DE2647895A1 - Verfahren zur herstellung von 9 alpha-hydroxyandrostendion - Google Patents

Verfahren zur herstellung von 9 alpha-hydroxyandrostendion

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Description

PA νκ ivy AN WALTE
HENKEL, KERN, FEILER& HÄNZEL
THUiRAMMh: FII.II'M)H> MOMHi=N D-SOO(I M(NCHEN 90 ..K1SfJN(K HAVK MONOIiN
HlZ -[IdMHI(JO —. I'O.SI.Si Hf < K. MtN(IIiN lilli
The Upjohn Company
Kalamazoo, Mich., V.St.A.
i'NKf κ/t.icnrN· Dr.F/rm \;ιν<ηγν. »r».
Verfahren zur Herstellung von 9a-Hydroxyandrostendion
Die Umwandlung von Steroiden durch Mikroorganismen wurde bereits recht weitgehend untersucht und in der Literatur veröffentlicht. Die früheste einschlägige Arbeit stammt offensichtlich von Mamoli und Vercellone aus dem Jahre 1937 »Berichte" 70, 470 und »Berichte" 70, 2079. AaO wird über die Reduktion von 17-Ketosteroiden zu 17ß-Hydroxysteroiden mit Hilfe von Gärhefe berichtet. Im Jahre 1952 , ^ » über
(vgl. US-PS 2 602 769) berichten Peterson und Murray Idie 11 cc-Hydroxylierung von Progesteron mit Hilfe des Pilzes Rhizopus nigricans. 1972 (vgl. US-PS 3 684 657) berichten Kraychy und Mitarbeiter über den selektiven mikrobiologischen Abbau von steroidischen 17-Alkylresten durch Vergären von Steroiden mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3683 unter Bildung von Androst-4-en-3,17-dion, Androst-1,4-dien-3;1-7-dion und 20a-Hydroxymethyl-pregna-1 f4-dien-3-on. 1973 (vgl. US-PS 3 759 791) berichten Marsheck und Mitarbeiter über die selektive mikrobiologische Darstellung von Androst-
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4-en-3,17-dion durch Vergären eines Steroids der Cholestan- oder Stigmastanreihe mit- mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3805.
Mutanten, die durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließ lich 10 Kohlenstoffatomen gekennzeichnet sind und in der Gärbrühe (fermentation beer) 9cc-Hydroxyandrostendion, im folgenden als 9oc-OH AD bezeichnet, anhäufen, erhält man nach den im folgenden näher erläuterten Mutationsmaßnahmen oder anderen Mutationsmaßnahmen aus Mikroorganismen der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces, vorzugsweise Mycobacterium. Beispiele für Arten dieser Gattungen sind M. phlei, M. smegmatis, M. rhodochrous, M. mucosum, M. fortuitum und M. butyricum.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird insbesondere ein neuer Mikroorganismusmutant, nämlich Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119, zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen zu 9oc-Hydroxyandrostendion (9a-0H AD) benutzt. Beispiele für geeignete Steroidsubstrate sind Sitosterine, Cholesterine, Stigmasterin, Campesterin und ähnliche Steroide mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen. Diese SteraLdsubstrate können entweder in reiner Form oder in Rohform zum Einsatz gelangen.
Wie bereits erwähnt, erhält man durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit -17-Alkylseitenketten
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mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen gekennzeichnete und 9<x-0H AD in der Gärbrühe ("fermentation beer) anhäufende Mutanten durch Mutation von Mikroorganismen der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces.
Für den Erfindungszweck wurde in der später beschriebenen Weise die Art Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 zu einem neuen Labormikroorganismusmutanten mutiert. Der ATCC-Katalog von 1974 erläutert neben der Auflistung von ATCC 6842 folgendes: "J.C. Cruz 2. Cold abscess. Acta Med. Rio de Janeiro 1:1 (1936). Medium 90 37C». M. Fortuitum ATCC 6842 baut Sterine nicht selektiv zu niedrigmolekularen Verbindungen, beispielsweise CO2 + HpO, ab. Somit eignet sich dieser Mikroorganismus nicht zum selektiven Steroidabbau.
Bei der Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 mittels Nitrosoguanidin erhält man einen neuen Mutanten, der selektiv Steroide mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen zu 9a-0H AD abzubauen vermag. Diesem Mikroorganismusinutanten von M. fortuitum wurde durch das Northern Regional Research Laboratory, US-Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, (der Mikroorganismusmutant wurde an diese? Hinterlegungsstelle in der Dauersammlung hinterlegt) die Nummer NRRL B-8119 zugeteilt. Eine Subkultur dieses Mikroorganismus ist auf Anfrage von dieser Hinterlegungsstelle frei erhältlich. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß die Verfügbarkeit bzw. Aushändi-
auf gung der Kultur keine Lizenz an einem etwa/die vorliegende
Patentanmeldung erteilten Patent begründet.
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Die Morphologie und die Chemikalien- bzw. Drogenempfindlichkeit von M. fortuitum NRRL B-8119 sind von den entsprechenden Eigenschaften der Ausgangsart M. fortuitum ATCC 6842 nicht zu unterscheiden. Beide M. fortuitum-Kultüren stellen säurefeste, unbewegliche, nicht-sporenbildende Bacilli aus der Familie Mycobacteriaceae der Ordnung Actinomycetales dar. Nach der Runyons-Klassifizierung (vgl. E.H. Runyon "Med. Clin. North America», 43, 273 (1959)) handelt es sich um ein nicht-chromogenes, der Gruppe IV angehörendesfoycobacterium, d.h. es wächst rasch bei niedriger Temperatur unter Bildung nicht-pigmentierter Kolonien auf relativ einfach zusammengesetzten Medien.
M. fortuitum ATCC 6842 und M. fortuitum NRRL B-8119 lassen sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Steroidmoleküle eindeutig voneinander unterscheiden. Wie bereits ausgeführt, kommt es beim Einsatz von M. fortuitum ATCC 6842 zu einem nicht-selektiven Abbau von Steroiden, bei Einsatz von M. fortuitum NRRL B-8119 erfolgt dagegen ein selektiver Steroidabbau. Diese Eigenschaft von M. fortuitum NRRL B-8119 stellt eine in hohem Maße wertvolle Eigenschaft dar.
Die Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 zu M. fortuitum NRRL B-8119 erfolgt mit Hilfe von Nitrosoguanidin. Die Einzelheiten der Mutationsmaßnahmen werden im folgenden noch näher erläutert werden. Obwohl Mutationsverfahren allgemein bekannt sind, gibt es auf dem einschlägigen Fachgebiet keine Lehren oder sogar Vermutungen bezüglich der möglicherweise bei Durchführung der im vorliegenden Falle ehgehaltenen Mutationsmaßnahmen erhältlichen Arten von Mutanten. Die im folgenden näher erläuterten Mutations- und Um-
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wandlungs- "bzw. Transformationsmaßnahmen werden zwar im einzelnen für ein Mycobacterium beschrieben, es ist jedoch ohne weiteres möglich, ähnliche oder äquivalente Maßnahmen bei Mikroorganismen der anderen genannten Gattungen anzuwenden.
Die erfindungsgemäße selektive Umwandlung läßt sich in einer wachsenden Kultur von M. fortuitum TJRRL B-8119 entweder durch Zugabe des jeweiligen Steroidsubstrats zu der Kultur während der Inkubationsdauer oder durch Zusatz des jeweiligen Steroidsubstrats zu dem Nährmedium vor dem Beimpfen bewerkstelligen. Das Steroid kann entweder alleine oder in Kombination mit einem anderen Steroid zugesetzt werden. Der bevorzugte, jedoch nicht zwingend erforderliche, Konzentrationsbereich für das Steroid in der Kultur beträgt etwa 0,1 bis etwa 100 g/l. Die Kultur wird in einem Nährmedium mit einem Kohlenstofflieferanten, beispielsweise einem assimilierbaren Kohlenhydrat, und einem Stickstofflieferanten, beispielsweise einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiweißartigen Material, wachsen gelassen bzw. gezüchtet. Bevorzugte Kohlenstofflieferanten sind Glukose, brauner Zucker, Rohrzucker, Glyzerin, Stärke, Maisstärke, Laktose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstofflieferanten sind Maiseinweichflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukt von Kasein, Fischmehl, Brennereirückstände, Tierpeptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle, Ammoniumsalze und dergleichen. In vorteilhafter Weise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstofflieferanten zum Einsatz gelangen. Den
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Gär- bzw. Fermentationsmedien brauchen keine Spurenmetalle, z.B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, zugesetzt zu werden, da vor der Sterilisation des Mediums Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile als Komponenten des Mediums zum Einsatz gelangen.
Das Umwandlungsverfahren.dauert etwa 72 h bis 15 Tage. Die Inkubationstemperatur während des Umwandlungsverfahrens reicht von etwa 25° bis etwa 370C und beträgt vorzugsweise 300C. Der Inhalt des Umwandlungsgefäßes wird mit sterilisierter Luft belüftet und zum leichteren Wachstum des Mikroorganismus bewegt. Auf diese Weise läßt sich der Wirkungsgrad des Umwandlungsverfahrens erhöhen.
Nach beendeter Umwandlung, ermittelt durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von handelsüblichen Silikagelplatten und eines Lösungsmittelsystems aus 2 Volumina Äthylacetat und 3 Volumina Cyclohexan, wird das umgewandelte Steroid in üblicher bekannter Weise isoliert. So kann beispielsweise das Gär- bzw. Fermentations- oder Umwandlungsgemisch einschließlich der Gärbrühe und der Mikroorganismenzellen mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für Steroide extrahiert werden. Geeignete Lösungsmittel sind Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylenchlorid, Trichloräthylen, Äther, Amylacetat, Benzol und dergleichen, vorzugsweise Methylenchlorid.
Andererseits können die Gär- bzw. Fermentationsbrühe und die Zellen zunächst in üblicher bekannter Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, voneinander ge-
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trennt und dann getrennt mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert werden. Die Zellen können entweder mit einem mit Wasser mischbaren oder mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert werden. Die zellenfreie Gäroder Fermentationsbrühe läßt sich mit mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahieren.
Die Extrakte können durch Diatomeenerde filtriert werden, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockene destilliert wird. Der das gewünschte umgewandelte Steroid enthaltende Destillationsrückstand kann in 10% Chloroform enthaltendem Methanol gelöst werden. Die erhaltene Lösung wird dann bis zum Auftreten von Kristallen mit Stickstoff auf einem Dampfbad eingeengt. Hierauf wird die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert, um das ausgefallene Steroid abzutrennen. Das gewünschte umgewandelte Steroid erhält man ferner aus der restlichen überstehenden Flüssigkeit beim Verdampfen des in der überstehenden Flüssigkeit enthaltenen Lösungsmittels.
Das bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Umwandlungsverfahrens angefallene Produkt stellt das bekannte Steroidzwischenprodukt 9<x-0H AD dar. Die 9oc-Hydroxyverbindungen der Androstanreihe eignen sich als Antiandrogene und Antiestrogene und als Antifertilitätsmittel. Die 9a-Hydroxysteroide eignen sich ferner zur Herstellung anderer therapeutisch wertvoller Steroide. So können beispielsweise die 9a-Äydroxy-11-unsubstituierten Steroide ohne weiteres in üblicher bekannter Weise, beispielsweise mit Thionylchlorid in Gegenwart von Pyridin, zu den wertvollen 9(11)-Dehydro-
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'ft.
steroiden dehydratisiert werden. Diese 9(11)-Dehydrover-Mndungen stellen bekannte Zwischenprodukte bei der Herstellung hochaktiver Verbindungen dar. So können beispielsweise die 9(H)-Dehydrosteroide ohne weiteres nach bekannten Verfahren (wie sie beispielsweise in der US-PS 2 852 511 für die Herstellung von 9a-Halohydrocortison beschrieben sind) in die entsprechenden 9a-Halo-11ß-hydroxyverbindungen überführt werden.
Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren gemäß der Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nicht anders angegeben, bedeuten sämtliche Prozentangaben "Gewichtsprozente". Ferner bedeuten sämtliche Mengenangaben bei Lösungsmittelgemischen, sofern nicht anderes angegeben, Volumenangaben.
Beispiel 1
Herstellung des Mutanten M. fortuitum NRRL B-8119 aus M. fortuitum ATCC 6842:
(a) Nitrosoguanidin-Mutagenese:
Zellen von M. fortuitum ATCC 6842 werden bei einer Temperatur von 280C in einem sterilen Saatmedium der folgenden Zusammensetzung wachsen gelassen:
Nährbrühe (Difco) 8 g/l
Hefeextrakt 1 g/l
Natriumpropionat 0,5 g/l
mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1
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26A7895 - < -
4 4g.
Der pH-Wert des Mediums wird mit In-NaOH vor einer 20-minütigem Sterilisation bei 1210C auf 7,0 eingestellt.
Die Zellen werden bis zur einer Dichte von etwa 5 χ 10 /ml wachsen gelassen, durch Zentrifugieren in Kügelchen überführt und dann mit einem gleichen Volumen sterilen O,1m-Natriumcitrat eines pH-Werts von 5,6 gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in demselben Volumen Citratpuffer resuspendiert, worauf ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung (d.h. zur Zellenzählung) abgetrennt wird. Schließlich wird Nitrosoguanidin bis zu einer Endkonzentration von 50 ug/ml zugesetzt. Die Zellensuspension wird in einem Wasserbad 30 min lang bei einer Temperatur von 370C inkubiert, worauf erneut ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung abgetrennt wird. Der Rest wird abzentrifugiert und mit einem gleichen Volumen sterilen 0,Im-KaIiumphosphats eines pH-Werts von 7,0 gewaschen. Schließlich werden die Zellen in einem sterilen Minimalsalzmedium ohne Kohlenstofflieferant der folgenden Zusammensetzung:
NH4NO3 1,0 g/l
K2HPO4 0,25 g/l
MgSO4-7H2O 0,25 g/l
NaCl 0,005 g/l
PeSO4'7H2O 0,001 g/l
mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1
resuspendiert. Der pH-Wert dieses Mediums wird vor einem 20-minütigem Sterilisieren bei 1210C mit In-HCl auf 7,0 eingestellt. Endlich werden die Zellen zur Auswahl der Mutanten ausgebreitet.
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(b) Auswahl und Isolierung des Mutanten M. fortuitum NRRL B-8119:
Die in der geschilderten Weise mutagenisierten Zellen werden verdünnt und auf Platten verstrichen, die ein Medium der folgenden Zusammensetzung enthalten (modifiziert nach Fräser und Jerrel, I963 "J. Biol. Chem.", 205, 291 bis 295):
Glyzerin 10,0 g/l
Na2HPO4 8,4 g/l
KH2PO4 4,5 g/l
NH4Cl 2,0 g/l
MgSO4.7H2O 0,3 g/l
FeCl3'6H2O 0,05 g/l
mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1
Nach Zugabe von 15 g/l Agar wird das Medium 30 min lang in einem Autoklaven auf eine Temperatur von 1210C erhitzt und dann in sterile Petrischalen gegossen. Das Wachsen bzw. die Züchtung auf diesem Medium eliminiert die meisten durch das Mutageneseverfahren gebildeten Nährauxotrophe. So werden beispielsweise Kulturen, die zum Wachsen auf chemisch definierten Medien Vitamine, Wachstumsfaktoren und dergleichen erfordern, eliminiert. Nach etwa 7-tägiger Inkubation bei einer Temperatur von 280C werden die gebildeten Kolonien auf zur Auswahl von Mutanten geeignete Testplatten und dann zurück auf das auf Glyzerin basierende Medium enthaltende Kontrollblatt repliziert. Die Testplatten werden entsprechend der Veröffentlichung von G.E. Peterson, H.L. Lewis und J.R. Davis, "Preparation of uniform dispersions of cholesterol and other water-insoluble
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- rr -
carbon sources in agar media", J. Lipid Research 3, 275 "bis 276 (1962) hergestellt. Das Minimalsalzmedium auf diesen Platten ist unter (a) von Beispiel 1 beschrieben. Nach Zugabe von 15 g/l Agar und 1,0 g/l eines geeigneten Kohlenstoff lief eranten werden Steroide, wie Sitosterin oder Androstendion (AD), zugesetzt, worauf die erhaltene Suspension 30 min lang bei 1210C im Autoklaven erhitzt wird. Das sterile, heiße Gemisch wird hierauf in ein steriles Mischgefäß gegossen, mehrere min lang durchgemischt und schließlich in sterile Petrischalen gegossen. Bei diesen Maßnahmen kann es infolge Schaumbildung zu Schwierigkeiten kommen, diese lassen sich jedoch durch Durchmischen des hißen Gemischs und durch Abflammen der Oberfläche der geschmolzenen Agarplatten verringern. Auf diese Weise erhält man gleichmäßige Dispersionen wasserunlöslicher Kohlenstofflieferanten, wodurch die Herstellung sehr homogener, jedoch opaker Agarplatten erleichtert wird.
Die auf den Kontrollplatten gewachsenen Kolonien, jedoch nicht die auf den AD als einzigen Kohlenstofflieferanten enthaltenden Testplatten gewachsenen Kolonien, werden durch Ausstrichen auf Nähragarplatten gereinigt. Nach dem Wachsen bei einer Temperatur von 280C werden mit Hilfe steriler Zahnstocher Einzelklonen von den Nähragarplatten gepflückt und durch Beimpfen netzartig gemusterter Platten mit AD als Kohlenstofflieferanten erneut getestet. Gereinigte Isolate, die noch einen von der Mutterkultur unterschiedlichen Phenotypus aufweisen, werden dann in Schüttelflaschen ausgewertet.
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(c) Schüttelflaschenauswertung:
Es werden 500 ml fassende Schüttelflaschen mit 100 ml
eines Biotransformationsmittels der folgenden Zusammensetzimg verwendet:
Glyzerin 10,0 g/l
Na2HPO4 8,4 g/l
KH2PO4 4,5 g/l
NH4Cl 2,0 g/l
MgS04-7H20 0,3 g/l
FeCl3-6H2O 0,05 g/l
mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1
Hierauf werden in das Medium 1 g/l Sojamehl und dann 10 g/l Sitosterin eingemischt. Nach 20-minütigem Erhitzen der Flaschen in einem Autoklaven auf 1210C werden sie auf 280C
abgekühlt und dann mit 10 ml eines wie folgt hergestellten
Saatguts beimpft:
Die gereinigten Isolate aus Stufe (b) werden bei einer Temperatur von 280C auf geneigtem Agar wachsen gelassen. Zum
Beimpfen einer 500 ml fassenden Flasche mit 100 ml eines
sterilen Saatmediums der folgenden Zusammensetzung:
Nährbrühe (Difco) 8 g/l
Hefeextrakt 1 g/l
Glyzerin 5 g/l
mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1
wird eine von einem geneigten Agar entnommene Öse voll Zellen verwendet.
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Der pH-Wert des Saatmediums wird vor dem 20-minütigen Erhitzen der Flaschen auf 1210C in einem Autoklaven mit In-NaOH auf 7,0 eingestellt. Die Saatflaschen werden 72 h lang bei einer Temperatur von 280C inkubiert.
Wie bereits erwähnt, werden 10 ml gewachsene Saat zum Beimpfen sämtlicher 500-ml-Flaschen mit jeweils 100 ml sterilen Transformationsmediums verwendet. Hierauf werden die Flaschen bei einer Temperatur von 28° bis 300C auf einem Drehrüttler inkubiert, wobei von Zeit zu Zeit aliquote Proben enibrnmen v/erden. Diese Proben umfassen jeweils 10 ml und werden nach dem Austragen durch Schütteln mit 3 Volumina Methylenchlorid extrahiert. Teile der Extrakte werden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel und des beschriebenen Lösungsmittelsystems, d.h. 2 Volumina Äthylacetat und 3 Volumina Cyclohexan, sowie durch Gas/Flüssig-Chromatographie analysiert. Ein Nachweis der Anwesenheit von 9a-0H AD bestätigt den selektiven Abbau von Sitosterin durch den neuen Mutanten aus dem Muttermycobacterium M. fortuitum ATCC 6842.
Beispiel 2
Umwandlung von Sitosterin in 9a-0H AD:
Das verwendete Medium entspricht dem Medium von Beispiel 1 (c) Dieses Medium wird durch 30-minütiges Erhitzen auf 1210C sterilisiert, dann auf 300C abgekühlt und schließlich mit 10 Teilen einer Saatkultur des Mutanten-Mycobacterium M. fortuitum NRRL B-8119, die entsprechend Beispiel 1 (c) hergestellt worden war, beimpft. Das beimpfte Gemisch wird un-
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ter Bewegung 336 h lang bei einer Temperatur von 3O0C zur Begünstigung eines submersen Wachstums inkubiert. Nach der Inkubation wird das Gemisch mit Methylenchlorid extrahiert. Der Extrakt wird durch Diatomeenerde filtriert, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockne destilliert wird. Der Rest wird mit Λ0% Chloroform enthaltendem Methanol aufgenommen und dann bis zum Erscheinen von Kristallen unter Stickstoff auf einem Dampfbad eingeengt. Hierauf wird die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt und zur Entfernung ausgefallener Sitosterine filtriert. Aus der überstehenden Flüssigkeit erhält man nach dem Abdampfen des Lösungsmittels in guter Ausbeute Roh-9a-hydroxy-4-androsten-3,17-dion. Durch Dünnschichtchromatographie kann auch die Anwesenheit einer Spur 9<x-Hydroxy-4-androsten-3-on-17-ol nachgewiesen werden.
Beispiel 3
Durch Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Cholesterin erhält man 9a-0H AD.
Beispiel 4
Durch Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Stigmasterin erhält man 9a-0H AD.
Beispiel 5
Durch Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Campesterin erhält man 9<x-OH AD.
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Beispiel 6
Durch Zusatz einer Kombination aus beliebigen Steroiden der Beispiele 2 bis 5 zu dem Sitosterin in Beispiel 2 oder durch Verwendung einer beliebigen Kombination der Steroide der Beispiele 2 bis 5 anstelle des Sitosterins in Beispiel 2 erhält man 9a-0H AD.
Beispiel 7
Das bei den Beispielen 2 bis 6 erhaltene Roh-9a-OH AD wird durch folgende Maßnahmen gereinigt: Die unlöslichen Bestandteile werden aus der jeweiligen Nährbrühe der Beispiele 2 bis 6 durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt. Der abgetrennte Kuchen wird mit einer geeigneten Menge Wasser gewaschen, worauf die Waschflüssigkeit mit dem feststofffreien Filtrat vereinigt wird. Die Kuchenfraktion wird mit einer wäßrigen Acetonlösung (1 : 4) ausgelaugt, worauf das Aceton entfernt und die restliche wäßrige Masse mit dem feststoff freien Filtrat und der Waschflüssigkeit vereinigt wird. Reststerine können aus der ausgelaugten Kuchenfraktion durch Extrahieren mit Methylenchlorid, Entfernen des Lösungsmittels und anschließende Kristallisation rückgewonnen werden.
Die filtrierte Brühefraktion wird zweimal mit dem halben Volumen Butylacetat bei einem pH-Wert von 4,0 extrahiert, worauf die verbrauchte Brühe verworfen wird. Gesammelte Extrakte der Brühe werden mit einem Fünftel Volumen einer 5%igen Natriumbicarbonatlösung zur Entfernung der bei der Fermentation bzw. Gärung gebildeten sauren Verbindungen gewaschen.
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Die gesammelten neutralisierten Extrakte werden auf etwa 2% des Brühevolumens eingeengt und dann abgekühlt, worauf das gereinigte Produkt 9a-OH AD zur Kristallisation gebracht wird. Das Endprodukt erhält man in üblicher bekannter Weise durch Filtrieren und Trocknen. Es besitzt, ermittelt durch Flüssigkeitschromatographie, eine Reinheit von mehr als 95%. Weiteres 9a-OH AD erhält man aus der Mutterlauge durch weiteres Einengen und Zusatz von Cyclohexan zur Erniedrigung der Löslichkeit.
Beispiel 8
Durch Ersatz von Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 durch einen Mikroorganismus der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces erhält man Mikroorganismenmutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung von 9<x-OH AD in der. Gär brühe auszeichnen.
Beispiel 9
Durch Ersatz des Mutanten M. foitnitum NRRL B-8119 in Beispielen 2 bis 7 durch die gemäß Beispiel 8 erhaltenen Mutanten erhält man 9a-0H AD.
Beispiel 10
Durch Ersatz des M. fortuitum ATCC 6842 in Beispiel 1 durch einen Mikroorganismus der Gruppe Mycobacterium phlei,
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M. smegmatis, M. rhodochrous, M. mucosum -und M. butyricum erhält man Mikroorganismenmutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17 Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlichiO Kohlenstoffatomen und zur Bildung von 9<x-OH AD in der Gärbrühe auszeichnen.
Beispiel 11
Durch Ersatz des Mutanten M. fortuitum NRRL B-8119 in Beispielen 2 bis 7 durch die gemäß Beispiel 10 hergestellten Mutanten erhält man 9a-0H AD.
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Claims (1)

  1. PATFNTANWAl TE
    HENKEL, KERN, FEILER Sc HÄNZEL
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    i'iiSISt HI CK 'IiN-(HiN j·-?;»" Ml*
    The Upjohn Company
    Kalamazoo, Mich., V.St.A»
    Ns.-".« /ΙΙΓΗΙ:Ν: \iiM Hi ν I)HN
    2 2· Okt. 1976
    Patentansprüche
    ; 1./verfahren zur Herstellung von 9a-Hydroxyandrostendion, dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette züchtet.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin verwendet.
    3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Cholesterin verwendet.
    4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Stigmasterin verwendet.
    5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Campesterin verwendet.
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    264 7
    Verfahren zur Herstellung von 9a-Hydroxyandrostendion, dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemischs aus zwei oder mehreren Steroiden mit jeweils 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen in den 17-Alkylseitenketten züchtet.
    7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroidgemisch ein Gemisch aus Sitosterin und/ oder Cholesterin und/oder Stigmasterin und/oder Campesterin verwendet.
    8. Neuer Laboratoriummutant Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119.
    9. Verfahren zur Herstellung von 9a-Hydroxyandrostendion, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismusmutanten aus der Gruppe Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces, der sich durchseine Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Koh lenstoffatomen und zur Bildung bzw. Ansammlung von 9a-Hydroxyandrostendion in der Gärbrühe auszeichnet, in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit 2 bis einschließlich 10 Koh lenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette züchtet.
    10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismusmutanten in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart einer Mischung aus zwei oder mehreren Steroiden mit jeweils 2
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    bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen in den 17-Alkylseitenketten züchtet.
    11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin oder Campesterin verwendet.
    12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroidgemisch ein solches aus Sitosterin und/ oder Cholesterin und/oder Stigmasterin und/oder Campesterin verwendet.
    13. Verfahren zur Herstellung von 9a-Hydroxyandrostendion, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mycobacteriummutanten, der sich durch eine Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung bzw. Ansammlung von 9a-Hydroxyandroste£ndion in der Nährbrühe auszeichnet, in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette züchtet.
    14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismusmutanten in einer wäßrigen Nährbrühe unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemischs aus zwei oder mehreren Steroiden mit jeweils 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen in den 17-Alkylseitenketten züchtet.
    15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin oder Campesterin verwendet.
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    16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroidgemisch ein solches aus Sitosterin und/ oder Cholesterin und/oder Stigmasterin und/oder Campesterin verwendet.
    7098ia/10S7
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