DK175173B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af delta1,4-3-keto-21-hemiester-steroider - Google Patents

Fremgangsmåde til fremstilling af delta1,4-3-keto-21-hemiester-steroider Download PDF

Info

Publication number
DK175173B1
DK175173B1 DK198806309A DK630988A DK175173B1 DK 175173 B1 DK175173 B1 DK 175173B1 DK 198806309 A DK198806309 A DK 198806309A DK 630988 A DK630988 A DK 630988A DK 175173 B1 DK175173 B1 DK 175173B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
steroid
process according
dione
keto
hemiester
Prior art date
Application number
DK198806309A
Other languages
English (en)
Other versions
DK630988A (da
DK630988D0 (da
Inventor
Leo A Kominek
Holly Jo Wolf
Paula S Steiert
Original Assignee
Upjohn Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Upjohn Co filed Critical Upjohn Co
Publication of DK630988A publication Critical patent/DK630988A/da
Publication of DK630988D0 publication Critical patent/DK630988D0/da
Application granted granted Critical
Publication of DK175173B1 publication Critical patent/DK175173B1/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/02—Dehydrogenating; Dehydroxylating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J13/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17
    • C07J13/005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17 with double bond in position 16 (17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J13/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17
    • C07J13/007—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17 with double bond in position 17 (20)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J5/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond
    • C07J5/0046—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa
    • C07J5/0053—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa not substituted in position 16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J5/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond
    • C07J5/0046—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa
    • C07J5/0061—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa substituted in position 16
    • C07J5/0069—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa substituted in position 16 by a saturated or unsaturated hydrocarbon group
    • C07J5/0076—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa substituted in position 16 by a saturated or unsaturated hydrocarbon group by an alkyl group
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/83—Arthrobacter

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

DK 175173 B1 i
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til 1,2-dehydrogenering af visse A4-3-keto-C2i-hemiester-steroider med Arthrobacter simplex eller Bacterium cyclooxy-dans til dannelse af de tilsvarende A*·4-3-keto-C2i”hemi-5 estere eller frie alkoholer under opnåelse af forbedrede udbytter og kortere bioomdannelsestid.
1,2-Dehydrogeneringen af A4-3-keto-steroider til de tilsvarende A^^-S-keto-steroider med Septomyxa af finis, A. simplex og andre mikroorganismer er velkendt i teknikken og 10 har værdifuld kommerciel betydning.' I US patentskrift nr. 2.837.464 er der beskrevet en fremgangsmåde til 1,2-dehydrogenering af A4-3-keto-pregnener til Δ1· 4-pregnadiener, hvor C2i~hydroxylgruppen enten er fri eller ester if iceret med en monocarboxylsyre, under anvendelse 15 af Corynebacterium (Arthrobacter) simplex eller Corynebac-terium hoagii.
I US patentskrifterne nr. 2.902.410 og nr. 2.902.411 er der beskrevet fremgangsmåder til 1,2-dehydrogenering af 1,2-mættede steroider til 1,2-dehydro-steroider under anven-20 delse af Septomyxa affinis.
I US patentskrift nr. 3.360.439 er der beskrevet en fremgangsmåde til 1,2-dehydrogenering af A4-3-keto-stero-ider til de tilsvarende A1»4-3-keto-steroider under anvendelse af A. simplex-celler, der i forvejen er blevet be-25 handlet med en lavere alkanol eller alkanon. Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kræver ikke forbehandling af cellerne og kan gennemføres under anvendelse af levedygtige celler i en fermenteringsvæske. Alternativt kan der anvendes celler forbehandlet ved luft- eller varmetørring 30 eller ved udsættelse for en lavere alkanon, f.eks. acetone. Steroid-A^-dehydrogenasen fra disse organismer kan også anvendes i en cellefri form.
I US patentskrift nr. 3.770.586 er der beskrevet en forbedret fremgangsmåde til fremstilling af 11/8,21-dihydroxy-35 pregna-1,4,17 (20)-trien-3-on (eksempel 1) og ll/?,21-dihy-droxy-6a-methylpregna-l,4,17(20)-trien-3-on (eksempel 5), DK 175173 B1 2 ved hvilken alkalimetalsaltene af A4-3-keto-21-hemiester-substraterne deraf, hvor acylgruppen er en acylgruppe fra en dicarboxylsyre med 3-12 carbonatomer, 1,2-dehydrogeneres ved anvendelse af S. affinis. Under anvendelse af rystekol-5 ber, ll/3,21-dihydroxypregna-4,l7(20)-dien-3-on-21-hemisuc-cinat-kaliumsalt i en koncentration på 5,0 g/1 og medium nr. 1, fremstilles det ©nskede A^-^-produkt i 100%'s udbytte i 5 dage (eksempel 8). Ifølge eksempel l anvendes der større, omrørte tanke, og der fås et lavere udbytte. Under anven-10 delse af medium nr. 2 og 2,0-7,0 g/1 11/3,21-dihydroxypregna--4,17(20)-dien-3-on-21-hemisuccinat-kaliumsalt fås der udbytter på 91,1-96,6% i løbet af 6 dage.
I US patentskrifterne nr. 4.524.134 og nr. 4.704.358 er der beskrevet mikrobielle fremgangsmåder til fremstilling 15 af et 1,2-dehydrogeneret steroid ud fra det tilsvarende 1,2-mættede A4-3-keto-steroid under anvendelse af lufttørrede eller ved hjælp af varme tørrede celler af henholdsvis Ar-throbacter simplex og Bacterium cyclooxydans.
I EP offentliggørelsesskrift nr. 0.127.294 er der 20 beskrevet en fremgangsmåde til fremstilling af 1,2-dehydro--3-steroider ud fra 1,2-umættede 3-keto-steroider under anvendelse af A1-dehydrogenasen fra Arthrobacter simplex eller Bacterium cyclooxydans i nærværelse af en exogen elek-tronacceptor.
25 Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles der et steroid med formlen (II), jf. nedenfor, ved at bringe et tilsvarende steroid med formlen (I), jf. nedenfor, i kontakt med steroid-A1-dehydrogenasen fra Arthrobacter simplex eller Bacterium cyclooxydans, idet der ved 30 denne fremgangsmåde fås forbedrede udbytter, og idet fremgangsmåden samtidig tillader anvendelsen af højere substratkoncentrationer og formindskede reaktionstider.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af Δ1'4-3-keto-21-hemiester-steroider med den almene formel 35 DK 175173 B1 3
Rw 5 sj (1I> *6 10 i hvilken (B-I) Rg er —CH2, H:H, o-F:/?-H eller a-CH3:/3-H, eller (B-ii) Rg er CH3, og der er en yderligere binding mellem Cg og C7, (C-I) Ru er H, Rg er fraværende, og der en yderligere 15 binding mellem Cg og Cn, (C-II) Rg er H, F, Cl eller Br, og Ri;l er =0, H:H, a-0H:0-H eller a-H:0-0H, eller (C-III) Ru er a-H:/3-0-, som sammen med Rg danner et epoxid mellem Cg og Cn i /3-konfigurationen, og 20 (D-I) Rig er H, R17 er -CO-CH2-OR2i, og der er en yderligere binding mellem Cig og C17, (D-II) Rig er H:H, og R17 er =CH-CH2-0R2i, eller (D-III) Rig er =CH2, H:H, a:H:/9-CH3, a-0H:0-H eller a-CH3:/3-H, og R17 er a-H:/S-CO-CH2-OR2i eller a-0H:£-C0-CH2-25 -0-R2i, hvor R2i er H eller -C0-Xi-C00R2i_i , hvor Xi er -CH=CH- eller -(CH2)i_8-, og R2i-i er H eller en kation, er således ejendommelig ved, at et tilsvarende A4-3-keto-21-he-miester-steroid med den almene formel 30 Sl7 R11 r16 R6 35 DK 175173 B1 4 i hvilken Rg, R9, Ru, Rig °9 Rl7 har de ovenfor angivne betydninger, idet dog R21 er -CO-Xj-COC^i-i, hvor Xi og r21-1 har de ovenfor angivne betydninger, bringes i kontakt med steroid-Δ ^—dehydrogenasen fra Arthrobacter simplex eller 5 Bacterium cyclooxydans.
Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse omfatter således tilvejebringelse af kontakt mellem et A4-3-keto-21-hemiester-steroid med formlen I og enten stero-id-A^—dehydrogenasen fra A. simplex eller B. cyclooxydans, 10 eller med celler fra A. simplex eller B. cyclooxidans indeholdende steroid-A ^—dehydrogenase, til dannelse af det tilsvarende A1»4-3-keto-steroid med formlen II i form af 21-hemiesteren og/eller den frie 21-hydroxy-forbindelse.
A4-3-keto-steroid-21-hemiester-udgangsmaterialerne 15 med formlen I er kendt for fagmanden eller kan let fremstilles ud fra kendte forbindelser ved hjælp af metoder, der er velkendte for fagmanden, jf. f.eks. US patentskrifterne nr. 3.025.311, 3.209.000 og 3.770.586. A4-3-keto-21-hemi- esterne med formlen I kan fremstilles ud fra enten de til-20 svarende A4-3-keto-21-halogen- eller A4-3-keto-21-hydroxy-steroider ved enkle, velkendte ombytningsreaktioner. A4-3-keto-21-halogen-steroidet, fortrinsvis 21-chlor-steroidet, omsættes med et salt af den ønskede disyre til dannelse af A4-3-keto-steroid-21-hemiesteren med formlen I. Alternativt 25 omsættes et A4-3-keto-21-hydroxy-steroid med et passende anhydrid eller syrehalogenid af den ønskede disyre til dannelse af A4-3-keto-steroid-21-hemiesteren med formlen I.
Med hensyn til A4-3-keto-21-hemiesterne med formlen I foretrækkes det, at Rg betegner -H, -F, -CH3 eller =0¾.
30 Det foretrækkes, at C-ringen er enten A9(ll) eller har 11a-0H, 11/J-0H eller har to hydrogenatomer ved C33. Med hensyn til D-ringen foretrækkes det, at substitutionen ved C37 er =CH-CH2“0-CO-(X1)-COO-R2i_i og a-OHrØ-CO-O^-O-CO-fX!) -COOR2i_i- Det foretrækkes, at X3 er -CH=CH- eller -(CH)n3-, 35 hvor n3 er 2-4, fortrinsvis 2. Det foretrækkes, at R2^ er succinat eller fumarat. Det foretrækkes endvidere, at kati DK 175173 B1 5 onen er monovalent og udvalgt fra gruppen bestående af natrium, kalium, ammonium og -H+. Den foretrukne steroiddel af hemiesterne er valgt fra gruppen bestående af 17a,21-dihydroxypregna-4,9(11)-dien-3,20-dion, 5 11)5,2l-dihydroxypregna-4,17(20) -dien-3-on, 11/5,17a, 21-tr ihydroxy-6a-methylpregn-4-en-3,20-dion, 110,21-dihydroxy-6a-methylpregna-4,17(20)-dien-3-dion, 110,17a,21-trihydroxypregn-4-en-3,20-dion, 17a,21-dihydroxy-6a-methylpregna-4,9(11)-dien-3,20-dion, 10 17a,21-dihydroxy-160-methylpregna-4,9(11)-dien-3,20-dion, 6a-fluor-21-hydroxypregna-4,9(11),16-trien-3,20-dion, 21-hydroxypregna-4,9(11),16-trien-3,20-dion og 17a,21-dihydroxy-16a-methylpregna-4,9(11)-dien-3,20-dion.
Mest foretrukken er 110,21-dihydroxypregna-4,17(20)-15 -dien-3-on som 21-hemisuccinatet.
Mikroorganismerne A. simplex og B. cyclooxidans er velkendte, jfr. US patentskrifterne nr. 2.837.464, 4.524.134 og 4.704.358. Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan gennemføres i praksis under udnyttelse af steroid-20 -A^-dehydrogenase-aktiviteten fra hver organisme på flere forskellige former. Enzymet fra hver organisme er anvendeligt, men det foretrækkes, at A. simplex anvendes som den mikrobielle kilde. Bioomdannelsen kan udføres med enten cellefri steroid-Δ^dehydrogenase eller med celler af mikro-25 organismerne. Fortrinsvis anvendes der hele mikrobielle celler i fermenteringsvæsken ved den praktiske gennemførelse af den omhandlede fremgangsmåde, hvilket sker til undgåelse af yderligere fremstillingstrin. Når der anvendes isolerede celler, kan disse anvendes efter opsamling og koncentrering 30 fra næringsmediet ved hjælp af konventionelle metoder, f.eks. centrifugering, flokkulering og filtrering, fældning og filtrering eller ultrafiltrering. De isolerede celler kan anvendes i en fugtig tilstand eller kan immobiliseres ved hjælp af standardmetoder, f.eks. indeslutning i collagen, 35 alginat eller carrageenin som beskrevet i Methods in En-zymology, bind XLIV, side 11-317 (1976), Academic Press, DK 175173 B1 6
Inc., New York, eller kan tørres ved behandling ned en lavere alkohol eller alkanon, f.eks. acetone, son beskrevet i US patentskrift nr. 3.360.439, ved vakuuntørring ved hjælp af varne, ved frysetørring, ved lufttørring ved hjælp af varne 5 eller ved spraytørring son beskrevet i US patentskrifterne nr. 4.524.134 og 4.704.358. Steroid-Δ1-dehydrogenase-ak-tivitet i en cellefri forn kan også anvendes i opløsning eller son et imnobiliseret enzym til katalyse af steroid-1-dehydrogenering. Det vil forstås, at den omhandlede frem-10 gangsmåde dækker anvendelsen af enhver form for steroid-A dehydrogenase-præparat fra A. simplex og B. cyclooxydans til steroid-bioomdannelsen af A4-3-keto-21-hemiester-steroi-der med formlen I til de tilsvarende A^-^-S-ketosteroider med formlen II.
15 Bioomdannelsen gennemføres ved udsættelse af steroid udgangsmaterialet, dvs. A4-3-keto-21-hemiester-steroiderne med formlen I, for et præparat indeholdende steroid-A ^--de-hydrogenase-aktivitet i et overvejende vandigt system med et pH-område fra 6 til 10, fortrinsvis fra 7 til 8. Det 20 vandige system kan indeholde mindre end ca. 5% af et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel. Egnede, med vand blandbare organiske opløsnigsmidler omfatter f.eks. dime-thylsulfoxid, dimethylformamid, methanol, ethanol og acetone.
Om ønsket kan der tilsættes et med vand ikke-blandbart or-25 ganisk opløsningsmiddel, forudsat at det ikke er toksisk i forhold til steroid-A 1-dehydrogenase-aktiviteten, i en mængde på fra ca. 2 til ca. 50%. Egnede, med vand ikke-blandbare organiske opløsningsmidler omfatter toluen, benzen, butyl-acetat, heptan, methylenchlorid og lignende, idet dog toluen 30 foretrækkes. De organiske opløsningsmidler kan anvendes til opløsning eller suspendering af A4-3-keto-21-hemiester-stero-id-udgangsmaterialet med formlen I eller en exogen elektronbærer forud for dens eller deres tilsætning til steroid-A dehydrogenase-præparatet. Det foretrækkes, at tilvejebrin-35 gelsen af kontakt med steroid-udgangsmaterialet finder sted i nærværelse af en exogen elektronbærer. Det er ikke nød- DK 175173 B1 7 vendigt at have den exogene elektronbærer til stede sammen med alle A4-3-keto-21-hemiester-udgangsmaterialer med formlen I, som dette er kendt for fagmanden, men dette foretrækkes.
Det foretrækkes navnlig, når bioomdannelsen udføres cellefrit 5 eller med tørrede celler. Den exogene elektronbærer kan tilsættes til stimulering af steroid-A ^--dehydrogenering og/-eller til hindring af andre steroid-nedbrydende aktiviteter i præparater, hvor disse aktiviteter ikke tidligere er blevet elimineret. Det foretrækkes, at den exogene elektronbærer 10 vælges fra gruppen bestående af menadion, menadionbisulfit, 1,4-naphthoquinon, phenazin-methosulfat, phenazin-ethosulfat, dichlorphenol, indophenol og cytochrom c. Det foretrækkes i højere grad, at den exogene elektronbærer er menadion, mena-dion-bisulfit eller 1,4-naphthoquinon. Den exogene elektron-15 bærer anvendes i katalytiske mængder fra ca. 0,01 g/1, på den i US patentskrift nr. 4.524.134 beskrevne måde, til ca. 3,0 g/1, forudsat, at hydrogenperoxid-akkumulering nedsættes til det mindst mulige. Det foretrækkes, at der anvendes fra ca. 0,10 til ca. 1,0 g/1. Under bioomdannelses-20 processen har blandingen fortrinsvis adgang til molekylært oxygen og omrøres. Temperaturen holdes mellem ca. 5 og ca.
45eC, fortrinsvis i området fra ca. 25 til ca. 35*0.
Den type bioomdannelsesmetode, der anvendes til de-hydrogenering af et specifikt A4-3-keto-21-hemiester-steroid-25 -udgangsmateriale med formlen I vil variere afhængigt af strukturen og arten af det bestemte steroid. Eksempelvis bioomdannes det i eksempel 1 nævnte udgangsmateriale fuldstændigt under anvendelse af hele celler i en fermenteringsvæske, medens dets omdannelse er væsentligt ringere, når 30 der anvendes en ækvivalent mængde af varmetørrede celler af A. simplex. Den optimale type og det optimale niveau for enzympræparatet, den optimale substrat-koncentration, tiden for substrat-tilsætningen og varigheden af bioomdannelsen kan let bestemmes ved hver individuel steroid-A ^—dehydrogene-35 ringsreaktion under anvendelse af rutinemæssig preliminær eksperimentel virksomhed, der falder indenfor rammerne af DK 175173 B1 8 fagfolks viden på området. De fleste A4-3-keto-21-hemiester-steroid-udgangsmaterialer med formlen I bioomdannes kun godt i et system, der er vandigt for ca. 95%'s vedkommende eller mere. Ikke alle A4-3-keto-2l-hemiester-steroiderne 5 med formlen I vil fungere godt under alle de ovennævnte betingelser. Nogle fungerer bedre med kun et vandigt system, nogle med et med vand blandbart eller med vand ikke-blandbart organisk opløsningsmiddel, og nogle fungerer bedre med fermenteringsceller og andre med tørrede celler etc.
10 Kendte steroid-A ^--dehydrogeneringsprocesser med A.
simplex-celler i gæringsvæsker gør brug af A4-3-keto-stero-id-udgangsmaterialer, der i C2i-stillingen har 21-hydroxy-eller 21-monocarboxylsyreester-funktionalitet, fortrinsvis eddikesyreestere. Substratkoncentrationerne af disse 21-15 hydroxy- eller 21-acyloxy-A4-3-keto-steroider i fermenteringsmedierne ligger fra ca. 1,5 til ca. 5 g/1, således som dette er beskrevet i US patentskrift nr. 2.837.464. Ved kendte metoder til l-dehydrogenering af A4-3-ketosteroid-21-hemiestere med formlen I anvendes en substratkoncentration 20 på fra ca. 2 til ca. 10 g/1, baseret på 21-ester-vægten, eller fra ca. 1,4 til ca. 7,1 g/1, baseret på 21-hydroxy-steroid—udgangsmaterialet, jf. US patentskrift nr. 3.-770.586. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen, ved hvilken der anvendes A. simplex, tillader fordelagtig anvendelse af 25 højere substratniveauer ved bioomdannelser, der udføres med fermenteringsvæsker under anvendelse af 21-dicarboxylsyre-ester-A4-3-keto-21-hemiester-steroid-udgangsmaterialer med formlen I og en fuldstændig omsætning i løbet af et kortere tidsrum.
30 Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse tillader den fordelagtige anvendelse af højere substratkoncentrationer med det fordelagtige resultat, at der opnås kortere reaktionstider. Ved den her omhandlede fremgangsmåde tillades anvendelse af A4-3-keto-21-hemiester-steroid-35 -koncentrationer med formlen I på fra ca. 4 til ca. 30 g/1, baseret på det ikke-esterificerede A4-3-keto-steroid. Mindre DK 175173 B1 9 mængder på under ca. 4 g/1 kan anvendes, men har ikke kommerciel betydning. Ved mængder over ca. 30 g/1 foreges mængden af reststoffer til et punkt, hvor det foretrækkes at gennemføre omsætningen ved lavere substratniveauer. Det 5 foretrækkes, at koncentrationen af A4-3-keto-steroid med formlen I er ækvivalent med fra ca. 4 til ca. 12 g/1, baseret på 21-hydroxy-udgangssteroidet.
Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fås der A1»4-3-keto-steroider med formlen XI i forbedrede 10 udbytter og i løbet af kortere tid end tidligere påkrævet. Reaktionen, ved hvilken der dannes A-^^-S-ketosteroider med formlen II, er fuldstændig i løbet af fra ca. 4 til ca.
72 timer. De nuværende steroid-A -^-dehydrogeneringsprocesser kræver almindeligvis gennemsnitligt ca. 120 timer under 15 anvendelse af hemiestere sammen med S. affinis, jf. US patentskrift nr. 3.770.586.
Når A4-3-keto-21-hemiester-steroid-udgangsmaterialet er blevet omdannet til det tilsvarende A*»4-3-keto-steroid-produkt med formlen II, isoleres det ved hjælp af metoder, 20 der er velkendte for fagfolk.
Al,4-3-keto-steroid-produkterne med formlen II kan anvendes som mellemprodukter ved fremstillingen af steroid--lægemidler.
De følgende definitioner og forklaringer vedrører de 25 betegnelser, der anvendes i nærværende beskrivelse og patentkrav.
De kemiske formler, der repræsenterer forskellige forbindelser eller molekyldele i beskrivelsen og kravene, kan indeholde variable substituenter udover direkte define-30 rede strukturelle træk. Disse variable substituenter identificeres ved et bogstav eller et bogstav efterfulgt af en numerisk betegnelse, f.eks. "Z^" eller "Ri", hvor "i" er et helt tal. Disse variable substituenter er enten monovalente eller bivalente, dvs. de repræsenterer en gruppe knyttet 35 til formlen med én eller to kemiske bindinger. Eksempelvis vil en gruppe Zj repræsentere en bivalent variabel, hvis DK 175173 B1 10 den er bundet til formlen CH3-C(®Z1)H. Grupperne og Rj vil repræsentere monovalente variable substituenter, hvis de er knyttet til formlen CH3-CH2-C(Ri) (Rj)H2. Når kemiske formler angives på lineær måde, således som formlerne oven-5 for, er variable substituenter indeholdt i parenteser bundet til atomet umiddelbart til venstre for den variable substituent, der er indesluttet i parentes. Når to eller flere på hinanden følgende variable substituenter er anbragt i parentes, er hver af de i rækkefølge forekommende variable 10 substituenter bundet til det umiddelbart foregående atom til venstre, der ikke er anbragt i parentes. I formlen ovenfor er både R^ og Rj således bundet til det foranstående carbonatom. For ethvert molekyle med et etableret system for carbonatom-nummerering, f.eks. steroider, betegnes disse 15 carbonatomer også som C^, hvor "i” er det hele tal, der svarer til antallet af carbonatomer. Eksempelvis repræsenterer Cg 6-stillingen eller carbonatomantallet i steroidkernen som traditionelt betegner af fagfolk indenfor steroidkemien. Ligeledes repræsenteres betegnelsen "Rg" en variabel 20 substituent (enten monovalent eller bivalent) i Cg-stil-1ingen.
Kemiske formler eller dele deraf, der er anført på lineær måde, repræsenterer atomer i en lineær kæde. Symbolet m-h repræsenterer i almindelighed en binding mellem to atomer 25 i kæden. Formlen CH3-0-CH2-CH(Ri)-CH3 repræsenterer således en 2-substitueret 1-methoxypropan-forbindelse. På tilsvarende måde repræsenterer symbolet en dobbeltbinding, f.eks. CH2=C(Ri)-0-CH3, og symbolet repræsenterer en tredob belt binding, f.eks. HCsC-CH(R^)-CH2-CH3. Carbonylgrupper 30 er angivet på to forskellige måder, enten som -CO- eller som -C(=0)-, idet den først angivne betegnelse foretrækkes for simpelheds skyld.
Kemiske formler for cycliske forbindelser (ringforbindelser) eller molekyldele deraf kan gengives på lineær 35 måde. Forbindelsen 4-chlor-2-methyl-pyridin kan således gengives lineært med formlen N*=C(CH3)-CH=CC1-CH-C*H, idet DK 175173 B1 11 atomerne mærket med en stjerne (*) ér bundet til hverandre, hvilket resulterer i dannelsen af en ring. Ligeledes kan det cycliske molekyl fragment 4-(ethyl) -1-piperazinyl gengives ved formlen -N*-(CH2)2-N(C2H5)-CH2-C*H2.
5 En cyclisk struktur (ringstruktur) for enhver her angivet forbindelse definerer en orientering med hensyn til ringens plan for substituenter knyttet til hvert carbonatom i den cycliske forbindelse. I formler, der afbilder sådanne forbindelser, er en substituent, der er bundet til et carlo bonatom under ringens plan, identificeret som værende i a-konfiguration og er vist ved en brudt, punkteret eller prikket linie, der er knyttet til carbonatomet, dvs. ved hjælp af symbolet ”---M eller Den tilsvarende substituent, der er bundet over ringens plan, identificeres som værende 15 i ^-konfigurationen. Når en variabel substituent er divalent, kan valenserne tages sammen eller særskilt eller begge i definitionen af den variable. Eksempelvis kan en variabel Ri bundet til et carbonatom som -C(=Ri)- være bivalent og være defineret som oxo eller keto (til dannelse af en car-20 bonylgruppe (-CO)) eller som to særskilt bundne, monovalente variable substituenter a-Ri_j og Æ-Ri-k* Når en bivalent variabel, Ri, defineres til at bestå af to monovalente variable substituenter, defineres den divalente variable på formen ”a-Ri_jrØ-Ri-k" eller en variant deraf. I et sådant 25 tilfælde er både a-R^-j og /9“Ri-k bundet til carbonatomet til dannelse af gruppen -C(a-Ri_j)(£-Ri-k)”· Når f.eks. den bivalente variabel Rg, -C(=Rg)-, er defineret som bestående af to monovalente variabelsubstituenter, er to monovalente variable substituenter a-Rg_i:0-Rg..2, ··· <*“1*6-9 :/3“R6-10 30 etc., hvilket giver formlerne -C(a-Rg_i)(0-Rg_2)-, ...
-C(a-Rg_9)(0-Rg_10)_ etc. Ligeledes er for den divalente variable Rllf -(:(=^^)-, to monovalente variable substituenter <*“Rii-i:^“Rh-2 · For en ringsubstituent, for hvilken der ikke eksisterer særskilte a- og /3-orienteringer, f.eks.
35 på grund af tilstedeværelsen af en carbon-carbon-dobbelt-binding i ringen, og for en substituent bundet til et car- DK 175173 B1 12 bonatom, der ikke er en del af en ring, anvendes det ovennævnte system stadig, men a- og β-betegnelserne udelades.
På samme måde som en divalent variabel kan defineres som to særskilte monovalente variable substituenter, kan to 5 særskilte roonovalente variable substituenter defineres tilsammen til dannelse af en bivalent variabel. Eksempelvis kan i formlen -C1(Ri)H-C2(Rj)H- (C! og C2 betegner arbitrært et første og et andet carbonatom) R^ og Rj defineres sammen til dannelse af (1) en anden binding mellem og C2 eller 10 (2) en divalent gruppe såsom oxa (-0-), og formlen beskriver således et epoxid. Når R^ og Rj tilsammen danner en mere kompleks molekyldel, f.eks. gruppen -X-Y-, er orienteringen af denne molekyldel således, at C3 i den ovennævnte formel er bundet til X, medens C2 er bundet til Y. Ifølge det her 15 anvendte system betyder betegnelsen "R^ og Rj tilsammen danner -CH2-CH2-0-C0-,..” en lacton, hvori carbonylet er bundet til C2. Når der imidlertid benyttes betegnelsen "Rj og R^ tilsammen danner -CH2-CH2-0-C0-”, betyder det her anvendte system en lacton, hvori carbonylet er bundet til C3.
20 Carbonatomindholdet af variable substituenter er angivet på en ud af to måder. Ved den første metode anvendes der et prefix til det samlede navn på de variable, f.eks.
, hvor både "l" og "4" er hele tal, der repræsenterer det minimale og maksimale antal carbonatomer i den variable.
25 Præfixet er adskilt fra den variable med et mellemrum. Eksempelvis betegner "Ci^-alkyl" en alkylgruppe med 1-4 carbonatomer, inklusive isomere former deraf, medmindre det modsatte udtrykkeligt er anført. Når dette enkelte præfix angives, betegner det det totale carbonatomindhold i den 30 variable, som defineres. C2_4-alkoxycarbonyl beskriver således en gruppe CH3-(CH2)n-0-C0-, hvor n er 0, 1 eller 2.
Ifølge den anden metode er carbonatomindholdet af kun hver del af definitionen angivet særskilt ved anbringelse af betegnelsen "Ci-CjM, og anbringelse af den umiddelbart (intet 35 mellemrum) før delen af definition, som defineres. Ved denne alternative metode har (C^-Cj)-alkoxycarbonyl samme mening DK 175173 B1 13 som C2-4-alicoxycarbonyl/ fordi "0^.3" kun refererer til carbonatomindholdet af carboxygruppen. Når ligeledes både C2-C6-alkoxyalkyl og (03-03)-alkoxy-(¢3-03)-alkyl definerer alkoxyalkylgrupper indeholdende fra 2 til 6 carbonatomer, 5 afviger de to definitioner fra hverandre, eftersom den førstnævnte definition tillader enten alkoxy- eller alkyldelen alene at indeholde 4 eller 5 carbonatomer, medens den sidstnævnte definition begrænser hver af disse grupper til 3 carbonatomer.
10 Når kravene indeholder en forholdsvis kompleks cyclisk substituent, vil der ved slutningen af den betegnelse eller det navn, der angiver den pågældende substituent, være en angivelse i parentes, der vil svare til det samme navn eller den samme betegnelse i det efterfølgende reaktionsskema, 15 der også angiver de kemiske strukturformler for de pågældende substituenter.
I det følgende er alle temperaturer angivet i cel-siusgrader, HPLC referer til højtryksvæskechromatografi, DMF betegner dimethylformamid, og når der anvendes opløs-20 ningsmiddelpar, er forholdet mellem de anvendte opløsningsmidler rumfang til rumfang. A. simplex betegner Arthrobacter simplex, og B. cyclooxidans betegner Bacterium cyclooxydans. Koncentrationerne af A4-3-keto-21-hemiester-steroid-udgangs-materialer med formlen I er angivet i pr. g/1, idet vægten 25 i g er udtrykt som mængden af det tilsvarende 21-hydroxy-steroid.
Det menes, at en fagmand på området under anvendelse af den foranstående beskrivelse fuldt ud kan udøve den foreliggende opfindelse. De følgende detaljerede eksempler be-30 skriver, hvorledes man kan fremstille de forskellige forbindelser og/eller udføre de forskellige fremgangsmåder ifølge opfindelsen, og disse eksempler er blot at betragte som illustrationer. Fagmanden vil straks være klar over passende variationer i de procedurer, der er tale om, såvel 35 med hensyn til reaktanter som med hensyn til reaktionsbetingelser og reaktionsteknik.
DK 175173 B1 14
Eksempel 1 A. Simplex-bioomdannelse af lig.21-dihvdropreana-4.17(20)-5 dien-3-on-21-hemisuccinat-kaliumsalt (1¾ Å. Primart mikrooraanismepodninasudviklinastrin.
Celler fra en kultur af Arthrobacter simplex (UC582, ATCC 6946), der holdes på næringsagar-skråkulturer, gen-10 suspenderes i sterilt vand (5 ml) og anvendes til podning af 300 ml primært podningsmedium, der er sammensat af næringsmedium (12 g Difco-produkt pr. liter), der er steriliseret ved 121*C i 30 minutter forud for podningen.
Blandingen inkuberes i rystekolber på 1 liter ved 15 28*C på et roterende rysteapparat (250 omdrejninger pr.
minut og ca. 5 cm's slaglængde) i 2 dage.
B. Sekundært podninasudviklinastrin.
Det vækstmedium, der anvendes til den sekundære for-20 mering af mikroorganismen, består af en vandig blanding af de følgende næringsmaterialer:
Koncentration af bestanddele Leverandør 25 Tørret majsstøbevæske 20 g/1 Roquette Freres (Solulys A)
Spækolie (No. 2) 15 g/1 Geo. Pfau & Son
Silicone-antiskummiddel 0,1 ml/1 Union Carbide (SAG-471) 30 Cortisone-acetat 0,1 g/1 The Upjohn Com pany
Mediets pH-værdi indstilles på pH = 7,0 med natriumhydroxid af reagenskvalitet forud for sterilisering som 35 ovenfor beskrevet. To rystekolber (300 ml) fra det foran nævnte primære trin anvendes til podning af et 250 liters DK 175173 B1 15 sekundært podningsmedium. Gæringsbeholderen anvendes ved ca. 28*C ved en omrøringshastighed på 250 omdrejninger pr. minut, en beluftningshastighed på 100 standardliter pr. minut (slm) og et modtryk på ca. 0,35 kg/cm2. Det sekundære 5 podningstrin inkuberes i to dage.
C. Fermenterings (reaktions!-trinnet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.
Et vandigt medium indeholdende 20 g tørret majsstøbe-10 væske (Solulys A) pr. liter, 20 g spækolie nr. 2 pr. liter, 0,1 g cortisoneacetat pr. liter og 0,2 ml af et silicone-antiskummiddel (SAG-471-Union Carbide) pr. liter indstilles på en pH-værdi på 6,0 med natriumhydroxidopløsning inden sterilisering af blandingen. Det fremkomne medium sterili-15 seres ved 121* C i 30 minutter i en gæringsbeholder med et arbejdsrumfang på 250 1. Mediet i tanken omrøres ved en temperatur på 28*C, en omrøringshastighed på 280 omdrejninger pr. minut, en beluftningshastighed på 25 standardliter pr. minut og med et modtryk på ca. 0,35 kg/cm2. Gæringsbeholder-20 indholdet inokuleres med 5 rumfangsprocent af det færdige fermenterede rumfang af en 48 timers kulturvækst (sekundært podningsmedium ovenfor) af Arthrobacter simplex (ATCC 6946).
Den fremkomne kulturblanding får lov at vokse i 36 timer, på hvilket tidspunkt pH-værdien indstilles på 7,5 og opret-25 holdes ved automatisk tilsætning af svovlsyre eller natriumhydroxidopløsning. Der tilsættes menadion efter pH-indstil-lingen, indtil der opnåe en slutkoncentration på 0,17 g/li-ter. Δ4-3-keto-21-hemiester-steroid-substratet (I), 110,21--dihydroxy-pregna-4,17 (20) -dien-3-on-21-hemisuccinat-kalium-30 salt (I) tilsættes i DMF til opnåelse af en slutkoncentration på 11,35 g/liter, hvilket svarer til 8 g/liter af det tilsvarende 21-hydroxy-A4-3-keto-steroid. Denne blanding inkuberes i 48 timer.
Reaktionens fuldstændighed bestemmes ved hjælp af en 35 HPLC-analyse. Produkterne, en blanding af 110,21-dihydroxy--pregna-1,4,17(20)-trien-3-on (II) og 110,21-dihydroxy-preg- DK 175173 B1 16 na-1,4,17(20)-trien-3-on-21-hemisuccinat (II) hydrolyseres til 110,21-dihydroxy-pregna-l,4,17(20)-trien-3-on (II) ved hjælp af base. Herefter filtreres blandingen, hvor A1»4-!-keto-steroidet (II) tilbageholdes i filterkagen, og der 5 ekstraheres dernæst med vandig acetone og krystalliseres ved hjælp af i sig selv velkendte fremgangsmåder. Produkterne identificeres ved sammenligning med kendte prøver ved hjælp af HPLC på en siliciumdioxid-baseret C-8-søjle på 25 cm, idet der elueres med en mobil fase af acetonitril/vand/ed-10 dikesyre i forholdet 40/60/0,1. Retentionstiden for 21-hy-droxy-forbindelsen er 12,5 minutter, og for 21-hemisuccinatet er den 28,5 minutter.
Eksempel 2-10 15 Idet man følger den generelle fremgangsmåde fra eksem pel 1 og anvender ikke-kritiske variationer, men går ud fra A4-3-keto-21-hemiester-steroiderne (I) i spalte A nedenfor, fås der de tilsvarende A1»4-steroider (II), enten som den frie 21-alkohol eller som 21-hemiesteren eller som en blan-20 ding deraf:
Eksempel nr. _Spalte A_ 2 17α,21-dihydroxypregna-4,9(11)-dien- -3,20-dion, 21-hemisuccinat, 25 3 110,17a,21-trihydroxy-6a-methylpregn- -4-en-3,20-dion, 21-hemisuccinat-kaliumsalt 4 110,21-dihydroxy-6a-methylpregna- 4,17(20)-dien-3-on, 21-hemisuccinat- 30 -natriumsalt 5 110,17a, 21-trihydroxypregn-4-en-3,20- -dion, 2l-hemisuccinat-triethylamin-salt 6 17a,21-dihydroxy-6a-methylpregna- 35 4,9(ll)-dien-3,20-dion, 21-hemisucci nat DK 175173 B1 17 7 17α, 21-dihydroxy-16/3-methylpregna- 4,9(11)-dien-3,20-dion, 21-hemisuc-cinat-natriumsalt 8 6a-fluor-21-hydroxypregna-4,9(ll) ,16- 5 -trien-3,20-dion, 21-hemisuccinat- kaliumsalt 9 21-hydroxypregna-4,9(11),16-trien- 3.20- dion, 21-hemisuccinat 10 17a,2l-dihydroxy-16a-methylpregna- 10 -4,9(11)-dien-3,20-dion, 21-hemisuc- cinat 11 110, 21-dihydroxypregna-4,17 (20)-dien- 3-on, 21-heraifumarat 12 17a,2l-dihydroxypregna-4,9(11)-dien- 15 3,20-dion, 21-hemioxylat 13 ll/3,17a,21-trihydroxy-6a-methylpregn- -4-en-3,20-dion, 21-hemimaleinat, natriumsalt 14 11β, 21-dihydroxy-6a-methylpregna- 20 4,17(20)-dien-3-on, 21-hemiglutarat- -natriumsalt 15 11β, 17a,21-trihydroxypregn-4-en-3,20- -dion, 21-hemiadipat-triethylaminsalt 16 17a,21-dihydroxy-6a-methylpregna- 25 4,9(11)-dien-3,20-dion, 21-hemifuma- rat-natriumsalt 17 17a,21-dihydroxy-16/3-met.hylpregna- 4,9(11)-dien-3,20-dion, 21-hemima-leinat 30 18 6a-fluor-21-hydroxypregna-4,9(ll) ,16- -trien-3,20-dion, 21-hemiglutarat 19 21-hydroxypregna-4,9(11),16-trien- 3.20- dion, 21-hemioxylat 20 17a, 21-dihydroxy-16a-methylpregna- 35 4,9(11)-dien-3,20-dion, 21-hemimalat
Eksempel 21 DK 175173 B1 18
A. simplex (torrede celler!-bioomdannelse af 6a-fluor-21-hvdroxv-preqna-4.9(11) . 16f 171-trien-3.20-dion-21-hemisuccinat 5 IH
Under anvendelse af de generelle metoder, der er beskrevet i US patentskrift nr. 4.524.134, og idet der anvendes ikke-kritiske variationer, suspenderes 1,0 g tørrede A. simplex-celler i kaliumphosphatpuffer (0,05 molær, 100 10 ml, pH = 7,5). Der opløses 8,6 mg menadion i 1 ml ethanol, og dette sættes til cellesuspensionen. A4-3-keto-21-hemi-ester-steroid-substratet (I), 6a-fluor-21-hydroxypregna-4,9- (11),16(17)-trien-3,10-dion-21-hemisuccinat (I) opløses i DMF og sættes til rystekolben til en slut-steroidkoncen-15 tration på 4,0 g/liter, beregnet på det tilsvarende 2l-hy-droxy-steroid, og en DMF-slutkoncentration på ca. 5%. Repli-kat-kolber inkuberes på en roterende omryster ved 31 *C i 3 dage. Analyse af bioomdannelsesblandingen ved hjælp af HPLC viser, at 99% af A4-3-keto-steroid-21-hemiester-substratet 20 (I) er dehydrogeneret til det tilsvarende A1-produkt og er tilstede som en blanding af 21-hemisuccinatet (II) og 21-hydroxy-former (II). Produkterne identificeres ved sammenligning ved kendte prøver ved hjælp af HPLC på en på sili-ciumdioxid baseret C-8-søjle, idet der elueres med acetoni-25 tril/THF/vand/eddikesyre i forholdet 9/31/60/0,3, og retentionstiden for 21-hydroxy-forbindelsen er 8,19 minutter, for 2l-hemisuccinatet 12,51 minutter, og for substratet 16,25 minutter.
DK 175173 B1 19
Eksempel 22 B. cvclooxvdans-bioomdannelse af 110.17a.21-trihvdroxv-6a-methvl-preana-4“en-·3.20-dion-21-hemisuccinat (I) 5 Under anvendelse af den generelle metode, der er beskrevet i US patentskrift nr. 4.704.358, og under anvendelse af ikke-kritiske variationer, men idet der gås ud fra 110,17a, 21-trihydroxy-6a-methylpregna-4-en-3,20-dion-21-hemisuccinat (I) og anvendes B. cyclooxidans, fås der den i 10 overskriften angivne forbindelse. Bioomdannelsen styres ved tyndtlagschromatografi af butylacetatekstrakter og kendte standarder på en silicagelplade (fluorescens) i et opløsningsmiddelsystem bestående af en blanding af chloroform, methylcellosolve og 95%'s ethylalkohol i forholdet 80,5:-15 5:7,5.
20 DK 175173 B1 SKEMA A 5 «17 M ^sr y^Ki6 10 (I) R6 15
BIOOMDANNELSE
20 Ψ u17 R’6 »6

Claims (21)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af A1»^-3-keto-21-hemiester-steroider med den almene formel • 5 II” '"YjY*16 10 h 15. hvilken (B-I) Rg er =CH2, H:H, a-F:/3-H eller 0-013:/3-11, eller (B-II) Rg er CH3, og der er en yderligere binding mellem Cg og C7, (C-l) Ru er H, Rg er fraværende, og der en yderligere 20 binding mellem C9 og (C-II) Rg er H, F, Cl eller Br, og R^ er =0, H:H, a-0H:/3-H eller o-H:/9-0H, eller (C-III) R^i er a-H:/3-0-, som sammen med Rg danner et epoxid mellem C9 og Cn i ^-konfigurationen, og 25 (D-I) Rig er H, R17 er -CO-CH2-OR2i, og der er en yderligere binding mellem Cig og C17, (D-II) Rig er H:H, og Ri7 er =CH-CH2-OR2i, eller (D-III) Rig er =CH2, H:H, o:H:/?-CH3, o-0H:0-H eller o-CH3:/3-H, og R17 er o-H:ø-C0-CH2-0R2i eller o-OH:/3-CO-CH2-30 —o—R21, hvor R2i er H eller -C0-Xi~C00R2i_i, hvor Xi er -CH=CH- eller -(CH2)i_8-, og R21-l er H eller en kation, kendetegnet ved, at et tilsvarende A4-3-keto-—21—hemiester—steroid med den almene formel 35 DK 175173 B1 22 δ17 Rn Ri6 (I) Rfc 10 b i hvilken Rg, Rg, Ru» **16 °9 R17 har de ovenfor angivne betydninger, idet dog R2i er -CO-X^-COOR^..!, hvor og r2i_i har de ovenfor angivne betydninger, bringes i kontakt 15 med steroid-Δ ^--dehydrogenasen fra Arthrobacter simplex eller Bacterium cyclooxydans.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Rg er =CH2, H:H, a-F:0-H eller a-CH3:jB-H.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kende-20 tegnet ved, at R^3 er H:H, a-OH:0-H eller α-Η:/ϊ-0Η.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at R^ er H, Rg er fraværende, og der findes en yderligere binding mellem Cg og C^.
5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående 25 krav, kendetegnet ved, at R17 er =CH-CH2-0-C0- -Xl-COOR^.!·
6. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved, at R17 er a-OH:0-CO-CH2-O-CO-
7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at X^ er -CH=CH-.
8. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-6, kendetegnet ved, at X3 er -(CH2)j__g-.
9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendete g-35 net ved, at X3 er -(CH2)2-4-·
10. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendete g- DK 175173 B1 23 net ved, at Xj er -(CH2)2“·
11. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at kat ionen er monovalent.
12. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående * 5 krav, kendetegnet ved, at R21-1 er H, natrium, kalium eller ammonium.
13. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at steroidet (I) er valgt blandt 10 17a,21—dihydroxypregna-4,9(11)-dien-3,20-dion, ll/3,21-dihydroxypregna-4,17 (20) -dien-3-on, 11/3, 17a, 21-trihydroxy-6a-methylpregn-4-en-3,20-dion, 11/3,21-dihydroxy-6a-methylpregna-4,17 (20) -dien-3-on, 11/3,17a, 21-trihydroxypregn-4-en-3,20-dion, 15 17a,21-dihydroxy-6a-methylpregna-4,9(11)-dien-3,20-dion, 17a, 21-dihydroxy-16/3-methylpregna-4,9(11) -dien-3,20-dion, 6a-fluor-21-hydroxypregna-4,9(11)-trien-3,20-dion, 21-hydroxypregna-4,9(11),16-trien-3,20-dion og 17a,21-dihydroxy-16a-methylpregna-4,9(11)-dien-3,20-dion.
14. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at den udføres i nærværelse af en effektiv mængde af en exogen elektronbærer.
15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at den exogene elektronbærer er valgt blandt 25 menadion, menadion-bisulfit, 1,4-naphthoquinon, phenazin--methosulfat, phenazin-ethosulfat, dichlorphenol, indophenol og cytochrom c.
16. Fremgangsmåde ifølge krav 15, kendetegnet ved, at den exogene elektronbærer er menadion, mena- 30 dion-bisulfit eller 1,4-naphthoguinon.
17. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at steroidet (I) bringes i kontakt med celler af A. simplex eller B. cyclooxydans.
18. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kendete g- 35 net ved, at steroidet (I) bringes i kontakt med levedygtige, reproducerende celler af A. simplex eller B. cyclooxy- DK 175173 B1 24 dans under aerobe fermenteringsbetingelser i et vandigt næringsmedium.
19. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 14-16, kendetegnet ved, at steroidet (I) bringes i kon- 5 takt med tørrede celler af Ά. simplex eller B. cyclooxydans.
20. Fremgangsmåde ifølge krav 19, kendetegnet ved, at cellerne er lufttørrede eller varmetørrede.
21. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 14-16, kendetegnet ved, at steroid-Δ^-dehydrogenasen er 10. form af et cellefrit præparat.
DK198806309A 1987-03-12 1988-11-11 Fremgangsmåde til fremstilling af delta1,4-3-keto-21-hemiester-steroider DK175173B1 (da)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2512787A 1987-03-12 1987-03-12
US2512787 1987-03-12
US8800405 1988-02-19
PCT/US1988/000405 WO1988007092A1 (en) 1987-03-12 1988-02-19 1,2-dehydrogenation of steroidal 21-esters with a. simplex

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK630988A DK630988A (da) 1988-11-11
DK630988D0 DK630988D0 (da) 1988-11-11
DK175173B1 true DK175173B1 (da) 2004-06-21

Family

ID=21824196

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK198806309A DK175173B1 (da) 1987-03-12 1988-11-11 Fremgangsmåde til fremstilling af delta1,4-3-keto-21-hemiester-steroider

Country Status (12)

Country Link
US (1) US5225335A (da)
EP (1) EP0350488B1 (da)
JP (1) JP2680870B2 (da)
KR (1) KR960013094B1 (da)
AT (1) ATE94212T1 (da)
AU (1) AU1340888A (da)
BG (1) BG50389A3 (da)
DE (1) DE3883973T2 (da)
DK (1) DK175173B1 (da)
HK (1) HK153896A (da)
HU (1) HU204305B (da)
WO (1) WO1988007092A1 (da)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1270660B (it) * 1994-10-13 1997-05-07 Poli Ind Chimica Spa Procedimento microbiologico per la preparazione di 3-oxo-4-azasteroidi-17beta-carbossi sostituiti e uso dei prodotti come inibitori dell'enzima 5alfa-riduttasi
AU5873300A (en) * 1999-07-07 2001-01-30 Pharmacia & Upjohn Company Process to prepare exemestane
WO2002102826A1 (en) * 2001-06-18 2002-12-27 Pharmacia & Upjohn Company PROCESS TO PREPARE 11β,17α,21-TRIHYDROXY-6α-METHYLPREGNA-1,4-DIENE-3,20-DIONE 21-ACETATE
HU227117B1 (en) 2002-05-10 2010-07-28 Richter Gedeon Nyrt Process for dehydrogenation of aza-androstane compounds
US20090142342A1 (en) * 2006-12-27 2009-06-04 Johns Hopkins University B7-h4 receptor agonist compositions and methods for treating inflammation and auto-immune diseases
KR101591482B1 (ko) 2008-05-28 2016-02-03 레베라겐 바이오파마 인코포레이티드 질환의 치료를 위한 ＮＦ-κＢ 의 비호르몬성 스테로이드 조절제
EP2556083A4 (en) 2010-04-05 2013-12-04 Validus Biopharma Inc NONHORMONAL STEROID MODULATORS OF NF-KAPPA-B FOR DISEASE TREATMENT
RU2480475C1 (ru) * 2011-11-16 2013-04-27 Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Промышленности И Торговли Российской Федерации Микробиологический способ получения 21-ацетоксипрегна-1,4,9( 11 ),16-тетраен-3,20-диона из 21-ацетоксипрегна-4,9( 11 ),16-триен-3,20-диона
CN103159817A (zh) * 2011-12-13 2013-06-19 辽宁海思科制药有限公司 一种琥珀酸甲泼尼龙的制备方法
CN104650172A (zh) * 2015-03-25 2015-05-27 浙江仙琚制药股份有限公司 琥珀酸甲泼尼龙的制备方法
US10799514B2 (en) 2015-06-29 2020-10-13 Reveragen Biopharma, Inc. Non-hormonal steroid modulators of NF-kappa beta for treatment of disease
US11382922B2 (en) 2019-03-07 2022-07-12 Reveragen Biopharma, Inc. Aqueous oral pharmaceutical suspension compositions

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2837464A (en) * 1955-01-11 1958-06-03 Schering Corp Process for production of dienes by corynebacteria
US2822318A (en) * 1956-12-07 1958-02-04 Olin Mathieson Production of 3-keto-delta pregnadienes by bacterium cyclo-oxydans
US2902411A (en) * 1957-06-28 1959-09-01 Upjohn Co Use of second steroid to accelerate 1-dehydrogenation of substrate steroid
US2902410A (en) * 1957-09-26 1959-09-01 Upjohn Co Process for the 1,2-dehydrogenation of a steroid with septomyxa
US3360439A (en) * 1964-08-19 1967-12-26 Squibb & Sons Inc Process for preparing 1-dehydro steroids
US3770586A (en) * 1971-03-24 1973-11-06 Upjohn Co Process for the microbiological 1-dehydrogenation of certain 4,9-(11)-pregnadienes
US4524134A (en) * 1982-07-30 1985-06-18 The Upjohn Company Process for preparing 1,2-dehydro steroids
DE3322120A1 (de) * 1982-07-30 1984-02-02 The Upjohn Co., 49001 Kalamazoo, Mich. Verfahren zur umwandlung von 1,2-gesaettigten 3-ketosteroiden in 1,2-dehydrosteroide
US4704358A (en) * 1982-10-25 1987-11-03 The Upjohn Company Δ1 -dehydrogenation with heat or air-dried B. cyclooxidans
US4749649A (en) * 1983-05-16 1988-06-07 The Upjohn Company Microbial Δ1-dehydrogenation process using a scavenger of toxic oxygen

Also Published As

Publication number Publication date
HK153896A (en) 1996-08-16
KR890700679A (ko) 1989-04-26
EP0350488A1 (en) 1990-01-17
BG50389A3 (en) 1992-07-15
EP0350488B1 (en) 1993-09-08
DE3883973D1 (de) 1993-10-14
AU1340888A (en) 1988-10-10
HU204305B (en) 1991-12-30
DK630988A (da) 1988-11-11
DK630988D0 (da) 1988-11-11
DE3883973T2 (de) 1994-02-17
KR960013094B1 (ko) 1996-09-30
ATE94212T1 (de) 1993-09-15
HUT50881A (en) 1990-03-28
JPH02502514A (ja) 1990-08-16
WO1988007092A1 (en) 1988-09-22
JP2680870B2 (ja) 1997-11-19
US5225335A (en) 1993-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK175173B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af delta1,4-3-keto-21-hemiester-steroider
JPS6117477B2 (da)
DE60308388T2 (de) 5-Androsten-3beta-ol-Steroide und Verfahren für ihre Herstellung
US6828120B2 (en) Process to prepare 11β, 17α,21-trihydroxy-6α-methylpregna-1,4-diene-3,20-dione 21-acetate
SU876059A3 (ru) Способ получени 11 -гидроксистероидов
WO2009034398A1 (en) Process for the synthesis of 6-hydroxymethyl-l,4- androstadien-3.17-dione
US4603013A (en) Estrane derivatives
US3623954A (en) Process for making 6-hydroxy-3-keto-{66 1,4-steroids of the pregnane and androstane series
US3143543A (en) Certificate of correction
US3577318A (en) Process for making 6-hydroxy-3-keto delta**4-steroids of the pregnane and androstane series
US3329579A (en) Method of preparing 16-oxygenated derivatives of estr-4-en-3-one
US20020035260A1 (en) 4-aza-steroids
US3226404A (en) Ester 4-en-3-one and 16-oxygenated derivatives thereof
IE44516B1 (en) Process for the manufacture of 4-androstene-3-,17-dione derivatives
SU482444A1 (ru) Способ получени 21-ацетата ацетонида -фторпрегнен-4-тетрол-11 ,16 , 17 ,21-диона-3,20
US5250712A (en) 1β,15α-dihydroxy-1α-methyl-5α-androstane-3,17-dione, its production and use
JPH0362717B2 (da)
DE1793784B2 (de) Verfahren zur herstellung optisch aktiver oestran-derivate
JPS59187000A (ja) アンドロスタ−１，４，１１（１２）−トリエン−３，１７−ジオン
DK144422B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af 11beta-hydroxy-pregn-4-en-3,20-dioner
JPH0420600B2 (da)
JPH02504519A (ja) １β，１５α‐ジヒドロキシ‐１α‐メチル‐５α‐アンドロスタン‐３，１７‐ジオン、その製造及び使用
CS200519B2 (cs) Způsob výroby androstanových derivátů
JPS5951277B2 (ja) 新規な微生物
AU2002311917A1 (en) Process to prepare 11beta,17alpha,21-trihydroxy-6alpha-Methylpregna-1,4-diene-3,20-dione 21-acetate

Legal Events

Date Code Title Description
PUP Patent expired