KR960013094B1 - 에이. 심플렉스(A. simplex)에 의한 스테로이드성 21-에스테르의 1,2-탈수소화 - Google Patents

에이. 심플렉스(A. simplex)에 의한 스테로이드성 21-에스테르의 1,2-탈수소화 Download PDF

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Abstract

없음.

Description

[발명의 명칭]
에이. 심플렉스(A. simplex)에 의한 스테로이드성 21-에스테르의 1,2-탈수소화
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 아르트로박터 심플렉스(Arthrobacter simplex) 또는 박테리움 시클로옥시단스(Bacterium cyclooxydans)로 일정한
Figure kpo00001
4-3-케토 C21-헤미에스테르 스테로이드를 1,2-탈수소화시켜 보다 짧은 생전환 시간동안 증가된 수율로 상응하는
Figure kpo00002
1,4-3-케토 C21-헤미에스테르 또는 유리 알콜을 제조하는 방법에 관한 것이다.
[관련 기술에 대한 설명]
셉토믹사 아피니스(Septomyxa affinis), 에이, 심플렉스 및 기타 미생물로
Figure kpo00003
4-3-케토 스테로이드를 1,2-탈수소화시켜 상응하는
Figure kpo00004
1,4-3-케토 스테로이드를 제조하는 방법은 이 분야에 잘 알려져 있으며 상업적으로 매우 가치가 있다.
미합중국 특허 제2,837,464호에서는
Figure kpo00005
4-3-케토 프레그넨을 코리네박티리움(아르트로박터) 심플렉스 또는 코리네박테리움 호아기(Corynebacterium boagii)를 사용하여 C21하이드록실 그룹이 유리되어 있거나 모노카복실산으로 에스테르화된
Figure kpo00006
1,4-프레그나디엔으로 1,2-탈수소화시키는 방법을 특허청구하고 있다.
미합중국 특허 제2,902,410호 및 2,902,411호에서는 셉토믹사 아피니스로 1,2-포화 스테로이드를 1,2-데하이드로 스테로이드로 1,2-탈수소화시키는 방법을 특허청구하고 있다.
미합중국 특허 제3,360,439호에서는, 사전에 미리 저급 알칸올 또는 알칸온으로 처리한 에이, 심플렉스 세포를 사용하여
Figure kpo00007
4-3-케토 스테로이드를 상응하는
Figure kpo00008
1,4-3-케토 스테로이드로 1,2-탈수소화시키는 방법을 기술하고 있다. 본 발명의 방법에서는 미생물 세포를 미리 처리할 필요가 없고, 또한 발효 배지에서 생존가능한 세포를 사용하여 수행할 수 있다. 선택적으로, 공기나 열 건조에 의해, 또는 아세톤과 같은 저급 알칸온에 노출시켜 미리 처리된 세포를 사용할 수도 있다. 이 미생물들의 스테로이드-1-데하이드로게나제는 또한 무세포(cell-free) 형태로 사용할 수도 있다.
미합중국 특허 제3,770,586호에서는, 11β,21-디하이드록시프레그나-1,4,17(20)-트리엔-3-온(실시예 1) 및 11β,21-디하이드록시-6α-메틸프레그나-1,4,17(20)-트리엔-3-온(실시예 5)의 진보된 제조방법을 특허청구하고 있는데, 이 방법에서는 아실 라디칼이 탄소수 3 내지 12의 디카복실산의 아실라디칼인 상기 화합물들의
Figure kpo00009
4-3-케토 21-헤미에스테르 기질의 알카리 금속염을 에스. 아피니스로 1,2-탈수소화시킨다. 진탕 플라스크, 5.0g/l 농도의 11β,21-디하이드록시프레그나-4,17(20)-디엔-3-온 21-헤미석시네이트 칼륨염 및 배지 1을 사용하여 5일 후에 원하는
Figure kpo00010
1,4-생성물을 100% 수율로 수득했다(실시예 8). 실시예 1에서는 보다 큰 교반탱크를 사용하였고 보다 낮은 수율을 나타냈다. 배지 2 및 2.0~7.0g/l의 11β,21-디하이드록시프레그나-4,17(20)-디엔-3-온 21-헤미석시네이트 칼륨염을 사용하여 6일 후에 91.1 내지 96.6%의 수율을 얻었다.
미합중국 특허 제4,524,134호 및 4,704,358호에서는 각각, 아르트로박터 심플렉스 및 박테리움 시클로옥시단스의 공기 건조 또는 열건조된 세포를 사용하여 1,2-포화
Figure kpo00011
4-3-케토 스테로이드로부터 상응하는 1,2-탈수소화 스테로이드를 제조하는 개선된 미생물 이용방법이 기술되어 있다.
본 발명의 방법에서는 수율이 증가된 뿐만 아니라 보다 고농도의 기질을 사용할 수 있고 반응 시간을 줄일 수 있다.
[본 발명의 요약]
본 명세서에서는
Figure kpo00012
4-3-케토 21-헤미에스테르 스테로이드(I)를 아르트로박터 심플렉스 또는 박테리움 시클로옥시단스의 스테로이드-1-데하이드로게나제와 접촉시킴을 포함하는
Figure kpo00013
1,4-3-케토 21-헤미에스테르 스테로이드(II)의 제조방법을 밝힌다.
이때, 일반식(II)(본 명세서 실시예 뒤에 나오는 챠아트 A 참조)에서,
(B-I) R6는 =CH2또는 α-R6-1: β-H[이때, R6-1은 -H, -F 또는 -CH3이다]이고, R7은 α-H : β-H이며 :
(B-II) R6는 R6-3: R6-4이고, R7은 R7-3: R7-4이며, R6-3및 R6-4중 하나는 R7-3및 R7-4중 하나와 함께 C6와 C7사이에 제 2 결합을 형성하고, R6-3및 R6-4중 하나는 -CH3이고, R7-3 및 R7-4중 다른 하나는 -H이며 ;
(C-I) R11은 α-R11-1: β-R11-2이며, 이때 R11-1및 R11-2중 하나는 R9와 함께 C9와 함께 C11사이에 제 2 결합을 형성하고, R11-1및 R11-2중 다른 하나는 -H이며 ;
(C-II) R9는 -H, -F, -Cl 또는 Br이고, R11은 =0 또는 α-R11-3: β-R11-4[이때, R11-3및 R11-4중 하나는 -H이고 R11-3및 R11-4중 다른 하나는 -H 또는 -OH이다]이며 ;
(C-III) R11은 α-H : β-O-이며, 이때 β-O-는 R9와 함께 C9와 C11사이에 β-배위의 에폭시드를 형성하며 ;
(D-I) R16은 R16-1: R16-2이고, R17은 R17-1: R17-2이며, 이때 R16-1및 R16-2중 하나는 -H이고 다른 하나는 R17-1및 R17-2중 하나는 함께 C16과 C17사이에 제 2 결합을 형성하며, R17-1및 R17-2중 다른 하나는 -CO-CH2-O-R21[이때, R21은 -H, -CO-(X1)-COOR21-1이고, X1은 -CH=CH- 또는 -(CH2)n1이며, n1은 1 내지 8이고, R21-1은 -H 또는 양이온이다]이며 ;
(D-II) R16은 α-H : β-H이고, R17은 =CH-CH2-O-R21[이때, R21은 상기 정의한 바와 같다]이며 ;
(D-III) R16은 =CH2또는 α-R16-5: β-R16-6[이때, R16-5는 -H, OH 또는 -CH3이며, 단 R16-5및 R16-6중 하나는 -H이다]이고, R17은 α-R17-5: β-CO-CH2-O-R2[여기서, R17-5는 -H 또는 -OH이고, R21은 상기 정의한 바와 같다]이다.
일반식(I)(본 명세서 실시예 뒤에 나오는 챠아트 A 참조)에서,
(D-I) R16은 R16-1: R16-2이고, R17은 R17-1: R17-2이며, 이때 R16-1및 R16-2중 하나는 -H이고 다른 하나는 R17-1및 R17-2중 하나는 함께 C16과 C17사이에 제 2 결합을 형성하고, R17-1및 R17-2중 다른 하나는 -CO-CH2-O-CO-(X1)COOR216-1[이때, X1및 R21-1은 상기한 바와 같다]이며 ;
(D-II) R16은 α-H : β-H이고, R17은 =CH-CH2-O-CO-(X1)-COOR21-1[이때, X1및 R21-1은 상기 정의한 바와 같다]이며 ;
(D-III) R16은 =CH2또는 α-R16-5: β-R16-6[이때, R16-5는 -H, OH 또는 -CH3이고, 단 R16-6은 -H 또는 -CH3이며, 단 R16-5및 R16-6중 하나는 -H이다]이고, R17은 α-R17-5: β-CO-CH2-O-C1(X1)-COOR21-1[여기서, R17-5는 -H 또는 -OH이고, X1및 R21-1은 상기 정의한 바와 같다]이며, R6,R9및 R11은 상기한 바와 같다.
[본 발명의 상세한 설명]
본 발명의 방법은 일반식(I)의
Figure kpo00014
4-3-케토 21-헤미에스테르 스테로이드를 에이. 심플렉스 또는 비시클로옥시단스로부터의 스테로이드-1-데하이드로게나제와, 또는 스테로이드-1-데하이드로게나제를 함유하는 에이, 심플렉스 또는 비. 시클로옥시단스의 세포와 접촉시켜 상응하는
Figure kpo00015
1,4-3-케토 스테로이드(II)를 21-헤미에스테르 및/또는 유리 21-하이드록시 화합물 형태로 제조합을 포함한다.
Figure kpo00016
4
Figure kpo00017
4
Figure kpo00018
4
Figure kpo00019
4
Figure kpo00020
4
Figure kpo00021
4
Figure kpo00022
4이드로드 또는 산 할라이드와 반응시켜
Figure kpo00023
4
Figure kpo00024
4 6-1 3 2
Figure kpo00025
9(12) 11 17 2 1 21-1 2 1 21-1 1 n1 1 +
17β,21-디하이드록시프레그나-4,9(11)-디엔-3,20-디온,
11β,21-디하이드록시프레그나-4,17(20)-디엔-3-온,
11β-17α-21-트리하이드록시-6α-메틸프레그느-4-엔-3,20-디온,
11β,21-다하이드록시-6α-메틸프레그나-4,17(20-디엔-3-온,
11β,17α-21-트리하이드록시프레그느-4-엔-3,20-디온,
17,21-디하이드록시-6α-메틸프레그나-4,9(11)-디엔-3,20-디온,
17,21-디하이드록시-16β-메틸프레그나-4,9(11)-디엔-3,20-디온,
6α-플루오로-21-하이드록시프레그나-4,9(11), 16-트라엔-3,20-디온,
21-하이드록시프레그나-4,9(11), 16-트리엔-3,20-디온,
17,21-디하이드록시-16-메틸프레그나-4,9(11)-디엔-3,20-디온.
가장 바람직한 것은 21-헤미석시네이트 형태의 11β,21-디하이드록시프레그나-4,17(20)-디엔-3-온이다.
미생물 에이. 심플렉스 및 비. 시클로옥시단스는 잘 알려져 있다[미합중국 특허 제2,837,464, 4,524,134 및 4,704,358호를 참조한 것]. 본 발명의 방법은 몇가지 형태중 어느 형태로든지 상기 두 미생물중 어느 한 미생물로부터 스테로이드-1-데하이드로게나제 활성을 이용하여 실시할 수도 있다. 둘중 어느 한 미생물로부터 수득한 효소를 사용할 수 있으나 미생물원으로서 에이. 심플렉스를 사용하는 것이 바람직하다. 생전환반응은 무세포 스테로이드-1-데하이드로게나제를 사용하거나 또는 미생물의 세포를 사용하여 수행할 수 있다. 바람직하게는, 추가의 제조 단계를 사용하여 수행할 수 있다. 바람직하게는, 추가의 제조 단계를 피하기 위하여 발표 브로스에 있는 전체 미생물 세포를 본 발명의 실시예 사용한다. 분리된 세포를 사용하고자 할 때에는 원심분리, 응결 및 여과, 침전 및 여과, 또는 한외여과와 같은 통상의 수단으로 보통 배지로부터 수집하고 농축시켜 사용할 수 있다. 분리된 세포는 젖은 상태로 사용되거나, 문헌[Methods in Enzymology, Vol. XLIV, p. 11-317(1976)]에 기재된 바와 같이 콜라겐, 알기네이트 또는 카라기닌에 포획하는 것과 같은 표준 기법으로 고정화시키거나, 또는 미합중국 특허 제3,360,439호에 기술된 바와 같이 저급 알콜 또는 아세톤과 같은 알칸온으로 처리하거나, 미합중국 특허 제4,524,134 및 4,704,358호에 기재된 바와 같이 가열 진공 건조에 의해, 동결 건조에 의해, 가열공기건조에 의해, 또는 분무건조에 의해 건조시킬 수 있다. 무세포 형태의 스테로이드-1-데하이드로게나제 활성은 스테로이드-1-탈수소화를 촉진시키기 위해 용액으로 사용할 수도 있고 또는 고정화 효소로서 사용할 수도 있다. 본 발명의 방법은
Figure kpo00026
4
Figure kpo00027
1,4
생전환 반응은 스테로이드 기질인
Figure kpo00028
4-3-케토 21-헤미에스테르 스테로이드(I)를 pH 6 내지 10, 바람직하게는 7 내지 8을 갖는 주로 수용성인 시스템에서 스테로이드-1-데하이드로게나제 활성을 함유하는 제제에 노출시켜 수행한다. 수용성 시스템은 약 5% 미만의 수혼화성 유기용매를 함유할 수 있다. 적합한 수혼화성 유기용매로는 예를들어, 디메틸 설폭사이드, 디메틸포름아미드, 메탄올, 아세톤 등이 있다. 경우에 따라서, 수불혼화성 유기용매를 약 2 내지 약 50%의 양으로 첨가할 수 있다(단, 이것이 스테로이드-1-데하이드로게나제 활성에 무독해야 한다). 적합한 수불혼화성 유기용매로는 톨루엔, 벤젠, 부틸 아세테이트. 헵탄, 염화메틸렌 등이 있고 톨루엔이 바람직하다.
Figure kpo00029
4-3-케토 21-헤미에스테르 스테로이드 기질(I) 또는 외생 전자운반체를 스테로이드-1-데하이드로게나제 제제에 첨가하기 전에 이를 용해시커거나 현탁시키기 위해 이 유기용매를 사용할 수 있다. 스테로이드 기질의 접촉과정을 외생 전자운반체 존재하에 수행하는 것이 바람직하다. 이 분야에 숙련된 자들에게 잘 알려진 바와 같이, 모든
Figure kpo00030
4
스테로이드-1-탈수소화를 자극시키고/거나 제제내의 다른 스테로이드-변성 활성(이러한 활성을 미리 제거하지 않았을 경우)을 막기 위해 외생 전자운반체를 첨가할 수 있다. 외생전자운반체는 메나디온, 메나디온 비설파이트, 1,4-나프토퀴논, 페나진 메토설페이트, 페나진 에토설페이트, 디클로로페놀, 인도페놀 및 시토크롬 C로 구성된 군으로부터 선택하는 것이 바람직하다. 이 외생 전자 운반체가 메나디온, 메나디온 비설파이트 또는 1,4-나프토퀴논인 것이 보다 바람직하다. 외생 전자운반제는 약 0.01g/l (미합중국 특허 제4,524,134호에 기술된 방식으로) 내지 약 3.0g/l의 촉매량(단, 과산화수소의 축적을 최소화한다)으로 사용한다. 약 0.10 내지 약 1.0g/l를 사용하는 것이 바람직하다. 생전환 공정 도중에 혼합물이 분자산소와 접촉하는 것이 바람직하므로 이 혼합물을 교반한다. 온도는 약 5 내지 약 45°의 범위가 바람직하다.
특정한
Figure kpo00031
1,4-3-케토 21-헤미에스테르 스테로이드 기질(I)을 탈수소화하는데 사용되는 생전환과정의 형태는 그 특정 스테로이드의 구조 및 서질에 따라 달라진다. 예를들어, 실시예 1에 기술된 기질은 발효 브로스에 있는 전체 세포를 이용하여 모두 생전환되지만, 에이. 심플렉스의 가열 건조 세포를 동등량 사용할 경우에는 그 전환정도가 휠씬 떨어진다. 효소 제제의 최적형태 및 농도, 최적기질농도, 기질첨가시간 및 생전환기간은 이 분야에 통상의 기술을 가진자가 알고 있는 범위내에서 통상의 예비실험을 거쳐 각각의 스테로이드-1-탈수소화 반응에서 쉽게 측정할 수 있다. 대부분의
Figure kpo00032
1,4
Figure kpo00033
1,4
발효 브로스의 에이. 심플렉스 세포를 사용하는 공지의 스테로이드-1-탈수소화 공정에서는, C21위치에 21-하이드록시 또는 21-모노카복실산 에스테르 관능기, 바람직하게는 초산 에스테르를 함유하는
Figure kpo00034
1,4-3-케토 21-헤미에스테르 스테로이드 기질을 사용한다. 발효 배지에서 상기 21-하이드록시-또는 21-아실옥시-
Figure kpo00035
1,4-3-케토 21-헤미에스테르 스테로이드 기질 농도는 미합중국 특허 제2,837,464호에 기재된 바와 같이 약 1.5 내지 약 5g/l이다.
Figure kpo00036
1,4-3-케토 스테로이드 21-헤미에스테르(I)를 1-탈수소화시키는 공지공정에서는 21-에스테르 모화합물을 중량을 기준으로 약 2 내지 약 10g/l, 또는 21-하이드록시 스테로이드 모화합물을 기준으로 약 1.4 내지 약 7.1g/l의 기질농도를 사용한다[미합중국 특허 제3,770,586호를 참조할 것]. 에이. 심플렉스를 사용하는 본 발명의 방법은, 21-디카복실산 에스테르
Figure kpo00037
1,4
본 발명의 방법은 보다 짧은 반응 시간에 보다 높은 기질 농도를 사용한다는 잇점이 있다. 본 발명의 방법에서는, 비에스테르화
Figure kpo00038
1,4-3-케토 스테로이드를 기준으로 약 4 내지 약 30g/l 농도의
Figure kpo00039
1,4-3-케토 21-헤미에스테르 스테로이드(I)을 사용할 수 있다. 약 4g/l 미만으로도 사용할 수는 있으나 상업적으로 의미가 없다. 약 30g/l 이상에서는 잔사가 증가하여 보다 낮은 기질 농도로 반응을 수행하는 것이 좋다.
Figure kpo00040
1,4-3-케토 스테로이드(I)의 농도는 21-하이드록시 스테로이드 모화합물을 기준으로 약 4 내지 12g/l에 상응하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에서는 증가된 수율로, 전에 소요되었던 시간보다 짧은 시간에
Figure kpo00041
1,4-3-케토 스테로이드(II)를 제조하다.
Figure kpo00042
1,4-3-케토 스테로이드(II) 생성반응은 약 4 내지 약 72시간안에 완결된다. 현존하는 스테로이드-1-탈수소화 방법들은 통상적으로 에스. 아피니스와 함께 헤미에스테를 사용하여 평균 약 120시간이 걸린다[미합중국 특허 제3,770,586호를 참조할 것].
Figure kpo00043
4
Figure kpo00044
1,4
Figure kpo00045
1,4
[정의 및 규정]
하기의 정의 및 설명들은 특허청구의 범위를 포함한 본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 용어에 관한 것이다.
I. 구조식 및 가변체의 정의에 대한 규정
본 명세서 및 특허청구범위에 있는 각종 화합물 또는 분자상 분절들을 표시하는 화학 구조식을 명백히 표시된 구조적 특정 이외에도 가변치환체를 포함할 수 있다. 이 가변치환체들은 문자 또는 문자와 그 아래에 적은 숫자, 예를들어 Z1또는 Ri(이때, i는 정수이다)로 표시한다. 이 가변치환테들은 일가 또는 이가이며 즉, 이들은 하나 또는 2개의 화학결합에 의해 구조식에 붙은 그룹이다. 예를들어, 그룹 Z1이 구조식 CH3-C(=Z1)H에 붙은 경우 이 그룹은 이가의 가변체가 될 것이다. 그룹 Ri및 Rj는 이들이 구조식 CH3-CH2-C(Ri)(Rj)H2에 붙을 경우 이 그룹은 이가의 가변체가 될 것이다. 상기한 바와 같이 화학 구조식을 선상으로 나타낼 경우, 괄호안에 표시한 가변치환체들이 괄호안에 들어 있는 가변치환체들의 바로 왼쪽에 있는 원자에 결합함을 뜻한다. 2개 이상의 연속 가변치환체들이 괄호안에 들어 있는 경우, 이들 연속 가변치환체들 각각이 괄호안에 들어 있지 않은 왼쪽으로 바로 전에 있는 원자에 결합함을 뜻한다.
그러므로 상기 구조식에서 Ri및 Rj는 모두, 앞에 있는 탄소원자에 결합되어 있다. 또한, 스테로이드와 같이, 확립된 탄소원자 넘버링(nimbering) 시스템을 갖는 분자의 경우, 이 탄소원자들은 Ci로 표시하며 이때 i는 탄소원자 번호에 해당하는 정수이다. 예를들어, C6은 스테로이드 화학분자에 숙련된 자들이 전통적으로 표시해온 바와같이 스테로이드 핵에서의 6 위치 또는 탄소원자 번호를 의미한다. 마찬가지로, R6라는 용어는 C6위치에서의 가변치환체(일가 또는 이가)를 표시한다.
선상으로 표시한 화학구조식 또는 그 일부는 선형 쇄형태의 원자들을 의미한다. 부호 -는 일반적으로 쇄의 2개 원자 사이에 있는 단결합을 의미한다. 그러므로 CH-O-CH-CH(Ri)-CH는 2-치환된-1-메톡시프로판 화합물을 의미한다. 비슷하게, 부호 =는 예를들어, CH2=C(Ri)-O-CH3에서와 같이 이중결합을 의미하며 부호 ≡C-CH(Ri)-CH2-CH3에서와 같이 삼중결합을 의미한다. 카보닐 그룹은 -CO- 또는 -C(=0)-로 표시하며 전자가 간단하기 때문에 바람직하다.
환상(고리) 화합물 또는 그의 분자상 분절들이 화학 구조식을 선상으로 표시할 수 있다. 그러므로, 화합물 4-클로로-2-메틸피리딘을 N*=C(CH3)-CH-CCl-CH=C'H[이때 별표(*)로 표시한 원자들이 서로 결합되어 고리를 형성한다라는 규정이 있음]로 선상 형태로 표시할 수 있다. 유사하게, 환상 분자상 분절, 4-(에틸)-1-피페라지닐을 -N*-(CH2)2-N(C2H5)-CH2-C*H2로 표시할 수 있다.
본 명세서에 기술된 화합물의 환상(고리) 구조에서는 환상 화합물의 각 탄소원자에 부착된 치환체의 고리의 면에 대한 배향(orientation)을 표시한다. 그러한 화합물을 표시하는 구조식에서, 고리의 면 아래로 탄소원자에 부착된 치환체는 알파(α) 배위로 구반하여 탄소원자에 점선, 생략선 등 즉, 부호 --- 또는 …으로 붙여 표시한다. 고리의 면 위로 부착된 상응하는 치환체는 베타(β) 배위로 구분한다. 가변치환체가 이가인 경우, 이 원자가는 함께 또는 별개로, 또는 두가지 방법 모두로 가변체의 정의에 표시될 수 있다. 예를들어, -C(=Ri)-와 같이 탄소원자에 부착된 가변체 Ri는 이가일 수도 있고, 옥소 또는 케토로 정의될 수도 있다. 따라서 카보닐 그룹(-CO-)을 형성하거나 또는 별개로 부착된 2개의 일가 가변치환체인 α-Ri-j및 β-Ri-k로 정의될 수도 있다. 이가 가변체, Ri가 2개의 일가 가변치환체로 구성된 것으로 정의될 경우, 이가 가변체는 α-Ri-j: β-Ri-k또는 그의 변이체 형태인 것으로 규정한다.
그러한 경우, α-Ri-j및 β-Ri-k모드가 그 탄소원자에 부착되어 -C(α-Ri-j)( β-Ri-k)-가 된다. 예를들어, 이가 가변체 R6, -C(=R6)-가 2개의 일가 가변치환체로 구성된 것으로 정의한 경우, 이 2개의 일가 가변치환체는 α-R6-1: β-R6-2, ...α-R6-9: β-R6-10등이고, -C(α-R6-1)(β-R6-2)-, ...-C(α-R6-9)(β-R6-10등이 될 것이다. 유사하게, 이가 가변체 R11, -C(=R11)-의 경우 2개의 일가 가변치환체는 α-R11-1: β-R11-2이다. 별개의 α 및 β 배향이 존재하지 않는(예를들어, 고리에 탄소-탄소 이중결합의 존재하기 때문에) 고리 치환체의 경우, 및 고리의 일부가 아닌 탄소원자에 결합된 치환체의 경우에도 상기 규정을 적용하나 α 및 β 표시만 삭제한다.
이가 가변체를 2개의 별개의 일가 가변치환체라고 정의할 수 있듯이, 2개의 별개의 일가 가변치환체를, 함께 결합하여 이가 가변체를 형성한다라고 정의할 수도 있다. 예를들어, 구조식 -C1(R1g/l)H-C2(Rj)H- (이때 C1과 C2는 임의로 각각 첫번째 탄소원자 및 두번째 탄소원자로 정의하다)에서, Ri와 Rj는 서로 함께 (1) C1과 C2사이에 제 2 결합을 형성하거나 (2) 옥사(-O-)와 같은 이가 그룹을 형성(이 경우 구조식은 에폭시드로 표시)하는 것으로 정의될 수 있다. Ri와 Rj가 함께 결합하여 보다 복잡한 치환체, 예를들어 그룹 -X-Y-를 형성하는 경우, 이 치환체의 배향은, 상기 구조식에서 C1이 X와 결합하고, C2가 Y와 결합하는 식이 된다. 그러므로, 이 규정에 의해 ...Ri및 Rj가 함께 -CH2-CH2-O-CO...를 형성한다라는 표시는 카보닐이 C2에 결합되어 있는 락톤을 의미한다. 그러나, ...Rj및 Ri가 함께 -CH2-CH2-O-CO-...를 형성한다라고 표시되었을 경우, 이는 카보닐이 C1에 결합되어 있는 락톤을 의미한다.
가변치환체의 탄소원자 수소는 2가지 방법중 하나의 방법으로 표시한다. 첫번째 방법은 가변체의 전체 이름앞에 접두사를, 예를들어 C1-C4와 같이 쓰는 것인데 이때 1과 4는 가변체에 있는 최소 및 최대 탄소원자 수를 나타내는 정수이다. 이 접두사는 가격을 두고 가변체로부터 떨어져 표시한다. 예를들어, C1-C4알킬은 탄소수 1 내지 4의 알킬을 의미하며 이때 특별히 언급하지 않는한 그의 이성체 형태로 포함된다. 이러한 단일 접두사가 붙어 있을 경우 이 접두사는 정의되는 가변체의 총 탄소원자 수를 표시한다. 그러므로 C2-C4알콕시카보닐은 그룹 CH2-(CH2)n-O-CO- (여기서, n은 0, 1 또는 2이다)를 의미한다. 두번째 방법에서는, 정의되는 각 부분만의 탄소원자 수를 괄호만에 Ci-Cj표시를 넣어 이를 정의되는 부분 바로전(간격없이)에 넣으므로써 별도로 표시한다. 이러한 임의 규정에 의해 (C1-C3)에 알콕시카보닐은 C1-C3가 알콕시 그룹의 탄소원자수만을 의미하므로 결국 C2-C4알콕시카보닐과 같은 의미가 된다. 유사하게, C2-C6알콕시알킬과 (C1-C3) 알콕시 (C1-C3) 알킬은 모두 탄소수 2 내지 6을 갖는 알콕시알킬그룹을 의미하지만, 전자는 정의는 알콕시나 알킬 부분 단독으로 4 내지 5개의 탄소원자를 함유하는 반면에 후자의 정의는 이들 그룹 각각의 탄소원자 수를 3까지로 한정하는 차이가 있다.
특허청구범위에 상당히 복잡한 (환상) 치환체가 포함될 경우, 그 특정 치환체를 부르는/표시하는 문구의 끝에 그 특정 치환체의 화학구조식도 기술한 챠아트의 하나에 있는 동일한 이름/표시에 상응하는 주석을 괄호안에 표시할 것이다.
II. 정의
모든 온도는 섭씨온도이다.
HPLC는 고압액체 크로마토그라피를 말한다.
DMF는 디메틸포름아미드를 말한다.
용매쌍을 사용하는 경우, 사용된 용매들간의 비율은 부피/부피(v/v)로 표시한다.
에이. 심플렉스는 아르트로박터 심플렉스를 말한다.
비. 시클로옥시단스는 박테리움 시클로옥시단스를 말한다.
Figure kpo00046
1,4
[실시예]
더 이상의 설명없이도 이 분야에 숙련된 사람은 전술한 내용으로부터 본 발명을 충분히 실시할 수 있으리라고 여겨진다. 하기의 상세한 실시에는 각종 화합물을 어떻게 제조하는지 및/또는 본 발명의 각종 방법을 어떻게 수행하는지를 기술한 것으로, 이는 단지 설명을 위한 것인지 어떠한 방법으로든 본 발명의 내용을 한정하려는 것은 아니다. 이 분야에 숙련된 자들은 반응물, 반응조건 및 반응기법에 관하여 이 공정들로부터 적절히 변형시킬 수 있음을 쉽게 알게될 것이다.
[실시예 1]
11β,21-디하이드록시프레그나-4,17(20)-디엔-3-온 21-헤미석시네이트 칼륨염(I)의 에이. 심플렉스에 의한 생전환
A. 1차 미생물 종자 육성 단계
보통 한천 사면 배지상에 있는 아르트로박터 심플렉스(UC582, ATCC 6946)의 배양물로부터 수득한 세포를 증류수(5ml)에 재현탁시키고, 보통 배치(12g/l의 디프코(Difco) 상표)로 구성된 300ml의 1차 종자배지(접종전에 121°에서 30분간 멸균시켰음)에 접종시킨다.
이 혼합물을 회전진탕기(250rpm, 2인치 거리)상, 28°에서 1리터짜리 진탕플라스크에서 2일동안 배양시킨다.
B. 2차 종자 육성 단계
미생물의 2차 증식에 사용된 성장배지는 다음 영양 물질의 수용성 혼합물로 구성된다 :
Figure kpo00047
배지의 pH는 상기한 바와 같이 멸균하기 전에 시약등급의 수산화 나트륨으로 pH 7.0으로 조절한다. 상기 1차 단계로부터 2개의 진탕플라스크(300ml)를 250리터짜리 2차 종자배지에 접종하는데 사용한다. 발효조는 약 28°에서, 280rpm의 교반속도, 100표준 리터/분(slm)의 통기속도 및 5psig의 배압(back-pressure)으로 작동시킨다. 2차 종자단계는 2일동안 배양시킨다.
C. 본 발명의 공정의 발효(반응)단계
20g/l의 건조 옥수수 침출액(Solulys A), 20g/l의 라아드유 제 2 호, 0.1g/l이 코티손 아세테이트 및 0.2ml/1의 실리콘 소포제(SAG-471-유니온 카바이드)를 함유하는 수성 배지를, 이 혼합물을 멸균하기 전에 수산화 나트륨으로 pH 6.0으로 조절한다. 생성된 배지를 250리터의 작동용량을 갖는 발효조에서 121°로 30분 동안 멸균시킨다. 탱크내의 배지를 28°의 온도에서, 280rpm의 교반속도, 25slm의 통기속도 및 5psig의 배압하에 교반시킨다. 발효조의 내용물을 아르트로박터 심플렉스(ATCC 6946)의 48시간 성장물(상기 2차 종자배지로부터)의 최종 발효부피의 5용량%로 접종시킨다. 생성된 배양 혼합물을 36시간 동안(이 시간동안 pH를 7.5로 조절하고 황산이나 수산화나트륨으로 자동적으로 첨가하여 이 pH를 유지시켰다) 성장시킨다. pH를 조절한 후 메나디온을 가해 최종농도 0.17g/l로 만든다.
Figure kpo00048
1,4
Figure kpo00049
1,4
HPLC 분석에 의해 반응이 완결된 것을 확인한다. 생성물인 11β,21-디하이드록시프레그나-1,4,17(20)-트리엔-3-온(II)과 11β,21-디하이드록시프레그나-1,4,17(20)-트리엔-3-온 21-헤미석시네이트(II)의 혼합물을 염기로 가수분해시켜 11β,21-디하이드록시프레그나-1,4,17(20)-트리엔-3-온(II)을 얻는다. 이 혼합물을 여과하고, 여과 케익안에 들어 있는
Figure kpo00050
1,4-3-케토 스테로이드(II)를 이어서 수성아세톤으로 추출하고 이 분야에서 잘 알려진 방법으로 결정화시킨다. 실리카 기재 C-8 컬럼(25cm) 상에서 아세토니트릴/물/초산(40/60/0.1)의 이동상으로 유출시키는 HPLC에 의해 공지된 샘플과 비교하여 생성물을 확인하였다. 21-하이드록시 화합물의 체류시간은 12.5분이고 21-헤미석시네이트의 체류시간은 28.5분이다.
[실시예 2 내지 20]
실시예 1의 일반공정에 따라 중요한 변화없이, 다만 하기 컬럼 A의
Figure kpo00051
4-3-케토 21-헤미에스테르 스테로이드(I)를 출발물질로 사용하여 상응하는
Figure kpo00052
1 D 3
Figure kpo00053
[실시예 21]
6α-플루오로-21-하이드록시프레그나-4,9(11),16(17)-트리엔-3,20-디온 21-헤미석시네이트(I)의 에이. 심플렉스(건조 세포)에 의한 생전환
미합중국 특허 제4,524,134호의 일반 공정에 따라 중요한 변화없이 에이. 심플렉스 건조 세포 1.0g을 인산칼륨 완충액(0.05M, 100ml, pH 7.5)에 현탁시킨다. 메나디온(8.6mg)을 에탄올(1ml)에 용해시켜 세포현탁액에 첨가한다.
Figure kpo00054
1,4
Figure kpo00055
1,4
Figure kpo00056
1
[실시예 22]
11β,17α,21-트리하이드록시-6α-메틸프레그느-4-엔-3,20-디온 21-헤미석시네이트(I)의 비. 시클로 옥시단스에 의한 생전환
미합중국 특허 제4,704,358호의 일반공정에 따라 중요한 변화없이, 다만 11β,17α,21-트리하이드록시-6α-메틸프레그느-4-엔-3,20-디온 21-헤미석시네이트(I)를 출발물질로 하고 비. 시클로옥시단스를 사용하여 표제 화합물을 수득한다. 부틸 아세테이트 추출물과 공지의 표준 물질을 클로로포름/메틸-셀로솔브/95% 에틸 알콜(87.5/5/7.5) 용매 시스템으로 실리카겔(형광) 플레이트상에서 박층 크로마토그라피하여 생전환을 확인한다.
Figure kpo00057

Claims (21)

  1. 하기 일반식(I)의
    Figure kpo00058
    4-3-케토 21-헤미에스테르 스테로이드를 아르트로박터 심플렉스 또는 박테리움 시클로옥시단스의 스테로이드
    Figure kpo00059
    1-데하이드로게나제와 접촉시킴을 포함하는, 하기 일반식(II)의
    Figure kpo00060
    1,4-3-케토 21-헤미에스테르 스테로이드의 제조방법.
    Figure kpo00061
    Figure kpo00062
    상기 일반식(II)에서,
    (B-I) R6는 =CH2또는 α-R6-1: β-H[이때, R6-1은 -H, -F 또는 -CH3이다]이고, R7은 α-H : β-H이며 :
    (B-II) R6는 R6-3: R6-4이고, R7은 R7-3: R7-4이며, R6-3및 R6-4중 하나는 R7-3및 R7-4중 하나와 함께 C6와 C7사이에 제 2 결합을 형성하고, R6-3및 R6-4중 하나는 -CH3이고, R7-3및 R7-4중 다른 하나는 -H이며 ;
    (C-I) R11은 α-R11-1: β-R11-2이며, 이때 R11-1및 R11-2중 하나는 R9와 함께 C9와 함께 C11사이에 제 2 결합을 형성하고, R11-1및 R11-2중 다른 하나는 -H이며 ;
    (C-II) R9는 -H, -F, -Cl 또는 Br이고, R11은 =0 또는 α-R11-3: β-R11-4[이때, R11-3및 R11-4중 하나는 -H이고 R11-3및 R11-4중 다른 하나는 -H 또는 -OH이다]이며 ;
    (C-III) R11은 α-H : β-O-이며, 이때 β-O-는 R9와 함께 C9와 C11사이에 β-배위의 에폭시드를 형성하며 ;
    (D-I) R16은 R16-1: R16-2이고, R17은 R17-1: Rg/l7-2이며, 이때 R16-1및 R16-2중 하나는 -H이고 다른 하나는 R17-1및 R17-2중 하나는 함께 C16과 C17사이에 제 2 결합을 형성하며, R17-1및 R17-2중 다른 하나는 -CO-CH2-O-R21[이때, R21은 -H, -CO-(X1)-COOR21-1이고, X1은 -CH=CH- 또는 -(CH2)n1이며, n1은 1 내지 8이고, R21-1은 -H 또는 양이온이다]이며 ;
    (D-II) R16은 α-H : β-H이고, R17은 =CH-CH2-O-R21[이때, R21은 상기 정의한 바와 같다]이며 ;
    (D-III) R16은 =CH2또는 α-R16-5: β-R16-6[이때, R16-5는 -H, OH 또는 -CH3이며, 단 R16-5및 R16-6중 하나는 -H이다]이고, R17은 α-R17-5: β-CO-CH2-O-R2[여기서, R17-5는 -H 또는 -OH이고, R21은 상기 정의한 바와 같다]이며,
    상기 일반식(I)에서,
    (D-I) R16은 R16-1: R16-2이고, R17은 R17-1: R17-2이며, 이때 R16-1및 R16-2중 하나는 -H이고 다른 하나는 R17-1및 R17-2중 하나는 함께 C16과 C17사이에 제 2 결합을 형성하고, R17-1및 R17-2중 다른 하나는 -CO-CH2-O-CO-(X1)-COOR|216-1[이때, X1및 R21-1은 상기한 바와 같다]이며 ;
    (D-II) R16은 α-H : β-H이고, R17은 =CH-CH2-O-CO-(X1)-COOR21-1[이때, X1및 R21-1은 상기 정의한 바와 같다]이며 ;
    (D-III) R16은 =CH2또는 α-R16-5: β-R16-6[이때, R16-5는 -H, OH 또는 -CH3이고, 단 R16-6은 -H 또는 -CH3이며, 단 R16-5및 R16-6중 하나는 -H이다]이고, R17은 α-R17-5: β-CO-CH2-O-(C1)-COOR21-1[여기서, R17-5는 -H 또는 -OH이고, X1및 R21-1은 상기 정의한 바와 같다]이며, R6,R9및 R11은 상기한 바와 같다.
  2. 제 1 항에 있어서, 유료량의 외생 전자운반체의 존재하에 상기 방법을 수행하는
    Figure kpo00063
    1,4-3-케토 스테로이드(II)의 제조방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 외생 전자운반체를 메나디온, 메나디온 비설파이트, 1,4-나프토퀴논, 페나진 메토설페이트, 페나진 에토설페이트, 디클로로페놀, 인도페놀 및 시토크롬 C로 구성된 군으로부터 선택하는
    Figure kpo00064
    1,4-3-케토 스테로이드(II)의 제조방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 외생전자운반체가 메나디온, 메나디온 비설파이트 또는 1,4-나프토퀴논인
    Figure kpo00065
    1,4-3-케토 스테로이드(II)의 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서, R6이 -H : -H, -F : -H, -CH3:-H 또는 =CH2인
    Figure kpo00066
    1,4-3-케토 스테로이드(II)의 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서, R11-3및 R11-4중 하나가 -H이고 다른 하나가 -H 또는 -OH인
    Figure kpo00067
    1,4-3-케토 스테로이드(II)의 제조방법.
  7. 제 1 항에 있어서, R11이 α-R11-1: β-R11-2이며, 이때 R11-1및 R11-2중 하나는 R9와 함께 C9와 함께 C11사이에 제 2 결합을 형성하고, R11-1및 R11-2중 다른 하나는 -H인
    Figure kpo00068
    1,4-3-케토 스테로이드(II)의 제조방법.
  8. 제 1 항에 있어서, R17이 =CH-CH2-O-CO-(X1)-COO-R21-1인
    Figure kpo00069
    1,4-3-케토 스테로이드(II)의 제조방법.
  9. 제 1 항에 있어서, R17이 α-OH : β-CO-CH2-O-CO-(X1)-COOR21-1인
    Figure kpo00070
    1,4-3-케토 스테로이드(II)의 제조방법.
  10. 제 1 항에 있어서, X1이 -CH=CH-인
    Figure kpo00071
    1,4-3-케토 스테로이드(II)의 제조방법.
  11. 제 1 항에 있어서, X1이 -(CH2)n1-인
    Figure kpo00072
    1,4-3-케토 스테로이드(II)의 제조방법.
  12. 제 11 항에 있어서, n1이 2 내지 4인
    Figure kpo00073
    1,4-3-케토 스테로이드(II)의 제조방법.
  13. 제 11 항에 있어서, n1이 2인
    Figure kpo00074
    1,4-3-케토 스테로이드(II)의 제조방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 양이온이 일가인
    Figure kpo00075
    1,4-3-케토 스테로이드(II)의 제조방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 일가의 양이온이 나트륨, 칼륨, 암모늄 또는 -H+인
    Figure kpo00076
    1,4-3-케토 스테로이드(II)의 제조방법.
  16. 제 1 항에 있어서,
    Figure kpo00077
    4-3-케토 21-헤미에스테르 스테로이드(I)를 하기
    Figure kpo00078
    4-3-케토 스테로이드, 즉,
    17α,21-디하이드록시프레그나-4,9(11)-디엔-3,20-디온,
    11β,21-디하이드록시프레그나-4,17(20)-디엔-3-온,
    11β-17α-21-트리하이드록시-6α-메틸프레그느-4-엔-3,20-디온,
    11α,21-다하이드록시-6α-메틸프레그나-4,17(20)-디엔-3-온,
    11β,17α-21-트리하이드록시프레그느-4--엔-3,20-디온,
    17β,21-디하이드록시-6α-메틸프레그나-4,9(11)-디엔-3,20-디온,
    17α,21-디하이드록시-16α-메틸프레그나-4,9(11)-디엔-3,20-디온,
    6α-플루오로-21-하이드록시프레그나-4,9(11), 16-트라엔-3,20-디온,
    21-하이드록시프레그나-4,9(11), 16-트리엔-3,20-디온 및 17α,21-디하이드록시-16α-메틸프레그나-4,9(11)-디엔-3,20-디온
    의 C21위치에서의 헤미에스테르(-CO-X1-COOR21-1)로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 접촉 반응을 에이. 심플렉스 또는 비. 시클로옥시단스의 세포를 사용하여 수행하는
    Figure kpo00079
    1,4-3-케토 스테로이드(II)의 제조방법.
  18. 제 2 항에 있어서, 에이. 심플렉스 또는 비. 시클로옥시단스와의 접촉반응을 에이. 심플렉스 또는 비. 시클로옥시단스의 건조세포를 사용하여 수행하는
    Figure kpo00080
    1,4-3-케토 스테로이드(II)의 제조방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 건조 세포가 공기건조 또는 가열건조된
    Figure kpo00081
    1,4-3-케토 스테로이드(II)의 제조방법.
  20. 제 1 항에 있어서, 에이. 심플렉스 또는 비. 시클로옥시단스와의 접촉을 수성 보통배지에서 호기성 발효 조건하에 생존가능한 생식 세포들을 사용하여 수행하는
    Figure kpo00082
    1,4-3-케토 스테로이드(II)의 제조방법.
  21. 제 2 항에 있어서, 상기 스테로이드
    Figure kpo00083
    1-데하이드로게나제가 무세포제제 형태인
    Figure kpo00084
    1 D 4-3-케토 스테로이드(II)의 제조방법.
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