DE3225649A1

DE3225649A1 - Fermentationsverfahren zur herstellung von insbesondere 9-hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd

Info

Publication number: DE3225649A1
Application number: DE19823225649
Authority: DE
Inventors: John Costain Knight; Merle Gene Kalamazoo Mich. Wovcha
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1981-07-24
Filing date: 1982-07-09
Publication date: 1983-02-17
Also published as: FR2510138A1; HU186868B; IE53354B1; US4425429A; DD206393A5; JPS5856693A; GB2102429A; IT8248847A0; NL8202849A; CH656390A5; IT1158019B; GB2102429B; IE821783L

Description

THE UPJOHN COMPANY,
Kalamazoo, Mich., USA

European Patent Attorneys
Zugelassene Vertreter vor dem Europäischen Patentamt

Dr phil. G. Henkel, München Dipl.-Ing. J Pfenning, Berlin
Dr. rer nat. L Feiler. München Dipl.-Ing.'W- Hänzel, München Dipl.-Phys. K. H. Meinig. Berlin Dr. Ing. A Butenschon. Berlin

Möhlstraße 37 D-8000 München 80

Tel.: 089/982085-87 Telex: 0529802 hnkld Telegramme: ellipsoid

TUC

Dr.

6. Juli

3883 F/ab

1982

Fermentationsverfahren zur Herstellung
von insbesondere 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd

Aus der US-PS 4 029 549 ist die Verwendung von Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 zur Herstellung von 9-Hydroxy-3-oxo-4-pregnen-20-carbonsäure [9-Hydroxybisnoracid] bekannt. Dieselbe Mutante dient gemäß der US-PS 4 035 236 zur Herstellung von 9-Hydroxy-4-androsten-3»17-dion [9-Hydroxyandrostendion] bzw. gemäß der US-PS 4 214 051 zur Herstellung von 9-Hydroxy-3-oxq-4-pregnen-20-carb'onsäuremethylester [9-Hydroxybisnoracidmethylester].

Aus der EP-Patentanmeldung 79104372.2 ist ein zweistufiges Fermentationsverfahren zur Herstellung der als Zwischenprodukt bei der Synthese wertvoller Corticoide brauchbaren 9-Hydroxy-3-Oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure bekannt. Bei dem bekannten Verfahren er- _λ folgt zunächst eine Umwandlung von Sterinen in 3-0xo-4,17(20)-pregnadien-20-oarbonsäure durch Fermentation mit dem Mycobacterium S^amm NRRL B-8054. Danach wird diese Verbindung durch Inkubation in irgendeinem zur Einführung einer Hydroxylgruppe in 9oc-Stellung befähigten Mikroorganismus in 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure überführt.

Gegenstand der Erfindung ist demgegenüber ein Fermenta-

tionsverfahren zur Herstellung des neuen wertvollen Zwischenprodukts 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd der Formel

(I)

Dieses Verfahren wird mit Hilfe einer Mutante von Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 durchgeführt.

Andererseits läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch mit Hilfe neuer Doppelirutanten der in der US-PS ' 4 029 549 genannten Mikroorganismen-Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces durchführen. Von den Mikroorganismen dieser Gattungen ist bekannt, daß sie Sterine abbauen. Die wilden Stämme dieser Arten bauen Sterine nicht selektiv zu ein geringes Molekulargewicht aufweisenden Verbindungen, beispielsweise CO₂ + H₂O ab. Diese wilden Stämme lassen sich gemäß Beispiel 1 der US-PS 4 029 549 in Mutanten, z.B. Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119, überführen.

Die gemäß Beispiel 1 der US-PS 4 029 549 hergestellten Mutanten der genannten Arten lassen sich dann in der im folgenden geschilderten Weise zu Doppelmutanten mutieren. Letztere Mutanten, beispielsweise M.fortuitum

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NRRL B-12433t eignen sich dann zur Durchführung des erfindungsgemäßen Fermentationsverfahrens zur Herstellung von 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd der Formel I.

Mutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten und zur Ansammlung von 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd der Formel I als Hauptprodukt in der Fermentationsbrühe auszeichnen, erhält man durch Mutation von Mikroorganismen der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces.

Im folgenden wird anhand eines Beispiels die Herstellung einer im Rahmen des erfindungsgemäßen Fermentationsverfahrens einsetzbaren neuen Mutante näher erläutert. Bei dieser Mutante handelt es sich um

M. fortuitum NRRL B-12433. Ähnliche Mutanten von anderen Mycobacterium-Arten und anderen Mikroorganismen-Gattungen (vgl. oben) erhält man in analoger Weise.

Herstellung einer Mutante, die als Hauptprodukt eines Sterinabbaus 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd bildet.

Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 wird in einem Medium aus (pro Liter) 8 g Nährbrühe, 1 g Hefeextrakt, 5g Glycerin, 0,1 % (wA) Tween 80 und destilliertem Wasser bei einer Tempere tür von 31⁰C wachsen gelassen. Das Medium wird durch 20-minütiges Erhitzen in einem Autoklaven unter einem Druck von 103 kPa sterilisiert. Die Zellen werden bis zu einer Dichte von etwa

5 x 10 /ml wachsen gelassen und dann auf einem sterilen

0,2 μΐη-Filter gesammelt. Nachdem die Zellen mit einem gleichen Volumen eines sterilen 0,1 M Natriumcitrat-Puffers eines pH-Werts von 5,6 mit 0,1 % Tween 80 gewaschen und dann in dem halben Volumen desselben Puffers resuspendiert wurden, wird N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin in einer Konzentration von 100 μg/ml zugesetzt, worauf die Zellensuspension 1 h bei 31⁰C inkubiert wird. Nun werden die Zellen mit 2 Volumina eines sterilen 0,1 M Kaliumphosphat-Puffers eines pH-Werts von 7 mit 0,1 % Twe an 80 gewaschen und dann in 1 Volumen desselben Puffers resuspendiert.

Ferner wird ein Medium aus (pro Liter) 8 g Nährbrühe, 5 g NaCl und 5 g Glycerin und destilliertem Wasser zubereitet. Nach Zugabe von Agar in einer Menge von 15 g/l wird das Medium 20 min lang unter einem Druck von 103 kPa einer Autoklavenbehandlung unterworfen und dann in sterile Petrischalen gegossen* Danach werden die mutierten Zellen auf dem geschilderten Medium gezüchtet. Die auf den Platten gewachsenen Kolonien werden danach im Rahmen von Versuchsfermentationen auf ihre Fähigkeit zur Umwandlung von Sterinen in 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd getestet. Der Nachweis der gewünschten Verbindung erfolgt durch Dünn-Schichtchromatographie von Methylenchloridextrakten der Versuchsfermentationen unter Verwendung von Silikagel und Methylenchlorid/Aceton/Essigsäure (212/38/1) als Lösungsmittelsystem. Auf diese Weise läßt sich die

9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd als Hauptprodukt der biologischen Umwandlung von Sterinen anhäufende Mutante NRRL B-12433 isolieren.

Der Schlüssel für die Isolierung einer Mutante entsprechend der beschriebenen Mutante ist, daß man mit einer

Mutante, z.B. NRRL B-8119i die hinsichtlich des Steroidringabbaus bereits derart blockiert ist, daß sie 9α-Hydroxyandrostendion liefert, beginnt und diesen Mikroorganismus einer zweiten Mutation, die dann einen Einfluß auf den Sterinseitenkettenabbau besitzt, unterwirft.

Die die geschilderte biologische Umwandlung herbeiführende Mutante unterscheidet sich von ihrer Mutterkultur, beispielsweise Mycobacterium fortuitum NFlRL B-8119, lediglich in ihrer Wirkung auf Steroidmoleküle. In sämtlichen sonstigen Eigenschaften, z.B. der Morphologie und der Chemikalienempfindlichkeit, entspricht sie der Mutterkultur, wenn sie mit dieser nicht sogar identisch ist. Beide M.fortuitum-Kultüren sind säurefeste, nichtbewegliche, nicht-sporenbildende Bazillen, die zur Familie Mycobacteriaceae der Ordnung Actinomycetales gehören. Nach der Klassifizierung von Runyon (vgl. R.H. Runyon in "Med.Clin. North America", Band 43, Seite 273 (1959)) handelt es sich um ein nicht-chromogenes Mycobacterium der Gruppe IV, d.h. um ein bei niedriger Temperatur unter Bildung nicht-pigmentierter Kolonien auf relativ einfachem Medium wachsendes MycobaGterium.

M. fortuitum NRRL B-8119 und NRRL B-12433 sind in der -Dauersammlung von Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, hinterlegt und auf Anfrage von dieser Hinterlegungsstelle erhältlich.

9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd der Formel I eignet sich als Zwischenprodukt bei der Herstellung wertvoller Corticoide. So kann er beispielsweise zu der entsprechenden Säure 9-Hydroxy-3-

oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure oxidiert und diese dann gemäß den Lehren der EP-Patentanmeldung 79104372.2 in Hydrocortisonjcetat Überführt werden,

Die folgenden Beispiele sollen das Fermentationsverfahren gemäß der Erfindung näher erläutern. Sofern nicht anders angegeben, bedeuten sämtliche Angaben "#" - "Gew.-96". Sämtliche Verhältnisse bei Lösungsmittelgemischen stellen, soweit nicht anders angegeben, "Volumenverhältnisse" dar.

Beispiel

Fermentation von rohem Sitosterin.

Das biologische Umwandlungsmedium bzw. Biotransformationsmedium enthält (pro Liter) 8,0 g Ucon, 5,0 g Cereiose, 3,0 g NH4CI, 3,0 g CaCO₃, 3,0 g Na₅(Citrat)»2H₂0, 2,0 g Tween 80, 1,0 g Sojamehl, 0,5 g KH₂PO^, 0,5 g Harnstoff und 30,0 g rohes Sitosterin in Leitungswasser. Der pH-Wert des Mediums ist auf 7,0 eingestellt. Mit jeweils 100 ml dieses Mediums gefüllte Kolben werden mit 10 ml Saatkulturen von bei 28⁰C in einem Medium aus (pro Liter) 8,0 g Nährbrühe, 5,0 g Glycerin, 1,0g Hefeextrakt und 1,0g Tween 80 in destilliertem Wasser (pH-Wert: 7,0) gezüchtetem M.fortuitum NRRL B-12433 beimpft. Danach werden die Kulturen 336 h lang bei einer Temperatur von 28°C auf einem Drehrüttler inkubiert. Nach der Inkubation wird entsprechend Beispiel 3 das Gemisch extrahiert und das Produkt isoliert.

Beispiel 2

Entsprechend Beispiel 1 werden anstelle von Sitosterin andere Sterinsubstrate in roher oder reiner Form, z.B. Sitosterin und/oder Cholesterin und/oder Stigmasterin und/oder Campesterin verwendet.

Beispiel

Isolierung von 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd aus der M. fortuitum NRRL B-12433-Fermentation.

1200 ml Fermentationsbrühe aus der mit Hilfe von M.fortuitum NRRL B-12433 durchgeführten biologischen Sitosterinumwandlung werden angesäuert und zweimal mit gleichen Volumina Methylenchlorid extrahiert, wobei 29,2 g bzw. 8,9 g Rohextrakt erhalten werden.

Der erste Extrakt wird" erneut in Methylenchlorid ge-2Q löst, worauf die Lösung zur Entfernung saurer Bestandteile mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung gewaschen wird. Bei Entfernung des Lösungsmittels fallen die restlichen neutralen Komponenten in Form eines braunen Öls (18,6 g) an. Bei dünnschichtchromatographischen und flüssigkeitschromatographischen Untersuchungen erscheinen drei Haupt-UV-Absorptionszonen. Die am wenigsten polare Zone enthält ein Gemisch aus den Methylestern der Formeln

30 CH₃_ ^COOCH

und

A*

J*

wobei der Ester der Formel B überwiegt. Die am stärksten polare Zone entspricht der S<,22-Dlhydroxyverbindung der Formel

CH₂OH

Die Verbindung mittlerer Polarität wird gemäß folgendem Verfahren als 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd der Formel I identifiziert: Aus einem Vorchromatogramm auf einer kurzen Silikasäule erhält man bei Verwendung von 30 % Ethylacetat enthaltendem Methylenchlorid (als Eluiermittel) eine Fraktion, in der der Aldehyd der Formel I angereichert ist. 3,3 g dieser Fraktion werden sorgfältig auf drei in Reihe angeordneten, vorgepackten Lobar-Silikagelsäulen (Größe B, E.Merck & Co.) rechromatographiert, wobei als Eluiermittel Methylenchlorid mit 20 % Ethylacetat verwendet wird. Aus Ethylacetat/Methylenchlorid erhält man schließlich 1,05 g Aldehyd der Formel I in Form eines farblosen und nadeiförmig kristallisieren-.den Feststoffs eines Fp von 194 - 212⁰C und einer optischen Drehung [a]_D von +96° [c, 1.024; CHCl,].

Eine Elementaranalyse der Verbindung ^C22^H30°3 ^erS^ib'^t folgende Werte:

C H

Berechnet: 77,16 % 8,83 % Gefunden: 77,53 % 8,71 % 35

ΊΖ J*

ι Das Massenspektrum zeigt ein Molekülion bei m/e 342 (Grundpeak) und Hauptfragmentionen bei 324, 309, 295, 191, 136 und 124.

H-Kernresonanz-Spektrum: 1.02 (18-CH,); 1.36 (19-CH,);

1.82 (21-CH₃); 5.88 (4-H); 10.04 (CHO) ppm.

IR-Spektrum: 3497, 3440 cm"¹ (-0H); 1663 cm (α,β-ungesättigter Carbonylrest);

1622, 1617 cm"¹ (C»C).

UV-Spektrum: \_ma'. 250 nmj (£ « 27 900 in Methanol).

niet JC

Beispiel 4

Beim Ersatz von Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 im Rahmen des beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von

M. fortuitum NRRL B-12433 durch einen sterinabbauenden 20

Mikroorganismus der Gattungen Arthrobacter, Bacillus,

Brevibacterium, Corynebacterlum, Nocardia, Protaminobacter, Serratia oder Streptomyces erhält man Mikroorganismus-Mutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit C-17-Sei-25

tenkette und zur Ansammlung von 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd als Hauptprodukt (der Fermentation) auszeichnen.

Beispiel

Ersetzt man in Beispiel 1 M.fortuitum NRRL B-12433 durch gemäß Beispiel 4 hergestellte Mutanten, erhält

man ebenfalls den 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-35

20-carboxaldehyd der Formel I.

Claims

PATENTANSPRÜCHE

1.J Fermentationsverfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel:

CH₃. CHO

(I)

dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacterium fortuitum NRRL B-12433 unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium in Gegenwart eines Steroids mit C-17-Seitenkette züchtet und das gewünschte Produkt gewinnt.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin und/oder Campesterin verwendet.

Fermentationsverfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mutante der Mikroorganismen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und/oder Streptomyces, die sich durch ihre Fähigkeit

zum selektiven Abbau von Steroiden mit einer C-17-Seltenkette und zur Anhäufung von 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd als Hauptprodukt in der Fermentationsbrühe auszeichnet, unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit einer C-17-Seitenkette in einem wäßrigen Nährmedium züchtet.

4. Verfahren nach Anspruch 31 dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin und/oder Campesterin verwendet.

5. Fermentationsverfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mycobacterium-Mutante, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit einer C-17-Seitenkette und zur Anhäufung von 9-Hydroxy-3-0X0-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd als Hauptprodukt in der Fermentationsbrühe auszeichnet, unter aeroben Bedingungen in Anwesenheit eines Steroids mit einer C-17-Seitenkette in einem wäßrigen Nährmedium züchtet und das gewünschte Produkt gewinnt.

6. Verfahren nach Anspruch 5> dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, . Stigmasterin und/oder Campesterin verwendet.

7. Verbindung der Formel:
30