CN1389539A - 纳米微粒、微球及其生物荧光探针的制备和应用 - Google Patents

Abstract

一种纳米微粒和微球生物荧光探针的制备方法。本发明方法主要包括以下两个方面:1)在微粒合成中选用带有胺基的巯基化合物作为稳定剂,在温和的条件下直接制备水溶性表面修饰有胺基的荧光纳米微粒,然后利用微粒表面的胺基直接与生物体系耦联,进而得到纳米微粒生物荧光探针;2)利用不同的方法将表面修饰有不同官能基团的上述荧光纳米微粒复合到无机二氧化硅或有机聚合物微球中得到可以在水溶液中均匀分散的荧光微球,通过对荧光微球表面进行适当的化学和生物化学修饰得到可用于生物检测的微球荧光探针。纳米微粒和微球荧光探针可用于免疫检测、多基因染色体组分析、蛋白芯片的联合检测、DNA测序、基因芯片及细胞或生物组织内不同区域的荧光同步检测中。

Description

纳米微粒、微球及其生物荧光探针的制备和应用

技术领域

本发明涉及水溶性高效荧光发光的无机半导体纳米微粒的合成、含有荧光纳米微粒的可以在水中分散的大尺寸微球的制备、纳米微粒和含有荧光微粒的大尺寸微球的表面生物化学修饰及其荧光性质在生物检测中的应用，特别是碲化镉(CdTe)纳米微粒和含有碲化镉荧光微粒的大尺寸微球的表面生物化学修饰及其荧光性质在生物检测中的应用。

背景技术

由于量子尺寸效应，半导体微粒的光学性质在纳米尺寸范围内强烈地依赖于微粒的尺寸，因此通过对微粒尺寸的调节便可以得到具有不同光学性质(如荧光性质)的纳米微粒材料。

到目前为止，已经有两种较为成熟的方法可以用于高效荧光发光(发光效率在10％以上)的半导体纳米微粒的合成。

一种方法是利用金属有机合成的方法采用三烷基磷氧化物(TOPO，trioctyl phosphine oxide)作为溶剂和稳定剂在高温(～300℃)下合成II-VI族半导体纳米微粒如CdS、CdSe、ZnSe、CdTe及CdSe/CdS、CdSe/ZnS等具有壳核结构的高效荧光发光的纳米微粒，由于采用TOPO作为稳定剂，这种方法通常又被称为TOPO方法。然而TOPO方法的实验操作具有非常高的危险性，尤其是作为镉源的金属有机化合物具有非常大的毒性。此外，TOPO方法的直接产物是油溶性的纳米微粒，需要经过非常复杂的化学方法，通过对微粒表面的TOPO进行置换才能得到水溶性的纳米微粒，而微粒的水溶性是纳米微粒在生物体系中应用的重要前提。

另一种合成高效荧光发光的纳米微粒的方法是在水体系中通过采用水溶性的巯基化合物(如巯基乙酸、巯基丙酸、巯基异丙酸、巯基甘油等)作为稳定剂，在温和的条件下(≤100℃)直接制备水溶性高效荧光发光的纳米微粒，如碲化镉(CdTe)纳米微粒。

发明内容

本发明合成高效荧光发光的纳米微粒的方法是在水体系中通过采用不同的巯基稳定剂来得到可用于生物荧光检测的CdTe荧光纳米微粒和复合有CdTe纳米微粒的荧光微球。

本发明的内容主要包括以下两个方面：1)在微粒合成中选用带有胺基的巯基化合物(如巯基乙胺等)作为稳定剂，合成高效荧光发光的纳米微粒的方法是在水体系中通过采用不同的巯基稳定剂来得到表面修饰有胺基的荧光纳米微粒，然后利用微粒表面的胺基直接与生物体系耦联，近而得到纳米微粒生物荧光探针；2)利用不同的方法将上述荧光纳米微粒复合到无机(如二氧化硅等)或有机(如聚苯乙烯等)微球中得到可以在水溶液中均匀分散的荧光微球，通过对荧光微球表面进行适当的化学和生物化学修饰得到可用于生物检测的微球荧光探针。具体步骤如下：

1.表面修饰有胺基的荧光CdTe纳米微粒的制备：用含有胺基的水溶性巯基化合物(巯基胺，其分子式如下图所示)或含有一定比例的巯基胺

n＝1-10；m＝0-10；X，Y＝-NH₂，-OH，-COOH，-SH，-H，-CH₃与其它水溶性巯基化合物如巯基乙酸、巯基丙酸、巯基甘油等的混合物[巯基胺与其它巯基稳定剂的比例为(1∶0-100)]作为稳定剂，在水溶液中直接合成表面修饰有胺基的CdTe荧光发光的纳米微粒，其荧光峰位在500-680纳米范围内，微粒尺寸在1-8纳米之间。通常，镉离子化合物可以采用CdCl₂、Cd(ClO₄)2·xH₂O(x＝0～6)、Cd(CH₃COO)₂等水溶性的镉盐化合物；碲源化合物采用不同方法制备的NaHTe或Na₂Te的水溶液；反应的投料比为Cd²⁺∶Te^2-∶HSR＝1∶(0.1-0.8)∶(0.5-10)(其中HSR代表含有不同官能团的巯基化合物的总摩尔数)；整个反应过程是在无氧的条件下进行的，Cd²⁺在与NaHTe或Na₂Te反应前先与巯基化合物混合，其混合溶液的pH通常在5-11.5之间；NaHTe或Na₂Te溶液通过缓慢滴加方式加入到Cd²⁺/HSR溶液中，Cd²⁺在最终反应体系中的浓度为10^-1～10^-6M；当上述反应结束后，整个混合溶液将在100℃下回流1分钟～8天，通过对回流时间的控制可以控制微粒尺寸的增长，从而在500nm-680nm范围内实现对荧光发射峰位的调控，待溶液的荧光发射强度和发射峰位达到了实际应用的要求便可以将所得的纳米微粒溶液降至室温，这样便得到了表面修饰有不同数量胺基的CdTe荧光纳米微粒。

  具体合成路线如下：

                  CdTe-NH₂ (1)CdTe-NH₂：表面修饰有胺基的CdTe纳米微粒；b∶a＝0-100∶1；HSRNH₂：详见上分子式；HSR(CH₂X)_mY∶R＝(CH₂)_n，m＝1-10；n＝1-10；X，Y＝-OH，-COOH，-SH，H，-CH₃；Cd²⁺∶Te^2-∶HSR’[HSR’＝aHSRNH₂+bHSR(CH₂X)_mY]＝1∶(0.1-0.8)∶(0.5-10)

2.荧光CdTe纳米微粒的表面化学和生物化学修饰：利用微粒表面的胺基进行化学和生物化学修饰，得到可以与生物体系进行特异性识别的纳米微粒荧光探针，附图1是表面修饰有抗体的CdTe纳米微粒荧光探针的结构示意图，具体修饰路线如下：

         (2)耦联剂：戊二醛及其它常用生物耦联剂[见《生物耦联技术》(Greg Hermanson，Academic Press，New York)]；生物分子：抗体、低分子量单链DNA、RNA、生物素(biotin)、抗原、蛋白等。

3.复合有CdTe纳米微粒的荧光微球的制备，微球的荧光发光性质由微球中荧光微粒的性质及不同种类的荧光微粒的配比决定。

1)用不同种类的表面活性剂将用上述方法制备的水溶性荧光纳米微粒萃取到油溶性聚合物单体溶液中，采用乳液聚合的方法得到可以在水中分散的荧光微球，具体的制备过程如下：

聚合物单体：含有乙烯基团的化合物如苯乙烯、丙稀酸酯等；

表面活性剂：阳离子表面活性剂如含有长烷基链的季铵盐、阴

离子表面活性剂如十二烷基苯磺酸钠等、及不同种类的非离子

型表面活性剂等；

2)用水解有机硅氧烷的方法(St_ber方法)制备含有荧光纳米微粒的二氧化硅微球。最终得到的荧光微球的尺寸在30纳米-1000纳米范围内。具体的制备过程如下：

  硅烷化试剂：含有三官能度或四官能度的有机硅氧烷；

  催化剂：无机酸碱等。

4.用不同方法将上述微球表面进行化学和生物化学修饰：微球表面的化学和生物化学修饰的目的是得到可以与生物体系进行特异性识别的功能。微球表面的化学和生物化学修饰可以采用以下方法：

1)如采用带有胺基或巯基的三-甲或乙氧基硅烷来修饰二氧化硅的微球表面，再用通用的生物耦联方法将生物基团修饰到微球表面，得到可与生物体系进行特异性识别[如抗体-抗原或biotin-avidin(生物素-抗生素蛋白)间的识别等]的微球荧光探针。

    (6)

表面修饰剂：含有有机官能基团的硅烷化试剂如：三-甲氧基(乙

氧基)-1-胺丙基(1-胺丁基、1-胺戊基、1-巯基丙基、1-巯基丁基、

1-巯基戊基等)等；

官能团：巯基、胺基、羧基等；

耦联剂：戊二醛及其它常用生物耦联剂[见《生物耦联技术》

(Greg Hermanson，Academic Press，New York)]；

生物分子：抗体、生物素或低分子量的单链DNA、RNA、蛋

白等。

2)通过静电吸附的方法将联接有生物分子的聚电解质(如polyethylenimine)直接吸附到由乳液聚合方法或水解硅氧烷方法得到的荧光微球的表面，得到可以对生物体系进行识别的微球荧光探针。   (7)

聚电解质-生物分子：如Polyethylenimine-生物分子等。

生物分子：抗体、生物素或低分子量的单链DNA、RNA、蛋

白等。

5.将上述方法制备的微粒或微球荧光探针用于生物检测：纳米微粒和微球荧光探针可以用于免疫检测、多基因染色体组分析、蛋白芯片的联合检测、DNA测序、基因芯片及细胞或生物组织内不同区域的荧光同步检测中。微球荧光探针可以用于高灵敏度的免疫检测，具体作法是用修饰有抗体的基片作为检测载体，将基片先后浸入待测溶液和荧光探针溶液中，当待测溶液中有抗原出现时，微球荧光探针会自动通过抗体-抗原的特异性识别作用吸附到固体基片表面，使固体基片产生荧光。由于微球中含有大量的荧光微粒，微球荧光探针的使用将大大地提高免疫检测的灵敏度。

用方法上述制备的纳米微粒和微球生物荧光探针具有下列优点：

1)同TOPO方法相比，采用巯基稳定剂在水中直接制备荧光CdTe纳米微粒，其制备过程简单，操作简便，制作过程危险性低，而且反应的直接产物是水溶性的荧光微粒。这就为纳米微粒的荧光性质在生物体系中的应用提供了巨大的方便。

2)CdTe纳米微粒的荧光性质主要取决于CdTe纳米微粒的尺寸，而具有不同尺寸的CdTe微粒的表面化学性质非常相近，因此任何一种可以用于单一尺寸的CdTe纳米微粒表面修饰的方法可用于其它尺寸的微粒，从而大大地简化了制备具有不同荧光特性的纳米微粒生物荧光标记的方法。

3)微粒的水溶性使其更容易被复合在具有生物相容性的二氧化硅材料中，得到微球生物荧光探针；而采用表面活性剂将水溶性的CdTe微粒萃取到乙烯基单体中还可以近一步提高微粒的荧光发光效率，荧光发光效率的提高将大大地提高通过乳液聚合方法得到的荧光微球在生物荧光检测中的灵敏度。

4)复合有CdTe纳米微粒的荧光纳球的制备具有以下几个优点：①通过提高微球中微粒的含量或增加微球的尺寸可以大大地提高单个荧光微球的荧光强度；②将微粒复合到微球中还可以提高微粒荧光的化学环境适应性，近而得到荧光性能稳定的微球；③通过改变在微球中不同种类荧光微粒的配比可以得到具有不同荧光特征的微球；④由于对微球内不同荧光微粒组分的调控并不影响整个合成过程，这就大大地简化了具有不同荧光特征的微球的制备过程。

5)基于CdTe纳米微粒和含有CdTe纳米微粒的微球生物荧光探针远优于基于有机染料的生物荧光探针，其优势主要体现在以下两个方面：①上述微粒和微球的荧光光稳定性要远高于通用的有机染料；②微粒的荧光激发谱非常宽，这使得对荧光激发波长的选择性大大降低，同时使具有不同荧光特征的微粒荧光探针可以用于同一体系进行多色荧光检测。

附图说明

图1是表面修饰有抗体的CdTe纳米微粒荧光探针的结构示意图，X＝胺基、羟基、羧基等；耦联剂＝戊二醛；

图2是由巯基乙胺作为稳定剂制备的不同尺寸的CdTe纳米微粒的吸收光谱；

图3是由巯基乙胺作为稳定剂制备的不同尺寸的CdTe纳米微粒的荧光光谱；

图4是由巯基乙胺作为稳定剂制备的不同尺寸的CdTe纳米微粒水溶液的荧光照片。

具体实施方式

1.CdTe纳米微粒的合成：

Cd²⁺∶Te^2-∶HSCH₂CH₂NH₂＝1∶0.4∶2.5

浓度：[Cd²⁺]＝10^-3M；酸度：pH＝7.0；反应温度：T＝室温+回流；回流时间：t＝5分钟-5天，在回流时间为一小时范围内，微粒的荧光颜色为绿色，延长回流时间，微粒的荧光颜色逐渐红移，到回流四或五天后，微粒的荧光为红色，在回流过程中微粒的粒度从2个纳米增加到4个纳米。图2和图3给出的是在上述条件下合成的不同尺寸的CdTe纳米微粒的吸收光谱和荧光光谱。图4是表面修饰有胺基的不同尺寸的CdTe纳米微粒水溶液的荧光照片。

2.CdTe纳米微粒的生物耦联：

然后通过色谱方法和电泳分离方法对产物进行分离

HS-DNA、HS-RNA：末端修饰有巯基单链DNA、RNA

然后通过色谱方法和电泳分离方法对产物进行分离

3.荧光微球的制备：

a)用十二烷基苯磺酸钠(DBS)将表面修饰有不同数量胺基的碲化镉(CdTe-NH₂)萃取到苯乙烯中，然后用乳液聚合的方法制备单分散的聚苯乙烯微球。通过调节乳液聚合中乳化剂(分子式如下)与苯乙烯的配比及由乳液聚合方法得到的小尺寸的种子微球的用量，得到尺寸在30-1000纳米的范围内的荧光微球(J.W.Vanderhoff，E.B.Bradford，W.K.Carrington，J.Polym Sci Symp，1973，41，155)。

b)用史道伯(St_ber)反应(W.St_ber，A.Fink，E.Bonn，J.ColloidInterface Sci.1968，26，62)将一定比例的CdTe纳米微粒(Wt 5％)加入四乙氧基硅烷的醇溶液中，通过控制溶液中水的含量(5％)和溶液的酸度(pH＝9-10)来水解四乙氧基硅烷，得到尺寸在50-1000纳米的荧光微球。微球合成的实例：水，3.00mol/l；NH₃H₂O，0.50mol/l；四乙氧基硅烷，0.17mol/l。产物SiO₂微球的尺寸为133纳米。

4.荧光微球的生物耦联：

a)荧光聚苯乙烯微球的表面由于带有负电荷，可以直接吸附结合有抗体polyethylenimine，进而得到表面有抗体的微球荧光探针。

b)采用3-胺丙基-三-乙氧基硅烷与SiO₂/CdTe复合微球表面反应得到表面修饰有胺基的SiO₂微球，再采用具体实施例2中提到的耦联方法得到微球荧光探针。

5.耦联有生物大分子的荧光微粒和荧光微球用于各种生物检测：

a)多抗原同时检测的免疫组织化学：以实施例4所述方法制备具有不同发射波长的抗癌胚抗原(CEA)抗体、抗erbB2抗体与荧光微球的耦联物，在肺癌病人手术标本石蜡切片经常规的脱腊入水处理后，滴加相应抗体浓度为10mg/L的抗体—荧光微球耦联物，37度孵育30分钟，洗涤3次后透明、封片，显微镜下观察代表CEA阳性和erbB2阳性的两种荧光的强弱和位置。用实施例2所述方法制备荧光微粒—抗体耦联物可同样用于上述检测过程。

b)尿样中吗啡的高灵敏度检测：将抗吗啡单抗1mg/ml滴加于硝酸纤维素膜上0.005ml，空气干燥后采用1％BSA封闭，将封闭后的硝酸纤维素膜浸入待检尿样中，37度孵育1小时。经3次洗涤后，再将膜浸入含采用实施例4所述方法制备的抗吗啡抗体—荧光微球耦联物溶液中，37度孵育1小时，再经5次PBS洗涤，采用荧光分光光度计探测膜上的荧光强度，以判定尿样中吗啡的含量。用实施例2所述方法制备荧光微粒—抗体耦联物可同样用于上述检测过程。

c)多基因染色体组分析：首先将抑癌基因p53与p16、p21的热点缺失片段采用实施例2所述方法与具有不同发射波长的荧光微粒耦联。将待检细胞按常规方法进行原位裂解，释放完整的染色体组。按常规FISH方法进行杂交，杂交结果于显微镜下观察并摄像，分析各基因缺失情况。

d)多种肿瘤标志物蛋白芯片的联合检测：将针对20种已知肿瘤血清标志物的单抗1mg/ml分别以阵列的方式滴加于硝酸纤维素膜上0.001ml，空气干燥后采用1％BSA封闭，将封闭后的硝酸纤维素膜浸入待检血清稀释液中，37度孵育1小时。经3次洗涤后，再将膜浸入含采用实施例4所述方法制备的20种相应抗体—荧光微球耦联物混合溶液中，37度孵育1小时，再经5次PBS洗涤，采用数码摄像头探测膜上阵列各点的荧光强度和荧光特征。e)细胞或组织内部不同区域的多色荧光检测：将TOPO方法制备的荧光纳米微粒经过化学处理变为水溶性的荧光微粒，再通过表面生物化学修饰得到的生物荧光探针用于多色检测已经在《科学》杂志上报道过(SCIENCE，1998，281，2013)，利用相同的原理采用实施例2和4方法制备的微粒和微球生物荧光探针同样可以用于细胞或组织内部不同区域的多色检测。

Claims (9)

1.一种碲化镉荧光纳米微粒的制备，其特征在于，按如下方法：

用含有胺基的水溶性巯基胺化合物，或含有一定比例的巯基胺与巯基乙酸、巯基丙酸、1-巯基甘油、1，2-二巯基甘油或巯基乙醇的混合物作为稳定剂，在水溶液中直接合成表面修饰有胺基的CdTe荧光发光的纳米微粒；其中巯基胺与上述不含胺基的巯基化合物的比例为1∶0-100；Cd²⁺来源于水溶性的镉离子化合物；碲来源于不同方法制备的NaHTe或Na₂Te的水溶液；反应的投料比为Cd²⁺∶Te^2-∶HSR＝1∶(0.1-0.8)∶(0.5-10)，HSR代表含有不同官能团的巯基化合物的总摩尔数，Cd²⁺在与NaHTe或Na₂Te反应前先与巯基化合物混合，其混合溶液的pH通常在5-11.5之间，NaHTe或Na₂Te溶液通过滴加方式加入到Cd²⁺和HSR混合溶液中，Cd²⁺在最终反应体系中的浓度为10^-1～10^-6M，当上述反应结束后，整个混合溶液将回流1分钟～8天，得到CdTe荧光纳米微粒。

2.如权利要求1所述的荧光纳米微粒的制备，其特征在于，所述的CdTe荧光发光纳米微粒的制备过程中，当碲化钠或碲氢化钠溶液滴加结束后，含有CdTe的溶液在60-95℃下静置3小时到10天，得到CdTe荧光纳米微粒。

3.如权利要求1或2所述的荧光纳米微粒的制备，其特征在于，用巯基胺、巯基羧酸、巯基丙酸、巯基乙醇、1-巯基甘油、1，2-二巯基甘油或上述两种或多种巯基化合物的混合物为稳定剂制备的CdTe荧光纳米微粒。

4.一种CdTe纳米微粒生物荧光探针的制备，其特征在于，采用权利要求1-3所述方法制备的CdTe纳米微粒，利用微粒表面的胺基通过生物耦联反应将荧光微粒同生物分子相联，得到可以与生物体系进行特异性识别的纳米微粒荧光探针。

5.一种荧光纳米微球的制备，其特征在于，用权利要求1、2或3方法制备的CdTe荧光纳米微粒，用阴离子型、阳离子型、非离子型或甲基丙烯酸将水中的CdTe荧光纳米微粒萃取到油溶性聚合物单体溶液中，采用乳液聚合的方法得到可以在水中分散的荧光微球；或者

用水解有机硅氧烷的方法制备含有荧光纳米微粒的二氧化硅微球。微球的尺寸在30纳米到1000纳米。

6.如权利要求5所述的荧光微球的方法，其特征在于，制备的荧光纳米微球的尺寸在30纳米到1000纳米。

7.一种纳米微球生物荧光探针的制备，其特征在于，采用权利要求5或6制得的复合有CdTe纳米微粒的荧光微球的表面进行化学修饰得到表面覆盖有胺基、羧基、羟基、或巯基的荧光微球，利用生物耦联反应通过微球表面的官能基团将荧光微球同生物分子相联得到微球生物荧光探针；或者

通过静电吸附的方法将联接有生物分子的聚电解质组装到权利要求5或6制得的复合有CdTe纳米微球表面，得到微球生物荧光探针。

8.一种CdTe纳米微粒生物荧光探针的应用，其特征在于，可用于免疫检测、多基因染色体组分析、蛋白芯片的联合检测、DNA测序、基因芯片及细胞或生物组织内不同区域的荧光同步检测中。

9.一种含有CdTe纳米微粒的微球生物荧光探针的应用，其特征在于，可用于免疫检测、多基因染色体组分析、蛋白芯片的联合检测、DNA测序、基因芯片及细胞或生物组织内不同区域的荧光同步检测中。

Images