DK144422B - Fremgangsmaade til fremstilling af 11beta-hydroxy-pregn-4-en-3,20-dioner - Google Patents

Description

(19) DANMARK (£'?I

føsf.l

^ 12) FREMLÆGGELSESSKRIFT <n> 14*^22 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 3924/77 (51) Int.CI.3 C 07 J 5/00 (22) Indleveringsdag 2. sep. 1977 g gy j 7 / q q (24) Løbedag 1^· feb. 1975 C 07 J 71/00 (41) Aim. tilgængelig 2. sep. 1977 (44) Fremlagt 8. mar. 1982 (86) International ansøgning nr. “ (86) International indleveringsdag -(85) Videreførelsesdag ** (62) Stamansøgning nr. 877/76

(30) Prioritet 18. feb. 1975, 550245, US

(71) Ansøger SYNTEX (U.S.A. ) INC., Palo Alto, US.

(72) Opfinder Pasquale G. Gallegra, US.

(74) Fuldmægtig Firmaet Chas. Hude.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af 11beta-hydroxy-pregn-4-en-5j20-dioner.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af Ιΐβ-hydroxy-pregn-4-en-3,20-dioner af den almene formel

f2R

C = O 1 HO l^r - - -2R

* J· o « t ;

X

t a 2 U4422 4 6 14 6 eller Δ ' - eller Δ ' ' -derivaterne deraf, hvori R betegner H, OH, alkoxy med 1-6 carbonatomer eller alkanoyloxy med 1-6 carbon- atomer, betegner H, OH eller alkanoyloxy med 1-6 carbonatomer, o R betegner H, α-CH.. eller β-CH , x betegner H, F, Cl eller Br, el- 1 2 J J ler R og R sammen betegner -------0 R4 \ /

C

/ \ 5 -------0 R° 4 5 hvori R og R uafhængigt er H eller en hydrocarbongruppe med 1-4 carbonatomer, og de punkterede linier i ringene A og B betegner en fakultativ binding, idet der dog, når X er hydrogen, altid er en dobbeltbinding i 6-stillingen.

Ved fremstillingen af aktive steroide forbindelser til anvendelse f. eks.som antiinflammatoriske lægemidler er det ofte nødvendigt at starte med en lettilgængelig forbindelse, derpå gennemføre et væsentligt antal trin, hvilke trin kan omfatte omsætning af en del af forbindelsen til dannelse af en beskyttelsesgruppe og derefter følgende omsætning af en anden del af forbindelsen som ønsket. Ved denne metode kan det være nødvendigt med et stort antal trin til opnåelse af det ønskede produkt, og i hvert trin er der visse udbyttetab, som, når de opsummeres for alle trinene, kan udgøre et væsentligt og dyrt udbyttetab for den samlede proces. På steroidkemiområdet forskes der derfor konstant for at udvikle mere effektive reaktionssystemer til forøgelse af de samlede udbytter ved at nedsætte det antal trin, som er nødvendigt i et reaktionsforløb, ved at forøge udbyttet for et specielt trin eller begge dele. Det samlede udbytte kan forbedres enten ved at finde frem til en fremgangsmåde, hvor i alt væsentligt hele udgangsmaterialemængden omsættes til dannelse af det ønskede produkt, eller sidereaktionerne undgås i størst muligt omfang.

Et vigtigt trin i mange reaktionssekvenser til dannelse af en 6-halogen-Δ eller -Δ^'4'^-pregnatrien omfatter omdannelsen af en 4 "cortisollignende" forbindelse med en 3-οχο-Δ -gruppe til en enol- 3 5 ether (d.v.s. dannelse af et 3-alkoxy-A ' -mellemprodukt) ved om- 4 sætning af 3-keto-A -steroidet med et lavere alkylorthoformiat i 3 144422 egnet opløsningsmiddel, såsom dioxan, i nærværelse af en sur katalysator, såsom p-toluensulfonsyre. Ved at starte med en lettilgængelig forbindelse, såsom cortisol (hydrocortison, 113,17a,21-trihydroxy-3,20-dioxopregn-4-en), som har en reaktiv hydroxygruppe ved 21 og 11β, har det imidlertid hidtil vist sig, at det er fordelagtigt først at omsætte cortisolet (angivet som I nedenfor) med formaldehyd og methylenchlorid i saltsyre til dannelse af en bis-methylendioxy-(BMD)-forbindelse, angivet som II nedenfor, d.v.s.

x0 — CH-OH w p 2 Vvo---0-v =0 _ ^ ch2 “VtS™ '«γγχ (I) (II)

Se f.eks. U.S.A. patentskrifterne nr. 2.888.456 og 2.888.457.

For at hindre dannelsen af et ^'"-derivat under den efterfølgende reaktion med det lavere alkylorthoformiat i syre ved dehydrering af OH-gruppen ved 113 og H ved 9 oxideres 113-OH først med f.eks. chromsyre i svovlsyre i dimethylformamid (DMF), d.v.s.

^ 0 — H2C-0__0s ✓ch2 (II) —--^ _ (III)

Forbindelse III omsættes derpå med det lavere alkylorthoformiat og syren til dannelse af den ønskede enolether (IV), som derpå kan behandles yderligere på passende måde, d.v.s.

4 \kkkll H_C-° 2 o--o.

CH„ °Y/Nfir (ud -> R0 (iv) hvor R = lavere alkyl.

Det er i beskrivelsen til U.S.A. patent nr. 3.082.224 blevet foreslået at løse dehydreringsproblemet ved omsætning af et cortisol eller en cortisol-21-ether med et lavere alkylorthoformiat i et opløsningsmiddel, som udelukkende består af den tilsvarende lavere alkanol og en sur katalysator. Ved at anvende denne metode påstås det, at dehydrering kan reduceres til mindre end 10%, og at 3-enol-etheren kan opnås i udbytter på 65-90%.

Et andet patentskrift, som diskuterer dannelsen af 3-enolether-mellemproduktet af den ovennævnte type, er U.S.A. patentskrift nr. 3.087.927. I den reaktionsrække var udgangsmaterialet f.eks. 16-hydroxycortisol eller 16-hydroxycortison. Patentskriftet angiver, at disse materialer i nærværelse af en mineralsyre kan omsættes med en orthoester med formlen R3C (or4)3 hvori R3 er H eller lavere alkyl med 1-3 carbonatomer, og R4 er lavere alkyl, såsom methyl og ethyl, til fremstilling af et reaktionsprodukt, såsom ch2oh =° 4

.... O /OR

H0 yNA..o"S*3 Γιι R40'^;:<X^:55^^ (V) 5 144422

Eksemplerne viser specielt, at reaktionen gennemføres i dioxan med en rinqe mængde methanol og svovlsyre med trimethylorthoformiat. Patentskriftet omhandler på ingen måde dehydreringsproblemet, som diskuteres i U.S.A. patentskrift nr. 3.082.224.

4

De kendte trykskrifter foreslår således, at ll-hydroxy-i\ -pregnen- 3-oner omsættes til dannelse af den tilsvarende enolether ved at anvende: (1) trialkylorthoformiat under anvendelse af en størstedel af et opløsningsmiddel, såsom dioxan, og en mindre mængde af den tilsvarende lavere alkanol (d.v.s. trimethylorthoformiat med methanol eller triethylorthoformiat med ethanol), (2) triethylorthoacetat med en størstedel af et opløsningsmiddel, såsom dioxan, med en mindre mængde ethanol eller (3) triethylorthoformiat med ethanol som det eneste opløsningsmiddel .

I hvert af disse tilfælde anvendes en sur katalysator, således at reaktionen kan forløbe med den ønskede hastighed. Det har vist sig, at i det første tilfælde er hovedproduktet Δ.® -dehydreringsproduktet, i det andet tilfælde reagerer reaktanterne ikke, og i det tredje tilfælde er der en vis dehydrering, som finder sted mellem stilling 11 og 9, og reaktionen forløber ikke til ende. I hver af de kendte reaktioner er udbytterne af den ønskede enolether således lave, og i et stort antal trin efter hinanden vil dette udbytte naturligvis følge med og nedskære den samlede produktion af det ønskede slutprodukt.

Det har nu vist sig, at man ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen får følgende fordele: 1) Dehydrering ved 9(11)-stillingen undgås så at sige fuldstændigt, 2) på grund af 1) er det ikke nødvendigt først at oxidere 11-hy-droxygruppen til en oxo-gruppe for at opnå beskyttelse, 6 144422 3) udbyttet af enoletheren forøges (delvis på grund af det under 1) og 2) nævnte og også delvis på grund af, at reaktionsprocessen ifølge opfindelsen har tendens til at forløbe fuldstændigt), 4) billige oxygenerede hydrocarboncoopløsningsmidler, såsom giymer, kan anvendes med ethanol, 5) ved omsætning af steroider med 17a,21-hydroxydele er det ikke nødvendigt at beskytte disse dele via BMD eller andre metoder, og 6) de ovennævnte fem fordele bidrager alle til en simplere proces, end man hidtil har kendt til.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at et 3- 4 keto-d -steroid af den almene formel:

CH_R

I 2 c=o 2

X

1 2 hvori R, R , R og X har de tidligere definerede betydninger, omsættes med mindst ca. 2 mol triethylorthoacetat pr. mol steroid i nærværelse af en katalytisk mængde af en stærk syre i et opløsningsmiddel som i al væsentligt består af ca. 40 vægt% eller mere ethanol og ca. 60 vægt% eller mindre af et forligeligt opløsningsmiddel, der er blandbart med ethanol i det mindste efterfulgt af 4 6 et af følgende trin: indføring af 6a-halogen-,Λ ' - og/eller 4,6_grUpper Qg om ønsket hydrolyse af eventuelle beskyttede estergrupper ved hjælp af i og for sig kendte metoder.

Opløsningsmidlet er fortrinsvis en blanding af lige dele ethanol og glyme, og katalysatoren er en stærk organisk syre, såsom p-toluensulfonsyre eller trifluoreddikesyre. Fremgangsmåden er sær- 7 U4422 lig velegnet til cortisol og cortisol-21-alkylestere, såsom 21-acetat.

Den resulterende 3-enolether halogeneres derpå, chloreres fortrins- 4 vis, til dannelse af den tilsvarende 6S-halogen-a -pregnen-3-on, som igen behandles til dannelse af en 6-halogen-3-enolether, som 4 6 14 6 derefter omdannes til en 6-halogen-A ' -(eller Δ ' ' )-pregnadien (eller -trien)-3-on,som forklaret nærmere i det følgende.

Dannelse af 3-enoletheren

Der skal anvendes triethylorthoacetat som reaktant ved fremgangsmåde ifølge opfindelsen. Der må skelnes mellem triethylorthoacetat i forhold til det analoge triethylorthoformiat. Triethylorthoacetat kan illustreres ved hjælp af følgende formel: ch3c(och2ch3)3, hvorimod triethylorthoformiatet generelt kan karakteriseres ved hjælp af følgende formel: hc(och2ch3)3.

Kemien, såsom fremstillingen og generelle reaktioner for de alifatiske orthoestere, omhandles i en bog med titlen "The Chemistry of Aliphatic Orthoesters", American Chemical Society Monograph af H.W. Post, publiceret af Rienhold. Triethylorthoacetatet kan sædvanligvis fremstilles ved hjælp af en række metoder. De to mest populære af disse er angivet i de følgende ligninger: ch3c-oc2h5 + 2c2h5oh-> nh4ci + ch3c(oc2h5)3 (1) NH-HC1 CH2=C(OC2H5)2 + C2H5OH -> CH3C(OC2H5)3 (2)

Yderligere fremstilling findes på side 40 i det ovennævnte skrift. Fremstillingsmetoder under anvendelse af reaktanterne fra den første af de ovennævnte ligninger findes i en artikel i Journal of the American Chemical Society, 50, 516 (1928) af P. Sah.

Selv om den teoretiske mængde triethylorthoacetat, som er nødven- 4 dig til dannelse af 3-enoletheren ved reaktionen med 3-οχο-δ -steroidet, er 1 mol af orthoacetatet til hvert mol af steroidet, 8 144422 viser det sig på grund af den særlige reaktionstype, at der kræves mindst ca. 2 mol af triethylorthoacetatet pr. mol steroid, for at reaktionen kan forløbe, og der anvendes fortrinsvis mindst ca. 3 mol af orthoacetatet pr. mol steroid. Der vil ikke blive anvendt mere end ca. et 5:1 forhold, da et højere forhold ikke vil resultere i nogen særlig gunstig reaktionshastighed etc.

For at få fremgangsmåden ifølge opfindelsen til at fungere godt er det vigtigt, at det anvendte opløsningsmiddelsystem er et sådant, hvori en væsentlig mængde af opløsningsmidlet er ethanol, d.v.s. over ca. 40%, og fortrinsvis over ca. 50 vægt% af opløsningsmiddelsystemet er ethanol. Der kan anvendes indtil 100% ethanol, selv om det foretrækkes at anvende et coopløsningsmiddel som nævnt nedenfor. Systemet bør også være i alt væsentligt vandfrit. Andre forligelige opløsningsmidler, der kan anvendes i systemet, er opløsningsmidler, som frit kan blandes med ethanol i alle forhold. Disse opløsningsmidler omfatter oxygenerede hydrocarboner, f.eks. alifatiske og cykliske ethere, såsom glycolethere, dioxan, tetrahydro-furan og tetrahydropyran. Særlig velegnet i denne henseende er de dimethylerede polyethylenglycoler, der kan illustreres med formlen: CH 0(CHLCHO) CH, 3 2 ni hvor n er et helt tal fra 1 til 4. Disse forbindelser betegnes generelt som "giymer", d.v.s. glyme (n = 1) , diglyme (n = 2) , triglyme (n = 3) tetraglyme (n = 4). Enhver af disse forbindelser alene eller i kombination kan anvendes som et forligeligt coopløsningsmiddel med ethanol ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. En særlig velegnet blanding er ca. 50 vægt% ethanol plus ca. 50 vægt% glyme.

Det er yderligere nødvendigt, at der indgår en katalytisk mængde af en stærk organisk syre eller svovlsyre som katalysator i forbindelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Egnede organiske sure katalysatorer omfatter p-toluensulfonsyre (PTSA), 2,4-dinitrobenzen-sulfonsyre, trifluoreddikesyre og lignende.

Der vil fortrinsvis blive anvendt PTSA eller trifluoreddikesyre.

En katalytisk mængde af syren er den mængde, som er nødvendig for at få reaktionen til at forløbe med en rimelig hastighed. Denne 9 144422 mængde vil sædvanligvis være ca. 0,1 - ca. 20% af den samlede vægtmængde af steroidet og fortrinsvis være ca. 10 vægt%.

De reaktionsbetingelser, ved hvilke den omhandlede reaktion kan forløbe, er ikke kritiske, men er velkendt i teknikken. Temperaturen kan således variere fra 0 til 100°C, men vil fortrinsvis ligge mellem ca. 20°C og 40°C, da højere temperaturer har tendens til at nedsætte det samlede udbytte på grund af tab, som skyldes nedbrydning. Trykket på reaktionsblandingen kan være atmosfærisk tryk eller under eller over atmosfærisk tryk, men der arbejdes sædvanligvis ved atmosfæriske betingelser. Den tid, som er nødvendig, for at den omhandlede fremgangsmåde kan forløbe i alt væsentligt fuldstændig, afhænger af reaktionstemperaturen, idet reaktionen forløber langsommere ved lavere temperaturer. Det er imidlertid almindeligvis nødvendigt med fra 5 minutter til ca. 3 timer, men ved 20-40°C vil der ikke medgå mere end ca. 1/2 time, for at hele reaktionen kan forløbe.

Reaktionsbeholderen, der kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan enten være en beholder til chargevis reaktion eller en beholder til kontinuerlig reaktion. Beholderen er fortrinsvis en almindelig beholder til chargevis reaktion, hvori de forskellige stoffer, som er nødvendige til gennemførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, anbringes og kommer i kontakt med hinanden, således at reaktionen kan finde sted.

De steroider, hvortil fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes, 4 er ll-hydroxy-Δ -pregnen-3-oner, der kan gennemgå dehydratisering mellem 11- og 9-carbonatomerne i steroidstrukturen og har følgende struktur:

CH2R

c = o HO_r2 i

X

10 144422 hvori R er -OH, H, en alkylethergruppe med 1-6 carbonatomer eller en alkylestergruppe med 1-6 carbonatomer, er -H, -OH eller en 2 alkylestergruppe med 1-6 carbonatomer, R er -H, β-CH, eller a- 12 J CH3, R og R sammen kan være -°x·· ---0 ^R5 4 5 hvori R og R uafhængigt er -H eller en hydrocarbongruppe med 1-4 carbonatomer, og X er F, Cl, Br eller H.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er særlig velegnet til via fremstilling af 3-enolethermellemprodukter at fremstille aktive steroidforbindelser, som udøver antiinflammatorisk, antiandrogenisk, østrogenisk eller anden aktivitet, således som det er beskrevet i U.S.A. patentskrift nr. 3.232.965.

Egnede forbindelser til brug ved fremstillingen af den tilsvarende 3-enolethylether omfatter således følgende: 110, 17a-dihydroxyprogesteron, 110,17a-dihydroxy-160-methylprogesteron, 110,17 α-dihydroxy-l6a-methyIprogesteron, 110,17a-dihydroxy-16a-methylprogesteron-17-acetat, corticosteron (110,21-dihydroxy-3,20-dioxopregn-4-en), corticosteron-21-acetat, cortisol (110,17a,21-trihydroxy-3,20-dioxopregn-4-en), 16a-hydroxycortisol-16,17-acetonid, 16a-hydroxycortisol-16,17-acetonid-21-acetat, cortisol-17a,21-diacetat, 160-methylcortisol, 16a-methylcortisol, 16a-methylcortisol-21-acetat, cortisol-21-methylether, 16a-methylcortisol-21-hexylether, 16a-methylcortisol-21-acetat, 16a-methylcortisol-21-pivalat, 11 144422 cortisol-21-acetat, cortisol-21-propionat, cortisol-21-butyrat, og de tilsvarende 6-halogenderivater af de ovennævnte forbindelser, såsom 6-brom-, 6-fluor- og 6-chlorderivaterne, fortrinsvis chlor-og fluorderivaterne, såsom 6a-chlorcortisol, 6a-fluorcortisol, 6ct-f luor-16a-hydroxycortisol-16,17-acetonid, 6a-chlor-16o-hydroxycortisol-16,17-acetonid, 6a-fluor-16a-methylcortisol, 6a-chlor-16a-methylcortisol, 6a-fluor-16a-methylcortisol-21-acetat, 6a-chlor-16a-methylcortisol-21-acetat.

Det skal bemærkes, at fremgangsmåden til fremstilling af en 3-enol-ether kan anvendes f.eks. til en 3-oxopregn-4-en, som er usubsti-tueret i 6a-stillingen eller halogensubstitueret i 63-stillingen.

Et ββ-halogensubstitueret steroid kan anbringes i opløsningsmidlet ved omtrent omgivelsernes temperatur i nærværelse af den sure katalysator, men uden nærværelse af triethylorthoacetat i et tidsrum, som er tilstrækkeligt til at danne 6a-halogensteroidet (sædvanligvis ca. 10 minutter til 1 time, fortrinsvis ca. 20-40 minutter ved stuetemperatur). Triethylorthoacetatet anbringes derpå i reaktiv kontakt med 6a-halogensteroidet i opløsningsmidlet til dannelse af 3-enoletheren.

Når udgangssteroidstrukturen har en hydroxygruppe i både 21- og 17-stillingerne, kan en resulterende 3-enolether illustreres ved strukturen: [Η2°χ /0C2H5 ^3 T°\ 'ch3 chJ T y—r2

X

12 144422 2 hvori X og R har de tidligere definerede betydninger. Nærværelsen af en sådan struktur er ikke skadelig, da 17,21-orthoesteren hydrolyseres delvis under efterfølgende trin, såsom chlorering eller bro-mering, og kan omdannes fuldstændigt til 17,21-dihydroxyforbindel-sen ved transforestring eller under basiske betingelser.

En sådan reaktion anvender imidlertid yderligere triethylorthoace-tat, og af økonomiske grunde foretrækkes det, at der i 21-stillingen er en alkylester, f.eks. et acetat.

Reaktioner af 3-enolethere

Opfindelsen vedrører også en fremgangsmåde til dannelse af 6-halo- 4 gen-Δ -pregnen-3-onmellemprodukter ved først at danne enoletheren som nævnt ovenfor og derpå halogenere ved 6-stillingen.

Halogenering, d.v.s. bromering og fortrinsvis chlorering, kan gennemføres på i og for sig kendt måde til halogenering i 6-stillingen. Halogeneringsmidler omfatter N-chlorsuccinimid, N-bromsuccinimid, N,N'-dichlorhydantoin og lignende.

Ved gennemførelse af halogeneringstrinet isoleres 3-enoletheren først fra reaktanterne og opløsningsmidlerne fra det første trin, hvorefter halogeneringsmidlet anbringes i reaktiv kontakt med 3-enoletheren i et egnet inaktivt opløsningsmiddel under betingelser, som er egnede til at forårsage dannelse af 6-halogen-Δ -forbindelsen.

Et egnet inaktivt opløsningsmiddel er et opløsningsmiddel, som ikke reagerer med 3-enoletheren eller halogeneringsmidlet på en for reaktionen skadelig måde. Egnede opløsningsmidler omfatter oxygenerede hydrocarboner, såsom tetrahydrofuran, dioxan og diethylether, acetone, eddikesyre eller blandinger deraf. Reaktionen gennemføres fortrinsvis under neutrale betingelser, d.v.s. ved en pH-værdi på ca. 7 og ved temperaturer varierende fra ca. -5°C til ca. 25°C, fortrinsvis ved ca. 0°C.

Halogeneringen kan mere specielt gennemføres ved at omsætte enoletheren med dimethyl-N,Ν'-dichlorhydantoin i en pufret acetoneopløsning ved temperaturer fra -5°C til ca. 5°C i 60 minutter.

Opfindelsen kan desuden indgå i en totalsyntese til fremstilling af 6- 13 144422 4 6 halogen-Δ ' -pregnadien-113,17a,21-triol-3,20-dioner og 6-halogen-14 6 Δ ' ' -pregnatrien-lip,17a,21-triol-3,20-dion, specielt 6-chlorfor-bindelserne, som er omhandlet i U.S.A. patentskrift nr. 3.232.965. Både dienerne og trienerne har antiinflammatorisk virkning med en minimal saltretention. Fremgangsmåden er også nyttig til fremstilling af forbindelser af 16a,17a-acetonid-rækken og andre under anvendelse af de tidligere anførte udgangsforbindelser.

Totalsyntesen kan bredt forklares ved henvisning til reaktionsskemaet og følgende sammendrag.

(1) Det første trin omfatter forestring af udgangssteroidet VIII

1 2 (hvor R og R har de ovenfor definerede betydninger) ved 21-hydroxy-gruppen til dannelse af den tilsvarende 21-alkylester (IX).

(2) 21-alkylesteren (IX) omsættes derpå ifølge den primære fremgangsmåde ifølge opfindelsen med triethylorthoacetat i ethanol og fortrinsvis glyme med en sur katalysator til dannelse af en 3-enol-ether som illustreret ved hjælp af formel X.

(3) 3-enoletheren X halogeneres derpå, d.v.s. chloreres eller brome- 4 res, til dannelse af f.eks. en 6β-ο1ι1θΓ-Δ -pregnen- 3-on-forbindelse med formlen XI.

(4) En forbindelse med formel XI omsættes derpå med triethylorthoacetat i nærværelse af en sur katalysator i ethanol og fortrinsvis glyme til dannelse af en enolether med formlen XII.

1 4 fi (5a) Enoletheren XII behandles derpå til direkte dannelse af δ ' ' -pregnatrienen (XIV) eller 4 6 (5b) enoleteren XII omsættes først til dannelse af Δ ' -pregnadienen XIII.

4 6 (5c) Δ ' -pregnadienen XIII dehydrogeneres på en i teknikken kendt måde i 14 6 1-stillingen til dannelse af den tilsvarende/\ ' ' -pregnatrien XIV.

14 6 (6a) Δ ' ' -pregnatrienen behandles derpå til fjernelse af 21-alkylesteren og dannelse af den tilsvarende 21-hydroxyforbindelse XV, hvor Z er en dobbeltbinding, (6b) XIII kan behandles til dannelse af forbindelsen XV, hvor Z er 14 6 en enkelt binding, hvilken forbindelse kan omdannes til Δ ' ' -pregnatrienen.

14 144422

CH2OH ch2°R

=° HO CH, 0 R1 CH, 1 \ 2 H0V^^JX\T’R 2 _J^R (i) ^Ψ3χ\___ (VIII) (IX)

CH2OR

CH,OR

2 =0

=° CH

CE i HO χ >---R o

(3) CH3 w^R

CH3CH20”^ΛS:^^^ίS^:^^, (XI) Cl (x)

(4) CH2OR CH2OR

=0 , _T =0 CH, -, ^ CH, 1 3 _ _ r! ^ 3L--R H° . o2 ^ch3 _ (5a) ---- CH,CH 0//^>/^γ °/^Ss//^Sl J 2 I (XIV) Cl

Cl (XII) u (6a) (5b) CH OR /

/ (5c) ?H20H

=° ^ =0 __r1 HO æ3,---r1 H0-^^S-K2 2 CH, Z 3 — ΓΎ

O<Λν^ν^ (6b) O

Cl Cl (XIII) (XV) 15 144422

En diskussion af hvert af syntesens trin findes i det følgende: (1) I det første trin forestres en forbindelse med formlen VIII, fortrinsvis cortisol, til dannelse af en 21-lavere-alkylester med ca. 2-4 carbonatomer i esterdelen. Dette kan ske ved hjælp af en hvilken som helst i teknikken kendt egnet metode til forestring i 21-stillingen. Dette sker sædvanligvis ved reaktion af et lavere alkylanhydrid i et egnet opløsningsmiddel, f.eks. reaktionen af cortisol med eddikesyreanhydrid i pyridin ved temperaturer på under 30°C. Reaktionen er ren og fuldstændig og danner en forbindelse med formlen IX, som fortrinsvis er cortisol-21-acetat. Prodionsyre-anhydrid eller smørsyreanhydrid kan anvendes i stedet for eddikesyreanhydrid.

(2) I det andet trin isoleres den resulterende 21-ester fra trin 1 først, hvorefter den omsættes med triethylorthoacetat ifølge det primære træk ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som nævnt ovenfor, til dannelse af den tilsvarende 3-enolethylether, der kan illustreres ved hjælp af formel X. Forbindelsen med formlen X vil fortrinsvis være 3-enoletheren af cortisol-21-acetat.

Selv om det foretrækkes først at reagere en forbindelse med en struktur som vist i formel VIII, f.eks. cortisol med eddikesyreanhydrid, til dannelse af det tilsvarende 21-acetat, kan forbindelsen med formlen VIII omsættes med triethylorthoacetat i begyndelsen, uden at det er nødvendigt at gå via den mellemliggende dannelse af 21-acetatet. Ved reaktion af en forbindelse med formel VIII med triethylorthoacetat dannes en ringe mængde, d.v.s. 10-15% af et 17,21-orthoestermellemprodukt sammen med enoletheren med formlen X, hvor R er hydrogen. Nærværelsen af 17,21-orthoesteren er ikke skadelig for den totale reaktion, da den hydrolyseres ved det efterfølgende chloreringstrin under sure betingelser. På grund af at dannelsen af 17,21-orthoesteren giver reaktion med yderligere triethylorthoacetat, og på grund af at reaktionen af en forbindelse, såsom cortisol med eddikesyreanhydrid i pyridin, er så ren, og dannelsen af den tilsvarende 3-enolethylether er fuldstændig og hurtig i trin 2, foretrækkes det imidlertid først at danne 21-esteren før reaktion med triethylorthoacetatet. Denne foretrukne vej er således vist i reaktionsskemaet.

16 144422 (3) Efter isolering af 3-enoletheren (X) halogeneres denne til dannelse af en 6-halogenforbindelse som vist ved hjælp af formel XI. Halogeneringstrinet er enten et chlorerings- eller bromeringstrin som beskrevet ovenfor.

(4) Forbindelsen med formlen (XI) er en δβ-halogensubstitueret forbindelse. Før denne kan reagere med triethylorthoacetat og effektivt danne en 3-enolether, som vist i formel XII, skal halogenet omdannes til et 6a-halogen. Dette sker ved at anbringe den ββ-sub-stituerede forbindelse (XI) i et inaktivt opløsningsmiddel ved omtrent omgivelsernes temperatur (20-25°C) og tilsætte en ringe mængde af en sur katalysator og holde temperaturen i 1 time eller mindre, fortrinsvis 30 minutter eller mindre. Dette gennemføres fortrinsvis i et opløsningsmiddel, såsom glyme, i nærværelse af 1 vægt% eller mindre af en stærk organisk sur katalysator, såsom trifluor-eddikesyre eller p-toluensulfonsyre. Omdannelsen af Sot-halogenforbindelsen er forløbet fuldstændigt i løbet af mindre end 1 time, sædvanligvis i løbet af mindre end 1/2 time. Derefter sættes ethanol og triethylorthoacetat til reaktionsblandingen, og der tillades reaktion ifølge det primære træk ved opfindelsen for at danne 3-enoletheren som vist i formel XII.

Efter isolering kan mellemproduktet XII derpå omdannes til det ønskede slutprodukt på forskellige måder.

(5a) Forbindelsen med formlen XII kan omsættes til direkte dannelse 14 6 afA ' ' -pregnatrienen med formlen XIV. Ved en ettrinsmetode kan forbindelsen med formlen XII f.eks. omsættes med 2,3-dichlor-4,5- dicyanbenzoquinon (DDQ) og et i alt væsentligt vandfrit egnet oxyge- neret hydrocarbonopløsningsmiddel, såsom dioxan, ved stuetempera- 14 6 tur til dannelse af A ' ' -pregnatrien-21-esteren med formlen XVI, som derpå kan hydrolyseres under basiske betingelser eller transforestres til dannelse af 21-hydroxysteroidet med formlen XV, hvor Z er en dobbeltbinding.

(5b) På grund af højere udbytter anvendes fortrinsvis en totrinsmetode, hvor en forbindelse med formlen XIII først dannes og derpå dehydrogeneres i 1-stillingen til dannelse af en forbindelse med 17 144422 formlen XIV. Hver af forbindelserne XIII og XIV kan derpå hydrolyseres til dannelse af en forbindelse med formlen XV, hvori Z kan være enten en enkelt- eller dobbeltbinding. Forbindelsen med formlen XIII fremstilles først ved at omsætte en forbindelse med formlen XII med et egnet oxidationsmiddel (en tetrasubstitueret 1,4-benzoquinon) ved lave temperaturer (d.v.s. ca. 0-10°C) i et vådt oxygeneret opløsningsmiddel, såsom dioxan eller acetone med 25 volumen% vand eller mindre. Et særlig velegnet oxidationsmiddel er 2,3-dichlor-5,6-dicyanbenzoquinon (DDQ). Denne reaktion vil sædvanligvis være forløbet i løbet af 2 timer eller mindre.

(5c) 4,6-pregnadienen, der er illustreret ved hjælp af formlen XIII, isoleres og dehydrogeneres derpå i 1-stillingen til dannelse af forbindelsen med formlen XIV. Dehydrogeneringen kan ske ad kemisk eller mikrobiologisk vej på i og for sig kendt måde. 4,6-pregnadienen med formlen XIII isoleres først, før den dehydrogeneres i overensstemmelse med det næste trin. Ved den selektive kemiske dehydrogenering i 1-stillingen omsættes forbindelse XIII med et egnet oxidationsmiddel under i alt væsentligt vandfrie betingelser i et egnet opløsningsmiddel, såsom en oxygeneret hydrocarbon, f.eks. i alkohol, dioxan eller acetone, ved temperaturer over stuetemperatur op til tilbagesvalingstemperaturer. Et egnet oxidationsmiddel er DDQ, medens egnede opløsningsmidler omfatter xylen, toluen, amylalkohol, dioxan eller acetone. Materialet tilbagesvales fortrinsvis i opløsningsmidlet i et tidsrum, som er tilstrækkeligt til at få dehydrogeneringen til at finde sted. Dette vil sædvanligvis være fra 1 time til ca. 20 timer med chloranil i amylalkohol eller ca. 12-16 timer i xylen. Med DDQ i vandfri acetone er det kun nødvendigt med 4 timer ved tilbagesvalingstemperaturer.

Den kemiske dehydrogenering i A^-stillingen vil imidlertid fortrinsvis ske ved hjælp af bromering i 2-stillingen og dehydrobromering mellem 1 og 2 til dannelse af dobbeltbindingen. Bromering sker ved 4 6 omsætning af et egnet bromeringsmiddel med Δ ' -pregnadienen i et egnet opløsningsmiddel i et tidsrum, som er tilstrækkeligt til, at reaktionen forløber fuldstændigt. Egnede bromeringsmidler omfatter brom i kombination med hydrogenbromid og kan anvendes i eddikesyre ved stuetemperatur til en reaktion på ca. 10 minutter, hvilket giver et reaktionsprodukt på ca. 85% eller mere.

18 U4A22

Et særligtværdifuldt bromeringsmiddel til 2-bromeringen er pyridi-niumhydrobromidperbromid eller trimethylphenylammoniumtribromid i tetrahydrofuran, når der arbejdes ved temperaturer på 30°C eller mindre, fortrinsvis ca. 20-25°C.

Det resulterende 2-bromerede produkt dehydrobromeres derpå ved reaktion af 2-bromproduktet med et dehydrobromeringsmiddel. Typiske de-hydrobromeringsreaktioner findes på siderne 213-218 i Steroid Reactions, An Outline For Organic Chemists af Carl Djerassi, Holden-Day, 1963. Alle vedkommende reaktioner herfra er inkorporeret heri ved denne henvisning. En særligt foretrukket fremgangsmåde omfatter 4 6 tilbagesvaling af 2-brom-A ' -pregnadienen med lithiumcarbonat og lithiumbromid i DMF i fem timer eller mindre, fortrinsvis under tre timer ved temperaturer på ca. 100-110°C.

(5d) Forbindelsen med. formlen XIII kan alternativt dehydrogeneres ad mikrobiologisk vej, d.v.s. forbindelsen behandles ved hjælp af en fermentationsproces, som kan anvende enten (i) mikroorganismer under vækst, såsom arthobaktersimplex eller (ii) cellefri enzympræparat eller lavere alkanol- eller alkanon-tørrede celler i nærværelse af en hydrogenacceptor. Da mikroorganismer og enzympræparater også har nogen esteraseaktivitet, foretrækkes det imidlertid først at danne 21-hydroxyforbindelsen ved hydrolyse eller transforestring 14 6 og derpå behandle forbindelsen til dannelse af Δ ' ' -forbindelsen.

Repræsentativ for fremgangsmåden, som anvender en mikroorganisme under dyrkning, er den i U.S.A. patentskrift nr. 2.837.464 beskrevne 4 fremgangsmåde, som omfatter, at en Δ -3-ketopregnen udsættes for påvirkning af en kultur, som indgår i en gruppe, der består af co-rynebakterium simplex (også benævnt som arthobacter simplex) og corynebacterium hoatii. De i ovennævnte patentskrift relevante informationer er inkorporeret heri ved denne henvisning. Indføringen af en & ^"-dobbeltbinding forløber sædvanligvis tilfredsstillende ved en pH-værdi på 7,6 til ca. 8 ved en temperatur fra 32°C til ca. 37°C.

Repræsentativ for det cellefri enzympræparat i nærværelse af hydro-genacceptorer er den i U.S.A. patentskrift nr. 3.047.469 beskrevne fremgangsmåde. Ved denne fremgangsmåde underkastes et steroid, som 19 144422 er mættet i 1,2-stillingen, indvirkning af en blanding af en ring A dehydrogenaseekstrakt af en mikroorganisme, såsom corynbacterium, idet ekstrakten er i alt væsentligt fri for levende celler.

Andre organismer, der kan ekstraheres, omfatter nocardia, corynbacterium, mycobacterium, cylindrocarpon og bacterium. Hydrogenbærerne, der kan anvendes sammen med den cellefri ekstrakt i overensstemmelse med denne opfindelse, omfatter oxidations-reduktionsmidler, f.eks. farvestoffer, såsom kaliumferrocyanid, thiaziner og iminderivater, f.eks. methylenblåt, phenazinmethosulfat og lignende, benzoquinoner og iminderivater, f.eks. orthoquinon, toluylenblåchlorid, naphtho-quinoner, såsom cresylblåt og lignende, og indophenoler, specielt 2,6-dichlorindophenol.

I den cellefri ekstraktproces kan ekstrakten blandes direkte med steroidudgangsmaterialet og hydrogenbæreren derpå sættes til blandingen, eller den kan først blandes med hydrogenbæreren og derpå anbringes i kontakt med steroidet. Koncentrationen af hydrogenbæreren er ikke kritisk, og der kan anvendes en hvilken som helst mængde fra en katalytisk mængde til en støkiometrisk mængde svarende til steroidkoncentrationen. pH-værdien og temperaturen, som eksisterer under dehydrogeneringen, er ikke kritisk. Temperaturerne kan variere fra ca. 20°C til ca. 45°C, idet den optimale temperatur er omkring 25°C til ca. 35°C. pH-værdien kan være sur, alkalisk eller neutral og ligger fortrinsvis i intervallet fra 6,0 til 8,0. Hvis det ønskes at holde pH-værdien på en bestemt værdi, kan der i reaktionsblandingen inkorporeres et puffermateriale, såsom et uorganisk phosphat, f.eks. natriumphosphat. Reaktionsblandingen får lov til at henstå i et tilstrækkeligt tidsrum, indtil ring-A-dehydrogene-ringen er forløbet fuldstændigt, hvilket normalt sker i løbet af en periode på 1 til 20 timer.

En særlig effektiv dehydrogeneringsproces er beskrevet i U.S.A.

4 6 patentskrift serie nr. 550.244, hvori en Δ ' -forbindelse, såsom XV, hvor Z er en enkelt binding, dehydrogeneres selektivt under anvendelse af arthobacter simplex (også benævnt som corynebacterium simplex) i nærværelse af en hydrogenacceptor, såsom quinoner eller quinonderivater. Det relevante indhold fra U.S.A. patentskrift serie nr. 550.244 indleveret 18. februar 1975 er medtaget heri ved denne henvisning. Denne fremgangsmåde er særlig værdifuld til frem- 14 6 stillingen af 6-chlor-^ ' ' -pregnatrien-ll(3,17a , 21-triol-3,20-dion 20 U4422 4 6 ud fra den tilsvarende Δ ' -pregnadien. En foretrukket stamme af arthobactersimplex, NRRL nr. V-8055 er offentligt tilgængelig og kan fås fra northern regional research laboratory, 1815 North University Street, Peoria, Illinois.

Hydrogenacceptorer, som er nyttige ved fremgangsmåden ifølge denne opfindelse, er valgt blandt quinonforbindelser og derivater og omfatter benzoquinon, såsom tetramethyl-p-benzoquinon og 2-isopropyl-5-methyl-p-benzoquinon, naphthoquinoner, såsom menadion og 2-hy-droxy-l,4-naphthoquinon, indophenoler, såsom 2,6-dichlorindophenol og menadionnatriumbisulfit. Det er fordelagtigt at holde pH-vær-dien inden for intervallet ca. 7,5 til ca. 8,5 under Δ^-dehydroge-neringen, medens temperaturen er ca. 23 til ca. 33°C, fortrinsvis ca. 28°C. Når der er opnået et egnet vækstmedium, sættes en substratmængde til dette medium på op til 0,7 g pr. liter medium, men den foretrukne substratkoncentration er 0,5 g pr. liter medium. Hydrogenacceptormængden kan variere inden for et stort interval, d.v.s. det molære forhold af substrat til hydrogenacceptor kan variere fra 30:1 til 10:1. Når menadionnatriumbisulfit anvendes som hydrogenacceptor , er det foretrukne forhold af substrat til acceptor 15:1.

Steroidet kan sættes til mediet som en suspension i et egnet opløsningsmiddel, såsom vand, som en opløsning i et opløsningsmiddel, såsom ethanol, acetone eller dimethylformamid, eller i findelt form, såsom faste mikrofindelte partikler. Hydrogenacceptoren sættes til mediet som en opløsning i opløsningsmidlet, såsom ethanol eller dimethylformamid eller i tilfældet med menadionnatriumbisulfit som en vandig opløsning.

Efter tilsætningen af substrat og hydrogenacceptor fortsættes omrøring og luftbehandling af mediet i en periode på 3 til 7 timer, indtil dehydrogeneringen er fuldstændig. I løbet af fermentations-reaktionen kan dehydrogeneringens forløb følges ved hjælp af sili-cagel, tyndtlagskromatografi af opløsningsmiddelekstraherede prøver .

14 6

Efter endt dehydrogenering fjernes produktet 6-chlor-A ' ' -pregna-trien-113,17a,21-triol-3,20-dion fra fermentationsmediet ved ekstraktion med et egnet opløsningsmiddel, såsom chloroform, methylenchlo- 21 U4422 rid, methylisobutylketon og lignende. Opløsningsmiddelopløsningen inddampes til opnåelse af et halvkrystallinsk produkt, der renses ved hjælp af silicagel:kromatografi. Produktet renses yderligere ved omkrystallisation fra et egnet opløsningsmiddel, såsom isopropyl-acetat, ethylacetat, en blanding af acetone og vand og lignende.

De følgende eksempler har til hensigt at illustrere fremgangsmåden ifølge opfindelsen såvel som at karakterisere fremgangsmåden ifølge opfindelsen i forhold til allerede kendte fremgangsmåder.

Eksempel 1 20 g cortisol-21-acetat blev sat til 100 ml absolut ethanol og 100 ml ethylenglycoldimethylether (glyme). Opløsningen blev opvarmet til 40°C, og 2 g p-toluensulfonsyre (PTSA) efterfulgt af 24 g tri-ethylorthoacetat blev tilsat. Reaktionsblandingen blev omrørt ved 40°C, indtil en opløsning er dannet. Reaktionsblandingen omrøres ved 40°C i yderligere 20 minutter, afkøles til stuetemperatur, og 2 ml pyridin tilsættes. Reaktionsblandingen druknes langsomt i en blanding af 520 ml vand og 52 ml hexan. Efter 30 minutter ved 0-5°C blev produktet filtreret og vasket med vand, derpå med 50 ml hexan, og produktet blev tørret i vakuum ved 40°C. Udbyttet var 90-140 w/w%. Dette er et eksempel på fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som viser, at udbytterne er i alt væsentligt kvantitative for denne specielle proces.

Eksempel 2

Dette eksempel gennemføres for at vise forskellen i udbytte og produkt mellem fremgangsmåden ifølge opfindelsen og en kendt fremgangsmåde. I dette specielle eksempel sættes 10 g cortisol-21-acetat til 100 ml absolut ethanol, 10 ml triethylorthoformiat og 0,300 g 2,4-dinitrobenzensulfonsyre. Blandingen omrøres ved stuetemperatur, indtil der er sket opløsning. Reaktionsblandingen omrøres i yderligere 15 minutter, og 1 ml pyridin tilsættes. Opløsningen koncentreres til halvt volumen, og 10 ml vand tilsættes. Koncentreringen fortsættes, indtil der optræder krystallisation. Ca. 100 ml vand tilsættes, og produktet filtreres, vaskes omhyggeligt med vand og 22 m*22 tørres til fremstilling af den tilsvarende 3-enolether. I dette specielle tilfælde viste der sig at være en vis mængde dehydrerings-produkt, som slet ikke fandtes i eksempel 1, og der var ca. 10S uomsat materiale tilbage ved denne fremgangsmåde såvel som en ringe mængde af andre uønskede produkter i sammenligning med eksempel 1, hvor der var væsentligt mindre uomsat materiale tilbage ifølge tyndtlagskromatografisk (TLC) bestemmelse.

Eksempel 3

Dette eksempel viser, at det er nødvendigt, at triethylorthoacetatet er til stede, for at fremgangsmåden ifølge opfindelsen virker. I dette eksempel blev der anvendt nøjagtig samme metode og mængder som i eksempel 1, bortset fra at triethylorthoformiat blev anvendt i stedet for triethylorthoacetat. Analyse af slutprodukterne ved hjælp af tyndtlagskromatografi (TLC) viste, at der stadig var en ringe mængde udgangsmateriale, men at der var en væsentlig mængde mellemprodukter og ca. 10-15% af -dehydreringsproduktet.

Eksempel 4 I dette eksempel sættes 20 g cortisol til 100 ml absolut ethanol og 100 ml ethylenglycoldimethylether som i eksempel 1. Den resterende del af fremgangsmåden som angivet i eksempel 1 blev anvendt i dette eksempel, bortset fra at 0,3 g 2,4-dinitrobenzensulfonsyre og 10 g triethylorthoacetat blev anvendt. Resultaterne viste en i alt væsentligt fuldstændig reaktion, idet der blev dannet ca. 15% af en 17,21-orthoester af 3-enoletheren. Nærværelsen af dette produkt er ikke skadelig i forbindelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen, da produktet kan omsættes yderligere, og ved reaktionsrækkens afslutning kan 17,21-orthoesteren let hydrolyseres til dannelse af det tilsvarende 11β,17α,21-trihydroxysteroid som ønslet.

Eksempel 5

Den samme fremgangsmåde som i eksempel 3 blev anvendt, bortset fra at der ikke blev anvendt noget ethylenglycoldimethylether. Efter reaktionsrækkens afslutning var der stadig en væsentlig mængde, d.v.s. ca. 10% af det oprindelige udgangsmateriale, som ikke var 23 U4422 omsat. Dette påpeger igen nødvendigheden af, at der indgår tri-ethylorthoacetat, for at fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan forløbe fuldstændigt.

Eksempel 6

Dette eksempel viser, at fremgangsmåden ifølge U.S.A. patentskrift nr. 3.087.927 ikke giver det ønskede produkt.

For yderligere at vise betydningen af nærværelsen af triethylortho-acetat og også betydningen af, at en størstedel af opløsningsmidlet er ethanol, suspenderes i dette eksempel 30 g cortisol-21-acetat i en opløsning fremstillet af 300 ml dioxan, 30,0 ml trimethylortho-formiat og 1,20 ml absolut methanol. Til den hurtigt omrørte suspension tildryppes 0,60 ml koncentreret svovlsyre. Suspensionen bliver stadigt tyndere i løbet af de første få minutter, og opløsningen er fuldstændig i løbet af 6 minutter. 1,80 ml pyridin tilsættes, hvorefter straks en svag lyserød farve fjernes, og den resulterende opløsning har lysegul farve. Indtil dette tidspunkt gennemføres hele processen ved stuetemperatur. Den afkølede reaktionsopløsning anbringes i en skilletragt, hvis stilk er neddyppet under overfladen på en blanding af 300 ml vand og is indeholdt i et stort bægerglas.

Reaktionsblandingen tilsættes langsomt i løbet af 2-3 timer til blandingen af is og vand, som holdes i kraftig bevægelse. Det dannede faste stof får lov til at henstå i opløsningen ved 5°C natten over og frafiltreres derpå. Produktet vaskes omhyggeligt med vand og lufttørres, og herved fås 28,7 g produkt. Tyndtlagskromatogra-fisk analyse af produktet viser, at hele produktet er A^-21-acetatet.

Eksempel 7 I dette eksempel følges fremgangsmåden fra eksempel 6, bortset fra at absolut ethanol anvendes i stedet for methanol, og triethylortho-acetat anvendes i stedet for trimethylorthoformiat. Ved at følge fremgangsmåden fra eksempel 6 viste det sig, at der så at sige ikke var nogen reaktion. Dette viser betydningen af at anvende en størstedel ethanol, og at den fra U.S.A. patentskrift nr. 3.086.927 24 144422 kendte teknik ikke virker.

Det fremgår således at de ovenfor anførte eksempler og angivelserne i tabel I, at fremgangsmåden ifølge nærværende opfindelse, hvori steroidet omsættes med triethylorthoacetatet i et opløsningsmiddel, som omfatter en størstedel ethanol og en mindre mængde af et oxyge-neret hydrocarbonopløsningsmiddel, såsom glyme, giver resultater, som er bedre end og uforudsigelige på baggrund af den kendte teknik.

Tabel I

vv 4- TEOA TECF EtOH GLyME H CAT Resultater I (opfindelse) X - X XX Rxn fuldstændigt II (kendt teknik) X X X Rxn ufuldstændig III (kendt teknik) - X X X X Rxn ufuldstændig; Δ11 (9) ringsprodukt IV (opfindelse) X XXX Rxn fuldstændig; noget 17,21-ortho-ester (ikke skadelig) V (kendt teknik) - X X X Rxn ufuldstændig VI 1 (kendt teknik - M)F Mindre Dioxan X Udelukkende 3.087.927) mængde dehydreringsprodukt

MeOH

VII (kendt teknik X Mindre Dioxan X Intet Rxn 3.087.927) mængde TMOF = trimethylorthoformiat; mindre end 1% methanol (MeOH); dioxan anvendt som hovedopløsningsmiddel.

vv TEOA - triethylorthoacetat TEOF - triethylorthoformiat EtOH - ethanol H+cat - sur katalysator - varierer, se hvert eksempel

Rxn - reaktion "X" - materiale indgår - materiale indgår ikke =#Cortisol anvendt som udgangsmateriale.

25 1«* 22

Eksempel 8 Følgende reaktionsrækker udgør en særlig effektiv fremgangsmåde til 14 6 fremstilling af 6-chlor-A ' ' -pregnatrien-113,17a,21-triol-3,20-dion ud fra cortisol.

Reaktionsbetingelserne er repræsentative som de, som er velegnet til anvendelse i både snævre og brede træk i forbindelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen og har vist sig at være at foretrække. De repræsentative reaktionsbetingelser, som er angivet i dette eksempel, må, selv om de foretrækkes, imidlertid ikke blive udlagt i begrænsende betydning.

Dannelse af cortisol-21-acetat Reaktion: ch2oh ch2qac CH =0 1=0 ho -oh fri

Metode;

En 1 liter kolbe forsynes med 400 ml pyridin, og 100 g (0,276 mol) hydrocortison (cortisol) tilsættes, indtil cortisolet går delvis i opløsning. Medens temperaturen i en periode på 10 minutter holdes under 30°C, tilsættes 163,3 g (1,59 mol) eddikesyreanhydrid. Blandingen henstår i 1 time ved stuetemperatur, indtil reaktionen er forløbet fuldstændigt. 300 ml vand sættes langsomt til reaktionsblandingen, medens temperaturen holdes under 40°C. Reaktionsblandingen henstår i 20 minutter og overføres til en 3 liter kolbe. I løbet af 20 minutter tilsættes 1500 ml mættet vandig natriumchlorid-opløsning. Blandingen afkøles til 10°C, henstår i 1 time og filtreres. Produktet vaskes med vand og tørres ved 50-60°C i en vakuum- 26 144422 ovn. Udbytte: 110,4 g (110,4 w/w; 99,2% af det teoretiske udbytte) .

Reaktion med triethylorthoacetat til fremstillingen af 3-enol-etheren og efterfølgende 6β-οΙι1θΓ6Γΐηυ

Reaktioner: :h2OAc CHjOAc

=0 =0 ~0H H0 "0H

-1 r Y gh3c(oc2h5)3 r t j F * i 0 LT2H5° _j CH20Ac =0

0H

Cl

Metode:

En 2 liter kolbe forsynes med 550 ml ethanol, 330 ml 1,2-dimethoxy-ethan (glyme) og 110,4 g (0,272 mol) cortisol-21-acetat. Blandingen opvarmes til 40-42°C, og en opløsning af 9 g p-toluensulfonsyre i 200 ml 1,2-dimethoxyethan efterfulgt af 116 g triethylorthoacetat tilsættes. Temperaturen holdes på 38-42°C. Efter 20 minutters forløb tilsættes 2,5 g p-toluensulfonsyre. Blandingen henstår ved 38-42°C i 30 minutter, afkøles derpå til 8-10°C, og 12 ml pyridin tilsættes efterfulgt af en opløsning af 2,7 g natriumacetat i 50 ml vand. Den lysegule opløsning sættes til en blanding af 14 g natriumacetat i 2450 ml vand og 288 ml hexan, afkøles derpå til 10°C, 27 144422 henstår i 20 minutter, filtreres og vaskes med 800 ml vand indeholdende 1 g natriumacetat, efterfulgt af 220 ml hexan.

Den våde kage (ca. 200 g) sættes til en kold (10°C) blanding af 13,7 g natriumacetat i 184 ml vand og 440 ml acetone og afkøles til 0-5°C. En opløsning af 27 g Halan (et indregistreret varemærke for l,2-dichlor-5,5-dimethylhydantoin) i 120 ml acetone tilsættes, medens temperaturen holdes under 5°C. Blandingen henstår i 45 minutter ved 0-5°C, derpå tilsættes en opløsning af 9,2 g natriumbisulfit i 132 ml vand, og blandingen hældes i løbet af 30 minutter langsomt i 2200 ml vand og afkøles til 0-5°C, henstår i 1 time, filtreres og tørres ved 45-50°C i en vakuumovn. Udbytte: 107,2 g (97,1 w/w; 89,5% af det teoretiske udbytte).

Reaktion med triethylorthoacetat til fremstilling af en 3-enolether 4 6 og efterfølgende Δ. ' -dannelse Reaktion: CH20AC CH2OAc

=0 =0 H0 0H H0 0H

^ ^CH C(OC2H ) I

it *

0 T C2H5° T

Cl L Cl _ CH20Ac =0

H°Y^NUk-0H

DDQ 1 J_I

Dioxan

Cl 28 144422

Metode:

En 2 liter kolbe forsynes med 104 g (0,237 mol) 6β-ο1ι1θΓ-11β,17α,21-trihydroxypregn-4-en-3,20-dion-21-acetat (fra det foregående trin), 500 ml 1,2-dimethoxyethan og 3,03 g p-toluensulfonsyre og henstår i 30 minutter ved 20-25°C. 500 ml ethanol tilsættes efterfulgt af 91,4 g (0.563 mol) triethylorthoacetat. Reaktionsblandingen bliver mørkerød og henstår ved 20-25°C i 40 minutter og afkøles derpå til 15°C, hvorefter der tilsættes en opløsning af 13 g natriumacetat i 640 ml vand. Temperaturen holdes under 20°C, og 220 ml methylen-chlorid tilsættes, hvorefter der langsomt tilsættes 1000 ml vand, idet temperaturen holdes under 25°C. Blandingen omrøres i 15 minutter, og det underste organiske lag skilles fra. Det øverste vandige lag ekstraheres med tre 75 ml portioner methylenchlorid. De organiske fraktioner forenes og vaskes med en opløsning af 1,3 g natriumacetat i 260 ml vand. Methylenchloridekstrakten (ca. 900 ml i alt) skilles fra og koncentreres under vakuum til ca. 400 ml, og under omrøring tilsættes en blanding af 850 ml dioxan og 1,3 ml py-ridin, idet volumenet holdes på ca. 400-450 ml. Blandingen destilleres til et slutvolumen på 400 ml (der bør ikke indgå methylenchlorid på dette tidspunkt), og 300 ml dioxan tilsættes. Blandingen afkøles til 10°C, og 65 ml vand tilsættes og afkøles derpå til 0-5°C.

Eksempel 9

Fremgangsmåden fra eksempel 8 følges for at fremstille 6-chlor-113,17a,21-trihydroxypregna-4,6-dien-3,20-dion-21-acetat, som transforestres til den tilsvarende 21-hydroxyforbindelse ved omsætning med vandig methanol i nærværelse af en ringe mængde kaliumcarbonat.

Eksempel 10

Dette eksempel viser en fremgangsmåde til Δ^-dannelse under anvendelse af mikrobiologiske metoder (d.v.s. dyrkning af celler med en hydrogenacceptor).

A. Fermentation

En kultur af Arthobacter simplex NRRLB-8055 dyrkes i 6 dage ved 29 UU22 28°C på skråagar med følgende sammensætning (A): Næringsagar (Difco) 20 g Glucose 10 g Gærekstrakt (Difco) 10 g Destilleret vand 1 liter

Et øjefuld af overfladevæksten af skråkulturen anvendes til at in-okulere hver af to 300 ml nephlo-kulturkolber (Bellco Inc.), hver indeholdende 50 ml af det følgende sterile næringsmedium (B):

Majsstøbevæske 5 g Gærekstrakt (Difco) 1 g

Cerelose (prakt.

glucosemonohydrat) 0,5 g

Destilleret vand, 1 liter pH-værdi 7

Kolberne inkuberes ved 28°C på et roterende rysteapparat ved 280 omdrejninger pr. minut under anvendelse af et strøg på 2,54 cm. In-kuberingen er forløbet i løbet af 24 timer,eller når kulturuklarheden når 165-180 Klett enheder målt på et Klett-Summerson fotoelektrisk kolorimeterudstyr med et nr. 66 filter og nul-indstillet med sterilt medium. Derefter anvendes hele indholdet af begge flasker til at inokulere 900 ml frisk sterilseret medium B indholdt i en 2 liter glasgæringsbeholder. Inkubering af gæringsbeholderen fortsættes ved 28°C, medens luftbehandlingen holdes på 1 1/2 volumen luft pr. volumen medium pr. minut, og emrøringen holdes på 300 emdrejninger pr. minut. Efter 24 timers forløb sættes 500 mg 6-chlor-113,17a,21-trihydroxypregna-4,6-dien-3,20-dion (fremstillet som vist i eksanpleme 8 og 9) til fermentationen som en ethanolisk opløsning (25 mg/0,4 ml ethanol). Samtidig sættes også 26,4 mg menadionnatriumbisulfit til fermentationen som en filtreret, steriliseret vandig opløsning (26,4 mg/10 ml). Inkuberingen fortsættes som før. Reaktionen er forløbet fuldstændigt på 3-5 timer.

B. Isolering og karakterisering.

Gæringsgrøden ekstraheres tre gange med 500 ml portioner af chloroform. De forenede chloroformekstrakter tørres over vandfri natrium- 30 \kkkll sulfat og koncentreres til tørhed under vakuum. Den resulterende halvkrystallinske rest renses ved kromatografi over silicagel. Produktet elueres med blandinger af chloroform og acetone. Fraktionerne, som indeholder det Ønskede produkt, forenes og inddampes til tørhed, hvilket giver 475 mg (et udbytte på 95% af det teoretiske udbytte) af 6-chlor-A^'4'®-pregnatrien-ll|3,17a,21-triol-3,20-dion, som derpå krystalliseres fra isopropylacetat.

Ved at anvende menadion og tetramethyl-p-benzoquinon i stedet for menadionnatriumbisulfit fås på tilsvarende måde en lignende omdan- 4 6 nelse af 6-chlor-Å ' -pregnadien-ΙΙβ,17a,21-triol-3,20-dion til 6-chlor-v\,^' 4' ^-pregnatrien-ΙΙβ ,17a, 21-triol-3,20-dion.

Eksempel 11

Et inokulum af Arthobacter simplex fremstilles som i eksempel 10.

5 ml af 24 timers podekulturen anvendes derpå til at pode fire 250 ml Erlenmeyer-kolber hver indeholdende 50 ml medium B (eksempel 1).

Kolberne inkuberes ved 28°C på et roterende rysteapparat ved 280 omdrejninger pr. minut under anvendelse af et strøg på 2,54 cm.

4 6

Efter 24 timers forløb sættes 25 mg 6-chlor-^ ' -pregnadien-ΙΙβ, 17a,21-triol-3,20-dion (fremstillet i eksemplerne 8 og 9) opløst i 0,4 ml ethanol til hver kolbe. Samtidig får én kolbe 0,78 mg 2-isopropyl-5-methyl-p-benzoquinon i 0,2 ml ethanol. En anden kolbe får 0,83 mg 2-hydroxy-l,4-naphthoquinon, og en tredje flaske får 1,2 mg af natriumsaltet af 2,6-dichlorindophenol opløst i 0,5 ml vand. En hydrogenacceptor sættes ikke til den fjerde kolbe, der tjener som kontrol. Tyndtlagskromatografiske analyser af opløsnings-. middelekstraherede prøver taget efter 7 og 24 timers kontakttid viser en forøget dannelseshastighed og procentisk dannelse af produktet. 6-chlor-A1,4'6-pregnatrien-l^, 17a, 21-triol-3,20-dion i sammenligning med den ubehandlede kontrol.

Eksempel 12

Ved denne fremgangsmåde følges metoden fra eksempel 1, bortset fra at 2 g trifluoreddikesyre anvendes i stedet for PTSA som den sure katalysator. Der fås tilsvarende udbytter.

Claims (4)

1. 31 1U422 Eksempel 13 Ved denne fremgangsmåde følges metoden fra eksempel 1, bortset fra at 2 g svovlsyre anvendes i stedet for PTSA som den sure katalysator. Der fås tilsvarende udbytter. Patentkrav .
2. 1. Fremgangsmåde til fremstilling af ll£-hydroxypregn-4-en-3,20-dioner af den almene formel CH0R c=o ΗΟγ'\ΐΑ·;^2 ^ " I I ' X 4 6 14 6 eller Δ ' - eller Δ ' ' -derivaterne deraf, hvori R er H, OH, alkoxy med 1-6 carbonatomer eller alkanoyloxy med 1-6 carbonatomer,
3. 1. R er H, OH eller alkanoyloxy med 1-6 carbonatomer, R er H, a-CH,
4. 12 J eller β-ΟΗ^, X er H, F, Cl eller Br, eller R og R sammen er -------O R1 \ / /\ 5 -------0 R"3 5 hvori R og R uafhængigt er H eller en hydrocarbongruppe med 1-4 carbonatomer, og de punkterede linier i ringene A og B betegner en fakultativ binding, idet der dog, når X er hydrogen, altid er en dobbeltbinding i 6-stillingen, kendetegnet ved, at et 4 3-keto-A -steroid af den almene formel: