CN204287188U - 一种双标记检测试纸 - Google Patents

Abstract

为了克服现有免疫胶体金检测技术只能做定性或者半定量检测而不能做定量检测；应用免疫胶体金检测技术的胶体金免疫检测试纸检测灵敏度低，对于含量较低的样品，易造成假阴性导致检出率较低的缺点。本实用新型提出一种双标记检测试纸，该双标记检测试纸包括样品垫和吸水垫，其特征在于：所述样品垫和吸水垫之间搭接有两条以上相互独立的检测条；所述检测条中至少有一个胶体金免疫检测条和一个荧光量子点检测条。本实用新型的双标记检测试纸可以实现定量和定性检测，并且灵敏度高，检出率高。可以实现一项多检，省时省力。

Description

一种双标记检测试纸

技术领域

本实用新型涉及免疫检测技术领域，特别涉及到一种双标记检测试纸。

背景技术

免疫胶体金技术是上世纪90年代发展起来的一种简便、快速、准确的检测技术，其原理与双夹心ELISA相似，不同的是使用胶体金结合蛋白质形成的复合物作为探针，且所使用的试剂事先都被固定在具有微孔的硝酸纤维素膜上。使用时将一端置于检测液中，硝酸纤维素膜可被液体穿过，若检测液中含有相关的抗原或抗体。在检测区就会出现淡红色线条。否则为阴性。该技术问世以来已在临床上不断被采用，该方法不依赖于精密的仪器、不依赖于熟练的技术人员、操作步骤简捷，比起目前常用的酶联免疫法具有更大的优点。整个反应过程约在5分钟内就可以完成。但胶体金免疫检测试纸在运用上具有以下缺点：单纯依靠显色深浅来判断结果的胶体金快速免疫检测试纸，只能作定性或半定量检测而不能做定量检测；由于方法学的限制，只使用胶体金为标记物的快速免疫检测试纸，其灵敏度较低；对于某些抗原含量较低的样品，由于胶体金免疫检测试纸受灵敏度限制，会造成假阴性，因而检出率较低。

发明内容

为了克服现有免疫胶体金检测技术只能做定性或者半定量检测而不能做定量检测；应用免疫胶体金检测技术的胶体金免疫检测试纸检测灵敏度低，对于含量较低的样品，易造成假阴性导致检出率较低的缺点。本实用新型提出一种双标记检测试纸，该双标记检测试纸可以实现定量和定性检测，并且灵敏度高，检出率高；同时可以实现一样多检，省时省力，方便快捷。

半导体量子点，简称量子点（quantum dots，QDs），顾名思义，即材料的尺寸在三维空间进行约束并达到一定的临界尺寸（可抽象为一个点），因此其表现出许多独特的光、电特性。1998年，美国加州伯克利大学的Alivisatos小组和印第安纳大学Nie小组同时提出荧光量子点可应用于生物标记这一思想，开创了荧光量子点在生物技术中研究应用的先河。《量子点的应用——一种新型的荧光检测技术》（徐飞，丁双阳；中国农业大学动物医学院）一文系统的介绍了现阶段量子点荧光检测技术的研究进展。

本实用新型双标记检测试纸的发明创造构思是在传统的胶体金免疫半定量检测的基础上同时引入荧光量子点定量检测。具体实施内容如下：

本实用新型一种双标记检测试纸包括两条以上相互独立的检测条，检测条的一端搭接共用一个样品垫，检测条的另一端既可以搭接共用一个吸水垫，也可以分别搭接有各自独立的吸水垫。

优选的，所述检测条中至少有一个胶体金免疫检测条和一个荧光量子点检测条。优选的，所述检测条仅由数个灵敏度不同的胶体金免疫检测条组成；更为优选的，所述检测条仅由数个灵敏度不同的荧光量子点检测条组成。

优选的，该双标记检测试纸包括两条相互独立的检测条。

优选的，胶体金免疫检测条具体包括相互搭接的胶体金垫和第一NC膜，胶体金垫远离第一NC膜的一端与样品垫搭接，第一NC膜远离胶体金垫的一端与吸水垫搭接；胶体金垫为涂覆有包含抗体一的胶体金溶液的玻璃纤维膜，第一NC膜上设置有检测线，检测线上涂覆有抗体二；

荧光量子点检测条具体包括相互搭接的量子点垫和第二NC膜，量子点垫远离第二NC膜的一端与样品垫搭接，第二NC膜远离量子点垫的一端与吸水垫搭接；量子点垫为涂覆有活化后与抗体三共价结合的量子点的玻璃纤维膜，第二NC膜上设置有检测线，检测线上涂覆有抗体四；

抗体一和抗体二为待检测目标抗原的两种不同结合位点的特异性结合抗体；

所述抗体三和抗体四为待检测目标抗原的两种不同结合位点的特异性结合抗体。

更为优选的，抗体三替换为抗体一或抗体二。更为优选的，抗体四替换为抗体一或抗体二。更为优选的，抗体三替换为抗体一，同时抗体四替换为抗体二。更为优选的，抗体三替换为抗体二，同时抗体四替换为抗体一。

优选的，第一NC膜和第二NC膜上分别设置有第一NC膜质控线和第二NC膜质控线，第一NC膜质控线和第二NC膜质控线上涂覆有监控检测条质量的多抗抗体。所述多抗抗体可以与抗体一、二、三、四或目标抗原特异性结合，可以通过质控线来判断该检测试纸是否已被使用或者是否已经失效处于异常状态。

优选的，第一NC膜上两条并列的检测线和质控线之间的间距为0.8cm，所述第二NC膜上两条并列的检测线和质控线之间的间距为0.8cm。

进一步优选的，样品垫、胶体金免疫检测条、荧光量子点检测条和吸水垫固定在底板上。

应当明确的是，本实用新型的双标记检测试纸的应用不局限于待检测抗原的种类，而只需要选用与之适配的抗体制备双标记检测试纸即可。即便如此，经过申请人的试验，本实用新型双标记检测试纸尤其适用于人绒毛膜促性腺激素、艾滋病病毒的检测。

还应当明确的是，本实用新型技术方案的实现不依赖于胶体金免疫检测条和荧光量子点检测条的具体制备方法。任意一种现有技术胶体金免疫检测条和荧光量子点检测条的制备方法，只要选用与待检目标抗原适配的抗体即可实现本实用新型的技术方案。即便如此，下文中依然给出一种具体的胶体金免疫检测条和荧光量子点检测条的具体制备方法。

一、胶体金免疫检测条中胶体金垫的制备

1、胶体金溶液的制备

将超纯水置磁力搅拌器上搅拌加热至沸腾，按终质量浓度为万分之一的量迅速加入质量浓度为1%的氯金酸溶液，煮沸5分钟；再按所加入氯金酸溶液等体积量加入质量浓度为1%的柠檬酸三钠溶液，煮沸10分钟后，冷却至室温，用超纯水定容至氯金酸终浓度为万分之一，常温避光保存备用。

2、胶体金与抗体结合

用2mol/L碳酸钾溶液调节胶体金溶液pH值至7.0。按3μg抗体/毫升胶体金溶液的比例浓度加入抗体一，混匀，静置10分钟；再按2%体积量加入浓度为20%的BSA溶液，混匀，静置10分钟；13000rpm离心15分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤一次，离心后弃上清，沉淀用二十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解。

3、胶体金标记抗体一的固定与干燥

将所述的胶体金标记抗体一用百德(Bio-Dot)仪的喷头按每毫升溶液铺15平方厘米的量涂覆在玻璃纤维膜上，形成胶体金垫，真空干燥2小时后，置装有干燥剂的密封袋中保存备用。

二、荧光量子点检测条中量子点垫的制备

1、量子点的制备

量子点采用有机相合成，主要是以Cd、Zn 的氧化物或盐等为原料，采用长链脂肪酸、脂肪胺和其他种类的磷酸氧化物等充当配体，以十八烯、三辛基氧化磷等高熔点有机化合物为溶剂，在高温条件下生长得到高质量的荧光量子点。有机相合成量子点的优势在于：反应温度较高，所得量子点荧光量子产率较高，荧光半峰宽较窄。

2、量子点与抗体结合以及抗体的固定与干燥

量子点通过EDC活化与目标抗原的抗体一共价结合后，将所述的量子点标记抗体一用百德(Bio-Dot)仪的喷头按每毫升溶液铺15平方厘米的量涂覆在玻璃纤维膜上，形成量子点垫，真空干燥2小时后，置装有干燥剂的密封袋中保存备用。

三、胶体金免疫检测条和荧光量子点检测条中第一、第二NC膜的制备

NC膜即硝酸纤维素膜。将目标抗原的另一抗体——抗体二用百德(Bio-Dot)仪的喷头喷到醋酸纤维素膜或硝酸纤维素上形成检测线；间隔0.8cm将多抗抗体喷上形成质控线。形成质控线所喷涂的多抗抗体为可以与抗体一、抗体二和/或目标抗原特异性结合的抗体，优选羊抗人或兔抗人。

四、将步骤一二和三准备好的胶体金垫、量子点垫和第一第二NC膜，连同样品垫和吸水垫一起按照前述本实用新型双标记检测试纸中记载的结构依序搭接在一起，即可得到本实用新型的双标记检测试纸。

与现有技术相比，本实用新型双标记检测试纸的有益效果如下：

其一，本实用新型双标记检测试纸在胶体金半定量检测的基础上引入了荧光量子点检测技术，定性检测方面：与胶体金检测技术互补，检测灵敏度高；荧光量子点检测条即使对于目标抗原含量较低的样品也能准确检出，检出率高，不易出现假阴性的现象。

其二，本实用新型双标记检测试纸，定量检测方面：利用荧光量子点检测的特点，能够得到更为精确的定量检测结果；同时，胶体金免疫检测条检测与荧光量子点检测条检测相互配合，可以避免出现因任一检测条失效而导致的错检现象，且两者互相参照也可以得到更为准确的定量检测结果。

其三，本实用新型双标记检测试纸引入了荧光量子点检测条，荧光量子点检测除了拥有荧光材料的高灵敏性，同时具有激发光谱宽且连续分布，发射光谱窄而对称，颜色可调，光化学稳定性高，荧光寿命长等优点。

附图说明

附图1为本实用新型双标记检测试纸实施例1的结构示意图；

附图1中：1为样品垫，2为胶体金垫，3为第一NC膜，3-1为第一NC膜检测线，3-2为第一NC膜质控线，4为吸水垫，5为第二NC膜，5-1为第二NC膜检测线，5-2为第二NC膜质控线，6为量子点垫。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本实用新型作进一步阐述。

如附图1所示，本实施例1的双标记检测试纸包括样品垫1和吸水垫4，其特征在于：所述样品垫1和吸水垫4之间搭接有两条相互独立的检测条；所述检测条中有一个胶体金免疫检测条和一个荧光量子点检测条。

胶体金免疫检测条具体包括相互搭接的胶体金垫2和第一NC膜3，胶体金垫2远离第一NC膜3的一端与样品垫搭接，第一NC膜3远离胶体金垫2的一端与吸水垫4搭接；胶体金垫为涂覆有包含抗体一的胶体金溶液的玻璃纤维膜，第一NC膜3上并列设置有检测线3-1和质控线3-2，检测线3-1和质控线3-2上分别涂覆有抗体二和多抗抗体，检测线3-1和质控线3-2两者的间距为0.8cm；

荧光量子点检测条具体包括相互搭接的量子点垫6和第二NC膜5，量子点垫6远离第二NC膜5的一端与样品垫1搭接，第二NC膜5远离量子点垫6的一端与吸水垫4搭接；量子点垫6为涂覆有活化后与抗体一共价结合的量子点的玻璃纤维膜，第二NC膜5上并列设置有检测线5-1和质控线5-2，检测线5-1和质控线5-2上分别涂覆有抗体二和多抗抗体，检测线5-1和质控线5-2两者的间距为0.8cm；

抗体一和抗体二为待检测目标抗原的两种不同结合位点的特异性结合抗体。

多抗抗体能够与抗体一、抗体二和目标抗原特异性结合。

以上通过一个较佳的实施例对本实用新型作了详尽的阐述，应当明确的是，所列举的实施例不应当理解成为对本实用新型保护范围的限制。本实用新型的保护范围应当以权利要求书限定的内容为准，并且说明书及其附图可以用来解释权利要求书。

Claims (10)

1.一种双标记检测试纸，特征在于：包括两条以上相互独立的检测条，检测条的一端搭接共用一个样品垫（1），检测条的另一端搭接有吸水垫（4）。

2.根据权利要求1所述的双标记检测试纸，其特征在于：所述检测条中至少有一个胶体金免疫检测条和一个荧光量子点检测条。

3.根据权利要求2所述的双标记检测试纸，其特征在于：该双标记检测试纸包括两条相互独立的检测条。

4.根据权利要求3所述的双标记检测试纸，其特征在于：

所述胶体金免疫检测条具体包括相互搭接的胶体金垫（2）和第一NC膜（3），胶体金垫（2）远离第一NC膜（3）的一端与样品垫（1）搭接，第一NC膜（3）远离胶体金垫（2）的一端与吸水垫（4）搭接；胶体金垫（2）为涂覆有包含抗体一的胶体金溶液的玻璃纤维膜，第一NC膜（3）上设置有检测线（3-1），检测线（3-1）上涂覆有抗体二；

所述荧光量子点检测条具体包括相互搭接的量子点垫（6）和第二NC膜（5），量子点垫（6）远离第二NC膜（5）的一端与样品垫（1）搭接，第二NC膜（5）远离量子点垫（6）的一端与吸水垫（4）搭接；量子点垫（6）为涂覆有活化后与抗体三共价结合的量子点的玻璃纤维膜，第二NC膜（5）上设置有检测线（5-1），检测线（5-1）上涂覆有抗体四；

所述抗体一和抗体二为待检测目标抗原的两种不同结合位点的特异性结合抗体；

所述抗体三和抗体四为待检测目标抗原的两种不同结合位点的特异性结合抗体。

5.根据权利要求4所述的双标记检测试纸，其特征在于：所述抗体三替换为抗体一或抗体二。

6.根据权利要求4所述的双标记检测试纸，其特征在于：所述抗体四替换为抗体一或抗体二。

7.根据权利要求4所述的双标记检测试纸，其特征在于：所述抗体三替换为抗体一，同时抗体四替换为抗体二；或者；抗体三替换为抗体二，同时抗体四替换为抗体一。

8.根据权利要求4~7任一权利要求所述的双标记检测试纸，其特征在于：所述第一NC膜（3）和第二NC膜（5）上分别设置有第一NC膜质控线（3-2）和第二NC膜质控线（5-2），第一NC膜质控线（3-2）和第二NC膜质控线（5-2）上涂覆有监控检测条质量的多抗抗体。

9.根据权利要求8所述的双标记检测试纸，其特征在于：所述第一NC膜（3）上两条并列的检测线（3-1）和质控线（3-2）之间的间距为0.8cm，所述第二NC膜（5）上两条并列的检测线（5-1）和质控线（5-2）之间的间距为0.8cm。

10.根据权利要求9所述的双标记检测试纸，其特征在于：所述样品垫（1）、胶体金免疫检测条、荧光量子点检测条和吸水垫（4）固定在底板上。