CN118090983A - 布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法 - Google Patents
布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于药物提取与药物检测的技术领域，具体涉及布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法。本发明所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，取布比卡因/美洛昔康复方凝胶，加入促进剂，在40‑60℃溶解至透明澄清溶液，过滤后得到供试品溶液，采用高效液相色谱法测定活性物质布比卡因和美洛昔康的含量。本发明提供布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，高效提取HTX‑011复方凝胶中的活性物质布比卡因和美洛昔康，利用高效液相色谱法检测HTX‑011复方凝胶中的活性物质布比卡因和美洛昔康，检测时效快、准确度高。
Description
技术领域
本发明属于药物提取与药物检测的技术领域，具体涉及布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法。
背景技术
布比卡因/美洛昔康复方凝胶（HTX-011）是由局部麻醉剂布比卡因与抗炎药美洛昔康组成的固定剂量的组合产品，属于第三个长效布比卡因制剂，也是第一个长效布比卡因的复方制剂，是一款新型、非阿片类止痛药，利用美洛昔康的控制组织炎症，从而使pH值正常化的作用，进一步增强布比卡因的作用，从而增加镇痛作用，专门用于在手术部位单次给药治疗术后疼痛和炎症。
布比卡因/美洛昔康复方凝胶复方凝胶的作用机理是：在生物体内，由于水分渗入缓释材料聚原酸酯（POE）内，使POE中的酯键水解，从而引起面降解及本体降解的发生，产物水溶性小分子可被有机体代谢，但由于复方凝胶体系中三甘醇聚原酸酯的存在，在提供缓释效果的同时，也增加了复方凝胶样品整体的粘度，因此在进行含量以及有关物质检测时，干扰了液相的进样和分离度。所以需要提前将高粘度的辅料去除，实现两种原料药的提取与分离。但是，由于其分离的难度较大，还没有建立起同时测定布比卡因和美洛昔康的稳定性检测方法。
目前，对于该HTX-011中的布比卡因、美洛昔康两种活性物质的分别检测，可采用高效液相色谱串联质谱法、高效液相色谱法，但是高效液相色谱串联质谱法的质谱检测器价格昂贵，仍然是阻碍其广泛使用的一个障碍。高效液相色谱法可以同时检测多种样品，而不会受限于pH值范围或消耗大量溶剂，技术简单、快速、经济、系统，而且对药物及其降解产物的分离和定量具有足够的准确性。但是，高效液相色谱法对于高粘度的样品检测效果是较差的，不仅进样困难，即使经过稀释的样品，依旧在色谱柱中容易堵塞，对仪器造成损坏，影响检测与分离。HTX-011复方凝胶作为缓释制剂，粘度高达3500mPa s，粘度大且对水较为敏感，接触水之后凝胶固化变得更加粘稠拉丝且不易处理，且很多分析检测所用到的流动相包含水，对实际检测造成影响，无法实现含量的分析。对于其中的活性成分布比卡因和美洛昔康，是无法完全从高分子基质中提取并检测的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，高效提取HTX-011复方凝胶中的活性物质布比卡因和美洛昔康，利用高效液相色谱法检测HTX-011复方凝胶中的活性物质布比卡因和美洛昔康，检测时效快、准确度高。
本发明所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，包括以下步骤：取布比卡因/美洛昔康复方凝胶，加入促进剂，在40-60℃溶解至透明澄清溶液，过滤后得到供试品溶液，采用高效液相色谱法测定活性物质布比卡因和美洛昔康的含量。
在40-60℃恒温溶解1.5-3h。
溶解过程中采取恒温振荡、超声、旋涡、搅拌的方式，溶解过程中采取恒温间歇振荡方式。
还包括向布比卡因/美洛昔康复方凝胶中加入调节剂。
调节剂为马来酸、磷酸、丙二酸、柠檬酸、氢氟酸、甲酸、乳酸、乙酸、丙酸、次氯酸、硅酸中的一种或多种。
调节剂的加入量与布比卡因/美洛昔康复方凝胶的体积比为（1:10）-（1:2），调节剂的浓度为1mg/mL-5mg/mL。
促进剂为十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠、三乙醇胺、吐温-80、吐温-20中的一种或多种。
布比卡因/美洛昔康复方凝胶与促进剂的体积比为1:9，促进剂的浓度为1mg/mL-5mg/mL。
采用高效液相色谱法的色谱条件为：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：Shim-Pack-GIST C18，规格为4.6×250mm，5µm；
检测波长：260nm-350nm；
柱温：25℃-35℃；
流速：0.5mL/min-1.5mL/min；
进样体积：20-50μL；
流动相：以0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比80:20为流动相A，0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比30:70为流动相B。其中磷酸盐溶液是将磷酸二氢钾2.72g、氢氧化钠0.75g，加水1000mL溶解制得。
所述的洗脱梯度，如表1所示。
表1洗脱梯度
具体的，所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，包括以下步骤：
（1）前处理：取布比卡因/美洛昔康复方凝胶，加入促进剂，还可以加入调节剂，在40-60℃恒温溶解1.5-3h，至透明澄清溶液，经过0.45μm的针式滤头后得到供试品溶液；布比卡因/美洛昔康复方凝胶与促进剂的体积比为1:9，促进剂的浓度为1mg/mL-5mg/mL；
调节剂的加入量与布比卡因/美洛昔康复方凝胶的体积比为（1:10）-（1:2），调节剂的浓度为1mg/mL-5mg/mL。
（2）采用高效液相色谱法测定活性物质布比卡因和美洛昔康的含量。
本发明的比卡因/美洛昔康复方凝胶凝胶配方包含：活性物质布比卡因、美洛昔康，缓释材料三甘醇聚原酸酯，有机溶剂三醋酸甘油酯和N-甲基吡咯烷酮以及马来酸。其中布比卡因29.25mg/mL，美洛昔康0.88mg/mL，三甘醇聚原酸酯730mg/mL，三醋酸甘油酯293mg/mL，N-甲基吡咯烷酮117mg/mL和马来酸0.59mg/mL，粘度为：3500mPa s。
本发明所述的配制促进制剂样品溶解提取原料药的溶液、促进溶液溶解均匀的方法、在升高的温度下加热所述药物组合物足够的时间、调整制剂样品的浓度、处理高效液相色谱进样前溶液的处理。其中，根据聚原酸酯本身作为极疏水的材料，可用于与水解不稳定的原酸酯键反应的水量是有限的，聚合物仅具有非常缓慢的水解。而且在生理条件下，聚合物聚原酸酯是非常稳定的。本发明配制促进制剂样品溶解提取原料药的溶液，首先采用表面活性剂改善聚原酸酯表面的疏水性质，从而增加制剂样品整体的溶解效果。由于布比卡因/美洛昔康复方凝胶中的原酸酯键对酸是敏感的，选用弱酸促进原酸酯键断裂，加快自催化的水解过程，以便于原料药的提取过程。通过振荡、超声、旋涡、搅拌等方法的振动和分散作用，使固液更加充分的混合，浓稀溶质均匀，加快接触面表面的液体流速，而加快液体的流速会加快表面的物质传导速度，大大增加与溶剂的接触面积可以实现促进溶液溶解的均匀分散。
本发明采用的温度不断升高可以促进聚原酸酯的溶解过程，一方面促进聚原酸酯溶质分子的扩散过程，另一方面加快聚原酸酯溶质分子与溶剂之间的分子相互作用促进降解的过程。并且，足够的加热稳定时间确保了降解的完全。本发明选择的制剂样品的浓度，可以高效快速的实现溶液均质的目的。本发明为了避免高粘度的布比卡因/美洛昔康复方凝胶堵塞色谱柱，对仪器造成损坏的问题，在进行高效液相色谱检测前采取了过滤、离心等处理方式，不仅增加了溶液的均匀度，而且对复方凝胶中的活性物质提取完全，检测效率高。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：
（1）本发明的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，采用促进剂以及调节剂将复方凝胶样品处理为可检测的粘度较低的溶液，检测效果好。
（2）本发明的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，将前处理好的复方凝胶样品进行高效液相色谱检测，检测分离度好，准确度高。
附图说明
图1是实施例1中空白溶剂的液相色谱图。
图2是实施例1中对照品溶液的液相色谱图。
图3是实施例1中空白辅料溶液的液相色谱图。
图4是实施例1中供试品溶液的液相色谱图。
图5是实施例2的液相色谱图。
图6是实施例3的液相色谱图。
图7是实施例4的液相色谱图。
图8是实施例5的液相色谱图。
图9是实施例6的液相色谱图。
图10是实施例7的液相色谱图。
图11为实施例8的液相色谱图。
图12为实施例9的液相色谱图。
图13为对比例2的液相色谱图。
图14为对比例3的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
以下实施例和对比例所采用的原料与试剂均为市售产品。
以下实施例中所采用的布比卡因/美洛昔康复方凝胶粘度为3500mPa s。所述的十二烷基硫酸钠溶液的制备为：称取白色粉末十二烷基硫酸钠溶解于纯化水中，搅拌混合均匀至透明澄清溶液，作为体系中的溶剂最终定容至容量瓶刻度线。
以下所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶的批号为83525，生产厂家为HeronTherapeutics.Inc。
布比卡因对照品的批号为S14-2206003，生产厂家为江苏天和制药有限公司。
美洛昔康对照品的批号为220903，生产厂家为江苏飞马药业有限公司。
实施例1
所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，包括以下步骤：
（1）前处理：用无针头注射器取1mL布比卡因/美洛昔康复方凝胶，注入10mL的容量瓶中；加入浓度为1mg/mL十二烷基硫酸钠溶液，至容量瓶刻度线，在60℃恒温溶解3h，采取100rpm水浴恒温振荡器溶解，至透明澄清溶液，经过0.45μm的针式滤头过滤后，得到检测溶液；
（2）溶液配制：
空白溶剂：取流动相A（0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比80:20混合溶液）作为空白溶剂；
对照品溶液：首先取美洛昔康对照品约17mg置于20mL量瓶中，加入乙腈5mL、流动相A5mL，超声溶解后放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，配制得到美洛昔康对照品贮备液。然后取布比卡因碱对照品约30mg置于100mL量瓶中，加溶剂适量，超声使其溶解，放冷，随后精密加入美洛昔康对照品贮备液1mL，用溶剂稀释至刻度，摇匀，最终得到对照品溶液；
空白辅料溶液：称取3.650g的三甘醇聚原酸酯，溶解于1.465g的三醋酸甘油酯中，然后再加入0.585g的二甲基亚砜和2.950mg的马来酸，混合溶解完全后，取上述溶液1g，置于10mL量瓶中，用空白溶剂稀释至刻度，最终得到空白辅料溶液；
供试品溶液：上述前处理步骤中，透明澄清溶液在经过0.45μm的针式滤头过滤后的溶液，取1g置于10mL的量瓶中，用空白溶剂稀释至刻度，得到供试品溶液。
将以上制备的空白溶剂、对照品溶液、空白辅料溶液、供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，采用高效液相色谱法测定活性物质布比卡因和美洛昔康的含量。由图1可以看出，空白溶剂无杂质峰；由图2可以看出，对照品溶液中美洛昔康盒布比卡因的保留时间为6.268min和27.463min，出峰时间合适，且峰型良好；由图3可以看出，根据空白辅料峰，排除了辅料峰对原料峰的影响；由图4可以看出，美洛昔康和布比卡因出峰时间准确，回收率均符合实际含量，实际测定和分析后其回收率分别为105.64%和106.19%，该方法有效可行，提取完全、稳定性良好。
采用高效液相色谱法的色谱条件为：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：Shim-Pack-GIST C18，规格为4.6×250mm，5µm；
检测波长：260nm；
柱温：25℃；
流速：0.5mL/min；
进样体积：30μL；
流动相：以0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比80:20为流动相A，0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比30:70为流动相B。其中磷酸盐溶液是将磷酸二氢钾2.72g、氢氧化钠0.75g，加水1000mL溶解制得。
洗脱梯度如表1所示。
实施例2
所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，包括以下步骤：
（1）前处理：用无针头注射器取1mL布比卡因/美洛昔康复方凝胶，注入10mL的容量瓶中；加入浓度为5mg/mL十二烷基硫酸钠溶液，至容量瓶刻度线，在60℃恒温溶解3h，采取100rpm水浴恒温振荡器溶解，至透明澄清溶液，经过0.45μm的针式滤头过滤后，得到检测溶液；
（2）供试品溶液的配制：
取上述检测溶液1g置于10mL的量瓶中，用空白溶剂稀释至刻度，得到供试品溶液。将供试品溶液注入高效液相色谱仪，采用高效液相色谱法测定活性物质布比卡因和美洛昔康的含量。如图5所示，美洛昔康和布比卡因出峰时间准确，回收率均符合实际含量，经实际测定和分析后其回收率分别为100.42%和107.40%，该方法有效可行，提取完全、稳定性良好。
采用高效液相色谱法的色谱条件为：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：Shim-Pack-GIST C18，规格为4.6×250mm，5µm；
检测波长：260nm；
柱温：25℃；
流速：0.5mL/min；
进样体积：30μL；
流动相：以0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比80:20为流动相A，0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比30:70为流动相B。其中磷酸盐溶液的配制与实施例1相同。
洗脱梯度如表1所示。
实施例3
所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，包括以下步骤：
（1）前处理：用无针头注射器取1mL布比卡因/美洛昔康复方凝胶，注入10mL的容量瓶中；加入浓度为5mg/mL十六烷基三甲基溴化铵，至容量瓶刻度线，在60℃恒温溶解3h，采取100rpm水浴恒温振荡器溶解，至透明澄清溶液，经过0.45μm的针式滤头过滤后，得到检测溶液；
（2）供试品溶液的配制：
取上述检测溶液1g置于10mL的量瓶中，用空白溶剂稀释至刻度，得到供试品溶液。将供试品溶液注入高效液相色谱仪，采用高效液相色谱法测定活性物质布比卡因和美洛昔康的含量。如图6所示，美洛昔康和布比卡因出峰时间准确，回收率均符合实际含量，经实际测定和分析后其回收率分别为99.36%和102.15%，该方法有效可行，提取完全、稳定性良好。
采用高效液相色谱法的色谱条件为：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：Shim-Pack-GIST C18，规格为4.6×250mm，5µm；
检测波长：260nm；
柱温：25℃；
流速：0.5mL/min；
进样体积：30μL；
流动相：以0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比80:20为流动相A，0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比30:70为流动相B。其中磷酸盐溶液的配制与实施例1相同。
洗脱梯度如表1所示。
实施例4
所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，包括以下步骤：
（1）前处理：用无针头注射器取1mL布比卡因/美洛昔康复方凝胶，注入10mL的容量瓶中；浓度1mg/mL的十二烷基硫酸钠溶液作为溶剂，配制成0.04g/mL的马来酸-十二烷基硫酸钠溶液，容量瓶中再加入5mL马来酸-十二烷基硫酸钠溶液；然后向容量瓶中加入浓度为1mg/mL十二烷基硫酸钠溶液，至容量瓶刻度线，在60℃恒温溶解2h，采取100rpm水浴恒温振荡器溶解，至透明澄清溶液，经过0.45μm的针式滤头过滤后，得到检测溶液；
（2）供试品溶液的配制：
取上述检测溶液1g置于10mL的量瓶中，用空白溶剂稀释至刻度，得到供试品溶液。将供试品溶液注入高效液相色谱仪，采用高效液相色谱法测定活性物质布比卡因和美洛昔康的含量。如图7所示，美洛昔康和布比卡因出峰时间合适，回收率均符合实际含量，美洛昔康和布比卡因的保留时间分别为7.046min、28.117min，含量均在95%-104%之间，两组分提取完全。
采用高效液相色谱法的色谱条件为：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：Shim-Pack-GIST C18，规格为4.6×250mm，5µm；
检测波长：260nm；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
进样体积：20μL；
流动相：以0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比80:20为流动相A，0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比30:70为流动相B。其中磷酸盐溶液的配制与实施例1相同。
洗脱梯度如表1所示。
实施例5
所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，包括以下步骤：
（1）前处理：用无针头注射器取1mL布比卡因/美洛昔康复方凝胶，注入10mL的容量瓶中；浓度1mg/mL的十二烷基硫酸钠溶液作为溶剂，配制成0.1g/mL的马来酸-十二烷基硫酸钠溶液，容量瓶中再加入5mL马来酸-十二烷基硫酸钠溶液；然随后容量瓶中向加入浓度为1mg/mL十二烷基硫酸钠溶液，至容量瓶刻度线，在60℃恒温溶解2h，采取100rpm水浴恒温振荡器溶解，至透明澄清溶液，经过0.45μm的针式滤头过滤后，得到检测溶液；
（2）供试品溶液的配制：
取上述检测溶液1g置于10mL的量瓶中，用空白溶剂稀释至刻度，得到供试品溶液。将供试品溶液注入高效液相色谱仪，采用高效液相色谱法测定活性物质布比卡因和美洛昔康的含量。如图8所示，美洛昔康和布比卡因出峰时间合适，回收率均符合实际含量，美洛昔康和布比卡因的保留时间分别为7.046min、28.115min，含量98%-113%之间，两组分提取完全。
采用高效液相色谱法的色谱条件为：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：Shim-Pack-GIST C18，规格为4.6×250mm，5µm；
检测波长：260nm；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
进样体积：20μL；
流动相：以0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比80:20为流动相A，0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比30:70为流动相B。其中磷酸盐溶液的配制与实施例1相同。
洗脱梯度如表1所示。
实施例6
所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，包括以下步骤：
（1）前处理：用无针头注射器取1mL布比卡因/美洛昔康复方凝胶，注入10mL的容量瓶中；浓度1mg/mL的十二烷基硫酸钠溶液作为溶剂，配制成0.02g/mL的磷酸-十二烷基硫酸钠溶液，容量瓶中再加入5mL磷酸-十二烷基硫酸钠溶液；然后向容量瓶中加入浓度为1mg/mL十二烷基硫酸钠溶液，至容量瓶刻度线，在40℃恒温溶解1.5h，采取100rpm水浴恒温振荡器溶解，至透明澄清溶液，经过0.45μm的针式滤头过滤后，得到检测溶液；
（2）供试品溶液的配制：
取上述检测溶液1g置于10mL的量瓶中，用空白溶剂稀释至刻度，得到供试品溶液。将供试品溶液注入高效液相色谱仪，采用高效液相色谱法测定活性物质布比卡因和美洛昔康的含量。如图9所示，美洛昔康和布比卡因出峰时间合适，回收率均符合实际含量，美洛昔康和布比卡因的保留时间分别为7.152min、27.784min，含量95%-100%之间，两组分提取完全。
采用高效液相色谱法的色谱条件为：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：Shim-Pack-GIST C18，规格为4.6×250mm，5µm；
检测波长：260nm；
柱温：30℃；
流速：1.5mL/min；
进样体积：40μL；
流动相：以0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比80:20为流动相A，0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比30:70为流动相B。其中磷酸盐溶液的配制与实施例1相同。
洗脱梯度如表1所示。
实施例7
所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，包括以下步骤：
（1）前处理：用无针头注射器取1mL布比卡因/美洛昔康复方凝胶，注入10mL的容量瓶中；浓度1mg/mL的十二烷基硫酸钠溶液作为溶剂，配制成0.04g/mL的磷酸-十二烷基硫酸钠溶液，容量瓶中再加入5mL磷酸-十二烷基硫酸钠溶液；然后向容量瓶中加入浓度为1mg/mL十二烷基硫酸钠溶液，至容量瓶刻度线，在40℃恒温溶解1.5h，采取100rpm水浴恒温振荡器溶解，至透明澄清溶液，经过0.45μm的针式滤头过滤后，得到检测溶液；
（2）供试品溶液的配制：
取上述检测溶液1g置于10mL的量瓶中，用空白溶剂稀释至刻度，得到供试品溶液。将供试品溶液注入高效液相色谱仪，采用高效液相色谱法测定活性物质布比卡因和美洛昔康的含量。如图10所示，美洛昔康和布比卡因出峰时间合适，回收率均符合实际含量，美洛昔康和布比卡因的保留时间分别为6.981min、27.728min，含量95%-100%之间，两组分提取完全。
采用高效液相色谱法的色谱条件为：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：Shim-Pack-GIST C18，规格为4.6×250mm，5µm；
检测波长：260nm；
柱温：30℃；
流速：1.5mL/min；
进样体积：40μL；
流动相：以0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比80:20为流动相A，0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比30:70为流动相B。其中磷酸盐溶液的配制与实施例1相同。
洗脱梯度如表1所示。
实施例8
所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，包括以下步骤：
（1）前处理：用无针头注射器取1mL布比卡因/美洛昔康复方凝胶，注入10mL的容量瓶中；浓度1mg/mL的十二烷基硫酸钠溶液作为溶剂，配制成0.1g/mL的磷酸-十二烷基硫酸钠溶液，容量瓶中再加入5mL磷酸-十二烷基硫酸钠溶液；然后容量瓶中向加入浓度为1mg/mL十二烷基硫酸钠溶液，至容量瓶刻度线，在40℃恒温溶解1.5h，采取100rpm水浴恒温振荡器溶解，至透明澄清溶液，经过0.45μm的针式滤头过滤后，得到检测溶液；
（2）供试品溶液的配制：
取上述检测溶液1g置于10mL的量瓶中，用空白溶剂稀释至刻度，得到供试品溶液。将供试品溶液注入高效液相色谱仪，采用高效液相色谱法测定活性物质布比卡因和美洛昔康的含量。如图11所示，美洛昔康和布比卡因出峰时间合适，回收率均符合实际含量，美洛昔康和布比卡因的保留时间分别为6.929min、28.113min，含量95%-100%之间，两组分提取完全。
采用高效液相色谱法的色谱条件为：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：Shim-Pack-GIST C18，规格为4.6×250mm，5µm；
检测波长：260nm；
柱温：30℃；
流速：1.5mL/min；
进样体积：40μL；
流动相：以0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比80:20为流动相A，0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比30:70为流动相B。其中磷酸盐溶液的配制与实施例1相同。
洗脱梯度如表1所示。
实施例9
所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，包括以下步骤：
（1）前处理：用无针头注射器取1mL布比卡因/美洛昔康复方凝胶，注入10mL的容量瓶中；浓度1mg/mL的十二烷基硫酸钠溶液作为溶剂，配制成0.1g/mL的丙二酸-十二烷基硫酸钠溶液，容量瓶中再加入5mL丙二酸-十二烷基硫酸钠溶液；然后容量瓶中向加入浓度为1mg/mL十二烷基硫酸钠溶液，至容量瓶刻度线，在40℃恒温溶解3h，采取100rpm水浴恒温振荡器溶解，至透明澄清溶液，经过0.45μm的针式滤头过滤后，得到检测溶液；
（2）供试品溶液的配制：
取上述检测溶液1g置于10mL的量瓶中，用空白溶剂稀释至刻度，得到供试品溶液。将供试品溶液注入高效液相色谱仪，采用高效液相色谱法测定活性物质布比卡因和美洛昔康的含量。如图12所示，美洛昔康和布比卡因出峰时间合适，回收率均符合实际含量，美洛昔康和布比卡因的保留时间分别为6.981min、27.728min，含量95%-100%之间，两组分提取完全。
采用高效液相色谱法的色谱条件为：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：Shim-Pack-GIST C18，规格为4.6×250mm，5µm；
检测波长：260nm；
柱温：30℃；
流速：1.5mL/min；
进样体积：40μL；
流动相：以0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比80:20为流动相A，0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比30:70为流动相B。其中磷酸盐溶液的配制与实施例1相同。
洗脱梯度如表1所示。
对比例1
一种布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，包括以下步骤：
（1）前处理：用无针头注射器取1mL布比卡因/美洛昔康复方凝胶，注入10mL的容量瓶中；加入浓度为5mg/mL十二烷基硫酸钠溶液，至容量瓶刻度线，在25℃恒温溶解，采取100rpm水浴恒温振荡器溶解，观察在恒温搅拌3h后，整体上层为透明澄清溶液，下层仍存在未降解的复方凝胶，然后取上层澄清溶液，经过0.45μm的针式滤头过滤后，得到检测溶液；
（2）供试品溶液的配制：
取上述检测溶液1g置于10mL的量瓶中，用空白溶剂稀释至刻度，得到供试品溶液。将供试品溶液注入高效液相色谱仪，采用高效液相色谱法测定活性物质布比卡因和美洛昔康的含量。其注入色谱仪后基本无峰值显示，无具体检测图谱分析。
采用高效液相色谱法的色谱条件为：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：Shim-Pack-GIST C18，规格为4.6×250mm，5µm；
检测波长：260nm；
柱温：25℃；
流速：0.5mL/min；
进样体积：50μL；
流动相：以0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比80:20为流动相A，0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比30:70为流动相B。其中磷酸盐溶液与实施例1相同。
洗脱梯度如表1所示。
对比例2
一种布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，包括以下步骤：
（1）前处理：用无针头注射器取1mL布比卡因/美洛昔康复方凝胶，注入10mL的容量瓶中；浓度1mg/mL的十二烷基硫酸钠溶液作为溶剂，配制成0.02g/mL的马来酸-十二烷基硫酸钠溶液，容量瓶中再加入5mL马来酸-十二烷基硫酸钠溶液；然后向容量瓶中加入浓度为1mg/mL十二烷基硫酸钠溶液，至容量瓶刻度线，在60℃恒温溶解2h，采取100rpm水浴恒温振荡器溶解，至透明澄清溶液，经过0.45μm的针式滤头过滤后，得到检测溶液；
（2）供试品溶液的配制：
取上述检测溶液1g置于10mL的量瓶中，用空白溶剂稀释至刻度，得到供试品溶液。将供试品溶液注入高效液相色谱仪，采用高效液相色谱法测定活性物质布比卡因和美洛昔康的含量。如图13所示，美洛昔康和布比卡因出峰时间合适，美洛昔康和布比卡因的保留时间分别为6.978min、28.067min，但其回收率不符合实际含量，发现只检测到41.07%的美洛昔康，说明体系中美洛昔康组分的溶解不完全，而其中布比卡因含量为108.20%，布比卡因组分提取完全。
采用高效液相色谱法的色谱条件为：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：Shim-Pack-GIST C18，规格为4.6×250mm，5µm；
检测波长：260nm；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
进样体积：50μL；
流动相：以0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比80:20为流动相A，0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比30:70为流动相B。其中磷酸盐溶液与实施例1相同。
洗脱梯度如表1所示。
对比例3
一种布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，包括以下步骤：
前处理：用无针头注射器取1mL布比卡因/美洛昔康复方凝胶，注入10mL的容量瓶中；浓度1mg/mL的十二烷基硫酸钠溶液作为溶剂，配制成0.1g/mL的马来酸-十二烷基硫酸钠溶液，容量瓶中再加入5mL马来酸-十二烷基硫酸钠溶液；然后向容量瓶中加入浓度为1mg/mL十二烷基硫酸钠溶液，至容量瓶刻度线，在60℃恒温溶解2h，采取100rpm水浴恒温振荡器溶解，至透明澄清溶液，经过0.45μm的针式滤头过滤后得到检测溶液；
（2）供试品溶液的配制：
取上述检测溶液1g置于10mL的量瓶中，用空白溶剂稀释至刻度，得到供试品溶液。将供试品溶液注入高效液相色谱仪，采用高效液相色谱法测定活性物质布比卡因和美洛昔康的含量。如图14所示，发现该检测波长无法检测到体系中布比卡因组分，无法同时检测到两组分，与实际含量不符，该色谱检测波长无法满足检测条件。
采用高效液相色谱法的色谱条件为：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：Shim-Pack-GIST C18，规格为4.6×250mm，5µm；
检测波长：350nm；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
进样体积：50μL；
流动相：以0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比80:20为流动相A，0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比30:70为流动相B。其中磷酸盐溶液与实施例1相同。
洗脱梯度如表1所示。
将以上实施例和对比例经过步骤（1）的前处理后，样品状态，以及经过高效液相色谱检测后，其布比卡因含量和美洛昔康含量的检测结果如表2所示，所述的含量为质量含量。
表2检测结果
由以上表2可以看出，本发明通过向布比卡因/美洛昔康复方凝胶中加入促进剂、调节剂，以及控制合适的温度，进行前处理后，溶液呈现无色透明，通过对比处理前后的溶液粘度变化，并采用高效液相色谱法测定两种活性物质的含量，美洛昔康和布比卡因出峰时间合适，回收率均符合实际含量，证明本发明能够快速高效提取HTX-011复方凝胶中的活性物质布比卡因和美洛昔康，检测时效快、准确度高。而对比例1中，温度的控制是提取两种活性成分的关键，温度较低时，无法实现供试品溶液的制备；对比例2中，调节剂对制剂样品中美洛昔康原料药的影响很大，较小浓度的调节剂对单独的美洛昔康原料药提取效果很微小，无明显的提取和降解效果；对比例3，在检测波长从260nm改变到350nm的情况下，无法实现同时对两种组分的检测和图谱分析，与实际含量不符，无法满足检测条件。
Claims (10)
1.一种布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：取布比卡因/美洛昔康复方凝胶，加入促进剂，在40-60℃溶解至透明澄清溶液，过滤后得到供试品溶液，采用高效液相色谱法测定活性物质布比卡因和美洛昔康的含量。
2.根据权利要求1所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，其特征在于：在40-60℃恒温溶解1.5-3h。
3.根据权利要求2所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，其特征在于：溶解过程中采取恒温振荡、超声、旋涡、搅拌的方式。
4.根据权利要求1所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，其特征在于：还包括向布比卡因/美洛昔康复方凝胶中加入调节剂。
5.根据权利要求4所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，其特征在于：调节剂为马来酸、磷酸、丙二酸、柠檬酸、氢氟酸、甲酸、乳酸、乙酸、丙酸、次氯酸、硅酸中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，其特征在于：调节剂的加入量与布比卡因/美洛昔康复方凝胶的体积比为（1:10）-（1:2），调节剂的浓度为1mg/mL-5mg/mL。
7.根据权利要求1所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，其特征在于：促进剂为十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠、三乙醇胺、吐温-80、吐温-20中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，其特征在于：布比卡因/美洛昔康复方凝胶与促进剂的体积比为1:9，促进剂的浓度为1mg/mL-5mg/mL。
9.根据权利要求1所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，其特征在于：采用高效液相色谱法的色谱条件为：
检测器：PDA检测器；
色谱柱：Shim-Pack-GIST C18，规格为4.6×250mm，5µm；
检测波长：260nm-350nm；
柱温：25℃-35℃；
流速：0.5mL/min-1.5mL/min；
进样体积：20-50μL；
流动相：以0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比80:20为流动相A，0.02mol/L磷酸盐溶液与乙腈按照体积比30:70为流动相B。
10.根据权利要求9所述的布比卡因/美洛昔康复方凝胶中活性物质的检测方法，其特征在于：流动相为梯度洗脱，梯度洗脱程序为：在第0min，流动相A为75%，流动相B为25%；在第7min，流动相A为75%，流动相B为25%；在第20min，流动相A为0%，流动相B为100%；在第30min，流动相A为0%，流动相B为100%；在第31min，流动相A为75%，流动相B为25%；在第40min，流动相A为75%，流动相B为25%。
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