ES2271636T3 - Intermediarios de 5 androsten-3-ol esteroides y procedimientos para su preparacion. - Google Patents
Intermediarios de 5 androsten-3-ol esteroides y procedimientos para su preparacion. Download PDFInfo
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Abstract
Un 7a, 11a dihidroxi esteroide de fórmula (IV) en el que R3 es: (1) -H; (2) -CO-R4 en el que R4 es H o alquilo C1-C5; en el que R17 y R18 forman de manera conjunta =O ó en el que R17 y R18 de manera conjunta con el átomo de carbono C17 del esqueleto de esteroide al cual se enlazan forman un anillo de lactona de fórmula
Description
Intermediarios de 5
androstén-3-ol esteroides y
procedimientos para su preparación.
La presente invención proporciona esteroides del
5-androstén-3\beta-ol
y los procedimientos para su preparación.
Los intermedios esteroides son a menudo útiles
en la producción de agentes farmacéuticos. La
5-androstén-3\beta,7\beta,11\alpha-triol-17-ona
es un intermedio esteroide útil para producir eplerenona.
De manera general, la presente invención
proporciona un procedimiento fúngico práctico para la
11\alpha-hidroxilación de la
5-androstén-3\beta-ol-17-ona
y otros análogos relacionados de fórmula general (I) para dar como
resultado
5-androstén-3\beta,7\beta,11\alpha-triol-17-ona
y otros análogos relacionados de fórmula general (IV).
En otro aspecto, la invención presenta un
7\beta,11\alpha-dihidroxi esteroide de fórmula
(IV)
en el que R_{3}
es:
(1) -H;
(2) -CO-R_{4}
en el que R_{4} es H o alquilo
C_{1}-C_{5};
en el que R_{17} y R_{18} forman de manera
conjunta =O ó
en el que R_{17} y R_{18} de manera conjunta
con el átomo de carbono C17 del esqueleto de esteroide al cual se
enlazan forman un anillo de lactona de fórmula 2 . Un
ejemplo del 7\beta,11\alpha-dihidroxi esteroide
de fórmula (IV) es la 5-androstén-
3\beta,7\beta,11\alpha-triol-17-ona.
En otro aspecto más, la invención presenta un
procedimiento para la preparación de un
7\beta,11\alpha-dihidroxi esteroide de fórmula
(IV)
en la que R_{3}
es
(1) -H;
(2) -CO-R_{4}
en el que R_{4} es H o alquilo
C_{1}-C_{5};
en el que R_{17} y R_{18} forman de manera
conjunta =O ó
en el que R_{17} y R_{18} de manera conjunta
con el átomo de carbono C17 del esqueleto de esteroide al cual se
enlazan forman un anillo de lactona de fórmula 4 ,
comprendiendo el procedimiento
(1) poner en contacto un
7\beta-hidroxi esteroide de fórmula (II)
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en el que R_{3}, R_{17} y
R_{18} son tal como se ha definido anteriormente y en el que
Z_{1}-Z_{2} es un enlace simple con una
11\alpha-hidroxilasa de Aspergillus, por
ejemplo, Aspergillus ochraceus. Un ejemplo del
7\beta,11\alpha-dihidroxi esteroide (V) es la
5-androstén-3\beta,7\beta,11\alpha-triol-17-ona.
El procedimiento de poner en contacto puede ser mediante
fermentación, concentrado de células, y reacción de células
completas o libres de
células.
En otro aspecto adicional más, la invención
presenta un procedimiento para la preparación de un
7\beta,11\alpha-dihidroxi esteroide de fórmula
(IV)
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en el que R_{3}
es
(1) -H;
(2) -CO-R_{4}
en el que R_{4} es H o alquilo
C_{1}-C_{5};
en el que R_{17} y R_{18} forman de manera
conjunta =O ó
\newpage
en el que R_{17} y R_{18} de manera conjunta
con el átomo de carbono C17 del esqueleto de esteroide al cual se
enlazan forman un anillo de lactona de fórmula 7 ,
comprendiendo el procedimiento
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En el que R_{3}, R_{18}, y R_{17} son tal
como se ha definido anteriormente y en el que
Z_{1}-Z_{2} es un enlace simple entre
7\beta-hidrolasa de Diplodia, por ejemplo,
Diplodia gossypina, para producir un
7\beta-hidroxi esteroide de fórmula (II)
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en el que R_{3}, R_{17},
R_{18}, y Z_{1}-Z_{2} son tal como se ha
definido anteriormente;
y
(2) poner en contacto el
7\beta-hidroxi esteroide (II) de la etapa (1) con
la 11\alpha-hidroxilasa de Aspergillus,
por ejemplo, Aspergillus ochraceus. Un ejemplo del
7\beta,11\alpha-dihidroxi esteroide (IV) es la
5-androstén-3\beta,7\beta,11\alpha-triol-17-ona.
El procedimiento para la preparación de un
7\beta,11\alpha-dihidroxi esteroide (IV) en el
que no se puede aislar el 7\beta-hidroxi esteroide
(II) de la etapa (1) es anterior a la puesta en contacto de la
etapa (2).
En otro aspecto, la invención presenta un
procedimiento para la preparación de un
7\beta,11\alpha-dihidroxi esteroide de fórmula
(IV)
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en la que R_{3}
es
(1) -H;
(2) -CO-R_{4}
en el que R_{4} es H o alquilo
C_{1}-C_{5};
en el que R_{17} y R_{18} forman de manera
conjunta =O ó
en el que R_{17} y R_{18} de manera conjunta
con el átomo de carbono C17 del esqueleto de esteroide al cual se
enlazan forman un anillo de lactona de fórmula 11 ,
comprendiendo el procedimiento
(1) poner en contacto un
\Delta^{5}-esteroide de fórmula (I)
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en el que R_{3}, R_{18}, y
R_{17} son tal como se ha definido anteriormente y en el que
Z_{1}-Z_{2} es un enlace simple con la
7\beta,11\alpha-hidroxilasa(s) de
Absidia, por ejemplo, Absidia coerulea. Un ejemplo
del 7\beta,11\alpha-dihidroxi esteroide (IV) es
la
5-androstén-3\beta,7\beta,11\alpha-triol-17-ona.
El procedimiento de poner en contacto puede ser mediante
fermentación, concentrado de células y reacción de células
completas o libre de
células.
Las formas de realización de cada aspecto de la
invención pueden incluir una o más de las siguientes. R_{3} es H.
R_{3} es-C(O)-CH_{3}.
R_{3} es –C(O)-H. R_{17} y R_{18}
forman =O. R_{17}, R_{18} y el átomo de carbono C17 del
esqueleto de esteroide forman el anillo de lactona que se muestra
anteriormente. El anillo de lactona tiene la estereoquímica
\alpha y \beta que se muestra en la fórmula
13 .
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Las definiciones y explicaciones siguientes son
para los términos tal como se usan a lo largo de este documento
completo, que incluye tanto la memoria como las
reivindicaciones.
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Las fórmulas químicas que representan los
diversos compuestos o fragmentos moleculares de la memoria y las
reivindicaciones pueden contener sustituyentes variables de manera
adicional a las características estructurales definidas de manera
expresa. Estos sustituyentes variables se identifican mediante una
letra o una letra seguida por un subíndice numérico, por ejemplo,
"Z_{i}" o "R_{i}" en los que "i" es un número
entero.
Las definiciones y explicaciones siguientes son
para los términos tal como se usan a lo largo del documento
completo que incluye tanto la memoria como las reivindicaciones.
\newpage
Todas las temperaturas están en grados
Celsius.
r.p.m se refiere a revoluciones por minuto.
TLC se refiere a cromatografía en capa fina.
HPLC se refiere a cromatografía líquida de alta
resolución.
psig se refiere a libras por pulgada
cuadrada.
DO se refiere a oxígeno disuelto.
RO se refiere a ósmosis inversa.
SLM se refiere a litros estándar por minuto.
VVM se refiere a volumen por minuto.
OUR se refiere a la velocidad de captación de
oxígeno.
Cuando se usan mezclas de solventes, las
relaciones de los solventes usados son volumen/volumen (v/v).
De manera general, la invención se refiere a los
7\beta,11\alpha-dihidroesteroides y a los
procedimientos para su preparación. Se pueden usar los compuestos
de esta invención en la producción de Eplerenona. El Esquema I
ilustra un procedimiento posible para usar unos
7\beta,11\alpha-dihidroesteroides para producir
Eplerenona.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
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En referencia al Esquema I, se puede producir el
intermedio 2 añadiendo hexametildisilazano (HMDS) (100 ml) a una
suspensión agitada de 50,0 g de Triol 1 en 40 ml de cloruro de
metileno. A continuación se añadió sacarina (0,57 g) y se calentó
la mezcla bajo reflujo durante 3 horas durante las cuales la
suspensión se disolverá de manera gradual hasta una solución ámbar
transparente. Se añadió agua (5 ml) para detener rápidamente
cualquier exceso de HMDS, Tras 5 minutos a reflujo se filtró la
mezcla a través de una capa húmeda de CH_{2}Cl_{2} de 32,6 g de
magnesol en un embudo de vidrio fritado grueso de 350 ml. El
filtrado debería ser transparente y casi incoloro. Se lavó la torta
del filtro con 2 x 100 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se concentraron los
filtrados combinados bajo presión reducida y se eliminó el cloruro
de metileno residual mediante evaporación con porciones de 2 x 500
ml de tetrahidrofurano (THF), concentrando hasta sequedad tras cada
adición para dar un sólido blanco.
Se enfrió una suspensión de
t-butóxido de potasio (42,0 g) en 500 ml de THF a
-9º \pm 5ºC con un baño de hielo/metanol. Se burbujeó acetileno en
la mezcla justo por debajo de la superficie con agitación moderada
durante al menos 1 hora. Se añadió el intermedio esteroide sigilado
procedente del anterior en THF (400 ml) durante 30 min manteniendo
a la vez una temperatura de reacción de 0º \pm 5ºC. Tras la
adición, se agitó la mezcla durante una hora más a 5º \pm 5ºC. Se
añadió agua (100 ml) lentamente dejando calentar la mezcla de
reacción hasta 15º \pm 5ºC. Se añadieron lentamente 125 ml de HCl
al 10% para reducir el pH se 2,5 a 3. Se agitó la mezcla a pH 2,5 a
3, añadiendo pequeñas cantidades de HCl al 5% tal como se necesita
para mantener un pH de 2,5 a 3, durante 1 a 2 horas a 20º \pm
5ºC. Cuando se completa la hidrólisis, se añade la solución de
NaHCO_{3} semisaturado para aumentar el pH de 5,5 a 6. se diluye
la mezcla con acetato de etilo (500 ml) y se separan las fases. Se
extrae la fase acuosa con acetato de etilo y se lavan las fases de
acetato de etilo combinado con agua y salmuera, se secan sobre
sulfato de magnesio y se concentran para dar el producto de adición
2.
Se puede acilar el intermedio 2 disolviendo el
tetraol 2 (50,00 g, 144 mmol) en piridina (150 ml) y enfriando la
mezcla resultante a < 10ºC en un baño de hielo. Se añadió
dimetilaminopiridina (DMAP) (1,7 g, 14 mmol) seguida por la adición
lenta de anhídrido acético (41,4 ml, 439 mmol) a una velocidad para
mantener la temperatura de la solución por debajo de 10ºC. Se
diluyó la mezcla con acetato de etilo (75 ml) y agua (50 ml), se
agitó durante 5 minutos y se separaron las capas. Se lavó la capa
orgánica con HCl al 10%/4 x 25) seguido por H_{2}O (2 x 50 ml),
se secó sobre MgSO_{4} y se concentró. Se recristalizó el producto
en tolueno (100 ml).
Se puede producir la hidroformilación del
intermedio acilado 3 calentando el compuesto 3 (25,4 g, 54 mmol)
con PPh_{3} (2,13 g, 8,1 mmol) y Rh_{2}(OAc)_{4}
(716 mg, 1,62 mmol) en acetato de etilo (200 ml) a aproximadamente
80ºC bajo una mezcla 1/1 de hidrógeno/monóxido de carbono a una
presión de 170 psi (1,17 x 10^{6} N/m^{2}) durante 12 horas. Se
concentró la mezcla bajo presión reducida y se purificó el producto
4 mediante cromatografía en columna (70/30 EtOAc/Hex y 500 g de
sílice).
Se puede llevar a cabo la oxidación del
compuesto lactol 4 mezclando el lactol 4 (25 g, 50 mmol), cloruro
de metileno (250 ml), agua (38 ml),
2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxil
(TEMPO) (156 mg, 1 mmol), KBr (595 mg, 5 mmol), y NaHCO_{3} (5,5,
65 mmol), y enfriar la mezcla a \leq 10ºC en un baño de hielo. Se
añadió lentamente una solución de hipoclorito de sodio 1,1 M
(NaOCl) (50 ml, 55 mmol). Se dejó calentar la mezcla a temperatura
ambiente y se diluyó con agua (50 ml). Se separaron las capas y se
lavó la capa orgánica con salmuera (2 x 50 ml). Se secó la capa
orgánica con MgSO_{4}, se filtró y se concentró para dar como
resultado 5 en forma de una espuma color crema.
Calentando una mezcla del triacetato 5 (2,0 g),
Pd(dppp)Br_{2} (126 mg), diisopropil amina (0,78
mL), Et_{4}NBr (260 mg), NaBr (1,09 g) en 20 ml de etanol bajo
1200 psi (8,27 x 10^{6} N/m^{2}) de CO a 65ºC durante doce
horas, seguida por enfriamiento, concentración y cromatografía del
residuo sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexano al
40-75% proporcionó el éster de metilo 6.
Se agitó a temperatura ambiente una solución de
diacetiléster 6 (5,01 g) en carbonato de potasio 0,15 N en metanol
(50 ml) y se monitorizó la reacción mediante TLC. Cuando ya no se
detecta el material de partida 6, se diluyó la mezcla con agua (200
ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 X 200 ml). Se lavaron los
extractos combinados con agua (100 ml), salmuera (100 ml), se
secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron a presión
reducida hasta sequedad. Se cromatografió el residuo sobre gel de
sílice con acetato de etilo/hexano para dar el
3-hidroxi compuesto 7.
Se enfrió a 5ºC una mezcla de alcohol 7 (6,0 g),
CH_{2}Cl_{2} (40 mL), agua (9,0 mL),
2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil
(TEMPO) (38 mg), KBr (142 mg) y bicarbonato de sodio (4,0 g). Se
añadieron lentamente a esta mezcla 14,1 ml de NaOCl 1,1 M. Tras la
adición, se dejó agitar la mezcla durante 1 h más y se acidificó con
HCl diluido. Se aisló el producto 8 con CH_{2}Cl_{2}.
Se agitó a temperatura ambiente una solución de
compuesto 8 (5,01 g) en carbonato de potasio 0,15 N en metanol (50
ml) y se monitorizó la reacción mediante TLC. Cuando ya no se
detecta el material de partida 8, se diluyó la mezcla con agua (200
ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 X 200 ml). Se lavaron los
extractos combinados con agua (100 ml), salmuera (100 ml), se
secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron a presión
reducida hasta sequedad. Se cromatografió el residuo sobre gel de
sílice con acetato de etilo/hexano para dar el compuesto 9.
Se añadió PCl_{5} a una solución del compuesto
9 en THF a -51ºC que dio como resultado un aumento de la
temperatura a -48ºC. Tras 2 h, se vertió la mezcla en NaHCO_{3}
acuoso y se extrajo con EtOAc y se concentró. Se cromatografió el
material sobre gel de sílice con EtOAc/hexano para dar como
resultado el compuesto dieno 10.
Se produjo Eperlenona mediante epoxidación del
compuesto 10 mediante procedimientos conocidos descritos, por
ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos N^{os} 4.559.332, y
5.981.744, los contenidos de las cuales se incorporan en su
totalidad por referencia.
En referencia al Diagrama A, se pueden convertir
los compuestos
androst-5-en-17-ona
de fórmula (I) en diferentes intermedios esteroides mediante
reacciones fúngicas. Por ejemplo poniendo en contacto los compuestos
androst-5-en-17-ona
de fórmula (I), en los que Z_{1}-Z_{2} es un
tanto un enlace simple como un doble enlace, con Diplodia
gossypina se producen los compuestos
7\beta-hidroxi
androst-5-en-17-ona
de fórmula (II). Los compuestos
11\alpha-hidroxiandrost-5-en-17-ona
de formula (III) se producen poniendo en contacto los compuestos
androst-5-en-17-ona
de fórmula (I) en los que Z_{1}-Z_{2} es un
enlace simple, con Aspergillus ochraceus. De manera
sorprendente, poniendo en contacto los compuestos
11\alpha-hidroxiandrost-5-en-17-ona
de fórmula (III) con Diplodia gossipina se fracasa en la
producción de los compuestos
7\beta,11\alpha-dihidroxiandrost-5-en-17-ona
de fórmula (IV), mientras que poniendo en contacto los compuestos
7\beta-hidroxiandrost-5-en-17-ona
de fórmula (II), en los que Z_{1}-Z_{2} es un
enlace simple, con Aspergillus ochraceus, se producen los
compuestos
7\beta,11\alpha-dihidroxiandrost-5-en-17-ona
de fórmula (IV). De manera inesperada, poniendo en contacto los
compuestos
androst-5-en-17-ona
de fórmula (I), en los que Z_{1}-Z_{2} es un
enlace simple, con Absidia coerulea, se producen de manera
directa los compuestos
7\beta,11\alpha-dihidroxiandrost-5-en-17-ona
de fórmula (IV).
Diagrama
A
Los hongos filamentosos reactivos pertenecen a
los géneros Diplodia (sinónimos Botryodiplodia,
Lasiodiplodia), Aspergillus, y Absidia coerulea,
y se prepararon de manera general mediante un estado primario y
secundario de semilla vegetativa. Se utilizó la semilla secundaria
para inocular la etapa de bioconversión del esteroide.
Se puede usar el procedimiento descrito en el
presente documento para producir compuestos esteroides de fórmula
(I), (II), (III), y (IV), que son intermedios útiles para la
fabricación de esteroides farmacéuticamente activos tales como los
antagonistas del receptor de la aldosterona. De manera adicional,
5-androstén-3\beta,7\beta-diol-17-ona
(fórmula II en la que R_{3} es un hidrógeno y R_{17} y R_{18}
son de manera conjunta una cetona, y Z_{1}-Z_{2}
es un enlace simple) es un intermedio atractivo para la síntesis de
5-androstén-3\beta-ol-7,17-diona,
un suplemento esteroide comercialmente disponible que se ha
postulado tiene efectos beneficiosos sobre las enfermedades del
corazón, la función inmune, el envejecimiento, y el bienestar
general.
Los compuestos esteroides de fórmula (I), en los
que Z_{1}-Z_{2} es un enlace simple o un doble
enlace, se hidroxilan microbiológicamente en la posición 7 para
producir los compuestos esteroides de fórmula (II), en los que
Z_{1}-Z_{2} es un enlace simple o un doble
enlace.
Se puede usar en el procedimiento de la
invención cualquier hongo filamentoso de los géneros Diplodia,
Botryodiplodia, o Lasiodiplodia de los esteroides capaz
de 7\beta-hidroxilar los esteroides de fórmula
(I). Se usan, de manera preferible, Diplodia gossypina ATCC
20571 (sinónimo, Botryodiplodia theobromae IFO 6469) o
Botryodiplodia malorum ATCC 24444 (sinónimo CBS 134.50). Se
usa, de manera más preferible, Diplodia gossypina ATCC 20571
(sinónimo Botryodiplodia theobromae IFO 6469).
Se puede utilizar la hidroxilasa fúngica en
forma de un cultivo que crece activamente, un concentrado de células
completas, o un extracto libre de células. De manera preferible, se
hace crecer el hongo en un cultivo sumergido en condiciones
aerobias, usando cualquier procedimiento reconocido por la técnica,
y la reacción de 7\beta-hidroxilación se lleva a
cabo in situ.
Se puede cultivar el hongo deseado en las
condiciones que se muestran en los Ejemplos 1 y 2 usando los
ingredientes especificados, u otras fuentes adecuadas de carbono y
nitrógeno tales como las conocidas por aquellas personas expertas
en la técnica. De manera general, se usa un procedimiento de siembra
vegetativo primario y secundario en la preparación de la
7\beta-hidroxilación fúngica. De manera
alternativa, se puede usar directamente una siembra vegetativa
primaria para inocular el medio de bioconversión.
Se pueden incubar los cultivos de semillas
vegetativas primarias durante un período de aproximadamente 24 a
aproximadamente 96 horas (de manera preferible aproximadamente
48-72 horas) a una temperatura entre aproximadamente
20º y aproximadamente 37º (de manera preferible aproximadamente
28º), y un pH entre aproximadamente 3,0 y aproximadamente 7,5. El
medio de siembra vegetativo secundario se inocula con
aproximadamente un 0,006% a aproximadamente un 0,1% (v/v) de
cultivos de siembras vegetativas secundarios, pero normalmente
aproximadamente un 0,012% (v/v), y se incuba durante un período de
aproximadamente 36 a aproximadamente 72 horas (de manera preferible
aproximadamente 60 horas) a una temperatura entre aproximadamente
20º y aproximadamente 37º (de manera preferible aproximadamente
28º). El pH del medio de siembra secundario puede estar entre
aproximadamente 2,5 y aproximadamente 7,0, pero de manera
preferible entre aproximadamente 3,0 y aproximadamente 5,0. El medio
de bioconversión, que puede ser el mismo o similar al medio de
siembra vegetativo secundario, se inocula con aproximadamente un 1%
a aproximadamente un 10% (v/v) de cultivo de siembra vegetativo
secundario (de manera preferible aproximadamente un 3% a
aproximadamente un 5%). Tras un período de incubación inicial de
aproximadamente 12 a aproximadamente 72 horas (de manera preferible
aproximadamente 16 a aproximadamente 24 horas), se añaden los
sustratos esteroides de fórmula (I), de manera preferible
micronizados, al cultivo de bioconversión. Se pueden añadir los
sustratos esteroides micronizados de fórmula (I) como un polvo en
seco o una suspensión acuosa, bien como una adición única o como
una serie de adiciones, o una alimentación continua. Se prefiere
usar los sustratos esteroides micronizados de fórmula (I) a una
concentración mayor de 1 g/L, de manera más preferible mayor de 2,5
g/L, incluso de manera más preferible mayor de 5 g/L. Se deja
proceder a la bioconversión de sustratos esteroides de fórmula (I)
para formar productos 7\beta hidroxilados de fórmula (II), de
manera respectiva, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 6
días, pero normalmente aproximadamente 3 a aproximadamente 4
días.
Se puede mejorar mucho la velocidad y extensión
de la 7\beta hidroxilación mediante (i) cultivar el hongo
seleccionado, y llevar a cabo la bioconversión en presencia de un
detergente. Se puede seleccionar el detergente entre el grupo
constituido por detergentes no iónicos, pero de manera preferible
por los subgrupos constituidos por alquifenoles etoxilados y
ésteres de polioxietilensorbitán. De manera más preferible, se usa
monooleato de polioxietilensorbitán; (ii) cultivar el hongo
seleccionado, y llevar a cabo la bioconversión en presencia de
aceite natural. Se puede seleccionar el aceite natural entre, pero
sin restringirse a, el grupo constituido por aceite de castor,
aceite de maíz, aceite de semillas de algodón, aceite de manteca de
cerdo, aceite de semillas de lino, aceite de oliva, aceite de
cacahuete, aceite de semillas de colza, aceite de semillas de
cártamo, aceite de soja, aceite de semillas de girasol, y aceite de
germen de trigo. De
manera preferible, se usa el aceite de soja; (iii) usando una combinación de las metodologías identificadas en (i) e (ii).
manera preferible, se usa el aceite de soja; (iii) usando una combinación de las metodologías identificadas en (i) e (ii).
Una vez se completa la bioconversión de los
sustratos esteroides de fórmula (I) a productos 7\beta
hidroxilados de fórmula (II), se pueden aislar los compuestos de
fórmula (II) usando uno cualquiera de los numerosos procedimientos
reconocidos por la técnica. De manera preferible se extraen sólidos
de cerveza usando un solvente orgánico, tal como metanol, acetona,
acetato de butilo, o cloruro de metileno y se aísla el producto
7\beta hidroxilado de fórmula (II) mediante cristalización. Los
solventes de cristalización incluyen un solvente seleccionado
entre, pero no restringido a, el grupo constituido por agua,
metanol, acetona, acetato de butilo, cloruro de metileno, o las
combinaciones de los mismos. La extracción preferida y el solvente
de cristalización para el producto 7\beta hidroxilado de fórmula
(II) es el cloruro de metileno.
Los compuestos esteroides de fórmula (I) ó (II),
en los que Z_{1}-Z_{2} es un enlace simple o un
doble enlace, se hidroxilan microbiológicamente en la posición 11
para producir los compuestos esteroides de fórmula (III) ó (IV), de
manera respectiva.
Se puede usar en el procedimiento de la
invención cualquier hongo filamentoso del género Aspergillus
capaz de 7\beta-hidroxilar los esteroides de
fórmula (I).ó (II), en el que Z_{1}-Z_{2} es un
enlace simple que se puede usar en el procedimiento de la
invención. De manera preferible, se usa Aspergillus ochraceus
ATCC 18500 (sinónimo NRRL 405)
Se puede utilizar la hidroxilasa fúngica en
forma de un cultivo que crece activamente, un concentrado de células
completas, o un extracto libre de células. De manera preferible, se
hace crecer el hongo en un cultivo sumergido bajo condiciones
aerobias, usando cualquier procedimiento reconocido por la técnica,
y la reacción de 7\beta-hidroxilación se lleva a
cabo in situ.
Se puede cultivar el hongo deseado en las
condiciones que se muestran en los Ejemplos 3 y 4 usando los
ingredientes especificados, u otras fuentes adecuadas de carbono y
nitrógeno tales como las conocidas por aquellas personas expertas
en la técnica. De manera general, se usa un procedimiento de siembra
vegetativo primario y secundario en la preparación de la
11\alpha-hidroxilación fúngica. De manera
alternativa, se puede usar directamente una siembra vegetativa
primaria para inocular el medio de bioconversión.
Se pueden incubar los cultivos de las siembras
vegetativas primarias durante un período de aproximadamente 24 a
aproximadamente 96 horas (de manera preferible aproximadamente
48-72 horas) a una temperatura entre aproximadamente
20º y aproximadamente 37º (de manera preferible aproximadamente
28º), y un pH entre aproximadamente 3,0 y aproximadamente 7,5. El
medio de siembra vegetativo secundario se inocula con
aproximadamente un 0,006% a aproximadamente un 0,1% (v/v) de
cultivo de siembras vegetativas secundario, pero normalmente
aproximadamente un 0,012% (v/v), y se incuba durante un período de
aproximadamente 36 a aproximadamente 72 horas (de manera preferible
aproximadamente 60 horas) a una temperatura entre aproximadamente
20º y aproximadamente 37º (de manera preferible aproximadamente
28º. El pH del medio de siembra secundario puede estar entre
aproximadamente 2,5 y aproximadamente 7,0, pero de manera
preferible entre aproximadamente 3,0 y aproximadamente 5,0. El medio
de bioconversión, que puede ser el mismos o similar al medio de
siembra vegetativo secundario, se inocula con aproximadamente un 1%
a aproximadamente un 10% (v/v) de cultivo de siembras vegetativo
secundario (de manera preferible aproximadamente un 3% a
aproximadamente un 5%). Tras un período de incubación inicial de
aproximadamente 12 a aproximadamente 72 horas (de manera preferible
aproximadamente 16 a aproximadamente 24 horas), se añaden los
sustratos esteroides de fórmula (I) ó (II), en los que
Z_{1}-Z_{2} es un enlace simple con el cultivo
de bioconversión. De manera preferible se micronizan los sustratos.
Se pueden añadir los sustratos esteroides micronizados de fórmula
(I) ó (II) como un polvo en seco o una suspensión acuosa, bien como
una adición única o como una serie de adiciones, o una alimentación
continua. Se prefiere usar los sustratos esteroides micronizados de
fórmula (I) ó (II) en los que Z_{1}-Z_{2} es un
enlace simple a una concentración mayor de 1 g/L, de manera más
preferible mayor de 2,5 g/L, incluso de manera más preferible mayor
de 5 g/L. Se deja proceder a la bioconversión de sustratos
esteroides de fórmula (I) ó (II), en los que
Z_{1}-Z_{2} es un enlace simple para formar
productos 11\alpha hidroxilados de fórmula (III) ó (IV), de
manera respectiva, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 6 días,
pero normalmente aproximadamente 2 a aproximadamente 3 días.
Se puede mejorar mucho la velocidad y extensión
de la 11\alpha hidroxilación mediante (i) cultivar el hongo
seleccionado, y llevar a cabo la bioconversión en presencia de un
detergente. Se puede seleccionar el detergente entre el grupo
constituido por detergentes no iónicos, pero de manera preferible
por los subgrupos constituidos por alquifenoles etoxilados y
ésteres de polioxietilensorbitán. De manera más preferible, se usan
octilfenoxipolietoxietanol o nonilfenoxipolietoxietanol; (ii)
cultivar el hongo seleccionado, y llevar a cabo la bioconversión en
presencia de aceite natural. Se puede seleccionar el aceite natural
entre, pero sin restringirse a, el grupo constituido por aceite de
castor, aceite de maíz, aceite de semillas de algodón, aceite de
manteca de cerdo, aceite de semillas de lino, aceite de oliva,
aceite de cacahuete, aceite de semillas de colza, aceite de semillas
de cártamo, aceite de soja, aceite de semillas de girasol, y aceite
de germen de trigo. De manera preferible, se usa el aceite de soja;
(iii) usando una combinación de metodologías identificadas en (i) e
(ii).
Una vez se completa la bioconversión de los
sustratos esteroides de fórmula (I) ó (II) en los que
Z_{1}-Z_{2} es un enlace simple a productos
11\alpha hidroxilados de fórmula (III) o (IV), se pueden aislar
los compuestos de fórmula (III) o (IV) usando uno cualquiera de los
numerosos procedimientos reconocidos por la técnica. De manera
preferible se extraen los sólidos de cerveza, filtrados o
centrifugados o las cervezas completas, usando un solvente orgánico
miscible en agua, tal como metanol o acetona, a temperaturas tan
bajas como aproximadamente 15ºC o tan altas como aproximadamente
55ºC. La temperatura de extracción preferida es aproximadamente
45-50ºC. Se genera el producto crudo 11\alpha
hidroxilado de fórmula (II) ó (IV) mediante cristalización
evaporativa, para eliminar el solvente orgánico, y enfriar. La
mezcla solvente de extracción preferida es acetona
80-85%/agua 15-20%. Se descarta el
licor acuoso residual.
Se purificó el producto crudo cristalino
11\alpha hidroxilado de fórmula (III) ó (IV), mediante tratamiento
con carbono y cristalización. Se prefiere que el tratamiento con
carbono y la cristalización posterior se lleven a cabo usando un
solvente miscible en agua seleccionado entre, pero no restringido a,
el grupo constituido por metanol o acetona. El solvente del
tratamiento de carbono/cristalización preferido es metanol. Tras la
eliminación del carbono mediante filtración, se lleva a cabo la
cristalización mediante evaporación del solvente y
enfriamiento.
Se pueden producir los compuestos de fórmula (I)
en los que Z_{1}-Z_{2} es un doble enlace
eliminando el 11\alpha hidroxil del producto de fórmula (III)
usando procedimientos químicos conocidos.
Los compuestos esteroides de fórmula (I), en los
que Z_{1}-Z_{2} es un enlace simple, se
hidroxilan microbiológicamente en la posiciones 7- y 11-, en una
etapa única, para producir los compuestos esteroides de fórmula
(IV).
Se puede usar en el procedimiento de la
invención cualquier hongo filamentoso del género Absidia
capaz de 7\beta,11\alpha dihidroxilar los esteroides de
fórmula (I), en los que Z_{1}-Z_{2} es un enlace
simple. De manera preferible, se usa Absidia coerulea ATCC
6647 (sinónimo Absidia orchidis).
Se puede(n) utilizar la(s)
hidroxilasa(s) fúngica(s) en forma de un cultivo que
crece activamente, un concentrado de células completas, o un
extracto libre de células. De manera preferible, se hace crecer el
hongo en un cultivo sumergido en condiciones aerobias, usando
cualquier procedimiento reconocido por la técnica, y las reacciones
de 7\beta y 11\alpha hidroxilación se llevan a cabo in
situ.
Se puede cultivar el hongo deseado bajo las
condiciones que se muestran en el Ejemplo 5 usando los ingredientes
especificados, u otras fuentes adecuadas de carbono y nitrógeno
tales como las conocidas por aquellas personas expertas en la
técnica. De manera general, se usa un procedimiento de siembra
vegetativo primario y secundario en la preparación de la 7\beta-
y 11\alpha-dihidroxilación fúngica. De manera
alternativa, se puede usar directamente una siembra vegetativa
primaria para inocular el medio de bioconversión.
Se pueden incubar los cultivos de siembra
vegetativos primarios durante un período de aproximadamente 24 a
aproximadamente 96 horas (de manera preferible aproximadamente
48-72 horas) a una temperatura entre aproximadamente
20º y aproximadamente 37º (de manera preferible aproximadamente
28º), y un pH entre aproximadamente 3,0 y aproximadamente 7,5. El
medio de siembra vegetativo secundario, que puede ser el mismo o
similar al medio de siembras primario, se inocula con
aproximadamente un 0,006% a aproximadamente un 0,1% (v/v) de cultivo
de siembras vegetativo primario, pero normalmente aproximadamente
un 0,012% (v/v), y se incuba durante un período de aproximadamente
36 a aproximadamente 96 horas (de manera preferible aproximadamente
70 a 80 horas) a una temperatura entre aproximadamente 20º y
aproximadamente 37º (de manera preferible aproximadamente 28º. El
pH del medio de siembra secundario puede estar entre aproximadamente
2,5 y aproximadamente 7,5, pero de manera preferible entre
aproximadamente 3,0 y aproximadamente 7,0. El medio de
bioconversión, que puede ser el mismo o similar al medio de siembra
vegetativo secundario, se inocula con aproximadamente un 1% a
aproximadamente un 10% (v/v) de cultivo de siembras vegetativo
secundario (de manera preferible aproximadamente un 3% a
aproximadamente un 5%). Tras un período de incubación inicial de
aproximadamente 12 a aproximadamente 72 horas (de manera preferible
aproximadamente 15 a aproximadamente 24 horas), se añaden los
sustratos esteroides de fórmula (I),en los que
Z_{1}-Z_{2} es un enlace simple en el cultivo de
bioconversión. De manera preferible se micronizan los sustratos. Se
pueden añadir los sustratos esteroides micronizados de fórmula (I),
en los que Z_{1}-Z_{2} es un enlace simple como
un polvo en seco o una suspensión acuosa, bien como una adición
única o como una serie de adiciones, o una alimentación continua. Se
prefieren usar los sustratos esteroides micronizados de fórmula (I)
en los que Z_{1}-Z_{2} es un enlace simple a una
concentración mayor de 1 g/L, de manera más preferible mayor de 2,5
g/L, incluso de manera más preferible mayor de 5 g/L. Se deja
proceder a la bioconversión de los sustratos esteroides de fórmula
(I), en los que Z_{1}-Z_{2} es un enlace simple
para formar los productos 11\alpha hidroxilados de fórmula (IV),
se deja proceder entre aproximadamente 2 y aproximadamente 9 días,
pero normalmente aproximadamente 5 a aproximadamente 7 días. Una vez
se completa la bioconversión de los sustratos esteroides de fórmula
(I), en los que Z_{1}-Z_{2} es un enlace simple,
a los productos 7\beta,11\alpha dihidroxilados de fórmula (IV),
se pueden aislar los compuestos de fórmula (IV) usando uno
cualquiera de los numerosos procedimientos reconocidos por la
técnica. De manera preferible, se extraen los sólidos de cerveza
filtrados o centrifugados, o las cervezas completas, usando un
solvente orgánico miscible en agua, tal como metanol o acetona a
temperaturas tan bajas como aproximadamente 15ºC o tan altas como
aproximadamente 55ºC. La temperatura de extracción preferida es
aproximadamente 45 – 50ºC. Se genera el producto 7\beta,11\alpha
dihidroxilado crudo de fórmula IV mediante cristalización
evaporativa, para eliminar el solvente orgánico, y enfriar. La
mezcla de solvente de extracción preferida es acetona al 80%/agua
al 20%. Se descarta el licor acuoso residual.
Se purificó el producto 7\beta,11\alpha
dihidroxilado cristalino crudo de fórmula (IV) mediante trituración
con cloruro de metileno, para eliminar las impurezas no deseadas,
seguido por el tratamiento con carbono y cristalización. Se
prefiere que el tratamiento con carbono y la cristalización
posterior se lleven a cabo usando un solvente miscible en agua
seleccionado entre, pero sin restringirse a, el grupo constituido
por metanol o acetona o sus mezclas. El solvente preferido para el
tratamiento de carbono/cristalización es metanol. Tras eliminar el
carbono mediante filtración, se consigue la cristalización del
producto mediante evaporación del solvente y enfriamiento.
Se cree que una persona experta en la técnica,
sin elaboración adicional y siguiendo las descripciones anteriores,
puede poner en práctica la presente invención en su extensión más
completa. Los siguientes ejemplos detallados describen cómo
preparar los diversos compuestos y/o llevar a cabo los diversos
procedimientos de la invención que se deben tomar de manera
meramente ilustrativa, y no como limitaciones de la descripción
precedente de cualquiera de las maneras. Aquellas personas expertas
en la técnica reconocerán con prontitud las variaciones de los
procedimientos tales como los reactivos y tales como las condiciones
de reacción y las técnicas.
3\beta-hidroxiandrost-5-en-17-ona,
denominado también
5-androstén-3\beta-ol-17-
ona, está disponible de Jiangsu Wujin Pharmaceuticals localizada en
China.
Ejemplo
1
La bioconversión de
5-androstén-3\beta-ol-17-ona
en
5-androstén-3\beta,7\beta-diol-17-ona
se lleva a cabo usando un cultivo sumergido de Diplodia
gossypina ATCC 20571 (sinónimo Botryodiplodia theobromae
IFO 6469) en una escala de fermentación de
10-L.
Se descongelaron las células vegetativas
congeladas de Diplodia gossypina ATCC 20571, se transfirieron
a placas con agar patata-dextrosa (PDA), y se
incubaron a 28º durante 72 horas. Se usaron tapones miceliales
únicos (6-7 mm de diámetro) para inocular en
matraces agitados apuntados de 500 mL siliconizados que contenían
100 mL de medio de siembra primario. El medio de siembra primario
está constituido por (por litro de agua RO): dextrina, 50 g; harina
de soja, 35 g; cerelosa, 5 g; cloruro de cobalto hexahidrato, 2 mg;
desespumante de silicona (SAG 471), 0,5 mL; se ajustó la
preesterilización a pH 7,0-7,2 con hidróxido de
sodio (2 N). Se incubó Diplodia gossypina ATCC 20571 durante
48 horas a 28º, usando un incubador-agitador de
ambiente controlado ajustado a 280 r.p.m (2,54 de carrera).
Se inocularon fermentadores de diez litros con
siembra secundaria usando 1,2 mL de cultivo de siembra primario
vegetativo (0,012% [v/v] velocidad de inóculo). El medio de siembra
secundario contiene (por litro de agua RO): cerelosa, 60 g; harina
de soja, 25 g; aceite de soja, 30 mL, sulfato de magnesio
heptahidrato, 1 g; dihidrógeno fosfato de potasio, 0,74 g;
monooletato de polioxietilensorbitán, 2 mL; desespumante de silicona
(SAG 471), 0,5 mL; se ajustó la preesterilización a pH
3,95-4,00, con ácido sulfúrico concentrado. Los
fermentos, que contienen medio de siembra secundario, se
esterilizaron durante 20 minutos a 121º usando tanto camisa como
inyección de vapor. La velocidad de agitación durante la
esterilización es de 200 r.p.m. Se ajustó el pH del medio en la
postesterilización a 4,0 usando ácido sulfúrico estéril. Se incubó
Diplodia gossypina ATCC 20571 a 28º usando los siguientes
parámetros iniciales: agitación, 100 r.p.m.; presión de apoyo = 5
psig; (3,44 x 10^{4} N/m^{2})caudal de aire = 2,5 SLM
(0,25 VVM); punto de ajuste del DO bajo, 30%; control del pH;
ninguno. Cuando el DO car por primera vez alcanzaron el 30%, se
incrementa el caudal de aire a 5 SLM (0,5 VVM). Cuando el cultivo
alcanza de nuevo un DO bajo, se mantiene el DO al 30% usando el
control de la agitación. Se cosecharon los cultivos de siembra
secundarios a aproximadamente las 60 horas después de la
inoculación cuando la OUR está entre aproximadamente 10 y
aproximadamente 15 mM/L/h.
Se inocularon fermentadores de diez litros de
bioconversión esteroide usando 500 mL de cultivo de siembra
secundario (5% [v/v] tasa de inoculación). El medio de bioconversión
esteroide es el mismo que el medio de siembra secundario. Las
condiciones de esterilización y el ajuste del pH son iguales a los
descritos para el medio de siembra secundario. Se incubó
Diplodia gossypina ATCC 20571 a 28º usando esencialmente los
mismos parámetros iniciales que aquellos usados para el cultivo de
siembra secundario, con la excepción que se aumenta el punto de
ajuste del DO bajo desde un 30% a un 50%. Cuando el DO car por
primera vez alcanzan el 50% se incrementa el caudal de aire desde
2,5 SLM (0,25 VVM) a 5 SLM (0,5 VVM). Cuando el cultivo alcanza de
nuevo el DO bajo, se mantiene el DO al 50% usando el control de la
agitación. Comenzando a las 24 horas después de la inoculación, se
añade el
5-androstén-3\beta-ol-17-ona
micronizado, suspendido en un volumen mínimo de monooleato de
polioxietilensorbitán al 0,2% a la fermentación en intervalos de una
hora hasta que se añaden un total de 400 g. A los aproximadamente 3
días después de la inoculación, se añaden 100 g más de cerelosa a
la fermentación de 10-L.
Se ensayaron los cultivos de bioconversión
diariamente para el
5-androstén-3\beta,7\beta-diol-17-ona
usando la TLC. Se extrajo un mililitro de cerveza entera con 10 mL
de metanol. Se separaron las células de la mezcla acuosa – metanol
mediante centrifugación (3.000 x g durante 10 minutos, y se
aplicaron algunos microlitros a una placa de TLC. Se desarrolló la
placa de TLC en ciclohexano : acetato de etilo : metanol (90:60;15)
y se visualizó el producto pulverizando la TLC con ácido sulfúrico
al 50%, seguido por la carbonización en un horno. Se comparó el
producto con el estándar auténtico, que se vuelve azul pulverizando
con ácido sulfúrico al 50%. Se completó la bioconversión del
5-androstén-3\beta-ol-17-ona
a
5-androstén-3\beta,7\beta-diol-17-ona
aproximadamente 4 días después de la inoculación.
Se centrifugó la cerveza después de su
cosechado, y se recuperaron los sólido ricos mediante
centrifugación. Se extrajeron los sólidos ricos con 10 litros de
cloruro de metileno y se recuperó el extracto rico, mediante
centrifugación. Se limpiaron los extractos y se concentraron hasta
aproximadamente 1 litro mediante destilación y la suspensión de
cristales se enfrió a -10ºC. Se recuperaron los cristales mediante
filtración, se lavaron con cloruro de metileno frío para eliminar
el color, y se secaron para dar 227 gramos de la
5-androstén-3\beta,7\beta-diol-17-ona.
Ejemplo
2
Se lleva a cabo la bioconversión de
5,9(11)-androstadien-3\beta-ol-17-ona
en
5,9(11)-androstadien-3\beta7\beta-diol-17-ona
usando un cultivo sumergido de Diplodia gossypina ATCC 20571
(sinónimo de Botryodiplodia theobromae IFO 6469) en una
escala de fermentación de 10-L.
Se preparan los cultivos de siembra primarios
tal como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Se prepararon diez litros de cultivos de siembra
secundarios tal como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Se prepararon diez litros de cultivos de
bioconversión del esteroide tal como se ha descrito en el Ejemplo
1. A aproximadamente 24 horas después de la inoculación, se
añadieron 120 g de
5,9(11)-androstadien-3\beta-ol-17-ona,
suspendidos en un volumen mínimo de monooleato de
polioxietilensorbitán al 0,2%, a la fermentación de
10-L.
Se evaluaron los cultivos de bioconversión en
una base diaria para
5,9(11)-androstadien-3\beta,7\beta-diol-17-ona
usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Se completó la
bioconversión de la
5,9(11)-androstadien-3\beta-ol-17-ona
en la
5,9(11)-androstadien-3\beta,7\beta-diol-17-ona
aproximadamente 3 días después de la inoculación.
Se recuperaron los sólidos ricos de la cerveza
entera mediante centrifugación. Se extrajo la fase líquida de la
cerveza usando 15 litros de cloruro de metileno. Tras la
sedimentación, se decantó y descartó la capa de cerveza residual
superior. A continuación se usó el cloruro de metileno rico restante
para extraer los sólidos ricos. Se purgó el extracto de cloruro de
metileno resultante de los sólidos residuales, se lavó, se
concentró mediante destilación en aproximadamente 0,5 litros, y se
enfrió a -10ºC. Se recuperaron los cristales obtenidos mediante
filtración, se lavaron con acetato de n-butilo para
eliminar el color, y se secaron para dar 52,2 gramos de la
5,9(11)-androstadien-3\beta,7\beta-diol-17-ona
cristalina purificada.
Ejemplo
3
Se lleva a cabo la bioconversión de de la
5-androsten-3\beta-ol-17-ona
en
5-androsten-3\beta,11\alpha-diol-17-ona
usando un cultivo sumergido de Aspergillus ochraceus ATCC
18500 (sinónimo NRRL 405) en una escala de fermentación de
10-L.
Se prepararon los cultivos de siembra primarios
de Aspergillus ochraceus ATCC 18500 tal como se ha descrito
para la Diplodia gossypina ATCC 20571 en el Ejemplo 1.
Se inocularon fermentadores de diez litros con
siembra secundaria usando 1,2 mL de cultivo de siembra primario
vegetativo (0,012% [v/v] índice de inóculo). El medio de siembra
secundario contiene (por litro de agua RO): cerelosa, 40 g; harina
de soja, 25 g; aceite de soja, 30 mL, sulfato de magnesio
heptahidrato, 1 g; dihidrógeno fosfato de potasio, 0,74 g;
nonilfenoxipolietoxietanol, 0,25 mL; desespumante de silicona (SAG
471), 0,5 mL; se ajustó la preesterilización a pH
3,95-4,00, con ácido sulfúrico concentrado. Los
fermentadores, que contienen medio de siembra secundario, se
esterilizaron durante 20 minutos a 121º usando tanto camisa como
inyección de vapor. La velocidad de agitación durante la
esterilización es de 200 r.p.m. Se ajustó el pH del medio en la
postesterilización a 4,0 usando ácido sulfúrico estéril. Se incubó
Aspergillus ochraceus ATCC 18500 a 28º usando los siguientes
parámetros iniciales: agitación, 100 r.p.m.; presión de apoyo = 5
psig; (3,44 x 10^{4} N/m^{2})caudal de aire = 2,5 SLM
(0,25 VVM); punto de ajuste del DO bajo, 50%; control del pH;
ninguno. Cuando el DO car por primera vez alcanzaron el 50%, se
incrementa el caudal de aire a 5 SLM (0,5 VVM). Cuando el cultivo
alcanza de nuevo un DO bajo, se mantiene el DO al 50% usando el
control de la agitación. Se cosecharon los cultivos de siembra
secundarios a aproximadamente entre 50 y 54 horas después de la
inoculación cuando la OUR está entre aproximadamente 20 y
aproximadamente 26 mM/L/h.
Se inocularon fermentadores de bioconversión
esteroide de diez litros usando 500 mL de cultivo de siembra
secundario (5% [v/v] tasa de inoculación). El medio de bioconversión
esteroide es esencialmente el mismo que el medio de siembra
secundario, con la excepción que el nonilfenoxipoloetoxietanol se
incrementa de 0,25 mL/L a 2 mL/L, y el pH de preesterilización se
ajustó a 2,95-3,00 con ácido sulfúrico concentrado.
Las condiciones de esterilización son iguales a las descritos para
el medio de siembra secundario. Tras la esterilización, el pH del
medio se ajustó a 3,00 con ácido sulfúrico estéril (5%). Se incubó
Aspergillus ochraceus ATCC 18500 a 28º usando esencialmente
los mismos parámetros iniciales que los usados para el cultivo de
siembra secundario, con la excepción que se ajusta inicialmente la
agitación a 200 r.p.m. A las 18 horas de la inoculación, se
micronizaron 200 de
5-androstén-3\beta-ol-17-ona,
se suspendieron en un volumen mínimo de nonilfenoxipoloetoxietanol
al 0,2% se añadieron a la fermentación de 10-L.
Se ensayaron los cultivos de bioconversión
diariamente respecto del
5-androstén-3\beta,11\alpha-diol-17-ona
usando la TLC. Se extrajo un mililitro de cerveza entera con 19 mL
de metanol. Se separaron las células de la mezcla acuosa – metanol
mediante centrifugación (3.000 x g durante 10 minutos), y se
aplicaron algunos microlitros a una placa de TLC. Se desarrolló la
placa de TLC en ciclohexano : acetato de etilo : metanol (90:60:15)
y se visualizó el producto pulverizando la TLC con ácido sulfúrico
al 50%, seguido por la carbonización en un horno. Se comparó el
producto con el estándar auténtico, que se vuelve azul pulverizando
con ácido sulfúrico al 50%. Se completó la bioconversión de la
5-androstén-3\beta-ol-17-ona
en
5-androstén-3\beta,11\alpha-diol-17-ona
a aproximadamente 3 días después de la inoculación.
Se recuperaron los sólidos de la cerveza entera
mediante centrifugación. Se descartó el líquido. Se extrajeron los
sólidos ricos con 10 litros de acetona al 85%, agua al 20% a de 45ºC
a 50ºC, y se recuperó el extracto rico mediante centrifugación. Se
concentró el extracto mediante destilación para eliminar la acetona,
que genera una suspensión acuosa de cristales crudos. Se
recuperaron los cristales crudos mediante filtración y se descartó
el licor madre. Se disolvieron los cristales húmedos en agua en 700
mililitros de metanol calentando a 55ºC, y a continuación se
decoloraron con 5 gramos de carbono Darco G-60. Tras
la filtración para eliminar el carbono, se concentró el filtrado
para cristalizar el producto. Se eliminó el metanol de manera
adicional añadiendo 300 mL de acetato de n-butilo y
se concentró hasta una suspensión espesa de cristales. Se filtraron
los cristales, se lavaron con acetato de n-butilo, y
se secaron para dar 158 gramos de la 5-androstén
3\beta,11\alpha-diol-17-ona
cristalina purificada.
Ejemplo
4
Se lleva a cabo la bioconversión de la
5-androstén-3\beta,7\beta-diol-17-ona
en
5-androstén-3\beta,7\beta,11\alpha-triol-17-ona
usando un cultivo sumergido de Aspergillus ochraceus ATCC
18500 (sinónimo NRRL 405) en una escala de fermentación de
10-L.
Se prepararon los cultivos de siembra primarios
de Aspergillus ochraceus ATCC 18500 tal como se ha descrito
en el Ejemplo 3.
Se prepararon diez litros de cultivos de siembra
secundarios de Aspergillus ochraceus ATCC 18500 tal como se
ha descrito en el Ejemplo 3.
Se prepararon diez litros de cultivos de
bioconversión del esteroide de Aspergillus ochraceus ATCC
18500 tal como se ha descrito en el Ejemplo 3.
A aproximadamente 18 horas después de la
inoculación, se añadieron 200 g micronizados de
5-androstén-3\beta,7\beta-diol-17-ona,
suspendidos en un volumen mínimo de nonilfenoxipolietoxietanol al
0,2%, a la fermentación de
10-L.
10-L.
Se evaluaron los cultivos de bioconversión
diariamente de
5-androstén-3\beta,7\beta,11\alpha-triol-17-ona
usando la TLC, tal como se ha descrito en el EJEMPLO 1. Se completó
la bioconversión de la
5-androstén-3\beta,7\beta-diol-17-ona
en
3\beta,7\beta,11\alpha-triol-17-ona
aproximadamente 4 días después de la inoculación.
Se recuperaron los sólidos de la cerveza entera
mediante centrifugación. Se descartó el líquido. Se extrajeron los
sólidos ricos con 10 litros de acetona al 80%, agua al 20% a 45ºC a
50ºC y se clarificó el extracto caliente mediante filtración. Se
concentró el filtrado rico mediante destilación para eliminar la
acetona, que genera una suspensión acuosa de cristales crudos. Se
recuperaron los cristales crudos mediante filtración y se descartó
el licor madre. Se trituraron los cristales húmedos en agua en 600
mililitros de cloruro de metileno para eliminar las impurezas, se
disolvieron en 700 mililitros de metanol (calentando a 55ºC) y a
continuación se decoloraron con 5 gramos de carbono Darco
G-60. Tras la filtración para eliminar el carbono,
se concentró el filtrado para cristalizar el producto. Se eliminó el
metanol de manera adicional añadiendo 300 mL de acetato de n butilo
y se concentró hasta una suspensión espesa de cristales. Se
filtraron los cristales, se lavaron con acetato de
n-butilo, y se secaron para dar 158 gramos de la
5-androstén
3\beta,7\beta,11\alpha-triol-17-ona
cristalina purificada.
Ejemplo
5
Se llevó a cabo la bioconversión de
5-androstén-3\beta-ol-17-ona
en
5-androstén-3\beta,7\beta,11\alpha-triol-17-ona
usando un cultivo sumergido de Absidia coerulea ATCC 6647
(sinónimo Absidia orchidis) en una báscula de fermentación
de 10-L.
Se prepararon los cultivos de siembra primarios
de Absidia coerulea ATCC 6647 tal como se ha descrito para
Diplodia gossypina ATCC 20571 en el Ejemplo 1
Se inocularon fermentadores de diez litros de
siembra secundarios usando 1,2 mL de cultivo de siembra primario
vegetativo (0,012% [v/v] tasa de inoculación). El medio de siembra
secundario contiene (por litro de agua RO): dextrina, 50 g; harina
de soja, 35 g; cerelosa, 5 g; cloruro de cobalto hexahidrato, 2 mg;
desespumante de silicona (SAG 471), 0,5 mL; se ajustó la
preesterilización a pH 4,95-5,00 con ácido sulfúrico
concentrado. Se esterilizaron los fermentadores, que contienen
medio de siembra secundario, durante 20 minutos a 121º usando
camisa y corriente de inyección. La velocidad de agitación durante
la esterilización es de 200 r.p.m. Tras la esterilización, se
ajustó el pH del medio a 5,0 usando ácido sulfúrico estéril (al 5%).
Se incubó Absidia coerulea ATCC 6647 a 28º usando los
siguientes parámetros iniciales: agitación, 100 r.p.m.; presión de
apoyo = 5 psig (3,44 x 10^{4} N/m^{2}); caudal de aire = 2,5
SLM (0,25 VVM); punto de ajuste del DO bajo, 50 %; control del pH,
ninguno: Cuando el DO cae por primera vez al 30%, se incrementa el
caudal de aire a 5 SLM (0,5 VVM). Cuando el cultivo alcanza de
nuevo el DO bajo, se mantiene el DO al 30% usando el control de la
agitación. Se cosecharon los cultivos de siembra secundarios
aproximadamente 76 horas después de la inoculación, cuando la OUR
está entre 4 y aproximadamente
7 mM/L/h.
7 mM/L/h.
Se inocularon fermentadores de diez litros de
bioconversión del esteroide usando 500 mL de cultivo de siembra
secundario vegetativo (5% [v/v] tasa de inoculación). El medio de
bioconversión del esteroide contiene (por litro de agua RO):
dextrina, 50 g; harina de soja, 35 g; cerelosa, 20 g; desespumante
de silicona (SAG 471), 0,5 mL, se ajusto la preesterilización a pH
2,95-3,00 con ácido sulfúrico concentrado. Las
condiciones de esterilización son tal como se han descrito para el
medio de siembra secundario. Tras la esterilización, se ajustó el
pH del medio a 3,0 usando ácido sulfúrico estéril (al 5%). Se incubó
Absidia coerulea ATCC 6647 a 28º usando los mismos
parámetros iniciales que aquello usados para el cultivo de siembra
secundario. A aproximadamente las 17 horas después de la
inoculación, se añadieron 200 g de
5-androstén-3\beta-ol-17-ona
micronizados, suspendidos en un volumen mínimo de
octilfenoxipolietoxietanol al 0,2% a la fermentación de
10-L.
Se evaluaron los cultivos de bioconversión
diariamente respecto del
5-androstén-3\beta,7\beta,11\alpha-triol-17-ona
usando TLC, tal como se ha descrito en el EJEMPLO1. Se completó la
bioconversión del
5-androstén-3\beta-ol-17-ona
en
5-androstén-3\beta,7\beta,11\alpha-triol-17-ona
aproximadamente 6-7 días después de la
inoculación.
Se recuperaron los sólidos de la cerveza entera
mediante centrifugación. Se descartó el líquido. Se extrajeron los
sólidos ricos usando 10 litros de acetona al 85% agua al 15% a 45ºC
a 50ºC y se clarificó el extracto caliente mediante filtración. Se
concentró el filtrado rico mediante destilación para eliminar la
acetona, que genera una suspensión acuosa de cristales crudos. Se
filtró la suspensión de cristales y se descartó el licor madre. Se
trituraron los cristales húmedos en agua en 600 mililitros de
cloruro de metileno para eliminar las impurezas, se disolvieron en
700 mililitros de metanol (calentando a 55ºC), y a continuación se
decoloraron con 5 gramos de carbono Darco G-60.
Tras la filtración para eliminar el carbono, se concentró el
filtrado para cristalizar el producto. Se eliminó el metanol de
manera adicional añadiendo 300 mL de acetato de
n-butilo y se concentró hasta una suspensión e
cristales espesa. Se filtraron los cristales, se lavaron con acetato
de n-butilo, y se secaron para dar 75,5 gramos de
la
5-androstén-3\beta,7\beta,11\alpha-triol-17-ona.
Se trituraron los cristales crudos en 600
mililitros de cloruro de metileno para eliminar las impurezas
adicionales, se disolvieron en 700 mililitros de metanol
(calentando a 55ºC), y a continuación se decoloraron con 5 gramos
de carbono Darco G-60. tras la filtración para
eliminar el carbono, se concentró el filtrado para cristalizar el
producto. Se eliminó el metanol de manera adicional añadiendo 300 mL
de acetato de n-butilo y se concentró hasta una
suspensión espesa de cristales. Se filtraron los cristales, se
lavaron con acetato de n-butilo, y se secaron para
dar 42,1 gramos de la
5-androstén-3\beta,7\beta,11\alpha-triol-17-ona
cristalina purificada.
Ejemplo
6
Etapa
1
Se añadió TMEDA (18,1 mL, 120 mmol) a una
suspensión de
5-androstén-3\beta,11\alpha-diol-17-ona
(30,4 g, 100 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (300 mL). Se enfrió la
suspensión a -10ºC y se añadió cloroformiato de metilo (7,72 mL,
100 mmol). Se dejó calentar la reacción a temperatura ambiente. No
se completó la reacción mediante la TLC de tal manera que se añadió
más cloroformiato de metilo (772 \muL, 100 mmol). Cuando se
determinó que se completó la reacción mediante la TLC, se añadieron
EtOAc (300 mL) y H_{2}O (100 mL) y se separaron las capas
resultantes. Se lavó la fase orgánica con 50 mL de H_{2}O, se secó
sobre MgSO_{4} y se concentró hasta un aceite que se solidificó
dejándolo reposar. Se recristalizó el producto crudo a partir de
EtOAc/CH_{2}Cl_{2} caliente y heptano. Se enfrió la suspensión
de manera adicional a 0-5ºC y se recogió el
producto mediante filtración (22 g, 60,8 de producto químico). Se
purificó el carbonato de manera adicional mediante cromatografía en
columna sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente de
acetona/CH_{2}Cl_{2} al 5% - 20% para obtener el monocarbonato
puro (20,57, 56,8%).
Etapa
2
Se disolvió el carbonato de la etapa 1
(38,0 g, 0,105 mol) en 570 mL de THF y se enfrió a -35ºC. Se añadió
lentamente PCl_{5} (37,1 g, o,178 mol) manteniendo la temperatura
por debajo de -30ºC. Cuando la TLC mostró la reacción completa se
vertió la mezcla en una solución de NaHCO_{3} frío y se extrajo el
producto con acetato de etilo. Se secaron las capas orgánicas sobre
MgSO_{4} y se concentraron para dar como resultado un aceite.
Etapa
3
Se disolvió este aceite de la etapa 2 en
metanol (500 ml) y se trató con 36,1 g de K_{2}CO_{3} y se agitó
la mezcla a temperatura ambiente 15 h. Se eliminó el carbonato
residual mediante filtración. Se concentró parcialmente la solución
y se añadió agua para precipitar el alcohol diénico deseado, que se
secó en un horno a 45ºC. Resultado 29,52 g.
Claims (17)
1. Un 7\beta,11\alpha dihidroxi esteroide de
fórmula (IV)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en el que R_{3}
es:
(1) -H;
(2) -CO-R_{4}
en el que R_{4} es H o alquilo
C_{1}-C_{5};
en el que R_{17} y R_{18} forman de manera
conjunta =O ó
en el que R_{17} y R_{18} de manera conjunta
con el átomo de carbono C17 del esqueleto de esteroide al cual se
enlazan forman un anillo de lactona de fórmula 18
2. Un procedimiento para la preparación de un
compuesto de fórmula (IV) de acuerdo con la reivindicación 1, que
comprende
(1) poner en contacto un
7\beta-hidroxi esteroide de fórmula (II)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{3}, R_{17}, y
R_{18} son tal como se ha definido en la reivindicación 1 y en la
que Z_{1}-Z_{2} es un enlace simple con la
11\alpha hidroxilasa de
Aspergillus.
3. Un procedimiento para la preparación de un
compuesto de fórmula (IV) de acuerdo con la reivindicación 1, que
comprende
\newpage
(1) poner en contacto un \Delta^{5}-
esteroide de fórmula (I)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{3}, R_{18} y
R_{17} son tal como se ha definido en la reivindicación 1 y en la
que Z_{1}-Z_{2} es un enlace simple con la
7\beta hidroxilasa de Diplodia para producir un
7\beta-hidroxi esteroide de fórmula
(II)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{3}, R_{17} y
R_{18} son tal como se ha definido en la reivindicación 1 y en la
que Z_{1}-Z_{2} es un enlace simple;
y
(2) poner en contacto el
7\beta-hidroxi esteroide (II) de la etapa (I) con
la 1 1\alpha- hidroxilasa de Aspergillus.
4. Un procedimiento para la preparación de un
compuesto de fórmula (IV) de acuerdo con la reivindicación 1, que
comprende
(1) poner en contacto un \Delta^{5}-
esteroide de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{3}, R_{18}, y
R_{17} son tal como se ha definido en la reivindicación 1 y en la
que Z_{1}-Z_{2} es un enlace simple con la
7\beta,11\alpha-hidroxilasa de
Absidia.
5. El compuesto o procedimiento de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que R_{3} es
H.
6. El compuesto o procedimiento de acuerdo con
la reivindicación 5 en el que R_{3} es
–C(O)-CH_{3}.
7. El compuesto o procedimiento de acuerdo con
alguna de las reivindicaciones 1 a 4 en el que R_{17} y R_{18}
forman =O
8. El compuesto o procedimiento de acuerdo con
alguna de las reivindicaciones 1 a 4 en el que R_{17}, R_{18},
y el átomo de carbono C17 del esqueleto de esteroide forman el
anillo de lactona.
9. El compuesto o procedimiento de acuerdo con
la reivindicación 8 en el que el anillo de lactona tiene la
estereoquímica \alpha y \beta que se muestra en la fórmula
23
10. El compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el 7\beta,11\alpha- dihidroxi
esteroide es la
5-androstén-3\beta,7\beta,11\alpha-triol-17-ona.
11. El procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el poner en contacto es
mediante reacción de fermentación, concentrado de células, reacción
de células completas o libre de células.
12. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11 en el que poner en contacto es mediante
fermentación.
13. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que Diplodia es Diplodia
gossypina.
14. El procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 2 a 3, en el que Aspergillus es
Aspergillus ochraceus.
15. El procedimiento para la preparación de un
compuesto de fórmula (IV) de acuerdo con la reivindicación 3 en el
que el 7\beta-hidroxi esteroide (II) de la etapa
(I) no se aísla antes de la puesta en contacto de la etapa (2).
16. El procedimiento para la preparación de un
compuesto de fórmula (IV) de acuerdo con la reivindicación 3 en el
que el 7\beta-hidroxi esteroide (II) de la etapa
(I) se aísla antes de la puesta en contacto de la etapa (2).
17. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4 en el que Absidia es Absidia
coerulea.
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