CN103343150A - 一种吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂的制备方法，将绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)经过微生物培养、发酵、提取而获得的一种对多种真菌性植物病害具有良好的抑制效果的新型生物农药。与现有技术相比，本发明制备得到的杀菌剂对黄瓜霜霉病和白粉病、水稻纹枯病病、西瓜枯萎病、辣椒疫病、油菜菌黑、番茄灰霉病等多种瓜果蔬菜和粮食作物病原真菌均有较强的抑制作用，且制备方法简单。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物杀菌剂的制备方法，尤其是涉及一种吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂的制备方法。
背景技术
植物根际中存在着一些有益的细菌，它们可以通过直接或间接的方式促进植物生长并对由病原菌引起的植物病害起到防治作用，这些能够促进植物生长、防治病害并增加作物产量的微生物统称为植物根际促生菌(plant growthpromoting rhizobacteria，PGPR)。此类根际微生物种类丰富多样，选择适当的根际促生细菌对植物进行处理(如浸种或喷雾)，可以改善根际微生态环境、促进植物生长、抑制或减轻植物病害、减少化肥和农药投入、减轻环境污染等作用。本发明提供的细菌是从植物根部分离获得，属于根际促生细菌。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供将绿针假单胞菌经过微生物培养、发酵而获得新型生物杀菌剂吩嗪-1-甲酰肼的制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将绿针假单胞菌接种到经过高温灭菌的液体培养基中并置于全自动控温摇床上，控制转速为180-240rpm，在25-30℃下培养1-3天得到含有绿针假单胞菌的液体种子；
(2)将液体种子液移入到经过高温灭菌的装在发酵罐中的培养基中，控制发酵罐转速为180-240rpm，在25-30℃下培养2-5天，即得到含有吩嗪-1-甲酰肼的发酵液；
(3)将含有吩嗪-1-甲酰肼的发酵液在搅拌下用酸调节pH至2-4，然后进行过滤，得到的滤液用溶剂进行萃取、分离、浓缩、结晶及干燥，即制备得到吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂。
所述的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)是上海农乐生物制品股份有限公司通过筛选获得的一种重要的植物根际促生细菌，其保藏编号为CGMCC NO.6773；保藏时间：2012年11月2日；保藏单位：保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心China General MicrobiologicalCulture Collection Center(CGMCC)；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。
步骤(1)中所述的液体培养基的配方采用以下组分及重量百分比含量：玉米粉1-5％、豆饼粉2-8％、蛋白胨1-3％、K2HPO40.01-0.03％、KH2PO40.01-0.03％、无水硫酸镁0.03-0.08％、甘油0.1-0.3％，余量为水，液体培养基的pH为6.5-7.5。
步骤(2)中所述的培养基的配方采用以下组分及重量百分比含量：玉米粉1-5％、豆饼粉2-8％、蛋白胨1-3％、K2HPO40.01-0.03％、KH2PO40.01-0.03％、无水硫酸镁0.03-0.08％、甘油0.1-0.3％，余量为水，培养基的pH为6.5-7.5。
步骤(3)中所述的酸选用盐酸、硫酸或草酸。
步骤(3)采用膜过滤、板框过滤或离心机过滤处理含有吩嗪-1-甲酰肼的发酵液。
步骤(3)中所述的溶剂为乙酸乙酯、氯仿或乙酸丁酯。
与现有技术相比，本发明采用从植物根围分离到的绿针假单胞菌大部分都具有防病增产作用，可用于植物病害的生物防治。该类菌株对黄瓜霜霉病和白粉病菌、水稻纹枯病菌、西瓜枯萎病菌、辣椒疫病菌、油菜菌黑病菌、番茄灰霉病菌等多种瓜果蔬菜和粮食作物病原真菌均有较强的抑制作用，并且能够在多种作物根际进行定殖，显示了在生物防治中应用的潜力。
绿针假单胞菌对黄瓜白粉病、辣椒疫病、甜瓜蔓枯病等农作物真菌病原菌有很强的抑制作用。绿针假单胞菌的作用机理一是产生活性物质或改善矿质营养直接促进植物生长；二是菌体产生代谢物质或通过竞争作用抑制或阻碍根围病原微生物的发展，间接促进植物的生长。其生防作用机理涉及有效的根部定殖、抗生作用、根际营养竞争(特别是对Fe的竞争)、诱导植物抗性和分泌降解微生物的酶等。
这种制备方法所使用的生产装置与化工装置相比，具有较大的安全优势。主要生产工艺参数温度、压力处于常态，可控，保险系数高的状态。所用原料以农产品、农产品加工品及生物制品为主，安全性高，无易燃、易爆、高毒等原料及产品风险。最终获得的产品属于低毒，对环境无不良影响，对储存环境要求低，在运输过程中安全。并且，加工成制剂产品后，具有更低的毒性和对环境更友好的特征，使产品从生产到使用整个过程中的安全得到可靠的保证。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)是上海农乐生物制品股份有限公司通过筛选获得的一种重要的植物根际促生细菌，其保藏编号为CGMCCNO.6773；保藏时间：2012年11月2日；保藏单位：保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心China General Microbiological CultureCollection Center(CGMCC)；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，本发明将绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)经过微生物培养、发酵、提取而获得的一种对多种真菌性植物病害具有良好的抑制效果的新型生物农药。
实施例1
吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1、将生长良好的绿针假单胞菌nlsy001菌种接种到装有经过高温灭菌的液体培养基中，置于全自动控温摇床上，转速调节为180rpm，在27℃下培养24小时，得到含有绿针假单胞菌nlsy001液体种子。所述液体培养基配方为：玉米粉1％、豆饼粉3.5％、蛋白胨2％、K2HPO40.01％、KH2PO40.01％、无水硫酸镁0.04％、甘油0.1％，PH7.0，余量为水。
2、将上述制好的nlsy003液体种子液移入到经过高温灭菌的装在发酵罐中的培养基中，发酵罐转速调节为180rpm，在27℃下培养2天，即得到含有1.2克/升吩嗪-1-甲酰肼的发酵液。所述液体培养基配方为：玉米粉1％、豆饼粉3.5％、蛋白胨2％、K2HPO40.01％、KH2PO40.01％、无水硫酸镁0.04％、甘油0.1％，PH7.0，余量为水。
3、将上述制好的含有吩嗪-1-甲酰肼的发酵液在搅拌下用酸(盐酸、硫酸、草酸)调节PH2.5，然后进行过滤(膜过滤、板框过滤、离心机过滤)，将滤液再用溶剂(乙酸乙酯、氯仿、乙酸丁酯)进行萃取、分离、浓缩、结晶及干燥，即得到吩嗪-1-甲酰肼产品。
实施例2
吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1、将生长良好的绿针假单胞菌nlsy001菌种接种到装有经过高温灭菌的液体培养基中，置于全自动控温摇床上，转速调节为200rpm，在28℃下培养36小时，得到含有绿针假单胞菌nlsy001液体种子。所述液体培养基配方为：玉米粉2％、豆饼粉4％、蛋白胨2.5％、K2HPO40.015％、KH2PO40.015％、无水硫酸镁0.04％、甘油0.1％，PH7.2，余量为水。
2、将上述制好的nlsy003液体种子液移入到经过高温灭菌的装在发酵罐中的培养基中，发酵罐转速调节为200rpm，在28℃下培养60小时，即得到含有3.0克/升吩嗪-1-甲酰肼的发酵液。所述液体培养基配方为：玉米粉2％、豆饼粉4％、蛋白胨2.5％、K2HPO40.015％、KH2PO40.015％、无水硫酸镁0.04％、甘油0.1％，PH7.2，余量为水。
3、将上述制好的含有吩嗪-1-甲酰肼的发酵液在搅拌下用酸(盐酸、硫酸、草酸)调节PH3.0，然后进行过滤(膜过滤、板框过滤、离心机过滤)，将滤液再用溶剂(乙酸乙酯、氯仿、乙酸丁酯)进行萃取、分离、浓缩、结晶及干燥，即得到吩嗪-1-甲酰肼产品。
实施例3
吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1、将生长良好的绿针假单胞菌nlsy001菌种接种到装有经过高温灭菌的液体培养基中，置于全自动控温摇床上，转速调节为220rpm，在30℃下培养48小时，得到含有绿针假单胞菌nlsy001液体种子。所述液体培养基配方为：玉米粉4.5％、豆饼粉4％、蛋白胨3％、K2HPO40.025％、KH2PO40.025％、无水硫酸镁0.05％、甘油0.3％，PH7.5，余量为水。
2、将上述制好的nlsy001液体种子液移入到经过高温灭菌的装在发酵罐中的培养基中，发酵罐转速调节为220rpm，在30℃下培养72小时，即得到含有2.2克/升吩嗪-1-甲酰肼的发酵液。所述液体培养基配方为：玉米粉4.5％、豆饼粉4％、蛋白胨3％、K2HPO40.025％、KH2PO40.025％、无水硫酸镁0.05％、甘油0.3％，PH7.5，余量为水。
3、将上述制好的含有吩嗪-1-甲酰肼的发酵液在搅拌下用酸(盐酸、硫酸、草酸)调节PH3.5，然后进行过滤(膜过滤、板框过滤、离心机过滤)，将滤液再用溶剂(乙酸乙酯、氯仿、乙酸丁酯)进行萃取、分离、浓缩、结晶及干燥，即得到吩嗪-1-甲酰肼产品。
实施例4
吩嗪-1-甲酰肼对植物病原菌的抑菌作用：将吩嗪-1-甲酰肼制成1％的悬浮剂，分别测试对黄瓜霜霉病(S)和白粉病菌(H)、水稻纹枯病菌(W)、西瓜枯萎病菌(G)、辣椒疫病菌(Q)、油菜菌黑病菌(J)、番茄灰霉病菌(F)的抑菌作用，结果如表1所示：
表1
| 病原菌 | S | H | W | G | Q | J | F |
| EC50(mg/L) | 0.56 | 0.85 | 0.28 | 1.88 | 1.20 | 1.17 | 1.52 |
EC50为半致死浓度，浓度越低，表示抑菌作用越强。
试验表明：吩嗪-1-甲酰肼是一种广谱生物杀菌剂，对多种植物真菌病害具有显著的抑菌效果。
实施例5
吩嗪-1-甲酰肼对黄瓜白粉病的药效试验：将吩嗪-1-甲酰肼制成1％的悬浮剂进行药效试验，将1％吩嗪-1-甲酰肼悬浮剂稀释500倍、1000倍和1500倍，采用常规的叶面喷雾法进行防治试验。对黄瓜白粉病的试验结果如下表所示，试验中，吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂对黄瓜的叶片、花及果实无任何药害，也没有观察到对其它生物的影响，因此，吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂可以作为无公害的瓜类白粉病防治药物加以使用。
表2吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂对黄瓜白粉病的药效试验
实施例6
吩嗪-1-甲酰肼对黄瓜霜霉病的药效试验：将吩嗪-1-甲酰肼制成1％的悬浮剂进行药效试验，将1％吩嗪-1-甲酰肼悬浮剂稀释500倍、1000倍和1500倍，采用常规的叶面喷雾法进行防治试验。对黄瓜霜霉病的试验结果如下表所示，试验中，吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂对黄瓜的叶片、花及果实无任何药害，也没有观察到对其它生物的影响，因此，吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂可以作为无公害的瓜类霜霉病防治药物加以使用。
表3吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂对黄瓜霜霉病的药效试验
实施例7
吩嗪-1-甲酰肼对水稻纹枯病的药效试验：将吩嗪-1-甲酰肼制成1％的悬浮剂进行药效试验，将1％吩嗪-1-甲酰肼悬浮剂稀释500倍、1000倍和1500倍，采用常规的叶面喷雾，在水稻纹枯病的发病初期施药。施药时把药液喷到水稻茎杆上，喷雾重点部位是水稻中下部。试验结果如下表明，吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂对水稻无任何不良影响，无药害产生。试验药剂1％吩嗪-1-甲酰肼悬浮剂对水稻纹枯病有较好的防效，在发病初期连施两次药基本能控制水稻纹枯病的为害。
表4吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂对水稻纹枯病的药效试验(药后14天)
Claims (7)
1.一种吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)接种到经过高温灭菌的液体培养基中并置于全自动控温摇床上，控制转速为180-240rpm，在25-30℃下培养1-3天得到含有绿针假单胞菌的液体种子；
(2)将液体种子液移入到经过高温灭菌的装在发酵罐中的培养基中，控制发酵罐转速为180-240rpm，在25-30℃下培养2-5天，即得到含有吩嗪-1-甲酰肼的发酵液；
(3)将含有吩嗪-1-甲酰肼的发酵液在搅拌下用酸调节pH至2-4，然后进行过滤，得到的滤液用溶剂进行萃取、分离、浓缩、结晶及干燥，即制备得到吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)，其微生物保藏登记号为：CGMCC NO.6773。
3.根据权利要求1所述的一种吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的液体培养基的配方采用以下组分及重量百分比含量：玉米粉1-5％、豆饼粉2-8％、蛋白胨1-3％、K2HPO40.01-0.03％、KH2PO40.01-0.03％、无水硫酸镁0.03-0.08％、甘油0.1-0.3％，余量为水，液体培养基的pH为6.5-7.5。
4.根据权利要求1所述的一种吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的培养基的配方采用以下组分及重量百分比含量：玉米粉1-5％、豆饼粉2-8％、蛋白胨1-3％、K2HPO40.01-0.03％、KH2PO40.01-0.03％、无水硫酸镁0.03-0.08％、甘油0.1-0.3％，余量为水，培养基的pH为6.5-7.5。
5.根据权利要求1所述的一种吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的酸选用盐酸、硫酸或草酸。
6.根据权利要求1所述的一种吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)采用膜过滤、板框过滤或离心机过滤处理含有吩嗪-1-甲酰肼的发酵液。
7.根据权利要求1所述的一种吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的溶剂为乙酸乙酯、氯仿或乙酸丁酯。
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