CN204719028U - 检测五种氨基糖苷类抗生素的同步检测卡 - Google Patents
检测五种氨基糖苷类抗生素的同步检测卡 Download PDFInfo
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Abstract
本实用新型提供一种检测五种氨基糖苷类抗生素的同步检测卡，包括检测卡和滴管，检测卡由试纸条和卡壳组成，试纸条由PVC板、样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、保护膜以及标签膜组成。用胶体金分别标记新霉素、链霉素、庆大霉素、大观霉素和卡那霉素单克隆抗体，冻干到玻璃纤维素膜上制成胶体金垫，硝酸纤维素膜上分别包被上述五种氨基糖苷类抗生素半抗原-卵清蛋白偶联物，作为检测线，包被羊抗鼠作为质控线。五种试纸条放入一个卡壳中，卡壳上有一个加样槽进行加样，同时检测新霉素、链霉素、庆大霉素、大观霉素和卡那霉素。本实用新型检测卡具有高效、省时、操作简单、灵敏度高、特异性好等特点。
Description
技术领域
本专利涉及一种生物工程技术领域的检测方法，利用免疫层析技术一次检测五种氨基糖苷类抗生素。
背景技术
近年来，由于畜牧业盲目滥用抗生素现象日益严重，造成畜产品中抗生素残留增加，影响人类食品安全，所以抗生素残留问题已经引起社会的高度重视。
动物性食品中氨基糖苷类抗生素残留的危害：1.对公共卫生和人体健康的危害。长期摄入氨基糖苷类抗生素严重超标的动物性食品可导致肾毒性和耳毒性，同时损害脑神经；2.引起过敏反应。氨基糖苷类抗生素具有抗原性，能刺激机体形成抗体，当被致敏人体再接受这些抗生素治疗时，该抗生素就会与抗体结合，生成抗原抗体复合物而发生过敏反应；3.病原菌耐药性增加。抗生素在畜产品中的残留可能使动物病原菌产生耐药性，耐药基因细菌之间传播，由此导致致病菌的耐药性增加而引起人类和动物感染性疾病的治疗失败；4.破坏人体胃肠道微生物菌群的动态平衡。如果长期食用有抗生素残留的畜产品，对人类胃肠道的正常菌群平衡产生不良影响：a.破坏肠道菌群的屏障作用。b.肠道细菌耐药性增加。c.肠道菌群代谢活性改变。d.肠道细菌数目和相对比例改变，部分敏感菌群受到抑制或杀死，条件性致病菌大量繁殖或体外病原菌侵入。
新霉素（NEO）、链霉素（SM）、庆大霉素（GM）、大观霉素（SPE）、卡那霉素（KAN）是几种兽药中常用的氨基糖苷类抗生素。2002年农业部组织修订了《动物性食品中兽药最高残留限量》，并予以发布，新霉素、链霉素、庆大霉素、大观霉素属于“附录2：已批准的动物性食品中最高残留限量规定”，卡那霉素被国际食品法典兽药残留委员会列入“有关需要评估及再评估兽药的优先名单”。目前氨基糖苷类抗生素检测的主要方法为微生物检测法、色谱分析法和免疫分析法。微生物检测法的主要原理是根据抗微生物药对特异微生物的抑制作用，来检测受检样品中残留的抗生素。微生物检测法测定时间长，特异性低，灵敏度低，操作复杂。色谱分析法需要专门的色谱仪进行检验，价格昂贵且检测时间较长。免疫分析法主要包括放射免疫分析（RIA）、酶联免疫分析法（ELISA）和免疫层析技术。免疫分析法普遍具有高灵敏度高特异性的优点，但各个方法又具有自己的特点。放射免疫分析样品回收率高，但易造成放射污染，不易操作，以及同位素半衰期短；酶联免疫分析法可以经行批量检测，但操作步骤较为繁琐，耗时较长；免疫层析技术和上述两种免疫分析方法一样具有高特异性高灵敏度的优点，同时简化了操作步骤，缩短检测时间，不会造成二次污染。
免疫层析技术是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术，其最大特点是具有高度选择性。待测物、抗体和标记物是免疫分析中的三个基本要素。它往往以条状纤维层析材料为固相，通过毛细管作用使样品溶液在层析条上涌动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的抗体发生高特异性和高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过可目测的标记物（胶体金或胶体硒）而达到直观的实验现象，而游离的标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。
检测五种氨基糖苷类抗生素的同步检测卡在市场上尚未有商品化的产品，市场上已有的产品均为对氨基糖苷类抗生素中某一种抗生素进行单一检测，多进行重复性操作，增加工作量，浪费时间。
实用新型内容
本实用新型的目的是设计开发出一种高灵敏度、高特异性的检测氨基糖苷类抗生素的检测卡，能够同时检测新霉素、链霉素、庆大霉素、大观霉素和卡那霉素，简化检测过程，使得检测更简单、省时、高效。
本实用新型检测卡由卡壳和试纸条组成，其中卡壳分为卡底和卡盖，卡盖上有项目名称显示窗、结果显示窗和加样槽，加样槽只有一个，且下方用无纺布覆盖，加样槽能够覆盖每个待检测试纸条，试纸条由PVC板、样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、保护膜以及标签膜组成。
胶体金垫是用胶体金分别标记新霉素、链霉素、庆大霉素、大观霉素和卡那霉素单克隆抗体，冻干到玻璃纤维素膜上制成的。硝酸纤维素膜上分别包被上述五种氨基糖苷类抗生素半抗原-卵清蛋白偶联物，作为检测线，包被羊抗鼠抗体作为质控线。样品垫为处理过的无纺布，保护膜为1cm宽透明胶带，标签膜上印有检测项目名称英文缩写（新霉素NEO、链霉素SM、庆大霉素GM、大观霉素SPE、卡那霉素KAN）。每个卡壳中并列放入5种试纸条各一个，分别检测新霉素、链霉素、庆大霉素、大观霉素和卡那霉素。
为了方便使用，检测卡配有滴管，滴管上有取液刻度，方便使用者吸取以及快速滴加样本。
本实用新型的有益效果：
1.检测效率高。无需重复点样，一次点样即可同时完成5个项目的检测；
2.检测时间短。与抗生素的其他检测方法相比，大大缩短检测时间，而且需要检测多个样本时，无需进行浸样等待，可连续检测多个样本，也无需与试剂盒中的其它试剂进行混匀等操作，只需将可检测样品直接点入加样槽计时5min即可进行结果判定；
3.检测工具简单。无需配备其他移液工具，使用滴管直接滴加样本即可，无需再用其他精确计量器具量取样本量；
4.灵敏度高、特异型好。本实用新型应用免疫层析技术，具有高灵敏度、高特异性的特点，本检测卡的最低检出限为：新霉素 200μg/kg、链霉素 100μg/kg、庆大霉素 50μg/kg、大观霉素 50μg/kg、卡那霉素 20μg/kg。
附图说明
图1为本实用新型试纸条结构示意图
图2为本实用新型试纸条俯视图
图3为本实用新型检测卡示意图
图4为本实用新型检测结果示意图，a表示检测结果为阳性，b表示检测结果为阴性，c、d表示检测结果无效
图5为本实用新型滴管示意图
具体实施方式
一、检测五种氨基糖苷类抗生素的同步检测卡的制备
1.胶体金垫的制备
将0.02%氯金酸溶液搅拌煮沸，加入2%柠檬酸三钠1%体积，使柠檬酸三钠终浓度为0.02%，持续加热搅拌，溶液由蓝色逐渐变为酒红色即可，停止加热，搅拌冷却至室温。
取上述胶体金溶液，用0.02mol/L NaOH调PH值至7.0±0.1取出3份，1mL/份，调PH值至7.5±0.1，取出2份，1mL/份；按表1加入单克隆抗体，混匀，振荡30 min；每毫升胶体金溶液中加入20 μL的10%BSA，混匀，振荡30 min；10000g离心10 min，弃上清；加入1/100胶体金溶液体积的复溶液制成100倍浓缩液；测540nm处的OD值，将五种浓缩液用复溶液稀释，分别铺到玻璃纤维素膜上，形成胶体金垫，置于真空冷冻干燥机中，真空冻干3小时。
表1 新霉素、链霉素、庆大霉素、大观霉素、卡那霉素单克隆抗体标记量
| 抗体名称 | NEO单抗 | SM单抗 | GM单抗 | SPE单抗 | KAN单抗 |
| 金水PH | 7.0 | 7.5 | 7.5 | 7.0 | 7.0 |
| 抗体加入量 | 10μg | 5μg | 10μg | 10μg | 5μg |
复溶液配置：0.5% BSA、0.5% Tween-20、0.2%蔗糖、0.05mol/L 硼酸盐缓冲液（PH8.0）。
2、硝酸纤维素膜包被
用1*PBS（PH7.4）将羊抗鼠多克隆抗体稀释到1.5mg/mL,将新霉素半抗原- 卵清蛋白偶联物（NEO-OVA）、链霉素半抗原- 卵清蛋白偶联物（SM-OVA）、庆大霉素半抗原- 卵清蛋白偶联物（GM-OVA）分别稀释到1.5mg/mL，将大观霉素半抗原- 卵清蛋白偶联物（SPE-OVA）、卡那霉素半抗原- 卵清蛋白偶联物（KAN-OVA）分别稀释到1.0mg/mL，用划膜机将上述羊抗鼠抗体及半抗原-卵清蛋白偶联物包被于5块硝酸纤维素膜上，分别作为C线（质控线）和T线（检测线），包被参数为0.12μL/mm 。将硝酸纤维素膜置于37℃干燥3小时。
3、样品垫制备
配制样品垫处理液：0.5%BSA的0.05mol/L 硼酸盐缓冲液（PH8.0）。
用样品垫处理液铺无纺布，1mL铺20cm2，37℃干燥3小时。
4、胶体金试纸条的组装
将样品垫1、胶体金垫2、硝酸纤维素膜3 和吸水纸6 按图1所示粘贴在PVC板7 上，样品垫压胶体金垫1mm，胶体金垫压硝酸纤维素膜1mm，吸水纸压硝酸纤维素膜1mm，如图2所示，保护膜9压在样品垫上端和硝酸纤维素膜下端，覆盖胶体金垫，吸水纸上用标签膜8覆盖，标签膜上的项目名称、胶体金垫上的单克隆抗体以及硝酸纤维素膜上包被的半抗原偶联物要彼此相对应。
组装完成后，用切条机切成3mm宽的条。
5、包装
将五种试纸条并列装入图3所示的卡底11，在样品垫位置覆盖无纺布15，使其覆盖住每个试纸条的样品垫，扣上卡盖10，使加样槽14对准无纺布15，压紧，检测卡装入铝箔袋，同时放入干燥剂和滴管，将铝箔袋密封保存。
二、检测过程
1、将检测卡与可检样本取出，室温平衡；
2、打开铝箔袋，取出检测卡，放平；
3、取出图5所示滴管16吸取样本至滴管刻度线17位置（约300μL），然后将样本滴加到检测卡的加样槽14中；
4、室温计时5min，观察检测结果。
三、检测结果分析
当检测样品中新霉素、链霉素、庆大霉素、大观霉素和卡那霉素中某种的含量等于或大于本检测卡对其设置的最低检出限时，胶体金标记的相应的单克隆抗体的结合位点将会被其完全封闭，T线上包被的相应的半抗原- 卵清蛋白偶联物不能与胶体金标记的抗体结合，此时结果显示窗13中T线不显色，C线显示紫红色，则表明结果显示窗上方的项目名称显示窗12中的项目检测结果为阳性，如图4a ；当检测样品中新霉素、链霉素、庆大霉素、大观霉素和卡那霉素中某种的含量小于本检测卡对其设置的最低检出限时，胶体金标记的相应的单克隆抗体的结合位点未被其完全封闭，T线上包被的相应的半抗原- 卵清蛋白偶联物即可与胶体金标记的抗体结合，此时T线显示紫红色，C线显示紫红色，表明项目名称显示窗中的项目为阴性，如图4b；如果C线不显色，无论T线显示紫红色或不显色，均表示结果无效，如图4 c、d。
Claims (4)
1.一种检测五种氨基糖苷类抗生素的同步检测卡，其特征在于包括试纸条、卡壳和滴管，试纸条由PVC板、样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、保护膜以及标签膜组成，硝酸纤维素膜上分别包被新霉素半抗原- 卵清蛋白偶联物、链霉素半抗原- 卵清蛋白偶联物、庆大霉素半抗原- 卵清蛋白偶联物、大观霉素半抗原- 卵清蛋白偶联物、卡那霉素半抗原- 卵清蛋白偶联物，胶体金垫是将胶体金分别标记的新霉素单克隆抗体、链霉素单克隆抗体、庆大霉素单克隆抗体、大观霉素单克隆抗体、卡那霉素单克隆抗体冻干到玻璃纤维素膜上，五种试纸条并列放入一个卡壳中，卡壳上只有一个加样槽，加样槽能够覆盖每个试纸条，同时检测新霉素、链霉素、庆大霉素、大观霉素、卡那霉素五种氨基糖苷类抗生素。
2.根据权利要求1所述的检测五种氨基糖苷类抗生素的同步检测卡，其特征在于所述卡壳分为卡盖和卡底，卡盖上有项目名称显示窗、结果显示窗和加样槽。
3.根据权利要求1所述的检测五种氨基糖苷类抗生素的同步检测卡，其特征在于所述加样槽在一个检测卡中只有一个，且下方用无纺布覆盖。
4.根据权利要求1所述的检测五种氨基糖苷类抗生素的同步检测卡，其特征在于所述滴管有一个刻度，刻度能辅助快速量取样本量。
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|---|---|---|---|---|
| CN105606808A (zh) * | 2016-03-30 | 2016-05-25 | 珠海华澳生物科技有限公司 | 一种a/b族链球菌胶体金免疫层析检测装置及其检测方法 |
| CN106770235A (zh) * | 2016-12-03 | 2017-05-31 | 无锡艾科瑞思产品设计与研究有限公司 | 一种卡那霉素检测方法及检测卡 |
| CN108459167A (zh) * | 2018-03-16 | 2018-08-28 | 江苏维尔生物科技有限公司 | 一种用于人体尿液中β-HCG、PDG定量检测的试剂盒及其制备方法 |
| CN109655618A (zh) * | 2019-01-22 | 2019-04-19 | 江苏大学 | 一种同时检测多种氨基糖苷类抗生素的方法 |
-
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- 2015-05-14 CN CN201520310084.9U patent/CN204719028U/zh not_active Expired - Fee Related
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