CH633562A5 - Verfahren zur herstellung neuer kortikoide. - Google Patents

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CH633562A5
CH633562A5 CH1500577A CH1500577A CH633562A5 CH 633562 A5 CH633562 A5 CH 633562A5 CH 1500577 A CH1500577 A CH 1500577A CH 1500577 A CH1500577 A CH 1500577A CH 633562 A5 CH633562 A5 CH 633562A5
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Klaus Dr Kieslich
Joachim-Friedrich Dr Kapp
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Schering Ag
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Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung neuer, pharmakologisch wirksamer Kortikoide, die als Arzneimittel 45 verwendet werden können.
Die neuen Kortikoide weisen die folgende Formel I auf
CH-OH
I 2
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c=o
(II),
worin
R2 weiter oben definiert ist und
Ri Wasserstoff oder einen physiologisch unbedenklichen Säurerest darstellt,
durch Fermentation mit 1 lß-hydroxylierenden Mikroorganismen entsprechend hydroxyliert, wobei eine gegebenenfalls vorhandene 21-Acyloxygruppe verseift wird, und anschliessend die A'-Doppelbindung durch Dehydrierung einführt.
2. Verfahren zur Herstellung von neuen Kortikoiden der allgemeinen Formel IA
CD,
worin
X eine ß-Hydroxymethylengruppe ist und
R.2 ein Fluoratom, ein Chloratom oder die Methylgruppe bedeutet.
Weitere neue, erfindungsgemäss herstellbare Kortikoide besitzen die folgende Formel IA
CH,OE,
I 2 1
e=o
R,
worin
X eine ß-Hydroxymethylengruppe ist,
Ri einen physiologisch unbedenklichen Säurerest darstellt und
R: ein Fluoratom, ein Chloratom oder die Methylgruppe bedeutet.
Als physiologisch unbedenkliche Säurereste R kommen vorzugsweise Acylgruppen mit 1 bis 16 Kohlenstoffatomen, Sulfatgruppen oder Phosphatgruppen in Betracht. Geeignete Acylgruppen sind beispielsweise solche, die sich von gradket-tigen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Mono- oder Dicarbonsäuren ableiten, welche in üblicher Weise, beispielsweise durch Hydroxygruppen, Ami-nogruppen oder Halogenatome substituiert sein können. Ferner eignen sich als Acylgruppen auch Reste cycloaliphati-scher, aromatischer, gemischt aromatisch-aliphatische oder heterocyclischer Säuren, die ebenfalls in üblicher Weise substituiert sein können. Als geeignete Acylgruppen seien beispielsweise genannt:
Die Formyl-, Acetyl-, Propionyl-, Butyryl-, Pentanoyl-, Hexanoyl-, Octanoyl-, Undecanoyl-, Dimethylacetyl-, Tri-methylacetyl-, Diäthylacetyl-, tert.-Butylacetyl-, Benzoyl-, Phenacetyl-, Cyclopentylpropionyl-, Hydroxyacetyl-, Monochloracetyl-, Dichloracetyl-, Trichloracetyl-, ferner die Dimethylaminoacetyl-, die Trimethylaminoacetyl-, die Di-äthylaminoacetyl-, die Piperidinoacetyl-, die Nicotinoyl-, die co-Carboxypropionyl- und die co-Carboxy-pentanoylgruppe.
Zur Herstellung wasserlöslicher Wirkstoffe können die 21-AcyVerbindungen mit einer basischen Stickstoffgruppe im Acylrest in die entsprechenden Säureadditionssalze, wie zum Beispiel die Hydrochloride, Hydrobromide, Sulfate, Phosphate, Oxalate, Tartrate oder Maleate überführt werden. Ferner lassen sich die 21 -Carbonsäuremonoester sowie die Schwefelsäure- und Phosphorsäureester zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit in ihre Alkalisalze, wie z.B. die Natriumoder Kaliumsalze oder in die Ammoniumsalze überführen.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen Kortikoide ist dadurch gekennzeichnet, dass man ein Steroid der allgemeinen Formel II
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|2l
C=0
*2
worin
R2 weiter oben definiert ist und
Ri Wasserstoff oder einen physiologisch unbedenklichen Säurerest darstellt,
durch Fermentation mit 11 ß-hydroxylierenden Mikroorganismen entsprechend hydroxyliert, wobei eine gegebenenfalls vorhandene 21-Acyloxygruppe verseift wird, und anschliessend die A'-Doppelbindung durch Dehydrierung einführt.
Die weiter oben beschriebenen Verbindungen der Formel IA werden erfindungsgemäss durch entsprechende Acylierung von erhaltenen Verbindungen der Formel I hergestellt.
Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens kann man die übliche Fermentation mit 11 ß-hydroxylierenden Mikroorganismen verwenden.
Für die 1 lß-Hydroxylierung können beispielsweise Pilzstämme der Gattung Curvularia (z.B. Curvularia lunata), Cunninghamella (z.B. Cunninghamella bainieri, Cunningha-mella elegans, Cunninghamella echinolata und Cunninghamella blackesleana), Absidia (z.B. Absidia orchidis und Absidia coerula), Helmintosporium, Rhizoctonia (z.B. Rhizoctonia solani), Verticillium (z.B. Verticillium theobromae), Stachylidium (z.B. Stachylidium bicolor), Pellicularia (z.B. Pellicularia filamentosa) oder Colletotrichum (z.B. Colletotrichum pisi) verwendet werden. Die Fermentation mit diesen Mikroorganismen wird gewöhnlich unter den üblichen Bedingungen durchgeführt. Bei dieser Umsetzung wird eine in der 21-Position ständige Acylgruppe abgespalten.
Die anschliessende Dehydrierung der in der 1-Position gesättigten A4-6-Steroide der allgemeinen Formel I kann sowohl mittels mikrobiologischer Arbeitsmethoden als auch mittels rein chemischer Methoden durchgeführt werden. So kann man beispielsweise die genannten Steroide unter den üblichen Bedingungen mit Bakterienkulturen der Gattungen Bacillus (z.B. Bacillus lentus oder Bacillus spaericus) oder Artrobacter (z.B. Artrobacter simplex) in der 1-Position dehydrieren. Andererseits ist es aber auch möglich, die A'-Dehydrierung in der Weise durchzuführen, dass man die Steroide mit den für diese Reaktion üblichen Oxydationsmitteln, wie z.B. Selendioxyd oder 2,3-Dichlor-5,6-dicyanoben-zochinon in inerten Lösungsmitteln erhitzt.
Ferner kann man entsprechende 3-Keto-steroide in an sich bekannter Weise in der 2-Position bromieren und aus den erhaltenen Bromsteroiden Bromwasserstoff abspalten.
Die anschliessende Veresterung freier Hydroxylgruppen in der 21-Position kann ebenfalls mit Hilfe der an sich bekannten Arbeitsmethoden erfolgen. So kann man beispielsweise die Hydroxysteroide mit Acylchloriden oder Acyl-anhydriden in Gegenwart von Säuren, wie zum Beispiel
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Chlorwasserstoff, p-Toluolsulfonsäure, Trifluoressigsäure oder in Gegenwart von Basen, wie Kaliumcarbonat, Pyridin, Kollidin oder p-Dimethylaminopyridin verestern. Andererseits ist es möglich, die Hydroxyverbindungen mit Carbonsäuren in Gegenwart von Trifluoressigsäureanhydrid zu verestern.
Aus den 21-Hydroxyverbindungen der allgemeinen Formel I können in an sich bekannter Weise die Alkalisulfate der 21-Monoschwefelsäureester hergestellt werden, beispielsweise in dem man die 21-Hydroxyverbindungen mit Schwe-feltrioxyd in Pyridin umsetzt, und den erhaltenen Schwefelsäureester durch Behandeln mit Alkalibasen in das Alkalisalz überführt.
Ferner kann man aus den 21-Hydroxyverbindungen der allgemeinen Formel I in an sich bekannter Weise die Alkalisalze der 21 -Monophosphorsäureester herstellen, indem man beispielsweise die 21-Hydroxyverbindungen mit Sulfonsäu-rechlorid in 21-Stellung verestert, die 21-Sulfonate mit Alka-lijodid in Aceton in die 21 -Jodverbindungen überführt, die Jodverbindungen mit Phosphorsäure in Gegenwart einer organischen Base umsetzt und die erhaltenen Phosphorsäuremonoester mit Alkali in die Dialkalimetallsalze überführt.
Die neuen Kortikoide der allgemeinen Formeln I und IA besitzen, wie bereits erwähnt, eine gute antiphlogistische Wirksamkeit und zeichnen sich durch eine günstige Dissoziation zwischen erwünschter entzündungshemmender Wirksamkeit und unerwünschten thymolytischen, katabolen und mineralkortikoiden Nebenwirkungen aus.
Die erwünschte entzündungshemmende Wirksamkeit wurde mit Hilfe des bekannten Adjuvans-Ödem-Tests ermittelt:
SPF-Ratten im Gewicht von 130 bis 150 g werden zur Erzeugung eines Entzündungsherdes 0,1 ml einer 0,5%igen Mycobacterium butyricum Suspension (erhältlich von der amerikanischen Firma Difko) in die rechte Hinterpfote injiziert. Vor der Injektion misst man das Pfotenvolumen der Ratten. 24 Stunden nach der Injektion wird das Pfotenvolumen zur Bestimmung des Ausmasses des Ödems abermals gemessen. Anschliessend appliziert man den Ratten per os unterschiedliche Mengen der Testsubstanz. Nach weiteren 24 Stunden wird das Pfotenvolumen erneut ermittelt.
Aus den erhaltenen Pfotenvolumina wird in üblicher Weise die prozentuale Ödem-Hemmwirkung ermittelt. In diesem Test zeigt das erfindungsgemässe 1 lß,21-Dihydroxy-6,16a-dimethyl-l,4,6-pregnatrien-3,20-dion bei einer Dosis von 7,5 mg/kg Körpergewicht eine 50%ige Ödem-Hemmwir-kung, während das als Vergleichssubstanz dienende handelsübliche Fluocortolon (=6-Fluor-l lß,21-dihydroxy-16a-methyl-l,4-pregnadien-3,20-dion bei einer Dosis von
10 mg/kg Körpergewicht eine 50%ige Ödem-Hemmwirkung zeigt.
Die unerwünschten Nebenwirkungen wurden mittels des bekannten Thymolysetests ermittelt.
Zur Bestimmung des thymolytischen Effektes werden SPF-Ratten im Gewicht von 70 bis 110 g unter Äthernarkose adre-nalektomiert. 6 Tiere bilden jeweils eine Testgruppe, welche jeweils über 3 Tage eine definierte Menge Testsubstanz oral appliziert bekommen. Am vierten Tag werden die Tiere getötet und ihr Thymus-Gewicht bestimmt. Die Kontrolltiere werden in der gleichen Weise behandelt, erhalten aber keine Testsubstanz. Aus den erhaltenen Thymusgewichten wird in üblicher Weise der prozentuale thymolytische Effekt errechnet.
Als Vergleichssubstanz dient wiederum das 6a-Fluor-
11 ß,21 -dihydroxy-16a-methyl-1,4-pregnadien-3,20-dion, welches bei einer Dosis von 1,0 mg/kg Körpergewicht eine 50%ige Thymolysewirkung zeigt. Demgegenüber verursacht das erfindungsgemässe 1 lß,21-Dihydroxy-6,16a-dimethyl-
1,4,6-pregnatrien-3,20-dion erst bei einer Dosis von 3 mg/kg Körpergewicht eine 50%ige Thymolyse.
Dass die erfindungsgemäss erhaltenen Verbindungen geringere systemische Nebenwirkungen verursachen, wurde auch mittels des bekannten Lebergycogentests ermittelt.
Die neuen Kortikoide sind in Kombination mit den in der galenischen Pharmazie üblichen Trägermitteln gut geeignet zur Behandlung zum Beispiel von a) lokal: Kontaktdermatitis, Ekzemen der verschiedensten Art, Neurodermitis, Erythrodermie, Verbrennungen 1. Grades, Pruritus vulvae et ani, Rosacea, Erythematodes cura-neus, Psoriasis, Liehen ruber planus et verrucosus;
b) oral: akute und chronische Polyarthritis, Neurodermi-tits, Asthma bronchiale, Heufieber u.a.
Darüberhinaus eignen sich die erfindungsgemäss hergestellten Kortikoide auch zur Behandlung allergischer Erkrankungen der Atemwege, wie zum Beispiel der Rhinitis oder des Bronchialasthmas.
Die Herstellung der Arzneimittelspezialitäten kann in üblicher Weise erfolgen, indem man die Wirkstoff mit geeigneten Zusätzen, Trägersubstanzen und Geschmackskorrigen-tien in die gewünschte Applikationsformen wie Tabletten, Dragees, Kapseln, Lösungen, Salben, Inhalationsmitteln usw. überführt.
Für die orale Anwendung eignen sich insbesondere Tabletten, Dragees und Kapseln, welche beispielsweise 0,1-50 mg Kortikoide und 50 mg-2 g eines pharmakologisch unwirksamen Trägers, wie zum Beispiel Laktose, Amylose, Talkum, Gelatine, Magnesiumstearat und ähnliches, sowie die üblichen Zusätze enthalten. Für die topische Anwendung eignen sich Puder, Salben, Aerosole und ähnliche Zubereitungen, die vorzugsweise 0,01 bis 2% des Kortikoids enthalten.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1
a) Eine Lösung von 24,0 g 3ß-Hydroxy-6,16a-dimethyl-5-pregnen-20-on in 840 ml Chloroform wird mit 4,8 g wasserfreiem Natriumsulfat und 15,6 g wasserfreiem Natriumacetat versetzt und auf +2°C gekühlt. Man tropft in die Mischung 24 ml 40%ige Peressigsäure. Während des Eintropfens werden weitere 4,8 g wasserfreies Natriumsulfat und 15,6 g wasserfreies Natriumacetat zugegeben.
Man rührt die Reaktionsmischung noch eine Stunde lang bei 5°C und eine weitere Stunde lang bei 15°C, neutralisiert sie mit 5%iger wässriger Natriumhydrogenkarbonatlösung, trennt die organische Phase ab, wäscht sie mit Wasser, trocknet sie über Natriumsulfat und engt sie im Vakuum ein. Der Rückstand wird aus Äthylacetat umkristallisiert und man erhält 21,2 g 5a,6a-Epoxy-3ß-hydroxy-6ß,16a-dimethyl-pregnan-20-on vom Schmelzpunkt 185-188°C.
b) Zu einer Lösung von 25,0 g 5a,6a-Epoxy-3ß-hydroxy-6ß,16cc-dimethyl-pregnan-20-on in 350 ml absolutem Methylenchlorid tropft man unter Rühren unter Stickstoff eine aus 2,1 g Natrium und 60 ml Äthanol hergestellte Natriumäthy-latlösung und anschliessend eine Lösung von 25 ml Oxalsäu-rediäthylester in 15 ml absolutem Methylenchlorid.
Man erwärmt die Reaktionsmischung 8 Stunden lang auf 60°C, engt sie im Vakuum zur Trockne ein, kocht den Rückstand mit 700 ml Hexan und 70 ml Methylenchlorid aus und erhält 39 g kristallines Rohprodukt.
Das Rohprodukt wird in 600 ml Methanol gelöst, auf -L5°C gekühlt und innerhalb einer Stunde unter Stickstoff s
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und Rühren mit einer Lösung von 19,5 g Jod in 250 ml Methanol tropfenweise versetzt. Man rührt die Mischung noch 90 Minuten lang bei -15°C, und tropft dann innerhalb von 40 Minuten eine Lösung von 4,3 g Natriummethylat in 45 ml Methanol zu. Dann rührt man die Mischung weitere 90 Minuten, und tropft innerhalb von zweieinhalb Stunden 140 ml Wasser zu, wobei man das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen lässt. Das abgeschiedene Produkt wird in einer Mischung von Aceton-Essigester aufgenommen, die wässrige Phase mit Essigester extrahiert und die vereinigten organischen Phasen im Vakuum eingeengt.
Der erhaltene Rückstand wird in 600 ml Aceton gelöst, auf 0°C gekühlt und unter Rühren mit 38 ml Eisessig und 64 ml Triäthylamin versetzt. Man erhitzt die Mischung zwei Stunden lang unter Rückfluss, destilliert 350 ml Aceton ab und versetzt sie mit 1 Liter Wasser. Die wässrige Phase wird abdekantiert und der Rückstand im Vakuum getrocknet. Der erhaltene Rückstand wird mit Hexan gewaschen, getrocknet und ergibt 22,6 g 21 -Acetoxy-5a,6a-epoxy-3ß-hydroxy-6ß,16a-dimethyl-pregnan-20-on vom Zersetzungspunkt 80-85°C.
c) Ein Glasfermenter mit 201 Fassungsvermögen wird mit 151 einer Nährlösung aus 0,3% Hefeextrakt, 0,5% corn-steep liquor und 0,2% Stärkezucker beschickt, durch 30 Minuten langes Erhitzen auf 120°C sterilisiert und nach dem Erkalten mit 250 ml einer 2 Tage alten Schüttelkalbenkultur von Fla-vobacterium dehydrogenans (ATCC 13 930) beimpft. (Diese Schüttelkultur wird durch Inoculieren von 250 ml des gleichen Mediums mit einer Abschwemmung einer 7 Tage alten Schrägagarkultur hergestellt.) Man rührt die Vorkultur mit 220 Umdrehungen pro Minute 24 Stunden lang unter Belüften (1/Stunde) entnimmt ihr 1,81 Kultur und überführt diese in einen 501 Fermenter, der mit 301 des gleichen Mediums beschickt ist. Man rührt die Kultur unter Belüften (151 pro Minute) mit 220 Umdrehungen pro Minute 6 Stunden lang bei 30°C, versetzt sie mit einer sterilfiltrierten Lösung von 14 g 21-Acetoxy-5cc,6a-epoxy-3ß-hydroxy-6ß,16a-dimethyl-pregnan-20-on im 200 ml Dimethyl-formamid und fermentiert unter Rühren und Belüften weitere 17 Stunden lang.
Nach beendeter Fermentation wird die Kulturbrühe mit Methylisobutylketon extrahiert, der Extrakt im Vakuum eingeengt, der Rückstand mit Hexan gewaschen und aus Essigester umkristallisiert. Man erhält 16 g 6a,21 -Dihydroxy-6ß,16a-dimethyl-4-pregnen-3,20-dion vom Schmelzpunkt 220-223°C.
d) 7,7 g 6a,21 -Dihydroxy-6ß, 16a-dimethyl-4-pregnen-3,20-dion werden in 1,3 1 absolutem Benzol gelöst, mit 3,5 g p-Toluolsulfonsäure versetzt und 2 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt, wobei das gebildete Wasser mittels Wasserabscheider entfernt wird. Dann filtriert man, wäscht das Filtrat mit 5%iger wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser und engt es im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird aus Diisopropyläther umkristallisiert und man erhält 4,8 g 21-Hydroxy-6,16a-dimethyl-4,6-pregnadien-3,20-dion vom Schmelzpunkt 123-125°C.
e) Ein 21 Erlenmeyerkolben mit 100 ml einer sterilen Nährlösung enthaltend
3% Stärkezucker, 1% corn-steep liquor, 0,2% Natriumnitrat, 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,2% Dikaliumhydrogen-phosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,05% Kaliumchlorid wird mit einer Hyophilkultur von Curvularia lunata NRRL 2380 beimpft und zwei Tage lang bei 30°C mit einer Frequenz von 145 Umdrehungen pro Minute geschüttelt.
Ein Glasfermenter mit 14,51 des gleichen Nährmediums wird mit 0,51 der Vorkultur beimpft und unter Rühren (220 Umdrehungen pro Minute) und Belüften (151 pro Minute) 6 Stunden lang bei 30°C germiniert. Dann setzt man der Kultur eine sterilfiltrierte Lösung von 3 g 21-Hydroxy-6,16a-dimethyl-4,6-pregnadien-3,20-dion in 150 ml Dimethyl-formamid zu und fermentiert unter Rühren und Belüften weitere 136 Stunden lang.
Dann extrahiert man die Kulturbrühe mit Methylisobutylketon, engt den Extrakt im Vakuum ein, wäscht den Rückstand mit Hexan und reinigt ihn durch Chromatographie über eine Kieselgelsäule. Das erhaltene Produkt wird aus Essigester umkristallisiert und ergibt 841 mg llß,21-Dihy-droxy-6,16a-dimethyl-4,6-pregnadien-3,20-dion vom Schmelzpunkt 242-244°C.
0 Ein 21 Erlenmeyerkolben mit 200 ml eines sterilen Nährmediums enthaltend
1,2% cornsteep liquor und 1,5% Pepton wird mit einer Lyophilkultur von Bacillus lentus (ATCC 13 805) beimpft und 2 Tage lang bei 30°C mit 145 Umdrehungen pro Minute geschüttelt.
Ein 201 Glasfermenter mit 101 einer sterilen Nährlösung enthaltend
0,1 % Hefeextrakt, 0,5% cornsteep liquor und 0,2% Glucose wird mit der Vorkultur beimpft, und einen Tag lang unter Belüften (101 pro Minute) bei 30°C mit 220 Umdrehung pro Minute gerührt.
1 Liter der Anzuchtskultur werden in 71 der gleichen Nährlösung in einem gleichgrossen Fermenter überführt. Nach 6stündiger Anzuchtszeit unter Rühren und Belüften setzt man eine sterilfiltrierte Lösung von 800 mg 1 lß,21-Dihy-droxy-6,16a-dimethyl-4,6-pregnadion-3,20-dion in 50 ml Dimethylformamid zu und fermentiert weitere 20 Stunden lang.
Man arbeitet die Reaktionsmischung auf, wie unter a) beschrieben, kristallisiert das erhaltene Rohprodukt aus Di-isopropyläther-Methylenchlorid um und erhält 400 mg 11 ß,21 -Dihydroxy-6,16a-dimethyl-1,4,6-pregnatrien-3,20-dion vom Schmelzpunkt 140-143°C.
Beispiel 2
80 mg 1 lß,21-Dihydroxy-6,16a-dimethyl-1,4,6-pregna-trien-3,20-dion werden mit 2,5 ml absolutem Pyridin und 0,2 ml Acetanhydrid versetzt und 4 Stunden lang bei Raumtemperatur aufbewahrt. Dann giesst man die Reaktionsmischung in 50 ml In Schwefelsäure, extrahiert mit Chloroform, wäscht die Chloroformphase engt sie im Vakuum ein und erhält 65 mg 21-Acetoxy-l lß-hydroxy-6,16a-dimethyl-1,4,6-pregnatrien-3,20-dion.
Beispiel 3
75 mg 11 ß,21-Dihydroxy-6,16a-dimethyl-1,4,6-pregna-trien-3,20-dion werden mit 2,5 ml absolutem Pyridin und 0,2 ml Valeriansäureanhydrid versetzt und 4 Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Man arbeitet die Reaktionsmischung auf, wie im Beispiel 3 beschrieben und erhält 60 mg 11 ß-Hydroxy-6,16a-dimethyI-21 -valeryloxy-1,4,6-pregna-trien-3,20-dion.
Beispiel 4
80 mg 11 ß, 21 -Dihydroxy-6,16a-dimethyl-1,4,6-pregna-trien-3,20-dion werden mit 2,5 ml absolutem Pyridin und 0,25 g Bernsteinsäureanhydrid versetzt und 4 Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt.
Man arbeitet die Reaktionsmischung auf, wie im Beispiel 2 beschrieben und erhält 60 mg21-Hemisuccinyloxy-l lß-hydroxy-6,16a-dimethyl-1,4,6-pregnatrien-3,20-dion.
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Beispiel 5
Unter den Bedingungen des Beispiels le) werden 101 einer Kultur von Cunninghamella elegans (ATCC 9245) angezüchtet, nach 12 Stunden Anzuchtsphase werden 1,9 g 21 -Hydro xy-6,16cc-dimethyl-4,6-pregnadien-3,20-dion in 60 ml Dimethylformamid gelöst, zugesetzt und weitere 62 Stunden lang fermentiert. Man arbeitet die Kulturbrühe auf, wie im Beispiel le) beschrieben und erhält 270 mg 11 (3,21 -Dihydroxy-6,16a-dimethyl-4,6-pregnadien-3,20-dion.
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Beispiel 6
a) Ein 21 Erlenmeyerkolben mit 500 ml einer sterilen Nährlösung enthaltend
1% cornsteep liquor, 1,25% Sojabohnenmehl und 0,005%
Sojaöl wird mit einer Abschwemmung einer 10 Tage alten auf is Maiskörnern gewachsenen Kultur von Aspergillus occhra-ceus ATCC 1008 beimpft und 72 Stunden lang bei 30°C mit 165 Umdrehungen pro Minute geschüttelt.
Mit 250 ml dieser Anzuchtskultur werden in einem 201 Glasfermenter 151 der gleichen Nährlösung beimpft, und 20 unter Rühren (220 Umdrehungen pro Minute) und Belüften (151 pro Minute) 24 Stunden lang bei 30°C germiniert. 900 ml der Vorkultur werden in einen gleichgrossen Fermenter überführt, der mit 141 der gleichen Nährlösung beschickt ist, und unter Belüften bei 30°C 12 Stunden lang gerührt. Dann setzt 2s man der Kultur eine sterilfiltrierte Lösung von 2,75 g 21 -Hydroxy-6,16a-dimethyl-4,6-pregnadien-3,20-dion in 110 ml Dimethylformamid zu und fermentiert weitere 27 Stunden.
Man arbeitet die Kulturbrühe auf, wie im Beispiel le 30 beschrieben und erhält 2,1 g 11 a,21 -Dihydroxy-6,16a-dimethyl-4,6-pregnadien-3,20-dion vom Schmelzpunkt 192-194°C (aus Essigester).
b) Unter den Bedingungendes Beispiels 1 werden in 151 35 Bacillus leutus (ATCC 13 805) Kultur 3 g 1 la,21-Dihydroxy-6,16a-dimethyl-4,6-pregnadien-3,20-dion umgesetzt, aufbereitet und man erhält 1,2 g 11 a,21 -Dihydroxy-6,16a-dimethyl-l,4,6-pregnatrien-3,2Ö-dion vom Schmelzpunkt
171 -172°C (aus Essigester). 40
c) 4 g 11 a,21 -Dihydroxy-6,16a-dimethyl-1,4,6-pregna-trien-3,20-dion werden in 40 ml Dimethylformamid gelöst, mit 400 mg Bleidiacetat und 8,3 ml Essigsäureanhydrid versetzt und 90 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. 45
Dann giesst man die Reaktionsmischung in 300 ml 10%ige Natriumacetatlösung und rührt eine Stunde lang. Man saugt den Niederschlag ab, wäscht ihn mit Wasser, trocknet ihn im Vakuum, kristallisiert ihn aus Essigester-Diisopropyläther um und erhält 3,74 g 21 -Acetoxy-11 a-hydroxy-6,16a- 50
dimethyl-l,4,6-pregnatrien-3,20-dion vom Schmelzpunkt 166-167°C.
Beispiel 7
Eine Lösung von 750 mg 6-Chlor-l lß,21-dihydroxy-16a- ss methyl-l,4,6-pragnatrien-3,20-dion in 5 ml Pyridin versetzt man mit 2,5 ml Buttersäureanhydrid und rührt 15 Stunden bei Raumtemperatur. Nach Zugabe von 1 ml Wasser wird die Lösung 15 Minuten auf dem Dampfbad erhitzt und anschliessend in Eiswasser eingegossen. Das ausgefallene 60 Produkt wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und in Di-chlormethan gelöst. Die Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird auf 15 Kieselgelplatten, 20 cm x 60 cm, 1 mm Schichtdicke chromatographiert. Als Fliessmittel dient 65 Hexan-Essigester (1:1). Nach dem Umkristallisieren aus Aceton-Diisopropylether erhält man 417 g 21-Butyryloxy-6-chlor-11 ß-hy droxy-16a-methyl-1,4,6-pregnatrien-3,20-dion.
Schmelzpunkt 203°C. [aß = + 8PC (Chloroform). UV: £228 = 10900,8255 = 10400, £299 = 9500 (Methanol).
Beispiel 8
750 mg 6-Chlor-l 1 ß,21 -dihydroxy- 16a-methyl-1,4,6-preg-natrien-3,20-dion werden in einem Gemisch aus 5 ml Pyridin und 2,5 ml Valeriansäureanhydrid gelöst. Die Lösung wird 15 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Nach Zugabe von 1 ml Wasser wird 30 Minuten auf dem Dampfbad erhitzt und anschliessend in Eiswasser eingerührt. Nach 3 Stunden wird das ausgefallene Produkt abfiltriert, mit Wasser gewaschen und in Dichlormethan gelöst. Die Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird auf 20 Kieselgelplatten, 20 cm x 60 cm, 1 mm Schichtdicke, chromatographiert. Als Fliessmittel dient Hexan-Essigester (1:1). Nach dem Umkristallisieren aus Aceton-Diisopropylether erhält man 370 mg 6-Chlor-l Iß-hydroxy-16a-methyl-21 -valeryloxy-1,4,6-pregnatrien-3,20-dion. Schmelzpunkt 193°C. [a]" =+ 81°C (Chloroform). UV: 8229 - 11000, £255 = 10600,8299 = 9500 (Methanol).
Beispiel 9
750 mg 6-Fluor-l 1 ß,21-dihy droxy-16a-methyl-1,4,6-preg-natrien-3,20-dion werden, wie im Beispiel 13 beschrieben, in 21 -Butylryloxy-6-fluor-11 ß-hy droxy-16a-methyl-1,4,6-preg-natrien-3,20-dion überführt. Ausbeute 502 mg, umkristallisiert aus Aceton-Diisopropylether. Schmelzpunkt 177°C. Md = + 34° (Chloroform). UV: £228 = 12300, £259 = 11000, £301 = 11000 (Methanol).
Beispiel 10
750 mg 6-Fluor-11 ß,21 -dihy droxy-16a-methyl-1,4,6-preg-natrien-3,20-dion werden, wie im Beispiel 8 beschrieben, in 6-Fluor-11 ß-hy droxy-16a-methyl-21 -valeryloxy-1,4,6-preg-natrien-3,20-dion überführt und aus Aceton-Diisopropylether umkristallisiert. Ausbeute 584 mg. Schmelzpunkt 187°C. [aß5 = + 36°C (Chloroform). UV: 8225 = 11100, £256 = 10600, £299 = 10500 (Methanol).
Beispiel 11
Eine Lösung von 2,0 g 6-Fluor-l lß,21-dihydroxy-16a-methyl-l,4,6-pregnatrien-3,20-dion in 10 ml Pyridin wird nach Zugabe von 1 g Bernsteinsäureanhydrid 2 Stunden auf 120°C erhitzt. Die Reaktionslösung wird in schwefelsäurehaltiges Eiswasser gegossen, der ausgefällte Niederschlag wird abfiltriert und in Essigester gelöst. Die Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der verbleibende Rückstand wird an Kieselgel chromatographiert. Das Produkt wird mit Essigester eluiert und aus Essigester-Diisopropylether umkristallisiert. Man erhält 1,03 g 6-Fluor-11 ß,21 -dihydroxy-16a-methyl-1,4,6-pregnatrien-3,20-dion-21-hydrogensuccinat. Führt man die Reaktion unter Verwendung des entsprechenden 6-Chlor-Derivats durch, so erhält man 6-Chlor-11 ß,21 -dihydroxy-16a-methyl-1,4,6-pregnatrien-3,20-dion-21 -hydrogensuccinat.
Beispiel 12
500 mg 6-Fluor-11 ß,21 -dihydroxy-16a-methyl-1,4,6-preg-natrien-3,20-dion-21 -hydrogensuccinat werden in 20 ml Methanol mit 0,1 N-Natriummethylatlösung in das Natriumsalz überführt. Das Salz wird durch Zugabe von 300 ml Äther gefällt, abgesaugt, mit Äther gewaschen und im Vakuum bei 50°C getrocknet. Man erhält 483 mg 6-Fluor-l lß,21 -dihy-droxy-16a-methyl-1,4,6-pregnatrien-3,20-dion-21 -succinat-natrium. Analog erhält man das 6-Chlor-l lß,21-dihydroxy-16a-methyl-1,4,6-pregnatrien-3,20-dion-21 -succinat-natrium.
Beispiel 13
Ein 2 1-Erlenmeyerkolben, der 500 ml einer 30 Minuten bei 120°C im Autoklaven sterilisierten Nährlösung aus 1% Com steep liquor, 1% Sojapuder und 0,005% Sojaöl, eingestellt auf pH 6,2, enthält, wird mit einer Lyophilkultur von Curvularia lunata (NRRL 2380) beimpft und 72 Stunden bei 30°C auf einem Rotationsschüttler mit einer Schüttelfrequenz von 145 U/Min. geschüttelt. Diese Vorkultur dient zur Beimpfung eines 201-Fermenters, der 141 eines bei 121 °C und 1,1 atü sterilisierten Mediums aus 1% Corn steep liquor, 0,5% Stärkezucker und 0,005% Sojaöl, eingestellt auf pH 6,2, enthält. Unter Zugabe von Silicon SH als Antischaummittel wird bei 29°C unter Belüftung (101/Min.), 0,7 atü Druck und Rühren 220 U/Min. 24 Stunden germiniert. 1 Liter der Kulturbrühe wird unter sterilen Bedingungen in 141 eines wie oben sterilisierten Mediums aus 1% Corn steep liquor, 1,25% Sojapuder und 0,005% Sojaöl überführt und unter gleichen Bedingungen angezüchtet. Nach 12 Stunden wird eine Lösung von 3 g 21-Acetoxy-6-chlor-16cc-methyl-4,6-pregna-dien-3,20-dion in 150 ml Dimethylformamid zugegeben und weiter gerührt und belüftet.
Der Ablauf der Umwandlung wird durch dünnschicht-
7 633562
chromatographische Analyse der Methylisobutylketonex-trakte von Fermenterproben verfolgt, wobei die Abnahme des Ausgangsmaterials beobachtet wird. Nach vollständiger Umwandlung (etwa 30 Stunden) wird der Fermenterinhalt s 2x mit je 101 Methylisobutylketon ausgerührt und der Extrakt bei 50°C Badtemperatur im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Methanol aufgenommen, das nicht gelöste Siliconöl abgeschieden und die Lösung erneut im Vakuum zur Trockne eingeengt. Zur Abtrennung von Neben-lo Produkten wird der ölige Rückstand mittels des linearen Elu-tionsmittelgradienten Methylenchlorid Aceton über eine Kieselgelsäule chromatographiert und anschliessend aus Aceton/Hexan umkristallisiert. Man erhält so 970 mg 6-Chlor-11 ß,21 -dihydroxy-16a-methyl-4,6-pregnadien-3,20-15 dion vom Schmelzpunkt 225°C.
Beispiel 14
Unter den Bedingungen des Beispiels 13 werden 3 g 21 - Acetoxy-6-fluor-16a-methyl-4,6-pregnadien-3,20-dion 20 durch Curvularia lunata umgewandelt zu 840 mg 6-Fluor-11 ß,21 -dihydroxy-16a-methyl-4,6-pregnadien-3,20-dion vom Schmelzpunkt 239°C.
B

Claims (4)

  1. 633 562
  2. 2
    PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von neuen Kortikoiden der allgemeinen Formel I
    CH,oh
    I 2
    c=o
    10
    15
    (i a)
    JEL
    CO,
    20
    worin
    X eine ß-Hydroxymethylengruppe ist und
    R.2 ein Fluoratom, ein Chloratom oder die Methylgruppe bedeutet,
    dadurch gekennzeichnet, dass man ein Steroid der allgemeinen Formel II
    CHo0R7 I 2 1
    C=0
    CH-
    worin
    X eine ß-Hydroxymethylengruppe ist,
    Ri einen physiologisch unbedenklichen Säurerest darstellt und
    25 R2 ein Fluoratom, ein Chloratom oder die Methylgruppe bedeutet,
    dadurch gekennzeichnet, dass man nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 eine Verbindung der Formel I herstellt und diese anschliessend verestert und anschliessend erhal-
    30 tenen Verbindungen gegebenenfalls in die entsprechenden Salze überführt.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man erhaltene 21-Acylverbindungen mit einer basischen Stickstoffgrappe im Acylrest in die entsprechenden Säuread-
    35 ditionssalze überführt.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man erhaltene 21 -Dicarbonsäuremonoester in ihre Alkali- oder Ammoniumsalze überführt.
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