CH623062A5

CH623062A5 -

Info

Publication number: CH623062A5
Application number: CH1444875A
Authority: CH
Inventors: Rudolf Prof Dr Wiechert; Klaus Dr Kieslich; Henning Dr Koch
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 1974-11-11
Filing date: 1975-11-07
Publication date: 1981-05-15
Also published as: NL7513156A; JPS645880B2; DE2453823C2; DK142057B; FR2290214B1; DE2453823A1; FR2290214A1; GB1530615A; JPS5191392A; DK503775A; US4012510A; JPH0148760B2; DK142057C; JPS62187486A; BE835427A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer, pharmakologisch wirksamer Methylensteroide der Formel

CHoEo

C=0

2(1)

0

«

X

worin

X ein Wasserstoffatom, ein Fluoratom oder eine Methylgruppe,

Y eine Hydroxymethylengruppe,

Ri ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe oder eine

Alkanoyloxygruppe und R2 ein Wasserstoffatom oder eine freie oder mit einer physiologisch unbedenklichen Säure veresterte Hydroxylgruppe bedeuten.

Der Wirkungsbeginn und die Wirkungsdauer der neuen Methylensteroide sowie ihre Löslichkeit in physiologisch verträglichen Lösungsmitteln sind ebenso wie bei den bekannten Kortikoiden insbesondere davon abhängig, ob und gegebenenfalls mit welcher Säure eine in der 11,17 und/

oder 21-Position ständige Hydroxygruppe verestert ist.

Als veresterte 21-Hydroxygruppen R2 kommen vorzugsweise Acyloxygruppen mit 1 bis 16 Kohlenstoffatomen im Acylrest, Sulfatgruppen oder Phosphatgruppen in Betracht. Geeignete Acyloxygruppen sind beispielsweise solche, die

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sich von geradkettigen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Mono- oder Dicarbonsäuren ableiten, welche in üblicher Weise, beispielsweise durch Hy-droxygruppen, Aminogruppen oder Halogenatome substituiert sein können.

Ferner eignen sich als Acyloxygruppen auch Reste cy-cloaliphatischer, aromatischer, gemischt aromatisch-ali-phatischer oder heteroeyclischer Säuren, die ebenfalls in üblicher Weise substituiert sein können. Als geeignete Acyloxygruppen seien beispielsweise genannt: die Formyloxy-, Acetoxy-, Propionyloxy-, Butyryloxy-, Pentanoyloxy-, Hexa-noyloxy-, Octanoyloxy-, Undecanoyloxy-, Dimethylacetoxy-, Trimethylacetoxy-, Diäthylacetoxy-, tert.-Butylacetoxy-, Benzoyloxy-, Phenacetyloxy-, Cyclopentylpropionyloxy-, Hydroxyacetoxy-, Monochloracetoxy-, Dichloracetoxy-, Tri-chloracetoxy-, ferner die Dimethylaminoacetoxy-, die Tri-methylaminoacetoxy-, die Diäthylaminoacetoxy-, die Piperi-dinoacetoxy-, die Nicotinoyloxy-, die eo-Carboxypropionyl-oxy- und die oj-Carboxypentanoyloxygruppe.

Zur Herstellung wasserlöslicher Wirkstoffe können die 21-AcyloxyVerbindungen mit einer basischen Stickstoffgruppe im Acylrest in die entsprechenden Säureadditionssalze wie zum Beispiel die Hydroehloride, Hydrobromide, Sulfate, Phosphate, Oxalate, Tartrate oder Maleate überführt werden. Ferner lassen sich die 21-Dicarbonsäuremonoester, sowie die Schwefelsäure- und Phosphorsäureester zur Erhöhung der Wasserstofflöslichkeit in ihre Alkalisalze, wie zum Beispiel die Natrium- oder Kaliumsalze, überführen).

Als veresterte 17-ständige Hydroxygruppen kommen Alkanoyloxygruppen in Betracht, wie zum Beispiel die Acetoxy-, die Propionyloxygruppe, die Butyryloxygruppe, die Pentanoyloxygruppe oder die Hexanoyloxygruppe.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen Methylensteroide ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel

GE0R0

I 2 2

C=0

CH.

worin X, Ri und R2 die gleiche Bedeutung wie in Formel I besitzen, mit einer Kultur eines zur ll-Hydroxylierung befähigten Mikroorganismus fermentiert.

In erhaltenen Verbindungen kann man vorhandene Estergruppen verseifen oder eine vorhandene 21-Hydroxygruppe mit einer physiologisch unbedenklichen Säure verestern.

Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Her-

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Stellung von Verbindungen der Formel

CŒU3EL

c=o

- E.

'CE.

2(i A)

0

t

X

worin X, Ri und R2 weiter oben definiert sind und Y' eine Alkanoyloxymethylengruppe bedeutet. Diese Verbindungen werden erhalten, indem man zuerst, wie weiter oben beschrieben, eine Verbindung der Formel I herstellt und diese dann in ll-Stellung entsprechend verestert.

In Verbindungen der Formel I wird durch Dehydrierung in /^-Stellung eine Doppelbindung eingeführt, so dass entsprechende A1,4-Steroide entstehen.

Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens kann man die übliche Fermentation mitt 11 a- oder ll/?-hy-droxylierenden Mikroorganismen verwenden. Für die 11«-Hydroxylierung verwendet man vorzugsweise Pilzstämme der Gattung Aspergillus (so zum Beispiel Aspergillus occhra-ceus) als Mikroorganismen. Für die 11/J-Hydroxylierung können beispielsweise Pilzstämme der Gattung Curvularia (zum Beispiel Curvularia lunata), Cunninghamella (zum Beispiel Cunninghamella bainieri, Cunninghamella elegans, Cunninghamella echinolata und Cunninghamella blackesleana), Ab-sidia (zum Beispiel Absidia orchidis und Absidia coerula), Helmintosporium, Rhizoctonia (zum Beispiel Rhizoctonia solani), Verticillium (zum Beispiel Verticillium theobromae), Stachylidium (zum Beispiel Stachylidium bicolor), Piellicula-ria (zum Beispiel Pellicularia filamentosa) oder Colletotrichum (zum Beispiel Colletotrichum pisi) verwendet werden. Die Fermentation mit diesen Mikroorganismen wird gewöhnlich unter den üblichen Bedingungen durchgeführt. Bei dieser Umsetzung wird eine in der 21-Position ständige Acyl-gruppe meist abgespalten. Das Verfahren wird vorzugsweise mit solchen Verbindungen der allgemeinen Formel II durchgeführt, die in der 21-Position eine Hydroxygruppe oder eine Acyloxygruppe tragen.

Die Dehydrierung der in der 1,2-Position gesättigten Steroide der Formel I kann sowohl mittels mikrobiologischer Arbeitsmethoden als auch mittels rein chemischer Methoden durchgeführt werden. So kann man beispielsweise die /^"Steroide unter den üblichen Bedingungen mit Bakterienkulturen der Gattung Bacillus (zum Beispiel Bacillus lentus oder Bacillus sphaericus) oder Arthrobacter (zum Beispiel Arthrobacter simplex) in der 1,2-Position dehydrie-ren. Andererseits ist es aber auch möglich, die A1-Dehydrie-run in der Weise durchzuführen, dass man die Asteroide mit den für diese Reaktion üblichen Oxydationsmitteln, wie zum Beispiel Selendioxyd oder 2,3-Dichlor-5,6-dizyanobenzo-chinon, in inerten Lösungsmitteln erhitzt.

Die gewünschtenfalls nachfolgende Verseifung der Ester kann nach an sich bekannten Arbeitsmethoden erfolgen.

Beispielsweise genannt sei die Verseifung der Ester in Wasser oder wässrigen Alkoholen in Gegenwart von sauren

Katalysatoren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, p-Toluolsulfon-säure oder von basischen Katalysatoren, wie Kaliumhydro-gencarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumhydroxid oder Ka- -liumhydroxid-

Eine Veresterung freier Hydroxylgruppen kann ebenfalls mit Hilfe der an sich bekannten Arbeitsmethoden erfolgen. So kann man beispielsweise die Hydroxysteroide mit Acylchloriden oder Acylanhydriden in Gegenwart von Säuren, wie zum Beispiel Chlorwasserstoff, p-Toluolsulfon-säure, Trifluoressigsäure oder in Gegenwart von Basen, wie Kaliumcarbonat, Pyridin, Kollidin oder p-Dimethylamino-pyridin verestern.

Andererseits ist es möglich- die Hydroxyverbindungen mit Carbonsäuren in Gegenwart von Trifluoressigsäureanhydrid zu verestern.

Aus den 21-Hydroxyverbindungen der Formel I können in an sich bekannter Weise die Alkalisulfate der 21-Mono-schwefelsäureester hergestellt werden, beispielsweise in dem man die 21-Hydroxyverbindungen mit Schwefeltrioxyd in Pyridin umsetzt, und den erhaltenen Schwefelsäureester durch Behandeln mit Alkalibasen in das Alkalisalz überführt.

Ferner kann man aus den 21-Hydroxyverbindungen der Formel I in an sich bekannter Weise die Alkalisalze der 21-Monophosphorsäureester herstellen, indem man beispielsweise die 21-Hydroxyverbindungen mit Sulfonsäurechlorid in 21-Stellung verestert, die 21-Sulfonate mit Alkalijodid in Aceton in die 21-Jodverbindungen überführt, die Jodverbindungen mit Phosphorsäure in Gegenwart einer organischen Base umsetzt und die erhaltenen Phosphorsäuremonoester mit Alkali in die Dialkalimetallsalze überführt.

Die neuen Kortikoide der Formel I, IA und IB sind pharmakologisch wirksame Substanzen, die sich insbesondere dadurch auszeichnen, dass sie bei topischer Anwendung eine ausgeprägte antiinflammatorisehe Wirksamkeit besitzen.

Darüberhinaus zeichnen sich diese Verbindungen oft durch einen raschen Wirkungsbeginn, eine hohe Wirkungsintensität und eine lange Wirkungsdauer aus, sie haben eine günstige Resorbierbarkeit und in galenischen Zubereitungen eine relativ gute Stabilität. Die neuen Verbindungen eignen sich in Kombination mit den in der galenischen Pharmazie üblichen Trägermitteln zur lokalen Behandlung von Kon-taktdermatitis, Ekzemen der verschiedensten Art, Neurodermatosen, Erythrodermie, Verbrennungen, Pruritis vulvae et ani, Rosacea, Erythematodes cutaneus, Psoriasis, Liehen ruber planus et verrucosus und ähnlichen Hauterkrankungen.

Die Herstellung der Arzneimittelspezialitäten kann in üblicher Weise erfolgen, indem man die Wirkstoffe mit geeigneten Zusätzen in die gewünschte Applikationsform, wie zum Beispiel: Lösungen, Lotionen, Salben, Cremen oder Pflaster, überführt. In den so formulierten Arzneimitteln ist die Wirkstoffkonzentration von der Applikationsform abhängig. Bei Lotionen und Salben wird vorzugsweise eine Wirkstoffkonzentration von 0,001% bis 2% verwendet.

Darüberhinaus sind die neuen Verbindungen gegebenenfalls in Kombination mit den üblichen Trägermitteln und Hilfsstoffe auch gut zur Herstellung von Inhalationsmitteln geeignet. Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemässen Verfahrens.

Präparat 1

a) 11,0 g 3/?-Acetoxy- 15 a, 16a-methylen-5 -pregnen- 17,20f-diol, werden in 230 ml Dimethylsulfoxid gelöst, auf 15 °C abgekühlt, 30,8 ml Triäthylamin zugegeben und innerhalb 30 Minuten eine Lösung von 22 gPyridin-Schwefel(VI)-oxyd-Komplex in 100 ml Dimethylsulfoxid zugetropft. Es wird 1 Stunde bei Raumtemperatur nachgerührt, dann in schwach essigsaures Eiswasser eingerührt, der ausgefallene Niederschlag abfiltriert, gut ausgewaschen und in Methylenchlorid

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aufgenommen. Nach dem Trocknen und Eindampfen wird der Rückstand aus Essigester umkristallisiert und es werden 7,5 g 17-Hydroxy-3/3-acetoxy-15a,16a-methylen-5-pregnen-20-on vom Schmelzpunkt 245—247 °C (Zersetzung) erhalten. 5

b) 10,0 g 17-Hydroxy-3/?-acetoxy-15a,16a-methylen-5-pregnen-20-on werden in 350 ml Essigsäure und 100 ml Chloroform teilweise gelöst, 0,1 ml Bromwasserstoff in Essigsäure (37 °/oig) zugesetzt und innerhalb 1,5 Stunden eine Lösung von 2,85 ml Brom in 100 ml Essigsäure zu- io getropft. Es wird dann 1 Stunde nachgerührt, die Reaktionslösung mit Methylenchlorid verdünnt, mit Wasser, Natrium-hydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen und getrocknet. Nach dem Eindampfen werden 17,9 g rohes 5,6/?,21-Tribrom-17-hydroxy-3/?-acetoxy-15a,16a-niethylen- 15 5a-pregnan-20-on erhalten-

c) 17,9 g rohes 5,6/3,21-Tribrom-17-hydroxy-3/5-acetoxy-15a,16a-methylen-5a-pregnan-20-on werden in 400 ml Aceton mit 9,1 giNatriumjodid und 40 giKaliumacetat ^Stunden unter Rühren am Rückfluss erhitzt. Nach Eiswasserfällung wird 20 der abfiltrierte Niederschlag in Methylenchlorid aufgenommen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird an Silikagel chromatographiert und es werden umkristallisiert aus Diisopropyläther/Aceton 4,75 g 17-Hydroxy-3/?,21-diacetoxy-15a,16a-methylen-5-pregnen-20-on vom Schmelz- 25 punkt 197,5—199 °C erhalten.

d) Ein Glasfermenter mit 201 Fassungsvermögen wird mit 151 einer Nährlösung aus 0,3% Hefeextrakt, 0,5% Corn-steepliquor und 0,2% Stärkezucker beschickt, durch halbstündiges Erhitzen auf 120 °C sterilisiert und nach dem 30 Abkühlen mit 250 ml einer 2-tägigen Schüttelkolbenkultur von Flavobacterium dehydrogenans ATCC 13 930 beimpft. (Die Schüttelkolbenkultur wird durch Inoculieren von 250 ml des gleichen Mediums mit der Abschwemmung einer 7 Tage alten Schrägagarkultur hergestellt.) Nach 24- 35

stündiger Vermehrung bei 30 °C unter Rühren (220 Umdrehungen pro Minute) und Belüftung (15 Liter pro Minute) werden 900 ml der erzeugten Kultur unter sterilen Bedingungen entnommen und in einen gleich grossen Fermenter mit 141 des gleichen Mediums überführt. Nach 6 Stunden wird 40 die Kulturbrühe auf 131 reduziert, mit einer sterilfiltrierten Lösung von 6,5 g 17-Hydroxy-3/?,21-diacetoxy-15a,16a-methylen-5-pregnen-20-on in 100 ml Dimethylformamid versetzt und unter gleichen Bedingungen weitere 13 Stunden fermentiert. Nach beendeter Fermentation wird die Kultur- 4J brühe dreimal mit je 61 Methylisobutylketon extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 100 ml heissem Hexan vom verwendeten Antischaummittel Silicon SH freigewaschen und ergibt 4,7 g Rohprodukt, das aus Essigester mit geringem ^ Kohlezusatz umkristallisiert wird. Man erhält 3,13 g 17,21-Dihydroxy-15«,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion (Ausbeute 68% der Theorie) vom Schmelzpunkt 225—226 °C.

Präparat 2 5J

a) 11,35 g r7-Hydroxy-3/?,21-diacetoxy-15a,16a-methylen-5-pregnen-20-on werden in 170 ml Methanol und 170 ml Methylenchlorid bei Eiskühlung mit einer Lösung von 568 mg Kaliumhydroxid in 10 ml Methanol versetzt und 1,5 Stunden bei Eistemperatur nachgerührt. Anschliessend wird 60 mit Essigsäure neutralisiert, die Lösung im Vakuum weitgehend eingeengt und in Eiswasser gefällt. Der ausgefallene Niederschlag wird abgesaugt, gewaschen und getrocknet.

Nach Chromatographie an Silicagel werden nach Diiso-propylätherverreibung 7,3 g 17,21-Dihydroxy-3/?-acetoxy- 6S 15a,16a-methylen-5-pregnen-20-on erhalten. Eine aus Essigester umkristallisierte Probe schmilzt bei 228—233,5 °C (Zersetzung).

b) 7,0 g 17,21-Dihydroxy-3/3-acetoxy-15a,16a-methylen-5-pregnen-20-on werden in 280 ml Essigsäure mit 700 mg kristallwasserhaltigem Zinkacetat 2 Stunden bei 120 °C gerührt. Es wird dann im Vakuum weitgehend eingeengt, der Rückstand in Methylenchlorid aufgenommen und mit Wasser neutral gewaschen. Nach dem Eindampfen werden 7,0 g rohes 20-Hydroxy-3/?-acetoxy-15a, 16a-methylen-5,17(20)-pregnadien-21-al erhalten.

c) 7,0 g 20-Hydroxy-3/?-acetoxy-15a,16a-methylen-5,17(20)-pregnadien-21-al werden in 28 ml Pyridin mit 14 ml Acetanhydrid 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Es wird dann in Eiswasser eingerührt, der ausgefallene Niederschlag abfiltriert und in Äther aufgenommen. Die Ätherphase wird mit verdünnter Salzsäure, Wasser Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen. Nach dem Eindampfen wird der Rückstand an Silicagel chromatographiert und es werden 6,5 g 3/?,20-Diacetoxy-15a,16a-methylen-5,17(20)-pregnadien-21-al erhalten.

Eine aus Diisopropyläther umkristallisierte Probe schmilzt bei 147,5—151 °C.

d) 6,5 g 3/j,20-Diacetoxy-15a,16a-methylen-5,17(20)-pregnadien-21-al werden in 65 ml Tetrahydrofuran mit

6,5 g Lithium-tri-tert.-butoxyalanat versetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Es wird dann in Eiswasser eingerührt, mit verdünnter Schwefelsäure angesäuert und mit Methylenchlorid extrahiert. Nach dem Trocknen und Eindampfen werden 6,5 g rohes 21-Hydroxy-3/?,20-diacetoxy-15a,16a-methylen-5,17(20)-pregnadien erhalten.

e) 6,5 g 21-Hydroxy-3yS,20-diacetoxy-15a,16a-methylen-5,17(20)-pregnadien werden in 260 ml Methanol mit 65 ml

2 n Salzsäure 3,5 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Anschliessend wird in Eiswasser gefällt, der Niederschlag abfiltriert, in Methylenchlorid aufgenommen, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Der nach dem Eindampfen erhaltene Rückstand wird an Silicagel chromatographiert und es werden aus Essigester umkristallisiert 2,6 g 3/5,21-Dihydroxy-15«,16a-methylen-5-pregnen-20-on vom Schmelzpunkt 174,5—179,5 °C erhalten.

f) 2,0 g 3yj,21-Dihydroxy-15a,16a-methylen-5-pregnen-20-on werden in 20 ml Dimethylformamid und 2 ml Acetanhydrid gelöst, mit 1,28 g Bleiacetat versetzt und 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wird dann in Eiswasser eingerührt, der ausgefallene Niederschlag abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Aus Essigester umkristallisiert werden 1,8 g 3/3-Hydroxy-21-acetoxy-15a,16a-methylen-5-pregnen-20-on vom Schmelzpunkt 168,5—169,5 °C erhalten.

g) 500 mg 3/?-Hydroxy-21-acetoxy-15a,16a-methylen-5-pregnen-20-on werden in 25 ml Toluol und 1 ml Cyclo-hexanon mit einer Lösung von 100 mg Aluminiumisopropy-lat in 2 ml Toluol versetzt und 45 Minuten unter langsamem Abdestillieren erhitzt. Es wird dann mit Äther verdünnt, mit verdünnter Schwefelsäure und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen und Eindampfen wird an Silicagel chromatographiert und es werden umkristallisiert aus Diisopropyläther 275 mg 21-Acetoxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion vom Schmelzpunkt 124—125 °C erhalten.

Präparat 3

a) Zu 2,5 ml auf —40 °C gekühltem Dimethylformamid werden 2,5 ml flüssiger Fluorwasserstoff gegeben, danach 250 mg N-Bromsuccinimid zugegeben und dann 500 mg 3/?-Hydroxy-21-acetoxy-15a,16a-methylen-5-pregnen-20-on gelöst in 5 ml Methylenchlorid eingetragen. Es wird dann 5 Minuten bei —15 °C nachgerührt, in gesättigte Kalium-hydrogencarbonatlösung eingegossen und mit Methylenchlorid extrahiert. Nach dem Trocknen und Eindampfen werden 700 mg rohes 6/?-Fluor-5-brom-3/?-hydroxy-21-acetoxy-15«,16a-methylen-5a-pregnan-20-on erhalten.

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b) 700 mg 6/?-Fluor-5-brom-3/5-hydroxy-21-acetoxy-15a,16a-methylen-5a-pregnan-20-on werden in 15 ml Aceton mit 0,55 ml Chromschwefelsäure (hergestellt aus 267 g Chromsäure, 400 ml Wasser, 230 ml konzentrierter Schwefelsäure aufgefüllt zu 1 Liter) versetzt und 10 Minuten bei Raumtemperatur nachgerührt. Es wird dann in Eiswasser eingerührt, der Niederschlag abfiltriert, in Methylenchlorid aufgenommen und getrocknet. Nach dem Eindampfen werden 700 mg rohes 6/?-Fluor-5-brom-21-acetoxy-15a,16a-methylen-5 a-pregnan-3,20-dion erhalten.

c) 700 mg 6/?-Fluor-5-brom-21-acetoxy-15a,16a-methy-len-5a-pregnan-3,20-dion werden in 15 ml Essigsäure 3 Stunden bei 30 °C gerührt, es werden dann 300 mg kristallines Natriumacetat zugesetzt und weitere 10 Minuten bei

30 °C gerührt. Anschliessend wird in Eiswasser eingerührt, der ausgefallene Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und in Methylenchlorid aufgenommen. Nach dem Trocknen und Eindampfen wird der Rückstand an Silicagel chromatographiert und es werden umkristallisiert aus Düso-propyläther 150 mg 6a-Fluor-21-acetoxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion vom Schmelzpunkt 155,5—157,5 °C erhalten.

Beispiel 1

Ein 20 1-GIasfermenter wird mit 141 einer Nährlösung aus 3% Glucose, 1% Cornsteep liquor, 0,2% NaNC>3, 0,1% KH2PO4, 0,2% K2HPO4, 0,05o/o MgS04, 0,002% FeS04 und 0,05% KCl beschickt, durch halbstündiges Erhitzen auf 120 °C sterilisiert und nach dem Abkühlen mit 900 ml einer 3 Tage alten Schüttelkolbenkultur von Pellicularia filamentosa f. sp. sasakii, IFO 6675, beimpft. (Die Schüttelkolbenkultur wird durch Inoculieren von 900 ml des gleichen Mediums mit einer Abschwemmung einer 7-tägigen Schräg-agarkultur hergestellt). Nach 12stündiger Vermehrung bei 29 °C unter den vorangehend beschriebenen Bedingungen wird eine sterilfiltrierte Lösung von 17,21-Dihydroxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion in 100 ml Dimethylformamid zugesetzt. Nach weiterer 36stündiger Fermentation wird die Kulturbrühe über Gaze abfiltriert. Der Mycelrückstand wird mehrmals mit Wasser gewaschen. Filtrat und Waschwasser werden mit Methylisobutylketon extrahiert und wie im Beispiel 2 d) beschrieben aufgearbeitet. Das Rohprodukt wird an Kieselgel mit einem Gradientensystem Hexan-Aceton chromatographiert. Man erhält nach Umkristallisieren aus Essigester 1,2 g ll/9,17,21-Trihydroxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion vom Schmelzpunkt 209—210 °C. Aus den polaren Fraktionen wird nach Umkristallisieren aus Diisopropyläther/Aceton 22 mg lla,17,21-Trihydroxy-15a,16«-methylen-4-pregnen-3,20-dion vom Schmelzpunkt 214-215 °C erhalten.

Beispiel 2

Ein 21-Erlenmeyerkolben wird mit 500 ml einer Nährlösung, bestehend aus 1,5% Pepton, 1,2% Cornsteep liquor und 0,2% MgSC>4, beschickt, sterillisiert und mit der Abschwemmung einer 3 Tage alten Schrägagarkultur von Bacillus lentus ATCC 13 805 beimpft. Nach 48 Stunden Schütteln auf einem Rotationsschüttler (165 Umdrehungen pro Minute) bei 30 °C werden 50 ml der Kultur unter sterilen Bedingungen entnommen, in einen 21-Erlenmeyerkolben mit 500 ml einer sterilen Nährlösung, bestehend aus 0,1% Hefeextrakt, 0,5% Cornsteep liquor und 0,05% Stärkezucker, überführt und 24 Stunden geschüttelt. Zehn 21-Erlenmeyerkolben, beschickt mit je 500 ml des gleichen Mediums, werden jeweils mit 50 ml der erhaltenen Vorkultur beimpft, nach 6 Stunden jeweils mit einer Lösung von 100 mg 11/?,17,21-Trihydroxy-15a,16a-methyIen-4-pregnen-3,20-dion in 4 ml Dimethylformamid beschickt und 24 Stunden bei 30 °C und 165 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Die Kulturbrühen werden vereinigt und mit Methylisobutylketon extrahiert.

Die Extrakte ergeben nach Evaporieren 1,2 g Rohprodukt, das aus Diisopropyläther/Aceton umkristallisiert, 11/3,17,21-Trihydroxy-15a,16a-methylen-l,4-pregnadien-3,20-dion vom Schmelzpunkt 205—207 °C liefert.

Beispiel 3

Ein 2 1-Erlenmeyerkolben mit 500 ml einer sterilen Nährlösung, bestehend aus 1% Cornsteep liquor, 1,25% Sojabohnenmehl und 0,005% Sojaöl, wird mit der Abschwemmung einer 10 Tage alten Schrägagarkultur von Aspergillus ochraceus ATCC 1008 beimpft und 72 Stunden bei 30 °C und 165 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Mit je 50 ml dieser Kultur werden sieben 21-Erlenmeyerkolben, beschickt mit je 500 ml des gleichen Mediums, beimpft und nach 16 Stunden mit je 100 mg 17,21-Dihydroxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion in 4 ml Dimethylsulfoxyd1 versetzt. Nach 21 Stunden Kontaktzeit werden die vereinigten Kulturbrühen ohne Mycelabtrennung mit Methylisobutylketon extrahiert. Die Extrakte ergeben nach Evaporieren 992 mg Rohprodukt, welches nach Umkristallisieren 331 mg IIa,17, 21-Trihydroxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion vom Schmelzpunkt 213—215 °C ergibt.

Beispiel 4

Unter den Bedingungen des Beispiels 2 werden in sechs 2 1-Erlenmeyerkolben aus 600 mg 11 a, 17,21-Trihydroxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion durch Fermentation mit Bacillus lentus ATCC 13 805 680 mg rohes Dehydrierungsprodukt erhalten, welches nach Aufreinigung über präparative Dünnschichtchromatographie an Kieselgelplatten im System Chloroform/Methanol 95 + 5 reines lla,17,21-Trihydroxy-15a,16a-methylen-l,4-pregnadien-3,20-dion vom Schmelzpunkt 225—227 °C ergibt.

Beispiel 5

Unter Bedingungen wie im Beispiel 2 beschrieben wird mit Corynebacterium simplex ATCC 6946 die 1,2-Dehydrie-rung von lla,17,21-Trihydroxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion erzielt.

Beispiel 6

Ein Glasfermenter mit 201 Fassungsvermögen wird mit 15 1 einer Nährlösung aus 4,4% Glucose (Stärkezucker), l"/o Malzextrakt, 0,3% NaNOs, 0,1% KH2PO4, 0,05% KCl, 0,5% MgSC>4, 0,002% FeSC>4 und 0,5% Cornsteep liquor beschickt, durch halbstündiges Erhitzen auf 120 °C sterilisiert und nach dem Abkühlen mit einer 3-tägigen Schüttelkolbenkultur von Curvularia lunata NRRL 2380 beimpft. (Die Schüttelkolbenkultur wird durch Inoculieren von 250 ml des gleichen Mediums mit der Abschwemmung einer 7 Tage alten Schrägagarkultur hergestellt.) Nach 48-stündiger Vermehrung bei 30 °C unter Rühren (220 Umdrehungen pro Minute) und Belüftung (15 Liter pro Minute) werden 900 ml der erzeugten Kultur unter sterilen Bedingungen entnommen und in einen gleich grossen Fermenter mit 141 des gleichen Mediums überführt. Nach 12 Stunden werden 3 g 21-Acetoxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion — in 100 ml Dimethylformamid gelöst — zugesetzt und weitere 28 Stunden fermentiert. Man arbeitet auf wie in Beispiel 3 beschrieben und erhält 2,7 g Rohprodukt, welches durch Säulenchromatographie an Kieselgel aufgetrennt wird und das ll|ß,21-Dihydroxy-15ö,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion liefert.

Beispiel 7

Unter den Bedingungen des Beispiels 2 werden in zwei 21-Erlenmeyerkolben 200 mg ll/?,21-Dihydroxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion mit Bacillus lentus ATCC 13 805 zum ll/?,21-Dihydroxy-15a,16a-methylen-l,4-preg-nadien-3,20-dion dehydriert.

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30

35

40

45

50

55

60

65

7

623 062

Beispiel 8

Unter den Bedingungen des Beispiels 6 werden 3 g 6a-Fluor-21-acetoxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion mit Curvularia lunata NRRL 2380 fermentiert und aufgearbeitet. Das Rohprodukt, 2,4 g, wird durch Säulenchromatographie aufgetrennt und ergibt das 6a-Fluor-ll/?,21-di-hydroxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion.

Beispiel 9

Unter den Bedingungen des Beispiels 2 werden in zwei 2 1-Erlenmeyerkolben 200 mg 6«-Fluor-11 /3,21-dihydroxy-15a, 16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion mit Bacillus lentus ATCC 13 805 zum 6a-Fluor-ll/?,21-dihydroxy-15a,16a-methylen~ l,4-pregnadien-3,20-dion dehydriert.

Beispiel 10

200 mg ll/?,17,21-Trihydroxy-15a,16a-methylen-4-preg-nen-3,20-dion werden in 1 ml Pyridin mit 0,5 1 Acetanhydrid 18 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Es wird dann in Eiswasser eingerührt, der ausgefallene Niederschlag abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Es werden 210 mg 11/j, 17-Dihydroxy-21-acetoxy- 15 a, 16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion erhalten.

Beispiel 11

100 mg ll/?,17,21-Trihydroxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion werden in 1 ml Pyridin mit 0,5 ml Buttersäureanhydrid 18 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Es wird dann in Eiswasser eingerührt, vom ausgeschiedenem Öl abdekantiert und dieses dann in Methylenchlorid aufgenommen. Nach präparativer Dünnschichtchromatographie werden 115 mg ll/3,17-Dihydroxy-21~ butyryloxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion erhalten.

Beispiel 12

250 mg ll/?,17,21-Trihydroxy-15a,16a-methylen-l,4-

pregnadien-3,20-dion werden in 1,5 ml Pyridin mit 0,75 ml Capronsäureanhydrid stehengelassen. Es wird dann wie in Beispiel 11 beschrieben aufgearbeitet und aufgereinigt. Es werden 210 mg 11 ß, 17-Dihydroxy-21-hexanoyloxy- 15 a, 16 a-5 methylen-l,4-pregnadien-3,20-dion erhalten.

Beispiel 13

250 mg 1 lß,21-Dihydroxy-15a, 16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion werden in 1,5 ml Pyridin mit 0,75 ml Önanthsäure-io anhydrid versetzt und 18 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Es wird dann wie in Beispiel 11 beschrieben umgesetzt und aufgearbeitet. Es werden 170 mg 11/5-Hy-droxy-21-heptanoyloxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion erhalten.

15 Beispiel 14

180 mg ll/?,21-Dihydroxy-15a,16a-methylen-l,4-pregna-dien-3,20-dion werden wie in Beispiel 10 beschrieben mit Acetanhydrid in Pyridin umgesetzt und aufgearbeitet. Es werden 145 mg 1 ly5-Hydroxy-2 l-acetoxy-15a, 16a-methylen-20 l,4-pregnadien-3,20-dion erhalten.

Beispiel 15

200 mg 6a-Fluor-ll/3,21-dihydroxy-15a,16a-methylen-4-pregnen-3,20-dion werden in 2 ml Pyridin mit 0,25 1 Pi-25 valinsäurechlorid versetzt und 18 Stunden bei 5 °C stehengelassen. Es wird wie in Beispiel 11 beschrieben umgesetzt und aufgearbeitet. Es werden 130 mg 6a-Fluor-11 /J-hydroxy-2 l-trimethylacetoxy- 15 a, 16 a-methylen-4-pregnen-3,20-dion erhalten.

30 Beispiel 16

200 mg 6a-Fluor-ll/j,21-dihydroxy-15a,16a-methylen-l,4-pregnadien-3,20-dion werden wie in Beispiel 11 beschrieben mit Buttersäureanhydrid in Pyridin umgesetzt 35 und aufgearbeitet. Es werden 150 mg 6a-FIuor-ll/?-hydroxy-21-butyryloxy-15a,16a-methylen-l,4-pregnadien-3,20-dion erhalten.

M

Claims

623 062

2

PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von neuen Methylen-steroiden der Formel ch5R~

12 2

c=o

2 (D

0

i

I

X

worin

X ein Wasserstoffatom, ein Fluoratom oder eine Methyl-gruppe,

Y eine Hydroxymethylengruppe,

Ri ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe oder eine

Alkanoyloxygruppe und R2 ein Wasserstoffatom oder eine freie oder mit einer physiologisch unbedenklichen Säure veresterte Hydroxylgruppe bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel c=o

CH,

(H)

0

( t worin X, Ri und Ra die gleiche Bedeutung wie in Formel I besitzen, mit eineï Kultur eines zur ll-Hydroxylierung befähigten Mikroorganismus fermentiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in erhaltenen Verbindungen vorhandene Estergruppen verseift.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in erhaltenen Verbindungen eine vorhandene 21-Hydroxygruppe mit einer physiologisch unbedenklichen Säure verestert.
4. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel j " c=0

CH,

<IA)

0

t

I

X

worin

X ein Wasserstoffatom, ein Fluoratom oder eine Methylgruppe,

Y' eine Alkanoyloxymethylgruppe,

Ri ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe oder eine

Alkanoylgruppe und Ra ein Wasserstoffatom oder eine freie oder mit einer physiologisch unbedenklichen Säure veresterte Hydroxylgruppe bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass man nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 eine Verbindung der Formel I herstellt und anschliessend die 11-Hydroxygrup-pe entsprechend verestert.
5. Verfahren zur Herstellung von neuen Methylensteroi-den der Formel

CH^

c=o

0

I

X

worin

X ein Wasserstoffatom, ein Fluoratom oder eine Methylgruppe,

Y eine Hydroxymethylengruppe,

Ri ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe oder eine

Alkanoyloxygruppe und R2 ein Wasserstoffatom oder eine freie oder mit einer physiologisch unbedenklichen Säure veresterte Hydroxylgruppe bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man nach

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

dem Verfahren gemäss Anspruch 1 eine Verbindung der f*8

c=o

'CSE

0

i

I

X

herstellt, worin die Substituenten weiter oben beschrieben sind, und diese zur Einführung der /\M-Bmdung in 1,2-Stellung dehydriert.