CS200519B2 - Způsob výroby androstanových derivátů - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby derivátů androstanu obecného vzorce I

ve kterém vazba . . . , představuje jednoduchou nebo dvojnou vazbu,

Ri značí atom vodíku nebo Cl—C4-alkylovou skupinu,

Rz značí Ci—C6-alkylovou skupinu, popřípadě přerušenou atomem kyslíku, nebo v případě, že n značí číslo 2, znamená rovněž atom vodíku a

Re značí methyl nebo ethinyl.

Tento způsob podle vynálezu spočívá v tom, že sterolový derivát obecného vzorce II

v němž vazba . , n, Ri a Rz mají výše Uvedený význam a

R3 představuje uhlovodíkový zbytek sterolu s 8 až 10 uhlíkovými atomy, se fermentuje kulturou mikroorganismů způsobilých k odbourávání postranního řetězce sterolů, a takto vyrobený derivát androstan-17-onu obecného vzorce III

v němž v němž vazba . . . . , Ri a R2 mají výše uvedený význam, se redukuje, popřípadě alkyluje organokovovou sloučeninou obecného vzorce IV

MeRs ,

v němž _________ ___ vazba . . . . , Ri a R2 mají význam uvedený v bodě 1 a

R4 značí atom vodíku, methylovou nebo ethylovou skupinu, se fermentuje kulturou mikroorganismů způsobilých k odbourávání postranního řetězce sterolů.

K fermentaci se může výhodně používat kultury mikroorganismů způsobilých k odbourávání postranního řetězce sterolů druhů Arthrobacter, Brevibacterium, Microbacterium, Protaminobacter, Bacillus, Nocardia, Streptomyces nebo zejména druhu Mycobacterium.

Alkylovou skupinou Ri nebo R2 se rozumí alkylová skupina obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, ,s výhodou alkylová skupina s rovným řetězcem. Vhodnými alkylovými skupiRs značí methyl nebo ethinyl a

Me značí atom alkalického kovu nebo zbytek halogenidu hořečnatého.

Způsob podle vynálezu se výhodně provádí tak, že sterolový derivát obecného vzorce Ila nami Ri nebo R2 jsou například propylová, butylová, isopropylová, sek.butylová skupí; n,a a zejména methylová skupina a ethylová skupina. Alkylovou skupinou přerušovanou atomem kyslíku se rozumí skupina, která obsahuje 3 až 6 uhlíkových atomů. Takovými skupinami jsou například 2;alkoxyethylenové skupiny, jako 2-methoxyethylenová skupina nebo 2-ethoxyethylenová skupina.

Uhlovodíkovým zbytkem R3 obsahujícím 8 áž 10 uhlíkových atomů se rozumí zbytek, který se vyskytuje v postranních řetězcích přirozených zoo- nebo fytosterolů, například cholesterolu, stigmasterolu, kampesterolu, brassikasterolu nebo sitosterolů.

Vhodnými sterolovými deriváty obecného vzorce II jsou například takové sloučeniny, které lze charakterizovat obecným vzorcem Ila

v němž // ·.

. Ri a Rz máji výše uvedený význam, vazby . . . . , představují jednoduché vazby nebo dvojné vazby,

R4 značí atom vodíku, methylovou skupinu nebo ethylovou skupinu.

Zvláště. vhodnými sterolovými deriváty obecného vzorce Ila jsou A⁵-steroidy a deriváty 5a-sterolů tohoto obecného vzorce.

Je známo, že četné mikroorganismy (například druhů Arthrobacter, Brevibacterium,

Microbácterium, Protaminobacter, Bacillus,

Nocardia, Streptomyces a zejména Mycobacterium) mají přirozenou schopnost odbourávat zoo- a fytosteroly na kysličník uhličitý a vodu a že při tomto odbourávání vzniká intermediárně 4-androsten-3,17-dion a l,4-androstaidien-3,17-dion.

Protože četné zoo- a fytosteroly (například cholesterol, stigimasterol, kampesterol, brassikasterol nebo sitosteroly) jsou hojně rozšířeny v přírodě a jsou tedy lehko dostupnými surovinami pro syntézu farmakologicky účinných steroidů, byly provedeny četné pokusy, řídit odbourávání sterolů tak, aby se zamezilo dalšímu odbourávání vznik200519 lého 4-androsten-3,17-dionu a 1,4-androstadien-3,17-dionu.

Tak bylo například možné zamezit další odbourávání l,4-ándrostadien-3,17-dionu a 4-.androšten-3,17-dionu tím, že se k fermentačním násadám přidávají inhibitory (viz vykládací spisy DE č. 1 543 269 a 1 593 327, jakož i patent US č. 1 208 078). Použitím inhibitorů se však .stává technické provedení těchto reakcí velmi nákladným, v neposlední řadě z toho důvodu, že musí být použité inhibitory po provedené reakci odstraňovány z fermentačních kultur, aby se zabránilo pronikání těchto látek do odpadních vod. Známé reakce mají kromě toho tu nevýhodu, že při nidh vždy vzniká 1,4-androstadien-3,l,7-dion nebo směsi 1,4-androstadien-3,17-dionu a 4-androsten-3,17-dioinu. Vznikající l,4-androstadien-3,17-dion je však jako výchozí látka pro syntézu četných farmakologicky účinných steriodů málo vhodný.

Jinak mohlo být dalšímu odbourávání 1,4-androstadien-3,17-dionu a 4-androsten-3,17-dionu zabráněno i tak, že ,k fermentační přeměně sterolů bylo použito mutant mikroorganismů druhu Mycobacterium (viz patent US č. 3 684 657). Dosud vypěstované mutanty mají však nevýhodu spočívající ve velmi omezené schopnosti tvorby 1,4-androstadien-3,17-dionu nebo 4-androstan-3,17-dionu ze sterolů.

Okolem tohoto vynálezu je vyvinout způsob odbourávání postranních řetězců sterolů prostý nedostatků známých způsobů.

Okol byl řešen vypracováním způsobu vyznačujícího se tím, že derivát sterolů obecného vzorce II se fermentuje s kulturou mikroorganismů způsobilých odbourávat postranní řetězce sterolů.

Pro odborníka je velmi překvapující, že při této fermentativní přeměně vznikají ve vysokých výtěžcích deriváty androstan-17-onu obecného vzorce I. To z toho· důvodu, poněvadž je známo, že odbourávání postranního řetězce sterolů provádí velmi komplexní enzymový systém a nemohlo být očekáváno, že všechny enzymy spolupůsobící při odbourávání postranních řetězců přirozených sterolů mají schopnost provádět rovněž odbourávání postranních řetězců sterolů obecného vzorce II nevyskytujících se v přírodě. Nemohlo být kromě toho předvídáno, že enzymové systémy účastnící se odbourávání l,4-.androstadien-3,17-dionu a 4-androsten-3,17-dionu neodbourávají deriváty ándrostan-17-onu obecného vzorce I.

Odhlédne-li se od použití jiných výchozích sloučenin a od skutečnosti, že tuto reakci lze provádět v nepřítomnosti inhibitorů, způsob podle vynálezu se provádí za stejných fermentačních podmínek, kterých se rovněž používá u známých reakcí mikrobiologického odbourávání postranních řetězců sterolů.

Podle vynálezu se fermentace provádí za použití kultur mikroorganismů, kterých se používá obvykle k odbourávání postranního řetězce sterolů. Vhodnými kulturami jsou například kultury bakterií způsobilé k odbourávání postranních řetězců sterolů druhů Arthrobacter, Brevibacterium, Microbacterium, Protaminobacter, Streptomyces nebo zejména druhu Mycobacterium. Jako vhodné .mikroorganismy lze uvést například Microbacterium lactum IAM-1640, Protaminobacter alboflavus IAM-1040, Bacillus roseus IAM-1257,

Bacillus sphaericus ATCC-7055,

Nocardia gardneri IAM-105,

Nocárdia minima IAM-374,

Nocardia corallina IFO-3338,

Streptomyces rubeseerís IAM-74 nebo zejména mikroorganismy

Mycobacterium avium IFO-3O82,

Mycobacterium phlei ÍFO-3158,

Mycobacterium phlei (Ostav Zdravotnictví, Budapešť č. 29),

Mycobacterium phlei ATCC-354, Mycobacterium smegmatis ATCC-20, Mycobacterium smegmatis IFO-3O84, Mycobacterium smegmatis (Ústav Zdravotnictví, Budapešť č. 27),

Mycobacterium smegmatis ATGC-19979, Mycobacterium fortuitum CBS-49566, Mycobacterium spec. NRRL-B-3805 a Mycobacterium spec. NRRL-B-368.3.

Sumberzní kultury se předpěstují za vzdušnění ve vhodném živném prostředí za obvyklých podmínek používaných u těchto mikroorganismů. Potom se přidává ke kulturám substrát (.rozpuštěný ve vhodném rozpouštědle nebo s výhodou v 'emulgované formě) a fermentuje se, až se dosáhne maximální přeměny substrátu.

Vhodnými rozpouštědly substrátu jsou například methanol, ethanol, glykolmonomethylether, dimethylformamid nebo diimethylsulfoxid. Emulgování substrátu lze provádět například tak, že se přidává v mikronizované formě nebo rozpuštěný v rozpouštědle mísitelném s vodou (jako methanolu, ethanolu, acetonu, glykolmonomethyletheru, dimethylformamidu neíbo dímethylsulfoxidu) za intenzívní turbulence do vody (s výhodou zbavené vápníku), která obsahuje obvyklá emulgační činidla. Vhodnými emulgačními činidly jsou neiono>genní emulgátory, například ethylenoxidové adukty nebo polyglykolové estery mastných kyselin. Vhodnými emulgátory jsou například obchodně dostupná smáčedla typu Teginu ^(R) , Tagatu ^(R) , Tweenu ^(R) a Spánu ^(R) .

Emulgování substrátu umožňuje často zvýšené prosazení substrátem a tím zvýšení koncentrace substrátu. Je pochopitelně rovněž možné při způsobu podle vynálezu používat další metody zvyšování prosazení substrátu, jak je dobře známo pracovníkům z oboru.

Optimální koncentrace substrátu, doba přidávání substrátu a trvání fermentace jsou závislé na struktuře použitého substrátu a druhu použitého mikroorganismu. Tyto veličiny musí být zjišťovány, jak se u mikrobiálních přeměn steroidů obecně vyžaduje, v jednotlivých případech předběžnými pokusy.

Deriváty androstan-17-onu obecného vzorce III lze v poloze 17 redukovat nebo alkylovat organokovovou sloučeninou obecného vzorce IV

MeRs (IV), v němž

Rs představuje nasycený nebo nenasycený uhlovodíkový zbytek s 1 až 2 uhlíkovými atomy a

Me značí atom alkalického kovu nebo zbytek halogenidů hořčíku.

Takto připravené sloučeniny obecného vzorce I

v němž vazba ,..., Ri a Rž mají výše uvedený význam a

R6 má stejný význam jako Rs nebo značí atom vodíku, lze v přítomnosti H⁺-iontů nebo Lewisových kylselin hydrolyzovat na příslušné 3i/J-hydroxysloučeniny. Jejich další zpracování ve farmakologicfcy účinné látky je známé.

Tak lze například takto získané deriváty 3i/í-hydrOxy-5-androsten-17-onu převádět pomocí Oppenauerovy reakce (například zahřátím produktů hydrolýzy s isopropylátem hlinitým ve směsi benzenu a acetonu) v příslušné 17í₎g-hydroxy-3-keto-A⁴-steroidy, například testosteron, 17«-methyltestosteron, 17«-ethyltestofsteron nebo 17,a-ethinyltestosteron, které jak známo, mají rovněž významnou hormonální aktivitu.

17«-Ethinyl-T7|$-hydroxy-4-androsten-3-on a 17/?-hydroxy-17a-vinyl-4-androsten-3-on jsou známými cennými meziprodukty pre výrobu farmakologicky účinného 17a-hydroxyprogesteronu a jeho esterů (Helv. Chim. Acta 24, 1941, 945 a vykládací spis DE č. 2 140 291).

Redukce 17-ketoskupiny u derivátů 5-androsten-17-onu obecného vzorce I se provádí způsoby známými z oboru (viz například John Eried: Organic Reactions in Steroid Chemistry — van Norlstrand Reinhold Comp. New York etc. 1972, sv. 1, str. 61 ff). Tyto sloučeniny lze uvést do reakce například s borohydridem sodným nebo hydridem llthnohlinltým a získat příslušné deriváty 17jjS-hydroxy-5-androstenu.

Rovněž jsou známé způsoby alkylace 17-ketoskupiny (viz například John Fried: Organíc Reactions in Steroid Chemiistry — van Norstrand Reinhold Comp., New York etc. 1972, sv. 2, str. 53 ff). Tak lze například deriváty 5-androsten-17-onu obecného vzorce I uvádět do reakce s alikylmagnesiumhalogenidy nebo acetyhdy alkalických kovů a získat příslušné deriváty 17-hydroxy-17«-alkyl (nebo ethinyl)5-androstenu.

Výchozí sloučeniny způsobu podle vynálezu jsou známé, nebo- je lze připravit známými způsoby [J. Pharm. Soc. 54, 514 (1965), Can. J. Chem. 49, 2418 (1971) Synthesis

1975, 276 a 1976, 244, Tetrahedron Letters

1976, 809, Can. J. Chem. 50, 2788 (1972) a Bull. Soc. Chim. France 1960, 297).

Následující příklady provedení slouží k objasnění vynálezu.

A) Příklady provedení týkající se mikrobiologického odbourávání postranního řetězce Příklad 1

a) Do 750 ml Erlenmeyerovy baňky se vnese 200 ml sterilního živného roztoku, obsahujícího 1 % kvasničného extraktu, 0,45 proč. dinatriumhýdrogenfosfátu, 0,34 % kaliumdihydrogenfosfátu a 0,2 % Tagatu^(E) 02, nastaveného na hodnotu pH 6,7, zaočkuje se smytou suchou kulturou Mycobacterium spec. NRRL-B-3805 a třepe se po dobu 3 dní při teplotě 30 °C při 190 otáčkách za minutu.

b) SOlitrový fermentor se 40 litry sterilního živného, roztoku obsahujícího 1,23 °/o kvasničného extraktu (05 %), 0.68 % kaliumdihydrogenfosfátu a 0,2 °/o Tagatu^w 02, nastaveného na hodnotu pH 6,0, se naočkuje 200 ml napěstované kultury Mycobacterium spec. a předkultura se inikubuje po· dobu 48 hodin při teplotě 30 °C za vzdušnění (2 m³ za hodiinu).

c) 400 g cholesterolu se rozpustí v 8 litrech dlmethylacetalu formaldehydu, za míchání se při teplotě místnosti přidá 400 g křemeliny a 200 g kysličníku fosforečného po dávkách a reakční směs se míchá po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Nerozpustné látky (se odfiltrují, promyjí dimethylacetalem formaldehydu a rozpouštědlo se oddestlluje ve vakuu. Po přidání roztoku hydrogenuhličitanu sodného se pevný surový produkt odsaje, profmyje vodou a po vysušení se získá 440 g 3i0-methoxymethoxy-5-cholestenu. Sloučenina překrystalovaná z acetonu má teplotu tání 79 až 80%!.

400 g takto připraveného 3/J-methoxymethoxy-5-cholestenu se emulguje se 120 g Teginu^(R), 10 litry delonizované vody a 40 ml 1 N hydroxidu sodného při teplotě 95 °C po dobu 30, minut. Emulze se sterilizuje po dobu 20 minut ipři teplotě 120 °C.

d) Do 501itrového farmantoru se vnese 40 litrů sterilního živného roztoku obsahujícího 2,0 °/o kukuřičného výluhu, 0,3 % diamoniumhydrogenfosfátu a 0,25 %' Tagatu^(R1 02, nastaveného na hodnotu pH 6,5, naočkuje se 2 litry předkultury Mycobacterium spec. a za vzdušnění (0,5 m³ 'za hodinu} a míchání (250 otáček za minutu) se inkubuje po dobu 24 hodin při teplotě 30 °C. Potqm se ke kultuře přidá emulze 3/?-methoxymethoxý-5-cholestenu, připravená podle odstavce c) a fermentuje se po dobu dalších 120 hodin.

Po skončené fermentací se kultura extrahuje 3X5 litry ethylenchloridu, ethylenchloridový extrakt ise zfiltruje a odpaří ve vakuu.

Zbytek (156 g) se chromatografuje na sloupci křemeliny, překrystaluje z ethylacetátu a získá ee 86 g 30-methoxymethoxy-5,-androsten-17-oinu s teplotou tání 129/131 až 132 °C.

P ř í k 1 a d 2

a) Ve 21itrové Erlenmeyerově baňce s 500 ml sterilního živného prostředí se napěstuje za podmínek příkladu la) Mycobacterium spec. N'RRL-3i8i0'5.

b) 10 g sitosterolu se přemění reakcí 'tak, jak je popsáno v příkladu lcj a získá se 11 g 24-ethyl-30-methoxymethoxy-5-cholestenu. Sloučenina překrystalovaná z acetonu má teplotu tání 70 až 71 °C.

10' g takto získaného 24-ethyl-3/3wethoxymethoxy-5-cholestenu se emulguje se 4 g Teginu^(R) a 300 ml vody při teplotě 95 °C po dobu 10 minut. Emulze ee sterilizuje po dobu 20 minut při teplotě 120 °C.

cj Obsah 20 Erlenmeyerových baněk vždy s 85 ml sterilního živného prostředí, obsahující 2,0 % kukuřičného výluhu, 0,3 % diamoniumhydrogenfo,státu a 0,25 % Tagatu^(R|, nastaveného, ina hodnotu pH 6,5, se očkuje po 5 ml napěstované kultury Mycobacterium spec. a třepe se po dobu 24 hodin při 2120 otáčkách za minutu při teplotě 30 °Ó.

Potom se ke každé kultuře přidá 14 ml suspenze 24-ethyl-30-me'thoxymethoxy-5-cholestenu (toto imnožství odpovídá 0,5 g 24-ethyl-30-methoxymethoxy-5-chole'stenuj a fermentuje se dalších 120 hodin při teplotě 30 °C na třepacím zařízení.

Po zpracování jako v příkladu ld j se získá 2,1 g 30-meťhoxymethoxy-5-androsten-17-onu s teplotou tání 130 až 132 °C.

Příklad 3

a) 10,5 g stigmasterolu se přemění reakcí jako v příkladu lc) a získá se 10,75 g 24-ethyl-3i/J-methoxymethoxy-5,22-cholestadienu. Sloučenina překrystalovaná z acetonu má teplotu tání 103 až 104 ^qC.

b) 10 g 24-ethyl-30-methoxymethoxy-5,22-cholesta dlenu (se emulguje za podmínek popsaných v příkladu 2ib).

cj Za podmínek popsaných v příkladu 2aj a cj se .připraví 85 ml kultury Mycobacterium spec. NRRL-B-3805 a přidá se 14 ml suspenze 24-ethyl-30-methoxymethoxy-5,22-cholestadienu (toto odpovídá 0,5 g 24-ethyl-3/3-methoxymetho>xy-5,22-cholestadienuj.

Po inkubaci dalších 120 hodin při teplotě 30 °C na třepacím zařízení následuje zpracování jak je popsáno v příkladu ld).

Získá se 2,3 g 3|3-methoxymethoxy-5-androsten-17-onu <s teplotou tání 130 až 132 st. Celsia.

Příklad 4 aj 20 g cholesterolu se rozpustí ve 300 ml diethylacetalu formaldehydu, za míchání se přidá 30 g křemeliny při teplotě místnosti .a po dávkách 15 g kysličníku fosforečného a míchá po dobu 4 hodin. Reakční směs se zbaví filtrací nerozpustných látek, filtr se promyje diethylacetalem formaldehydu a rozpouštědlo se oddestiluje ve vakuu. Zbytek krystaluje při teplotě 0 °C, Po přidání roztoku hydrogenuhličitanu sodného se surový produkt odsaje, promyje vodou a po sušení se získá 22,5 g 30-ethoxymethoxy-5-cholestenu. Sloučenina překrystalovaná z ethylacetátu má teplotu tání 64 až 66 °C.

bj 10 g 3j3-ethoxymethoxy-5-cholestenu se emulguje za podmínek popsaných v příkladu 2bj.

cj K 85 ml kultury Mycobacterium spec. NRRL-B-3805, připravené za podmínek uvedených v příkladu 2a) a c), se přidá 14 ml suspenze 30-ethoxymethoxy-5-cholestenu (toto odpovídá 0,5 g 30-ethoxymethoxy-5-cholestenu).

Po inkubaci po dobu dalších 120 hodin při teplotě 30 °C na třepacím zařízení, následuje zpracování jako v příkladu ld).

Získá se 1,5 g 30-ethoxymethoxy-5-androsten-17-onu s teplotou tání 121 až 123 °C.

P ř í k 1 a d 5 aj 38,67 g cholesterolu se rozpustí ve 250 mililitrech methylenchloridu .a 164,2,g formaldehyd-bis-glykolmonomethyletheracetalu (připravitelného například podle vykládacího spisu DE č. 2 405 633), za míchání při teplotě místnosti se přidá 60 g křemeliny a 30 g kysličníku fosforečného a míchá se po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Nerozpustné produkty se odfiltrují, promyjí methylenchloridem a neutralizují methanolickým roztokem hydroxidu draselného. Po oddestilování rozpouštědla ve vakuu se produkt vyjme do methanolu, zfiltruje a sloučenina pomalým odpařením zkrystaluje. Získá se 25 g 20-(2,5-dioxahexyloxy]-5-choleštěnu s teplotou tání 41 až 42 °C.

bj Za podmínek uvedených v příkladu 2b)

12 sé ' emulguje '10 g ' 3/3- (2,5-dioxahexy loxy) -5-cholesténu.' , ,,c) Za podmínek uvedených v příkladu 2aj a c) se připraví 25 riil kultury Mycobacterium spec:.'NRRL-B-3805 a přidá se 14 ml suspenze .3/3-(2,5-dioxahexy loxy )-5-cholestenu (toto odpovídá 0,5 g 3/3-(2,5-dioxahexyloxy-5-cholestehu.

Po dalších 120 hodinách inkubace při teplotě 30 °C na třěpacím ' zařízení následuje zpracování jak je popsáno v příkladu ld).

Získá se 1,75 g 3+(2,5-dioxahexyloxy)-5androsten-17-onu s teplotou tání 65 až 67 °C.

P ř í k 1 a d 6

a) 12 g cholesterolu se suspenduje ve 100 mililitrech dimethylacetalu acetaldehydu, za míchání při teplotě místnosti se přidá 25 g křemeliny a po dávkách 12 g kysličníku fosforečného a za teploty místnosti se míchá po dobu 45 minut. Nerozpustné látky se odsají, promyjí methylenchloridem a roztok se neutralizuje methanolickým roztokem hydroxidu sodného. Po oddestilování rozpouštědel ve vakuu se surový produkt překrystaluje po přidání aktivního uhlí z acetonu. Získá se 10,2 g 3,/3-( 1-methoxyethoxy )-5-cholestenu s teplotou tání 94 až 95 °C.

b) 10 g 3/3-( 1-methoxyethoxy )-5-cholestenu se emulguje za podmínek popsaných v příkladu 2b).

c) Za podmínek popsaných v příkladu 2a) a c) se připraví 85 ml kultury Mycobacterium spec. NRRL-B-3805 a přidá se 14 ml suspenze 3/3-(l-methoxýethoxy)-5-cholestenu (toto odpovídá 0,5 g 3/3- (1-methoxyethoxy)-5-cholestenu).

Po dalších 120 hodinách inkubace při teplotě 30 °C na třěpacím zařízení následuje zpracování jak je popsáno v příkladu ld).

Získá se 1,89 g 3/3- (1-methoxyethoxy)-5-androsten-17-onu s teplotou tání 111 až 118 stupňů C.

Příklad 7

a) K 19,33 g cholesterolu ve 200 ml methylenchloridu se přidá 23,6 ml vinylethyletheru a. 86 mg kyseliny p-toluensulfonové (bělzvodé) a míchá se po dobu 1,5 hodiny. Po neutralizaci roztokem hydrogenuhličitanu sodného se reakční směs extrahuje roztokem chloridu sodného, suší síranem sodným a rozpouštědlo se oddestiluje. Olejovitý surový produkt se chromatografuje na sloupci silikagelu ve směsích hexan-ethylacetát. Získá še 18,4 g 3/3-(1-ethoxyethoxy )-5-cholestenu ve formě bezbarvé voskovité látky.

b) 10 g 3/?-(l-ethoxyethoxy)-5-cholestenu se emulguje ža podmínek popsaných v příkladu 2b).

c) Za podmínek popsaných v příkladu 2a) a c) se připraví 85 ml kultury Mycobacteřium spec. NRRL-B-3805 a přidá se 14 ml suspenze 3/3-(l-ethoxyethoxy)-5-cholestenu (toto odpovídá 0,5 g 3/3-(l-ethoxyethoxy)-5-cholestenu). Potom se inkubuje na třepacim .Zařízení (při teplotě 30 °C), po dobu dalších 120 hodin.

Spojené kultury se extrahují ethylenchloridem. Extrakty se zahustí ve vakuu, zbytek se zahřívá k varu pod zpětným chladičem se 70 ml methanolu, 12 ml Vody a 6 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové po dobu 1 hodiny. Po ochlazení na teplotu 12 °C se reakční produkt vysráží 100 ml vody a odfiltruje. Po překrystalování z acetonu se získá 0,62 g 5-androsten-3/3-ol-17-onu s teplotou tání 138/148 až 149 °C.

Příklade

a) 38,7 g cholesterolu se rozpustí v 500 ml methylenchloridu, při teplotě 0 °C se přidá 25 ml ethylenoxidu a 0,5 ml bortrifluoridetherátu. Reakční směs se ponechá stát přes noc při teplotě místnosti, vytřepe vodou, vysuší síranem sodným a rozpouštědlo se oddestiluje ve vakuu. Surový produkt (50 g) se chromatografuje na silikagelu ve směsích hexan-ethyl-acetát.

Získá se 10 g 3/3-(2-hydroxyethoxy)-5-cholestenu s teplotou tání 91 až 95 °C.

b) 10 g 3/3-(2-hydroxyethoxy)-5-cholestenu se emulguje za podmínek popsaných v příkladu 2b). '

c) Za podmínek uvedených v příkladu 2aj a c) se připraví 85 ml kultury Mycobacterium spec. NRRL-3805 a zpracuje se 14 ml suspenze 3/3-(2-hydroxyethoxy)-5-cholestenu (toto odpovídá 0,5 g 3/3-(2-hydroxyethoxy)-5-cholestenu). Po dalších 120 hodinách inkubace při teplotě 30 °C na třěpacím zařízení následuje zpracování jak je popsáno v příkladu ld).

Získá se 2,1 g 3/3-(2-hydroxyethoxy)-5-androsten-17-onu s teplotou tání 173/175 až 177 °C.

Příklad 9 '

a) 20 g 5cei-choléstan-3,/3-olu se uvádí do reakce s dimethylacetalem formaldehydu jak je popsáno v příkladu lc) a získá se 21,5 g 3/3-methoxyinetb.oxy-5aí-cholestenu. Sloučenina překrystalovaná z acetonu má teplotu tání 65 až 68 °C.

b) 10 g S+methoxymethoxy-Stf-cholestanu se emulguje za podmínek popsaných v příkladu 2b).

c) Za podmínek popsaných v příkladu 2a) a c) se připraví 85 ml kultury Mycohacterium spec. NRRL-3805 a zpracuje se 14 ml suspenze a/J-methoxymethoxy-Sw-cholestanu (toto odpovídá 0,5 g 3/3-methoxymethoxy-5«·200519 cholestanu). Po dalších 120 hodinách inkubace při teplotě 30 °C na třepačce následuje zpracování jako v příkladu ld).

Získá se 2,05 g 3j3-methoxymethoxy-5a'-androstan-17-onu a teplotou tání 97 až 98 °C.

Bj Příklady provedení týkající se dalšího chemického zpracování derivátů androstan-17-onu

Příklad 10 g terc.butylátu draselného ve 100 ml tetrahydrofuranu se převádí uváděním acetylenu v acetylid. K této suspenzi se přidá při teplotě 10 °G roztok 20 g 3/3-methoxymethoxy-5-androsten-17-onu ve 100 ml tetrahydrofuranu a míchá se po dobu 1 hodiny. Rozpouštědlo se oddestiluje ve vakuu a nahradí vodou. Surový produkt se odsaje, promyje vodou a suší. Získá se 21,53 g 17a-ethinyl-3/3-methoxymethoxy-5-androsten-17/3-olu s teplotou tání 184 až 186 °G.

Přikladli

3,59 g 17o-ethinyl-3/J-methomethoxy-5-androsten-17/3-olu se zahřívá pod zpětným chladičem se 100 ml acetonu, 4 ml vody a 3,4 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové po dobu 15 minut. Produkt se po ochlazení vysráží vodou, odfiltruje, promyje vodou a suší. Získá se 3,1 g 17a^-ethinyl-5-androsten-3jj3,17/3;-diolu s teplotou tání 241 až 243 °C (z acetonu).

P ř í k 1 a d 1 2

Methylmagnesiumbromid se připraví obvyklým způsobem z 1,5 g hořčíkových hoblin, 37,5. ml toluenu a 9 ml etheru a plynného methylbromidu. Do této směsi se přidává při teplotě místnosti pod dusíkem roztok 5,63 g 3(S-methoxymethoxy-5-androsten-17-onu ve 40 ml toluenu během 30 minut. Reakční směs se potom po dobu 200 minut míchá při teplotě 50 až 55 °C pod dusíkem, ochladí, rozloží opatrně zředěnou kyselinou sírovou, rozpouštědla se oddestilují a krystaly izolují. Výtěžek 5,85 g 3/J-methoxymethoxy-17a-methyl-5-androsten-17/S-olu s teplotou tání 134 až 135 °C (z methanolu).

P ř í k 1 a d 1 3

3,49 g 3/S-methoxymethoxy-17<r-methyl-5-androsten-lZ/S-olu se rozpustí ve 100 ml acetonu, přidá se 6 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a 6 ml vody a směs se zahřívá po dobu 1 hodiny pod zpětným chladičem k varu. Po ochlazení se produkt vysráží vodou, zfiltruje, promyje vodou a suší. Získá se 3,0 g 17a-methyl-5-androsten-3/?,17,/3-diolu s teplotou tání 200 až 204 °C (z methanolu).

Příklad 14 g 3i/S-methoxymethoxy-5-androsten-17-onu se rozpustí ve 100 ml ethánolu a 150 ml benzenu, přidají se 2,63 g borohydrldu sodného a reakční směs se míchá po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Potom se přidá voda, rozpouštědla se oddestilují ve vakuu a surový produkt se odsaje, promyje vodou a suší. Získá se 20,1 g 3./3-methoxymethoxy-5-androsten-17/J-olu s teplotou tání 149 až 150 stupňů C (z methanolu).

PŘEDMĚT

Claims (2)

1. PŘEDMĚT

   1. Způsob výroby androstanových derivátů obecného vzorce I

   YNÁLEZU vyznačující se tím, že sterolový derivát obecného vzorce II vazba . . . . , n, Ri a R2 mají výše uvedený význam a

   R3 představuje uhlovodíkový zbytek sterolu s 8 až 10 uhlíkovými atomy, se fermentuje kulturou mikroorganismů způsobilých k odbourávání postranního řetězce sterolů, a takto vyrobený derivát androstan-17-onu obecného vzorce III v němž vazba . . . , představuje jednoduchou nebo dvojnou vazbu,

   Ri značí atom vodíku nebo Ci—Ci-alkylovou skupinu,

   Rž značí Cl—C6-alkylovou skupinu, popřípadě přerušenou atomem kyslíku, nebo značí-li n číslo 2, pak znamená také atom vodíku, a

   R6 značí methyl nebo ethinyl, v němž vazba . . . . , Ri a Rž mají výše uvedený význam, se redukuje, popřípadě alkyluje organokovovou sloučeninou obecného vzorce IV

   MeRs , (IV) v němž

   Rs značí methyl nebo ethinyl a Me značí atom alkalického kovu nebo zbytek halogenidu hořečnatého.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že sterolový derivát obecného vzorce Ha v němž vazba . . . . , Ri a R2 mají význam uvedený v bodě 1 a

   Rí značí atom vodíku, methylovou nebo ethylovou skupinu, se fermentuje kulturou mikroorganismů způsobilých k odbourávání postranního řetězce sterolů, načež se provede druhý reakční stupeň.

   Severograha, n. p., závod 7, Most