 기반의 진단 면역법을 사용함으로써 진단 키트의 안정성을 증가시켰으며, 검사 소요 시간을 단축시키고 제작, 이송, 보관, 검사의 각 과정에 들이는 비용을 절감하여 경제성을 향상시킨 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩 및 알러지 진단용 Immunoplate 키트를 제공할 수 있다.
도 1에서는 기존 범용되어온 알러지 진단과정의 모식도(위)와 본 발명의 실시예에 따른 진단과정의 모식도(아래)를 비교하고 있다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른, 과산화효소 활성을 모방하는 H-Pt 나노입자에 대한 transmission electron microscope(TEM) 사진이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라, 유기 과산화효소 (HRP)와 H-Pt 나노입자의 효소 활성을 확인함으로써 온도와 pH 조건에 대한 안정성을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따라, 유기 과산화효소 (HRP)와 H-Pt 나노입자가 접합된 항-IgE 항체를 이용해 IgE 항체 농도를 발색 진단하여 비교한 결과를 나타낸 그래프 및 사진이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따라, 총 IgE 농도와 특이 IgE 농도에 대한 검량선 (calibration curve)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라, 인간 혈청 내 총 IgE를 검출 및 정량 분석하여 나온 농도 값과 가천대학교 길병원에서 제공받은 실제 IgE 농도 값과 비교한 데이터를 정리한 표이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따라, 인간 혈청 내 특이 IgE를 검출 및 정량 분석하여 나온 농도 값과 가천대학교 길병원에서 제공받은 실제 IgE 농도 값과 비교한 데이터를 정리한 표이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따라, 측면유동 알러지 진단 키트의 구성 및 원리를 나타낸 모식도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명은 혈액, 뇨, 타액 등 인체로부터 유래하는 시료를 검체로 사용하여 특정 지표물질을 분석할 수 있는 체외진단기술에 관한 것으로서, 조금 더 구체적으로는 면역반응(항원-항체 반응)을 이용하여 혈액 내 IgE를 검출하고 정량 분석하여 알러지 여부를 진단하는 방법에 관한 것이다. 항원-항체 반응을 이용한 진단기술은, 효소가 결합되어 있는 항체가 특정 항원과 반응했을 때에 기질과 효소간의 반응에 의하여 고감도로 항원-항체 반응이 있다는 것을 보임으로써 항원의 유무를 판별하여 진단에 이용하는 기술이다. 지난 수십 년 간 단백질에 기반한 유기효소의 활성을 이용한 면역진단기술 연구가 광범위하게 이루어졌으며 지금까지도 다양한 제품들이 상품화되고 있다. 이와 같은 유기효소 기반 진단기술은 특이적이고 민감하게 대상 물질을 진단할 수 있다는 장점이 있지만, 반응 환경과 보관 시간에 따라 효소의 활성이 점차 변하여 결과적으로 진단결과의 신뢰성에 문제를 야기할 수 있다는 단점이 있다. 한 예로, 알러지 진단을 위해 현재 가장 보편적으로 사용되고 있는 Phadia사의 이뮤노캡 검사법(ImmunoCAP test)은 인간 혈청 또는 혈장 시료 안의 IgE를 정량적으로 측정함으로써 알러지 여부를 임상적으로 측정할 수 있는 검증된 면역진단법이지만, 검사 과정에서 유기효소인 β-galactosidase를 사용하여 주변 환경 및 보관시간에 따라 효소활성이 감소된다는 점과 진단 방식이 형광검출 방식에 제한된다는 단점이 있다. 따라서 이러한 유기효소의 단점을 보완함과 동시에 효소활성을 유지할 수 있는 대체물질의 수요가 급증하였고 최근까지 수많은 연구가 지속되고 있다.
본 발명에서는 유기효소 대신 효소 모방 나노입자를 항-IgE 항체(anti-ImmunoglobulinE antibodies)에 결합하는 전략을 통해 안정성과 촉매활성을 극대화하고, IgE 항체를 특이적으로 검출하고 정량 분석할 수 있는 고감도 알러지 진단법을 제안한다. 무기 금속 중 산화철(Fe3O4)과 백금(Pt)의 나노 입자에 알러지 진단을 위하여 사용할 제1 항-IgE 를 고정시킨다.
본 발명에서 제공하는 나노 입자는 두 가지 방법 이상의 방법으로 실시가 가능하다. 첫째는 특이적 알러젠에 대한 알러지 반응을 진단하는 방법이다. 각각의 알러젠이 진단 키트의 반응부 밑면에 고정되어 있고, 그 위에 혈액 시료를 통과시키면 각각의 알러젠에 특이적인 IgE 항체(allergen-specific IgE)가 결합하게 된다. 다시 그 위에 나노 입자가 결합되어 있는 제1 항-IgE 항체가 알러젠-특이적 IgE 항체에 결합하게 되고, 나노 입자의 효소 모방 기능에 의하여 발색 기질이 발색을 하게 되어 알러젠-특이적 IgE 항체의 존재를 식별이 가능하게 된다. 둘째는 혈액 내의 총 IgE 항체(total IgE)의 증가를 검출함으로써 알러지 반응을 진단하는 방법이다. 제2 항-IgE 항체가 진단 키트의 반응부 밑면에 고정되어 있고, 그 위에 혈액 시료를 통과시키면 혈액 시료 내의 총 IgE 항체가 제2 항-IgE 항체에 결합하게 된다. 다시 그 위에 나노 입자가 결합되어 있는 제1 항-IgE 항체가 총 IgE 항체와 결합하게 되고, 나노 입자의 효소 모방 기능에 의하여 발색 기질이 발색을 하게 되어 총 IgE 항체의 양적 증가를 식별하여 알러지 여부를 진단할 수 있다.
본 발명에 의하여 제공되는 진단법을 이용하면, 시간에 따른 구조의 변성과 활성의 감소가 나타날 수 밖에 없는 유기효소를 사용하는 종래의 진단법에 비하여, 본 발명은 효소 활성을 모방하는 계층구조 형태의 플래티늄 나노입자(H-Pt 나노입자)를 사용하기 때문에 보다 안정적인 면역진단법을 제공할 수 있다. 본 발명은 종래의 유기효소 기반의 알러지 진단법에 대하여 효소 모방 나노입자를 적용한 최초 사례이다.
이하, 본 발명에서 사용하는 용어에 대하여 기술하고자 한다.
본 발명의 일 구체예에서 “알러지 질환”이란, 부종, 과민증(anaphylaxis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염, 두드러기, 곤충 알러지, 음식 알러지(food allergies), 알러지성 천식(allergic asthma) 및 약품 알러지 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서 “알러젠”(allergen)이란 알러지를 유발하는 항원을 의미하며, 목초류, 나무 껍질, 동물 상피나 털, 곤충, 진드기, 집먼지, 기생충, 미생물, 벌독, 약물, 직업성 알러젠류, 과일, 채소, 씨, 견과류, 향신료, 어패류, 알, 가금류, 육류, 유제품, 식품첨가물 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 우리나라에서 4가지 대표적인 알러젠(allergen)은 집먼지 진드기, 쑥 꽃가루, 고양이 털, 알터나리아 곰팡이이다. 알러젠의 종류에 대해서는 다음 표 1에 자세하게 정리하였다.
표 1 알러젠의 종류
분류 알러젠
목초 (Grass pollens) 갈대, 개나래새, 쇠미기풀, 귀리, 넓은잎김의털, 밀, 바히아그라스, 보리, 새귀리, 시리아수수새, 야생호밀풀, 갯보리, 오리새, 오차드그라스, 염생초, 옥수수, 왕포아풀, 우산잔디, 카나리아풀, 큰뚝새풀, 큰조아재비, 향기풀, 호밀, 호밀풀, 흰겨이삭, 흰털새, 가짜두드러기쑥, 개꽃, 긴이삭비름, 단풍잎돼지풀, 댑싸리, 도꼬마리, 돼지풀, 불란서국화, 마거리트, 명아주, 미역취, 민들레, 루핀, 비름, 사탕무, 서양 돼지풀, 소리쟁이, 솔장다리, 쐐기풀, 쑥, 쓴쑥, 애기수영, 유채, 자주개자리, 질경이, 카모마일, 펠리토리, 환삼덩굴, 해바라기, 습지양딱총나무, 갯능쟁이
나무 (Tree pollens) 가문비나무, 개암나무, 구주물푸레, 기름야자, 낙엽송, 너도밤나무, 네군도단풍, 느릅나무, 대추나무, 리브참나무, 린던, 메스키트, 무늬덧나무, 물푸레나무, 미루나무, 미국포플러, 미송, 밤나무, 백향목, 삼나무, 백화나무, 카유풋, 버드나무, 붉은뽕나무, 독뽕나무, 뽕나무, 사막보리수나무, 사이프러스, 측백나무, 서어나무, 소귀나무, 속나무, 소나무, 스트로브잣나무, 시다느릅나무, 아카시아, 양골담초, 여왕야자, 오리나무, 올리브나무, 유칼립투스, 일본삼나무, 자작나무, 적삼나무, 쥐똥나무, 지중해사이프러스, 참나무, 칠엽수, 마로니에, 팽나무, 페퍼트리, 펠로버디, 풍나무, 플라타너스, 피칸, 향나무, 호두나무, 호주소나무, 히코리
동물 (Epidermal and animal proteins) 개 비듬, 거위털, 게루빌루스쥐 상피, 고양이 비듬, 기니아피그상피, 녹색잉꼬 배설물, 녹색잉꼬 깃털, 닭털, 닭 배설물, 닭 혈청 단백질, 담비 상피, 돼지 상피, 말 비듬, 말 혈청 단백질, 밍크 상피, 비둘기 배설물, 비둘기 깃털, 사슴 상피, 소 비듬, 순록 상피, 생쥐 상피, 생쥐 뇨 단백질, 생쥐 혈청 단백질, 시궁쥐 상피, 시궁쥐 뇨 단백질, 시궁쥐 혈청 단백질, 양 상피, 여우털, 염소 상피, 오리털, 앵무새 깃털, 잉꼬 깃털, 잉꼬 배설물, 잉꼬 혈청 단백질, 친칠라 상피, 칠면조 깃털, 카나리아 배설물, 카나리아 깃털, 토끼 상피, 토끼 뇨 단백질, 토끼 혈청 단백질, 핀치 깃털, 햄스터 상피
곤충 (Insects) 곡물바구미, 깔따구, 나방, 딱정벌레, 말파리, 쇠등에, 모기, 바퀴벌레, 불개미, 실지렁이, 지중해밀가루명나방
진드기 (Mites) 집먼지진드기, 저장진드기
집먼지 집먼지
기생충 (Parasites) 고래회충, 회충
벌독 (Venoms) 꿀벌, 땅벌, 말벌(White-faced hornet), 말벌(Yellow hornet), 말벌(European hornet), 종이말벌(Paper wasp), 종이말벌(European paper wasp), 호박벌
약물 (Drugs) 아목시실린, 암피실린, 세파클로르, 클로르헥시딘, 키모파파인, 젤라틴, 인슐린, 페니실린, 폴코딘, 모르핀, 스키사메토늄
직업성 (Occupational) 부겐빌레아, 아주까리씨, 목화씨, 생커피콩, 폴리우레탄 (Isocyanate (TDI/MDI/HDI)), 라텍스, 비단, 명주실 부스러기, 해바라기 씨, Abachi wood dust, Alkalase, Maxatase, Savinase, Chloramin T, Ispaghula, Ethylene oxide, Formaldehydee/Formalin, Hexahydrophtalic anhydrid, Methyltetrahydrophtalic anhydrid, Phtalic anhydrid, Trimellitic anhydride
과일, 채소 (Friuts, Vegetables) 가지, 감, 감자, 고구마, 구아바, 근대, 당근, 대추, 들장미 열매, 딸기, 라임, 레몬, 마늘, 만다린, 망고, 멜론, 묏대추, 무화과, 미니양배추, 바나나, 바라밀, 배, 버찌, 복숭아, 붉은커런트, 브로콜리, 블랙베리, 블루베리, 사과, 산딸기, 살구, 상추, 셀러리, 수박, 시금치, 아보카도, 아스파라거스, 양배추, 양파, 리치, 오렌지, 오렴자, 오이, 올리브, 자두, 자몽, 죽순, 콜리플라워, 크랜베리, 키위, 토마토, 파인애플, 파파야, 패션푸르트, 포도, 호박, 회향
씨, 견과류 (Seeds, nuts) 개암/ 헤이즐넛, 귀리, 글루텐, 글리아딘, 껍질 콩, 땅콩, 렌즈콩, 루핀 씨, 리마빈, 마카다미아넛, 메밀, 밀, 밤, 병아리콩, 보리, 붉은 강낭콩, 브라질넛, 사탕무우 씨, 수수, 기장, 스펠트 밀, 아마 씨, 아몬드, 양귀비 씨, 옥수수, 완두콩, 유채 씨, 인도 완두콩, 잣, 조, 참깨, 캐슈넛, 코코넛, 콩, 퀴노아, 피스타치오, 피칸, 호두, 호로파, 호밀, 호박씨, 흰 강낭콩
향신료 (Spices) 겨자, 계피, 고수, elf, 러비지, 마조람, 메이스, 바닐라, 바질, 박하, 백두구, 백리향, 사프란, 사철쑥, 생강, 세이지, 아니스, 오레가노, 올스파이스, 월계수 잎, 정향, 칠리, 카레, 캐러웨이, 파슬리, 파프리카, 피망, 회향 씨, 후추
어패류 (Fish, shellfish, mollusks) 가리비, 가자미, 넙치, 가재, 강꼬치고기, 게, 광어, 굴, 농어, 고등어, 달팽이, 대구, 대하, 대합, 메기, 멸치, 명태, 문어, 바닷가재, 붉돔, 서대기, 새우, 송어, 연어, 오렌지너피, 오징어, 장어, 전갱이, 전복, 정어리, 참치, 청어, 틸라피아, 홍합, 황새치
알, 가금류 (Egg, fowl) 계란노른자, 계란흰자, 닭고기, 칠면조고기
육류 (Meat) 돼지고기, 말고기, 사슴고기, 소고기, 양고기, 토끼고기
유제품 (Milk) 산양유, 소 유장, 암말 젖, 양유, 양 유장, 우유, 체다 치즈, 몰드 치즈
식품첨가물 (Additives) 구아검, 아라비아고무, 캐럽, 코치닐, 트래거캔스
기타 식품류 (Miscellaneous) 꿀, 맥아, 버섯, 양송이, 차, 카카오, 커피, 홉, 효모
미생물류 (Microorganisms) Acremonium kiliense, Alternaria alternata, Aspergillus 림편, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aureobasidium pullulans, Botrytis cinerea, Candida albicans, Chaetomium globosum, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata, Epicoccum purpurascens, Fusarium proliferatum, Setomelanomma rostrata, Malassezia spp. Mucor racemo년, Penicillium chrysogenum, Penicillium glabrum, Phoma betae, Pityrosporum orbiculare, Rhizopus nigricans, Staphylococcal enterotoxins, Stemphylium herbarum, Tilletia tritici, Trichoderma viride, Trichophyton mentagrophytes var. goetzii, Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale, Trichophyton rubrum, Trichosporon pullulans, Ulocladium chartarum
본 발명의 일 구체예에서 “진단”(diagnosis)이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하여, 본 발명의 목적상 진단은 알러지 질환의 발병 여부를 확인하는 것이다. 본 발명에 있어서, 알러지 질환 진단은 검사 대상으로부터 채취한 혈액 시료에 포함된 ‘알러젠-특이적 IgE’ 혹은 ‘총 IgE’의 존재를 확인하는 방법으로 이루어질 수 있다.
본 발명에서 “효소 모방 나노 입자”는 철(Fe), 구리(Cu), 알루미늄(Al), 코발트(Co), 세륨(Ce), 니켈(Ni), 망간(Mn), 아연(Zn), 백금(Pt) 등의 금속으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 포함하는 나노 입자를 합성하고, 과산화효소 또는 산화효소 활성을 가지는 것을 선별하는 방법으로 만들어 질 수 있다. 더욱 구체적으로는 철산화물(Fe3O4)이나 백금(Pt)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 포함하는 나노 입자인 것이 바람직하다.
본 발명에서 “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 항체는, 본 발명의 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 더욱 구체적으로는 IgE(Immunoglobulin E, 면역글로불린 E)에 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체는 당업계에 통상적인 모노클로날 항체 제작 방법에 따라 발현 벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻은 후, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제작되어 사용될 수도 있고, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 또한, 모노클로날 항체 대신에 상기 단백질을 인식하는 폴리클로날 항체를 사용할 수도 있고, 이는 당업계에서 통상적인 항혈청 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있다. 또한 본 발명에서의 항체는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 보다 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함되며, 더 나아가 단백질이 아닌 염기서열로 구성된 압타머(aptamer)도 본 발명에서는 항체의 개념에 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 본 발명의 IgE 검출에 사용되는 항체는 2개 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(Heavy chain)를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에서 “IgE”(Immunoglobulin E)란 포유류의 면역반응 중 제1형 과민반응에 관여하는 항체로, 4개의 도메인을 가진 모노머 항체로서 알러지 반응에 중요한 역할을 하는 단백질이며, 본 발명에서는 알러지성 질환의 진단을 위한 마커 단백질로 사용한다.
본 발명에서 “알러젠 특이적 IgE”란 제1형 과민반응 중 특정 항원에 대하여 나타나는 면역글로불린으로, 그 항원에 대해 특이적인 IgE 급 항체가 비만세포나 호염기성 세포에 결합되어 유도된다. 이러한 유도 반응은 이들 세포가 만들어내는 매개물질의 종류와 양에 따라 국소적으로 또는 전신적으로 나타날 수 있다. 또한 이러한 반응은 항원이 들어온 지 한 시간 이내에 나타나기 때문에 즉각적인(immediate) 과민반응이라고도 부른다. 이러한 즉각적인 과민반응이 전신적으로 강하게 나타나는 경우를 아나필락시스라고 부르며, 심하면 질식과 순환계 이상으로 사망할 수도 있다. 그러나 같은 알러젠에 노출되더라도 사람에 따라 이 반응이 나타나지 않을 수도 있고 잘 나타날 수도 있기 때문에 이 반응을 특이체질반응이라는 뜻의 아토피라고 부르기도 한다.
본 발명에서 “시료”란 IgE 항체의 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 검사 대상으로부터 채취한 혈액의 혈청을 사용하였으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 “항원-항체 복합체”란 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 IgE의 정량 수준을 측정하기 위해 육안으로 확인하는 방법 이외에도, ELISA 방법을 이용할 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 예를 들어, 고체 지지체(진단 키트의 반응부 밑면)에 알러젠을 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원(시료 내에 포함된 알러젠-특이적 IgE)을 인지하는 효소 모방 나노 입자에 표지된 제1 항-IgE 항체를 결합시켜 효소적으로 발색시키거나, 고체 지지체에 제2 항-IgE 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원(시료 내에 포함된 총 IgE)을 인지하는 효소 모방 나노 입자에 표지된 제1 항-IgE 항체를 결합시켜 효소촉매 반응으로 발색시키는 방법에 의해서 검출할 수 있다. 검출된 항원-항체 복합체 형성 정도를 확인하여, 알러지성 질환을 진단할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “진단 키트”란, 특정한 목적을 위해 필요한 조성물 및 부속품들을 모아놓은 세트를 의미한다. 본 발명의 목적상 본 발명의 진단 키트는 알러지 질환의 발병 여부를 확인하는 것이다. 본 발명의 키트에는 알러지 질환 여부를 측정하기 위한 제1 항-IgE 항체가 포함된 효소 활성을 가진 효소 모방 나노 입자, 각각의 알러젠 혹은 제2 항-IgE 항체가 부착된 반응부가 포함된 고체 지지대, 과산화효소 등의 효소 활성을 측정할 수 있는 시약이 포함될 수 있으며, 그 외에 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “측면 유동 면역 발색칩”이란, 표적 물질을 포함하는 액상 시료가 다공성 매질을 통해 이동하면서 고정되 검출물질과 반응하여 육안으로 식별할 수 있도록 검출시 발색 신호를 나타내는 키트를 의미한다.
본 발명에서 “나노 입자”(Nano-particle)란, 1000 ㎚ 미만의 직경을 가지는 나노 단위의 임의의 입자를 말한다. 본 발명의 실시예에서 구체적으로는 상기 나노 입자는 10 내지 90 ㎚의 직경을 가진 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에서 “무기 나노 입자”란, 무기 성분을 포함하는 나노 입자를 의미한다. 상기 무기 물질은 무기, 무기 물질의산화물, 무기성 복합체일 수 있다. 상기 무기성 복합체는 예를 들어 금속과 함께 비금속, 세라믹, 플라스틱, 고분자, 생물학적 소재, 반도체, 양자점 들이 복합된 복합 재질일 수 있으며, 상기 복합 재질이라 함은 예를 들어, 내부는 세라믹이나 고분자와 같은 비금속 재질의 핵제가 들어 있고 외부는 무기 물질로 코팅된 입자일 수 있으며, 무기 입자의 표면에는 반응성 관능기나 분자체 등이 존재할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, “효소 모방 나노 입자”는 발색 기질을 산화시킬 수 있는 무기 나노 입자로서, 바람직하게는 철산화물(Fe3O4), 백금(Pt), 이들의 혼합물 등으로 이루어진 입자이다. 본 발명에 있어서 발색 기질은 효소 모방 ksh 입자가 산화촉매로 작용하여 산화 후 무기 나노 입자가 존재하는 위치에서 침전 및 불용화되면서 발색하면서 검출신호를 증폭시키게 된다. 본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 상기 발색 기질은 과산화 효소 모방 나노 입자일 경우, 3-amino-9-ethylcarbazole(AEC)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 나노 입자의 표면에는 검출 항체를 고정시킬 수 있는 기능기들이 존재할 수 있다. 상기 무기 나노 입자의 표면에 존재하는 기능기는 검출 항체의 고정 수단으로써 공유 결합 또는 이온성의 전기적 인력을 제공할 수 있는 카르복실산기(Carboxylic acid group)인 것이 바람직하다. 이 경우 IgE 항체에 풍부하게 존재하는 아민기(-NH2, amino group)를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 나노 입자는 액상에 포함되어 수 마이크로미터 직경의 모세관로를 통해서 측면 유동 면역 발색칩의 접합부로 이동할 수 있도록 단분산된 나노 입자인 것이 바람직하다. 본 발명에서 “단분산성”이란, 나노 입자의 크기와 구조가 균일한 정도를 나타내는 것으로서 J. Am. Chem. Soc. (Shouheng Sun 외, 단분산성의 MFe2O4 (M = Fe, Co, Mn) 나노입자 : 2004, Vol. 126, 273-279)의 종래 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 구체적인 실시예에서, 상기 단분산성 나노 입자의 합성은 유기 용매 내에서 계면활성제를 이용하여 단분산성을 향상시킨 합성법을 이용하여 제조될 수 있다.
이하, 본 별명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험예]
[실험 재료와 방법]
알러젠(allergen) 또는 항-IgE 항체가 결합되어 있는 고정상을 확보하기 위해 Phadia사의 ImmunoCAP을 이용하였으며, 검출 대상물질인 IgE 항체는 실제 환자 혈청 시료를 이용하였다. 또한 높은 촉매활성과 안정성을 지닌 계층구조 플래티늄 나노입자(Advanced Healthcare Materials, 2015, 4(9), 1311-1316)를 항-IgE 항체에 접합시켜 선택적으로 IgE 항체를 검출 및 정량 분석할 수 있는 고감도 알러지 진단법을 구현하였다. 정량 분석에는 sandwich 방식의 면역진단 방식을 채택하였다.
96-well plate에 ImmunoCAP을 놓고, ImmunoCAP의 코팅막을 제거하기 위해 인산완충생리식염수 200 μL를 분주한 후 30 분 동안 기다린다. 그 후 측정하고자 하는 검체(인간 혈청 시료)를 각 well에 분주하고 1시간 동안 반응시킨다. 반응하지 않은 물질을 0.05% tween-20을 포함하는 인산완충생리식염수로 3번 씻어낸다. 그 후 실시예 1에서 만든 항-IgE 항체-H-Pt 나노입자 결합체를 분주하고, 1 시간 동안 반응시킨다. 반응하지 않은 항-IgE 항체-H-Pt 나노입자 결합체를 인산완충생리식염수로 3 번 씻어낸다. 과산화수소 (H2O2)와 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) 그리고 아세트산 나트륨 완충용액 (pH 4.0)로 이루어진 발색시약을 250 μL를 분주하고 5 분간 반응시킨다. ImmunoCAP을 제거한 후, 각 용액 200 μL를 96-well plate에 옮기고, 96-well plate reader로 각 well 의 흡광도를 측정한다.
[실험 결과]
실제 현장(가천대학교 길병원)에서 제공한 혈청 내 총 IgE 항체와 특이 IgE 항체 농도 데이터를 본 발명의 나노자임에 기반한 면역진단을 통해 나온 데이터와 비교한 결과 거의 동일한 혈중 IgE 농도의 데이터를 얻을 수 있었다. 또한 각 데이터의 진단 신뢰성을 검증하기 위하여 표준편차(standard deviation)와 변동계수(coefficient of variation)를 분석하였다. 측정 정밀도를 나타내는 변동계수는 5개의 서로 다른 혈액 샘플에 대하여 낮은 수치(2.3~10.9%)를 보였으며, Recovery 값 또한 신뢰할 만한 값(95.4~104.7%)을 얻을 수 있었다(도 6, 도 7).
[실시예]
[실시예 1] 항-IgE 항체가 포함된 나노입자를 만드는 방법
(1) 철산화물 나노입자의 합성
철 산화물 나노입자는 공침방법(co-precipitation method)을 이용해 합성하였다. 0.4 g의 ferrous chloride와 1.1 g의 ferric chloride를 20 mL의 증류수에 넣고 열교반기에서 섞어주며 80℃까지 올려주었다. 80℃에서 28%의 ammonium hydroxide solution을 5 mL을 첨가한 후 한 시간동안 반응시켰다. 만들어진 자성나노입자를 자석을 이용해 끌어당기고 상층액을 제거한 뒤 에탄올과 증류수로 각각 3회씩 세척해주었다.
상기방법으로 합성된 자성나노입자는 자성을 띄어 별도의 원심분리과정 없이 자석을 이용해 쉽게 분리 및 회수할 수 있다는 장점이 있다. 또한 HRP(horseradish peroxidase)와 같은 유기 과산화효소처럼 H2O2가 존재할 때 과산화효소 기질을 산화시키는 시킬 수 있는 성질을 갖고 있어 기존 발색기질을 이용한 효소면역진단방법에 사용되는 유기효소를 효과적으로 대체할 수 있는 물질로 각광받고 있다.
(2) 계층 구조의 백금 나노입자(Hierarchically structured Pt nanoparticles)의 합성
백금 나노입자는 시드-성장 합성법을 통해 합성하였다. 232 mL의 끓는 증류수에 0.2%의 chloroplatinic acid hexahydrate 18 mL를 넣고 1분 후에 1%의 sodium citrate와 0.05%의 citric acid가 포함된 용액 5.5 mL를 넣었다. 30초 후에 0.08%의 sodium borohydrate 와 1%의sodium citrate, 0.05%의 citric acid가 포함된 용액 2.75 mL를 넣고 10분간 반응시킨 후, 5 ㎚ 크기의 백금 나노입자 시드가 포함된 시드용액를 얻었다. 위 시드용액과 증류수 1:9 비율(10 ml:90 ml)로 섞은 후 0.4 M chloroplatinic acid hexahydrate 0.05 mL와 sodium citrate 1%, lascorbic acid 1.25% 0.5 mL 첨가하여 10℃/분으로 끓는점까지 올리고 30분동안 유지하고 식힌다. 원심분리기로 20 분 동안 입자를 가라앉힌 후 (8000 rpm) 잔여반응물을 제거하기 위해 상층액을 제거하고 에탄올과 증류수로 3회 깨끗이 씻어 주었다.
상기 방법으로 합성된 백금 나노입자는 과산화효소의 활성뿐만 H2O2가 존재하지 않을 때도 용존 산소만으로 발색기질을 산화시킬 수 있는 산화효소 활성을 지니고 있다. 무엇보다 현재까지 발견된 금속나노입자 가운데 가장 강한 과산화효소 활성을 지니고 있어 각 종 발색진단법에 적용하였을 때 발색정도를 육안으로 확인할 수 있다. 또한 계층구조를 이루는 형태로 합성하여 단독으로 쓰였을 때보다 보다 강력한 활성을 보이는 나노입자로 합성이 가능하다.
(3) 항-IgE 항체에 H-Pt 나노입자 결합
알러지 진단용 효소 모방 나노입자는 상기 산화철을 포함하는 나노입자 또는 상기 백금을 포함하는 나노입자에 항-IgE 항체를 물리적으로 결합시켜서 만들 수 있다.
H-Pt 나노입자 (1.0 mg/mL)를 증류수로 두 번 씻고, 증류수 1 mL에 같은 농도로 분산시킨다. 증류수에 분산된 H-Pt 나노입자 용액 (1 mg/ml) 250 μL와 항-IgE 항체 (200 ㎍/mL) 250 μL를 혼합한다. 그 후 blocking agents (0.1% Tween-20와 3% 소혈청알부민을 포함하는 인산완충생리식염수) 500 μL를 혼합액에 첨가한다. 항-IgE 항체와 H-Pt 나노입자 간의 물리적 결합을 촉진시키기 위하여 4℃에서 24 시간 동안 진탕배양기에서 반응시킨다. 보관용액 (0.1% Tween-20와 3% 소혈청알부민을 포함한 인산완충생리식염수)로 3 번 씻어낸 후, 같은 보관용액에 분산시켜 4℃에 보관한다.
위 방법을 통해 항-IgE 항체가 H-Pt 나노입자에 얼마나 효과적으로 접합되었는지를 확인하기 위해서 세척과정 전에 원심분리를 통해 H-Pt 나노입자와 수식되지 않은 항-IgE 항체를 분리하고, 수식되지 않은 항-IgE 항체가 녹아있는 상층액을 BCA protein assay를 통해 분석한 결과 약 90%의 항-IgE 항체가 H-Pt 나노입자에 수식되어 있다는 것을 확인하였다.
[실시예 2] 측면유동 면역진단키트로서의 이용
(1) 항원과 항-IgE 항체가 코팅된 막(membrane)의 준비
도 8의 모식도와 같이 측면 유동 면역 진단칩을 준비하였다. 상기 알러지 항원 단백질(고정물질, 620)을 반응부의 검사선(test line)으로 사용하였고, IgE 항체를 대조부의 대조군선(control line)으로 사용하였다. 알러지 항원 단백질을 1mg/ml이 되도록 인산완충생리식염수(pH7.4)에 희석하고 지지체(600)인 니트로셀룰로스 막의 반응부에 디스펜서를 이용하여 코팅하였다. 상기 알러지 항원 단백질은 표적 물질이 총 IgE 항체인 경우에는 항-IgE 항체를 사용하며, 표적 물질이 알러젠-특이적 IgE 항체인 경우에는 알러젠을 사용할 수 있다. 여기에서 나노 입자에 결합된 항-IgE 항체와 고정 물질로 사용되는 항-IgE 항체는 IgE 항체에 대하여 서로 다른 epitope를 가지고 있으며 IgE를 사이에 두고 동시에 삼자간 결합이 가능하다. 서로 구분을 하기 위하여 나노 입자에 있는 항-IgE 항체를 제1 항-IgE 항체로, 고정 물질로 사용되는 항-IgE 항체를 제2 항-IgE 항체로 명명하기로 한다.
분사된 니트로셀룰로스 막을 제습기가 설치된 보관함(desiccator)에서 12시간동안 건조하였다. 또한 대조군선에 1mg/mL의 농도로 희석한 IgE 항체 용액을 상기 방법과 같이 코팅하고 건조하였다.
(2) 항-IgE 항체-H-Pt 나노입자 접합부(결합체 패드, 500)의 준비
실시예 1에서 제조한 항-IgE 항체-H-Pt 나노입자(520)를 수크로오스와 소혈청알부민이 포함된 인산완충생리식염수(pH7.4)에 1mg/mL의 농도가 되도록 희석하고 유리섬유에 코팅한 뒤 건조하여 접합부를 준비하였다. 접합부에서는 상기 나노 입자(520)와 시료(700) 내의 표적 물질(720)인 총 IgE 항체 혹은 알러젠-특이적 IgE 항체가 접합하여 결합하게 된다.
(3) 샘블부(샘플 패드, 300)와 흡수부(흡수 패드, 400)의 준비
샘플 패드(300)와 흡수 패드(400)는 반응용액이 잘 흡수될 수 있도록 건조하여 제조하였다. 샘플 패드(300)에 시료(700)가 주입된 뒤, 상기 시료(700)는 상기 샘플부(300)로부터 상기 접합부(500)를 거쳐서 모세관 현상에 의하여 상기 지지체(600) 위의 상기 반응부와 상기 대조부를 거쳐서 상기 흡수부(400)로 이동하게 된다.
(4) 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩 조립
상기에서 제조된 검사선 및 대조군선이 코팅된 니트로셀룰로스 막(600)과 패드들을 지지대(백킹 패드) 위에 검체 패드, 니트로셀룰로스 막, 마지막으로 흡수 패드 순으로 중첩되게 접합하고, 플라스틱 하판과 상판으로 구성된 하우싱에 조립하여 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩을 제조하였다.
(5) IgE 항체 검출 및 진단 과정
상기 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩을 이용하여 시료 속의 표적 물질인 총 IgE 항체 또는 알러젠-특이적 IgE 항체를 검출한다. 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 나노 입자 표면에 표지된 제1 항-IgE 항체를 통하여 상기 시료 속의 상기 총 IgE 항체 또는 알러젠-특이적 IgE 항체와 결합하고, 상기 총 IgE 항체 또는 알러젠-특이적 IgE 항체는 상기 면역 발색칩의 반응부에 있는 고정 물질인 제2 항-IgE 항체 또는 알러젠과 결합하게 되면, 상기 효소 모방 나노 입자는 발색기질과 반응하여 검출 신호를 증폭시키게 된다. 증폭된 상기 검출 신호로부터 상기 시료 내에 총 IgE 항체 또는 알러젠-특이적 IgE 항체의 존재를 알게 되고, 알러지 질환 진단에 관한 정보를 제공하게 된다. 반응부 외에 별도로 대조부를 두어 대조군 물질로 IgE를 고정시켜 두면 시료 내에 IgE 항체가 없더라도 상기 나노 입자의 제1 항-IgE 항체가 대조군 물질인 상기 IgE와 결합하게 되어 신호가 증폭되어 나타나므로 상기 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩이 제대로 작동하고 있는지 오류 여부를 체크할 수 있다.
또한, 상기 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩의 상기 반응부를 상기 면역 발색칩 위에 여러 구간으로 나누어 구획화시키고, 각 구획마다 다른 알러젠을 위치하여 한번에 여러 알러젠에 대한 알러젠-특이적 IgE 항체의 존재 유무를 검사할 수 있다. 이 방법에 의하면, 피검자에게 고통을 초래하는 피부 검사법 대신에 편하고 손쉽게 알러젠-특이적 IgE 항체의 존재를 통하여, 피검자가 어떤 알러젠에 알러지 반응을 보이는지 확인할 수 있으며 피검자의 알러지 질환 진단에 관한 정보를 제공하게 된다.
[실시예 3] 효소면역측정법으로서의 이용
(1) 알러지 항원 또는 항-IgE 항체가 고정된 알러지 진단용 Immunoplate 키트 준비
혈중 특이 IgE 항체를 진단할 수 있는 효소면역측정법을 위해 알러지 항원이 고정된 Immunoplate를 제작하였다.
알러지 항원이 고정된 Immunoplate를 제작하기 위해 다양한 농도의 알러지 항원(알러젠, 620)을 하나의 well 당 100μL씩 분주하고, 12~16시간동안 4℃에서 보관하여 충분히 반응시켰다. 보관 후 결합하지 않은 항원을 제거하기 위해 Immunoplate를 0.05% tween-20을 포함하는 인산완충생리식염수로 3번 세척하였다. 그 후 1% 소혈청알부민이 포함된 인산완충생리식염수를 각 well당 100μL씩 분주하여 2시간동안 반응시킴으로서 항원이 결합되지 않은 부분을 차단(blocking)하였다.
(2) 항-IgE 항체-H-Pt 나노입자 용액 준비
시료(700) 내의 표적 물질(알러젠-특이적 IgE, 720)을 Immunoplate에 부착되어 있는 고정 물질(620)에 결합시킨 뒤, IgE 항체에 선택적으로 결합하는 항-IgE 항체-H-Pt 나노입자 결합체(520)를 1mg/ml 농도로 희석하여 준비하였다. 상기 시료(혈청이나 혈장 등)를 Immunoplate에 분주한 뒤 37℃에서 약 6시간동안 반응하고 세척과정을 거친 뒤에, 상기 준비된 용액을 분주하였고 37℃에서 약 6시간동안 반응시켰다.
(3) 발색진단시약 준비
IgE에 결합되지 않은 항-IgE 항체-H-Pt 나노입자를 제거하기 위해 세척과정을 거치고, 발색진단을 위한 시약을 준비하였다.
효소면역진단용 TMB (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine liquid substrate system for ELISA, Sigma사 제품)와 1M 과산화수소 (H2O2)를 아세트산 나트륨 완충용액 (pH4.0)과 7:1:2 비율로 섞어 발색진단시약을 제조하고, 100μL씩 각 well에 분주한다. 최종적으로 45℃에서 20분간 반응시킨 후 육안으로 발색신호를 확인하였고, ELISA 측정기의 흡광도 측정을 통해 발색신호를 확인하였다.
(4) IgE 항체 검출 및 진단 과정
상기 알러지 진단용 Immunoplate 키트를 이용하여 시료 내의 표적 물질인 총 IgE 항체 또는 알러젠-특이적 IgE 항체를 검출한다. 시료 내의 상기 총 IgE 항체 또는 알러젠-특이적 IgE 항체는 상기 Immunoplate의 각 well에 있는 고정 물질인 제2 항-IgE 항체 또는 알러젠과 결합하고, 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 나노 입자 표면에 표지된 제1 항-IgE 항체를 통하여 상기 시료 속의 상기 총 IgE 항체 또는 알러젠-특이적 IgE 항체와 결합하게 되면, 상기 효소 모방 나노 입자는 발색기질과 반응하여 검출 신호를 증폭시키게 된다. 증폭된 상기 검출 신호로부터 상기 시료 내에 총 IgE 항체 또는 알러젠-특이적 IgE 항체의 존재를 알게 되고, 알러지 질환 진단에 관한 정보를 제공하게 된다. 대조군 물질로써 시료 대신에 IgE 항체를 고정시켜 두면 시료 내에 IgE 항체가 없더라도 상기 나노 입자의 제1 항-IgE 항체가 대조군 물질인 상기 IgE 항체와 결합하게 되어 신호가 증폭되어 나타나므로 상기 알러지 진단용 Immunoplate 키트가 제대로 작동하고 있는지 오류 여부를 체크할 수 있다.
또한, 상기 알러지 진단용 Immunoplate의 각 well마다 다른 알러젠을 위치하여 한번에 여러 알러젠에 대한 알러젠-특이적 IgE 항체의 존재 유무를 검사할 수 있다. 이 방법에 의하면, 피검자에게 고통을 초래하는 피부 검사법 대신에 편하고 손쉽게 알러젠-특이적 IgE 항체의 존재를 통하여, 피검자가 어떤 알러젠에 알러지 반응을 보이는지 확인할 수 있으며 피검자의 알러지 질환 진단에 관한 정보를 제공하게 된다.
이상으로 본 발명의 실시예를 상세히 기술하였다. 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (49)

  1. 표면에 제1 항-IgE 항체가 물리적 결합에 의해 표지되고, 단분산성이며, 발색 기질을 산화시키는 무기 금속 촉매를 포함하는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 무기 금속 촉매는 과산화효소 또는 산화효소의 효소 모방 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 무기 금속 촉매는 상기 발색 기질을 침전하거나 불용화시키는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 무기 금속 촉매는 산화철(Fe3O4)를 포함하는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 무기 금속 촉매는 자성을 가지고 있으며, 상기 자성을 이용하여 세척, 분리, 회수되는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 무기 금속 촉매는 백금(Pt)을 포함하는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 무기 금속 촉매는 계층 구조를 이루는 형태로 합성된 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 단분산성을 가지는 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 유기용매환경에서 계면활성제를 사용하여 크기가 균일하게 조절되어 단분산성으로 합성되는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 상기 나노 입자의 표면을 카르복실산으로 치환하고, 상기 제1 항-IgE 항체는 상기 카르복실산의 카르복실기와 반응하여 상기 나노 입자에 결합되며, 치환된 무기 나노 입자와 상기 제1 항-IgE 항체를 생리 식염수에 고르게 분산시켜 고정시키는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자.
  10. 접합부에 제1 항-IgE 항체를 포함하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 존재하고, 반응부에 시료의 표적 물질과 결합할 수 있는 고정 물질이 존재하는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 시료의 표적 물질은 총 IgE 항체이고, 상기 고정 물질은 제2 항-IgE 항체인 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩.
  12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서,
    상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자의 표면에 표지된 상기 제1 항-IgE 항체는 상기 시료의 표적 물질인 상기 총 IgE 항체와 결합하고 총 IgE 항체는 상기 반응부의 고정 물질인 상기 제2 항-IgE 항체와 결합함에 의하여, 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 반응부에 고정되고, 발색기질과 반응하여 검출 신호를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩.
  13. 제 10항에 있어서,
    상기 시료의 표적 물질은 알러젠-특이적 IgE 항체이고, 상기 고정 물질은 알러젠(allergen)인 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩.
  14. 제 10항 또는 제 13항에 있어서,
    상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자의 표면에 표지된 상기 제1 항-IgE 항체는 상기 시료의 표적 물질인 상기 알러젠-특이적 IgE 항체와 결합하고 알러젠-특이적 IgE 항체는 상기 반응부의 고정 물질인 상기 알러젠과 결합함에 의하여, 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 반응부에 고정되고, 발색기질과 반응하여 검출 신호를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩.
  15. 제 13항에 있어서,
    상기 알러젠은 목초류, 나무 껍질, 동물 상피나 털, 곤충, 진드기, 집먼지, 기생충, 미생물, 벌독, 약물, 직업성 알러젠류, 과일, 채소, 씨, 견과류, 향신료, 어패류, 알, 가금류, 육류, 유제품, 식품첨가물 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 물질인 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩.
  16. 제 10항에 있어서,
    상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 단분산성 무기 나노 입자이고, 상기 단분산성 무기 나노 입자는 유기용매환경에서 계면활성제를 사용하여 크기가 균일하게 조절되어 단분산성으로 합성되는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩.
  17. 제 10항에 있어서,
    상기 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨를 포함하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩.
  18. 제 10항에 있어서,
    상기 제1 항-IgE 항체를 포함하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 상기 나노 입자의 표면을 카르복실산으로 치환하고, 상기 제1 항-IgE 항체는 상기 카르복실산의 카르복실기와 반응하여 상기 나노 입자에 결합된 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩.
  19. 제 10항에 있어서,
    상기 제1 항-IgE 항체를 포함하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 산화철, 백금으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자 중 상기 백금을 포함하는 나노 입자는 계층 구조를 이루는 형태로 합성된 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩.
  21. 제 10항에 있어서,
    상기 제1 항-IgE 항체를 포함하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자의 표면에 표지된 상기 제1 항-IgE 항체가 반응부의 지지체 위에 고정된 상기 고정 물질에 결합되는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩.
  22. 제 10항에 있어서,
    상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 과산화효소 또는 산화효소의 효소 모방 활성을 가지며, 상기 발색 기질의 산화 촉매인 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 상기 발색 기질을 침전 또는 불용화시키는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 발색 기질은 3-아미노-9-에틸카바졸(3-amino-9-ethylcarbazole)인 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩.
  25. 제 10항에 있어서,
    상기 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩은 표적 물질을 포함하는 시료가 투입되는 샘플부, 제1 항-IgE 항체를 포함하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 존재하며 상기 나노 입자의 상기 제1 항-IgE 항체가 상기 표적물질과 접합하여 결합할 수 있는 접합부, 시료의 표적 물질과 결합할 수 있는 고정 물질이 존재하는 반응부, 오류 확인을 위하여 대조군 물질이 존재하는 대조부, 액체 시료를 모세관 현상에 의하여 흡수할 수 있는 흡수부를 포함하고 있으며, 상기 시료는 상기 샘플부로부터 상기 접합부를 거쳐서 모세관 현상에 의하여 지지체 위의 상기 반응부와 상기 대조부를 거쳐서 상기 흡수부로 이동하는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 대조부에는 대조군 물질로 IgE 항체가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩.
  27. 제 25항에 있어서,
    상기 고정 물질은 알러젠이고, 상기 시료에 포함된 표적 물질은 알러젠-특이적 IgE 항체이며, 상기 반응부는 여러 구간으로 구획이 나뉘어져 있어서 각 구간마다 다른 종류의 알러젠이 고정되어 있는 것을 특징으로 하며, 상기 여러 구간에 있는 각각의 상기 알러젠에 대한 상기 시료에 포함된 상기 알러젠-특이적 IgE 항체의 존재를 한 번의 검사로써 동시에 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩.
  28. 제 10항에 있어서,
    상기 알러지는 부종, 과민증(anaphylaxis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염, 두드러기, 곤충 알러지, 음식 알러지(food allergies), 알러지성 천식(allergic asthma) 또는 약품 알러지 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 알러지 질환인 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩.
  29. (1) 제 10항 또는 제 11항의 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩을 이용하여 시료 속의 표적 물질인 총 IgE 항체를 검출하는 단계; 및
    (2) 상기 총 IgE 항체와 결합된 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 발색기질과 반응하여 검출 신호를 증폭시키는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 총 IgE 검출 방법.
  30. (1) 제 10항 또는 제 13항의 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩을 이용하여 시료 속의 표적 물질인 알러젠-특이적 IgE 항체를 검출하는 단계; 및
    (2) 상기 알러젠-특이적 IgE 항체와 결합된 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 발색기질과 반응하여 검출 신호를 증폭시키는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 알러젠-특이적 IgE 검출 방법.
  31. (1) 제 10항 또는 제 13항의 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩을 이용하여 시료 속의 표적 물질인 알러젠-특이적 IgE 항체를 검출하는 단계;
    (2) 상기 알러젠-특이적 IgE 항체와 결합된 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 발색기질과 반응하여 검출 신호를 증폭시키는 단계;
    (3) 증폭된 상기 검출 신호로부터 상기 알러젠-특이적 IgE 항체와 결합된 고정 물질인 알러젠을 확인하는 단계; 및
    (4) 상기 알러젠의 정체(identity)를 확인하여 알러지 질환을 판정하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 알러젠-특이적인 알러지 질환 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  32. 제 10항의 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩을 제조하는 방법에 있어서,
    (1) 표면에 제1 항-IgE 항체가 물리적 결합에 의해 표지되고, 발색 기질을 산화시키는 무기 금속 촉매를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자를 합성하는 단계;
    (2) 표적 물질을 포함하는 시료가 투입되는 샘플부, 제1 항-IgE 항체를 포함하는 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 위치하는 접합부, 상기 샘플부에 투입된 상기 시료의 표적 물질과 결합할 수 있는 고정 물질이 존재하는 반응부, 상기 반응부 측면에 오류 확인을 위하여 대조군 물질로 IgE 항체가 고정되어 있는 대조부, 액체 시료를 모세관 현상에 의하여 흡수할 수 있는 흡수부를 지지체 위에 조립하는 단계;
    를 포함하는 알러지 진단용 측면 유동 면역 발색칩 제조 방법.
  33. (1) Immunoplate의 well에 시료의 표적 물질과 결합할 수 있는 고정 물질을 고정시키는 단계;
    (2) 표적 물질이 존재하는 시료를 상기 Immunoplate의 각 well에 분주하여 상기 고정 물질과 상기 표적 물질을 결합시키는 단계;
    (3) 표면에 제1 항-IgE 항체가 표지된 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자를 상기 Immunoplate의 각 well에 분주된 표적물질과 결합시키는 단계; 및
    (4) 상기 제1 항-IgE 항체가 상기 표적 물질을 통하여 상기 고정 물질과 결합한 후, 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 발색기질과 반응하여 검출 신호를 증폭시키는 단계;
    를 포함하는 알러지 진단용 Immunoplate 방법.
  34. 제 33항에 있어서,
    상기 시료의 표적 물질은 총 IgE 항체이고, 상기 고정 물질은 제2 항-IgE 항체인 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 Immunoplate 방법.
  35. 제 33항에 있어서,
    상기 시료의 표적 물질은 알러젠-특이적 IgE이고, 상기 고정 물질은 알러젠(allergen)인 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 Immunoplate 방법.
  36. 제 35항에 있어서,
    상기 알러젠은 목초류, 나무 껍질, 동물 상피나 털, 곤충, 진드기, 집먼지, 기생충, 미생물, 벌독, 약물, 직업성 알러젠류, 과일, 채소, 씨, 견과류, 향신료, 어패류, 알, 가금류, 육류, 유제품, 식품첨가물 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 물질인 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 Immunoplate 방법.
  37. 제 35항에 있어서,
    Immunoplate의 각 well마다 다른 종류의 상기 알러젠이 고정되어 있어서 각각의 상기 알러젠에 대한 상기 알러젠-특이적 IgE 항체의 존재를 한 번의 검사로써 동시에 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 Immunoplate 방법.
  38. 제 33항에 있어서,
    상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 단분산성 무기 나노 입자이고, 상기 단분산성 무기 나노 입자는 유기용매환경에서 계면활성제를 사용하여 크기가 균일하게 조절되어 단분산성으로 합성되는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 Immunoplate 방법.
  39. 제 33항에 있어서,
    상기 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨를 포함하는 알러지 진단용 Immunoplate 방법.
  40. 제 33항에 있어서,
    상기 제1 항-IgE 항체를 포함하는 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 상기 나노 입자의 표면을 카르복실산으로 치환하고, 상기 제1 항-IgE 항체는 상기 카르복실산의 카르복실기와 반응하여 상기 나노 입자에 결합된 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 Immunoplate 방법.
  41. 제 33항에 있어서,
    상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 산화철, 백금으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 Immunoplate 방법.
  42. 제 41항에 있어서,
    상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자 중 상기 백금을 포함하는 나노 입자는 계층구조를 이루는 형태로 합성되는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 Immunoplate 방법.
  43. 제 33항에 있어서,
    상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 과산화효소 또는 산화효소의 효소 모방 활성을 가지며, 상기 발색 기질의 산화 촉매인 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 Immunoplate 방법.
  44. 제 43항에 있어서,
    상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자는 상기 발색 기질을 침전 또는 불용화시키는 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 Immunoplate 방법.
  45. 제 44항에 있어서,
    상기 발색 기질은 3-아미노-9-에틸카바졸(3-amino-9-ethylcarbazole)인 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 Immunoplate 방법.
  46. 제 33항에 있어서,
    상기 알러지는 부종, 과민증(anaphylaxis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염, 두드러기, 곤충 알러지, 음식 알러지(food allergies), 알러지성 천식(allergic asthma) 또는 약품 알러지 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 알러지 질환인 것을 특징으로 하는 알러지 진단용 Immunoplate 방법.
  47. 제 33항의 알러지 진단용 Immunoplate 방법을 수행하기 위한 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자와, 시료의 표적 물질과 결합할 수 있는 상기 고정 물질을 포함하고 있는 조성물을 포함하는 알러지 진단용 Immunoplate 키트.
  48. 제 47항에 있어서,
    Immunoplate의 각 well마다 다른 종류의 상기 알러젠이 고정되어 있어서 각각의 상기 알러젠에 대한 상기 알러젠-특이적 IgE 항체의 존재를 한 번의 검사로써 동시에 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 Immunoplate를 더 포함하는 알러지 진단용 Immunoplate 키트.
  49. (1) 제 47항의 알러지 진단용 Immunoplate 키트를 이용하여 시료 속의 표적 물질인 알러젠-특이적 IgE 항체를 검출하는 단계;
    (2) 상기 알러젠-특이적 IgE 항체와 결합된 상기 알러지 진단용 효소 모방 나노 입자가 상기 발색기질과 반응하여 검출 신호를 증폭시키는 단계;
    (3) 증폭된 상기 검출 신호로부터 상기 알러젠-특이적 IgE 항체와 결합된 고정 물질인 알러젠을 확인하는 단계; 및
    (4) 상기 알러젠의 정체(identity)를 확인하여 알러지 질환을 판정하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 알러젠-특이적인 알러지 질환 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
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