MXPA05001857A - Intermedios esteroideos de 5-androsten-38-ol y procedimientos para su preparacion. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona intermedios esteroideos de 5-androsten-3¦-ol y procedimientos para su preparacion.

Description

INTERMEDIOS ESTEROIDEOS DE 5-ANDROSTEN-3 ?-OL Y PROCEDIMIENTOS PARA SU PREPARACION CAMPO DE LA INVENCION La presente invención proporciona esteroides de 5-androsten-3 ?-ol y procedimientos para su preparación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los intermedios esteroideos a menudo son útiles para producción de agentes farmacéuticos. 5-Androsten-3 ?,7yí?,11 a-tr¡ol-17-ona un intermedio esteroideo útil para la producción de eplerenona.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En general, la presente invención proporciona un procedimiento fúngico práctico para la hidroxilación en 7ß y en 1 1 a de 5-androsten-3 ?-ol-17-ona y otros análogos relacionados de la fórmula general (I) para proporcionar 5-androsten-3,£?,7 ?,11 a-triol-17-ona y otros análogos relacionados de las fórmulas generales (II y IV). En un aspecto, la invención presenta un 7 ?-hidroxiesteroide de la fórmula (II) en el que F¾ es: (1) -H; (2) -CO-R4) en el que Ftt es H o alquilo CrC5; en el que R17 y F½ juntos forman =0 o en el que R17 y R 8 junto con el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo al que están unidos forman un anillo de lactona de la fórmula en el que Z1-Z2 es un enlace simple o un enlace doble. Ejemplos del 7 ?-hidroxiesteroide (II) incluyen, pero sin limitación, 5-androsten-3 ?,7/í?-diol-17-ona y 5,9(11)-androstadien-3£,7j?-diol-17-ona.

En otro aspecto, la invención presenta un 1 1 -hidroxiesteroide de la fórmula (III) en el que f¾ es: (1 ) -H; (2) -CO-R4, en el que R4 es H o alquilo CrC5; en el que R17 y ½ juntos forman =0 o en el que R 7 y R-m junto con el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo al que están unidos forman un anillo de lactona de la fórmula Un ejemplo del 1 1 s-hidroxiesteroide de la fórmula (III) es 5-androsten-3 ?,1 1 a-diol-17-ona. En otro aspecto, la invención presenta un ?ß, a-dihidroxiesteroide de la fórmula (IV) en el que R3 es: (1) -H; (2) -CO-R4, en el que R4 es H o alquilo CrC5; en el que R17 y R18 juntos forman =0 o en el que R17 y R 8 junto con el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo al que están unidos forman un anillo de lactona de la fórmula Un ejemplo del 7yff,11a-dihidroxiesteroide de la fórmula (IV) es 5-androsten-3jff ,7/?, 11 s-trioM 7-ona. Todavía en otro aspecto, la invención presenta un procedimiento para la preparación de un 7^-hidroxiesteroide de la fórmula (II) en el que R3 es: (1) -H; (2) -CO-R4, en el que R es H o alquilo C1-C5; en el que R-i7 y F½ juntos forman =0 o en el que Ri7 y Ris junto con el átomo de carbono C 7 del esqueleto esteroideo al que están unidos forman un anillo de lactona de la fórmula en el que Z1-Z2 es un enlace sencillo o un enlace doble, comprendiendo el procedimiento: (1) poner en contacto un A5-esteroide de la fórmula (I) en el que R3, Ri7, Ri8 y Z1-Z2 son tal como se definen anteriormente, con 7y?-hidroxilasa de Diplodia, por ejemplo Diplodla gossyplna. Ejemplos del 7j?-hidroxiestero¡de (II) incluyen, pero sin limitación, 5-androsten-3£,7/?-diol-17-ona y 5,9(1 IJ-androstadien-S^J^-diol-^-ona. El procedimiento de poner en contacto puede ser mediante fermentación, concentrado celular, células enteras o reacción sin células.

En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento para la preparación de un 11 - idroxiesteroide de la fórmula (III) en el que R3 es: d) -H; (2) -CO-R,, en el que R4 es H o alquilo C^Cs; en el que R17 y R18 juntos forman =0 o en el que R-i7 y R18 junto con el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo al que están unidos forman un anillo de lactona de la fórmula comprendiendo el procedimiento: (1) poner en contacto un A5-esteroide de la fórmula (I) en el que R3) R17 y 18 son tal como se definen anteriormente y en el que Z Z2 es un enlace sencillo, con 11 -hidroxilasa de Aspergillus, por ejemplo Aspergillus ochraceus. Un ejemplo del 1 1 s-hidroxiesteroide es 5-androsten-3 ?,11 < diol-17-ona. El procedimiento de poner en contacto puede ser mediante fermentación, concentrado celular, células enteras o reacción sin células. Todavía en otro aspecto, la invención presenta un procedimiento para la preparación de un 7jff,11a-d¡hidroxiesteroide de la fórmula (IV) en el que R3 es: (1 ) -H; (2) -CO-R , en el que R4 es H o alquilo C1-C5; en el que R17 y R18 juntos forman =0 o en el que R17 y R-|8 junto con el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo al que están unidos forman un anillo de lactona de la fórmula comprendiendo el procedimiento: (1 ) poner en contacto un 7 ?-hidroxiesteroide de la fórmula (II) en el que R3, R17 y R18 son tal como se definen anteriormente y en el que Z1-Z2 es un enlace sencillo, con 11a-hidroxilasa de Aspergillus, por ejemplo Aspergillus ochraceus. Un ejemplo del 7j&,11 -dihidroxiesteroide (IV) es 5-androsten-3 ?,7 1a-triol-17-ona. El procedimiento de poner en contacto puede ser mediante fermentación, concentrado celular, células enteras o reacción sin células. Todavía en otro aspecto más, la invención presenta procedimiento para la preparación de un 7^, 1a-dihidroxiesteroide de la fórmula (IV) (1 ) -H; en el que R4 es H o alquilo C-i-C5; en el que Ri7 y R18 juntos forman =0 o en el que R 7 y R-i8 junto con el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroldeo al que están unidos forman un anillo de lactona de la fórmula comprendiendo el procedimiento: (1) poner en contacto un A5-esteroide de la fórmula (I) en el que R3, R17 y R18 son tal como se definen anteriormente y en el que Z Z2 es un enlace sencillo, con 7 ?-hidrox¡lasa de Diplodia, por ejemplo Diplodia gossypina, produciendo un 7 ?-hidroxiesteroide de la fórmula (II) en el que R3, R17. 18 y Z Z2 son tal como se definen anteriormente; y (2) poner en contacto el 7/?-h¡droxiesteroide (II) de la etapa (I) con 11a-hidroxilasa de Aspergillus, por ejemplo Aspergillus ochraceus. Un ejemplo del 7 ?,11 ar-dihidroxiesteroide (IV) es 5-androsten-3/?,7 ?, cr-triol-17-ona. El procedimiento para la preparación de un 7/5,11 -dihidroxiesteroide (IV), en el que el 7 ?-hidroxiesteroide (II) de la etapa (1) puede no aislarse antes de la puesta en contacto de la etapa (2). En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento para la preparación de un 7/?,1 1 a-dihidroxiestero¡de de la fórmula (IV) en el que F¾ es: (1 ) -H; (2) -CO-R4, en el que R4 es H o alquilo C-i-C5; en el que R 7 y R18 juntos forman =0 o en el que R17 y Ris junto con el átomo de carbono C 7 del esqueleto esteroideo al que están unidos forman un anillo de lactona de la fórmula comprendiendo el procedimiento: (1) poner en contacto un A5-esteroide de la fórmula (I) en el que R3, Ri7 y Ri8 son tal como se definen anteriormente y en el que Z Z2 es un enlace sencillo, con 7 ?,11a-h¡droxilasa(s) de Absidia, por ejemplo Absidia coerulea. Un ejemplo del 7ß,1 ?s-dihidroxiesteroide (IV) es 5-androsten-¾&,7,&,11<7-t.riol-17-ona. El procedimiento de poner en contacto puede ser mediante fermentación, concentrado celular, células enteras o reacción sin células. Todavía en otro aspecto, la invención presenta un procedimiento para la preparación de un 5,9(11)-androstadieno de la fórmula (I) en el que R3 es: (1 ) -H; (2) -CO-R4, en el que R4 es H o alquilo CrC5; en el que R17 y R-|8 juntos forman =0 o en el que R17 y R 8 junto con el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo al que están unidos forman un anillo de lactona de la fórmula y en el que Z1-Z2 es un enlace doble, comprendiendo el procedimiento: (1) proporcionar un compuesto de la fórmula (III) en el que R3, Ri7 y Ri8 son tal como se definen anteriormente; y (2) eliminar el grupo hidroxilo en 1 a para formar el enlace doble entre Z1 y Z2 (Fórmula I). La etapa de proporcionar el compuesto de la fórmula III puede incluir poner en contacto un A5-esteroide de la fórmula (I) en el que R3, Rn y Ris son tal como se definen anteriormente y en el que Z Z2 es un enlace sencillo, con 11 a-hidroxilasa de Aspergillus, por ejemplo Aspergillus ochraceus.

Realizaciones de cada aspecto de la invención pueden incluir uno o más de los siguientes. R3 es H. R3 es -C(0)-CH3. R3 es -C(0)-H. R17 y Ría forman =0. R17, R18 y el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo forman el anillo de lactona que se muestra anteriormente. El anillo de lactona tiene la estereoquímica a ß que se muestra en la fórmula Definiciones v convenciones Las definiciones y explicaciones siguientes son para los términos tal como se usan a lo largo de todo este documento que incluye tanto la memoria descriptiva como las reivindicaciones.

Convenciones para las fórmulas y definiciones de variables Las fórmulas químicas que representan diversos compuestos o fragmentos moleculares en la memoria descriptiva y las reivindicaciones pueden contener sustituyentes variables además de las características estructurales definidas expresamente. Estos sustituyentes variables se identifican mediante una letra o una letra seguida de un subíndice numérico, por ejemplo "Z¡" o "R¡" en los que i es un número entero.

Definiciones Las definiciones y explicaciones siguientes son para los términos tal como se usan a lo largo de todo este documento que incluye tanto la memoria descriptiva como las reivindicaciones. Todas las temperaturas están en grados centígrados. r.p.m. se refiere a revoluciones por minuto. TLC se refiere a cromatografía en capa fina. HPLC se refiere a cromatografía líquida de presión alta. psig se refiere a presión manométrica en libras por pulgada cuadrada. OD se refiere a oxígeno disuelto. OI se refiere a osmosis inversa. ESM se refiere a litros estándar por minuto. WM se refiere a volumen por minuto. VCO se refiere a velocidad de captación de oxígeno. Cuando se usan mezclas de disolventes, las relaciones entre los disolventes que se usan son en volumen/volumen (v/v).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En general, la invención se refiere a 7/?,11 ff-dihidroxiestero¡des y procedimientos para su preparación. Los compuestos de esta invención pueden usarse para la producción de Epierenona. El Esquema I ilustra un procedimiento posible para usar un 7/?,11a-dihidroxiesteroide para producir Eplerenona.

En referencia al Esquema I, el intermedio 2 puede producirse añadiendo hexametildisilazano (HMDS) (100 mi) a una suspensión en agitación de 50.0 g del Triol 1 en 400 mi de cloruro de metileno. Después se añade sacarina (0.57 g) y la mezcla se calienta a reflujo durante 3 horas, tiempo durante el cual la suspensión se disuelve gradualmente hacia una solución transparente y ámbar. Se añade agua (5 mi) para inactivar cualquier exceso de HMDS. Después de 5 minutos a reflujo, la mezcla se filtra a través de una capa humedecida con CH2CI2 de 32.6 g de magnesol en un embudo de filtración de vidrio poroso grueso de 350 mi. El filtrado debería ser transparente y casi incoloro. La torta de filtrado se lava con 2 x 100 mi de CH2CI2. Los filtrados combinados se concentran a presión reducida y se elimina el cloruro de metileno residual por evaporación con 2 porciones de 500 mi de tetrahidrofurano (THF), concentrando a sequedad después de cada adición proporcionando un sólido blanco. Una suspensión de f-butóxido potásico (42.0 g) en 500 mi de THF se enfría a -9o + 5°C con un baño de hielo/metanol. Se burbujea acetileno en la mezcla justo debajo de la superficie con agitación moderada durante al menos 1 hora. El esferoide sililado intermedio anterior en THF (400 mi) se añade durante 30 minutos mientras se mantiene una temperatura de reacción de 0o ± 5°C. Después de la adición, la mezcla se agita durante otra hora más a 5o ± 5°C. Se añade agua (100 mi) lentamente dejando que la mezcla de reacción se caliente a 15° ± 5°C. Lentamente se añaden 125 mi de HCI ai 0% para reducir el pH a 2.5-3. La mezcla se agita a pH 2.5-3, añadiendo cantidades pequeñas de HCI al 5% según sea necesario para mantener un pH de 2.5-3, durante 1 a 2 horas a 20°C + 5°C. Cuando se completa la hidrólisis, se añade una solución de NaHCCb semisaturada para elevar el pH a 5.5-6. La mezcla se diluye con acetato de etilo (500 mi) y se separan las fases. La fase acuosa se extrae con acetato de etilo y las fases de acetato de etilo combinadas se lavan con agua, salmuera, se desecan sobre sulfato magnésico y se concentran proporcionando el producto de adición 2. El intermedio 2 puede adiarse disolviendo tetraol 2 (50.00 g, 144 mmol) en piridina (150 mi) y enfriando la mezcla resultante a <10°C en un baño de hielo. Se añade dimetilaminopiridina (DMAP) (1.7 g, 14 mmol) seguido de la adición lenta de anhídrido acético (41.4 mi, 439 mmol) a una velocidad suficiente para mantener la temperatura de la solución por debajo de 10°C. Después de la adición, la mezcla de reacción se calienta a temperatura ambiente. La mezcla se diluye con acetato de etilo (75 mi) y agua (50 mi), se agita durante 5 minutos y se separan las fases. La fase orgánica se lava con HCI al 10% (4 x 25 mi) seguido de H20 (2 x 50 mi), se deseca sobre MgS04 y se concentra. El producto se recristaliza en tolueno (100 mi). La hidroformilación del intermedio acilado 3 puede producirse calentando el compuesto 3 (25.4 g, 54 mmol) con PPh3 (2.13 g, 8.1 mmol) y Rh2(OAc)4 (716 mg, 1.62 mmol) en acetato de etilo (200 mi) a aproximadamente 80°C en una mezcla 1/1 de hidrógeno/monóxido de carbono a una presión de 170 psi (1172.15 kPa) durante 12 horas. La mezcla se concentra a presión reducida y el producto 4 se purifica mediante cromatografía en columna (EtOAc/Hex 70/30 y 500 g de sílice). La oxidación del compuesto de lactol 4 puede lograrse mezclando el lactol 4 (25 g, 50 mmol), cloruro de metileno (250 mi), agua (38 mi), 2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxilo (TEMPO) (156 mg, 1 mmol), KBr (595 mg, 5 mmol) y NaHC03 (5.5 g, 65 mmol) y enfriando la mezcla a < 10°C en un baño de hielo. Lentamente se añade una solución de hipoclorito sódico 1.1 M (NaOCI) (50 mi, 55 mmol). La mezcla se deja calentar a temperatura ambiente y se diluye con agua (50 mi). Se separan las fases y la fase orgánica se lava con salmuera (2 x 50 mi). La fase orgánica se deseca con MgS04, se filtra y se concentra proporcionando 5 en forma de una espuma blanquecina. Calentando una mezcla del triacetato 5 (2.0 g), Pd(dppp)Br2 ( 26 mg), diisopropilamina (0.78 mi), EtjNBr (260 mg), NaBr (1.09 g) en 20 mi de metanol con una presión de 1200 psi (8274 kPa) de CO a 65°C durante 12 horas, seguido de refrigeración, concentración y cromatografía del residuo en . gel de sílice con acetato de etilo al 40-75%/hexano se obtiene el éster metílico 6. Una solución del éster de diacetilo 6 (5.01 g) en carbonato potásico 0.15 N en metanol (50 mi) se agita a temperatura ambiente y la reacción se controla por TLC. Cuando ya no se detecta material inicial 6, la mezcla se diluye con agua (200 mi) y se extrae con acetato de etilo (3 x 200 mi). Los extractos combinados se lavan con agua (100 mi), salmuera (100 mi), se desecan sobre sulfato magnésico y se concentran a presión reducida a sequedad. El residuo se cromatografía sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexano proporcionando el compuesto de 3-hidroxi 7. Una mezcla del alcohol 7 (6.0 g), CH2CI2 (40 mi), agua (9.0 mi), 2,2,6,6-tetrametilpiperidin-l-oxilo (TEMPO) (38 mg), KBr (142 mg) y bicarbonato sódico (4.0 g) se enfría a 5°C. A esta mezcla lentamente se añade 14.1 mi de NaOCI 1.1 M. Después de la adicción, se deja agitar la mezcla durante 1 hora más y se acidifica con HCI diluido. El producto 8 se aisla con Una solución del compuesto 8 (5.01 g) en carbonato potásico 0.15 N en metanol (50 mi) se agita a temperatura ambiente y la reacción se controla por TLC. Cuando ya no se detecta el material inicial 8, la mezcla se diluye con agua (200 mi) y se extrae con acetato de etilo (3 x 200 mi). Los extractos combinados se lavan con agua (100 mi), salmuera (100 mi), se desecan sobre sulfato magnésico y se concentran a presión reducida a sequedad. El residuo se cromatografía sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexano proporcionando el compuesto 9. PCI5 (1.08 g) se añade a una solución del compuesto 9 en THF a -51 °C lo que provoca que la temperatura aumente a -48°C. Después de 2 horas, la mezcla se vierte en NaHC03 acuoso y se extrae con EtOAc y se concentra. El material se cromatografió en gel de sílice con EtOAc/hexano proporcionando el compuesto de dieno 10. Se produce Eplerenona mediante epoxidación del compuesto 10 por procedimientos conocidos que se describen, por ejemplo en las patentes de Estados Unidos n° 4,559,332 y 5,981 ,744, cuyo contenido se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad. En referencia al Diagrama A, los compuestos de androst-5-en-17-ona de la fórmula (I) pueden convertirse en diferentes intermedios esteroideos mediante reacciones fúngicas. Por ejemplo, al poner en contacto compuestos de androst-5-en-17-ona de la fórmula (I), en los que Z1-Z2 es un enlace sencillo o un enlace doble, con Diplodia gossypina se producen compuestos de 7^-hidroxiandrost-5-en-17-ona de la fórmula (II). Los compuestos de 1 1 or-hidrox¡androst-5-en-17-ona de la fórmula (III) se producen poniendo en contacto los compuestos de androst-5-en-17-ona de la fórmula (I), en los que Z-i-Z2 es un enlace sencillo, con Aspergillus ochraceus. Sorprendentemente, al poner en contacto los compuestos de 11 cr-hidroxiandrost-5-en-17-ona de la fórmula (III) con Diplodia gossypina no se producen los compuestos de 7 ?,1 1 r-dihidroxiandrost-5-en-17-ona de la fórmula (IV), mientras que al poner en contacto los compuestos de ?ß-hidroxiandrost-5-en-17-ona de la fórmula (II), en los que Z-|-Z2 es un enlace sencillo, con Aspergillus ochraceus se producen los compuestos de 7 ?,1 ct-dihidroxiandrost-5-en-17-ona de la fórmula (IV). Inesperadamente, al poner en contacto los compuestos de androst-5-en-17-ona de la fórmula (I), en los que Z1-Z2 es un enlace sencillo, con Absídia coerulea se producen directamente los compuestos de 7^,11 a-dihidroxiandrost-5-en-17-ona de la fórmula (IV).

DIAGRAMA A (IV) Los reactivos de los hongos filamentosos pertenecen a los géneros Diplodia (sinónimos Botryodiplodia, Lasiodiplodia), Aspergillus y Absidia coerulea y generalmente se preparan mediante una etapa de siembra vegetativa primaria y una secundaria. La siembra secundaria se usa para inocular la etapa de bioconversión de los esteroides. Los procedimientos descritos en la presente memoria pueden usarse para producir compuestos esteroideos de las fórmulas (I), (II), (III) y (IV), que son intermedios útiles para la fabricación de esteroides farmacéuticamente activos tales como antagonistas de los receptores de aldosterona. Además, 5-androsten-3 ?,7 ?-diol-17-ona (fórmula II en la que R3 es un hidrógeno y R 7 y Ft|8 juntos son una cetona y Z Z2 es un enlace sencillo) es un intermedio atractivo para la síntesis de 5-androsten-3/?-ol-7,17-diona, un suplemento esteroideo disponible en el mercado que se ha propuesto que tiene efectos beneficiosos sobre las enfermedades cardíacas, la función inmunitaria, el envejecimiento y el bienestar general.

Descripción detallada de la etapa de hidroxilación en IB Los compuestos esteroideos de la fórmula (I), en los que Z-i-Z2 es un enlace sencillo o un enlace doble, se hidroxilan microbiológicamente en la posición 7 produciendo los compuestos esteroideos de la fórmula (II), en los que Z1-Z2 es un enlace sencillo o un enlace doble. En el procedimiento de la invención puede usarse cualquier hongo filamentoso del género Diplodia, Botryodiplodia o Lasiodiplodia capaz de hidroxilar los esteroides de la fórmula (I) en 7ß. Preferiblemente, se usan Diplodia gossypina ATCC 20571 (sinónimo Botryodiplodia theobromae IFO 6469) o Botryodiplodia malorum ATCC 24444 (sinónimo CBS 134.50). Más preferiblemente se usa Diplodia gossypina ATCC 20571 (sinónimo Botryodiplodia theobromae IFO 6469). La hidroxilasa fúngica puede utilizarse en forma de cultivo en crecimiento activo, de concentrado de células enteras o de extracto sin células. Preferiblemente, el hongo se cultiva en un cultivo sumergido en condiciones aeróbicas, usando cualquier procedimiento reconocido en la técnica, y la reacción de hidroxilación en 7ß se realiza in sltu. El hongo deseado puede cultivarse en las condiciones que se describen en los EJEMPLOS 1 y 2 usando los ingredientes que se especifican u otras fuentes de carbono y nitrógeno adecuadas tal como es sabido por los expertos en la técnica. Generalmente se usa un procedimiento de siembra vegetativa primaria y secundaria en la preparación para la hidroxilación fúngica en 7ß. De forma alternativa, puede usarse una siembra vegetativa primaria para inocular el medio de bioconversión directamente. Los cultivos de siembra vegetativa primaria pueden incubarse durante un periodo de aproximadamente 24 a aproximadamente 96 horas (preferiblemente aproximadamente 48-72 horas) a una temperatura entre aproximadamente 20° y aproximadamente 37° (preferiblemente aproximadamente 28°) y a un pH entre aproximadamente 3.0 y aproximadamente 7.5. El medio de siembra vegetativa secundaria se inocula con aproximadamente 0.006% a aproximadamente 0.1% (v/v) de cultivo de siembra vegetativa primaria, pero típicamente aproximadamente 0.012% (v/v) y se incuba durante un periodo de aproximadamente 36 a aproximadamente 72 horas (preferiblemente aproximadamente 60 horas) a una temperatura entre aproximadamente 20° y aproximadamente 37° (preferiblemente aproximadamente 28°). El pH del medio de siembra secundaria puede estar entre aproximadamente 2.5 y aproximadamente 7.0, pero preferiblemente entre aproximadamente 3.0 y aproximadamente 5.0. El medio de bioconversión, que puede ser el mismo o similar al medio de siembra vegetativa secundaria, se inocula con aproximadamente 1 % a aproximadamente 10% (v/v) de cultivo de siembra vegetativa secundaria (preferiblemente de aproximadamente 3% a aproximadamente 5%). Después de un periodo de incubación inicial de aproximadamente 12 a aproximadamente 72 horas (preferiblemente aproximadamente 16 a aproximadamente 24 horas), se añaden los sustratos esteroideos de la fórmula (I), preferiblemente micronízados, al cultivo de bioconversión. Los sustratos esteroideos micronízados de la fórmula (I) pueden añadirse en forma de polvo desecado o de suspensión acuosa, ya sea en forma de adición única, de una serie de adiciones o de alimentación continua. Se prefiere usar los sustratos esteroideos micronízados de la fórmula (I) con una concentración mayor de 1 g/l, más preferiblemente mayor de 2.5 g/l, incluso más preferiblemente mayor de 5 g/l. La bioconversión de los sustratos esteroideos de la fórmula (I) para formar productos hidroxilados en 7ß de la fórmula (II), respectivamente, se deja continuar durante entre aproximadamente 2 y aproximadamente 6 días, pero típicamente durante aproximadamente 3 a aproximadamente 4 días. La velocidad y grado de hidroxilación en 7ß puede mejorarse muchísimo: (i) cultivando el hongo seleccionado y realizando la bioconversión, en presencia de un detergente. El detergente puede seleccionarse del grupo que consiste en detergentes no iónicos, pero preferiblemente los subgrupos que consisten en alquilfenoles etoxilados y ásteres de polioxietilensorbitan. Más preferiblemente, se usa monooleato de polioxietilensorbitan; (ii) cultivando el hongo seleccionado y realizando la bioconversión en presencia de un aceite natural. El aceite natural puede seleccionarse, pero sin restricción, del grupo que consiste en aceite de ricino, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de manteca, aceite de linaza, aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de semilla de colza, aceite de cártamo, aceite de soja, aceite de girasol y aceite de germen de trigo. Preferiblemente, se usa aceite de soja; (iii) usando una combinación de las metodologías que se identifican en (i) y (ii). Una vez se ha completado la bioconversión de los sustratos esteroideos de la fórmula (I) en productos hidroxilados en 7ß de la fórmula (II), los compuestos de la fórmula (II) pueden aislarse usando uno cualquiera de un número de procedimientos reconocidos en la técnica. Preferiblemente, los sólidos del caldo de fermentación filtrados o centrifugados se extraen usando un disolvente orgánico, tal como metanol, acetona, acetato de butilo o cloruro de metileno y el producto hidroxilado en 7ß de la fórmula (II) se aisla por cristalización. Los disolventes de cristalización incluyen un disolvente que se selecciona, pero sin restricción, del grupo que consiste en agua, metanol, acetona, acetato de butilo, cloruro de metileno o sus combinaciones. El disolvente de extracción y cristalización preferido para el producto hidroxilado en 7ß de la fórmula (II) es cloruro de metileno.

Descripción detallada de la etapa de hidroxilación en 11 a Los compuestos esteroideos de la fórmula (I) o (II), en los que Zi-Z2 es un enlace sencillo, se hidroxilan microbiológicamente en la posición 11 produciendo los compuestos esteroideos de la fórmula (III) o (IV), respectivamente. En el procedimiento de la invención puede usarse cualquier hongo filamentoso del género Aspergillus capaz de hidroxilar en 11 a los esteroides de la fórmula (I) o (II), en los que Z-i-Z2 es un enlace sencillo. Preferiblemente, se usa Aspergillus och ceus ATCC 18500 (sinónimo NRRL 405). La hidroxilasa fúngica puede utilizarse en forma de cultivo en crecimiento activo, de concentrado de células enteras o de extracto sin células. Preferiblemente, el hongo se cultiva en un cultivo sumergido en condiciones aeróbicas, usando cualquier procedimiento reconocido en la técnica, y la reacción de hidroxilación en 11s se realiza In situ. El hongo deseado puede cultivarse en las condiciones que se describen en los EJEMPLOS 3 y 4 usando los ingredientes que se especifican u otras fuentes de carbono y nitrógeno adecuadas tal como es sabido por los expertos en la técnica. Generalmente se usa un procedimiento de siembra vegetativa primaria y secundaria en la preparación para la hidroxilación fúngica en 1 s. De forma alternativa, puede usarse una siembra vegetativa primaria para inocular el medio de bioconversión directamente. Los cultivos de siembra vegetativa primaria pueden incubarse durante un periodo de aproximadamente 24 a aproximadamente 96 horas (preferiblemente aproximadamente 48-72 horas) a una temperatura entre aproximadamente 20° y aproximadamente 37° (preferiblemente aproximadamente 28°) y a un pH entre aproximadamente 3.0 y aproximadamente 7.5. El medio de siembra vegetativa secundaria se inocula con aproximadamente 0.006% a aproximadamente 0.1 % (v/v) de cultivo de siembra vegetativa primaria, pero típicamente aproximadamente 0.012% (v/v) y se incuba durante un periodo de aproximadamente 36 a aproximadamente 72 horas (preferiblemente aproximadamente 60 horas) a una temperatura entre aproximadamente 20° y aproximadamente 37° (preferiblemente aproximadamente 28°). El pH del medio de siembra secundaria puede estar entre aproximadamente 2.5 y aproximadamente 7.0, pero preferiblemente entre aproximadamente 3.0 y aproximadamente 5.0. El medio de bioconversión, que puede ser el mismo o similar al medio de siembra vegetativa secundaria, se inocula con aproximadamente 1% a aproximadamente 10% (v/v) de cultivo de siembra vegetativa secundaria (preferiblemente de aproximadamente 3% a aproximadamente 5%). Después de un periodo de incubación inicial de aproximadamente 12 a aproximadamente 72 horas (preferiblemente aproximadamente 16 a aproximadamente 24 horas), se añaden los sustratos esteroideos de la fórmula (I) o (II), en los que Z1-Z2 es un enlace sencillo, al cultivo de bioconversión. Preferiblemente los sustratos están micronizados. Los sustratos esteroideos micronizados de la fórmula (I) o (II), en los que Z1-Z2 es un enlace sencillo, pueden añadirse en forma de polvo desecado o de suspensión acuosa, ya sea en forma de adición única, de una serie de adiciones o de alimentación continua. Se prefiere usar los sustratos esteroideos micronizados de la fórmula (I) o (II), en los que Z1-Z2 es un enlace sencillo, con una concentración mayor de 1 g/I, más preferiblemente mayor de 2.5 g/I, incluso más preferiblemente mayor de 5 g/I. La bioconversión de los sustratos esteroideos de la fórmula (I) o (II), en los que Z1-Z2 es un enlace sencillo, para formar productos hidroxilados en 1 1 a de la fórmula (III) o (IV), respectivamente, se deja continuar durante entre aproximadamente 1 y aproximadamente 6 días, pero típicamente durante aproximadamente 2 a aproximadamente 3 días. La velocidad y grado de hidroxilación en 11s puede mejorarse muchísimo: (i) cultivando el hongo seleccionado y realizando la bioconversión, en presencia de un detergente. El detergente puede seleccionarse del grupo que consiste en detergentes no iónicos, pero preferiblemente los subgrupos que consisten en alquilfenoles etoxilados y ásteres de polioxietilensorbitan. Más preferiblemente, se usa octilfenoxipolietoxietanol o nonilfenoxipolietoxietanol; (¡i) cultivando el hongo seleccionado y realizando la bioconversión en presencia de un aceite natural. El aceite natural puede seleccionarse, pero sin restricción, del grupo que consiste en aceite de ricino, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de manteca, aceite de linaza, aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de semilla de colza, aceite de cártamo, aceite de soja, aceite de girasol y aceite de germen de trigo. Preferiblemente, se usa aceite de soja; (iii) usando una combinación de las metodologías que se identifican en (i) y (ii). Una vez se ha completado la bioconversión de los sustratos esteroideos de la fórmula (I) o (II), en los que Z1-Z2 es un enlace sencillo, en productos hidroxilados en 11s de la fórmula (III) o (IV), los compuestos de la fórmula (III) o (IV) pueden aislarse usando uno cualquiera de un número de procedimientos reconocidos en la técnica. Preferiblemente, los sólidos del caldo de fermentación filtrados o centrifugados, o el caldo de fermentación completo se extraen usando un disolvente orgánico miscible en agua, tal como metanol o acetona, a temperaturas tan bajas como aproximadamente 15°C o tan altas como aproximadamente 55°C. La temperatura de extracción preferida es de aproximadamente 45-50°C. El producto hidroxilado en 11or de la fórmula (III) o (IV) bruto se genera por cristalización evaporatoria, para eliminar el disolvente orgánico, y por refrigeración. La mezcla de disolventes de extracción preferida es de acetona al 80-85% / agua al 15-20%. Las aguas madres acuosas empleadas se desechan. El producto cristalino hidroxilado en 11a de la fórmula (III) o (IV) bruto, se purifica mediante tratamiento con carbono y cristalización. Se prefiere que el tratamiento con carbono y la cristalización subsiguiente se realicen usando un disolvente miscible en agua que se selecciona, pero sin restricción, del grupo que consiste en metanol y acetona. El disolvente preferido para tratamiento con carbono/cristalización es metanol. Después de eliminar el carbono por filtración, la cristalización se realiza evaporando el disolvente y enfriando. Los compuestos de la fórmula (I) en los que Z Z2 es un enlace doble pueden producirse eliminando el hidroxilo en 11 a del producto de la fórmula (III) usando procedimientos químicos conocidos.

Descripción detallada de la etapa de dihidroxilación en 7 ?,11a Los compuestos esteroideos de la fórmula (I), en los que Zi-Z2 es un enlace sencillo, se hidroxilan microbiológicamente en la posición 7 y 11 , en una etapa única, produciendo los compuestos esteroideos de la fórmula (IV). En el procedimiento de la invención puede usarse cualquier hongo filamentoso del género Absidia capaz de dihidroxilar en ?ß,? ?a los esferoides de la fórmula (l), en los que Z 2 es un enlace sencillo. Preferiblemente, se usa Absidia coerulea ATCC 6647 (sinónimo Absidia orchidis). La(s) hidroxilasa(s) fúngica(s) puede(n) utilizarse en forma de cultivo en crecimiento activo, de concentrado de células enteras o de extracto sin células. Preferiblemente, el hongo se cultiva en un cultivo sumergido en condiciones aeróbicas, usando cualquier procedimiento reconocido en la técnica, y las reacciones de hidroxilación en ?ß y 11cr se realizan in situ. El hongo deseado puede cultivarse en las condiciones que se describen en el EJEMPLO 5 usando los ingredientes que se especifican u otras fuentes de carbono y nitrógeno adecuadas tal como es sabido por los expertos en la técnica. Generalmente se usa un procedimiento de siembra vegetativa primaria y secundaria en la preparación para la dihidroxilación fúngica en 7 ,11a. De forma alternativa, puede usarse una siembra vegetativa primaria para inocular el medio de bioconversión directamente. Los cultivos de siembra vegetativa primaria pueden incubarse durante un periodo de aproximadamente 24 a aproximadamente 96 horas (preferiblemente aproximadamente 48-72 horas) a una temperatura entre aproximadamente 20° y aproximadamente 37° (preferiblemente aproximadamente 28°) y a un pH entre aproximadamente 3.0 y aproximadamente 7.5. El medio de siembra vegetativa secundaria, que puede ser el mismo o similar al medio de siembra vegetativa primaria, se inocula con aproximadamente 0.006% a aproximadamente 0.1% (v/v) de cultivo de siembra vegetativa primaria, pero típicamente aproximadamente 0.012% (v/v) y se incuba durante un periodo de aproximadamente 36 a aproximadamente 96 horas (preferiblemente aproximadamente 70 a 80 horas) a una temperatura entre aproximadamente 20° y aproximadamente 37° (preferiblemente aproximadamente 28°). El pH del medio de siembra secundaria puede estar entre aproximadamente 2.5 y aproximadamente 7.5, pero preferiblemente entre aproximadamente 3.0 y aproximadamente 7.0. El medio de bioconversion, que puede ser el mismo o similar al medio de siembra vegetativa secundaria, se inocula con aproximadamente 1 % a aproximadamente 10% (v/v) de cultivo de siembra vegetativa secundaria (preferiblemente de aproximadamente 3% a aproximadamente 5%). Después de un periodo de incubación inicial de aproximadamente 12 a aproximadamente 72 horas (preferiblemente aproximadamente 15 a aproximadamente 24 horas), se añaden los sustratos esteroideos de la fórmula (I), en los que Z Z2 es un enlace sencillo, al cultivo de bioconversion. Preferiblemente los sustratos están micronizados. Los sustratos esteroideos micronizados de la fórmula (I), en los que ZrZ2 es un enlace sencillo, pueden añadirse en forma de polvo desecado o de suspensión acuosa, ya sea en forma de adición única, de una serie de adiciones o de alimentación continua. Se prefiere usar los sustratos esteroideos micronizados de la fórmula (I), en los que Z1-Z2 es un enlace sencillo, con una concentración mayor de 1 g/l, más preferiblemente mayor de 2.5 g/l, incluso más preferiblemente mayor de 5 g/l. La bioconversion de los sustratos esteroideos de la fórmula (I), en los que Z1-Z2 es un enlace sencillo, para formar productos hidroxilados en 1 s de la fórmula (IV), se deja continuar durante entre aproximadamente 2 y aproximadamente 9 días, pero típicamente durante aproximadamente 5 a aproximadamente 7 días. Una vez se ha completado la bioconversion de los sustratos esteroideos de la fórmula (I), en los que Z 2 es un enlace sencillo, en productos dihidroxilados en 7yff,11 s de la fórmula (IV), los compuestos de la fórmula (IV) pueden aislarse usando uno cualquiera de un número de procedimientos reconocidos en la técnica. Preferiblemente, los sólidos del caldo de fermentación filtrados o centrifugados, o el caldo de fermentación completo se extraen usando un disolvente orgánico miscible en agua, tal como metanol o acetona a temperaturas tan bajas como aproximadamente 15°C o tan altas como aproximadamente 55°C. La temperatura de extracción preferida es de aproximadamente 45-50°C. El producto dihidroxilado en 7 ?,11a de la fórmula (IV) bruto se genera por cristalización evaporatoria, para eliminar el disolvente orgánico, y por refrigeración. La mezcla de disolventes de extracción preferida es de acetona al 80 / agua al 20%. Las aguas madres acuosas empleadas se desechan. El producto cristalino dihidroxilado en 7 ?,11a de la fórmula (IV) bruto, se purifica mediante trituración con cloruro de metilo para eliminar las impurezas indeseadas, seguido de tratamiento con carbono y cristalización. Se prefiere que el tratamiento con carbono y la cristalización subsiguiente se realicen usando un disolvente miscible en agua que se selecciona, pero sin restricción, del grupo que consiste en metanol o acetona o sus mezclas. El disolvente preferido para tratamiento con carbono/cristalización es metanol. Después de eliminar el carbono por filtración, la cristalización del producto se realiza evaporando el disolvente y enfriando.

EJEMPLOS Sin elaborar más, se cree que un experto en la técnica puede, usando las descripciones precedentes, practicar la presente invención en toda su amplitud. Los ejemplos detallados siguientes describen cómo preparar los diversos compuestos y/o realizar los diversos procedimientos de la invención y se deben interpretar como meramente ilustrativos y no como limitaciones de la descripción precedente en modo alguno. Los expertos en la técnica rápidamente reconocerán variaciones apropiadas de los procedimientos en lo que se refiere a reactivos y a condiciones y técnicas de reacción. 3 ?-Hidroxiandrost-5-en-17-ona, también denominado 5-androsten-3 -ol-17-ona está disponible en Jiangsu Wujin Pharmaceuticals localizado en China.

EJEMPL0 1 Bioconversión de 5-androsten-3^-ol-17-ona (I, en el que F¾ = hidrógeno, Ri7, is = cetona y Z1-Z2 es un enlace sencillo) en 5-androsten-3 ?,7/?-diol-17-ona (II, en el que R3 = hidrógeno, R17j 8 = cetona y Z Z2 es un enlace sencillo). La bioconversión de 5-androsten-3¿ff-ol-17-ona en 5-androsten-3/?,7 ?-diol- 7-ona se realiza usando un cultivo sumergido de Diplodia gossypina ATCC 20571 (sinónimo Botryodiplodia theobromae IFO 6469) a una escala de fermentación de 10 I.

(A) Etapa de siembra primaria Se descongelan células vegetativas congeladas de Diplodla gossypina ATCC 2057 , se transfieren a placas de agar con patata y dextrosa (PDA) y se incuban a 28° durante 72 horas. Se usan discos de micelio único (6-7 mm de diámetro) para inocular matraces de agitación punteados de 500 mi con silicona, que contenían 100 mi de medio de siembra primaria. El medio de siembra primaria consiste (por litro de agua de OI) en: dextrina, 50 g; harina de soja, 35 g; cerelosa, 5 g; cloruro de cobalto hexahidratado, 2 mg; desespumante de silicona (SAG 471 ), 0.5 mi; pH antes de la esterilización 7.0-7.2, ajustado con hidróxido sódico (2 N). Se incuba Diplodia gossypina ATCC 20571 durante 48 horas a 28°, usando una incubadora-agitadora de ambiente controlado programada a 280 r.p.m. (recorrido orbital de 1").

(B) Etapa de siembra secundaria Se inoculan fermentaciones de siembra secundaria de diez litros usando 1.2 mi de cultivo de siembra primaria vegetativa (porcentaje de inoculación del 0.012% [v/v]). El medio de siembra secundaria contiene (por litro de agua de OI): cerelosa, 60 g; harina de soja, 25 g; aceite de soja, 30 mi; sulfato magnésico heptahidratado, 1 g; dihidrogenofosfato potásico, 0.74 g; monooleato de polioxietilensorbitan, 2 mi; desespumante de silicona (SAG 471), 0.5 mi; pH previo a la esterilización 3.95-4.00, ajustado con ácido sulfúrico concentrado. Los fermentadores, que contienen el medio de siembra secundaria, se esterilizan durante 20 minutos a 121° usando una camisa y vapor inyectado. La velocidad de agitación durante la esterilización es de 200 r.p.m. Tras la esterilización, el pH del medio se ajusta a 4.0 usando ácido sulfúrico estéril (5%). Se incuba Diplodia gossypina ATCC 20571 a 28°C usando los siguientes parámetros iniciales: agitación, 100 r.p.m.; presión de fondo = 5 psig (34.48 kPa manométrica); caudal de aire = 2.5 ESM (0.25 WM); programación de OD mínimo a 30%; sin control de pH. La primera vez que el OD baja a 30%, el caudal del aire aumenta a 5 ESM (0.5 WM). Cuando el cultivo presenta un OD bajo de nuevo, se mantiene un OD del 30% usando el control de agitación. Los cultivos de siembra secundaria se recolectan aproximadamente 60 horas después de la inoculación, cuando la VCO está entre aproximadamente 10 y aproximadamente 5 mM/l/h.

(C) Bioconversión de esferoides Se inoculan fermentaciones de bioconversión de esferoides de diez litros usando 500 mi de cultivo de siembra secundaria vegetativa (porcentaje de inoculación del 5% [v/v]). El medio de bioconversión de esferoides es igual que el medio de siembra secundaria. Las condiciones de esterilización y ajuste de pH son tal como se describe para el medio de siembra secundaria. Se incuba Diplodia gossypina ATCC 20571 a 28°C usando esencialmente los mismos parámetros iniciales que los que se usan para el cultivo de siembra secundaria, a excepción de que la programación de OD mínimo se aumenta de 30% a 50%. La primera vez que el OD baja a 50%, el caudal del aire aumenta de 2.5 ESM (0.25 WM) a 5 ESM (0.5 WM). Cuando el cultivo presenta un OD bajo de nuevo, se mantiene un OD del 50% usando el control de agitación. Comenzando a las 24 horas de la inoculación, se añade a la fermentación 5-androsten-3 ?-ol-17-ona micronizada, suspendida en un volumen mínimo de monooleato de polioxietilensorbitan al 0.2%, en intervalos de una hora hasta que se añaden un total de 400 g. Aproximadamente a los 3 días de la inoculación, se añaden 100 g más de cerelosa a la fermentación de 10 I. Los cultivos de bioconversión se analizan a diario para determinar la presencia de 5-androsten-3 ?,7j#-diol-17-ona usando TLC. Se extrae 1 mi del caldo de fermentación completo con 10 mi de metanol. Las células se separan de la mezcla de metanol acuoso centrifugando (3,000 x g durante 10 minutos) y se aplican varios microlitros a una placa de TLC. La placa de TLC se revela con ciciohexano: acetato de etilo:metanol (90:60:15) y el producto se visualiza pulverizando la TLC con ácido sulfúrico al 50%, seguido de carbonización en un horno. El producto se compara con un patrón auténtico, que se vuelve azul al pulverizar con ácido sulfúrico al 50%. La bioconversión de 5-androsten-3^-ol-17-ona en 5-androsten-3 ?,7/?-diol-17-ona se completa aproximadamente en 4 días después de la inoculación.

(D) Procedimiento de aislamiento El caldo de fermentación completo recolectado se centrifuga y los sólidos enriquecidos se recuperan por centrifugación. Los sólidos enriquecidos se extraen con 10 litros de cloruro de metileno y el extracto enriquecido se recupera por centrifugación. El extracto se refina y se concentra a aproximadamente 1 litro mediante destilación y la suspensión cristalina se enfría a -10°C. Los cristales se recuperan por filtración, se lavan con cloruro de metileno frío para eliminar el color y se desecan proporcionando 227 gramos de 5-androsten-3 ?,7j6-diol-17-ona cristalina purificada.

EJEMPLO 2 Bioconversión de 5,9( 1 )-androstadien-3/?-ol- 7-ona (l, en el que R3 = hidrógeno, R 7i 18 = cetona y Z-i-Z2 es un enlace doble) en 5,9(11)-androstadien-3/?,7 ?-diol-17-ona (II, en el que R3 = hidrógeno, Ri7, i8 = cetona y Z1-Z2 es un enlace doble). La bioconversión de 5,9(11 )-androstadien-3ytf-ol-17-ona en 5,9(11)-androstadien-3 ?,7 ?-diol-17-ona se realiza usando un cultivo sumergido de Diplodla gossypina ATCC 20571 (sinónimo Botryodiplodia theobromae IFO 6469) a una escala de fermentación de 10 1.

(A) Etapa de siembra primaria Los cultivos de siembra primaria se preparan tal como se describe en el EJEMPLO 1.

(B) Etapa de siembra secundaria Los cultivos de siembra secundaria de diez litros se preparan tal como se describe en el EJEMPLO 1.

(C) Bioconversión de esteroides Los cultivos de bioconversión de esteroides de 10 litros se preparan tal como se describe en el EJEMPLO 1. Aproximadamente 24 h después de la inoculación, a la fermentación de 10 litros se añaden 120 g de 5,9(11 )-androstadien-3 ?-ol-17-ona micronizada, suspendida en un volumen mínimo de monooleato de polioxietilensorbitan al 0.2%. Los cultivos de bioconversión se analizan a diario para determinar la presencia de 5,9(11)-androstadien-3j5,7 ?-diol-17-ona usando el procedimiento que se describe en el EJEMPLO 1. La bioconversión de 5,9(1 )-androstadien-3 ?-ol- 7-ona en 5,9( 1 )-androstadien-3j6,7jS-diol-17-ona se completa aproximadamente en 3 días después de la inoculación.

(D) Procedimiento de aislamiento Los sólidos enriquecidos del caldo de fermentación completo se recuperan por centrifugación. La fase líquida del caldo de fermentación se extrae usando 15 litros de cloruro de metileno. Después de reposar, se decanta y se desecha la capa superior del caldo de fermentación empleado. El cloruro de metileno enriquecido restante se usa después para extraer los sólidos empleados. El extracto de cloruro de metileno enriquecido resultante se drena de los sólidos empleados, se refina y se concentra por destilación a aproximadamente 0.5 litros y se enfría a -10°C. Los cristales obtenidos se recuperan por filtración, se lavan con acetato de n-butilo para eliminar el color y se desecan proporcionando 52.2 gramos de 5,9(11)-androstadien-3 ?,7/?-diol-17-ona cristalina purificada.

EJEMPLO 3 Bioconversión de 5-androsten-3 ?-ol-17-ona (I, en el que F¾ = hidrógeno, R17, 18 = cetona y Z1-Z2 es un enlace sencillo) en 5-androsten-3 ?,11 a-diol-17-ona (II, en el que R3 = hidrógeno, Ri7) 13 = cetona y Z-i-Z2 es un enlace sencillo). La bioconversión de 5-androsten-3 ?-ol-17-ona en 5-androsten-3,8,11 a-diol-17-ona se realiza usando un cultivo sumergido de Aspergillus ochraceus ATCC 18500 (sinónimo NRRL 405) a una escala de fermentación de 10 1.

(A) Etapa de siembra primaria Los cultivos de siembra primaria de Aspergillus ochraceus ATCC 18500 se preparan tal como se describe para Diplodia gossypina ATCC 20571 en el EJEMPLO 1.

(B) Etapa de siembra secundaria Se inoculan fermentaciones de siembra secundaria de diez litros usando 1.2 mi de cultivo de siembra primaria vegetativa (porcentaje de inoculación del 0.012% [v/v]). El medio de siembra secundaria contiene (por litro de agua de OI): cerelosa, 40 g; harina de soja, 25 g; aceite de soja, 30 mi; sulfato magnésico heptahidratado, 1 g; dihidrogenofosfato potásico, 0.74 g; nonilfenoxipolietoxietanol, 0.25 mi; desespumante de silicona (SAG 471), 0.5 mi; pH previo a la esterilización 3.95-4.00, ajustado con ácido sulfúrico concentrado. Los fermentadores, que contienen el medio de siembra secundaria, se esterilizan durante 20 minutos a 121° usando una camisa y vapor inyectado. La velocidad de agitación durante la esterilización es de 200 r.p.m. Tras la esterilización, el pH del medio se ajusta a 4.0 usando ácido sulfúrico estéril (5%). Se incuba Aspergillus ochraceus ATCC 8500 a 28°C usando los siguientes parámetros iniciales: agitación, 100 r.p.m.; presión de fondo = 5 psig (34.48 kPa manométrica); caudal de aire = 2.5 ESM (0.25 WM); programación de OD mínimo al 50%; sin control de pH. La primera vez que el OD baja a 50%, el caudal del aire aumenta a 5 ESM (0.5 WM). Cuando el cultivo presenta un OD bajo de nuevo, se mantiene un OD del 50% usando el control de agitación. Los cultivos de siembra secundaria se recolectan entre 50 y 54 horas después de la inoculación, cuando la VCO está entre aproximadamente 20 y aproximadamente 26 mM/l/h.

(C) Bioconversión de esteroides Se inoculan fermentaciones de bioconversión de esteroides de diez litros usando 500 mi de cultivo de siembra secundaria vegetativa (porcentaje de inoculación del 5% [v/v]). El medio de bioconversión de esteroides es esencialmente igual que el medio de siembra secundaria, pero se aumenta el nonilfenoxipolietoxietanol de 0.25 ml/l a 2 ml/l y el pH anterior a la esterilización se ajusta a 2.95-3.00 con ácido sulfúrico concentrado. Las condiciones de esterilización son tal como se describe para el medio de siembra secundaria. Después de la esterilización, el pH del medio se ajusta a 3.0 usando ácido sulfúrico estéril (5%). Aspergillus ochraceus ATCC 18500 se incuba a 28° usando esencialmente los mismos parámetros iniciales que los que se usan para el cultivo de siembra secundaria, a excepción de que la agitación se programa inicialmente a 200 r.p.m. Aproximadamente 18 horas después de la inoculación, a la fermentación de 10 I se añaden 200 g de 5-androsten-3 ?-ol-17-ona micronizada, suspendida en un volumen mínimo de nonilfenoxipolietoxietanol al 0.2%. Los cultivos de bioconversión se analizan a diario para determinar la presencia de 5-androsten-3/?,11 a-diol-17-ona usando TLC. Se extrae 1 mi del caldo de fermentación completo con 19 mi de metanol. Las células se separan de la mezcla de metanol acuoso centrifugando (3,000 x g durante 10 minutos) y se aplican varios microlitros a una placa de TLC. La placa de TLC se revela con ciclohexano:acetato de etilo:metanol (90:60:15) y el producto se visualiza pulverizando la TLC con ácido sulfúrico al 50%, seguido de carbonización en un horno. La bioconversión de 5-androsten-3 ?-ol-17-ona en 5-androsten-3/?, 1 a-diol-17-ona se completa aproximadamente en 3 días después de la inoculación.

(D) Procedimiento de aislamiento Los sólidos del caldo de fermentación completo se recuperan por centrifugación. El líquido se desecha. Los sólidos enriquecidos se extraen con 10 litros de acetona al 85% y agua al 15% de 45°C a 50°C y el extracto enriquecido se recupera por centrifugación. El extracto se concentra por destilación para eliminar la acetona generando una suspensión acuosa de cristales brutos. Los cristales brutos se recuperan por filtración y las aguas madres se desechan. Los cristales brutos humedecidos con agua se disuelven en 700 mi de metanol calentado a 55°C y después se decoloran con 5 gramos de carbono Darco G-60. Después de filtrar para eliminar el carbono, el filtrado se concentra para cristalizar el producto. El metanol se elimina adicionalmente añadiendo 300 mi de acetato de n-butilo y concentrando hasta una suspensión espesa de cristales. Los cristales se filtran, se lavan con acetato de n-butilo y se desecan proporcionando 174 gramos de 5-androsten-3/?,11 a-diol-17-ona cristalina purificada.

EJEMPLO 4 Bioconversión de 5-androsten-3 ?,7jS-diol-17-ona (II, en el que R3 = hidrógeno, R17, 18 = cetona y Z1-Z2 es un enlace sencillo) en 5-androsten-3/? ,7/5,11a-triol-17-ona (IV, en el que R3 = hidrógeno, Ri7> is = cetona). La bioconversión de 5-androsten-3j#,7 ?-diol-17-ona en 5-androsten-3/?,7 ?,11ff-triol-17-ona se realiza usando un cultivo sumergido de Aspergillus ochraceus ATCC 18500 (sinónimo NRRL 405) a una escala de fermentación de 10 I.

(A) Etapa de siembra primaria Los cultivos de siembra primaria de Aspergillus ochraceus ATCC 8500 se preparan tal como se describe en el EJEMPLO 3.

(B) Etapa de siembra secundaria Los cultivos de siembra secundaria de diez litros de Aspergillus ochraceus ATCC 18500 se preparan tal como se describe en el EJEMPLO 3.

(C) Bioconversión de esteroides Los cultivos de bioconversión de esteroides de diez litros de Aspergillus ochraceus ATCC 18500 se preparan tal como se describe en el EJEMPLO 3. Aproximadamente 18 horas después de la inoculación, a la fermentación de 10 litros se añaden 200 g de 5-androsten-3jí?,7 ?-d¡ol-17-ona micronizada, suspendida en un volumen mínimo de nonilfenoxipolietoxietanol al 0.2%. Los cultivos de bioconversión se analizan a diario para determinar la presencia de 5-androsten-3/?,7 ?,11 s-triol-l 7-ona usando TLC, tal como se describe en el EJEMPLO 1. La bioconversión de 5-androsten-3/?,7 ?-diol-17-ona en 5-androsten-3 ?,7 ?,11a-triol-17-ona se completa aproximadamente en 4 días después de la inoculación.

(D) Procedimiento de aislamiento Los sólidos del caldo de fermentación completo se recuperan por centrifugación. El líquido se desecha. Los sólidos enriquecidos se extraen con 10 litros de acetona al 80% y agua al 20% de 45°C a 50°C y el extracto caliente se clarifica por filtración. El filtrado enriquecido se concentra por destilación para eliminar la acetona generando una suspensión acuosa de cristales brutos. Los cristales brutos se recuperan por filtración y se desechan las aguas madres. Los cristales humedecidos con agua se trituran en 600 mililitros de cloruro de metileno para eliminar las impurezas, se disuelven en 700 mi de metanol (calentado a 55°C) y después se decoloran con 5 gramos de carbono Darco G-60. Después de filtrar para eliminar el carbono, el filtrado se concentra para cristalizar el producto. El metanol se elimina adicionalmente añadiendo 300 mi de acetato de n-butilo y concentrando a una suspensión espesa de cristales. Los cristales se filtran, se lavan con acetato de n-butilo y se desecan proporcionando 158 gramos de 5-androsten-3j#,7 ?,11<7-triol-17-ona cristalina purificada.

EJEMPLO 5 Bioconversión de 5-androsten-3;S-ol- 7-ona (I, en el que R3 = hidrógeno, R17t 13 = cetona y Z-i-Z2 es un enlace sencillo) en 5-androsten-?ß,?ß, 1 <7-triol-17-ona (IV, en el que F¾ = hidrógeno, R-i7, -is = cetona). La bioconversión de 5-androsten-3/?-ol-17-ona en 5-androsten-3,6,7/?, 1 1 -triol-17-ona se realiza usando un cultivo sumergido de Absidia coerulea ATCC 6647 (sinónimo Absidia orchidis) a una escala de fermentación de 10 I.

(A) Etapa de siembra primaria Los cultivos de siembra primaria de Absidia coerulea ATCC 6647 se preparan tal como se describe para Diplodia gossypina ATCC 20571 en el EJEMPLO 1.

(B) Etapa de siembra secundaria Se inoculan fermentaciones de siembra secundaria de diez litros usando 1.2 mi de cultivo de siembra primaria vegetativa (porcentaje de inoculación del 0.012% [v/v]). El medio de siembra secundaria contiene (por litro de agua de OI): dextrina, 50 g; harina de soja, 35 g; cerelosa, 5 g; cloruro de cobalto hexahidratado, 2 mg; desespumante de silicona (SAG 471), 0.5 mi; pH previo a la esterilización 4.95-5.00, ajustado con ácido sulfúrico concentrado. Los fermentadores, que contienen el medio de siembra secundaria, se esterilizan durante 20 minutos a 121° usando una camisa y vapor inyectado. La velocidad de agitación durante la esterilización es de 200 r.p.m. Tras la esterilización, el pH del medio se ajusta a 5.0 usando ácido sulfúrico estéril (5%). Se incuba Absidia coerulea ATCC 6647 a 28°C usando los siguientes parámetros iniciales: agitación, 100 r.p.m.; presión de fondo = 5 psig (34.48 kPa manométrica); caudal de aire = 2.5 ESM (0.25 WM); programación de OD mínimo al 50%; sin control de pH. La primera vez que el OD baja a 30%, el caudal del aire aumenta a 5 ESM (0.5 WM). Cuando el cultivo presenta un OD bajo de nuevo, se mantiene un OD del 30% usando el control de agitación. Los cultivos de siembra secundaria se recolectan aproximadamente 76 horas después de la inoculación, cuando la VCO está entre aproximadamente 4 y aproximadamente 7 mM/l/h.

(C) Bioconversión de esteroides Se inoculan fermentaciones de bioconversión de esteroides de diez litros usando 500 mi de cultivo de siembra secundaria vegetativa (porcentaje de inoculación del 5% [v/v]). El medio de bioconversión de esteroides contiene (por litro de agua de OI): dextrina, 50 g; harina de soja, 35 g; cerelosa, 20 g; desespumante de silicona (SAG 471), 0.5 mi; el pH previo a la esterilización es de 2.95-3.00, ajustado con ácido sulfúrico concentrado. Las condiciones de esterilización son tal como se describe para el medio de siembra secundaria. Después de la esterilización, el pH del medio se ajusta a 3.0 usando ácido sulfúrico estéril (5%). Absidia coerulea ATCC 6647 se incuba a 28° usando los mismos parámetros iniciales que los que se usan para el cultivo de siembra secundaria. Aproximadamente 17 horas después de la inoculación, a la fermentación de 10 I se añaden 200 g de 5-androsten-3£-ol-17-ona micronizada, suspendida en un volumen mínimo de octilfenoxipolietoxietanol al 0.2%. Los cultivos de bioconversión se analizan a diario para determinar la presencia de 5-androsten-3/?,7 ?,1 ff-tr¡ol-17-ona usando TLC, tal como se describe en el EJEMPLO 1. La bioconversión de 5-androsten-3 ?-ol-17-ona en 5-androsten-3^,7yff,11 -triol- 7-ona se completa aproximadamente en 6-7 días después de la inoculación.

(D) Procedimiento de aislamiento Los sólidos del caldo de fermentación completo se recuperan por centrifugación. El líquido se desecha. Los sólidos enriquecidos se extraen usando 10 litros de acetona al 85% y agua al 15% de 45°C a 50°C y el extracto caliente se clarifica por filtración. El filtrado enriquecido se concentra por destilación para eliminar la acetona generando una suspensión acuosa de cristales brutos. La suspensión de cristales se filtra y se desechan las aguas madres. Los cristales humedecidos con agua se trituran en 600 mililitros de cloruro de metileno para eliminar las impurezas, se disuelven en 700 mi de metanol (calentado a 55°C) y después se decoloran con 5 gramos de carbono Darco G-60. Después de filtrar para eliminar el carbono, el filtrado se concentra para cristalizar el producto. El metanol se elimina adicionalmente añadiendo 300 mi de acetato de n-butilo y concentrando hasta una suspensión espesa de cristales. Los cristales se filtran, se lavan con acetato de n-butilo y se desecan proporcionando 75.5 gramos de 5-androsten-3/?,7j£,11 a-triol-17-ona cristalina bruta. Los cristales brutos se trituran en 600 mililitros de cloruro de metileno para eliminar más impurezas, se disuelven en 700 mi de metanol (calentado a 55°C) y después se decoloran con 5 gramos de carbono Darco G-60. Después de filtrar para eliminar el carbono, el filtrado se concentra para cristalizar el producto. El metanol se elimina adicionalmente añadiendo 300 mi de acetato de n-butilo y concentrando hasta una suspensión espesa de cristales. Los cristales se filtran, se lavan con acetato de n-butilo y se desecan proporcionando 42.1 gramos de 5-androsten-3 ?,7/?, 1 a-triol-17-ona cristalina purificada.

EJEMPLO 6 Preparación de 5,9(11)-androstadien-3 ?-ol-17-ona a partir de 5- androsten-3 ?. 1 s-dioM 7-ona Etapa 1 A una suspensión de 5-androsten-3yS,11 -diol-17-ona (30.4 g, 100 mmol) en CH2CI2 (300 mi) se añadió TMEDA (18.1 mi, 120 mmol). La suspensión se enfrió a -10°C y se añadió cloroformiato metílico (7.72 mi, 100 mmol). La reacción se dejó calentar a temperatura ambiente. Según la TLC, la reacción no se había completado de forma que se añadió más cloroformiato de metilo (772 µ\, 10 mmol). Cuando se determinó mediante TLC que se había completado la reacción, se añadieron EtOAc (300 mi) y H2O (100 mi) y se separaron las fases resultantes. La fase orgánica se lavó con 50 mi de H20, se desecó sobre MgS04 y se concentró a un aceite que solidificó al reposar. El producto bruto se recristalizó en EtOAc caliente/CH2Cl2 y heptano. La suspensión se enfrió más a 0-5°C y el producto se recolectó por filtración (22 g, rendimiento del 60.8%). El carbonato se purificó adicionalmente por cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con un gradiente de acetona al 5%-20% CH2Cl2 para obtener monocarbonato puro (20.57, 56.8%).

Etapa 2 El carbonato de la etapa 1 (38.0 g, 0.105 mol) se disolvió en 570 mi de THF y se enfrió a -35°. Lentamente se añadió PCI5 sólido (37.1 g, 0.178 mol) manteniendo la temperatura por debajo de -30°C. Cuando la TLC mostró que se había completado la reacción, la mezcla se vertió en una solución de NaHC03 fría y el producto se extrajo con acetato de etilo. Las fases orgánicas se desecaron sobre MgS04 y se concentraron proporcionando un aceite.

Etapa 3 Este aceite de la etapa 2 se disolvió en metanol (500 mi) y se trató con 36.1 g de K2C03 y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. El carbonato residual se eliminó por filtración. La solución se concentró parcialmente y se añadió agua para precipitar el alcohol diénico deseado, que se desecó en un horno a 45°C. Rendimiento de 29.52 g. Habiendo descrito la invención como antecede se declara como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un 7 ?-hidroxiesterolde de la fórmula (II) en el que R3 es: (1) -H; (2) -CO-R4, en el que R4 es H o alquilo C1-C5; en el que R-17 y R 8 juntos forman =0 o en el que Ri7 y R18 junto con el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo al que están unidos forman un anillo de lactona de la fórmula en el que Z Z2 es un enlace simple o un enlace doble. 2. - El 7 ?-hidroxiesteroide (II) de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque R3es H. 3. - El 7 ?-hidroxiesteroide (II) de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque R3 es -C(0)-CH3. 4. - El 7 ?-hidroxiesteroide (II) de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque R-17 y Re forman =0. 5. - El 7 ?-hidroxiesteroide (II) de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque R 7 y R-ie y el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo forman el anillo de lactona. 6.- El 7^-hidroxiesteroide (II) de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el anillo de lactona tiene la estereoquímica a y ß que se muestra en la fórmula 7.- El 7 ?-hidroxiesteroide (II) de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el 7 ?-hidroxiesteroide (II) es 5-androsten-3 ?,7/?-diol-17-ona. 8. - El 7/?-hidroxiesteroide (II) de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el 7 ?-hidroxiestero¡de (II) es 5,9(11)-androstadien-3y5,7jg-diol-17-ona. 9. - Un s-hidroxiesteroide de la fórmula (III) en el que R3 es: (1) -H; (2) -CO-R4, en el que R4 es H o alquilo C1-C5; en el que R17 y R-ia juntos forman =0 o en el que R17 y R-i8 junto con el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo al que están unidos forman un anillo de lactona de la fórmula 10.- El ? ? s-hidroxiesteroide (III) de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque F¾ es H. 11. - El 11 a-hidroxiesteroide (lll) de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque R3 es -C(0)-CH3. 12. - El 1 a-h¡droxiesteroide (III) de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque Ri7 y F½ forman =0. 13. - El 11 -hidroxiesteroide (III) de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque R 7 y Ri8 y el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo forman el anillo de lactona. 14. - El 7 ?-hidrox¡estero¡de (II) de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el anillo de lactona tiene la estereoquímica a y ß que se muestra en la fórmula 15 - El 11a-hidroxiesteroide (III) de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el 1 1 -hidroxiesteroide es 5-androsten-3>5,11 s-diol-l 7-ona. 16.- Un 7 ?,1 -dihidroxiesteroide de la fórmula (IV) en el que R3 es: (1 ) -H; (2) -CO-R4, en el que R4 es H o alquilo C C5; en el que R 7 y Ri8 juntos forman =0 o en el que R17 y R 8 junto con el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo al que están unidos forman un anillo de lactona de la fórmula 17.- El 7^,1 1 ar-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque R3 es H. 18.- El 7/?,1 1 -dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque R3 es -C(0)-CH3. 19. - El 7Jff,1 1 -dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque Ri7y Ríe forman =0. 20. - El 7/?,1 1 a-dihidroxiestero¡de (IV) de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque R17 y R-IB y el átomo de carbono C 7 del esqueleto esteroideo forman el anillo de lactona. 21.- El 7/?-hidroxiesteroide (II) de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el anillo de lactona tiene la estereoquímica a y ß que se muestra en la fórmula 22. - El 7jí?,11 ff-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el 7^,11a-dihidroxiesteroide (IV) es 5-androsten-¾S,7(?, 1 s-triol-l 7-ona. 23. - Un procedimiento para la preparación de un 7ß-hidroxiesteroide de la fórmula (II) en el que R3 es: (1) -H; (2) -CO-R4, en el que R4 es H o alquilo C C5; en el que R17 y Ri8 juntos forman =0 o en el que R17 y Ríe junto con el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo al que están unidos forman un anillo de lactona de la fórmula el que Z1-Z2 es un enlace simple o un enlace doble, comprendiendo el procedimiento: (1) poner en contacto un A5-esteroide de la fórmula (I) en el que R3, R17, R 8 y Z Z2 son tal como se definen anteriormente, con 7ß-hidroxilasa de Diplodia. 24. - El procedimiento para la preparación de un 7ß-hidroxiesteroide (II) de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque R3 es H. 25. - El procedimiento para la preparación de un 7ß-hidroxiesteroide (II) de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque R3 es -C(0)-CH3. 26. - El procedimiento para la preparación de un 7ß-hidroxiesteroide (II) de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque R17 y R18 forman =0. 27. - El procedimiento para la preparación de un 7/3-hidroxiesteroide (II) de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque R17 y R18 y el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo forman el anillo de lactona. 28. - El procedimiento para la preparación de un 7ß-hidroxiesteroide (II) de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el anillo de lactona tiene la estereoquímica a y ß que se muestra en la fórmula 29. - El procedimiento para la preparación de un 7ß-hidroxiesteroide (II) de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el 7j£-hidroxiesteroide (II) es 5-androsten-3 ?,7 ?-diol-17-ona. 30. - El procedimiento para la preparación de un 7ß-hidroxiesteroide (II) de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el 7/?-hidroxiesteroide (II) es 5,9(11)-androstadien-3^,7jS-diol-17-ona. 31. - El procedimiento para la preparación de un 7ß-hidroxiesteroide (II) de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque la puesta en contacto es mediante fermentación, concentrado celular, células enteras o reacción sin células. 32. - El procedimiento para la preparación de un 7ß-hidroxiesteroide (II) de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque la puesta en contacto es mediante fermentación. 33.- El procedimiento para la preparación de un 7ß-hidroxiesteroide (II) de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque la Diplodia es Diplodia gossypina. 34.- Un procedimiento para la preparación de un 11a-hidroxiesteroide de la fórmula (III) en el que R3 es: (1 ) -H; (2) -CO-R4, en el que F¾ es H o alquilo C1-C5; en el que Ri7 y Ri8 juntos forman =0 o en el que R17 y Ríe junto con el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo al que están unidos forman un anillo de lactona de la fórmula comprendiendo el procedimiento: (1) poner en contacto un A5-esteroide de la fórmula (I) en el que R3, Ru y íe son tal como se definen anteriormente y en el que Zr Z2 es un enlace sencillo, con 11s-hidroxilasa de Aspergillus. 35.- El procedimiento para la preparación de un 'l la-hidroxiesteroide (III) de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque R3 es H. 36.- El procedimiento para la preparación de un 11 a-hidroxiesteroide (III) de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque Rs es -C(0)-CH3. 37.- El procedimiento para la preparación de un 11 a-hidroxiesteroide (III) de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque Ri7 y R-?e forman =0. 38. - El procedimiento para la preparación de un 11 a-hidroxiesteroide (III) de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque R17 y R-is y el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo forman el anillo de Iactona. 39. - El procedimiento para la preparación de un 11 a-hidroxiesteroide (III) de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque el anillo de Iactona tiene la estereoquímica a y ß que se muestra en la fórmula 40. - El procedimiento para la preparación de un 11 a-hidroxiesteroide (III) de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque el 11 a-hidroxiesteroide es 5-androsten-3/?,1 a-diol-17-ona. 41. - El procedimiento para la preparación de un 11 a- hidroxiesteroide (III) de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque la puesta en contacto es mediante fermentación, concentrado celular, células enteras o reacción sin células. 42 - El procedimiento para la preparación de un 11 s-hidroxiesteroide (111) de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque la puesta en contacto es mediante fermentación. 43. - El procedimiento para la preparación de un 11 s-hidroxiesteroide (III) de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque el Aspergillus es Aspergillus ochraceus. 44. - Un procedimiento para la preparación de un 7/5,1 \a-dihidroxiesteroide de la fórmula (IV) en el que R3 es: (1) -H; (2) -CO-R4, en el que R4 es H o alquilo C-i-C5; en el que R17 y R18 juntos forman =0 o en el que R-|7 y R-|8 junto con el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo al que están unidos forman un anillo de lactona de la fórmula comprendiendo el procedimiento: (1 ) poner en contacto un 7^-hidroxiesteroide de la fórmula (II) en el que R3, R17 y R 8 son tal como se definen anteriormente y en el que Z Z2 es un enlace sencillo, con 11 -hidroxilasa de Aspergillus. 45. - El procedimiento para la preparación de un 7 ?,11 s-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque R3 es H. 46. - El procedimiento para la preparación de un 7 ?,11 o dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado además porque R3es -C(0)-CH3. 47. - El procedimiento para la preparación de un 7 ?,11o dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque Ri7y R-is forman =0. 48. - El procedimiento para la preparación de un 7 ?,11 s-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque R-i7 y íe y el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo forman el anillo de lactona. 49.- El procedimiento para la preparación de un 7 ?,11 s-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado además porque el anillo de lactona tiene la estereoquímica a y ß que se muestra en la fórmula 50.- El procedimiento para la preparación de un 7^,11 a-dlhidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado además porque el 7jS,11a-dihidroxiesteroide (IV) es 5-androsten-3yff,7 ?,11 ff-triol-17-ona. 51. - El procedimiento para la preparación de un 7/?,11s-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado además porque la puesta en contacto es mediante fermentación, concentrado celular, células enteras o reacción sin células. 52. - El procedimiento para la preparación de un 7ß? a-dihldroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque la puesta en contacto es mediante fermentación. 53. - El procedimiento para la preparación de un 1ß,\ \ a-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado además porque el Aspergillus es Aspergillus ochraceus. 54.- Un procedimiento para la preparación de un 7ß,11 s-dihidroxiesteroide de la fórmula (IV) en el que R3 es: (1 ) -H; (2) -CO-R4, en el que R4 es H o alquilo CrC-5; en el que R-17 y R18 juntos forman =0 o en el que R17 y R-is junto con el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo al que están unidos forman un anillo de lactona de la fórmula comprendiendo el procedimiento: (1) poner en contacto un A5-esteroide de la fórmula (I) en el que R3, R17 y R18 son tal como se definen anteriormente y en el que Z-i Z2 es un enlace sencillo, con 7 ?-hidroxi!asa de Diplodia, produciendo un 7ß hidroxiesteroide de la fórmula (II) en el que R3, Ri7, y Ríe son tal como se definen anteriormente y en el que Z-i-Z2 es un enlace sencillo; y (2) poner en contacto el 7 ?-hidrox¡esteroide (II) de la etapa (I) con 11a-hidroxilasa de Aspergillus. 55. - El procedimiento para la preparación de un 7 ?,11 a-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado además porque Ra es H. 56. - El procedimiento para la preparación de un 7^,11a-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque R3 es -C(0)-CH3. 57.- El procedimiento para la preparación de un ?ß^ s-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado además porque R-i7 y R-is forman =0. 58. - El procedimiento para la preparación de un 7ß,1 s-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado además porque R17 y R-is junto con el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo al que están unidos forman el anillo de lactona. 59. - El procedimiento para la preparación de un ?ß,\ \ a-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado además porque el anillo de lactona tiene la estereoquímica a y ß que se muestra en la fórmula 60. - El procedimiento para la preparación de un ?ß,? a-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado además porque el 7 ?,11a-d¡hidroxiesteroide (IV) es 5-androsten-3£,7/?,11a-triol-17-ona. 61. - El procedimiento para la preparación de un 7 ?,11a-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado además porque la puesta en contacto es mediante fermentación, concentrado celular, células enteras o reacción sin células. 62.- El procedimiento para la preparación de un 7/?,11a-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 61 , caracterizado además porque la puesta en contacto es mediante fermentación. 63. - El procedimiento para la preparación de un 7 ?,11s-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 61 , caracterizado además porque la Diplodla es Diplodia gossypina. 64. - El procedimiento para la preparación de un 7^,11 a-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 61 , caracterizado además porque el Aspergillus es Aspergillus ochraceus. 65.- El procedimiento para la preparación de un 7 ?,11 ar-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado además porque el 7yff-hidroxiesteroide (II) de la etapa (I) no se aisla antes de la puesta en contacto de la etapa (2). 66.- El procedimiento para la preparación de un 7^,1 \ -dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado además porque el 7jS-h¡droxiestero¡de (ll) de la etapa (I) se aisla antes de la puesta en contacto de la etapa (2). 67.- Un procedimiento para la preparación de un ?ß,\ 1 s-dihidroxiesteroide de la fórmula (IV) en el que F¾ es: (1 ) -H; (2) -CO-R4, en el que R4 es H o alquilo Ci-C5; en el que Ri7 y F½ juntos forman =0 o en el que R17 y R18 junto con el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo al que están unidos forman un anillo de lactona de la fórmula comprendiendo el procedimiento: (1 ) poner en contacto un A5-esteroide de la fórmula (I) en el que R3, R17 y R-ie son tal como se definen anteriormente y en el que Z-i-Z2 es un enlace sencillo, con la(s) 7 ?,1 l -hidroxilasa(s) de Absidia. 68.- El procedimiento para la preparación de un 7^,11 a-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado además porque R3 es H. 69.- El procedimiento para la preparación de un ?ß,\\ a-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado además porque R3 es -C(0)-CH3. 70. - El procedimiento para la preparación de un 7 ?,11 s-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado además porque R-| y R^ forman =0. 71. - El procedimiento para la preparación de un 7^,11 a-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado además porque Ri7 y 18 junto con el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo al que están unidos forman el anillo de lactona. 72.- El procedimiento para la preparación de un 7ß,\ ?a-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado además porque el anillo de lactona tiene la estereoquímica a y ß que se muestra en la fórmula 73. - El procedimiento para la preparación de un 7/?,1 \ a-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado además porque el 7 ?,11a-dihidroxiesteroide (IV) es 5-androsten-3>í?,7 ?,11 <7-triol-17-ona. 74. - El procedimiento para la preparación de un ?ß? 1 s-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado además porque la puesta en contacto es mediante fermentación, concentrado celular, células enteras o reacción sin células. 75. - El procedimiento para la preparación de un 7 ?,11o dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado además porque la puesta en contacto es mediante fermentación. 76.- El procedimiento para la preparación de un 7/?,11s-dihidroxiesteroide (IV) de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado además porque la Absidia es Absidia coerulea. 77.- Un procedimiento para la preparación de un 5,9(11 )-androstadieno de la fórmula (!) en el que R3 es: (1) -H; (2) -CO-R4, en el que R4 es H o alquilo C-i-C5; en el que Ri7 y Ri8 juntos forman =0 o en el que R17 y R18 junto con el átomo de carbono C17 del esqueleto esteroideo al que están unidos forman un anillo de lactona de la fórmula y en el que Z1-Z2 es un enlace doble, comprendiendo el procedimiento: (1 ) proporcionar un compuesto de la fórmula (III) en el que R3, R17 y R18 son tal como se definen anteriormente; y (2) eliminar el grupo hidroxilo en 1 \a para formar el enlace doble entre Zi y Z2 (fórmula I). 78.- El procedimiento de la reivindicación 77, caracterizado además porque la etapa de proporcionar el compuesto de la fórmula (III) incluye poner en contacto un A5-esteroide de la fórmula (I) en el que R3, R7 y R8 son tal como se definen anteriormente y en el que Z Z2 es un enlace sencillo, con 11s-hidroxilasa de Aspergillus.