CN116768754B - 一种山梨酸半抗原、人工抗原及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种山梨酸半抗原、人工抗原及其制备方法与应用，属于生物化工技术领域。以山梨醛、盐酸羟胺和6‑溴己酸为主要原料，合成一种山梨酸半抗原，所述山梨酸的半抗原如式(I)所示：用活泼酯法将其与乳铁蛋白(LF)和卵清蛋白(OVA)偶联制备山梨酸人工抗原。将所制备的人工抗原免疫BALB/c小鼠，并对免疫小鼠的抗血清进行测试，结果显示抗血清对山梨酸的IC50达1.96mg/L，表明本发明的制备的人工抗原具有良好的免疫原性，可以进行后续单克隆抗体筛选及建立相应免疫分析方法，在山梨酸检测中具有较大的应用前景。

Description

一种山梨酸半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，更具体涉及一种山梨酸半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。
背景技术
山梨酸作为食品中常用的添加剂和防腐剂，对霉菌、酵母菌和好氧性细菌的生长活性能有效抑制，同时能防止肉毒杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌等有害微生物的生长和繁殖，实现保质期的延长。在食品领域中，山梨酸的日最大摄入量被严格限定，经常食用含有过量山梨酸的食品，将对人体造成损害，如破坏肠道菌群平衡，影响体内正常的新陈代谢，严重的会抑制骨骼生长，对肾脏和肝脏造成损伤。
山梨酸的常见检测方法包括薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法，这些仪器方法的精确性比较高，但是实际操作难度较高，对于操作人员技术要求比较高，它的检测成本也相应更高，且因其依赖于大型仪器，所以不适合现场快速、高通量的检测和监控。而免疫分析技术以其高灵敏、特异性高、快速、操作简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用，相比起依赖于仪器的检验方法，免疫分析技术可以补足仪器检测方法无法实现现场快速、批量检测和监控的短板。所以免疫分析为山梨酸残留研究提供了一条新的分析检测方法。
基于抗原－抗体特异性结合的免疫分析法，因其操作简单、快速、灵敏和高通量等特点，在食品安全领域具有广阔的应用前景。对于免疫分析法而言，抗体作为核心原材料，抗体的效果很大程度是取决于引起相应动物发生免疫反应的抗原结构。只有合成、制备出合理结构的有效山梨酸半抗原，才能够获得特异性强、灵敏度高的抗体。虽然中国专利CN109970550 A已经公开了山梨酸半抗原，但是灵敏度并不理想。因此，提供更有效保留山梨酸共轭双烯线性特征结构的有效半抗原及抗原，对制备出高灵敏度的抗体，从而能够快速灵敏的检测山梨酸的具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种山梨酸半抗原。
本发明的另一目的是提供一种山梨酸人工抗原。
本发明的再一目的是提供山梨酸人工抗原抗血清效果评价方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现：
本发明提供了一种山梨酸半抗原，其结构如式(I)所示：
本发明对从山梨酸的类似物山梨醛着手进行半抗原的设计，在山梨醛分子基础上引入极性基团并延长间隔臂，通用盐酸羟胺与分子内醛基进行肟化引入碳氮双键以及羟基，然后再令6-溴己酸与羟基进行反应，引入6个碳的间隔臂以及羧基，从而得到所设计的半抗原。该半抗原在山梨醛分子基础上进行间隔臂的延伸以增大其分子量，提高人工抗原的免疫原性，有利于高特异性抗体的诱导。
本发明还提供所述山梨酸半抗原的制备方法，先将山梨醛与盐酸羟胺进行反应制备出产物I，所述产物I具有的结构式再将产物I与6-溴己酸发生反应制备出产物II，即制得式(I)所示山梨酸半抗原。
反应式如下所示：
作为一种优选的可实施方案，所属山梨酸半抗原制备方法，具体包括如下步骤：
(1)产物Ⅰ的合成
称取山梨醛和盐酸羟胺分别溶于6mL甲醇/吡啶/水的混合液中，60℃条件下，反应5h。反应结束后将溶剂蒸干，加入稀盐酸将体系pH值调为3，再用乙酸乙酯萃取，蒸干溶剂后，经200-300目硅胶柱层析分离得到黄色油状物，即产物I。
(2)产物Ⅱ的合成，即山梨酸半抗原的合成
取摩尔比为2：1的产物I与6-溴己酸溶于吡啶中，往产物I的吡啶溶液中加入适量的无水碳酸钾，85℃搅拌下，将6-溴己酸的吡啶溶液逐滴滴加到产物I的吡啶溶液中，反应45min。反应结束后蒸干溶剂，加入稀盐酸将体系pH值调为3，再用乙酸乙酯萃取，蒸干溶剂后，经200-300目硅胶柱层析分离得到黄色固体，即制得式(I)山梨酸半抗原。
本发明还提供所述山梨酸半抗原在制备山梨酸人工抗原或抗体中的应用。
一种山梨酸人工抗原，由式(I)所示半抗原通过活泼酯法与大分子载体蛋白偶联得到，所述山梨酸人工抗原具有式(II)所示结构：
优选地，结构式中的载体蛋白为乳铁蛋白(LF)或卵清蛋白(OVA)。其中，式(II)–LF，用于制备免疫原，式(II)–OVA，用于制备包被原。
优选的，所述山梨酸人工抗原制备方法包括如下步骤：将半抗原、NHS、EDC溶于适量的DMF中，4℃下搅拌过夜对半抗原羧基进行活化，离心取上清即为活化好的山梨酸半抗原的衍生物；将活化好的半抗原衍生物缓慢逐滴加入到含有5mg/mL大分子载体的包被缓冲溶液中，4℃下搅拌反应12h。4℃下用PBS透析三天，每天换三次透析液，得到山梨酸人工抗原，分装并低温保存备用。所述山梨酸半抗原与载体蛋白的摩尔比为60～100：1。
优选地，本发明所述山梨酸人工抗原抗血清效果评价方法如下：
选取5周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫，首次免疫将山梨酸半抗原-LF偶联物(免疫原)与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，腹部皮下注射；从首次免疫开始，第2，4和8周加强免疫，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫；最后一次加强免疫一周后取少量尾部静脉血，充分离心取上清检测效价和抑制，建立间接酶联免疫分析方法标准曲线。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首先提供了一种山梨酸半抗原，该半抗原在山梨醛分子基础上进行设计，通过肟化法引入不饱和线性间隔臂以提高半抗原基人工抗原的特异免疫原性。同时，本发明提供由所述半抗原偶联载体蛋白制备的人工抗原，以及免疫实验动物所得抗血清效果，对山梨酸的IC50达1.96mg/L，灵敏度良好。本发明的抗原抗体合成过程简单、成本较低，开发出成本低廉，检测效率高、操作简单的酶联免疫快速检测工具，奠定基础，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明半抗原、载体蛋白及人工抗原紫外扫描图。
图2为本发明基于山梨酸人工抗原抗血清效果建立的间接竞争ELISA标准曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实验例1、山梨酸半抗原的合成，其合成路线具体如下所示：
1、产物Ⅰ的合成
称取盐酸羟胺232mg(3.3mmol)溶于6mL甲醇/吡啶/水(4:1:1)混合溶液中，在60℃条件下，往其中滴加山梨醛550μL(5mmol)，反应5h。反应结束后蒸干溶剂，滴加1M稀盐酸溶液将pH值调为3，再用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相，蒸干溶剂后，经200-300目硅胶柱层析分离(乙酸乙酯：石油醚＝1:5)得到黄色油状物，即产物I。
2、产物Ⅱ的合成，即山梨酸半抗原的合成
将产物I 111.14mg(1mmol)、6-溴己酸175.545mg(0.9mmol)、无水碳酸钾691.05mg(5mmol)分别溶于2mL吡啶中，将6-溴己酸的吡啶溶液逐滴滴加到产物I和无水碳酸钾混合的吡啶溶液中，在85℃条件下避光搅拌反应45min。反应结束后蒸干溶剂，加入1M的稀盐酸将粗品复溶并将体系pH值调为3，再用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相，蒸干溶剂后，经200-300目硅胶柱层析分离(乙酸乙酯：石油醚＝1:1)分离得到黄色固体，即制得式(I)山梨酸半抗原。ESI-MS:226.14110[M+H]+；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ11.32(s,1H),7.49–7.42(m,1H),6.51–6.34(m,2H),6.26–6.15(m,1H),5.90(dqd,J＝14.0,5.7,1.1Hz,1H),3.94(t,J＝6.4Hz,2H),2.28(t,J＝8.8Hz,2H),1.83(ddd,J＝5.6,1.5,0.8Hz,3H),1.72(p,J＝6.7Hz,2H),1.65–1.53(m,2H),1.51–1.39(m,2H).13C NMR(125MHz,Chloroform-d)δ178.36,151.53,135.62,134.88,132.07,127.85,73.33,34.33,27.85,25.82,24.59,18.52。
实施例2、山梨酸人工抗原的制备与鉴定
1、免疫原制备——山梨酸半抗原与乳铁蛋白(LF)偶联得到免疫原。
将5mg山梨酸半抗原与10mg EDC、5mg NHS溶于200μL的DMF中，4℃下搅拌过夜，离心后取上清为A液。称取乳铁蛋白10mg，将溶解于2mL的包被缓冲溶液中，为B液。磁力搅拌下，吸取A液逐滴缓慢加入到B液中，4℃下搅拌反应12h。离心后取上清液，装入透析袋中，4℃下用PBS(0.01M，pH 7.4)透析3天，每天换3次透析液，得到人工抗原(SA-H1-LF)。用PBS调整浓度为1mg/mL，每管500μL分装于1.5mL离心管中，-20℃保存备用。
2、包被原制备——山梨酸半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原。
将5mg山梨酸半抗原与10mg EDC、5mg NHS溶于200μL的DMF中，4℃下搅拌过夜，离心后取上清为A液。称取卵清蛋白10mg，将其分别溶解于2mL的包被缓冲溶液中，为B液。磁力搅拌下，吸取A液逐滴缓慢加入到B液中，4℃下搅拌反应12h。离心后取上清液，装入透析袋中，4℃下用PBS(0.01M，pH 7.4)透析3天，每天换3次透析液，得到人工抗原(SA-H1-OVA)。用PBS调整浓度为1mg/mL，每管500μL分装于1.5mL离心管中，-20℃保存备用。
3、人工抗原的鉴定。
按合成山梨酸偶联抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，进行紫外(200nm～800nm)扫描测定，通过比较三者分别在260nm和280nm的吸光值计算其结合比。如图2所示，偶联物山梨酸半抗原-载体蛋白的最大吸收峰与山梨酸半抗原、载体蛋白的最大吸收峰相比发生了明显的变化，表明山梨酸半抗原-载体蛋白的合成是成功的。
实施例3、山梨酸人工抗原免疫动物抗血清测定
1、动物免疫：首次免疫将山梨酸半抗原-LF偶联物(免疫原)与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，腹部皮下注射5周龄的BALB/c小鼠，每只0.20mL；从首次免疫开始，第2，4和8周加强免疫，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫；最后一次加强免疫一周后取少量尾部静脉血，充分离心取上清检测效价和抑制。
2、抗血清测定：以实施例2制备得到的山梨酸包被原，取上述采集的小鼠的血清作为抗体，采用间接竞争酶联免疫分析方法测定小鼠血清的抗血清效价和抑制率，综合考虑各血清的效价和抑制率，对其进行评价，具体操作如下：
(1)包板：用包被缓冲液将被包被原(SA-H1-OVA)稀释成1mg/mL，以每孔100μL加入96孔酶标板的微孔中，37℃水浴孵育过夜。倾去孔内液孔，每孔加PBST 300μL，洗涤2次，甩干。每孔加入120μL封闭液，37℃水浴封闭3h，甩干孔内液体，于37℃烘箱烘干，1h后取出放4℃备用。
包被缓冲液：pH 9.6，0.1M的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(溶剂为蒸馏水，溶质及其浓度如下：Na2CO3 1.65g/L和NaHCO3 2.65g/L)。
PBST：0.01M PBS和0.06％ Tween-20(v/v)(溶剂为蒸馏水)
封闭液：含有1％(体积百分含量)脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液，pH 7.4。
(2)标准曲线的建立：将步骤(1)包好的酶标板，效价列：每孔分别加入50μL PBS和50μL按梯度倍数稀释(1K、2K、4K、8K、16K、32K、64K)的血清；抑制列：每孔加入50μL稀释好的100mg/L药物(山梨酸半抗原)和50μL按梯度倍数稀释(1K、2K、4K、8K、16K、32K、64K)的血清，做3组平行。37℃孵育40min，用PBST洗涤五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释的酶标二抗(羊抗鼠IgG-HRP),37℃孵育30min，用PBST洗涤五次，拍干孔内液体，加入100μL TMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸光值。以不同山梨酸浓度为横坐标，B/B0(加入山梨酸的孔OD450/未加入山梨酸的孔OD450)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。
(3)实验结果
基于山梨酸人工抗原抗血清建立的间接竞争酶联免疫分析方法标准曲线(如图2所示)，经S曲线拟合得出对山梨酸的IC50为1.96mg/L，说明该半抗原对山梨酸有很好的灵敏度，可用于后续山梨酸免疫分析检测。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首先提供了一种山梨酸半抗原，该半抗原在山梨醛分子基础上进行设计，通过肟化法引入不饱和线性间隔臂以提高半抗原基人工抗原的特异免疫原性。同时，本发明提供由所述半抗原偶联载体蛋白制备的人工抗原，以及免疫实验动物所得抗血清效果，对山梨酸的IC50达1.96mg/L，灵敏度良好。本发明的抗原抗体合成过程简单、成本较低，开发出成本低廉，检测效率高、操作简单的酶联免疫快速检测工具，奠定基础，具有良好的应用前景。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种山梨酸半抗原，其特征在于，其分子结构如下所示：
2.根据权利要求1所述的山梨酸半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将山梨醛、盐酸羟胺进行反应得到产物I，所述产物I具有的结构式
S2、将所述产物I与6-溴己酸发生反应，制备得到产物II，所述产物II即为式(I)所示的山梨酸半抗原；
反应式如下：
3.根据权利要求2所述的的山梨酸半抗原的制备方法，其特征在于，所述S1具体包括如下步骤：将山梨醛和盐酸羟胺分别溶于甲醇/吡啶/水的混合液中，60℃条件下，反应5h。反应结束后将溶剂蒸干，用稀盐酸将体系pH值调为3，再用乙酸乙酯萃取，蒸干溶剂后，经200-300目硅胶柱层析分离得到产物I；
所述S2具体包括如下步骤：取摩尔比为2：1的产物I与6-溴己酸溶于吡啶中，往产物I的吡啶溶液中加入无水碳酸钾，85℃搅拌下，将6-溴己酸的吡啶溶液滴加到产物I的吡啶溶液中，反应45min，反应结束后蒸干溶剂，用稀盐酸将体系pH值调为3，再用乙酸乙酯萃取，蒸干溶剂后，经200-300目硅胶柱层析分离得到式(I)山梨酸半抗原。
4.一种山梨酸抗原，其特征在于，由权利要求1所述的山梨酸半抗原通过活泼酯法与大分子载体蛋白偶联得到，所述大分子载体蛋白为乳铁蛋白和卵清蛋白。
5.一种如权利要求4所述的山梨酸抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将山梨酸半抗原、NHS、EDC溶于适量的DMF中，4℃下搅拌过夜对半抗原羧基进行活化，离心取上清即为活化好的山梨酸半抗原的衍生物；将活化好的半抗原衍生物缓慢逐滴加入到含有5mg/mL大分子载体的包被缓冲溶液中，4℃下搅拌反应12h；4℃下用PBS透析三天，每天换三次透析液，得到山梨酸人工抗原，分装并低温保存备用；所述山梨酸半抗原与载体蛋白的摩尔比为60～100：1。
6.一种山梨酸人工抗原抗血清效果评价方法，其特征在于，由权利要求4所述的山梨酸半抗原-乳铁蛋白偶联物作为免疫原，所述山梨酸半抗原-卵清蛋白偶联物作为包被原，进行基于间接竞争酶联免疫分析方法检测，具体步骤如下：
选取BALB/c小鼠进行免疫，首次免疫将山梨酸半抗原-乳铁蛋白偶联物与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，腹部皮下注射；从首次免疫开始，第2，4和8周加强免疫，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫；最后一次加强免疫一周后取少量尾部静脉血，充分离心取上清检测效价和抑制，建立间接酶联免疫分析方法标准曲线。
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