CN117233374A - 一种检测美洛昔康的试纸条及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测美洛昔康的试纸条及其应用。试纸条包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)，所述反应膜上具有包被有美洛昔康半抗原‑载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)喷涂有美洛昔康单克隆抗体‑胶体金标记物。本发明还提供了一种应用上述美洛昔康试纸条检测乳及乳制品(生牛乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳、羊奶)中美洛昔康残留的方法。本发明所提供的试纸条具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低等特点，适合大量样本的筛查和现场监控。

Description

一种检测美洛昔康的试纸条及其应用

技术领域

本发明涉及一种检测美洛昔康的试纸条及其应用，具体涉及一种用于检测美洛昔康的胶体金试纸条，其特别适用于乳及乳制品(生牛乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳、羊奶)中美洛昔康残留的检测。

背景技术

美洛昔康(meloxicam)是一种新型非甾体抗炎药，具有良好的解热镇痛、消炎等作用，在兽医临床治疗方面应用广泛。然而，由于畜牧业的规模化发展，养殖数量大，不法养殖户滥用兽药、不遵守休药期等规定，导致动物源性食品残留美洛昔康药物，该药物可能引起胃肠道、肝脏、神经系统、泌尿系统及血液系统等不良反应。

为保证消费者利益和动物源性食品的安全，一些国家和地区规定了美洛昔康的最大残留限量(MRLs)，如欧盟规定了美洛昔康在牛奶中的MRLs为15μg/kg，加拿大规定了美洛昔康在牛奶中的MRLs为35μg/kg。我国GB-31650.1-2022《食品安全国家标准食品中41种兽药最大残留限量》规定了美洛昔康在牛奶中的MRLs为15μg/kg。

检测美洛昔康的方法有高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱/质谱法、超高效液相色谱-质谱/质谱法、液相色谱-质谱/质谱法等。与上述方法相比，免疫化学检测法对药物检测具有快速、特异、灵敏、准确、可以批量监测、样品处理简单、能实现自动化操作等优点。而免疫化学法检测美洛昔康的前提是需要具备针对美洛昔康的抗体，本申请发明了美洛昔康人工抗原制备方法，并将其应用于胶体金免疫层析快速检测试纸条中，用时短，操作简单，成本较低，适用于基层单位大批量地检测样品。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短的美洛昔康残留检测试纸条。

本发明所提供的检测美洛昔康残留的试纸条，包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)；所述反应膜上具有包被有美洛昔康半抗原-载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)喷涂有美洛昔康单克隆抗体-胶体金标记物。

所述美洛昔康半抗原-载体蛋白偶联物是由美洛昔康半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

所述美洛昔康单克隆抗体是以美洛昔康半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，是由美洛昔康单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。

所述样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)依次粘贴在底板(7)上，所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。

所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：

1)制备喷涂有美洛昔康单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2)制备具有包被有美洛昔康半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。

具体地说，步骤包括：

1)半抗原制备：将美洛昔康与1,4-二氧六环等物质经过一系列化学反应得到美洛昔康半抗原；

2)将美洛昔康半抗原与载体蛋白偶联，得到美洛昔康半抗原-载体蛋白偶联物；

3)用美洛昔康半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到美洛昔康单克隆杂交瘤细胞株；

4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

6)将步骤3)制备的美洛昔康单克隆抗体加入步骤5)制备的胶体金中，得到美洛昔康单克隆抗体-胶体金标记物；

7)将美洛昔康单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；

8)将美洛昔康半抗原-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线；

9)将样品吸收垫用含0.5％牛血清白蛋白(体积分数)、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；

10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收垫盖住结合物释放垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4～30℃条件下可保存12个月。

本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测乳及乳制品(生牛乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳、羊奶)中美洛昔康残留的方法，它包括步骤：

(1)用试纸条进行检测；

(2)分析检测结果。

本发明的美洛昔康快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及竞争抑制免疫层析分析技术，将美洛昔康单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的美洛昔康在流动过程中，与结合物释放垫上的美洛昔康单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成药物-抗体-胶体金标记物。样本中的药物与反应膜检测线上的美洛昔康半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合美洛昔康单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带有无或颜色深浅来判断待测样品液中是否含有美洛昔康残留。

检测时，样品经处理后滴入试纸条孔内，当美洛昔康在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的美洛昔康半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线(T)和质控线(C)内各出现一条红色条带；如果美洛昔康在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与美洛昔康全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与美洛昔康半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。

本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本发明试纸条检测美洛昔康残留的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

图1为美洛昔康半抗原合成图。

图2为试纸条剖面结构示意图。

图3为美洛昔康半抗原核磁氢谱图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1美洛昔康检测试纸条的制备

该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

1)制备喷涂有美洛昔康单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2)制备具有包被有美洛昔康半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和PVC底板组装成试纸条。

下面分步详细叙述：

1、美洛昔康半抗原的制备

3.0g化合物Ⅰ，加入1,4-二氧六环80mL，加叔丁醇钠1.15g，醋酸铅0.2g，(2R)-1-[(1R)-1-[双(1,1-二叔丁基)膦]乙基]-2-(二环己基膦)二茂铁0.2g，充分搅拌，加巯基丙酸2.12g，搅拌，加热回流反应12h。停止加热，冷却至室温，加水200mL，加乙酸乙酯100mL，萃取，除去水相，有机相蒸干，无水乙醇20mL重结晶，得到化合物Ⅱ1.49g，收率39.9％；

全部的化合物Ⅱ1.49g，依次加二甲基甲酰胺20mL、二甲苯80mL，加2-氨基-5-甲基噻唑0.68g，充分搅拌，装上回流冷凝管，加热回流反应24h，旋蒸，除去有机溶剂，得到红色油状物，上硅胶柱，加体积比为5/1的二氯甲烷/甲醇洗脱分离纯化，得到化合物Ⅲ0.76g，收率41.8％，即为半抗原产物。

2、免疫原的制备

取化合物Ⅲ16.97mg，加1mlDMF溶解澄清，加NHS12.87mg，EDC18.1mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液A液；取牛血清白蛋白BSA 50mg，加0.1mol/L pH9.5的CB缓冲液4ml溶解，得到B液，将A液逐滴滴加到B液中，室温反应6h，停止反应，0.02mol/LPBS透析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到美洛昔康-BSA偶联物，即为免疫原。

3、包被原的制备

与免疫原制备方法相同，20.22mg化合物Ⅲ与100mg卵清蛋白OVA，在pH9.5的CB缓冲液中偶联，透析纯化后得到美洛昔康-OVA偶联物，得到包被原。

4、美洛昔康单克隆抗体的制备

(1)动物免疫

将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

(2)细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(3)细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

(4)单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量分数)，碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量分数)；所述细胞培养基的pH为7.4。

5、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

6、美洛昔康单克隆抗体-胶体金标记物的制备

(1)胶体金的制备

用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％(质量分数)，取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml 1％柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。

(2)美洛昔康单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至7.0，按每毫升胶体金溶液中加入20～50μg的标准向胶体金溶液中加入美洛昔康单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10％BSA，使其在胶体金溶液中的终浓度为1％(体积分数)，静置10min。12000r/min、4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。

复溶缓冲液：含酪蛋白0.02％～0.1％(质量分数)、吐温-80 0.05％～0.2％(质量分数)、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

7、结合物释放垫的制备

将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为0.5％)、pH为7.2、0.5mol/L的磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1h，37℃烘3h备用。用Isoflow喷膜仪将制备好的美洛昔康单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01ml美洛昔康单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37℃环境中(湿度＜20％)60min后取出，置于干燥环境(湿度＜20％)中保存备用。

8、反应膜的制备

将美洛昔康半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线。

包被过程：用磷酸缓冲液将美洛昔康半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T线)，包被量为0.8μl/cm；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C线)，包被量为1.0μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

9、样品吸收垫的制备

将样品吸收垫置于含0.5％牛血清白蛋白(体积分数)、pH7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h备用。

10、试纸条的组装

将样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PVC底板上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线和质控线，检测线(T线)和质控线(C线)均为与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸条用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，4～30℃条件下可保存12个月。

实施例2样品中美洛昔康残留的检测

1、用试纸条进行检测

用吸管吸取待检样品溶液垂直滴加3滴于加样孔，液体流动时开始计时，反应5～10min，判定结果。

2、分析检测结果

通过胶体金分析仪(简称“分析仪”)读取结果：

阴性(-)：表示样品中待测物质浓度低于检测限；

阳性(+)：表示样品中待测物质浓度等于或高于检测限；

无效：表示需要重新测试。

实施例3样品检测实例

1、检测限试验

取空白乳及乳制品(生牛乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳、羊奶)样本，在其中分别添加美洛昔康至终浓度为0.025、0.05、0.075μg/L，取试纸条进行检测，每个样本重复测定三次。

用试纸条检测乳及乳制品(生牛乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳、羊奶)样本时，当其中美洛昔康添加浓度为0.025μg/L时，分析仪显示为阴性；当其中美洛昔康添加浓度为0.05、0.075μg/L时，分析仪显示为阳性。

2、假阳性率、假阴性率试验

取已知美洛昔康含量为0.05μg/L的乳及乳制品(生牛乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳、羊奶)阳性样本各50份和含量小于0.025μg/L的乳及乳制品(生牛乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳、羊奶)阴性样本各50份，用三批试纸条进行检测，计算其阴阳性率。结果见表1。

表1乳及乳制品(生牛乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳、羊奶)检测样本结果

结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性乳及乳制品(生牛乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳、羊奶)样本时，生牛乳样本的假阴性率为2％，其他样本的假阴性率为0％；UHT灭菌乳、羊奶样本的假阳性率为4％，其他样本的假阳性率为0％。上述样本出现了少量假阴性样本或少量假阳性样本，但总体的假阴性率和假阳性率较低，符合兽药残留检测试剂盒(条、卡)备案技术资料要求，说明本发明的检测美洛昔康的试纸条可以对乳及乳制品(生牛乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳、羊奶)中美洛昔康残留进行快速检测。

3、特异性试验

测定与庆大霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、链霉素、双氢链霉素、安乃近代谢物、雌二醇、青霉素G、头孢氨苄、四环素、土霉素、玉米赤霉醇、黄曲霉毒素M1、三聚氰胺、粘杆菌素、诺氟沙星等药物(为乳品中可能的联合用药)的交叉反应率，结果见表2。试验结果显示试纸条不与乳品中可能联合用药的药物反应，因此，在实际应用中，试纸条特异性良好，避免了不必要的交叉反应。

表2特异性试验

Claims (7)

1.一种检测美洛昔康的试纸条，包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)，其特征在于所述反应膜上具有包被有美洛昔康半抗原-载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)喷涂有美洛昔康单克隆抗体-胶体金标记物，所述美洛昔康半抗原的制备方法如下：

3.0g化合物Ⅰ，加入1,4-二氧六环80mL，加叔丁醇钠1.15g，醋酸铅0.2g，(2R)-1-[(1R)-1-[双(1,1-二叔丁基)膦]乙基]-2-(二环己基膦)二茂铁0.2g，充分搅拌，加巯基丙酸2.12g，搅拌，加热回流反应12h；停止加热，冷却至室温，加水200mL，加乙酸乙酯100mL，萃取，除去水相，有机相蒸干，无水乙醇20mL重结晶，得到化合物Ⅱ1.49g，收率39.9％；

全部的化合物Ⅱ1.49g，依次加二甲基甲酰胺20mL、二甲苯80mL，加2-氨基-5-甲基噻唑0.68g，充分搅拌，装上回流冷凝管，加热回流反应24h，旋蒸，除去有机溶剂，得到红色油状物，上硅胶柱，加体积比为5/1的二氯甲烷/甲醇洗脱分离纯化，得到化合物Ⅲ0.76g，收率41.8％，即为半抗原产物。

2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)依次粘贴在底板(7)上。

3.如权利要求1-2任一项所述的试纸条，其特征在于所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。

4.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述美洛昔康半抗原-载体蛋白偶联物由美洛昔康半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

5.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述美洛昔康单克隆抗体是以美洛昔康半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。

6.一种制备权利要求1-5任一项所述试纸条的方法，其包括步骤：

1)制备喷涂有美洛昔康单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2)制备具有包被有美洛昔康半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。

7.一种检测乳及乳制品中美洛昔康残留的方法，其包括步骤：

1)用权利要求1-5任一项所述的试纸条进行检测；

2)分析检测结果。