MXPA05014202A - Procedimiento microbiano para la hidrolisis y oxidacion de esteres esteroideos de androst-5-eno y preg-5-eno. - Google Patents

Abstract

Se da a conocer un procedimiento microbiano para la hidrolisis y la oxidacion de esteres esteroideos de androst-5-eno y pregn-5-eno.

Description

PROCEDIMIENTO MICROBIANO PARA LA HIDRÓLISIS Y OXIDACIÓN DE ESTERES ESTEROIDEOS DE ANDROST-5-ENO Y PREGN-5-ENO CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención describe una transformación microbiana de compuestos esteroideos 5-eno sustituidos con 3,7-dihidroxi- o 3-hidroxi-7-carbox¡ en la que existe una hidrólisis concomitante de ésteres de alcanoílo, oxidación de 3-hidroxi a 3-cetona y migración del doble enlace 5,6 a la posición 4,5. Los productos resultantes son intermedios útiles en la preparación de eplerenona y otros esteroides sustituidos en 7.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Ciertos esteroides sustituidos con 7-carboxi, por ejemplo eplerenona, son bien conocidos por su actividad antagonista de aldosterona y son por tanto útiles en el tratamiento y la prevención de enfermedades del sistema circulatorio. Las patentes de EE.UU. n° 4.559.332 y 5.981.744 y la publicación internacional WO 98/25948 describen procedimientos para la preparación de eplerenona y compuestos relacionados. Sin embargo, la aparición de usos clínicos nuevos y extendidos para la eplerenona crea la necesidad de procedimientos mejorados para la fabricación de éste y otros esteroides relacionados. Se han reseñado transformaciones microbianas de compuestos esteroideos en las que existe una hidrólisis concomitante de ésteres de alcanoílo C C4 seguida de la oxidación de un grupo 3-hidroxi a la correspondiente cetona (véase por ejemplo: patentes de EE.UU. 4.012.510; 3.379.745; 3.352.923; 3.293.285). Sin embargo, estas biotransformaciones no se han aplicado hasta el momento a esteroides sustituidos en 7. Esta transformación, si se realiza químicamente, requiere una serie de etapas y puede conducir a la epimerización de sustituyentes en C-7.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a procedimientos para la transformación microbiana de compuestos esteroideos sustituidos en 7 de fórmula I, Fórmula I en la que Ri es H o alquil d-Ce-CÍO)-; R2 es -ORi o -C(0)-0-alqu¡lo Ci-C6; O -C O R , C i es Z2 es -CH-; o Zi y Z2 pueden tomarse conjuntamente para formar un doble enlace carbono-carbono; en intermedios esteroideos de fórmula II Fórmula II en la que R2, Zi, Z2 y Q son como para la fórmula I; cuando se utilizan compuestos de fórmula II como intermedios para la síntesis de epierenona, R2 es ß-?^ o a-C(0)-0-alqu¡lo CrC6. Los compuestos de fórmula II son útiles para la preparación de esteroides sustituidos en 7, especialmente epierenona, como se describe con detalle en la descripción de las realizaciones.

DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES Definiciones En la descripción detallada, se utilizan las siguientes definiciones. El término "alquilo", por sí solo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique otra cosa, una cadena lineal o ramificada, o un radical hidrocarburo cíclico, o una combinación de los mismos. Los ejemplos de radicales hidrocarburo saturados incluyen, pero sin limitación, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, ferc-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciciohexiio, (ciclohexil)etilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros por ejemplo de n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y similares. El término "biotransformación" significa transformación de compuestos químicos en un sistema vivo.

El término "ácido de Lewis" significa un aceptor de un par de electrones como se define en McQuarrie, D.A. et al., General Chemistrv, 3a edición, W.H. Freeman and Company Pub., 1991, pág. 665.

Descripción detallada de la invención Los inventores han descubierto que los compuestos esteroideos de fórmula (I) Fórmula I en la que: Ri es H o alquil C^C6-C(Oy, R2 es -ORi o -C(0)-0-alquilo CrC6; O - R i i 1 1 Zi es ; Z2 es -CH-; o Zi y ?2 pueden tomarse conjuntamente para formar un doble enlace carbono-carbono; sorprendentemente se desacilan y posteriormente se oxidan para formar compuestos esteroideos de fórmula (II) Fórmula II en la que R2, Zi, Z2 y Q son como para la fórmula I. Los compuestos de fórmula II son útiles para la preparación de esferoides sustituidos en 7, especialmente eplerenona. Cuando se utilizan compuestos de fórmula II como intermedios para la síntesis de eplerenona, R2 es ß-ORi o a-C(0)-0-alquilo d-C6. La biotransformación, sorprendente e inesperadamente, realiza en una sola operación la hidrólisis de grupos acilo, la oxidación selectiva de sólo el grupo 3-hidroxi y la migración del doble enlace 5,6 a la posición 4,5. Además, la transformación no afecta a la estereoquímica del sustituyente en C-7. La biotransformación prosigue a través de los intermedios I, en los que R1 es H, que pueden aislarse también. La biotransformación puede conseguirse con cualquier bacteria perteneciente al género Flavobacterium capaz de realizar la biotransformación, y en particular Flavobacterium dehydrogenans, cepa ATCC 13930. Se ilustra un procedimiento para identificar cepas capaces de realizar la biotransformación en el ejemplo . La bacteria puede utilizarse en forma de un cultivo de crecimiento activo, en ausencia o presencia de un disolvente orgánico inmiscible con agua. Habitualmente, la bacteria crece en cultivo sumergido en condiciones aeróbicas, utilizando cualquier procedimiento reconocido en la técnica, y las transformaciones de esteroides se realizan in situ. La bacteria deseada puede cultivarse utilizando condiciones identificadas en los ejemplos 1-3 utilizando los ingredientes especificados. Las fuentes de carbono pueden incluir azúcares tales como monosacáridos, disacáridos, trisacáridos, polisacáridos hidrolizados, ácidos dé azúcar y alcoholes de azúcar. Preferiblemente, se utiliza un monosacárido, disacárido o alcohol de azúcar como fuente de carbono. Más preferiblemente, se utiliza el monosacárido glucosa (dextrosa). La concentración de fuente de carbono puede ser de aproximadamente 0,5 g/l a aproximadamente 40 g/l, pero típicamente de aproximadamente 2 g/l a aproximadamente 10 g/l. Las fuentes de nitrógeno pueden incluir sustancias orgánicas que contienen nitrógeno tales como caseína, extracto de maíz fermentado, extracto de carne, peptona, hidrolizado de proteína de soja, harina de soja y extracto de levadura y/o compuestos inorgánicos que contienen nitrógeno tales como nitratos y sales de amonio inorgánicas. Preferiblemente, se utilizan la sustancia orgánica que contiene nitrógeno extracto de levadura y el compuesto inorgánico que contiene nitrógeno sulfato de amonio. El extracto de levadura puede utilizarse a una concentración de aproximadamente 0 g/l a aproximadamente 25 g/l, pero típicamente de aproximadamente 0 g/l a aproximadamente 20 g/l. Puede utilizarse sulfato de amonio a una concentración de aproximadamente 0 g/l a aproximadamente 10 g/l, pero típicamente de aproximadamente 0,5 g/l a aproximadamente 5 g/l. Otras fuentes de carbono y nitrógeno adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica.

Generalmente, se utiliza un procedimiento de siembra vegetativa primaria y secundaria en la preparación de la transformación de esteroides bacteriana. Como alternativa, puede utilizarse una siembra vegetativa primaria directamente para inocular medio de bioconversión. Los cultivos de siembra vegetativa primaria pueden incubarse durante un periodo de aproximadamente 24 a aproximadamente 96 horas (preferiblemente aproximadamente 48 horas) a una temperatura entre aproximadamente 22°C y aproximadamente 37°C (preferiblemente aproximadamente 28°C) y a un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,0 (preferiblemente entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 7,5). Se inocula medio de siembra vegetativa secundaria con aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1,0% (v/v) de cultivo de siembra vegetativa primaria, pero típicamente aproximadamente 0,5% (v/v), y se incuba durante un periodo de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 96 horas (preferiblemente aproximadamente 48 a aproximadamente 72 horas) a una temperatura entre aproximadamente 22°C y aproximadamente 37°C (preferiblemente aproximadamente 28°C). El pH del medio de siembra secundaria puede estar entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,0 (preferiblemente entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 7,5). El medio de bioconversión se inocula con aproximadamente 1% a aproximadamente 10% (v/v) de cultivo de siembra vegetativa secundaria, pero típicamente aproximadamente 5% (v/v), y se incuba a una temperatura entre aproximadamente 22°C y aproximadamente 37°C (preferiblemente aproximadamente 28°C). El pH del medio de bioconversión puede estar entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,0 (preferiblemente entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 7,5). Pueden añadirse sustratos esteroideos de fórmula (I) al medio de bioconversión,. disueltos en un volumen mínimo de disolvente míscible con agua tal como acetona, metanol, etanol, DMSO o DMF, antes de la esterilización e inoculación. Se prefiere utilizar sustratos de fórmula (I) a una concentración mayor de 0,5 g/l, más preferiblemente mayor de 1,0 g/l, aún más preferiblemente mayor de 4 g/l. Como alternativa, pueden añadirse sustratos esteroideos micronizados de fórmula (I) al cultivo en crecimiento entre 0 horas y aproximadamente 72 horas después de la inoculación (preferiblemente entre aproximadamente 24 horas y aproximadamente 48 horas). También puede elegirse añadir sustratos esteroideos de fórmula (I) disueltos en un disolvente orgánico inmiscible con agua a un cultivo en el que se han inducido las actividades desacilasa y 3P-alcohol deshidrogenasa. Pueden utilizarse disolventes orgánicos inmiscibles con agua tales como tolueno, octano ramificado, diclorometano, octanol y mezclas de los mismos a una relación de aproximadamente 0,1-2:1 (v/v) de disolvente erveza entera, pero típicamente aproximadamente 0,5:1 (v/v). Puede utilizarse cualquier 3-ol-A5-esteroide que posea ésteres acetato para inducir estas actividades enzimáticas. La concentración de inductor utilizada es de aproximadamente 1 mg/l a aproximadamente 100 mg/l, pero típicamente de aproximadamente 10 mg/l. El inductor puede añadirse al medio de bioconversión, disuelto en un volumen mínimo de disolvente miscible con agua tal como acetona, metanol, etanol, DMSO o DMF, antes de la esterilización e inoculación, o en forma de una suspensión densa micronizada entre 0 horas y aproximadamente 36 horas después de la inoculación, pero típicamente entre aproximadamente 12 horas y 24 horas. La bioconversión de sustratos esteroideos de fórmula (I) se deja proceder durante aproximadamente 1 a 5 días, pero típicamente de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 días. Una vez se completa la bioconversión de los sustratos esteroideos de fórmula (I), pueden aislarse los productos esteroideos de fórmula (II) utilizando uno cualquiera de una serie de procedimientos reconocidos en la técnica, o más específicamente, utilizando los disolventes y condiciones descritos en los ejemplos. Preferiblemente, la cerveza entera se extrae utilizando un disolvente orgánico, tal como acetato de etilo, tolueno, acetato de butilo o cloruro de metileno, y los productos desacilados de fórmula (II) se aislan mediante cristalización. Puede utilizarse cromatografía en gel de sílice (aproximadamente 50 g de sílice por gramo de producto) para separar los productos desacilados de fórmula (II) antes de la cristalización. La cromatografía en columna y los disolventes de cristalización incluyen disolventes tales como agua, metanol, acetona, acetato de butilo, cloruro de metileno o combinaciones de los mismos. El disolvente de extracción preferido es cloruro de metileno; el disolvente de cromatografía preferido es 95% de cloruro de metileno/5% de metanol; y el disolvente de cristalización preferido es acetato de n-butilo. Los productos de la biotransformación son útiles en la síntesis de esferoides sustituidos en 7 y, en particular, eplerenona. Los esquemas l-VI ilustran los procedimientos de esta invención donde los productos de la biotransformación son compuestos de fórmula II. En los esquemas, son ilustrativas de la invención las etapas l-F, ll-C, lll-B, IV-C, VA y VIA.

Esquema I Esquema II Esquema III Esquema IV Esquema VI La preparación del material de partida 1, (3p,7P,11a-trih¡droxi-5-androsten-17-ona) para los esquemas l-ll se obtiene de uno de dos maneras. Una manera es poner en contacto en primer lugar la 5-androsten-3p-ol-17-ona con un cultivo sumergido de Diplodia gossypina ATCC 20517 (sinónimo de Botryodiplodia theobromae IFO 6469) para generar 5-androsten-3p,7p-dioI-17-ona (véase el ejemplo 10), y poner después en contacto la 5-androsten-3p,7 -diol-17-ona con un cultivo sumergido de Aspergillus ochraceus ATCC 18500 para generar la 5-androsten-3p,73,11a-triol-17-ona 1. Como alternativa, puede ponerse en contacto la 5-androsten-3p-ol-17-ona con un cultivo sumergido de Absidia coerulea ATCC 6647 para generar 5-androsten-3 ,7p,11a-triol-17-ona 1. El material de partida para el esquema IV (25) se obtiene poniendo en contacto en primer lugar la 5-androsten-3P-oI-17-ona con un cultivo sumergido de Aspergillus ochraceus ATCC 18500 para generar 5-androsten-33,11a-dioI-17-ona (véase el ejemplo 13), eliminando después químicamente el 11a-hidroxilo para generar 5,9(11)-androstadien-3p-ol-17-ona, seguido de poner en contacto la 5,9(11)-androstadien-3 -ol-17-ona con un cultivo sumergido de Diplodia gossypina ATCC 20517 (sinónimo de Botryodiplodia theobromae IFO 6469) para generar 5,9(11)-androstadien-3 ,7P-diol-17-ona 25. Sigue una descripción general de las diversas etapas de los procedimientos: Biotransformación de esferoides 3, 11-diaciloxi-5-eno en esferoides 11-hidroxi-4-en-3-ona (etapas l-F, ll-C, lll-B, IV-C, VA y VIA): Las biotransformaciones se realizaron como se describe anteriormente.

Etapas l-A, ll-D, UI-C y lV-E: adición de acetileno a intermedios 17-oxo: Se hacen reaccionar intermedios 17-oxo con acetileno para proporcionar los correspondientes compuestos de adición según procedimientos descritos en la bibliografía (véanse por ejemplo: Schwede, W. et al., Steroids 63, 166 (1998); Corey, EJ. et al., J. Amer. Chem. Soc. (1999), 121 , 710-714, Schwede, W. et al., Steroids (1998), 63(3), 166-177; Ali, H. et al., J. Med. Chem. (1993), 36(21), 3061; Turuta, A.M., eí al., Mendeleev Commun. (1992), 47^8; Kumar, V. et al., Tetrahedron (1991), 47(28), 5099; Page, P.C., Tetrahedron (1991), 47, 2871-2878; Curts, S.W., et al., Steroids (1991), 56, 8; Kataoka, H. et al., Chem. Lett. (1990), 1705-1708; Christiansen, R.G. et al., J. Med. Chem. (1990), 33(8), 2094-2100). Etapas l-B, ll-A y IVA: acilaciones de hidroxi Los intermedios hidroxi se acilan con un reactivo acilante en presencia de una base orgánica terciaria mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Los reactivos acilantes incluyen anhídridos alcanoicos inferiores, cloruros alcanoicos inferiores y similares. Las bases orgánicas terciarias adecuadas incluyen piridina, 4-dimetilaminopiridina, /V-óxido de 4-dimetilaminopiridina, trietilamina, díisopropiletilamina y similares. Etapas l-C, ll-F, lll-E y IV-F: hidroformilación de aducios de acetileno: Se consigue la formación de intermedios lactol mediante hidroformilación con monóxido de carbono e hidrógeno en presencia de una cantidad catalítica de catalizador de rodio y un ligando coordinante de rodio según procedimientos descritos en la bibliografía (Wuts, P.G.M., et al., J. Orq. Chem. 1989, 54, 5180; Botteghi, C, et al., Tetrahedron, 2001, 57, 1631). La reacción se realiza a una presión de 96,6-3.450 KPa, preferiblemente 690-1.380 kPa. La relación de hidrógeno a monóxido de carbono es de 1/5 a 5/1 , preferiblemente 1/1. Los catalizadores de rodio adecuados incluyen acetato de rodio, cloruro de radio, hidrorodiotristrifenilfosfina y dicarbonilacetilacetonato de rodio II. Los ligandos adecuados incluyen triarilfosfinas, trialquilfosfitos fosfinas bidentadas tales como xantfós, fosfitos bidentados y similares. Etapas Í-D, ll-G y lll-F: oxidación de lactoles a lactonas: La oxidación de lactoles a lactonas puede conseguirse mediante una serie de reactivos oxidantes estándar. Los ejemplos de reactivos oxidantes adecuados incluyen: yodosuccinimida/yoduro de tetrabutilamonio (Kraus, G.A., et al., Bioorqanic & Medicinal Chemistrv Letters (2000), 10(9), 895-897; Barrett, A.G.M., et al., J. Oro. Chem. (1989), 54(14), 3321); reactivo de Jones (ácido crómico en acetona) (Panda, J. et al., Tetrahedron Letters (1999), 40, 6693; Tomioka, K. ef al., J. Ora. Chem. (1988), 53(17), 4094; carbonato de plata (Chow, T.J. et al., J. Chem. Soc. Perkin Transactions 1 , (1999), 1847); clorocromato de piridinio (Uchiyama, M. et al., Tetrahedron Letters (2000), 41(51), 10013; Vanderiei, J.M. de L, Svnthetic Communications (1998), 28(16), 3047; Kassou, M. et al., J. Ora. Chem. (1997), 62, 3696; Rehnberg, N., et al., J. Ora. Chem. (1990), 55(14), 4340-4349; RuC sales de tetraalquilamonio/ V-óxido de ferc-amina, Jeewoo, K. et al., Chem. Lett. (1995), (4), 299; dicromato de piridinio, Paquette, L.A., et al., J. Am. Chem. Soc. (1995), 117(4), 1455-1456); hipoclorito de sodio//V-óxido de íerc-amina, (Waldemar, A., ef al., Chem. Rev. (2001), 101 , 3499); alcóxidos de aluminio/acetona (Ooi, T. et al., Svnthesis (2002), 279; Djerassi, C. et al., Orq. React. (1951), 6, 207); triacetoxiperyodoindano (Martin, J.C., et al., J. Amer. Chem. Soc. ?991), 113, 7277). Etapas l-E, ll-B y IV-B: Carbonilación en C-7: La carbonilación de A5-en-7-acilatos esteroideos (compuestos 5, 10 y 26) se realiza mediante reacción con monóxido de carbono en presencia de un alcohol, una base, un catalizador de paladio y, opcionalmente, un codisolvente, para proporcionar los compuestos esteroideos de fórmula I según procedimientos descritos en la bibliografía (Tsuji et al., J. Orq. Chem. (1984), 49, 1341; Murahashi, S.-l., et al.; J. Orq. Chem. (1993), 58, 1538; Satoh, T. ef al., J. Orq. Chem. (1997), 62, 2662; Cao, P. ef al., J. Amer. Chem. Soc. (1999) 121, 7708; Brunner, M. et al., J. Orq. Chem.. (1997), 62, 7565; Gabriele, B., J, Mol. Catal.. (1996), 111, 43; Yamamoto, A., et al., Helv. Chím. Acta (2001), 84, 2996). Los catalizadores de paladio adecuados incluyen, pero sin limitación, acetato de paladio, acetilacetonato de paladio (II), bis(dibencilidenacetona)-paladio (0) (Pd2(dba)2), dibromuro de 1,3-difenilfosfinopropanopaladío (Pd(dppp)Br2), dimetiI-2-(dimetilfosfino)etilfosfinopaladio y dibromuro de bistrifenilfosfinopaladio (Pd2(Ph3P)2Br2). Las bases adecuadas incluyen, pero sin limitación, W-metilmorfolina (NMM), trietilamina (TEA), diisopropiletilamína (DIPEA) y similares. Las reacciones se realizaron a 70-80°C y a 8.280-9.660 kPa de monóxido de carbono en metanol durante 10-12 horas. La mezcla de reacción contiene opcionalmente bromuro, por ejemplo bromuro de litio. Los resultados de la carbonilación en una serie de condiciones se resumen en la Tabla 1. Como puede observarse, los rendimientos de producto dependen de las condiciones y oscilan entre 0% hasta casi 80%. Las condiciones específicas para esta reacción se encuentran en los ejemplos. Etapas l-G, ll-l y lll-H: Deshidratación de intermedios 11-hidroxi: La deshidratación de los intermedios 11-hidrox¡ 7b y 18b se consiguió utilizando pentacloruro de fósforo como se ha descrito (patente de EE.UU. 4.559.332). Como alternativa, los intermedios 11-hidroxi pueden convertirse en un éster sulfonílico, por ejemplo un metanosulfonato o un p-toluenosulfonato, seguido de tratamiento con una base para efectuar la eliminación como se describe en el documento WO 97/21720 y WO 98/25948. Etapa lll-A: Alilación de 2-mefílfurano: La reacción del compuesto triacilado 10 con 2-metilfurano en presencia de un ácido de Lewis, habitualmente en un disolvente inerte tal como acetonitrilo o cloruro de metileno, proporciona 17. Los ácidos de Lewis adecuados incluyen, pero sin limitación, triflatos de elementos de transición (OTf= OS02CF3) tales como Sc(OTf)3, Ce(OTf)3 e Yb(OTf)3, y complejos de molibdeno (II) tales como Mo(CO)5(OTf)2 y [Mo(CO)4Br2]2. Etapa lll-l: Conversión de esferoides 7-furanilo en esteroides 7-carbometoxi: La degradación del anillo furano de 24 a éster metílico 8 se consigue mediante ozonolisis, oxidación y esterificación como se describe en los ejemplos. Etapas l-H, ll-H y lll-H: Oxidación de olefínas C-9, 11 a epóxidos: Los procedimientos para la conversión del conocido intermedio 8 a 9 (epierenona) se describen en las patentes de EE.UU. n° 3095412, 4.559.332 y 5.981.744. Etapas VB y VIB: Deshidratación de esteroides 7-hidroxi-4-en-3-ona a esteroides 4,6-dien-3-ona: Los compuestos 33 y 35b se convierten en los dienos 4,6 mediante tratamiento con ácido en presencia de ortoformiato de trimetilo como se describe en la patente de EE.UU. n° 4.565.657. Etapas VC y VIC: Conversión de esteroides 4,6-dien-3-ona en esteroides 7-carboxi-4-en-3-ona Se convierten las dienonas 34 y 36 en los correspondientes compuestos 7-carbometoxi 12b y 7b mediante: a) tratamiento de la dienona con cianhidrina de acetona en dimetilformamida en presencia de cloruro de litio y trietilamina a 85°C durante 8-15 horas; b) tratamiento del producto de la etapa a) con ácido clorhídrico en metanol/agua a 80°C durante 5 horas; y c) tratamiento del producto de la etapa b) con metoxido de sodio en metanol a reflujo durante 20 horas como se describe en la patente de EE.UU. n° 5.981.744.

Ejemplos Sin posterior elaboración, se cree que un experto en la técnica puede practicar la presente invención en su máxima extensión utilizando las descripciones precedentes. Los siguientes ejemplos detallados describen cómo preparar los diversos compuestos y realizar los diversos procedimientos de la invención, y han de considerarse meramente ilustrativos, y no limitaciones de la descripción anterior en modo alguno. Los expertos en la técnica reconocerán rápidamente variaciones de los procedimientos tanto de los reactivos como de las condiciones y técnicas de reacción.

Ejemplo 1: La biotransformación de 5-androsten-3p,7p,11a-triacetoxi-17-ona 10 en 4-androsten-7P,11a-diol-3,17-diona 27 y/o 5-androsten-3 ,73,11a-triol- 7-ona 1 se realiza utilizando un cultivo sumergido de Flavobacteríum dehydrogenans ATCC 13930. (A) Etapa de siembra primaria Se descongelan células vegetativas congeladas de Flavobacteríum dehydrogenans ATCC 13930, se transfieren a placas con agar nutriente (Difco) y se incuban a 28°C durante 72 horas. Se utiliza una sola colonia de Flavobactenum dehydrogenans ATCC 13930 para inocular un matraz agitado de 500 mi que contiene 100 mi de medio de siembra primaria. El medio de siembra primaria consiste en (por litro de agua de OI): caldo nutriente, 8 g; glicerol, 4 mi; extracto de levadura de cerveza soluble en agua, 1 g; KH2PO4, 2,72 g; monooleato de polioxietilensorbitán, 2 mi; pH de preesterilización 6,8, ajustado con NaOH 2 N. Se esterilizan matraces agitados que contienen 100 mi de medio de siembra primaria durante 30 minutos a 121°C utilizando un autoclave. Se incuba Flavobactenum dehydrogenans ATCC 13930 durante 48 horas a 28°C utilizando un incubador-agitador de entorno controlado fijado a 270 rpm (recorrido orbital de 5,08 cm) (B) Etapa de siembra secundaria Se inoculan 100 mi de medio de siembra secundaria en un matraz agitado de 500 mi utilizando 0,12 mi de cultivo de siembra primaria vegetativa (aproximadamente 0,12% [v/v] de velocidad de inoculación). El medio de siembra secundaria contiene (por litro de agua de OI): cerelosa, 20 g; proteína de soja desnaturalizada, 6 g; extracto de levadura de cerveza soluble en agua, 6 g; desespumante de silicona (SAG 471), 0,5 mi; pH de preesterilización 6,8, ajustado con NaOH 2 N. Se esterilizan los matraces agitados que contienen 100 mi de medio de siembra secundaria durante 30 minutos a 121°C utilizando un autoclave. Se incuba Flavobactenum dehydrogenans ATCC 13930 durante 48 horas a 28°C utilizando un incubador-agitador de entorno controlado fijado a 270 rpm (recorrido orbital de 5,08 cm). (C) Bioconversión de esferoides Se inoculan 50 mi de medio de bioconversión de esteroides en un matraz agitado de 500 mi utilizando 2,5 mi de cultivo de siembra secundaria vegetativa (aproximadamente 5% [v/v] de velocidad de inoculación). El medio de bioconversión de esteroides contiene (por litro de agua): cerelosa, 5 g; extracto de levadura de cerveza soluble en agua, 15 g; monooleato de polioxietilensorbitán, 0,1 mi; (NH4)2S04, 1 g; KH2P04, 1 g; pH de preesterilización 6,8, ajustado con NaOH 2 N. Antes de esterilizar el medio de bioconversión de esteroides, se añade sustrato esteroideo disuelto en un volumen mínimo de acetona a medio vigorosamente agitado hasta una concentración final de 1 g/l. Se esterilizan los matraces agitados, que contienen 50 mi de medio de bioconversión de esteroides, durante 30 minutos a 121°C utilizando un autoclave. Se incuba Flavobacterium dehydrogenans ATCC 13930 a 28°C utilizando un incubador-agitador de entorno controlado fijado a 270 rpm (recorrido orbital de 5,08 cm) durante 96 horas. Se siguió la progresión de la biotransformación por cromatografía en capa fina utilizando placas de gel de sílice Analtech desarrolladas con ciclohexano:acetato de etilo:metanol:ácido acético glacial (90:60:30:1, v/v/v/v). (D) Procedimiento de aislamiento Se extraen 350 mi de cerveza entera recogida de siete matraces agitados (carga de sustrato inicial 350 mg) con un volumen igual de cloruro de metileno durante 1 hora. Esta operación se repite para maximizar la recuperación del producto. Los extractos orgánicos se separan de la parte acuosa consumida mediante centrifugación. Los extractos de cloruro de metileno se clarifican, se combinan, se secan en 5 g de gel de sílice G-60 mediante destilación y se disponen en la parte superior de 100 g de gel de sílice G-60 en una columna de vidrio de 2,54 x 50,8 cm equilibrada con 95% de cloruro de metileno y 5% de metanol. La cromatografía se desarrolla con la misma mezcla de 95% de cloruro de metileno y 5% de metanol. El eluido de la columna se recoge en fracciones de 20 mi y el desarrollo se controla por TLC utilizando la misma fase móvil de 95% de cloruro de metileno y 5% de metanol. Se combinan las fracciones de cada uno de los dos productos finales y se concentra cada uno mediante evaporación hasta aproximadamente 5-10 mi. Se añaden aproximadamente 10 mi de acetato de n-butilo a los dos concentrados. La concentración continuada, y posterior enfriamiento a 4°C, da como resultado la cristalización del producto. Los cristales se recuperan mediante filtración, se lavan con acetato de n-butilo frío y se secan, proporcionando 53 mg de 4-androsten-7p,11a-diol-3,17-diona, 27, y 18 mg de 5-androsten-3 ,7 , 1 a-triol-17-ona 1.

Ejemplo 2: Se realiza la bioconversión de 5-androsten-3p,11a-diacetoxi-7a-carbometoxi-17-ona 11 en 4-androsten-11a-ol-7a-carbometoxi-3,17-diona 12b y/o 5-androsten-3p, 1a-diol-7a-carbometox¡-17-ona 12a utilizando un cultivo sumergido de Flavobacteríum dehydrogenans ATCC 13930. En las condiciones descritas en el EJEMPLO 1 , pero utilizando 1 I de cerveza entera recogida de 20 matraces agitados (carga de sustrato inicial 1 g), se preparan 611 mg de 5-androsten-3p,11a-dihidroxi-7a-carbometoxi-17-ona, 12b, y 49 mg de 4-androsten-11a-ol-7a-carbometox¡-3,17-ona, 12a.

Ejemplo 3: La bioconversión de éster 3ß, a^?3?6????-17ß-G^G???-?-?3^??3 éster metílico del ácido pregn-5-en-7a,21-dicarboxílico 6 en éster 3-oxo-11a,17p-dih¡droxi-Y-Iactona éster metílico del ácido pregn-4-en-7a,21-dicarboxílico, 7b y éster 3p,11a,17p-trihidroxi~Y-lactona éster metílico del ácido pregn-5-en-7a,21-dicarboxílico 7a se realizó utilizando un cultivo sumergido de Flavobacteríum dehydrogenans cepa ATCC 13930. En la condiciones descritas en el EJEMPLO 1, pero utilizando 1,6 I de cerveza entera recogida de 32 matraces agitados y una carga de sustrato de 1,6 g, se preparan 216 mg de éster 3-oxo-11a,17P-dihidroxi-Y-lactona éster metílico del ácido pregn-4-en-7a,21-dicarboxílico, 7, y 767 mg de éster 3p,11a,17p-trihidroxi-Y-lactona éster metílico del ácido pregn-5-en-7a,21-dicarboxílico.

Ejemplo 4: La bioconversión de 5-androsten-3p,11a-diacetoxi-7a-furan-17-ona 15 en 5-androsten-3p, 1a-diol-7a-furan-17-ona 16a y 4-androsten-11a-ol-7a-furan-3,17-diona 16b se realiza utilizando un cultivo sumergido de Flavobacteríum dehydrogenans cepa ATCC 3930. En las condiciones descritas en el EJEMPLO 1 , pero utilizando un litro de cerveza entera recogida de 15 matraces agitados (carga de sustrato inicial de 1 g), se preparan 126 mg de 5-androsten-3p,11a-dihidroxi-7a-furan-17-ona 16a y 97 mg de 4-androsten-1 a-ol-7a-furan-3,17-ona 16b.

Ejemplo 5: Se realiza la bioconversión de ?-lactona del ácido 3ß,7ß,11a-triacetoxi-17P-hidroxipregn-5-en-21-carboxílico 5 en ?-lactona del ácido 7p,11a,17p-trihidroxi-3-oxopregn-4-en-21-carboxílico 35a, ?- lactona del ácido 7a,11a- 7p-trihidroxi-3-oxopregn-4-en-21-carboxílico 35b, y ?-lactona del ácido 11a,17p-dihidroxi-3-oxopregn-4,6-dien-21-carboxílico 36 utilizando un cultivo sumergido de Flavobacteríum dehydrogenans cepa ATCC 13930. En las condiciones descritas en el EJEMPLO 1, pero utilizando 1 litro de cerveza entera recogida de 15 matraces agitados (carga de sustrato inicial/matraz de 1 g), se preparan 30 mg de ?-lactona del ácido 7ß,11a,17ß-trihidroxi-3-oxopregn-4-en-21-carboxílico 35a, 95 mg de ?-lactona del ácido 7a,11a-17ß-trih¡droxi-3-oxopregn-4-en-21-carboxílico 35b y 20 mg de ?-lactona del ácido 11a,17 -dihidroxi-3-oxopregn-4,6-dien-21-carboxílico 36.

Ejemplo 6: Adición de acetileno a intermedios 17-oxo: Se añade hexametildisilazano (HMDS) (100 mi) a una suspensión densa agitada de 50,0 g del triol 1 en 400 mi de cloruro de metileno. Se añade sacarina (0,57 g) y la mezcla se calienta a reflujo durante 3 horas, durante cuyo tiempo la suspensión densa se disuelve gradualmente a una solución ámbar transparente. Se añade agua (5 mi) para inactivar cualquier exceso de HMDS. Después de 5 minutos a reflujo, la mezcla se filtra a través de una capa húmeda de CH2CI2 de 32,6 g de magnesol en un embudo de filtro de frita gruesa de 350 mi. El filtrado debe ser transparente y casi incoloro. La torta de filtrado se lava con 2 x 100 mi de CH2C½. Los filtrados combinados se concentran a presión reducida y se retira el cloruro de metileno residual mediante evaporación con 2 porciones de 500 mi de tetrahidrofurano (THF) y concentración hasta sequedad después de cada adición, proporcionando un sólido blanco. Se enfría una suspensión de ferc-butóxido de potasio (42,0 g) en 500 mi de THF a 9±5°C con un baño de hielo/metanol. Se burbujea acetileno en la mezcla justo por debajo de la superficie con agitación moderada durante al menos 1 hora. Se añade el intermedio esteroideo silHado anterior en THF (400 mi) durante 30 minutos manteniendo la temperatura de reacción a 0±5°C. Después de la adición, la mezcla se agita durante una hora adicional a 5±5°C. Se añade lentamente agua (100 mi) dejando calentarse la mezcla de reacción hasta 15±5°C. Se añaden lentamente 125 mi de HCI al 10% para reducir el pH hasta 2,5 a 3. La mezcla se agita a pH 2,5 a 3, añadiendo pequeñas cantidades de HCI al 5% según sea necesario para mantener un pH de 2,5 a 3, durante 1 a 2 horas a 20+5°C. Cuando se completa la hidrólisis, se añade una solución semisaturada de NaHC03 para aumentar el pH hasta 5,5 a 6. La mezcla se diluye con acetato de etilo (500 mi) y las fases se separan. La fase acuosa se extrae con acetato de etilo y las fases combinadas de acetato de etilo se lavan con agua, salmuera, se secan sobre sulfato de magnesio y se concentran, proporcionando el producto de adición 2.

Ejemplo 7 Acetilaciones de hidroxi Se enfría a <10°C una mezcla del tetraol 2 (50,00 g, 144 mmol) disuelto en piridina (150 mi) en un baño de hielo. Se añade dimetilaminopiridina (DMAP) (1,7 g, 14 mmol) seguida de la lenta adición de anhídrido acético (41,4 mi, 439 mmol) a una velocidad para mantener la temperatura de la solución por debajo de 10°C. Después de la adición, la mezcla de reacción se calienta a temperatura ambiente. La mezcla se diluye con acetato de etilo (75 mi) y agua (50 mi), se agita durante 5 minutos y las fases se separan. La fase orgánica se lava con HCI al 10% (4 x 25 mi) seguido de H2O (2 x 50 mi), se seca sobre MgS04 y se concentra. El producto se recristaliza con tolueno (100 mi).

Ejemplo 8 Hidroformilación de aducios de acetileno Se calienta a 80°C una solución del triacetato 3 (25,4 g, 54 mmol), PPh3 (2,13 g, 8,1 mmol) y Rh2(OAc)4 (716 mg, 1,62 mmol) en acetato de etilo (200 mi) en una mezcla 1 :1 de hidrógeno/monóxido de carbono a una presión de 1.173 kPa durante 12 horas. La mezcla se concentra a presión reducida y el producto 4 se purifica mediante cromatografía en columna (AcOEt/Hex 70:30 y 500 g de sílice).

Ejemplo 9 Oxidación de lactoles a lactonas Se enfría a = 10°C una mezcla del lactol 4 (25 g, 50 mmol), cloruro de metileno (250 mi), agua (38 mi), 2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxilo (TEMPO) (156 mg, 1 mmol), KBr (595 mg, 5 mmol) y NaHC03 (5,5 g, 65 mmol) en un baño de hielo. Se añade lentamente una solución de hipoclorito de sodio 1,1 (NaOCI) (50 mi, 55 mmol). La mezcla se deja calentar hasta temperatura ambiente y se diluye con agua (50 mi). Las fases se separan y la fase orgánica se lava con salmuera (2 x 50 mi). La fase orgánica se seca con MgS04, se filtra y se concentra, proporcionando 5 en forma de una espuma blanquecina.

Ejemplo 10 Carbonilación en C-7 5 6 Se someten a 8.280 kPa de presión de CO el triacetato 5 (2,0 g), Pd(dppp)Br2 (126 mg), diisopropilamina (0,78 mi), EÍ4NBr (260 mg), NaBr (1,09 g) en 20 mi de metanol y después se calienta a 65°C durante 12 horas. La solución se enfría y se concentra, y el residuo se cromatografía en gel de sílice con 40-75% de acetato de etilo/hexano, proporcionando el éster metílico 6.

Ejemplo 11 Deshidratación de intermedios 11-hidroxi Se añade pentacloruro de fósforo (2 eq.) a una solución del alcohol 7 (1 eq.) en THF a -51 °C, lo que da como resultado un aumento de temperatura a - 8°C. Después de 2 horas, la mezcla se vierte en NaHCÜ3 acuoso y se extrae con AcOEt y se concentra. El residuo se cromatografía en gel de sílice con AcOEt/hexano proporcionando el dieno 8.

Preparación de 5-androsten-3p,7P-diol-17-ona a 5-androsten-3p,17p,11a-triol-17-ona, material de partida 1. Etapa 1, ejemplo 12: Bioconversión de 5-androsten-3p-ol-17-ona en 5-androsten-3p,7p-diol-17-ona La bioconversión de 5-androsten-3P-ol-17-ona en 5-androsten-3P,7P-diol-17-ona se realiza utilizando un cultivo sumergido de Diplodia gossypina ATCC 20571 (sinónimo de Botryodiplodia theobromae IFO 6469) a escala de fermentación de 10 I. (A) Etapa de siembra primaria Se descongelan células vegetativas congeladas de Diplodia gossypina ATCC 20571 , se transfieren a placas de patata-dextrosa-agar (PDA) y se incuban a 28°C durante 72 horas. Se utilizan lechos micelares individuales (6-7 mm de diam.) para inocular matraces agitados grabados de 500 mi siliconizados que contienen 100 mi de medio de siembra primaria. El medio de siembra primaria consiste en (por litro de agua de OI): dextrina, 50 g; harina de soja, 35 g; cerelosa, 5 g; cloruro de cobalto hexahidratado, 2 mg; desespumante de silicona (SAG 471), 0,5 mi; pH de preesterilización 7,0-7,2, ajustado con hidróxido de sodio (2 N). Se incuba Diplodia gossypina ATCC 20571 durante 48 horas a 28°C utilizando un incubador-agitador de entorno controlado fijado a 280 rpm (recorrido orbital de 2,54 cm). (B) Etapa de siembra secundaria Se inoculan fermentaciones de siembra secundaria de 10 I utilizando cultivo de siembra primaria vegetativa de 1,2 mi (0,012% [v/v] de velocidad de inoculación). El medio de siembra secundaria contiene (por litro de agua de OI): cerelosa, 60 g; harina de soja, 25 g; aceite de soja, 30 mi; sulfato de magnesio heptahidratado, 1 g; dihidrogenofosfato de potasio, 0,74 g; monooleato de polioxietilensorbitán, 2 mi; desespumante de silicona (SAG 471), 0,5 mi; pH de preesterilización 3,95-4,00, ajustado con ácido sulfúrico concentrado. Los fermentadores, que contienen medio de siembra secundaria, se esterilizan durante 20 minutos a 121°C utilizando tanto vapor en camisa como de inyección. La velocidad de agitación durante la esterilización es de 200 rpm. Después de la esterilización, el pH del medio se ajusta a 4,0 utilizando ácido sulfúrico estéril (al 5%). Se incuba Diplodia gossypina ATCC 20571 a 28°C utilizando los siguientes parámetros iniciales: agitación, 100 rpm; presión de fondo manométrica= 34,5 kPa; flujo de aire= 2,5 SLM (0,25 WM); bajo valor de referencia de OD, 30%; control de pH, ninguno. Cuando el OD cae por primera vez al 30%, el flujo de aire se aumenta a 5 SLM (0,5 WM). Cuando el cultivo alcanza un bajo OD de nuevo, se mantiene el 30% de OD utilizando control de la agitación. Los cultivos de siembra secundaria se recogen aproximadamente 60 horas después de la inoculación, cuando el OUR está entre aproximadamente 10 y aproximadamente 15 mM/l/h. (C) Bioconversión de esteroides Se inoculan fermentaciones de bioconversión de esteroides de 10 I utilizando 500 mi de cultivo de siembra secundaria vegetativa (5% [v/v] de velocidad de inoculación). El medio de bioconversión de esteroides es el mismo que el medio de siembra secundaria. Las condiciones de esterilización y el ajuste del pH son como se describen para el medio de siembra secundaria. Se incuba Diplodia gossypina ATCC 20571 a 28°C utilizando esencialmente los mismos parámetros iniciales que los utilizados para el cultivo de siembra secundaria, con la excepción de que el valor de referencia bajo de OD se aumenta de 30 a 50%. Cuando el OD cae por primera vez al 50%, se aumenta el flujo de aire de 2,5 SLM (0,25 WM) a 5 SLM (0,5 WM). Cuando el cultivo alcanza de nuevo un bajo OD, se mantiene un 50% de OD utilizando control de la agitación. Empezando 24 horas después de la inoculación, se añade 5-androsten-3p-ol-17-ona micronizada, suspendida en un volumen mínimo de monooleato de polioxietilensorbitán al 0,2%, a la fermentación en intervalos de una hora hasta añadir un total de 400 g. Aproximadamente 3 días después de la inoculación, se añaden 100 g adicionales de cerelosa a la fermentación de 0 I. En los cultivos de bioconversión se ensaya diariamente la 5-androsten-3p,7p-diol-17-diona utilizando TLC. Se extrae 1 mi de cerveza entera con 10 mi de metanol. Las células se separan de la mezcla acuosa de metanol mediante centrifugación (3.000 x g durante 10 minutos) y se aplican varios microlitros a una placa de TLC. La placa de TLC se procesa con ciclohexano.acetato de etilo:metanol (90:60:15) y el producto se visualiza pulverizando la TLC con ácido sulfúrico al 50%, seguido de carbonización en una estufa. El producto se compara con un patrón auténtico, que se vuelve azul al pulverizar con ácido sulfúrico al 50%. La bioconversión de 5-androsten-3p-ol-17-ona en 5-androsten-3p,7p-diol-17-ona se completa aproximadamente 4 días después de la inoculación. (D) Procedimiento de aislamiento Se centrifuga la cerveza entera recogida y se recuperan los sólidos ricos mediante centrifugación. Los sólidos ricos se extraen con 10 litros de cloruro de metileno y el extracto rico se recupera mediante centrifugación. El extracto se clarifica y se concentra hasta aproximadamente 1 litro mediante destilación, y la suspensión densa cristalina se enfría a -10°C. Los cristales se recuperan mediante filtración, se lavan con cloruro de metileno frío para retirar el color y se secan, proporcionando 227 g de 5-androsten-3 ,7P-diol-17-ona cristalina purificada.

Etapa 2, ejemplo 13: Bioconversión de 5-androsten-3p,7p-diol-17-ona en 5-androsten-3p,7p-11 a-triol-17-ona La bioconversión de 5-androsten-3p,7p-diol-17-ona en 5-androsten-3ß,7ß, 11 a-triol-17-ona se realiza utilizando un cultivo sumergido de Aspergillus ochraceus ATCC 18500 (sinónimo de NRRL 405) a una escala de fermentación de 10 1. (A) Etapa de siembra primaria Se preparan cultivos de siembra primaria de Aspergillus ochraceus ATCC 18500 como se describe para Diplodia gossypina ATCC 20571 en el EJEMPLO 12.

(B) Etapa de siembra secundaria Se inoculan fermentaciones de siembra secundaria de 10 I utilizando 1 ,2 mi de cultivo de siembra primaria vegetativa (0,012% [v/v] de velocidad de inoculación). El medio de siembra secundario contiene (por litro de agua de OI): cerelosa, 40 g; harina de soja, 25 g; aceite de soja, 30 mi; sulfato de magnesio heptahidratado, 1 g; dihidrogenofosfato de potasio, 0,74 g; nonilfenoxipolietoxietanol, 0,25 mi; desespumante de silicona (SAG 471), 0,5 mi; pH de preesterilización 3,95-4,00, ajustado con ácido sulfúrico concentrado. Los fermentadores, que contienen medio de siembra secundaria, se esterilizan durante 20 minutos a 121°C utilizando tanto vapor de camisa como de inyección. La velocidad de agitación durante la esterilización es de 200 rpm. Después de la esterilización, el pH del medio se ajusta a 4,0 utilizando ácido sulfúrico estéril (al 5%). Se incuba Aspergillus ochraceus ATCC 18500 a 28°C utilizando los siguientes parámetros iniciales: agitación, 100 rpm; presión de fondo nanométrica= 34,5 kPa; flujo de aire= 2,5 SLM (0,25 WM); bajo valor de referencia de OD, 50%; control de pH, ninguno. Cuando el OD cae por primera vez al 50%, se aumenta el flujo de aire a 5 SLM (0,5 WM). Cuando el cultivo alcanza un bajo OD de nuevo, se mantiene 50% de OD utilizando control de la agitación. Los cultivos de siembra secundaria se recogen entre 50 y 54 horas después de la inoculación, cuando el OUR está entre aproximadamente 20 y aproximadamente 26 mM/l/h. (C) Bioconversión de esferoides Se inoculan fermentaciones de bioconversión de esteroides de 10 I utilizando 500 mi de cultivo de siembra secundaria vegetativa (5% [v/v] de velocidad de inoculación). El medio de bioconversión de esteroides es esencialmente el mismo que el medio de siembra secundaria, con la excepción de que el nonilfenoxipolietoxietanol aumenta de 0,25 ml/l a 2 ml/l, y el pH de preesterilización se ajusta a 2,95-3,00 con ácido sulfúrico concentrado. Las condiciones de esterilización son como se describen para el medio de siembra secundario. Después de la esterilización, el pH del medio se ajusta a 3,0 utilizando ácido sulfúrico estéril (al 5%). Se incuba Aspergillus ochraceus ATCC 18500 a 28°C utilizando esencialmente los mismos parámetros iniciales que los utilizados para el cultivo de siembra secundario, con la excepción de que la agitación se fija inicialmente a 200 rpm. Aproximadamente 18 horas después de la inoculación, se añaden 200 g de 5-androsten-3p,7p-diol-17-ona micronizada suspendida en un volumen mínimo de 0,2% de nonilfenoxipolietoxietanol a la fermentación de 10 1. En los cultivos de bioconversión se ensaya diariamente la 5-androsten-3p,7p,11a-triol-17-ona utilizando TLC, como se describe en el EJEMPLO 10. La bioconversión de 5-androsten-3P,7P-diol-17-ona en 5-androsten-3 ,7p,11a-triol-17-ona se completa aproximadamente 4 días después de la inoculación. (D) Procedimiento de aislamiento Se recuperan los sólidos de cerveza entera mediante centrifugación. Se desecha el líquido. Los sólidos ricos se extraen con 10 litros de 80% de acetona, 20% de agua a 45°C a 50°C, y el extracto templado se clarifica mediante filtración. Se concentra el filtrado rico mediante destilación para retirar la acetona, generando una suspensión densa acuosa de cristales brutos. Los cristales brutos se recuperan por filtración y se desechan las aguas madre. Los cristales humedecidos con agua se trituran en 600 mililitros de cloruro de metileno para retirar impurezas, se disuelven en 700 mililitros de metanol (mediante calentamiento a 55°C) y después se decoloran con 5 g de carbón Darco G-60. Después de la filtración para retirar el carbono, el filtrado se concentra para cristalizar el producto. Se retira el metanol adicionalmente añadiendo 300 mi de acetato de n-butilo y concentrando hasta una suspensión densa cristalina espesa. Los cristales se filtran, se lavan con acetato de n-butilo y se secan, proporcionando 158 g de 5-androsten-3p,7P,11a-triol- 7-ona cristalina purificada.

Ejemplo 14: Preparación de 1, procedimiento 2, bioconversión de 5-androsten-3p-ol-17-ona en 5-androsten-3p,7p,11a-triol-17-ona Se realiza la bioconversión de 5-androsten-3p-ol-17-ona en 5-androsten-3p,7p,11a-triol-17-ona utilizando un cultivo sumergido de Absidia coerulea ATCC 6647 a una escala de fermentación de 10 I. (A) Etapa de siembra primaria Se preparan cultivos de siembra primaria de Absidia coerulea ATCC 6647 preparados como se describe para Diplodia gossypina ATCC 20571 en el EJEMPLO 12 (B) Etapa de siembra secundaria Se inoculan fermentaciones de siembra secundaria de 10 I utilizando 1,2 mi de cultivo de siembra primaria vegetativa (0,012% [v/v] de velocidad de inoculación). El medio de siembra secundaria contiene (por litro de agua de OI): dextrina, 50 g; harina de soja, 35 g; cerelosa, 5 g; cloruro de cobalto hexahidratado, 2 mg; desespumante de silicona (SAG 471), 0,5 mi; pH de preesterilización 4,95-5,00, ajustado con ácido sulfúrico concentrado. Los fermentadores, que contienen medio de siembra secundaria, se esterilizan durante 20 minutos a 121°C utilizando tanto vapor en camisa como de inyección. La velocidad de agitación durante la esterilización es de 200 rpm. Después de la esterilización, el pH del medio se ajusta a 5,0 utilizando ácido sulfúrico estéril (al 5%). Se incuba Absidia coerulea ATCC 6647 a 28°C utilizando los siguientes parámetros iniciales: agitación, 100 rpm; presión de fondo manométrica= 34,5 kPa; flujo de aire= 2,5 SLM (0,25 W ); bajo valor de referencia de OD, 50%; control de pH, ninguno. Cuando el OD cae por primera vez al 30%, el flujo de aire se aumenta a 5 SLM (0,5 WM). Cuando el cultivo alcanza un bajo OD de nuevo, se mantiene 30% de OD utilizando control de la agitación. Los cultivos de siembra secundaria se recogen aproximadamente 76 horas después de la inoculación, cuando el OUR está entre aproximadamente 4 y aproximadamente 7 mM/l/h. (C) Bioconversión de esferoides Se inoculan fermentaciones de bioconversión de esferoides de 10 I utilizando 500 mi de cultivo de siembra secundaria vegetativa (5% [v/v] de velocidad de inoculación). El medio de bioconversión de esferoides contiene (por litro de agua de OI): dextrina, 50 g; harina de soja, 35 g; cerelosa, 20 g; desespumante de silicona (SAG 471), 0,5 mi; pH de preesterilización 2,95-3,00, ajustado con ácido sulfúrico concentrado. Las condiciones de esterilización son como se describen para el medio de siembra secundario.

Después de la esterilización, se ajusta el pH del medio a 3,0 utilizando ácido sulfúrico estéril (al 5%). Se incuba Absidia coerulea ATCC 6647 a 28°C utilizando los mismos parámetros iniciales que los utilizados para el cultivo de siembra secundaria. Aproximadamente 17 horas después de la inoculación, se añaden 200 g de 5-androsten^-ol-17-ona micronizada suspendida en un volumen mínimo de octilfenoxipolietoxietanol al 0,2% a la fermentación de 10 I.

En los cultivos de bioconversión se ensaya diariamente la 5-androsten-3p,7p,11a-triol-17-ona utilizando TLC, como se describe en el EJEMPLO 1. La bioconversión de 5-androsten-3p-ol-17-ona en 5-androsten-3p,7p,11a-triol-17-ona se completa aproximadamente 6-7 días después de la inoculación. (D) Procedimiento de aislamiento Se recuperan los sólidos de cerveza entera mediante centrifugación. Se desecha el líquido. Los sólidos ricos se extraen utilizando 10 litros de 85% de acetona, 15% de agua a 45°C a 50°C, y el extracto templado se clarifica mediante filtración. El filtrado rico se concentra mediante destilación para retirar la acetona, generando una suspensión densa acuosa de cristales brutos. La suspensión densa cristalina se filtra y se desechan las aguas madre. Los cristales húmedos de agua se trituran en 600 mi de cloruro de metileno para retirar impurezas, se disuelven en 700 mi de metanol (por calentamiento a 55°C) y después se decoloran con 5 g de carbón Darco G-60. Después de la filtración para retirar el carbón, se concentra el filtrado para cristalizar el producto. Se retira el metanol adicionalmente añadiendo 300 mi de acetato de n-butilo y concentrando hasta una suspensión densa cristalina espesa. Los cristales se filtran, se lavan con acetato de n-butilo y se secan, proporcionando 75,5 g de 5-androsten-3p,7p, 1a-triol-17-ona cristalina bruta.

Los cristales brutos se trituran en 600 mi de cloruro de metileno para retirar las impurezas adicionales, se disuelven en 700 mi de metanol (por calentamiento a 55°C) y después se decoloran con 5 g de carbón Darco G-60. Después de la filtración para retirar el carbón, el filtrado se concentra para cristalizar el producto. El metanol se retira adicionalmente añadiendo 300 mi de acetato de n-butilo y concentrando hasta una suspensión densa cristalina espesa. Los cristales se filtran, se lavan con acetato de n-butilo y se secan, proporcionando 42,1 g de 5-androsten-3 ,7 ,11a-triol-17-ona cristalina purificada.

Ejemplo 15: Bioconversión de 5-androsten-3P-ol-17-ona en 5-androsten-3p,11a-diol-17-ona La bioconversión de 5-androsten-3p-ol-17-ona en 5-androsten-3 ,11a-diol-17-ona se realiza utilizando un cultivo sumergido de Aspergillus ochraceous ATCC 18500 (sinónimo de NRRL 405) a escala de fermentación de 10 I. (A) Etapa de siembra primaria Se preparan cultivos de siembra primaria de Aspergillus ochraceous ATCC 18500 como se describe en el EJEMPLO 13. (B) Etapa de siembra secundaria Se preparan cultivos de siembra secundaria de 10 litros de Aspergillus ochraceous ATCC 18500 como se describe en el EJEMPLO 11. (C) Bioconversión de esferoides Se inoculan fermentaciones de bioconversión de esferoides de 10 I utilizando 500 mi de cultivo de siembra secundaria vegetativa (5% [v/v] de velocidad de inoculación). El medio de bioconversión de esferoides es esencialmente el mismo que el medio de siembra secundaria, con la excepción de que el nonilfenoxipolietoxietanol aumenta de 0,25 ml/l a 2 ml/l, y el pH de preesterilización se ajusta a 2,95-3,00 con ácido sulfúrico concentrado. Las condiciones de esterilización son como se describen para el medio de siembra secundario. Después de la esterilización, se ajusta el pH del medio a 3,0 utilizando ácido sulfúrico estéril (al 5%). Se incuba Aspergillus ochraceus ATCC 18500 a 28°C utilizando esencialmente los mismos parámetros iniciales que se utilizaron para el cultivo de siembra secundaria, con la excepción de que la agitación se fija inicialmente a 200 rpm. Aproximadamente 18 horas después de la inoculación, se añaden 200 g de 5-androsten-33-ol-17-ona micronizada, suspendida en un volumen mínimo de nonilfenoxipolietoxietanol al 0,2%, a la fermentación de 10 I. En los cultivos de bioconversión se ensaya diariamente la 5-androsten-3ß,11a-diol-17-ona utilizando TLC. Se extrae 1 mi de cerveza entera con 19 mi de metanol. Las células se separan de la mezcla acuosa de metanol mediante centrifugación (3.000 x g durante 10 minutos) y se aplican varios microlitros a una placa de TLC. La placa de TLC se procesa en ciclohexano:acetato de etilo:metanol (90:60:15) y el producto se visualiza pulverizando la TLC con ácido sulfúrico al 50%, seguido de carbonización en una estufa. La bioconversión de 5-androsten-3P-ol-17-ona en 5-androsten-33,11a-diol-17-ona se completa aproximadamente 3 días después de la inoculación. (D) Procedimiento de aislamiento Se recuperan los sólidos de cerveza entera mediante centrifugación. Se desecha el líquido. Los sólidos ricos se extraen con 10 I de 85% de acetona, 15% de agua a 45°C a 50°C, y el extracto rico se recupera mediante centrifugación. El extracto se concentra mediante destilación para retirar la acetona para generar una suspensión densa acuosa de cristales brutos. Los cristales brutos se recuperan por filtración y las aguas madre se desechan. Los cristales brutos humedecidos con agua se disuelven en 700 mi de metanol calentando a 55°C y después se decoloran con 5 g de carbón Darco G-60. Después de la filtración para retirar el carbón, se concentra el filtrado para cristalizar el producto. Se retira el metanol adicionalmente añadiendo 300 mi de acetato de n-butilo y concentrando hasta una suspensión densa cristalina espesa. Los cristales se filtran, se lavan con acetato de n-butilo y se secan, proporcionando 174 g de 5-androsten-3p,11a-diol-17-ona cristalina purificada.

Ejemplo 16: Preparación de 5,9(11)-androstadien-3p-oM7-ona a partir de 5-androsten-3p,11a-diol-17-ona, material de partida 25 25 Efapa 1 Se añadió T EDA (18,1 mi, 120 mmol) a una suspensión densa de 5- androsten-33,11a-diol-17-ona (30,4 g, 100 mmol) en CH2CI2 (300 ml). La suspensión densa se enfrió a -10°C y se añadió cloroformiato de metilo (7,72 ml, 100 mmol). La reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente. La reacción no se completó según la TLC, de modo que se añadió más cloroformiato de metilo (772 µ?, 10 mmol). Cuando se determinó que la reacción se había completado según la TLC, se añadieron AcOEt (300 ml) y H20 (100 ml) y se separaron las fases resultantes. La fase orgánica se lavó con 50 ml de H20, se secó sobre MgSC y se concentró hasta un aceite que solidificó en reposo. Se recristalizó el producto bruto con AcOEt/CH2Cl2 caliente y heptano. La suspensión densa se enfrió adicionalmente a 0-5°C y el producto se recogió por filtración (22 g, 60,8% de producto químico). El carbonato se purificó adicionalmente por cromatografía en columna en gel de sílice eluyendo con un gradiente de 5-20% de acetona/CH2CI2, obteniéndose monocarbonato puro (20,57 g, 56,8%).

Etapa 2 Se disolvió el carbonato de la etapa 1 (38,0 g, 0,105 mol) en 570 ml de THF y se enfrió a -35°C. Se añadió lentamente PCI5 sólido (37,1 g, 0,178 mol) manteniendo la temperatura por debajo de -30°C. Cuando la TLC mostró completada la reacción, se vertió la mezcla en una solución fría de NaHCC y . el producto se extrajo con acetato de etilo. Las fases orgánicas se secaron sobre MgS04 y se concentraron, proporcionando un aceite.

Etapa 3 Este aceite de la etapa 2 se disolvió en metanol (500 ml), se trató con 36,1 g de K2CO3 y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. Se retiró por filtración el carbonato residual. La solución se concentró parcialmente y se añadió agua para precipitar el alcohol diénico deseado, que se secó en una estufa a 45°C. Rendimiento: 29,52 g.

Etapa 4 Se realiza la bioconversión de 5,9(11)-androstadien-3p-ol-17-ona en 5,9(11)-androstadien-3 ,73-diol-17-ona utilizando un cultivo sumergido de Diplodia gossypina ATCC 20571 (sinónimo de Botryodiplodia theobromae IFO 6469) a una escala de fermentación de 10 I. (A) Etapa de siembra primaria Se preparan cultivos de siembra primaria como se describe en el EJEMPLO 12. (B) Etapa de siembra secundaria Se preparan cultivos de siembra secundaria de 10 I como se describe en el EJEMPLO 12. (C) Bioconversión de esteroides Se preparan cultivos de bioconversión de esteroides de 10 I como se describe en el EJEMPLO 12. Aproximadamente 24 h después de la inoculación, se añaden 120 g de 5,9(11)-androstadien-3p-ol-17-ona micronizada, suspendida en un volumen mínimo de monooleato de polioxietilensorbitán al 0,2%, a la fermentación de 10 I. En los cultivos de bioconversión se ensaya diariamente 5,9(11)-androstadien-3p,7 -diol-17-ona utilizando el procedimiento descrito en el EJEMPLO 12. La bioconversión de 5,9(11)-androstadien-3 -ol-17-ona en 5,9(11)-androstadien-33,7 -diol-17-ona se completa aproximadamente 3 días después de la inoculación. (D) Procedimiento de aislamiento Se recuperan los sólidos ricos de cerveza entera mediante centrifugación. La fase de cerveza líquida se extrae utilizando 15 I de cloruro de metileno. Después de asentarse, la fase superior de cerveza consumida se decanta y desecha. Se utiliza después el cloruro de metileno rico restante para extraer los sólidos ricos. El extracto de cloruro de metileno rico resultante se escurre de los sólidos consumidos, se clarifica, se concentra mediante destilación aproximadamente a 0,5 I y se enfría a -10°C. Los cristales obtenidos se recuperan mediante filtración, se lavan con acetato de n-butilo para eliminar el color y se secan, proporcionando 52,2 g de 5,9(11)-androstadien-3 ,7 -diol-17-ona cristalina purificada.

Ejemplo 17: Formación de furano 15 Se trata una solución del triacetato 10 (2,02 mmol) en 7 mi de acetonitrilo a 22°C con 2-metilfurano (0,2 mi, 2,22 mmol) y 0,298 g de Sc(OTf)3 durante 1 hora. La cromatografía en gel de sílice con 25% de AcOEt/hex proporciona el furano 17.

Ejemplo 18: Formación del éster metílico 8 a partir del furano 20 Procedimiento A Se enfrió a -79°C una solución del derivado de furano 8 (1 ,0 g, 2,280 mmol) en 100 mi de cloruro de metileno. Se pasó una corriente de O3/O2 a través de la solución durante 10 minutos, después la mezcla se calentó a temperatura ambiente y se concentró hasta un residuo sólido, que se recogió en 50 mi de metanol/cloruro de metileno 1:1, se trató con 1,0 mi de piridina y se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La solución se enfrió después a -80°C. Se pasó una corriente de O3/O2 a través de la solución durante 4 minutos. La mezcla se diluyó después con 100 mi de acetato de etilo y se extrajo con 70 mi de bicarbonato de sodio acuoso. La fase acuosa se acidificó con ácido clorhídrico acuoso a pH 0,5, después se extrajo con cloruro de metileno y se concentró hasta una espuma (peso: 250 mg). La espuma se disolvió en tolueno/metanol, se trató con trimetilsilildiazometano (0,5 mi de solución 2,0 M en hexano, 1,0 mmol) a temperatura ambiente, después la solución se concentró proporcionando el éster 9 en forma de un aceite.

Procedimiento B Etapa 1) Bis-y-lactona del ácido 5a,17 -dihidroxipregn-9(11)-en-3-on-7a,21- dicarboxílico 8a Se enfria a -10°C una mezcla de ?-lactona del ácido 17 -hidroxi-7a-(5'-metil-2'-furil)pregna-4,9(11)-dien-3-on-21-carboxírico (8, 100 g, 0,23778 mol) y acetato de potasio (50,0 g, 0,5094 mol, 2,14 eq.) en acetona (500 mi) y agua (150 mi), y se trata con una suspensión densa de dibromantina (34,0 g, 0,1189 mol, 0,50 eq. molares) en agua (100 mi) hasta que aparece un aumento de potencial rédox. En este punto, el análisis por cromatografía líquida indicó la conversión completa en una endiona c/'s. La mezcla de reacción que contiene la endiona se inactiva después con isobutilviniléter (1 ,0 mi, 0,768 g, 7,668 mmol, 0,032 eq.), se concentra hasta una suspensión densa espesa, se diluye con cloruro de metileno (200 mi) y se trata a 20°C con ácido clorhídrico concentrado (50,0 mi, 0,50 mol, 2,10 eq.). La mezcla se agita a 20-25°C durante 2 horas, en cuyo momento el análisis de cromatografía líquida indicó la conversión completa en una endiona trans. La fase orgánica que contiene la endiona se separa, se diluye con cloruro de metileno (80 mi) y metanol (300 mi) y se enfría a -48°C. Se burbujea una corriente de O3/O2 a través de esta mezcla hasta que el análisis de CL indica la completa desaparición de la endiona (\U-trans), después la mezcla se inactiva con sulfuro de dimetilo (30,0 ml, 25,38 g, 0,4085 mol, 1,72 eq.), se agita a -20°C durante 16 horas, se concentra hasta un volumen de aproximadamente 300 mi, se diluye con metanol (350 mi), se concentra hasta un volumen de aproximadamente 300 mi, se diluye con isopropanol (40 mi) y metanol (80 mi), después se trata con una solución caliente (55-60°C) de bicarbonato de potasio (120 g, 1, 986 mol, 5,04 eq.) en agua (240 mi). Se enfría esta suspensión a 5-10°C, después se añade peróxido de hidrógeno (al 50%, 66,0 g, que contiene 33,0 g (0,9703 mol, 4,08 eq.) de peróxido de hidrógeno) durante 3 horas. La mezcla se agita durante 4 horas y se inactiva con sulfuro de dimetilo (40 mi, 33,84 g, 0,5447 mol, 2,29 eq.). Después de agitar a 20-25°C durante 23 horas, la mezcla se diluye con cloruro de metileno (100 mi) y agua (80 mi) y se acidifica a pH= 3,0 con ácido clorhídrico concentrado. Se calienta a 36°C la mezcla bifásica, después se separan las fases y la fase acuosa se extrae con cloruro de metileno (100 mi). Las fases orgánicas se combinan, se lavan con agua (75 mi) y la fase acuosa se vuelve a extraer con cloruro de metileno (25 mi). Las fases orgánicas se combinan, se concentran hasta un volumen de 150 mi, después se tratan con ácido bencenosulfónico (1 ,0 g de material puro al 90% que contiene 0,90 g (5,690 mmol, 0,0239 eq.) de ácido bencenosulfónico) y acetona (50 mi). La mezcla se concentra después a presión atmosférica hasta un volumen de 160 mi, después se diluye con acetona (250 mi), se concentra hasta un volumen de 200 mi, se enfría a 12°C y se filtra. La torta de filtrado se lava con acetona fría (2 x 25 mi) y se seca por corriente de nitrógeno, proporcionando el compuesto del título, CMR (100 MHz, CDCI3) 206,08, 176,47, 175,41 , 139,63, 124,00, 94,89, 90,97, 47,08, 43,90, 42,36, 41,58, 41,07, 38,93, 36,97, 35,16, 33,01 , 32,42, 32,42, 31 ,35, 29,10, 23,08, 22,98 y 14,23, d; RMN (400 MHz, CDCl3) 0,94, 1,40, 1,4-2,8 y 5,70; EM (IC, NH3) m/e= 385 (P+H, 100%). 2) ?-Lactona del ácido 17p-hidroxi-7a-carbometoxipregna-4,9(11)-d¡en-3- 21-carboxílico 9 Se agita una mezcla de bis-y-lactona del ácido 5a,17 -dihidroxipregn- 9(11)-en-3-on-7a,21-dicarboxílico (8a, 50,0 g, 0,13005 mol) y bicarbonato de potasio (16,92 g, 0,1690 mol, 1,30 eq.) en acetona (200 mi) y agua (100 mi) a 45°C durante 2 horas, en cuyo momento la conversión de la 5,7-lactona (VII) en el ácido carboxílico (VI) se ha completado según la CL. La mezcla resultante se trata después con sulfato de dimetilo (22,92 g, 0,1817 mol, 1,40 eq.), se agita a 45°C durante 3 horas, después se trata con una solución de bicarbonato de potasio (1,3 g, 0,0130 mol, 0,100 eq.) en agua (10 mi), seguido de trietilamina pura (1,81 mi, 1,314 g, 0,0130 moles, 0,100 eq.). La mezcla se agita a 45°C durante 1 hora, se inactiva con ácido clorhídrico concentrado (1,92 mi, 2,304 g, que contiene 0,852 g (0,0234 mol, 0,180 eq.) de ácido clorhídrico), se enfría a 0°C, se concentra a presión reducida hasta un volumen de 150 mi (temperatura del recipiente 13°C), después se filtra y la torta de filtrado se lava con agua (2 x 25 mi) y se seca, proporcionando el compuesto del título 9.

Ejemplo 19: Formación de epierenona a partir de 8 Se oxida la dienona 9 como se describe en las patentes de EE.UU. 3095412, 4.559.332 y 5.981.744 proporcionando epierenona.

Claims (12)

RE1VIND1CACIONES

1. Un procedimiento para la transformación microbiana compuestos esteroideos sustituidos en 7 de fórmula I Fórmula I en la que Ri es H o alquil d-Ce-CíO)-; R2 es ß-ORi o a-C(0)-0-alquilo C-¡-Ce, o -C O R Zi es ' ; Z2 es -CH-; o Zi y Z2 pueden tomarse conjuntamente para formar un doble enlace carbono-carbono; en intermedios esteroideos de fórmula II Fórmula II en la que R2, Zi, Z2 y Q son como para la fórmula I; que comprende poner en contacto un compuesto de fórmula I con un miembro el género Fíavobactenum capaz de realizar la transformación de un compuesto de fórmula I en un compuesto de fórmula II.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1 , en el que el miembro del género Fíavobactenum se selecciona de Fíavobactenum dehydrogenans o Fíavobactenum dehydrogenans cepa ATCC 13930.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el procedimiento se realiza en un cultivo sumergido.

4. Un procedimiento según la reivindicación 1 para preparar eplerenona que comprende además las etapas de: a) biotransformación de un compuesto de fórmula 6 7b b) deshidratación de un compuesto de fórmula 7b a un compuesto ula 8; 8 c) oxidación de un compuesto de fórmula 8 a epierenona, fórmula 9. Eplerenona 9

5. Un procedimiento según la reivindicación 1 para preparar eplerenona que comprende las etapas de: a) hacer reaccionar acetileno con un compuesto de fórmula 1 proporcionando un compuesto de fórmula 2; b) acetilar un compuesto de fórmula 2 proporcionando un compuesto de fórmula 3; c) hidroformilar un compuesto de fórmula 3 proporcionando un compuesto de fórmula 4; d) oxidar un compuesto de fórmula 4 proporcionando un compuesto de fórmula 5; e) carbonilar un compuesto de fórmula 5 proporcionando compuesto de fórmula 6; f) biotransformar un compuesto de fórmula 6 en un compuesto de fórmula 7b; 7b g) deshidratar un compuesto de fórmula 7b a un compuesto de fórmula 8; h) oxidar un compuesto de fórmula 8 a eplerenona, fórmula 9.

9. Un procedimiento según la reivindicación 1 para preparar intermedios esteroideos que comprende además las etapas de: a) hacer reaccionar acetileno con un compuesto de fórmula 1 proporcionando un compuesto de fórmula 2; b) acetilar un compuesto de fórmula 2 proporcionando un compuesto de fórmula 3; c) hidroformilar un compuesto de fórmula 3 proporcionando un compuesto de fórmula 4; d) oxidar un compuesto de fórmula 4 proporcionando un compuesto de fórmula 5; e) carbonilar un compuesto de fórmula 5 proporcionando un compuesto de fórmula 6; y f) biotransformar un compuesto de fórmula 6 en un compuesto de fórmula 7b.

7. Un procedimiento según la reivindicación 1 para preparar intermedios para la síntesis de epierenona que comprende biotransformar un compuesto de fórmula 11 11 en un compuesto de fórmula 12b.

8. Un procedimiento según la reivindicación 7 para preparar epierenona que comprende además las etapas de: a) hacer reaccionar un compuesto de fórmula 12b con acetileno, proporcionando un compuesto de fórmula 13; b) cetalizar un compuesto de fórmula 13 proporcionando compuesto de fórmula 14; c) hidroformilar un compuesto de fórmula 14 proporcionando un compuesto de fórmula 15; d) oxidar un compuesto de fórmula 15 proporcionando compuesto de fórmula 16; e) hidrolizar un cetal de fórmula 16 proporcionando un compuesto de fórmula 7b; f) deshidratar un compuesto de fórmula 7b proporcionando compuesto de fórmula 8; oxidar un compuesto de fórmula 8 proporcionando la epierenona Epleronona 9

9. Un procedimiento según la reivindicación 1 para preparar intermedios esteroideos que comprende la biotransformación de un compuesto de fórmula 27 27 en un compuesto de fórmula 28b. 28b

10. Un procedimiento para preparar eplerenona según reivindicación 9 que comprende además las etapas de: a) acetilar un compuesto de fórmula 25 proporcionando compuesto esteroideo diacetoxi de fórmula 26; b) carbonilar un compuesto de fórmula 26 proporcionando un compuesto de fórmula 27; c) biotransformar un compuesto de fórmula 27 en un compuesto de fórmula 28b; d) hacer reaccionar un compuesto de fórmula 28b con acetileno proporcionando un compuesto de fórmula 29; 29 e) cetalizar un compuesto de fórmula 29 proporcionando puesto de fórmula 30; f) hidroformilar un compuesto de fórmula 30 proporcionando un compuesto de fórmula 31 ; g) oxidar un compuesto de fórmula 31 proporcionando compuesto de fórmula 32; h) hidrolizar un compuesto de fórmula 32 proporcionando compuesto de fórmula 8; 8 i) oxidar un compuesto de fórmula 8 a eplerenona, fórmula 9.

Epierenona 11. Un procedimiento de preparación de intermedios esteroideos según la reivindicación 3, que comprende la biotransformación de un compuesto de fórmula 5

12. Un procedimiento de preparación de epierenona según la reivindicación 1 que comprende además las etapas de: a) deshidratar un compuesto de fórmula 35a a un compuesto de fórmula 36; 36 b) hacer reaccionar un compuesto de fórmula 36 con una cianhidrina y posterior hidrólisis proporcionando un compuesto de fórmula 7; c) deshidratar un compuesto de fórmula 7 proporcionando un compuesto de fórmula 8; d) oxidar un compuesto de fórmula 8 a un compuesto de fórmula 9, eplerenona.