CN115820242A

CN115820242A - 一种超稳定高亮度量子点荧光微球及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115820242A
Application number: CN202310010930.4A
Authority: CN
Inventors: 邓大伟; 张伟; 赵晓敏
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2023-01-05
Filing date: 2023-01-05
Publication date: 2023-03-21

Abstract

本发明公开了一种超稳定高亮度量子点荧光微球及其制备方法和应用，属于荧光标记技术领域，所述制备方法包括：合成具有中心径向孔径的树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒dSiO2；对合成的二氧化硅纳米颗粒dSiO2进行表面氨基化处理；对合成的氨基化介孔二氧化硅再次进行修饰；利用上述步骤得到的微球原位生长CdTe量子点荧光微球。另一方面本申请公开了所述超稳定高亮度量子点荧光微球在PCT样品免疫层析检测中的应用。本申请所提供的超稳定高亮度的量子点荧光微球的制备方法，使量子点荧光微球合成后表面自带二氧化硅涂层，同时具有强荧光性能，无需进一步修饰以提高其稳定性，且在强酸、强碱条件下保存一段时间仍能保持高稳定性。

Description

一种超稳定高亮度量子点荧光微球及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于荧光标记技术领域，具体涉及一种超稳定高亮度量子点荧光微球及其制备方法和应用。

背景技术

免疫层析过程采用抗原抗体标记试剂，通过对疾病标志物的特异性识别与结合可以实现对疾病的快速诊断。但是在现有技术中，如免疫层析常用的抗原抗体标记试剂的胶体金和染料/量子点微球，存在灵敏度低、血液样本中干扰性高即相对荧光强度低的技术问题。

量子点作为一种新型的荧光标记材料，具有宽激发、窄发射峰且耐光漂白的优良性质，然而量子点本身粒径小、表面能高等缺点限制了其应用。目前可重复、有效的量子点荧光编码微球制备方法包括四种：（i）在微球的纳米孔隙中掺杂量子点；（ii）依靠静电力的层层自组装（LBL）；（iii）在微球的聚合过程中填装量子点；（iv）利用硅化学方法制备包覆量子点的二氧化硅微球。其中纳米结构的二氧化硅包覆材料由于容易制备，且可方便地与生物分子耦联从而在生物分析上具有广阔的应用前景。

为获得更高质量的量子点荧光微球，精确控制半导体量子点（QD）的荧光特性和量子点荧光微球的尺寸、形状、组成和表面性质是极有必要的。目前，树枝状二氧化硅胶体（dSiO₂）已被开发用于包裹大颗粒，如刚性大分子或纳米颗粒，树枝状二氧化硅胶体具有规则的中心-径向孔道和极大的孔径，非常适合于纳米组分的均匀组装。本发明采用巯基化合物修饰氨基化的树枝状介孔二氧化硅，然后在巯基化介孔二氧化硅上原位生长量子点，形成量子点荧光微球。

发明内容

本发明的目的在于提供一种超稳定高亮度量子点荧光微球及其制备方法和应用，通过在微球表面自带二氧化硅涂层，进而无需进一步修饰以提高量子点荧光微球的稳定性。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种超稳定高亮度量子点荧光微球的制备方法，包括如下步骤：

步骤S1：合成具有中心径向孔径的树枝状的介孔二氧化硅纳米颗粒dSiO2；

步骤S2：对步骤S1合成的二氧化硅纳米颗粒dSiO2进行表面氨基化处理；

步骤S3：对步骤S2中合成的氨基化介孔二氧化硅再次进行修饰；

步骤S4：利用步骤S3得到的微球原位生长CdTe量子点荧光微球。

进一步的，所述步骤S1中合成介孔二氧化硅的方法为：在去离子水中加入三乙醇胺，搅拌条件下加入十六烷基三甲基溴化铵和水杨酸钠进行反应；再加入正硅酸乙酯继续反应，反应结束用乙醇稀释，离心收集并纯化；再分散于盐酸/甲醇混合溶液中加热回流反应，以除去模板剂十六烷基三甲基溴化铵；最后离心纯化，得到具有中心径向孔径的树枝状二氧化硅纳米颗粒。

进一步的，所述步骤S2中利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷和氢氧化铵对合成的二氧化硅纳米颗粒进行表面氨基化处理。

进一步的，所述步骤S3中利用3-巯基丙酸修饰介孔二氧化硅。

根据本发明的另一方面，提供一种由上述制备方法制备得到的超稳定高亮度量子点荧光微球，包括二氧化硅纳米颗粒及原位生长在带有3-巯基丙酸的氨基化介孔二氧化硅上的CdTe量子点。

进一步的，量子点荧光微球的发射波长在可见光至近红外可调。

根据本发明的另一个方面，还提供所述超稳定高亮度量子点荧光微球在PCT样品免疫层析检测中的应用。

本发明提供的一种超稳定高亮度量子点荧光微球制备方法使用具有中心径向孔径的树枝状二氧化硅纳米颗粒为载体，提供了大量的内部空间用于量子点组装，通过对其进行氨基化处理和3-巯基丙酸再次修饰，使量子点荧光微球合成后表面自带二氧化硅涂层，无需进一步修饰以提高其稳定性，且经实验表明，其在强酸、强碱条件下保存一段时间仍能保持高稳定性；同时该量子点微球具有强荧光性能。

附图说明

图1为本发明的超稳定高亮度量子点荧光微球合成示意图；

图2a-2c为实施例1中制备的超稳定高亮度量子点荧光微球的透射电镜图；

图3a为实施例1中制备的多色超稳定高亮度量子点荧光微球的荧光发射光谱；图3b为实施例1中制备的多色超稳定高亮度量子点荧光微球的紫外-可见吸收光谱；

图4a为实施例1中制备的超稳定高亮度量子点荧光微球的红外光谱；图4b为实施例1中制备的超稳定高亮度量子点荧光微球的红外光谱zeta电位；

图5为实施例1中制备的超稳定高亮度量子点荧光微球与传统通过静电吸附制备的量子点荧光微球的荧光强度随储存时间的变化曲线；

图6为实施例1中制备的超稳定高亮度量子点荧光微球与传统通过静电吸附制备的量子点荧光微球的荧光强度在不同NaCl浓度下的荧光曲线；

图7为实施例1中制备的超稳定高亮度量子点荧光微球与传统通过静电吸附制备的量子点荧光微球的荧光强度在不同pH下的荧光曲线；

图8a为实施例1中制备的超稳定高亮度量子点荧光微球在pH1强酸条件下储存7天，在紫外灯下随时间的变化照片；图8b为实施例1中制备的超稳定高亮度量子点荧光微球在pH1强酸条件下储存7天的荧光发射光谱；图8c为实施例1中制备的超稳定高亮度量子点荧光微球在pH1强酸条件下储存7天的紫外吸收变化曲线；

图9a为实施例1中制备的超稳定高亮度量子点荧光微球在pH14强碱条件下储存7天，在紫外灯下随时间的变化照片；图9b为实施例1中制备的超稳定高亮度量子点荧光微球在pH14强碱条件下储存7天的荧光发射光谱；图9c为实施例1中制备的超稳定高亮度量子点荧光微球在pH14强碱条件下储存7天的紫外吸收变化曲线；

图10a为用二氢硫辛酸、谷胱甘肽、L-半胱氨酸修饰的氨基化介孔二氧化硅原位生长的CdTe量子点荧光微球的荧光发射光谱；图10b为用二氢硫辛酸、谷胱甘肽、L-半胱氨酸修饰的氨基化介孔二氧化硅原位生长的CdTe量子点荧光微球的紫外吸收光谱；

图11为通过实施例1制备的发射为620nm的超稳定高亮度量子点荧光微球与传统通过静电吸附制备的量子点荧光微球在免疫层析试纸条中的比较实例。

具体实施方式

为了相关技术领域人员更好的理解本发明专利的内容，下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的内容不限于下述的实例。

实施例1：

1. 超稳定高亮度量子点荧光微球的制备

图1为超稳定高亮度量子点荧光微球合成过程的示意图。具体制备流程如下：

1）介孔二氧化硅的合成：称取三乙醇胺68 mg溶于25 mL去离子水中，在80℃下搅拌30 min，随后加入380 mg十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和68 mg水杨酸钠继续反应1 h，再加入4 mL 正硅酸乙酯（TEOS）继续反应2 h，反应结束用乙醇稀释，离心收集并用乙醇纯化。再分散于盐酸/甲醇混合溶液中，于60℃加热回流反应6 h，该步骤重复三次，以除去模板剂CTAB。最后乙醇离心纯化3次。

2）介孔二氧化硅微球的表面氨基化处理：将步骤1）中合成的介孔二氧化硅取1 g分散于50 mL乙醇溶液中，向溶液体系中加入500 μL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）和2 mL氢氧化铵，室温下反应12 h，最后离心收集，乙醇洗涤纯化3次，离心后沉淀冷冻干燥。

3）氨基化的介孔二氧化硅的表面修饰：取3-巯基丙酸30 mg，用EDC/NHS溶液活化30 min，称取50 mg氨基化的介孔二氧化硅加入上述溶液，实现表面修饰。

4）CdTe量子点前体的制备

a.合成碲氢化钠前体：取适量硼氢化钠溶于水，在氮气保护下加入127 mg碲粉反应30分钟获得NaHTe溶液，置于4℃保存；

b.镉前体溶液的制备：取366 mg无水氯化镉，3-巯基丙酸溶于100 mL水中，用氢氧化钠溶液将pH调至碱性，制成镉前体溶液；

5）超稳定高亮度量子点荧光微球的合成：将上述制备的巯基化介孔二氧化硅、碲氢化钠前体和镉前体混合均匀，置于聚四氟乙烯水热反应釜中，180℃反应数小时。

图2为制备的超稳定高亮度量子点荧光微球的透射电镜图。图3为制备的1mg/mL多色超稳定高亮度量子点荧光微球的荧光发射和紫外吸收光谱。图4为制备的超稳定高亮度量子点荧光微球的红外吸收光谱图和zeta电位。图10为用二氢硫辛酸（DHLA）、谷胱甘肽(GSH)、L-半胱氨酸(L-Cys)修饰的氨基化介孔二氧化硅原位生长的CdTe量子点荧光微球的荧光发射和紫外吸收光谱。

实施例2：超稳定高亮度量子点荧光微球的性能检测

1）图5为1mg/mL超稳定高亮度量子点荧光微球与传统通过静电吸附制备的量子点荧光微球随储存时间的荧光变化曲线。根据图5测试结果，超稳定高亮度量子点荧光微球储存12周，荧光强度基本保持不变，而传统通过静电吸附制备的量子点荧光微球在储存12周后，荧光强度略有下降。

2）图6为1mg/mL超稳定高亮度量子点荧光微球与传统通过静电吸附制备的量子点荧光微球在不同NaCl浓度下的荧光变化曲线。根据图6测试结果，随着NaCl浓度的提高，超稳定高亮度量子点荧光微球荧光强度先升高后降低，在高盐浓度(500 mmol/L)下，荧光强度与其在去离子水中相比，几乎不变，而传统通过静电吸附制备的量子点荧光微球荧光强度随着盐浓度提高不断降低。

3）图7为1mg/mL超稳定高亮度量子点荧光微球与传统通过静电吸附制备的量子点荧光微球在pH3-12下的荧光变化曲线。根据图7测试结果，在pH3-12的条件下，超稳定高亮度量子点荧光微球荧光强度变化曲线相比传统通过静电吸附制备的量子点荧光微球更加平缓，在pH3、pH12的条件下，仍能保持高荧光强度。

4）图8为1mg/mL超稳定高亮度量子点荧光微球在pH1强酸条件下储存7天，在紫外灯下随时间的变化照片及荧光发射、紫外吸收变化曲线。

5）图9为1mg/mL超稳定高亮度量子点荧光微球在pH14强碱条件下储存7天，在紫外灯下随时间的变化照片及荧光发射、紫外吸收变化曲线。根据图8a、9a测试结果，在强酸、强碱条件下储存7天，超稳定高亮度量子点荧光微球荧光并没有完全淬灭，仍能发出肉眼可辨的红色荧光。如图8b所示，在强酸条件下，随着时间的推移，荧光先骤降，然后趋于平缓。如图9b所示，在强碱条件下，随着时间的推移，荧光缓慢降低，同时还能保持高荧光强度。

实施例3：超稳定高亮度量子点荧光微球在PCT样品免疫层析检测实验过程

称取实施例1中制备的荧光微球，加入超纯水超声复溶(体系浓度＝10mg/mL)，取上述微球溶液100μL，加入500μL 50mM pH 6 .1的MES缓冲液，超声分散后，15000rpm ,4℃离心5min,除去上清。向上述洗好的微球中加入500μL 50mM pH6.1的MES缓冲液超声分散。向上述微球溶液中加入10μL浓度为10mg/mL的EDC，快速涡旋，室温孵育30min。向活化后的微球溶液中加入35μL降钙素原(PCT)抗体(2.9mg/mL，大约0.1mg抗体)，快速涡旋；再加入3.6μL鸡IgY抗体(14mg/ml，大约0.05mg) ，快速涡旋。室温孵育1～3h。将偶联溶液超声分散，向上述偶联溶液中加入5μL牛血清白蛋白(BSA)封闭剂后涡旋。37℃封闭 30min～1h。用pH8.0的Tris保存液清洗4次，并用保存液定容至100μL 。在封闭后的结合垫进行包被。将包被好的条带真空干燥。用上述同样的方法制备传统量子点荧光微球的试纸条。制备试纸条：样品垫，结合垫，缓冲垫，NC膜，吸水垫。用人血清白蛋白梯度稀释PCT抗原标准品，制成10000、5000、2000、1000、500、200、100ng/mL PCT抗原浓度标准品，以及一组空白对照。在18.5℃下，加入60μL检测液，孵育8min后在紫外灯下观测，测试结果如图11所示。

当样品中含有抗原时，抗原先与结合垫上的超稳定高亮度量子点荧光微球标记的PCT抗体形成复合物，复合物由于毛细管作用一起向吸水垫端层析，当流经T线（质检线）时，复合物上可被T线上的PCT二抗捕获而富集，在365 nm紫外灯激发光的作用下，T线可出现肉眼可见的红色荧光条带，而多余的荧光微球与C线上的羊抗鸡IgY结合而被富集，在365 nm紫外灯激发光的作用下，C线可出现肉眼可见的红色荧光条带；当样本中没有抗原时，T线无荧光条带，而C线可出现肉眼可见的红色荧光条带。

如图11所示，为超稳定高亮度量子点荧光微球（图11上）与传统通过静电吸附制备的量子点荧光微球（图11下）检测PCT抗原的测试结果。传统通过静电吸附制备的量子点荧光微球在1000ng/mL的抗原浓度检测下T线条带清晰可见（条带上方为T线，条带下方为C线），超稳定高亮度量子点荧光微球在500ng/mL抗原浓度下T线条带清晰可见。测试结果表明，超稳定高亮度量子点荧光微球比传统通过静电吸附制备的量子点荧光微球具有更低的检测限。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不以上述实施方式为限，但凡本领域普通技术人员根据本发明所揭示内容所作的等效修饰、等同替换和改进等，皆应纳入权利要求书中记载的保护范围落。

Claims

1.一种超稳定高亮度量子点荧光微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种超稳定高亮度量子点荧光微球的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中合成介孔二氧化硅的方法为：在去离子水中加入三乙醇胺，搅拌条件下加入十六烷基三甲基溴化铵和水杨酸钠进行反应；再加入正硅酸乙酯继续反应，反应结束用乙醇稀释，离心收集并纯化；再分散于盐酸/甲醇混合溶液中加热回流反应，以除去模板剂十六烷基三甲基溴化铵；最后离心纯化，得到具有中心径向孔径的树枝状二氧化硅纳米颗粒。

3.根据权利要求1所述的一种超稳定高亮度量子点荧光微球的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷和氢氧化铵对合成的二氧化硅纳米颗粒进行表面氨基化处理。

4.根据权利要求3所述的一种超稳定高亮度量子点荧光微球的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中利用3-巯基丙酸修饰介孔二氧化硅。

5.一种由上述权利要求1-4中任一项所述的制备方法制备得到的超稳定高亮度量子点荧光微球，其特征在于，包括二氧化硅纳米颗粒及原位生长在带有3-巯基丙酸的氨基化介孔二氧化硅上的CdTe量子点。

6.根据权利要5所述的一种超稳定高亮度量子点荧光微球的制备方法，其特征在于，所制备得到的量子点荧光微球的发射波长在可见光至近红外可调。

7.权利要求5-6任一项所述的一种超稳定高亮度量子点荧光微球在PCT样品免疫层析检测中的应用。