PL109912B1

PL109912B1 - Method of producing 9 alpha-hydroxyandrostendione

Info

Publication number: PL109912B1
Application number: PL1976193220A
Authority: PL
Priority date: 1975-10-24
Filing date: 1976-10-23
Publication date: 1980-06-30
Also published as: DE2647895A1; IL50747A; IE44668L; FR2328718A1; IE44668B1; JPS55148085A; NL7611711A; NL172763C; JPS55148099A; IL50747A0; GB1530730A; FR2328718B1; DE2647895C3; JPS5254093A; NL172763B; JPS5642919B2; DE2647895B2; JPS6029470B2; MX4502E; CH624143A5

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia 9 a-hydroksyandrostendionu o wzorze przed¬ stawionym na rysunku na drodze mikrobiologicz- •ne3- 5 Przeksztalcanie steroidów przez drobnoustroje badane bylo w szerokim zakresie i zostalo do¬ kladnie udokumentowane. Najwczesniejsza praca zostala opublikowana przez Mamoli i Vercellone w 1937 r. Ber. 70, 470 i Ber. 70, 2079. Stwierdzi¬ li oni redukcje 17-ketosteroidów do 17 0-hydro- 10 ksysteroidów pod wplywem fermentujacych droz¬ dzy. Pózniej Peterson i Murray wykazali hydro- ksylacje progesteronu w pozycji 11 przez grzyby Rhizopus nigricans; patrz opis patentowy St.Zjed¬ noczonych Ameryki nr 2 602 769 (1952). Równiez 15 Kraychy i inni w opisie patentowym St. Zjedn.Amer. nr 3 684 657 (1972) opisali wybiórcza degra¬ dacje na drodze mikrobiologicznej zwiazków ste- roidowych o alkilowym lancuchu w pozycji 17, przez poddanie steroidu zawierajacego przynaj- 20 mniej 8 atomów wegla w alkilowym lancuchu bo¬ cznym wystepujacym w pozycji 17, fermentacji z Mycobacterium sp. NRRL B-3683, prowadzacej do otrzymania androsteno-4-dionu-3,17-, androsta- dieno-l,4-dionu-3,17 i 20 a-hydroksymetylopregna- dien-l,4-onu-3. W najnowszym opisie, Marsheck i inni w opisie patentowym St. Zjedn. Amer. nr 3 759 791 (1973), podaja sposób wybiórczego otrzy¬ mywania na drodze mikrobiologicznej androsten- -4-dionu-3,17, przez poddanie steroidu z grupy 25 30 cholestanu lub stigmostanu zawierajacego przy¬ najmniej 8 atomów wegla w alkilowym lancuchu bocznym wystepujacym w pozycji T7, fermenta¬ cji z Mycobacterium sp. NRRL B-3805.Postepem sposobu wedlug wynalazku w stosun¬ ku do metod znanych omówionych powyzej jest fakt, ze otrzymuje sie tu „produkt koncowy", któ¬ ry tylko izoluje sie ze srodowiska transformacji.Natomiast zwiazki wytwarzane metodami opisa¬ nymi w stanie techniki otrzymuje sie jedynie w sladowych ilosciach jako produkty posrednie lecz nie jako produkt koncowy.W sposobie wedlug wynalazku stosuje sie mu¬ tanty charakteryzujace sie zdolnoscia selektywnej degradacji steroidów z alkilowym lancuchem bo¬ cznym w pozycji 17, zawierajacym od 2 do 10 ato¬ mów wegla wlacznie, i nagromadzania w plynie hodowlanym 9 a-hydroksyandrostendienu o wzo¬ rze przedstawionym na rysunku, okreslonego dalej jako 9 a-OH AD. Mutanty te otrzymuje sie .spo¬ sobem opisanym ponizej badz przy pomocy innych metod mutacji z drobnoustrojów nastepujacych rodzajów: Arthrobacter, Bacillus, Bravibacterium, Corynobacterium, Microbacterium, Mycobacte¬ rium, Nocardis, Protaminobacter, Serratia i Strep- tomyces. Do szczególnie przydatnych nalezy ro¬ dzaj Mycobacterium. Na przyklad, gatunki nale¬ zace do tego rodzaju to, M, phlei, M. smogmatis, M. rhodochrous, M. mucosam, M. fortuitum i M. butyricum. Przykladowo, szczególnie podkresla sie 109912109912 3 nowy mutant Mycobacterium fortuitum, NRRL B-8119, który stosowany jest do wybiórczej degra¬ dacji steroidów z alkilowym lancuchem w pozy¬ cji 17 o 2 do 10 atomach wegla wlacznie, do 9 a-hydroksyandrostendionu, dalej okreslanego ja¬ ko 9 a—OH AD. Przyklady uzytecznych substra- tów steroidowych to sitosterole, cholesterol, stig- masteirod, kamipeisterol i ione steroidy zawierajace w pozycji 17 alkilowe lancuchy boczne o 2 do 10 atomów wegla wlacznie. Substraty sterydowe sto¬ sowane sa w postaci oczyszczonej lub jako pro¬ dukty surowe.Mutanty charakteryzujace sie zdolnoscia do wy¬ biórczej degradacji steroidów zawierajacych w po¬ zycji 17 alkilowy lancuch o 2 do 10 atomów we¬ gla wlacznie i nagromadzania 9 a—OH AD w plTnj^Y^?^la^^m;, Jizyskuje sie przez poddanie mdtacjf' drobnoustrojów nalezacych do nastepu¬ jacych rodzajów: Arthrobacter, Bacillus, Brovi- balte^ium^^Córynobacterium, Microbacterium, My- cottactermm,_Nbc^rdi§, Protaminobacter, Serratis i Streptomyces. Mycoibaoterium fortuitum, ATCC 6842, jak podano powyzej, poddaje sie mutacji w celu uzyskania nowego laboratoryjnego mutanta.Katalog ATCC z 1974 r. podaje nastepujaca cha¬ rakterystyke w wykazie przy ATCC 6842: „J. C.Cruz 2. Ropien z przeziebienia. Acta. Med. Rio de Janeiro 1 : 1 (1936). Sredni 90 37C". M. fortu¬ itum ATCC 6842, rozklada w sposób nieselektyw- ny sterole do zwiazków niskoczasteczkowych np.C02+H20. Dlatego drobnoustrój ten nie nadaje sie do wybiórczej degradacji steroidów.Mutacja szczepu M.. fortuitum ATCC 6842, przy uzyciu nitrozoguanidyny, prowadzi do otrzymania nowego mutanta, który wybiórczo degraduje ste¬ roidy zawierajace w pozycji 17 alkilowe lancuchy o 2 do 10 atomów wegla wlacznie, do 9 a—OH AD.Mutant ze szczepu M. fortuitum otrzymal numer katalogowy NRRL B-8119, w Northern Regional Research Laboratory, U.S., Wydzial Rolniczy, Peo- ria, Illinois, USA, gdzie zostal zdeponowany w stalej kolekcji.Wlasciwosci morfologiczne i wrazliwosc na róz¬ ne czynniki M. fortuitum NRRL B-8119, nie róz¬ nia sie od szczepu rodzimego M. fortuitum ATCC 6842. Obydwie hodowle M. fortuitum to silnie kwasowe paleczki, nie ruchliwe nie tworzace spor, nalezace do rodziny Mycobacteriaceae, rzedu Acti- nomycotales. Wedlug klasyfikacji Runyon's, Ru- nyon, E. H. 1959, Med. Clin. North Americs, 43: 273, nalezy do niechromogennej grupy IV myco¬ bacterium, np. rosnie szybko w niskich tempera¬ turach, tworzac niepigmentujace kolonie na sto¬ sunkowo prostym podlozu.M. fortuitum ATCC 6842 i M. fortuitum NRRL B-8119, daja sie latwo rozróznic pod wzgledem dzialania na czasteczke steroidu. Jak stwierdzo¬ no powyzej M. fortuitum ATCC 6842 degraduje steroidy w sposób nieselektywny, podczas gdy M. fortuitum NRRL B-8119 degraduje w sposób wy¬ biórczy. Stwierdzone jest, ze ta wlasciwosc M. fortuitum NRRL B-8119 decyduje o jego duzej uzytecznosci.Mutacje M. fortuitum ATCC 6842 do M. fortui¬ tum NRRL B-8119 przeprowadza sie z uzyciem ni¬ trozoguanidyny. Szczególy postepowania opisane sa ponizej. Chociaz ogólne metody mutacji sa zna¬ ne, to jednak w specjalnosci, która uczy lub na¬ wet sugeruje, nie znany jest typ mutacji, która 5 uzyskuje sie stosujac metode stanowiaca przed¬ miot wynalazku. Jezeli metody mutacji lub trans¬ formacji, opisane tu odnosza sie do Mycobacte¬ rium, to zrozumiale jest, ze równiez identyczne lub podobne metody mozna stosowac do drobno- 10 ustrojów z innych rodzajów anizeli opisanych w niniejszym opisie.Wybiórcza transformacje stanowiaca przedmiot wynalazku mozna przeprowadzic w rosnacej ho¬ dowli M. fortuitum NRRL B-8119 przez dodanie 15 wybranego steroidowego substratu do hodowli podczas trwajacej juz inkubacji, lub dodajac ten substrat do podloza przed szczepieniem. Steroid dodaje sie pojedynczo lub w polaczeniu z innym steroidem. Korzystne, lecz nie ograniczajace ste- 20 zenie steroidu w hodowli wynosi okolo 0,1 do okolo 100 gramów na litr. Hodowle prowadzi sie na podlozu odzywczym zawierajacym zródlo we¬ gla, na przyklad przyswajalne weglowodany, oraz zródlo azotu, na przyklad przyswajalne zwiazki 25 azotowe lub surowce bialkowe. Korzystne zródla wegla obejmuja glikozef, cukier nieoczyszczony, sa¬ charoze, glicerol, skrobie, skrobie kukurydziana, laktoze, dekstryne, melase i inne. Korzystne zró¬ dla azotu obejmuja wyciag namokowy kukury- 30 dzy, drozdze, autolizowane drozdze browarnicze z mlekiem stalym, make sojowa, make z nasion ba¬ welny, make kukurydziana, mleko stale, kazeine trawiona pankreatyna, make rybna, stala pozo¬ stalosc podestylacyjna drozdzy gorzelniczych, plyn- 35 ny pepton zwierzecy, odpadki miesne i kosci, sole amonowe i inne. Korzystnie, stosuje sie produk¬ ty cukrowe i azotowe w mieszaninie. Nie jest po- < trzebne dodawanie do podloza fermentacyjnego sladowych metali, jak na przyklad cynku, magne- 40 zu, manganu, kobaltu, zelaza i innych, poniewaz jako skladniki podloza przed jego sterylizacja sto¬ sowane sa woda wodociagowa i nieoczyszczone surowce.Proces transformacji moze trwac od okolo 72 45 godzin do 15 dni. Temperatura inkubacji podczas transformacji waha sie od 25 do 37°C, korzystnie 30°C. Zawartosc naczyn, w których zachodzi transformacja jest napowietrzana jalowym powie¬ trzem i wstrzasana w celu ulatwienia wzrostu 50 drobnoustroju a tym samym zwiekszenie efek¬ tywnosci procesu transformacji.Po zakonczeniu procesu transformacji, co stwier¬ dza sie metoda chromatografii cienkowarstwowej na plytkach pokrytych zelem krzemionkowym (E. 55 Merc, Darmstadt) w ukladzie rozpuszczalników za¬ wierajacych octan etylu-cykloheksan 2:3 (obje¬ tosciowo), pozadany po transformacji steroid wy¬ dziela sie znanymi metodami.Na przyklad, 'mieszanine pofermentacyjna (po 60 transformacji) lacznie z plynem fermentacyjnym i komórkami, ekstrahuje sie organicznym rozpu¬ szczalnikiem nie mieszajacym sie z woda w celu oddzielenia steroidów. Przydatnymi do tego celu rozpuszczalnikami sa chlorek metylenu (korzyst- 65 ny), chloroform, czterochlorek wegla, chlorek etyle-109912 6 nu, trójchloroetylen, eter, octan amylu, benzen i in¬ ne. Ewentualnie, komórki oddzielane sa od plynu fermentacyjnego w znany^ sposób, np. przez sacze¬ nie lub wirowanie i nastepnie oddzielnie ekstraho¬ wano odpowiednim rozpuszczalnikiem. Komórki 5 ekstrahuje sie. rozpuszczalnikami mieszajacymi sie badz nie mieszajacymi sie z woda. Plyn fermenta¬ cyjny po oddzieleniu komórek, ekstrahuje sie roz¬ puszczalnikami nie mieszajacymi sie z woda.Ekstrakty saczy sie przez ziemie okrzemkowa i io przesacz odparowuje sie przy zmniejszonym cisnie¬ niu do suchej pozostalosci. Uzyskana pozostalosc, zawierajaca pozadany, przeksztalcony steroid roz¬ puszcza sie nastepnie w 10*/« chloroformie w me¬ tanolu i ten roztwór zateza sie na lazni parowej w 15 atmosferze azotu az do ukazania sie krysztalów.Roztwór oziebia sie do temperatury otoczenia i saczy sie w celu usuniecia wytraconego steroi¬ du. Pozadany, przeksztalcony steroid uzyskuje sie równiez z pozostalego supermutanta po ^odparo- 20 waniu rozpuszczalnika.Pozadany produkt otrzymany w procesie trans¬ formacji stanowiacym przedmiot wynalazku jest znanym steroidowym zwiazkiem posrednim 9 a—OH AD. 9 a-hydroksy zwiazki z grupy an- drostanu sa uzytecznymi czynnikami o dzialaniu przeciwandrogenowym, przeciwestrogenowym i przeciwplodnosciowym. 9 a-hydroksy steroidy sto- stowane sa równiez w otrzymywaniu innych ste¬ roidów uzytecznych w terapii. Na przyklad, 9 a-hydroksysteroidy podstawione w pozycji 11, mozna w prosty sposób odwodnic do uzytecznych 9(ll)-dehydro steroidów, znanymi powszechnie me¬ todami, np. dzialajac chlorkiem tionylu w obec¬ nosci pirydyny. 9(ll)-dehydro zwiazki otrzymane w ten sposób sa znanymi produktami posrednimi przy otrzymywaniu wysoce aktywnych zwiazków.Na przyklad, 9 sób mozna przeksztalcic w odpowiednie 9 a-chlo- rowco- 11 p-hydroksy zwiazki metodami powsze¬ chnie znanymi, np. jak .w opisie patentowym St.Zjedn. Amer. nr 2 852 511 przy otrzymywaniu 9 a-chlorowco-hydrokortizonu.Nastepujace przyklady ilustruja proces i pro- 45 dukty stanowiace przedmiot wynalazku, nie ogra¬ niczajac jego zakresu. Wszystkie procenty podane sa wagowo i wszystkie mieszaniny rozpuszczalni¬ ków w przeliczeniu na objetosc, jezeli nie jest za¬ znaczoneinaczej. 50 Przyklad I. Otrzymywanie mutanta M. for- tuitum NRRL B-8119 z M. fortuitum ATCC 6842. a) Mutacja przy uzyciu nitrozoguanidyny.Komórki M. fortuitum ATCC 6842 hoduje sie w temperaturze 28°C na podlozu posiewpwym, ste- 55 rylnym, o nastepujacym skladzie: Bulion odzywczy (Difco) 8 g/litr Ekstrakt drozdzowy 1 g/litr Propioniansodu 0,5 g/litr Woda destylowanado 1 litra 60 pH przed sterylizacja doprowadza sie do 7,0 przy uzyciu 1 N NaOH, sterylizacje prowadzi sie w temperaturze 121°C w ciagu 20 minut.Rozwój komórek prowadzi sie do gestosci okolo 5X108 na mililitr, osadza sie je przez odwirowa- w 25 30 35 nie i nastepnie przemywa sie równa objetoscia 0,1 M, sterylnego, roztworu cytrynianu sodowego, o pH 5,6.Przemyte komórki zawiesza sie w tej samej objetosci buforu cytrynianowego, pobiera sie prób¬ ke do miareczkowania (liczba komórek) i dodaje sie nitrozoguanidyny do stezenia koncowego 50 \l g/ml.Zawiesine komórek inkubuje sie w lazni wod¬ nej, w temperaturze 37°C w ciagu 30 minut, po czym ponownie pobiera sie próbke do miareczko¬ wania, a pozostalosc odwirowuje sie, przemywa sie równa objetoscia sterylnego, 0,1 M fosforanu potasowego, o pH 7,0. W koncu komórki zawiesza sie w sterylnym, minimalnym podlozu zlozonym w soli, bez dodawania zródla wegla, o nastepuja¬ cym skladzie: NH4NO3 1,0 g/litr K2NPO4 0,25 g/litr MgS04-7H2O 0,25 g/litr NaCl 0,005 g/litr FeS04-7HjO 0,001 g/litr Woda destylowana, do objetosci 1 litra Przed sterylizacja pH doprowadza sie do 7,0 przy uzyciu 1 N HC1; sterylizuje sie w ciagu 20 minut, w temperaturze 121°C. Komórki wysiewa sie na plytki w celu przeprowadzenia selekcji. b) Selekcja i izolacja mutanta M. fortuitum NRRL B-8119.Zmutagenizowane komórki, jak opisano powy¬ zej, rozsiewa sie na plytki z podlozem o nastepu¬ jacym skladzie (zmodyfikowane wedlug tfraser i Jerrel, 1963, J. Biol. Chem. 205—291—295): Glicerol 10,0 g/litr Na2HP04 8,4 g/litr KHaP04 4,5 g/litr NH4CI 2,0 g/litr MgS04-7HjO 0,3 g/litr FeClr6H20 0,05 g/litr woda destylowana,do 1 litra . objetosci Dodaje sie nastepnie agar (15 g/litr) i podloze sterylizuje sie w autoklawie w ciagu 30 minut, w temperaturze 121°C, a nastepnie rozlewa sie do jalowych plytek Petriego.Wzrost na tym podlozu eliminuje wiekszosc mu¬ tantów pokarmowych auksotroficznych otrzyma¬ nych w wyniku mutag^nozy, np. hodowle wyma¬ gajace witamin, czynników wzrostowych i innych, których brak jest w zdefiniowanym chemicznie podlozu. Po inkubacji w ciagu okolo 7 dni, w temperaturze 28°C, wyrosnieta kolonia przenosi sie na plytki testowe metoda repliki, w celu se¬ lekcji mutantów i z powrotem na plytki kontrol¬ ne z podlozem glicerolowym.Plytki testowe przygotowuje sie wedlug Peter- sona G.E., H.L. Lewisa i J.R. Davisa; 1962, „Otrzy¬ mywanie jednorodnych zawiesin cholesterolu i in¬ nych nierozpuszczalnych w wodzie zródel wegla w podlozu agarowym. J. Lipid Research 3: 275— 276. Do plytek tych stosuje sie minimalne podlo¬ ze zlozone z soli, jak opisano w punkcie a).Przyklad I. Dodaje sie agar (15 g/litr) i od¬ powiednie zródlo wegla (1,0 g/litr) jak sitosterol lub androstendion (AD) i uzyskana zawiesine pod-9 109912 10 lowa objetosci octanu butylu w pH 4,0 i wyeks¬ trahowana brzeczke odrzuca. Zebrane ekstrakty brzeczki przemywa sie jedna czwarta objetosci 5% roztworu dwuweglanu sodowego w celu usu¬ niecia skladników kwasowych, które moga powsta- 5 wac w czasie fermentacji.Polaczone, zobojetnione ekstrakty zateza sie do okolo 2% objetosci brzeczki, oziebia i pozostawia do krystalizacji 9 sie zwyklymi metodami przez saczenie i suszenie. 10 Produkt w badanych metoda chromatografii cie¬ czowej wykazuje czystosc powyzej 95%. Z roz¬ tworu macierzystego mozna odzyskac dodatkowa ilosc 9 a—OH AD przez zatezenie i dodanie cy¬ kloheksanu, w celu zmniejszenia rozpuszczalnosci. 15 Przyklad VIII. Przez zastapienie Mycobac- terium fortuitum ATCC 6842, z przykladu I, drob¬ noustrojami z rodzajów Arthrabaciter, Bacillus Brevibacterium, Gorynebacterium, Microbacte- rium, Necardia, Protominobacterium, Serratia i 20 Streiptomyces, otrzymuje sie mutanty drobno¬ ustrojów, które charakteryzuja sie zdolnoscia wy¬ biórczego degradowania sterydów z alkilowym lancuchem bocznym w pozycji 17, zawierajacym od 2 do 10 atomów wegla wlacznie, i nagromadza- 25 nia w brzeczce fermentacyjnej 9 a—OH AD.Przyklad IX. Przez zastapienie M. fortui¬ tum NRRL B-8119 z przykladów II—VII, mutan¬ tami uzyskiwanymi sposobem wedlug przykladu VIII, otrzymuje sie 9 a—OHAD. 30 Przyklad X. Przez zastapienie M. fortuitum ATCC 6842 z przykladu I, drobnoustrojem wybra¬ nym z grupy obejmujacej Mycobacterium phlei, M. smegmatio, M. rhodechreus, M. mucesum i M. butyricum, otrzymuje sie mutanty drobnoustro- 35 jów charakteryzujace sie zdolnoscia wybiórczej degradacji steroidów z lancuchem bocznym alkilo¬ wym w pozycji 17, zawierajacym od 2 do 10 ato¬ mów wegla wlacznie, i nagromadzania w brzecz¬ ce fermentacyjnej 9 a—OHAD. 40 Przyklad XI. Przez zastapienie M. fortuitum NRRL B-8119 z przykladów II—VII, mutantami otrzymanymi jak w przykladzie I, otrzymuje sie 9 a—OH AD.Zastrzezenia patentowe * 1. Sposób wytwarzania 9 a-hydroksyandrosten- dionu o wzorze przedstawionym na rysunku, zna¬ mienny tym, ze hodowle Mycobacterium fortui¬ tum NRRL B-8119 jak równiez hodowle mutanta Mycobacterium, charakteryzujacego sie zdolnoscia do wybiórczej degradacji steroidów zawierajacych w pozycji 17 alkilowy lancuch boczny o 2 do 10 atomach wegla, i do nagromadzenia w brzeczce fermentacyjnej 9 a-hydroksyandrostendionu, pro¬ wadzi sie na plynnym podlozu odzywczym w wa¬ runkach napowietrzania i w obecnosci steroidu zawierajacego w pozycji 17 alkilowy lancuch bo¬ czny o 2 do 10 atomach wegla. v 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako steroid stosuje sie sitosterol. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jaiko steroid stosuje sie cholesteroli. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako steroid stosuje sie stigmasterol. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako steroid stosuje sie cholesterol. 6. Sposób wedlug zastrz. 1, - znamienny tym, ze jako drobnoustrój stosuje sie mutant Mycobacte¬ rium fortuitum NRRL B-8119. 7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze mutanta drobnoustroju hoduje sie na plynnym podlozu odzywczym w warunkach napowietrzania i w obecnosci mieszaniny dwóch lub wiecej ste¬ roidów, przy czym kazdy ze steroidów zawiera w pozycji 17 alkilowy lancuch boczny o 2 do 10 atomach wegla wlacznie. 8. Sposób otrzymywania 9 a-hydroksyandro¬ stendionu o wzorze przedstawionym na rysunku, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle Myco¬ bacterium fortuitum NRRL B-8119 na plynnym podlozu odzywczym w warunkach napowietrza¬ nia i w obecnosci mieszaniny dwóch lub wiecej steroidów, przy czym kazdy ze steroidów zawiera w pozycji 17 alkilowy lancuch boczny o 2 do 10 atomach wegla. 9. Sposób wedlug zastrz. 8, znamienny tym, ze mieszanine steroidów dobiera sie z grupy obej¬ mujacej sitosterol, cholesterol, stigmasterol i kam- pesterol. 10. Sposób wedlug zastrz. 8, znamienny tym, ze jako drobnoustrój stosuje sie mutant Mycobac¬ terium fortuitum NRRL B-8119.109912 Drukarnia Narodowa, Zaklad Nr 6, 863/80 Cena 45 zl PL PL

Claims

1. Zastrzezenia patentowe * 1. Sposób wytwarzania 9 a-hydroksyandrosten- dionu o wzorze przedstawionym na rysunku, zna¬ mienny tym, ze hodowle Mycobacterium fortui¬ tum NRRL B-8119 jak równiez hodowle mutanta Mycobacterium, charakteryzujacego sie zdolnoscia do wybiórczej degradacji steroidów zawierajacych w pozycji 17 alkilowy lancuch boczny o 2 do 10 atomach wegla, i do nagromadzenia w brzeczce fermentacyjnej 9 a-hydroksyandrostendionu, pro¬ wadzi sie na plynnym podlozu odzywczym w wa¬ runkach napowietrzania i w obecnosci steroidu zawierajacego w pozycji 17 alkilowy lancuch bo¬ czny o 2 do 10 atomach wegla. v

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako steroid stosuje sie sitosterol.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jaiko steroid stosuje sie cholesteroli.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako steroid stosuje sie stigmasterol.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako steroid stosuje sie cholesterol.

6. Sposób wedlug zastrz. 1, - znamienny tym, ze jako drobnoustrój stosuje sie mutant Mycobacte¬ rium fortuitum NRRL B-8119.

7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze mutanta drobnoustroju hoduje sie na plynnym podlozu odzywczym w warunkach napowietrzania i w obecnosci mieszaniny dwóch lub wiecej ste¬ roidów, przy czym kazdy ze steroidów zawiera w pozycji 17 alkilowy lancuch boczny o 2 do 10 atomach wegla wlacznie.

8. Sposób otrzymywania 9 a-hydroksyandro¬ stendionu o wzorze przedstawionym na rysunku, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle Myco¬ bacterium fortuitum NRRL B-8119 na plynnym podlozu odzywczym w warunkach napowietrza¬ nia i w obecnosci mieszaniny dwóch lub wiecej steroidów, przy czym kazdy ze steroidów zawiera w pozycji 17 alkilowy lancuch boczny o 2 do 10 atomach wegla.

9. Sposób wedlug zastrz. 8, znamienny tym, ze mieszanine steroidów dobiera sie z grupy obej¬ mujacej sitosterol, cholesterol, stigmasterol i kam- pesterol.

10. Sposób wedlug zastrz. 8, znamienny tym, ze jako drobnoustrój stosuje sie mutant Mycobac¬ terium fortuitum NRRL B-8119.109912 Drukarnia Narodowa, Zaklad Nr 6, 863/80 Cena 45 zl PL PL