CN115160135B - 一种大麻二酚半抗原与完全抗原的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

一种大麻二酚半抗原与完全抗原的制备方法及应用，大麻二酚半抗原是由3,5‑二甲氧基苯甲醛与三乙基‑4‑磷化物反应生成（2E，4E）‑5‑（3,5‑二甲氧基苯基）‑2,4‑戊二烯酸乙酯，随后经PdC/H2还原，HBr/HoAc脱甲基和皂化反应得到5‑（3,5‑二羟苯基）戊酸，最后再与(1S,4R)‑1‑甲基‑4‑(1‑甲基乙烯基)‑2‑环己烯‑1‑醇反应得到大麻二酚半抗原；大麻二酚完全抗原由大麻二酚半抗原与载体蛋白偶联得到。本发明制备的抗原呈现出特异性的大麻二酚抗原决定簇，使得筛选出高特异性的大麻二酚单克隆抗体成为可能。产生的抗体特异性高、灵敏度高，对大麻及其衍生物均无明显的交叉反应，可用于建立酶联免疫分析方法和胶体金、荧光快速检测试纸法，实现对样品中大麻二酚的快速检测。

Description

一种大麻二酚半抗原与完全抗原的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种大麻二酚半抗原与完全抗原的制备方法及应用。属于生物技术领域。
背景技术
大麻二酚即CBD，是一种从大麻中提取的植物大麻素，缺乏精神活性，具有镇痛、抗炎、抗肿瘤和化学预防活性。大麻二酚具有阻断某些多酚对人体神经系统的不利影响，并且具有阻断乳腺癌转移、治疗癫痫、抗类风湿关节炎、抗失眠等一系列生理活性功能，对治疗多发性硬化症具有良好的效果。
工业大麻是指四氢大麻酚(THC)含量低于0.3％的大麻，是大麻科(Cannabaceae)大麻属(Cannabis)一年生草本植物。工业大麻花叶提取物大麻二酚(CBD)具有广阔的市场前景，工业大麻中大麻二酚含量的测定则有助于对工业大麻种植过程中CBD含量的监控以及工业大麻品种的优化。
目前常用的大麻二酚检测方法主要是仪器方法，如高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法，采用这些分析方法不仅需要昂贵的仪器和专业的技术人员，样品前处理过程复杂、周期长、成本高，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。基于抗原抗体特异性识别的免疫分析方法可以定性定量检测样品中的大麻二酚含量。
免疫分析是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，然而得到高亲和力和高特异性的单克隆抗体是免疫学检测的前提，人工抗原的合成则是其中重要的一步。
与现有的检测方法相比，基于抗原–抗体特异性分子识别的免疫检测方法，在现场检测方面具有更大优势，表现出快速、灵敏、简便等特点，并且成本低廉，对操作人员技能要求较低。然而，免疫分析方法研发的关键在于设计出合适的大麻二酚半抗原，制备出灵敏度高、特异性强的抗体，但是现有技术中未见有关于大麻二酚半抗原与完全抗原的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中大麻二酚检测方法的缺陷和不足，提供一种大麻二酚半抗原与完全抗原的制备方法及应用。本发明制备的大麻二酚半抗原不仅最大程度上保留了大麻二酚的特征结构，而且与载体蛋白偶联存在合适结构的连接臂，尽可能让大麻二酚特征结构充分暴露于机体，增强免疫效果，提高抗体的特异性，降低与其他大麻二酚类似物的交叉反应；本发明制备的大麻二酚半抗原在原有结构上引入羧基，有利于制备大麻二酚人工抗原；本发明提供的大麻二酚人工抗原具有强的免疫原性，有利于刺激机体完成免疫应答，从而获得高质量的单克隆抗体，为大麻二酚免疫分析方法的建立提供核心试剂。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种大麻二酚半抗原的制备方法，是由3,5-二甲氧基苯甲醛与三乙基-4-磷化物反应生成(2E，4E)-5-(3,5-二甲氧基苯基)-2,4-戊二烯酸乙酯，随后经PdC/H2还原，HBr/HoAc脱甲基和皂化反应得到5-(3,5-二羟苯基)戊酸，最后再与(1S,4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇反应得到，其分子结构式为：
具体反应路线见图1。
该制备方法的具体步骤如下：
1)取氢化钠0.87g(22mmol)，加20ml干燥无水的四氢呋喃搅拌形成悬浮液，冰浴下逐滴加入含有5g三乙基-4-磷化物(20mmol)的无水的四氢呋喃50ml，搅拌反应30min。随后逐滴加入含有2.77g 3,5-二甲氧基苯甲醛的无水的四氢呋喃50ml，移除冰浴，并在室温下搅拌反应1h，然后加热到60℃反应1h。TLC确定反应结束后，将反应液冷却至室温，并用120ml水淬灭反应，用120ml乙酸乙酯萃取水相3次，合并有机相，饱和食盐水反萃有机相，无水硫酸钠干燥过夜，旋蒸得到4.0g中间体1。
2)将3.6g中间体1和10％ Pd-C(0.74g)加入至75ml甲醇中，在室温下加氢气搅拌反应2h，过滤Pd-C，将滤液浓缩，得到3.5g淡黄色油状液体(中间体2)。
3)在中间体2中加入50ml 40％氢溴酸，50ml冰醋酸，60℃回流反应4h。TLC确定反应结束后，将反应混合物冷却至室温并添加冰水150ml。反应混合物用150ml乙酸乙酯萃取3次，饱和食盐水反萃有机相，无水硫酸钠干燥过夜，浓缩有机相得到黑色油状粗产物。粗产物通过柱层析(乙酸乙酯/己烷1：2)纯化，得到2.50g中间体3。
4)取1g中间体3(4.75mmol)，0.18g p-TsOH(0.95mmol)加入50ml THF：DCM(1：4)混合液中，搅拌混匀，逐滴加入1.08g(1S,4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇，室温下搅拌反应30min，TLC确定反应的进程，最后加入50ml乙酸乙酯来终止反应，并用NaHCO3溶液调节溶液的pH值至3-4，分离有机相，用饱和食盐水洗涤两次，干燥浓缩得到油状粗产物2.3g，经柱层析简单纯化后再制备HPLC进一步纯化，得到大麻二酚半抗原220mg。
所述大麻二酚半抗原可用于制作动物免疫的抗原体系原料。
一种大麻二酚完全抗原的制备方法，是由按上述制备方法得到的大麻二酚半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、甲状腺蛋白。
该制备方法的具体步骤如下：
免疫抗原的制备：取20mg半抗原，EDC 23mg，NHS14mg加入1ml二氧六环溶解完全得到A液，室温搅拌反应4h。取50mg牛血清白蛋白用5ml 10mM PBS搅拌溶解完全得到B液。将A液逐滴加入至B液中，4℃搅拌反应过夜。反应结束后将蛋白溶液用10mM PBS透析3天，每6h换液一次，得到大麻二酚-牛血清白蛋白偶联物即得免疫抗原CBD-BSA。
包被抗原的制备：取10mg半抗原，EDC 12mg，NHS 7mg加入1ml无水DMF溶解完全得到A液，室温搅拌反应4h。取20mg卵清蛋白用5ml 10mM PBS搅拌溶解完全得到B液。将A液逐滴加入至B液中，4℃搅拌反应过夜。反应结束后将蛋白溶液用10mM PBS透析3天，每6h换液一次，得到大麻二酚-卵清蛋白偶联物即得包被抗原CBD-OVA。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种大麻二酚的半抗原，应用半抗原偶联载体蛋白制备得到的人工抗原作为免疫原，进而制备得到大麻二酚抗体。本发明半抗原与待测物大麻二酚的骨架结构重叠度高，有效的提高了大麻二酚人工抗原的免疫原性。半抗原与载体蛋白偶联存在合适结构的连接臂，降低了空间位阻，尽可能让大麻二酚特征结构充分暴露于机体，增强免疫效果，进一步提高抗体亲和力。
(2)同时，本发明所得到的抗体效价高、特异性强、亲和力高，对大麻二酚类似物无交叉反应；本发明的抗体具有简便快速、特异性强、线性范围广，灵敏度高的特点；利用本发明的大麻二酚人工抗原、抗体可实现快速准确的检测大麻二酚的目的。
附图说明
图1：大麻二酚半抗原的合成路线图；
图2：中间体1核磁共振氢谱；
图3：中间体1核磁共振碳谱；
图4：中间体2核磁共振氢谱；
图5：中间体2核磁共振碳谱；
图6：中间体3核磁共振氢谱；
图7：中间体3核磁共振碳谱；
图8：大麻二酚半抗原核磁共振氢谱；
图9：大麻二酚半抗原核磁共振碳谱；
图10：大麻二酚完全抗原紫外吸收光谱。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内可能会对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰同样应落入发明的保护范围。
实施例1大麻二酚半抗原的制备
1、大麻二酚半抗原的制备
1)取氢化钠0.87g(22mmol)，加20ml干燥无水的四氢呋喃搅拌形成悬浮液，冰浴下逐滴加入含有5g三乙基-4-磷化物(20mmol)的无水的四氢呋喃50ml，搅拌反应30min。随后逐滴加入含有2.77g 3,5-二甲氧基苯甲醛的无水的四氢呋喃50ml，移除冰浴，并在室温下搅拌反应1h，然后加热到60℃反应1h。TLC确定反应结束后，将反应液冷却至室温，并用120ml水淬灭反应，用120ml乙酸乙酯萃取水相3次，合并有机相，饱和食盐水反萃有机相，无水硫酸钠干燥过夜，旋蒸得到4.0g中间体1。
2)将3.6g中间体1和10％ Pd-C(0.74g)加入至75ml甲醇中，在室温下加氢气搅拌反应2h，过滤Pd-C，将滤液浓缩，得到3.5g淡黄色油状液体(中间体2)。
3)在中间体2中加入50ml 40％氢溴酸，50ml冰醋酸，60℃回流反应4h。TLC确定反应结束后，将反应混合物冷却至室温并添加冰水150ml。反应混合物用150ml乙酸乙酯萃取3次，饱和食盐水反萃有机相，无水硫酸钠干燥过夜，浓缩有机相得到黑色油状粗产物。粗产物通过柱层析(乙酸乙酯/己烷1：2)纯化，得到2.50g中间体3。
4)取1g中间体3(4.75mmol)，0.18g p-TsOH(0.95mmol)加入50ml THF：DCM(1：4)混合液中，搅拌混匀，逐滴加入1.08g(1S,4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇，室温下搅拌反应30min，TLC确定反应的进程，最后加入50ml乙酸乙酯来终止反应，并用NaHCO3溶液调节溶液的pH值至3-4，分离有机相，用饱和食盐水洗涤两次，干燥浓缩得到油状粗产物2.3g，经柱层析简单纯化后再制备HPLC进一步纯化，得到大麻二酚半抗原220mg。
2、大麻二酚半抗原的鉴定
中间体及大麻二酚半抗原的1H NMR，13C NMR如图2-图9所示。
实施例2大麻二酚完全抗原的制备
1、免疫抗原的制备
大麻二酚半抗原与牛血清白蛋白偶联得到免疫抗原。
取20mg半抗原，EDC 23mg，NHS14mg加入1ml二氧六环溶解完全得到A液，室温搅拌反应4h。取50mg牛血清白蛋白用5ml 10mM PBS搅拌溶解完全得到B液。将A液逐滴加入至B液中，4℃搅拌反应过夜。反应结束后将蛋白溶液用10mM PBS透析3天，每6h换液一次，得到大麻二酚-牛血清白蛋白偶联物即得免疫抗原CBD-BSA。
2、包被抗原的制备
大麻二酚半抗原与卵清蛋白偶联得到包被抗原。
取10mg半抗原，EDC 12mg，NHS 7mg加入1ml无水DMF溶解完全得到A液，室温搅拌反应4h。取20mg卵清蛋白用5ml 10mM PBS搅拌溶解完全得到B液。将A液逐滴加入至B液中，4℃搅拌反应过夜。反应结束后将蛋白溶液用10mM PBS透析3天，每6h换液一次，得到大麻二酚-卵清蛋白偶联物即得包被抗原CBD-OVA。
2、大麻二酚完全抗原的鉴定
完全抗原采用紫外光谱法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。大麻二酚半抗原-载体蛋白的最大吸收峰与大麻二酚半抗原、载体蛋白的最大吸收峰相比发生了明显的变化，表明大麻二酚-载体蛋白的制备是成功的(参见图10)。经计算，半抗原与BSA的偶联比为25：1，与OVA的偶联比为16：1。
实施例3大麻二酚单克隆抗体的制备
1、动物免疫
选用6-8周龄的Balb/c雌鼠，将免疫抗原与弗氏佐剂混合乳化，按照100ug/只的免疫剂量，使小鼠产生抗血清。
2、细胞融合与亚克隆
取免疫成功的Balb/c小鼠脾细胞，将骨髓瘤细胞SP2/0和免疫鼠脾细胞比例调至1:5～1:10的融合，采用竞争ELISA法测定细胞培养上清液，筛选出合适的阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
3、单克隆抗体的制备与纯化
腹水制备：选用10～11周龄的Balb/c雌鼠，将佐剂注射Balb/c小鼠腹腔，每只0.3～0.5ml处理腹腔7～15天左右，将筛选出来的杂交瘤细胞株扩大培养后接种到Balb/c小鼠腹腔内。小鼠脱颈椎处死抽取后小鼠腹水，3000rpm离心10min。
单克隆抗体的纯化：腹水先用硫酸铵沉淀法初纯后，再用Protein G柱纯化得到最终的单克隆抗体。
4、单克隆抗体的效价测定
Elisa法测定抗体的效价为1：600000。
竞争Elisa:大麻二酚-OVA包被酶标板，加入大麻二酚标准品、大麻二酚单克隆抗体37℃孵育2h后，洗涤，加入HRP标记的羊抗鼠二抗，再次洗涤加入TMB显色液，酸终止反应，在酶标仪上测定450nm处的吸光度值。
5、单克隆抗体特异性测定
抗体的特异性是指与相应抗原或近似抗原物质的识别能力。抗体的特异性高，它的识别能力就强。衡量特异性通常以交叉反应率来表示。交叉反应率可用竞争抑制试验测定。以不同浓度抗原和近似抗原分别做竞争抑制曲线，计算各自的结合率，求出各自在IC50时的浓度，并按下列公式计算交叉反应率。
按照上式计算，本发明测试了抗体对大麻其他主要成分的交叉反应率：四氢大麻酚(THC)＜1％、大麻环萜酚(CBC)＜1％、大麻酚(CBN)＜1％、大麻萜酚(CBG)＜1％，本发明抗体对四氢大麻酚(THC)、大麻环萜酚(CBC)、大麻酚(CBN)、大麻萜酚(CBG)基本无交叉反应，说明抗体特异性较好。

Claims (8)

1.一种大麻二酚半抗原的制备方法，其特征在于：是由3,5-二甲氧基苯甲醛与三乙基-4-磷化物在NaH/THF条件下反应生成(2E，4E)-5-(3,5-二甲氧基苯基)-2,4-戊二烯酸乙酯，随后经PdC/H2还原，HBr/HOAc脱甲基和皂化回流反应得到5-(3,5-二羟苯基)戊酸，最后在p-TsOH，THF/DCM条件下与(1S,4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇反应得到，其分子结构式为：
具体反应过程如下：
2.根据权利要求1所述的大麻二酚半抗原的制备方法，其特征在于：该制备方法的具体步骤如下：
S1.制备大麻二酚中间体1
取氢化钠0.87g，加20ml干燥无水的四氢呋喃搅拌形成悬浮液，冰浴下逐滴加入含有5g三乙基-4-磷化物的无水的四氢呋喃50ml，搅拌反应30min；随后逐滴加入含有2.77g 3,5-二甲氧基苯甲醛的无水的四氢呋喃50ml，移除冰浴，并在室温下搅拌反应1h，然后加热到60℃反应1h；TLC确定反应结束后，将反应液冷却至室温，并用120ml水淬灭反应，用120ml乙酸乙酯萃取水相3次，合并有机相，饱和食盐水反萃有机相，无水硫酸钠干燥过夜，旋蒸得到4.0g中间体1；
S2.制备大麻二酚中间体2
将3.6g中间体1和0.74g 10％Pd-C加入至75ml甲醇中，在室温下加氢气搅拌反应2h，过滤Pd-C，将滤液浓缩，得到3.5g淡黄色油状液体即中间体2；
S3.制备大麻二酚中间体3
在中间体2中加入50ml 40％氢溴酸，50ml冰醋酸，60℃回流反应4h；TLC确定反应结束后，将反应混合物冷却至室温并添加冰水150ml；反应混合物用150ml乙酸乙酯萃取3次，饱和食盐水反萃有机相，无水硫酸钠干燥过夜，浓缩有机相得到黑色油状粗产物；粗产物通过柱层析纯化，得到2.50g中间体3；
S4.制备大麻二酚半抗原
取1g中间体3，0.18g p-TsOH加入至50ml THF：DCM混合液中，搅拌混匀，逐滴加入1.08g(1S,4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇，室温下搅拌反应30min，TLC确定反应的进程，最后加入50ml乙酸乙酯来终止反应，并用NaHCO3溶液调节溶液的pH值至3-4，分离有机相，用饱和食盐水洗涤两次，干燥浓缩得到油状粗产物2.3g，经柱层析简单纯化后再制备HPLC进一步纯化，得到大麻二酚半抗原220mg。
3.一种利用权利要求1或2所述方法制备的大麻二酚半抗原的应用，其特征在于：大麻二酚半抗原可用于制作动物免疫的抗原体系原料。
4.一种大麻二酚完全抗原的制备方法，其特征在于：是由权利要求1制备的大麻二酚半抗原与载体蛋白偶联得到。
5.根据权利要求4所述的大麻二酚完全抗原的制备方法，其特征在于所述载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、甲状腺蛋白。
6.根据权利要求4或5所述的大麻二酚完全抗原的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：取20mg半抗原，EDC 23mg，NHS14mg加入1ml二氧六环溶解完全得到A液，室温搅拌反应4h；取50mg牛血清白蛋白用5ml 10mM PBS搅拌溶解完全得到B液；将A液逐滴加入至B液中，4℃搅拌反应过夜；反应结束后将蛋白溶液用10mM PBS透析3天，每6h换液一次，得到大麻二酚-牛血清白蛋白偶联物即大麻二酚完全抗原。
7.如权利要求4或5所述的大麻二酚完全抗原的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：取10mg半抗原，EDC 12mg，NHS 7mg加入1ml无水DMF溶解完全得到A液，室温搅拌反应4h；取20mg卵清蛋白用5ml 10mM PBS搅拌溶解完全得到B液；将A液逐滴加入至B液中，4℃搅拌反应过夜；反应结束后将蛋白溶液用10mM PBS透析3天，每6h换液一次，得到大麻二酚-卵清蛋白偶联物即大麻二酚完全抗原。
8.一种利用权利要求4或5所述方法制备的大麻二酚完全抗原的应用，其特征在于：采用大麻二酚完全抗原免疫动物所得的单克隆抗体，用于检测化妆品及工业大麻中的大麻二酚。
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