CN103224902B

CN103224902B - 一种生防菌枯草芽孢杆菌sbz-106和可湿性粉剂及应用

Info

Publication number: CN103224902B
Application number: CN201310167139.0A
Authority: CN
Inventors: 肖炎农; 甄熙; 谢冲; 莫陈汨; 黄丽娜; 王珍
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2013-05-08
Filing date: 2013-05-08
Publication date: 2014-12-31
Anticipated expiration: 2033-05-08
Also published as: CN103224902A

Abstract

本发明公开了一种生防菌枯草芽孢杆菌sbz-106及其可湿性粉剂及应用。本发明公开的枯草芽孢杆菌sbz-106对核盘菌具有强防治效果，已保藏在中国典型培养物保藏中心，CCTCCNO：M2013127。同时制备了一种枯草芽孢杆菌sbz-106可湿性粉剂，该粉剂中枯草芽孢杆菌芽孢含量为1×10⁹cfu/g，由黄原胶、羧甲基纤维素钠配方、碳酸钙、抗坏血酸、用硅藻土组成。本发明产品对作物菌核病高效，对人畜无毒；成本低；适合多种菌核病的防治。本发明的制剂生产中没有用到有机溶剂，降低了生产过程中和产品中的污染，也不会产生溶剂中毒，生产及使用均十分简单，具有生物农药对人畜安全的优点。

Description

一种生防菌枯草芽孢杆菌sbz-106和可湿性粉剂及应用

技术领域

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种防治菌核病的生防菌枯草芽孢杆菌sbz-106，还涉及一种防治菌核病的生防菌枯草芽孢杆菌sbz-106的制备方法，同时还涉及一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，还涉及枯草芽孢杆菌的用途。

背景技术

油菜是我国重要的油料作物及工业原料。油菜菌核病是由核盘菌[Sclerotinia sclerotioru m(Lib.)de Bary]引起的一种世界性病害，是我国油菜生产上的三大病害之一（陈利锋，2001），该病从油菜苗期到成熟期都可造成危害，严重影响着油菜的品质和产量，成为影响我国油菜高产、优质的关键因素。在一般年份，油菜菌核病的发病率为10%～30%，减产5%～7%。在发病重的年份，发病率高达80%，减产达30%～70%，含油量降低1%～5%（李国庆等，1995）。国内外的研究证实利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）防治菌核病是替代化学防治以及弥补抗病资源匮乏的重要措施，生物防治可以有效的避免使用化学农药带来的一系列环境和能源方面的问题，更有利于促进农业的可持续发展（于淑池，2004）。研究表明:枯草芽孢杆菌不仅对油菜菌核病有理想的防治效果，对多种植物病害均有防治效果。配制枯草芽孢杆菌可湿性粉剂可适用于田间土壤使用和喷雾使用。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种枯草芽孢杆菌菌株，该菌株对核盘菌有强防治效果，可用于制备枯草芽孢杆菌的微生物制剂，该菌株已于2013年4月8日送交中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）sbz106，CCTCC NO：M2013127，地址：中国武汉武汉大学。

本发明还有一个目的是在于提供了一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，该粉剂对作物菌核病高效，对人畜无毒；成本低；适合多种菌核病的防治。本发明的制剂生产中没有用到有机溶剂，降低了生产过程中和产品中的污染，也不会产生溶剂中毒，生产及使用均十分简单，具有生物农药对人畜安全的优点。

本发明的最后一个目的是在于提供了一种枯草芽孢杆菌在制备治疗或预防核盘菌制剂药物中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种枯草芽孢杆菌菌株，其筛选及鉴定过程为：

1.枯草芽孢杆菌sbz-106菌株的分离筛选：

枯草芽孢杆菌sbz-106分离与鉴定：申请人于2008年3月至5月从中国湖北省随洲采集健康的油菜植株上分离、筛选得到一株对核盘菌具有强防治效果的枯草芽孢杆菌菌株，申请人将其命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）sbz-106。本发明的枯草芽孢杆菌sbz-106分离和筛选采用稀释平板方法和平板拮抗的方法，菌种鉴定工作参照植物病理研究方法（方中达，1998），微生物学实验（赵斌和何绍江，2006）等书中的实验方法。

2.枯草芽孢杆菌sbz-106菌学特征：

（1）枯草芽孢杆菌sbz-106的形态学：

枯草芽孢杆菌sbz-106在LB培养基（配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min）上菌落接近圆形，中间部分有小颗粒状隆起，不透明，菌落乳白色。菌体直杆状，大小为（0.7-0.8）μm×（2-2.5）μm，革兰氏染色反应紫色，为阳性；产生芽孢，芽孢呈椭圆形近中生，但不产生荚膜，周生鞭毛。

（2）枯草芽孢杆菌sbz-106菌株的遗传学特性：

将sbz-106菌株于28℃180r/min培养24h，取1μl作为模板，对16S rDNA片段进行PCR扩增。引物设计和扩增条件参照细菌16S rDNA的通用引物和标准方法（见：Weisbur g et al.,1991），所述的引物DNA序列如下：

正向引物：5′AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG3′

反向引物：5′ACG GTT ACC TTG TTA CGA CTT3′

序列分析表明16S rDNA扩增片段长度为1513bp，其序列如序列表SEQ ID NO：1所示。在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）进行BLAST分析，可知其与Bacillus subtilis菌株的相应序列的同源性为99%。

（3）枯草芽孢杆菌sbz-106菌株生理生化特性：

sbz-106菌株适宜的生长温度为25-37℃，适宜的生长环境pH值为7.0。能利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、淀粉、甘露醇、乳糖、D—果糖和肌糖等碳源；能利用酵母粉、NH₄NO₃、钼酸铵、NH₄Cl、硫酸铵、碳酸铵、牛肉浸膏和酵母浸膏等氮源；革兰氏染色为阳性，运动性测定为阳性，过氧化氢酶测定为阳性，苯丙氨酸解氨酶为阴性，淀粉水解反应为阳性，吲哚产生为阴性，甲基红（MR）测定为阴性，乙酰甲基甲醇（VP）反应为阳性，接触酶反应为阴性，氧化酶测定为阳性，明胶液化为阳性，硝酸盐还原反应为阳性，纤维素分解测定为阴性，柠檬酸盐的利用为阳性，丙二酸盐反应为阳性，NaCl浓度超过10%时不能生长，葡萄糖氧化发酵测定为阳性，产H₂S试验（产气）为阴性。

一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，每1000mg粉剂含有：

枯草芽孢杆菌sbz-106 1×10⁹cfu

黄原胶2-16mg

羧甲基纤维素钠8-64mg

碳酸钙10-20mg

抗坏血酸10-20mg

硅藻土补充至1000mg。

所述的黄原胶、羧甲基纤维素钠、碳酸钙、抗坏血酸和硅藻土为市售的商品化的产品。

一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，每1000mg粉剂含有（优选范围）：

枯草芽孢杆菌sbz-106 1×10⁹cfu；

黄原胶2-10mg；

羧甲基纤维素钠8-30mg；

碳酸钙15-20mg；

抗坏血酸10-15mg；

硅藻土补充至1000mg。

一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，每1000mg粉剂含有（更优范围）：

枯草芽孢杆菌sbz-106 1×10⁹cfu；

黄原胶2-5mg；

羧甲基纤维素钠8-15mg；

碳酸钙15-20mg；

抗坏血酸10-12mg；

硅藻土补充至1000mg。

一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，每1000mg粉剂含有（最佳值）：

枯草芽孢杆菌sbz-106 1×10⁹cfu；

黄原胶2mg；

羧甲基纤维素钠8mg；

碳酸钙20mg；

抗坏血酸10mg；

硅藻土补充至1000mg。

一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，其步骤是：

将菌浓度为10⁸/ml枯草芽孢杆菌sbz-106发酵菌液10ml离心去上清液，枯草芽孢杆菌菌体低温冷冻干燥后按比例依次加入黄原胶2-16mg、羧甲基纤维素钠8-15mg和碳酸钙10-12mg充分搅拌混合均匀，然后依次加入抗坏血酸10-12mg和硅藻土补充至1000mg，边加入边搅拌均匀，于粉碎机中充分粉碎，使枯草芽孢杆菌sbz-106可湿性粉剂的粒径为44～74μm即得。

一种枯草芽孢杆菌在制备治疗或预防核盘菌制剂药物中的应用，其步骤是：

将枯草芽孢杆菌按照4.8×10⁸cfu/m²试验田（或2.4×10⁸cfu/m²试验田或1.2×10⁸cfu/m²试验田）喷在油菜株冠(花、枝条)上。在油菜叶片和茎干上人工接种核盘菌后每隔一周测一次菌核病发病情况及其病级。实验结果证实，经枯草芽孢杆菌sbz-106处理的油菜植株发病指数都比对照的低，本发明制备的枯草芽孢杆菌sbz-106可湿性粉剂的防效与速克灵没有显著差异，各个处理油菜产量与对照相比均有显著增加。田间实验结果表明本发明制备的枯草芽孢杆菌sbz-106可湿性粉剂对油菜菌核病具有较好的防治作用，该制剂具有良好的生防价值，可以对其进行进一步地开发与应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明筛选出的枯草芽孢杆菌sbz-106对核盘菌的平板拮抗实验平均抑菌宽度达2.7cm，平均抑菌率为80%以上，为一株强拮抗活性的菌株。

2.本发明对作物菌核病高效，对人畜无毒；成本低；适合多种菌核病的防治。

3.本发明利用枯草芽孢杆菌sbz-106所制得的制剂生产中没有用到有机溶剂，降低了生产过程中和产品中的污染，也不会产生溶剂中毒，生产及使用均十分简单，具有生物农药对人畜安全的优点。

附图说明

图1为一种枯草芽孢杆菌sbz-106与核盘菌对峙培养后的菌丝形态示意图。

左:对照组右:对峙培养后的菌丝。

图2为一种枯草芽孢杆菌sbz-106与核盘菌平板对峙实验示意图。

左：对峙培养菌落形态；右：对照组。

图3为一种枯草芽孢杆菌sbz-106离体油菜叶片下对核盘菌菌丝侵染的抑制作用示意图。

图4为一种枯草芽孢杆菌SZ-106可湿性粉剂。

图5A为一种枯草芽孢杆菌SZ-106挥发性物质对核盘菌菌丝生长的抑制作用。

左:对照;右:sbz-106处理。

图5B为一种枯草芽孢杆菌SZ-106挥发性物质对核盘菌菌核萌发的抑制作用。

左:对照;右:sbz-106处理。

具体实施方式

实施例1：

枯草芽孢杆菌sbz-106的分离与鉴定：

枯草芽孢杆菌sbz-106分离与鉴定：申请人于2008年3月至5月从中国湖北省随洲采集健康的油菜植株上分离、筛选得到一株对核盘菌具有强防治效果的枯草芽孢杆菌菌株，申请人将其命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）sbz-106。本发明的枯草芽孢杆菌sbz-106分离和筛选采用稀释平板方法和平板拮抗的方法，菌种鉴定工作参照植物病理研究方法（方中达，1998），微生物学实验（赵斌和何绍江，2006）等书中的实验方法。将sbz-106菌株于28℃180r/min培养24h，取1μl作为模板，对16S rDNA片段进行PCR扩增。引物设计和扩增条件参照细菌16S rDNA的通用引物和标准方法（见：Weisburg et al.,1991），所述的引物DNA序列如下：

正向引物：5′AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG3′

反向引物：5′ACG GTT ACC TTG TTA CGA CTT3′

该菌株已于2013年4月8日送交中国典型培养物保藏中心（英文简称CCTCC），分类命名：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）sbz106，CCTCC NO：M2013127，地址：中国武汉武汉大学。

实施例2：

枯草芽孢杆菌sbz-106与核盘菌平板拮抗实验和离体叶片测定：

（1）枯草芽孢杆菌sbz-106与核盘菌平板拮抗实验：

将枯草芽孢杆菌sbz-106菌株在PDA平板中央划线，用内径为5mm的打孔器打取活化好的核盘菌接在待测菌株的两侧，间距为4cm，以PDA平板中央划线无菌水两边接核盘菌作为对照，重复3次。待核盘菌长满整个平板后观察其拮抗作用的大小，显微镜下观察其菌丝形态。试验结果为图1和图2，枯草芽孢杆菌sbz-106对核盘菌有明显的抑制作用，核盘菌的菌丝发生溃解（图1）。

（2）离体叶片测定：

将枯草芽孢杆菌sbz-106接种于已灭好菌的LB中（每瓶100ml），摇菌48h，直至菌浓度为10⁸/ml，真菌接直径为5mm的菌块。将田间采集的新鲜油菜叶片在流动的自来水中冲洗干净，自然凉干后将其浸入发酵液（加一滴土温）约5～10s，以喷无菌水作为对照，每个处理设10次重复。处理24h后，在每个叶片的相同位置处接培养2～3d后的核盘菌尖端菌丝块，菌块大小为5mm。瓷盘内保持一定的湿度，盖上胶纸膜后置于20℃恒温光照培养箱中，每24h观察发病情况，并测量其病斑大小。实验结果如图3所示，离体叶片条件下抑制作用同样表现出较强的拮抗活性。

平板拮抗实验平均抑菌宽度达2.7cm，平均抑菌率为80%以上，为一株强拮抗活性的菌株。

(3)枯草芽孢杆菌sbz106挥发性物质对核盘菌菌丝生长和菌核萌发的抑制活性测定

①挥发性物质对核盘菌菌丝生长的抑制作用（双皿对扣法）：

在培养皿底倾倒LB培养基，凝固后涂布100μL浓度为1×10⁸的sbz-106菌悬液。顶盖倾倒PDA培养基，凝固后在培养皿中央接种核盘菌菌丝块（Φ=9mm）。用封口膜密封。对照不接种菌株sbz-106。先将培养皿于28℃培养24h使细菌迅速长满全皿，然后再将培养皿置于22℃培养，连续观察并计算抑菌率。试验设置10次重复。

抑制率（%）=（对照菌落直径－处理的菌落直径）/对照菌落直径×100%

②挥发性物质对核盘菌菌核萌发的抑菌作用（双皿对扣法）：

选取大小一致的菌核（平均直径为500～600mm），表面杀菌、洗净、晾干备用。在培养皿底倾倒LB培养基，凝固后涂布100μL浓度为1×108的枯草芽孢杆菌sbz-106菌悬液。顶盖倾倒PDA培养基，冷却后将菌核放在PDA平板上，每个平板上放3个菌核，用封口膜封好。对照不接种sbz-106。先将培养皿于28℃培养24h使细菌迅速长满全皿，然后再将培养皿置于22℃培养，连续观察并计算抑制率。试验设置10次重复。

抑制率（%）=（对照菌核的萌发个数－处理的菌核萌发个数）/对照菌核萌发个数×100%

结果测定：未经枯草芽孢杆菌sbz-106处理的对照核盘菌菌丝长满全皿时，计算其对核盘菌的抑制率为84%，此后经K-106处理的核盘菌菌丝未生长，抑制率为100%。（图5A）。72h后，未经枯草芽孢杆菌sbz-106处理的对照核盘菌菌核全部萌发，而经sbz-106处理的菌核全部未萌发，由此推断sbz-106的挥发性物质可以完全抑制核盘菌菌核的萌发（图5B）。

实施例3～9：一种枯草芽孢杆菌sbz-106可湿性粉剂，每1000mg粉剂含有：

所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌sbz-106，CCTCC NO：M2013127；

所述的黄原胶为淄博中轩生物制品公司生产；

所述的羧甲基纤维素钠800～1200为国药集团化学试剂有限公司生产；

所述的碳酸钙为国药集团化学试剂有限公司生产；

所述的抗坏血酸为国药集团化学试剂有限公司生产；

所述的硅藻土为上海市奉贤奉城试剂厂生产。

一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，其步骤是：将菌浓度为10⁸/ml枯草芽孢杆菌sbz-106发酵菌液10ml离心去上清液，枯草芽孢杆菌菌体低温冷冻干燥与按上述比例依次加入黄原胶、羧甲基纤维素钠和碳酸钙充分搅拌混合均匀，然后依次加入抗坏血酸和硅藻土，边加入边搅拌均匀，于粉碎机中充分粉碎，使枯草芽孢杆菌sbz-106可湿性粉剂的粒径为44～74μm即可。制得的可湿性粉剂见图4，枯草芽孢杆菌含量为10⁹CFU/g。

实施例9：

枯草芽孢杆菌sbz-106可湿性粉剂在防治油菜菌核病药物中的（田间试验）用途：

2012年春季的田间试验安排在华中农业大学试验农场进行，油菜长势均匀一致。本实施例所用的为实施例3制备的枯草芽孢杆菌sbz-106可湿性粉剂。油菜长势均匀一致。试验设5个处理：(1)枯草芽孢杆菌sbz-106 4.8×10⁸cfu/m²；(2)枯草芽孢杆菌sbz-106 2.4×10⁸cfu/m²；(3)枯草芽孢杆菌sbz-106 1.2×10⁸cfu/m²；(4)速克灵0.1g/m²；(5)对照喷清水。每一处理设3个小区，小区面积为10m²，各处理小区按完全随机区组排列。用手动喷雾器于3月26日将各处理药剂或水均匀喷在油菜株冠(花、枝条)上。

在油菜叶片和茎干上人工接种核盘菌后每隔一周测一次菌核病发病情况及其病级。将油菜菌核病病级分为5级(0，1，2，3，4)，各病级发病情况如下：0级：油菜植株没有发生菌核病。1级：油菜植株1/3以下分枝数发生菌核病或主茎病斑长度不超过3cm。2级：油菜植株1/3-2/3的分枝发生菌核病或发病分枝数在1/3以下，但主茎病斑超过3cm。3级：油菜植株2/3以上分枝数发病或发病分枝数在2/3以下及主茎中下部病斑超过3cm。4级：油菜植株2/3的分枝发生菌核病或主茎的病斑长度超过10cm。根据病级、发病植株数和调查的植株总数计算各小区的发病率、病情指数和相对防效。结果如下：

表1本发明的枯草芽孢杆菌sbz-106可湿性粉剂对油菜菌核病的防治效果

由表1可知，本发明枯草芽孢杆菌sbz-106可湿性粉剂处理的油菜植株发病指数都比对照的低，本发明制备的枯草芽孢杆菌sbz-106可湿性粉剂的防效与速克灵没有显著差异，各个处理油菜产量与对照相比均有显著增加。田间实验结果表明本发明制备的枯草芽孢杆菌sbz-106可湿性粉剂对油菜菌核病具有较好的防治作用，该制剂具有良好的生防价值，可以对其进行进一步地开发与应用。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本发明书内容不应理解为对本发明的限制。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种生防菌枯草芽孢杆菌sbz-106和可湿性粉剂及应用

<130> 一种生防菌枯草芽孢杆菌sbz-106和可湿性粉剂及应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1041

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 1

ataaaggtta cctcaccgac ttcgggtgtt acaaactctc gtggtgtgac gggcggtgtg 60

tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc atgctgatcc gcgattacta gcgattccag 120

cttcacgcag tcgagttgca gactgcgatc cgaactgaga acagatttgt gggattggct 180

taacctcgcg gtttcgctgc cctttgttct gtccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc 240

ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca ccggcagtca 300

ccttagagtg cccaactgaa tgctggcaac taagatcaag ggttgcgctc gttgcgggac 360

ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg caccacctgt cactctgccc 420

ccgaagggga cgtcctatct ctaggattgt cagaggatgt caagacctgg taaggttctt 480

cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt 540

tgagtttcag tcttgcgacc gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt agctgcagca 600

ctaaggggcg gaaaccccct aacacttagc actcatcgtt tacggcgtgg actaccaagg 660

gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt cgctcctcag cgtcagttac agaccagaga 720

gtcgcctgcg ccactggcgt tgctccacat ctctacgcat ttcaccgcta cacgtggaat 780

tccactctcc tcttctgcac tcaagttccc cagtttccaa tgacccctcc ccggatgagc 840

cggggacttt cacatcagac atgaagaaac cgcctgcgag cccttacgcc caacaattcc 900

ggaaaacgct tgccaactac gtattaccgc ggctgctggc acgcagttag cagtgccttt 960

ctggttaggt acccgtcaag tgcgacgcta ttttgaacgg ccacttgtct tccctaccac 1020

agagcttacg ttgcgaaaga c 1041

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)sbz106，CCTCC NO：M2013127。

2.一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，每1000mg粉剂含有：

枯草芽孢杆菌sbz-106 1×10⁹cfu；

黄原胶 2-16mg；

羧甲基纤维素钠 8-64mg；

碳酸钙 10-20mg；

抗坏血酸 10-20mg；

硅藻土补充至 1000mg。

3.根据权利要求2所述的一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，每1000mg粉剂含有：

枯草芽孢杆菌sbz-106 1×10⁹cfu；

黄原胶 2-10mg；

羧甲基纤维素钠 8-30mg；

碳酸钙 15-20mg；

抗坏血酸 10-15mg；

硅藻土补充至 1000mg。

4.根据权利要求2所述的一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，每1000mg粉剂含有：

枯草芽孢杆菌sbz-106 1×10⁹cfu；

黄原胶 2-5mg；

羧甲基纤维素钠 8-15mg；

碳酸钙 15-20mg；

抗坏血酸 10-12mg；

硅藻土补充至 1000mg。

5.根据权利要求2所述的一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，每1000mg粉剂含有：

枯草芽孢杆菌sbz-106 1×10⁹cfu；

黄原胶 2mg；

羧甲基纤维素钠 8mg；

碳酸钙 20mg；

抗坏血酸 10mg；

硅藻土补充至 1000mg。

6.权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌在制备治疗或预防油菜核盘菌病药物中的应用。