DE1904543C3 - Verfahren zur mikrobiologischen Umwandlung von 3 ß-Hydroxy-5,6- epoxysteroiden in 6-Hydroxy-3-Keto- A4 -Steroide - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von 6-Hydroxy-3-Keto-d⁴-Steroiden der Pregnan- und Androstanreihe, dadurch gekennzeichnet, daß man ein im Α-Ring gesättigtes 3/J-Hydroxy- bzw. 3ji-Acyloxy-5,6-epoxysteroid der Pregnan- und Androstanreihe mit Bakterien der Gattung Flavobacterium oder der Gattung Pseudomonas oder mit deren Enzymen fermentiert, wobei die Verwendung von Mikroorganismen der Species Flavobacterium dehydrogenans oder der Species Pseudomonas fluorescens bevorzugt geeignet sind.

Chemische Verfahren zur Herstellung von 6-Hydroxy-3-Keto-4⁴-Steroiden aus im Α-Ring gesättigten 5,6-Epoxysteroiden sind bekannt (L. Liteil und S. Bernstein, J. Org. Chem, 27, 2544 [1962]). Diese bekannten Verfahren sind vielstufige Synthesen, bei denen Ausbeuten von weniger als 20% erzielt werden können.

Demgegenüber kann man bei dem erfindungsgemäßen einstufigen Verfahren Ausbeuten von über 50% erzielen.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist allein erforderlich, daß die angewandten Ausgangssteroide die 3/3-Hydroxy- bzw. 30-Acyloxy-5,6-epoxy-Gruppierung, wobei der 5,6-Epoxyring <x- oder ^-ständig sein kann, besitzen. Darüber hinaus kann das Ausgangssteroid beliebige weitere Substituenten, wie beispielsweise freie oder funktionell abgewandelte Hydroxylgruppen, z. B. in 1«-, 11)?-, 14<x-, 15«-, 16-, 17- und/oder 21-Stellung, vorzugsweise niedere Alkylgruppen, z. B. in 1«-, 2«-, 7«-, 16- und/oder 18-Stellung, freie oder funktionell abgewandelte Ketogruppen, z. B. in 11- und/oder 17- oder 21-Stellung, Halogenatome, vorzugsweise Chlor und Fluor, z.B. in 16-Stel lung enthalten. Auch zusätzliche Doppelbindungen, z.B. in 7-, 9(11)-, 14(15)- und/oder 16-Stellung, kann das angewandte Ausgangssteroid enthalten.

Die Durchführung dir erfindungsgemäßen mikrobiologischen Umwandlung erfolgt nach den dem Fachmann dafür bekannten Arbeitsmethoden. So werden in allgemein üblichen Vorversuchen die günstigsten Reaktionsbedingungen für die aerobe, submerse Fermentation ermittelt Die Umwandlung des als Lösung oder Suspension zugesetzten Substrats wird zweckmäßigerweise durch dünnschichtchromatographische Analyse von Probeextraktraten verfolgt. Nach beendeter Fermentation wird das Verfahrensprodukt mit einem geeigneten mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel aus der Kulturbrühe extrahiert und aus dem Extrakt, z. B. durch Eindampfen und weitere bekannte Aufarbeitungsmethoden, beispielsweise durch Umkristallisieren und/oder Chromatographie an Silicagel gereinigt.

Die erfindungsgemäß eingeführte 6-Kydroxyignippe

im Verfahrensprodukt ist je nach der Stellung des

5,6-Epoxydringes im Ausgangssteroid «- oder ^-ständig.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein technisch

einfaches Verfahren zur Herstellung von 6-Hydroxy-3-

keto-4⁴-Steroiden der Pregnan- oder Androstanreihe, die wichtige Zwischenprodukte zur Herstellung von

hormonwirksamen Steroiden sind oder teilweise selbst schon als Arzneimittelwirkstoffe verwandt werden können. Der glatte Reaktionsverlauf unter Erzielung

■o technisch brauchbarer Ausbeuten an gewünschtem Verfahrensprodukt war auch für den Fachmann nicht zu erwarten. Der Arbeit von S. S. Lee und Ch. J. Sih [Biochem. 3,1267 (1964)] ist nämlich zu entnehmen, daß die Fermentation von 3^-Hydroxy-5«,6a-epoxy-androstan-17-on mit Pilzen, wie z. B. Nocardia restrictus, zur Einführung einer 6<x-Hydroxylgruppe ungeeignet ist, da dabei das gewünschte 6«-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion in nur bescheidener Ausbeute (maximale Ausbeute 15%) entsteht und sich unter Ringspaltung überwiegend

jo 9,10-seco-Steriode bilden.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren notwendigen 30-Hydroxy- bzw. 3/3-Acetoxy-5,6-epoxysteroide werden hergestellt aus den entsprechenden 3JJ-Hydroxy- bzw. 3/i-Acyloxy-4⁵-Steroiden durch Epoxydierung der Δ⁵- Doppelbindung in an sich bekannter Weise, z. B.

mittels Persäuren. Am Beispiel des 3ß-Hydroxy-21-acetoxy-16«-methyl-5-pregnen-2o-on soll die Herstellung des Ausgangssteroids näher erläutert werden:

60 g 3/i-Hydroxy-21-acetoxy-16a-methyl-5-pregnen-20-on werden in 1,8 I trockenem Methylenchlorid gelöst und mit 12 g Natriumacetat (geschmolzen) und 40 g Natriumsulfat (sicc) versetzt. Bei +2° C werden innerhalb einer halben Stunde unter Rühren 36 ml Peroxyessigsäure zugetropft, dann nochmals 12 g Natriumacetat und 40 g Natriumsulfat zugesetzt und in gleicher Zeit weitere 36 ml Peroxyessigsäure zugetropft. Es wird nachgerührt, wobei innerhalb von 2 Stunden die Reaktionslösung sich auf Raumtemperatur erwärmt Nach Neutralisieren mit 1 Liter 5%iger NaHCC>3-Lösung unter Rühren wird die Methylenchloridlösung abgetrennt, mit Wasser, FeSCv Lösung und Wasser gewaschen, über NajSO« getrocknet und im Vakuum bei 4O⁰C eingeengt Der Rückstand wird aus Essigester umkristallisiert, F. 177-169° C (Ausbeuten bis85%«-Epoxyd).

Die gewünschten 3-Acetate werden durch Epoxydierung der analogen 4⁵-3-Acetate erhalten oder auch durch nachträgliche Acetylierung der 30-Hydroxy-5a,6«-epoxyde.

Die Verfahrensprodukte sind wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung pharmakologisch wertvoller 110-Hydroxysteriodverbindungen.

Beispiel 1
6ß- Hydroxy- testololacton

Ein 2-l-Erlenmeyerkolben - gefüllt mit 500 ml eines sterilisierten wäßrigen Mediums, enthaltend 03% Hefeextrakt, 0,5% Cornsteep liquor und 0,2% Stärke, eingestellt auf Ph 7 — wird mit einer Lyophilkultur von

te Flavobacterium dehydrogenans beimpft und 48 Stunden bei 30⁰C und 145 U/Min, geschüttelt. Mit 250 ml der Bakteriensuspension wird ein 20-1-Giasfermenter — beschickt mit 14,75 1 sterilisierter Nährlösung gleicher Zusammensetzung — inokuliert und 24 Stunden bei 29° C mit einer Belüftung von 1650 l/U mit 220 U/Min, gerührt Aus dieser Vorfermentation werden 0,91 in einen 20-1-Glasfermenter überführt, der mit 151 sterilisierten Mediums gleicher Zusammensetzung be-

schickt ist Zur Hauptfermentation werden die gleichen technischen Bedingungen wie bei der Vorfermentation angewendet Dabei wird der pH-Wert während der Hauptfermentation zwischen 6-7 gehalten. Nach 6 Stunden Anwachsphase werden 3,75 g 3/?-Hydroxy-5/?- 6/3-epoxy-testololacton in 80 ml Dimethylformamid zugegeben und fermentiert Der Reaktionsverlauf wird durch dünnschichtchromatographische Analyse von Methylisobutylketonextrakten einzelner Kulturproben verfolgt Nach 28 Stunden ist das Ausgangsmaterial vollständig umgesetzt und ein Hauptprodukt (Rf: 0,25 Chloroform/Me 95 :5) und in sehr geringen Mengen ein Nebenprodukt (Rf: 0,06) entstehen. Die Kulturbrühe wird einmal mit 7,51 und weitere zweimal mit je 5 I Methylisobutylketon ausgerührt Die vereinigten Extrakte werden in einem Umlaufverdampfer im Vakuum bei 30-35⁰C konzentriert und im Rotationsverdampfer bei maximal 40⁰C Badtemperatur im Vakuum zur Trockne eingeengt Der Rückstand wird mit wenig kaltem Hexan von Antischaummitteln (Siliconöl) freigewaschen und ergibt nach Trocknen 3,2 g Rohprodukt Nach Umkristallisieren aus Essigester/Methanol und Essigester/Isopropyläther erhält man 2,1 g (58% d.Th.) 6/J-Hydroxy-testololacton vom Schmelzpunkt 222-224° C, Rf: 0,16 (Benzol/Essigester 1 :4), 8234 = 10 200.

Beispiel 2

6a-21-Dihydroxy-16«-methyl-4-pregnen-3,20-dion

Unter den Bedingungen von Beispiel 1 — jedoch in einem Hauptfermentermedium der Zusammensetzung 1% Hefeextrakt, 0,77% KH₂PO₄ - werden 7,5 g 3jJ-Hydroxy-21 -acetoxy-Six.ea-epoxy-16<x-methyl-pregnan-20-on in 100 ml Dimethylformamid in 151 Kulturbrühe von Flavobacterium dehydrogenans fermentiert Nach 33 Stunden Kontaktzeit ist das Ausgangsmaterial zu zwei Produkten Rf 0,57 und 0,5 (Cyclohexan/Essigester 1 + 1) umgewandelt. Durch übliche Aufarbeitung erhält man 3,2 g Rohprodukt (Schmelzpunkt 161 -166° C) das aus Essigester umkristallisiert wird; F. 177/179- 181⁰C; Rf: 0,5 (Cyclohexan/ Essigester 1 +1); 6239 = 14 890.

Beispiel 3 6a-Hydroxy-testoloIacton

Analog Beispiel 1 werden 3,75 g 3/5-Hydroxy-S 5«,6«.-epoxy-testololacton in 80 ml Dimethylformamid ir 151 Kulturbrühe von Flavobacterium dehydrogenans fermentiert Nach 25 Stunden ist das Ausgangsmaterial umgewandelt und ein Hauptprodukt (Rf 0,18) und zu sehr geringen Anteilen ein Nebenprodukt (Rf 0,27) (Chloroform/Methanol 95-5) entstehen. Nach 28 Stunden Fermentationszeit = 22 Stunden Kontaktzeit wird wie üblich aufgearbeitet Das isolierte Rohprodukt wird aus Essigester und Essigester/Methanol umkristallisiert Man erhält so 2 g 6«-Hydroxy-testololacton; F.

264/269-272°C; Rf: 0,16 (Benzol/Essigester 1 :4), Rf: 0,85(Chloroform/Methanol 9 :1)₁B₂Si = 15 700.

Beispiel 4 ^ 6/J-Hydroxy-4-androsten-3,l7-dion

Eine Lyophilkultur von Pseudomonas fluorescens (Biologische Bundesanstalt Berlin) wird in 500 ml eines sterilen wäßrigen Mediums, enthaltend 0,5% Glucose, 0,5% Hefeextrakt und 0,2% Cornsteep liquor (pH eingestellt auf 7), eingebracht und 48 Stunden bei 30° C geschüttelt 5CmI der Bakteriensuspension werden in einen 2-l-Erlenmeyerkolben, der 500 ml des gleichen Mediums enthält überführt Nach 24 Stunden werden 2 ml der Kulturbrühe überführt in einen 100-ml-Erlenmeyeirkolben, der 20 ml des gleichen Mediums enthält Nach 6 Stunden Anschütteln werden 0,2 ml einer sterilfiltrierten Lösung von 400 mg 3/?-Hydroxy-5«,6«- epoxy-androstan-17-on in 20 ml Dimethylformamid zugegeben und weitere 42 Stunden bei 30° C geschüttelt Die Fermentationsbrühe wird dann mit 4 ml Methylisobutylketon ausgeschüttelt Vom Extrakt wird eine aliquote Menge dünnschichtchromatographisch untersucht und gegen Vergleichsmengen einer Standardsub- stanz 6«-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion ausgeschätzt (Rf 0,43 Benzol: Essigester 1 :4). Danach entstehen ca. 60% Umwandlungsprodukt.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von 6-Hydroxy-3-keto-J⁴-Steroiden der Pregnan- und Androstanreihe, dadurch gekennzeichnet, daß man ein im Α-Ring gesättigtes 30-Hydroxy- bzw. 30-Acyloxy-5,6-epoxysteroid der Pregnan- oder Androstanreihe mit Bakterien der Gattung Fiavobacterium oder der Gattung Pseudomonas oder mit deren Enzymen fermentiert