CN105622695A - 雌三醇半抗原和抗体及其在检测游离雌三醇的快速传感器方法中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物传感器技术领域，公开了雌三醇半抗原和抗体及其在检测游离雌三醇的快速传感器方法中的应用。本发明科学设计半抗原结构，提高抗原-抗体的灵敏度和特异性，在电极表面电沉积普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜，并将雌三醇抗原固定在膜表面，待封闭未结合位点后加入新型辣根过氧化物酶标记雌三醇抗体与待测样品，样品与固定抗原竞争游离酶标抗体，洗涤后加入过氧化氢，测定电流信号，获得循环伏安法的雌三醇标准曲线，成功提供检测雌三醇的快速传感器方法，检测范围为0.001～100？ng/mL，检测限为0.001？ng/mL。本发明方法具有操作简单、灵敏度高、快速方便等优势，可很好地应用于样品中雌三醇的超灵敏快速检测。

Description

雌三醇半抗原和抗体及其在检测游离雌三醇的快速传感器方法中的应用
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，更具体地，提供了一种雌三醇半抗原和抗体及其在检测游离雌三醇的快速传感器方法中的应用。
背景技术
雌三醇是一种性激素，主要是在肝脏中由雌酚酮和雌二醇转化而得，卵巢仅分泌少量。在胎儿的肾上腺里生成的脱氢表雄酮，在肝脏里经16α羟基化后，在胎盘里芳构化而生成。随着妊娠的进行，在尿中的排出量逐渐增加，至分娩后锐减。作为缓和的性激素试剂，经口服可治疗更年期障碍等疾病。雌三醇对于维持雌性副特征和蛋白同化方面具有显著的效应，临床兽医用于同期发情和家畜促生长及提高饲料转化率。雌三醇被违法应用于畜禽和水产业中，起到快速催肥、催大，提高家畜产奶率等作用；也被违法添加到奶制品和中老年动物性保健食品中，长期摄入雌激素残留的食品会引起性早熟、性异常、癌症等病症，并增加某些疾病的发病危险；某些化妆品中也含有雌三醇可以通过皮肤吸收进入人体。《乳品质量安全监督管理条例》、《饲料和饲料添加剂管理条例》中明确规定禁止销售、收购和加工尚处于用药期和休药期内的奶畜产品；日本规定牛肉中雌三醇的含量小于0.01mg/mL；1980年华沙国际学术讨论会和同年的联合国粮农组织会议决定全面禁止使用除己烯雌酚外的人工合成类雌激素。在经济利益的驱使下，激素出现残留和超标的现象仍然屡见不鲜。
雌三醇的滥用对人类、动物和环境均产生了严重的危害，有效的检测方法对控制药物使用和保障人类身体健康有至关重要的作用。目前，除了医学临床检测雌三醇外，雌三醇的检测对象主要有动物性食品、牛奶、奶粉和老年保健品等。食品安全国家标准GB29698-2013采用气相色谱-质谱连用法同时检测17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇多残留的测定。常见的分析方法有乙酸乙酯提取法、薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法、毛细管电泳法、酶联免疫法等分析。仪器检测法样品前处理复杂、耗时长、操作繁琐、需要专业的操作人员、费用昂贵，限制了其在食品检测方面的应用。市场中食品样品种类繁多，采用仪器法显然无法满足市场需求。国家标准的气质连用法用到了衍生化，样品前处理复杂，费时昂贵。相对于仪器法，酶联免疫分析方法具有灵敏度高、特异性强、可以实现批量化检测等优点，在实际应用中具有优势并被广泛应用。
基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析法具有简便、快速、灵敏等特点，近年来被广泛应用于食品、医学、环境等领域。Tian等人(2013)通过获得雌三醇单克隆抗体建立了快速简单的免疫渗滤试验法，以硝酸纤维素膜为固相载体，抗雌三醇单克隆抗体作为包被抗体，建立了竞争性抑制模式的免疫渗滤试验方法，检测限为2ng/mL，检测范围为2～200ng/mL。郑金国等人(2011)建立了管式磁微粒子化学发光免疫分析法检测尿液中雌三醇的方法。标记辣根过氧化物酶的雌三醇与标记异硫氰酸荧光素的兔抗雌三醇抗体在均相体系中发生竞争性反应，再加入用羊抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁微粒。磁微粒反应生成物，在磁场中经分离、洗涤后加入发光底物，检测发光强度，即可计算出尿液中雌三醇的含量。该方法的线性范围为1～100ng/mL，检出限为0.25ng/mL。吴丹凝等(2007)在传统的放射免疫分析的基础上，以磁性微粒子为二抗分离剂和固相一抗，建立血清及类似样品中雌三醇含量的分析方法。碳化二亚胺法使雌三醇-6-羧甲基肟与盐酸组胺发生反应，薄层层析法纯化得到雌三醇组胺，再用氯胺T氧化法对雌三醇组胺进行125I碘化标记，高效液相色谱法分离纯化。该方法用磁性微粒子产生抗体作为包被原，分别建立了磁性微粒子二抗分离法和磁性微粒子固相一抗法检测待测样品中雌三醇的含量，线性范围为0.3～30ng/mL。
以上虽然有报道雌三醇的免疫快速检测方法，但是主要仍存在几个问题：(1)抗体特异性不够，与雌三醇结构相似的包括雌二醇、孕酮等激素，在抗体的制备上，很难能够区分这些结构类似物，特别是雌二醇，容易造成干扰；(2)灵敏度不够，目前现有的免疫检测方法最高灵敏度一般在0.1ng/mL，由于免疫检测方法存在基质干扰问题，常常需要对样品进行稀释以消除基质干扰，因此实际检测灵敏度通常要降低上百倍，使得现有方法不能满足需求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有检测雌三醇的免疫传感器技术不足，提供一种可应用于雌三醇免疫传感器检测的免疫半抗原和竞争半抗原，通过设计半抗原结构，提高抗体的特异性性能，并结合细胞融合筛选技术，获得一株具有高特异性的雌三醇单克隆抗体。此外，通过设计竞争半抗原结构，提高抗体-抗原组合的灵敏度和特异性。
本发明的另一要解决的技术问题是提供一种可应用于雌三醇免疫传感器检测的雌三醇抗原。
本发明要解决的另一技术问题是一种可应用于雌三醇免疫传感器检测的新型辣根过氧化物酶标记雌三醇抗体。
本发明同时要解决的技术问题是提供前述半抗原、抗原和抗体的在方面的应用。
本发明要解决的还一技术问题是提供检测游离雌三醇的快速传感器方法。结合电沉积普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金得到纳米复合膜，利用该复合膜的高粘度、低位阻、生物相容性好等优势，可以高效固定前述抗原，构建出高灵敏度的雌三醇免疫传感器，很好地用于检测雌三醇。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
提供一种雌三醇免疫半抗原，所述免疫半抗原的结构式如式(Ⅰ)所示：
提供所述雌三醇免疫半抗原制备方法如下：在雌三醇中加入无水DMF，0℃条件下氮气保护搅拌溶解；再加入NaH搅拌反应后加入丁二酸酐，0℃条件下继续反应；调节pH值，点硅胶板监控反应，展开剂甲醇:氯仿＝1:5，原料Rf＝0.7，产物Rf＝0.1。经硅胶过柱，蒸干溶剂后得到。
优选地，所述硅胶过柱的展开剂为甲醇:氯仿＝1:10。
本发明同时提供一种雌三醇竞争半抗原，所述竞争半抗原的结构式如式(Ⅱ)所示：
提供所述雌三醇竞争半抗原制备方法如下：以6-ketoestriol和吡啶混合后搅拌溶解，加入羧甲基羟胺半盐酸盐反应，点硅胶板监控反应，以甲醇:氯仿＝1:3作为展开剂，原料Rf＝0.5，产物Rf＝0.1；减压蒸干产物后经硅胶柱层析法纯化得到。
优选地，所述硅胶柱层析法纯化的洗脱剂为甲醇:氯仿＝1:8混合物。
本发明同时提供一种雌三醇抗原，是以雌三醇竞争半抗原与载体蛋白偶联得到的产物。所述载体蛋白优选牛血清蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白。
本发明提供优选的抗体标记方法将多聚辣根过氧化物酶(MHRP)标记于雌三醇单克隆抗体上。具体是将雌三醇抗体与多聚辣根过氧化物酶通过过碘酸钠法合成的产物作为本发明新型辣根过氧化物酶标记雌三醇抗体。
本发明将所述雌三醇的半抗原、抗原、抗体可以很好地应用于检测游离雌三醇的快速传感器方法中。通过电沉积普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金得到纳米复合膜，利用该复合膜的高粘度、低位阻、生物相容性好等优势，高效固定抗原，构建出本发明高灵敏度的雌三醇免疫传感器。具体是在电极表面电沉积普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜，并将雌三醇抗原固定在膜表面，待封闭未结合位点后加入新型辣根过氧化物酶标记雌三醇抗体与待测样品，样品与固定抗原竞争游离酶标抗体，经过洗涤后加入过氧化氢，测定电流信号，样品中的游离雌三醇含量与电信号成反比线性关系
优选地，所述纳米复合膜中纳米金与普鲁士蓝的摩尔浓度比为1:1000，壳聚糖的质量体积含量为0.02％。
所述检测游离雌三醇的快速传感器方法包括以下步骤：
S1.电沉积法制备纳米复合膜：电沉积法制备纳米复合膜：配制0.05％的壳聚糖醋酸溶液；向壳聚糖醋酸溶液中加入FeCl3、K3[Fe(CN)6]、KCl和浓盐酸，使完全溶解，得到分散液；将纳米金胶加入所述分散液中，使完全溶解；以0.01MKCl的含1％盐酸的水溶液为稳定液；将玻碳电极浸在电沉积底液(含有FeCl3、K3[Fe(CN)6]、KCl和浓盐酸等的壳聚糖醋酸溶液)中沉积；
优选将预处理好的玻碳电极在+0.4V电压下浸在新配制的电沉积底液(除氧)，沉积时间为60s。之后，电极在0.1MKCl/0.1MHCl溶液中在-0.6V到+0.8V之间扫描循环伏安图直至图像稳定。
S2.将包被原用包被液稀释；将稀释好的包被原滴加在每根电极上，静置，冲洗，风干；向每根电极滴加封闭液，静置，冲洗，风干；配制一系列浓度的雌三醇标准溶液分别与使酶标雌三醇抗体等体积混合得混合物，取所述混合物滴加至已固定包被原的电极表面。
S3.将步骤S2制备的电极与铂电极、Ag/AgCl参比电极组成三电极体系，于对苯二酚缓冲液中加入H2O2，扫描；采用循环伏安法对过氧化氢的氧化还原电流进行检测，计算。
优选地，步骤S2所述包被液为碳酸盐缓冲液(Na2CO3和NaHCO3)，pH9.6。
优选地，步骤S2所述包被原用包被液稀释是按照1:100的比例稀释。
优选地，步骤S3所述扫描的扫描电压为-0.6～0.8V，扫描速率为50mV/s。
优选地，所述检测游离雌三醇的快速传感器方法各方面因素的优选条件分别为：包被原最优稀释比为1:100；一抗最优的稀释比为1:100；对苯二酚溶液pH为7.0；过氧化氢添加量为20L。
本发明具有以下有益效果：
本发明最重要的创新发明点至少包括以下几个方面：
(1)本发明通过设计免疫半抗原结构，显著提高抗体的特异性性能，并科学结合细胞融合筛选技术，获得一株具有高特异性的雌三醇单克隆抗体。
(2)本发明通过科学合理地设计竞争半抗原结构，显著提高了抗体-抗原组合的灵敏度和特异性。
(3)本发明进一步将雌三醇单克隆抗体与多聚辣根过氧化物酶偶联，提高催化过氧化氢能力，保障和提高本发明检测雌三醇方法的灵敏度。
(4)本发明通过精确限定工艺条件，获得电沉积普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金得到纳米复合膜，所述复合膜具有高粘度、低位阻、生物相容性好等优势，保障了高效固定抗原，构建出高灵敏度的雌三醇免疫传感器。
综上所述，本发明分别提供了半抗原、抗原、抗体、抗体-抗原组合、电沉积普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金得到纳米复合膜、构建高灵敏度的雌三醇免疫传感器等方面做出创造性地改进，同时有整体提供了一种快速检测游离雌三醇的免疫传感器检测方法，填补了本领域的技术空白，将免疫反应的特异性和传感器检测方法的高灵敏度等特点相结合，具有操作简单、灵敏度高、快速方便等优势，为快速、超灵敏地检测雌三醇提供技术支持。本发明检测范围为0.001～100ng/mL，检测限为0.001ng/mL。
附图说明
图1雌三醇免疫半抗原的合成路线图。
图2雌三醇免疫半抗原的质谱鉴定图。
图3雌三醇竞争半抗原的合成路线图。
图4雌三醇竞争半抗原的质谱鉴定图。
图5免疫传感器在电沉积不同复合物的循环伏安图。
图6免疫传感器在不同组装阶段的交流阻抗谱图。
图7包被原浓度的优化实验结果。
图8酶标抗体浓度的优化实验结果。
图9对苯二酚溶液pH的优化实验结果。
图10过氧化氢添加量的优化实验结果。
图11雌三醇免疫传感器标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明。除非特别说明，本发明实施例中采用的原料、方法和设备为本领域常规使用的原料、方法和设备。
实施例1
本实施例提供一种雌三醇免疫半抗原和竞争半抗原的制备方法。
雌三醇免疫半抗原的合成路线图见图1所示。取0.5g(1.7mM)雌三醇于25mL圆底烧瓶中，加入3mL无水DMF，0℃条件下氮气保护搅拌溶解。再加入45.0mg(1.9mM)NaH，搅拌20min，最后加入0.17(1.7mM)丁二酸酐，0℃条件下继续反应30min。(参照ZhaoDangetal，2015)用1MHCl调节反应溶液pH至3左右。点硅胶板监控反应，展开剂甲醇:氯仿＝1:5(体积比，下同)，原料Rf＝0.7，产物Rf＝0.1。200～300目硅胶过柱，展开剂甲醇:氯仿＝1:10，蒸干溶剂后得到产物(雌三醇免疫半抗原)的质量为0.24g，质谱鉴定图见图2所示。
雌三醇竞争半抗原的合成路线图见图3所示。取1.0g(3.3mM)6-ketoestriol于100mL圆底烧瓶中，加入30mL吡啶，室温下搅拌溶解。再加入0.21g(1.2mM)羧甲基羟胺半盐酸盐，室温下反应23h。点硅胶板监控反应，展开剂甲醇:氯仿＝1:3，原料Rf＝0.5，产物Rf＝0.1。减压蒸干产物，80～100目硅胶粉拌样，100～200目硅胶柱层析法纯化，洗脱剂甲醇:氯仿＝1:8。蒸干洗脱剂得到白色固体粉末(雌三醇竞争半抗原)，质谱鉴定图见图4所示。
实施例2将多聚辣根过氧化物酶(MHRP)标记于雌三醇单克隆抗体上。
雌三醇单克隆抗体的筛选：将5次免疫后的小鼠处死，取脾脏细胞与小鼠SP2/0细胞融合(将骨髓瘤细胞和脾细胞以个数5～10:1的比例)。采用间接ELISA和间接竞争ELISA法进行阳性杂交瘤细胞筛选，显示阳性并出现竞争抑制反应的孔为产阳性孔，并用于进一步亚克隆。无菌条件下，洗脱阳性孔内的细胞，用弯头吸管将细胞转移至预先以饲养细胞铺板的96孔培养板中，每个原始阳性孔克隆通过细胞计数板计数，有限稀释至每孔1个细胞。每个阳性原始克隆有限稀释1块96孔细胞培养板。待细胞贴壁长满1/2～1/3孔底后，取上清液，间接ELISA检测。取呈阳性强的亚克隆，如此反复2～3次，待所克隆的8个孔上清液中抗体阳性率为100％时，检测为全阳性者转移至24孔细胞培养板或50mL细胞培养皿扩大培养，建株并分装、冻存。
取8mg多聚辣根过氧化物酶(MHRP)溶于500μLCH3COONa–CH3COOH(0.2mol/L，pH5.6)缓冲液中，加入0.1mol/L的NaIO4溶液100μL，4℃下搅拌反应30min，然后逐滴加入2.5％乙二醇溶液500μL，室温下反应30min。反应完毕后逐滴加入纯化抗体5mg，4℃搅拌30min，用NaHCO3–Na2CO3(0.05mol/L，pH9.6)缓冲溶液中透析过夜。次日，取出抗体，加入100μL5mg/mL硼氢化钠，4℃下搅拌2h，再用PBS(0.01mol/L，pH7.4)透析过夜。第三日，取出抗体，按0.277g/mL的量加入硫酸铵，使其饱和度为45％，4℃搅拌30min，4℃下离心10min(10000rpm)，沉淀用少量PBS(0.01mol/L，pH7.4)溶解，在4℃用PBS(0.01mol/L，pH7.4)透析过夜，完毕收集透析袋中液体即为多聚辣根过氧化物酶酶标抗体。
实施例3
本实施例提供一种检测组胺的可抛式一步电沉积免疫生物传感器，采用表面有普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜的电极。
所述复合膜中纳米金与普鲁士蓝(Fe4[Fe(CN)6]3)的摩尔浓度比为1:1000，壳聚糖含量为0.02％，制备方法如下：
将0.05g壳聚糖(脱乙酰度≥95％，粘度100～200mpa.s)溶于100mL1.0％的醋酸溶液中，室温下搅拌3h，使壳聚糖完全溶解，配制成0.05％壳聚糖溶液。将0.0406gFeCl3，0.0822gK3[Fe(CN)6]，0.7455gKCl以及1mL浓盐酸加入100mL上述壳聚糖溶液中，在室温下超声分散，直至得到稳定的暗绿色分散液；再将制备好的1mL的纳米金胶加入已混合好的上述溶液中，再在室温下超声分散0.5h至完全溶解，制备得到沉积液；
将丝网印刷电极分别在乙醇和超纯水中超声处理1min，氮气吹干，再将丝网印刷电极在+0.4V电压下浸在配制好的沉积液中，沉积时间为60s；电极浸在0.1MKCl/0.1MHCl溶液中在-0.6V到+0.8V之间扫描循环伏安图直至图像稳定，使电极表面获得普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜。
在电极表面滴涂用0.1M的碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释后浓度为10ug/mL的包被原，使其在微碱的环境下能更好地将包被原固定在纳米膜修饰的电极表面，4℃孵育12h。滴涂5％脱脂奶粉以封闭电极表面非特异性位点，37℃孵育1h，用0.01M磷酸盐冲洗、风干，制备得到所述免疫生物传感器。
所述纳米金胶的制备方法可参照如下：纳米金粒径约35nm。用量筒量取99mL蒸馏水加入到500mL烧瓶中，加入1mL1％的氯金酸，用电热套加热至沸腾回流状态，持续沸腾1min后，取1.5mL1％柠檬酸三钠，迅速加入到烧瓶中，观察颜色，溶液由浅黄色逐渐变为黑色，再逐渐变为红色。当红色颜色稳定后，继续加热3min，关闭热源继续搅拌，待冷却后转移到玻璃瓶中(参考文献ChandlerJetal,2000)。
所述玻碳电极的预处理方法可参照如下：先将玻碳电极在涂有铝粉的麂皮上打磨多次至镜面，然后分别用硝酸、乙醇和水超声清洗，吹干，备用。
图5所示为免疫传感器在电沉积不同复合物的循环伏安图，其中，a为裸电极；b为电沉积金-壳聚糖复合物；c为电沉积普鲁士蓝-壳聚糖复合物；d为电沉积普鲁士蓝-金-壳聚糖复合物。图6所示为免疫传感器在不同组装阶段的交流阻抗谱图，其中，a为裸电极；b为电沉积普鲁士蓝-金-壳聚糖复合物；c为包被后；d为封闭后；e是滴涂酶标后。
实施例4
本实施例提供构建传感器条件的优选方法，经过长期大量的实验对比结合对本发明所用试剂原料的特点分析，总结得到优选条件为包被原最优稀释比为1:100，一抗最优的稀释比为1:100，对苯二酚溶液pH为7.0，过氧化氢添加量为20L。
包被原浓度的优化实验结果见图7所示。图中显示雌三醇竞争抗原浓度从1:25～1:800不同条件下，传感器的电流量信号情况。包被原稀释比为1:100的条件下，电流差显示为最大值时。
酶标抗体浓度的优化实验结果见图8所示。图中显示，对一抗稀释比从1:1600到1:50分别进行电流变化值的测定，考察传感器的电流量信号，结果表明酶标抗体在稀释比为1:100的条件下，电流差为最大值。
对苯二酚溶液pH的优化实验结果见图9所示：通过优化不同的pH值条件优化实验，考察电流差。总结发现从6.4到7.8范围内，电流差值增大，高于7.0后，电流差值逐渐减弱。综合考虑确定雌三醇传感器在检测过程中对苯二酚溶液pH为7.0。
过氧化氢添加量的优化实验结果见图10所示：重点考察过氧化氢浓度从0.6M～6.0M浓度对传感器的影响，考察电流差。结果表明在过氧化氢浓度从0.6M增加到6.0M的过程中，峰电流差先增大后减小。为获得最优效果，确定过氧化氢最优浓度为2.4M，相应的过氧化氢添加量为20L。
在本发明实验总结的最优条件下，构建雌三醇传感器检测方法，获得标准曲线，见图10所示。
本发明传感器在雌三醇浓度为0.001～100ng/mL范围内呈良好的线性关系，线性方程：I＝13.487-4.773lgCE3，相关系数为0.998，检测限为0.001ng/mL。
实施例5
本实施例提供基于本发明传感器检测方法对雌三醇及各种结构类似物的交叉反应情况，结果如表1所示。实验结果表明所建立的方法对雌三醇有良好的特异性结合，对结构类似物无交叉反应，可以很好地实现雌三醇的特异性结合。
表1雌三醇多克隆抗体对不同药物的交叉反应率

Claims (10)

1.一种雌三醇免疫半抗原，其特征在于，所述免疫半抗原的结构式如式(Ⅰ)所示：
2.权利要求1所述雌三醇免疫半抗原的制备方法，其特征在于，是在雌三醇中加入无水DMF，0℃条件下氮气保护搅拌溶解；再加入NaH搅拌反应后加入丁二酸酐，0℃条件下继续反应；调节pH值，点硅胶板监控反应，展开剂甲醇:氯仿＝1:5，原料Rf＝0.7，产物Rf＝0.1；经硅胶过柱，蒸干溶剂后得到；优选所述硅胶过柱的展开剂为甲醇:氯仿＝1:10。
3.一种雌三醇竞争半抗原，其特征在于，所述竞争半抗原的结构式如式(Ⅱ)所示：
4.权利要求3所述雌三醇竞争半抗原的制备方法，其特征在于，是以6-ketoestriol和吡啶混合后搅拌溶解，加入羧甲基羟胺半盐酸盐反应，点硅胶板监控反应，以甲醇:氯仿＝1:3作为展开剂，原料Rf＝0.5，产物Rf＝0.1；减压蒸干产物后经硅胶柱层析法纯化得到；优选所述硅胶柱层析法纯化的洗脱剂为甲醇:氯仿＝1:8。
5.一种雌三醇抗原，其特征在于，是以权利要求3所述的雌三醇竞争半抗原与载体蛋白偶联得到的产物。
6.一种雌三醇游离酶标抗体，其特征在于，是将雌三醇单克隆抗体与多聚辣根过氧化物酶通过过碘酸钠法合成。
7.雌三醇免疫半抗原、竞争半抗原、抗原或游离酶标抗体在快速检测雌三醇的免疫传感器方法中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述快速检测雌三醇的免疫传感器方法是在电极表面电沉积普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜，将权利要求5所述的雌三醇抗原固定在复合膜表面，待封闭未结合位点后，加入权利要求6所述的雌三醇游离酶标抗体与待测样品，待测样品与固定的雌三醇抗原竞争游离酶标抗体；洗涤后加入过氧化氢，测定电流信号，样品中的游离雌三醇含量与电信号成反比线性关系，经由雌三醇标准曲线，计算检测雌三醇。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述复合膜中，纳米金与普鲁士蓝的摩尔浓度比为1:1000，壳聚糖的质量体积含量为0.02％。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1.电沉积法制备纳米复合膜：配制0.05％的壳聚糖醋酸溶液；向壳聚糖醋酸溶液中加入FeCl3、K3[Fe(CN)6]、KCl和浓盐酸，使完全溶解，得到分散液；将纳米金胶加入所述分散液中，使完全溶解；以0.01MKCl的含1％盐酸的水溶液为稳定液；将玻碳电极浸在电沉积底液中沉积；
S2.将包被原用包被液稀释；将稀释好的包被原滴加在每根电极上，静置，冲洗，风干；向每根电极滴加封闭液，静置，冲洗，风干；配制一系列浓度的雌三醇标准溶液分别与使酶标雌三醇抗体等体积混合得混合物，取所述混合物滴加至已固定包被原的电极表面。
S3.将步骤S2制备的电极与铂电极、Ag/AgCl参比电极组成三电极体系，于对苯二酚缓冲液中加入H2O2，采用循环伏安法对过氧化氢的氧化还原电流进行检测，计算。
S3.上述制备的电极与铂电极、Ag/AgCl参比电极组成三电极体系，于对苯二酚缓冲液中加入H2O2，采用循环伏安法对过氧化氢的氧化还原电流进行检测，计算雌三醇标准曲线；
优选步骤S2所述包被原用包被液稀释是按照1:100的比例稀释；步骤S3所述扫描的扫描电压为-0.6～0.8V，扫描速率为50mV/s；
优选所述包被原最优稀释比为1:100；一抗稀释比为1:100；对苯二酚溶液的pH为7.0；所述过氧化氢的添加量为20L。
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