CN113030349B - 提高脉络宁注射液中间体浸膏中肉桂酸含量检测准确度和精密度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高脉络宁注射液中间体浸膏中肉桂酸含量检测准确度和精密度的方法，包括脉络宁注射液中间体浸膏中肉桂酸的供试品溶液制备，所述供试品溶液制备包括如下具体步骤：取脉络宁注射液中间体浸膏样品，50‑80℃水浴加温助溶，振摇混合均匀，精密度量取0.5 mL，置于500 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，采用热水温溶的方法，浸膏混合更加均匀；浸膏提取由0.395 mg/mL提高到1.719 mg/mL，提取程度提高了335%；本发明确定了供试品溶解制备的优选方法,供试品溶液制备时间由改善前的4小时，降低到现在的1小时，大大缩短了供试品溶液制备时间，提高了工作效率；且使检测结果的RSD均小于2%。

Description

提高脉络宁注射液中间体浸膏中肉桂酸含量检测准确度和精密度的方法

技术领域

本发明属于药物质量检测领域，具体涉及一种提高脉络宁注射液中间体浸膏中肉桂酸含量检测准确度和精密度的方法。

背景技术

脉络宁系列产品是金陵药业股份有限公司的主要产品，其中脉络宁注射液是其中之一，处方药材为牛膝、玄参、石斛、金银花、山银花，辅料为聚山梨酯80，功能主治为清热养阴，活血化瘀，用于血栓闭塞性脉管炎、动脉硬化性闭塞症、脑血栓形成及后遗症、静脉血栓形成等病。肉桂酸是玄参中的主要活性成分，具有轻泻作用，也是诱导分化剂，能够诱导分化肿瘤细胞，肉桂酸衍生物对大鼠脑卒中有保护作用，具有代表性和可控性，所以我们选择肉桂酸作为脉络宁注射液中间体的质量控制成分之一。

按照国家药品标准WS3-B-3462-98-2011和脉络宁注射液酯提浸膏检验操作规程(STP-JY-ZJ122h)含量测定项下玄参中肉桂酸的测定方法，供试品溶液的制备方法是：本品放入30℃摇床中保温3小时后取出，精密量取0.5mL，置500mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；此方法检测时，常出现RSD大于2.0％的情况，重复性差；同时供试品前处理需摇床振荡3小时，存在制备时间长的问题。

发明内容

针对现有问题的不足，本发明的目的是提供一种提高脉络宁注射液中间体浸膏中肉桂酸含量检测准确度和精密度的方法；通过改良供试品溶液的制备方法，制定脉络宁注射液酯提肉桂酸HPLC方法学验证，同时解决现有技术制备时间长、提取度低和重复性差等问题。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

一种提高脉络宁注射液中间体浸膏中肉桂酸含量检测准确度和精密度的方法，包括脉络宁注射液中间体浸膏中肉桂酸的供试品溶液制备，所述供试品溶液制备包括如下具体步骤：取脉络宁注射液中间体浸膏样品，50-80℃水浴加温助溶，振摇混合均匀，精密度量取0.5mL，置于500mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

优选的，将所述溶解用水替换成有机溶剂或使用HPLC检测用流动相。

优选的，将用水溶解并稀释替换成两个步骤，先用有机溶剂溶解并稀释，再进一步使用HPLC检测用流动相溶解并稀释。

优选的，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮中的任意一种。

优选的，所述HPLC检测用流动相为体积比35-45:55-65的0.1％磷酸-甲醇混合溶液。

优选的，所述脉络宁注射液中间体浸膏中肉桂酸的供试品溶液制备包括如下具体步骤：取脉络宁注射液中间体浸膏样品，50-80℃水浴加温助溶，振摇混合均匀，精密度量取5mL至100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，再精密度量取1mL至50mL量瓶中，加0.1％磷酸-甲醇混合溶液溶解并稀释至刻度，即得。

更优选的，所述的提高脉络宁注射液中间体浸膏中肉桂酸含量检测准确度和精密度的方法，包括如下步骤：首先制备供试品溶液和对照品溶液，按照设定的色谱条件，进样进行测定；其中，色谱条件为：色谱柱C18(4.6*150mm，5μm)；流动相：0.1％磷酸溶液-甲醇体积比40:60；检测波长：278nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL。

优选的，所述对照品溶液的制备方法为：取肉桂酸对照品，精密称定，用50％甲醇制成每1mL含2μg的溶液。

有益效果

本发明提供的提高脉络宁注射液中间体浸膏中肉桂酸含量检测准确度和精密度的方法，与现有技术相比，具有以下有益效果：

(1)采用热水温溶的方法，浸膏混合更加均匀；

(2)将用水溶解稀释修改成先用有机溶液溶解并稀释，再使用HPLC流动相进一步溶解和稀释，提高肉桂酸的溶出率和溶出重复性；浸膏提取由0.395mg/mL提高到1.9mg/mL，提取程度提高了381％；

(4)本发明确定了供试品溶解制备的优选方法；

(5)供试品溶液制备时间由改善前的4小时，降低到现在的1小时，大大缩短了供试品溶液制备时间，提高了工作效率；

(6)本发明的方法使检测结果的RSD均小于2％。

附图说明

图1为实施例不同的样品提取方法得出的检验结果柱形图；

图2为用甲醇溶解的HPLC图谱；

图3为先用甲醇溶解再用流动相溶解的HPLC图谱；

图4为专属性试验HPLC图谱；

图5为供试品溶液放置不同时间肉桂酸含量图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。

实施例部分所用液相色谱为金陵制药厂质量管理部门液相室的两台Agilent1260高效液相色谱仪，均经过3Q认证，并经过江苏省计量院验证合格。

HPLC色谱条件：仪器：高效液相色谱仪Agilent1260；色谱柱:Kromasil C18，5μm，150*4.6mm；流动相：0.1％磷酸溶液-甲醇40:60；检测波长：278nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL。

实施例1：采用水浴加温助溶的方法将浸膏混合均匀

脉络宁注射液中间体为酯提浸膏，上层为非均一性溶液，下层为沉淀物；选用水浴加温助溶方法将浸膏混合均匀，并采用摇床振摇法、上清液滤过法、超声法进行对比，具体供试品制备方法如下表1，检测结果如图1。样品批号为20190202B。

表1不同的样品提取方法得出的检验结果表

由表1可知，通过水浴加温助溶，检测结果的RSD均小于2％，重复性达到预期。

实施例2：比较水、甲醇、流动相三种溶剂的溶解效果和HPLC峰形

在实施例1水浴加温助溶的基础上，选用甲醇、乙醇、HPLC流动相体积比40:60的0.1％磷酸-甲醇溶液，与原提取方法中的溶剂水来作比较。检测结果如表2所示，样品批号为20190203B。

表2不同溶剂的检测结果

如表2所示，溶剂中含有水相，肉桂酸溶解度降低，使用甲醇溶解稀释，肉桂酸溶出量明显提高，但是峰形如图1所示，拖尾，对称因子为1.22；但用流动相作为溶剂，HPLC峰形最理想，故考虑两步稀释，第一步用有机溶剂甲醇溶解，第二步用流动相最终定容，蜂形如图2所示。

实施例3：比较多种前处理方法的提取程度

原有的供试品溶液制备方法为：本品放入30℃摇床中保温3小时后取出，精密量取0.5mL，置500mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。申请入使用数种新的供试品溶液制备方法，整理成表3。

表3多种前处理方法的提取程度

由表3所示，将浸膏样品置于热水中温溶振摇后，样品混合均匀，再精密量取，肉桂酸含量大幅度提高，其重复性也得到显著改善。

实施例4：方法学验证

在方法学验证之前，我们先进行系统适用性试验。取肉桂酸对照品溶液连续进样6次结果见下表4。

表4系统适用性试验结果

标准：主峰肉桂酸峰面积的RSD应≦2.0％。主峰保留时间的RSD应≦1.0％，理论塔板数按肉桂酸峰计算应≥1500。

1准确度试验

供试品溶液的制备如下：样品置于60℃-70℃的热水浴,并加以振摇使溶液分布均匀，精密量取5mL置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀滤过，精密移取续滤液1mL置50mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，即得。

对照品溶液的制备：取肉桂酸对照品适量，精密称定，用50％甲醇制成每1mL含2μg的溶液。

HPLC色谱条件：仪器：高效液相色谱仪Agilent1260；色谱柱:Kromasil C18，5μm，150*4.6mm；流动相：0.1％磷酸溶液-甲醇40:60；检测波长：278nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL。

精密吸取低(80％)、中(100％)、高(120％)系列浓度的对照品溶液(每个浓度三份)，分别准确加入到已知含量的样品中，按供试品溶液制备方法制备，在规定的色谱条件下测定肉桂酸峰面积，计算回收率，准确度用回收率来表示。结果如下表5。样品批号为20190301B。

表5回收率试验结果表

回收率％＝(C-A)/B*100％；

式中，A为供试品所含被测成分量；B为加入对照品量；C为实测值；

结果显示：回收率结果为102.26％，RSD为0.95％；表明该方法准确性良好。

2精密度试验

供试品和对照品的制备以及色谱条件与准确度试验相同。

2.1重复性试验

制备相当于100％浓度水平的供试品溶液6份，每份平行测定2次，用测定12次的结果进行评价。结果如下表6。样品批号为20190302B。

表6重复性试验结果表

参见表6，重复性RSD为0.16％，表明该方法精密度良好。

2.2中间精密度

在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定。将相当于100％浓度水平的供试品溶液6份，用测定12次的结果进行评价，结果见下表7。

表7中间精密度试验结果

参见表7，两台仪器主峰RSD分别为0.21％和0.41％，仪器之间相对偏差为0.48％，符合中间精密度标准。

3专属性试验

供试品和对照品的制备以及色谱条件与准确度试验相同。

进针空白溶剂、空白流动相，来评价溶剂干扰、流动相干扰。样品批号为20190304B。结果如图4，流动相空白对肉桂酸峰没有干扰，肉桂酸峰与相邻峰分离度为3.18，符合专属性标准。

4线性试验

色谱条件与准确度试验相同。

精密称取肉桂酸对照品适量，加50％甲醇溶解，定量稀释制成每1mL中约含1.0μg、1.5μg、2.0μg、2.5μg、3.0μg的五个不同浓度的对照品溶液。取上述对照品溶液各20μL进样，以峰面积对样品浓度作图，通过线性回归分析，得到线性方程和相关系数R。结果见表8。

表8线性试验结果表

结果如表8所示,R＝0.9999，符合线性标准。表明该方法具有良好的线性关系。

5线性范围

线性范围根据分析方法的具体应用及其线性、准确度、精密度结果和要求确定为，肉桂酸在1.0065-3.0690μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系。

6耐用性实验

耐用性指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为所建立的方法用于日常检验提供依据。本验证中的变动因素为供试品溶液的存放时间、不同品牌色谱柱、流动相比例、柱温。

6.1供试品溶液稳定性试验

供试品和对照品的制备以及色谱条件与准确度试验相同。

取同一供试品溶液，在实验室室温条件下分别放置0、1、2、3、6、24、48小时进行测定。结果见表9和图5。样品批号为20190305B。

表9供试品溶液稳定性试验结果表

结果表明，供试品溶液在6小时稳定性良好。

6.2HPLC中的变动因素

供试品和对照品的制备以及色谱条件参考准确度试验。

考察HPLC中的变动因素，变动因素见表10。结果见表11。样品批号为20190306B。

表10 HPLC变动因素表

表11各变动因素下的结果

注：色谱柱：47^#:Inertsil ODS-SP(5μm 4.6*150mm)

57^#:Kromasil 100-5C18(5μm 4.6*150mm)

81^#:Hadesil C18(5μm 4.6*150mm)

95^#:ES Caprisil C18(5μm 4.6*150mm)

结果如表11所示，在1)流动相：有机相比例±5％；2)色谱柱：C18色谱柱47^#、57^#、81^#、95^#；3)柱温：±5℃；以上这些变动因素下检测，均能满足系统适用性试验。

综上所述：六个方法学验证项目均已达到各项标准，说明我们建立的脉络宁注射液中间体中肉桂酸含量测定方法成立。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims (2)

1.一种提高脉络宁注射液中间体浸膏中肉桂酸含量检测准确度和精密度的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：首先制备供试品溶液和对照品溶液，按照设定的色谱条件，进样进行测定；其中，色谱条件为：色谱柱C18，色谱柱内径4.6mm，长度150mm，粒径5μm；流动相：0.1%磷酸溶液-甲醇体积比40:60；检测波长：278nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：20µL；

所述供试品溶液制备包括如下具体步骤：取脉络宁注射液中间体浸膏样品，50-80℃水浴加温助溶，振摇混合均匀，精密量取5 mL至100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，再精密量取1 mL至50 mL量瓶中，加0.1%磷酸-甲醇混合溶液溶解并稀释至刻度，即得。

2.根据权利要求1所述的提高脉络宁注射液中间体浸膏中肉桂酸含量检测准确度和精密度的方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备方法为：取肉桂酸对照品，精密称定，用50%甲醇制成每1mL含2μg的溶液。

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