CN111965360B - 一种检测腐霉利的试纸条及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测腐霉利的试纸条及方法。该试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有腐霉利半抗原Ⅰ‑载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫上喷涂有腐霉利单克隆抗体‑胶体金标记物，所述腐霉利单克隆抗体是以腐霉利半抗原Ⅱ‑载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。本发明还提供一种应用上述试纸条检测蔬菜、水果中腐霉利的方法。本发明提供的试纸条具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低、适于大批量样本筛查等优点，能够满足我国食品监管部门开展现场监控和检测工作。

Description

一种检测腐霉利的试纸条及方法
技术领域
本发明涉及一种检测腐霉利的试纸条及方法，具体涉及一种用于检测腐霉利的胶体金试纸条，其特别适用于蔬菜、水果中腐霉利残留的检测。
背景技术
腐霉利(procymidone)，是一种广谱内吸性低毒杀菌剂，主要用于果蔬、花卉等植物的灰霉病、菌核病、褐腐病、大斑病、黑星病的防治。腐霉利有很强的刺激作用，对皮肤和眼睛的正常合成和代谢，一旦进入人体，会干扰或抑制物质的内分泌系统，具有对人体健康的影响。我国国家标准GB 2763-2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定了蔬菜、水果中腐霉利的残留限量为0.2～10mg/kg。
目前已报道的检测腐霉利的方法主要是气相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱串联质谱法等仪器方法。这些方法均须在实验室条件下操作，样品前处理繁琐费时，还需配备昂贵的仪器设备，检测成本较高、耗时长、操作复杂，在实际应用过程中有很大的限制性，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。因此，开发一种简单快速、适用于蔬菜水果中腐霉利残留的胶体金试纸条，可满足大量样品现场筛选和监控，能够更好地满足我国食品监管部门等开展检测工作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够检测蔬菜、水果中腐霉利残留的胶体金试纸条，并且提供一种高效、准确、简便、适于现场监控和大量样本筛查的检测方法。
本发明所提供的检测腐霉利的试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板；所述反应膜上具有包被有腐霉利半抗原Ⅰ-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线；所述结合物释放垫上喷涂有腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物，所述腐霉利单克隆抗体是以腐霉利半抗原Ⅱ-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。
所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白；所述腐霉利半抗原Ⅰ是由羟基腐霉利与琥珀酸酐反应得到，其具有式(Ⅰ)所示的结构；所述腐霉利半抗原Ⅱ是在碱性条件下，将3,5-二氯-4-氟硝基苯与
Figure BDA0002595355360000011
发生亲核取代反应后，将产物进行加氢还原反应，然后再与1,2-二甲基环丙烷-1,2二羧酸、草酰氯发生环化反应得到，其具有式(Ⅱ)所示的结构：
Figure BDA0002595355360000021
其中，n为-CH2基团数目，n为0～4的整数。
所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。
所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：
1)制备喷涂有腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；
2)制备具有包被有腐霉利半抗原Ⅰ-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。
具体地说，步骤包括：
1)将羟基腐霉利与琥珀酸酐反应，制备腐霉利半抗原Ⅰ；在碱性条件下，将3,5-二氯-4-氟硝基苯与
Figure BDA0002595355360000022
发生亲核取代反应后，将产物进行加氢还原反应，然后再与1,2-二甲基环丙烷-1,2二羧酸、草酰氯发生环化反应，制备腐霉利半抗原Ⅱ；
2)将腐霉利半抗原Ⅰ和腐霉利半抗原Ⅱ分别与载体蛋白偶联，制备腐霉利半抗原Ⅰ-载体蛋白偶联物、腐霉利半抗原Ⅱ-载体蛋白偶联物；
3)用腐霉利半抗原Ⅱ-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌腐霉利单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
5)分别将腐霉利半抗原Ⅰ-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测线(T)和质控线(C)上；
6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；
7)将制备的腐霉利单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物；
8)将腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；
9)将样品吸收垫用含0.5％牛血清白蛋白、pH为7.2、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；
10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖。最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4～30℃条件下保存12个月。
本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测蔬菜、水果中腐霉利残留的方法，它包括步骤：
(1)样品前处理；
(2)用试纸条进行检测；
(3)分析检测结果。
本发明的腐霉利快速检测试纸条采用高度特异性的抗原抗体反应及免疫层析分析技术，将腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的腐霉利在流动过程中与结合物释放垫上的腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成药物-抗体-胶体金标记物。样本中的药物与反应膜检测线上的腐霉利半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带深浅来判断待测样品液中是否含有腐霉利残留。
检测时，样品经处理后滴入试纸条卡孔内，当腐霉利在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的腐霉利半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线(T)和质控线(C)上各出现一条红色条带，且T线显色比C线显色深或与C线显色一致；如果腐霉利在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与腐霉利全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与腐霉利半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带或比C线显色浅。如图5所示。
阴性：当质控线(C)显示出红色条带，检测线(T)同时也显示出红色条带，且(T)线颜色接近或深于(C)线时，判为阴性。
阳性：当质控线(C)显示出红色条带，而检测线(T)不显色或(T)线颜色浅于(C)线时，判为阳性。
无效：当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。
本发明创造性地将两种不同结构的腐霉利半抗原分别与载体蛋白偶联后制得腐霉利免疫原和腐霉利包被原，这样更有利于建立起具有高灵敏度的测定腐霉利的间接竞争免疫分析方法；本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点；用本发明试纸条检测腐霉利残留的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。
附图说明
图1为腐霉利半抗原Ⅰ、腐霉利半抗原Ⅱ分子结构图。
图2为腐霉利半抗原Ⅰ合成图。
图3为腐霉利半抗原Ⅱ合成图。
图4为试纸条剖面结构示意图。
图5为试纸条检测结果判定图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。
实施例1检测腐霉利的试纸条的制备
该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：
1)制备喷涂有腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；
2)制备具有包被有腐霉利半抗原Ⅰ-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。
下面分步详细叙述：
1、腐霉利半抗原Ⅰ的合成(合成路线见附图2)
取2.99g羟基腐霉利加吡啶80mL溶解，加入琥珀酸酐1.1g，油浴加热，75℃反应6h，反应结束后，旋蒸除去吡啶，加入水100mL和1mol/L盐酸10mL，用乙酸乙酯80mL萃取，收集有机相，有机相加无水硫酸钠干燥蒸干，用硅胶柱纯化，用石油醚和乙酸乙酯体积比为5:1的混合溶剂洗脱分离，得到腐霉利半抗原Ⅰ。
2、腐霉利半抗原Ⅱ的合成(合成路线见附图3)
1)在碱性条件下，将3,5-二氯-4-氟硝基苯与
Figure BDA0002595355360000041
发生亲核取代反应，得到中间体1，所述中间体1具有结构式/>
Figure BDA0002595355360000051
其中，n为-CH2基团数目，n为0～4的整数；
2)在钯碳的催化作用下，将所述中间体1进行加氢还原反应，得到中间体2，所述中间体2具有结构式
Figure BDA0002595355360000052
3)将所述中间体2与1,2-二甲基环丙烷-1,2二羧酸、草酰氯进行环化反应，得到腐霉利半抗原Ⅱ。
具体地，方法一：①取3,5-二氯-4-氟硝基苯2.08g加乙醇80mL溶解，加入NaOH0.8g，搅拌，再加入氨基丁酸1.05g，充分搅拌，60℃反应4h，反应结束后，旋蒸除去乙醇，加入水100mL，用乙酸乙酯70mL萃取，收集水相，水相用6mol/L盐酸调节pH到5，再用乙酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥、蒸干，得到中间体1；②将中间体1加甲醇90mL溶解澄清，缓慢加入0.5g钯碳，充分混匀后，抽取空气，通入氢气，室温搅拌6h，反应结束后，抽滤除去钯碳，旋蒸蒸干，得到中间体2；③取1,2-二甲基环丙烷-1,2二羧酸1.58g加二氯甲烷100mL溶解，0～5℃恒温30min，加入草酰氯2.48g，充分搅拌，再加入N,N-二甲基甲酰胺0.5mL，0～5℃继续搅拌3h；加入全部的中间体2，加三乙胺2.8mL，回流反应8h，反应结束后，旋蒸除去有机溶剂，加入水120mL，用乙酸乙酯100mL萃取，蒸干，用硅胶柱纯化，用石油醚和乙酸乙酯体积比为5:1的混合溶剂洗脱分离，得到腐霉利半抗原Ⅱ。
具体地，方法二：①取3,5-二氯-4-氟硝基苯2.08g加乙醇80mL溶解，加入NaOH0.8g，搅拌，再加入氨基乙酸0.76g，充分搅拌，60℃反应4h，反应结束后，旋蒸除去乙醇，加入水100mL，用乙酸乙酯70mL萃取，收集水相，水相用6mol/L盐酸调节pH到5，再用乙酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥、蒸干，得到中间体1；②将中间体1加甲醇90mL溶解澄清，缓慢加入0.5g钯碳，充分混匀后，抽取空气，通入氢气，室温搅拌6h，反应结束后，抽滤除去钯碳，旋蒸蒸干，得到中间体2；③取1,2-二甲基环丙烷-1,2二羧酸1.58g加二氯甲烷100mL溶解，0～5℃恒温30min，加入草酰氯2.48g，充分搅拌，再加入N,N-二甲基甲酰胺0.5mL，0～5℃继续搅拌3h；加入全部的中间体2，加三乙胺2.8mL，回流反应8h，反应结束后，旋蒸除去有机溶剂，加入水120mL，用乙酸乙酯100mL萃取，蒸干，用硅胶柱纯化，用石油醚和乙酸乙酯体积比为5:1的混合溶剂洗脱分离，得到腐霉利半抗原Ⅱ。
具体地，方法三：①取3,5-二氯-4-氟硝基苯2.08g加乙醇80mL溶解，加入NaOH0.8g，搅拌，再加入氨基丙酸0.91g，充分搅拌，60℃反应4h，反应结束后，旋蒸除去乙醇，加入水100mL，用乙酸乙酯70mL萃取，收集水相，水相用6mol/L盐酸调节pH到5，再用乙酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥、蒸干，得到中间体1；②将中间体1加甲醇90mL溶解澄清，缓慢加入0.5g钯碳，充分混匀后，抽取空气，通入氢气，室温搅拌6h，反应结束后，抽滤除去钯碳，旋蒸蒸干，得到中间体2；③取1,2-二甲基环丙烷-1,2二羧酸1.58g加二氯甲烷100mL溶解，0～5℃恒温30min，加入草酰氯2.48g，充分搅拌，再加入N,N-二甲基甲酰胺0.5mL，0～5℃继续搅拌3h；加入全部的中间体2，加三乙胺2.8mL，回流反应8h，反应结束后，旋蒸除去有机溶剂，加入水120mL，用乙酸乙酯100mL萃取，蒸干，用硅胶柱纯化，用石油醚和乙酸乙酯体积比为5:1的混合溶剂洗脱分离，得到腐霉利半抗原Ⅱ。
具体地，方法四：①取3,5-二氯-4-氟硝基苯2.08g加乙醇80mL溶解，加入NaOH0.8g，搅拌，再加入氨基戊酸1.19g，充分搅拌，60℃反应4h，反应结束后，旋蒸除去乙醇，加入水100mL，用乙酸乙酯70mL萃取，收集水相，水相用6mol/L盐酸调节pH到5，再用乙酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥、蒸干，得到中间体1；②将中间体1加甲醇90mL溶解澄清，缓慢加入0.5g钯碳，充分混匀后，抽取空气，通入氢气，室温搅拌6h，反应结束后，抽滤除去钯碳，旋蒸蒸干，得到中间体2；③取1,2-二甲基环丙烷-1,2二羧酸1.58g加二氯甲烷100mL溶解，0～5℃恒温30min，加入草酰氯2.48g，充分搅拌，再加入N,N-二甲基甲酰胺0.5mL，0～5℃继续搅拌3h；加入全部的中间体2，加三乙胺2.8mL，回流反应8h，反应结束后，旋蒸除去有机溶剂，加入水120mL，用乙酸乙酯100mL萃取，蒸干，用硅胶柱纯化，用石油醚和乙酸乙酯体积比为5:1的混合溶剂洗脱分离，得到腐霉利半抗原Ⅱ。
具体地，方法五：①取3,5-二氯-4-氟硝基苯2.08g加乙醇80mL溶解，加入NaOH0.8g，搅拌，再加入氨基己酸1.34g，充分搅拌，60℃反应4h，反应结束后，旋蒸除去乙醇，加入水100mL，用乙酸乙酯70mL萃取，收集水相，水相用6mol/L盐酸调节pH到5，再用乙酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥、蒸干，得到中间体1；②将中间体1加甲醇90mL溶解澄清，缓慢加入0.5g钯碳，充分混匀后，抽取空气，通入氢气，室温搅拌6h，反应结束后，抽滤除去钯碳，旋蒸蒸干，得到中间体2；③取1,2-二甲基环丙烷-1,2二羧酸1.58g加二氯甲烷100mL溶解，0～5℃恒温30min，加入草酰氯2.48g，充分搅拌，再加入N,N-二甲基甲酰胺0.5mL，0～5℃继续搅拌3h；加入全部的中间体2，加三乙胺2.8mL，回流反应8h，反应结束后，旋蒸除去有机溶剂，加入水120mL，用乙酸乙酯100mL萃取，蒸干，用硅胶柱纯化，用石油醚和乙酸乙酯体积比为5:1的混合溶剂洗脱分离，得到腐霉利半抗原Ⅱ。
3、包被原的制备
取腐霉利半抗原Ⅰ18mg，加N,N-二甲基甲酰胺1mL溶解，加三乙胺0.1mL、氯甲酸异丁酯0.22mL，0～5℃反应4h，得到半抗原溶液A液；取卵清蛋白(OVA)100mg，加0.1mol/L PB缓冲液溶解，得到B液；将A液缓慢滴加到B液中，4℃反应12h，用0.02mol/L PBS透析纯化3天，每天换液3次，得到腐霉利半抗原Ⅰ-OVA偶联物，即为包被原，分装，-20℃保存。
4、免疫原的制备
取腐霉利半抗原Ⅱ28mg，加N,N-二甲基甲酰胺1mL溶解，澄清，加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)19mg、碳二亚胺(EDC)24.5mg，充分反应1h，得到半抗原溶液A液；取人血清白蛋白(HSA)100mg，加PB缓冲液溶解，得到B液；将A液缓慢滴加到B液中，4℃搅拌12h，用0.02mol/LPBS透析纯化3天，每天换液3次，得到腐霉利半抗原Ⅱ-HSA偶联物，即为免疫原，分装，-20℃保存。
5、腐霉利单克隆抗体的制备
(1)动物免疫
将步骤4得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。
(2)细胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
(3)细胞冻存和复苏
将杂交瘤细胞用冻存液制成1×106个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
(4)单克隆抗体的制备与纯化
增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。
所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量分数)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量分数)；所述细胞培养基的pH为7.4。
6、羊抗鼠抗抗体的制备
以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
7、腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物的制备
(1)胶体金的制备
用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％(质量分数)，取100mL置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5mL 1％柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，在日光下观察颜色为酒红色。
(2)腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物的制备
在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入20～50μg抗体的标准向胶体金溶液中加入上述腐霉利单克隆抗体，继续搅拌混匀30min；静置10min后加入10％BSA，使其在胶体金溶液中的终浓度为1％，静置10min。12000r/min、4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。
复溶缓冲液：含BSA的质量分数为0.1％～0.3％、吐温-80的质量分数0.05％～0.2％、pH 7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
8、结合物释放垫的制备
将结合物释放垫浸泡于含0.5％BSA、pH 7.2、0.5mol/L的磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1h，37℃烘3h备用。用Isoflow喷膜仪将制备好的腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01mL腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37℃环境中(湿度＜20％)60min后取出，置于干燥环境(湿度＜20％)中保存备用。
9、样品吸收垫的制备
将样品吸收垫置于含0.5％牛血清白蛋白、pH为7.2、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃下烘干2h备用。
10、反应膜的制备
将腐霉利半抗原Ⅰ-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线。
包被过程：用磷酸缓冲液将腐霉利半抗原Ⅰ-卵清蛋白偶联物稀释到1mg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T线)，包被量为1.0μL/cm；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C线)，包被量为1.0μL/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。
11、试纸条的组装
根据附图4所示试纸条剖面结构，将样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)依次按顺序粘贴在PVC底板(7)上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线(5)和质控线(6)，检测线(T线)和质控线(C线)均为与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸条用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，4～30℃的环境中贮存，有效期12个月。
实施例2蔬菜、水果中腐霉利的检测
1、样品前处理
检测前将样品恢复至室温(20～30℃)，取新鲜样品擦去泥土，剪碎成小于1cm见方的碎片；称取(1.00±0.05)g样品至15mL聚苯乙烯离心管中，再加入6mL提取液，盖上盖子，手动振荡30s，静置1min，得样品液；根据检测需求，按照下表稀释，得样品待检液。
样品名称 国标限量(mg/kg) 样品液(μL)+提取液(μL)
韭菜 0.2 无需稀释，即为样品待检液
番茄、黄瓜 2 100+900
茄子、辣椒、葡萄 5 50+950
草莓 10 20+660
所述提取液为pH 7.0的0.02mol/L磷酸缓冲液。
2、用试纸条检测
用微量移液器吸取样品待检液70μL垂直滴于加样孔中；液体流动开始计时，反应10min，判定结果。
3、分析检测结果
阴性(－)：T线显色比C线显色深或与C线显色一致，表示样品中腐霉利浓度低于检测限，如图5a、5b。
阳性(+)：T线显色比C线显色浅或T线不显色，表示样品中腐霉利浓度等于或高于检测限，如图5c、5d。
无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效，如图5e、5f。
实施例3样品检测实例
1、检测限试验
取空白韭菜、番茄、黄瓜、茄子、辣椒、葡萄、草莓样本，在其中分别添加腐霉利至终浓度为国标限量的1/2、1倍、2倍，取试纸条进行检测，每个样本重复测定三次。
用试纸条检测韭菜、番茄、黄瓜、茄子、辣椒、葡萄、草莓样本时，当其中无腐霉利和其添加浓度为国标限量的1/2时，试纸条上显示出T线显色比C线显色深或与C线显色一致，呈阴性；当其中腐霉利添加浓度为国标限量的1倍和2倍时，试纸条上显示出T线显色比C线显色浅或T线不显色，呈阳性，表明本试纸条对蔬菜、水果中腐霉利的检测限为：韭菜0.2mg/kg，番茄、黄瓜2mg/kg，茄子、辣椒、葡萄5mg/kg，草莓10mg/kg，可满足国家标准GB 2763-2019中规定的残留限量要求。
2、假阳性率、假阴性率试验
取空白韭菜、番茄、黄瓜、茄子、辣椒、葡萄、草莓梨样本及添加腐霉利至终浓度为检测限的阳性韭菜、番茄、黄瓜、茄子、辣椒、葡萄、草莓样本各20份，用3个批次生产的试纸条分别进行检测，计算其阴阳性率。
结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性样本时，结果全为阳性，可知阳性符合率为100％，假阴性率为0；检测阴性样本时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100％，假阳性率为0。说明本发明的检测腐霉利的试纸条可以对蔬菜、水果样本中腐霉利残留进行快速检测。
3、特异性试验
用本试纸条检测10mg/kg六六六、滴滴涕、异菌脲、百菌清、乙烯菌核利等其他有机氯类农药时，试纸条上显示出T线显色比C线显色深或与C线显色一致，呈阴性，说明本试纸条对这些药物无交叉反应。

Claims (5)

1.一种检测腐霉利的试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有腐霉利半抗原Ⅰ-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫上喷涂有腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物，所述腐霉利单克隆抗体是以腐霉利半抗原Ⅱ-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白；
其特征在于所述腐霉利半抗原Ⅰ的合成方法为：取2.99g羟基腐霉利加吡啶80mL溶解，加入琥珀酸酐1.1g，油浴加热，75℃反应6h，反应结束后，旋蒸除去吡啶，加入水100mL和1mol/L盐酸10mL，用乙酸乙酯80mL萃取，收集有机相，有机相加无水硫酸钠干燥蒸干，用硅胶柱纯化，用石油醚和乙酸乙酯体积比为5:1的混合溶剂洗脱分离，得到腐霉利半抗原Ⅰ，其具有式(Ⅰ)所示的结构；
所述腐霉利半抗原Ⅱ的合成方法为：1)在碱性条件下，将3,5-二氯-4-氟硝基苯与
Figure FDA0004232753600000011
发生亲核取代反应，得到中间体1，所述中间体1具有结构式
Figure FDA0004232753600000012
2)在钯碳的催化作用下，将所述中间体1进行加氢还原反应，得到中间体2，所述中间体2具有结构式/>
Figure FDA0004232753600000013
3)将所述中间体2与1,2-二甲基环丙烷-1,2二羧酸、草酰氯进行环化反应，得到腐霉利半抗原Ⅱ，其具有式(Ⅱ)所示的结构：
Figure FDA0004232753600000014
其中，n为-CH2基团数目，n为0～4的整数。
2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上。
3.如权利要求1-2任一项所述的试纸条，其特征在于所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。
4.一种制备权利要求1-3任一项所述试纸条的方法，其包括步骤：
1)制备喷涂有腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；
2)制备具有包被有腐霉利半抗原Ⅰ-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。
5.一种检测蔬菜或水果中腐霉利残留的方法，其包括步骤：
1)样品前处理；
2)用权利要求1-3任一项所述的试纸条进行检测；
3)分析检测结果。
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