DE60308388T2

DE60308388T2 - 5-Androsten-3beta-ol-Steroide und Verfahren für ihre Herstellung

Info

Publication number: DE60308388T2
Application number: DE60308388T
Authority: DE
Inventors: J. Michael Portage WHITE; G. Peter Mattawan WUTS; Doris Kalamazoo BECK
Original assignee: Pharmacia and Upjohn Co LLC
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co LLC
Priority date: 2002-08-16
Filing date: 2003-03-21
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2023-03-22
Also published as: ES2271636T3; WO2004016640A2; US20040034215A1; CA2495412A1; US7002028B2; BR0313523A; MXPA05001857A; JP2006507369A; EP1534732A2; US20040220158A1; WO2004016640A3; AU2003285485A1; TW200406419A; EP1534732B1; DE60308388D1; ATE339437T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt 5-Androsten-3β-ol-Steroide und Verfahren für ihre Herstellung bereit.
Hintergrund
Steroid-Intermediate sind oft bei der Herstellung pharmazeutischer Mittel verwendbar bzw. nützlich. 5-Androsten-3β,7β,11α-triol-17-on ist ein Steroid-Intermediat, verwendbar zur Herstellung von Eplerenon.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Im Allgemeinen liefert die vorliegende Erfindung ein praktisches Pilz-Verfahren für die 11α-Hydroxylierung von 5-Androsten-3β-ol-17-on und anderen zugehörigen Analoga der allgemeinen Formel (I), um 5-Androsten-3β,7β,11α-triol-17-on und andere zugehörige Analoga der allgemeinen Formel (IV) zu ergeben.
In einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung ein 7β,11α-Dihydroxysteroid der Formel (IV)
worin R₃ ist:

(1) -H;
(2) -CO-R₄

₄

₁

₅

₁₇

₁₈

₁₇

₁₈

Ein Beispiel des 7β,11α-Dihydroxysteroids der Formel (IV) ist 5-Androsten-3β,7β,11α-triol-17-on.
In einem noch weiteren Aspekt bietet die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines 7β,11α-Dihydroxysteroids der Formel (IV)
worin R₃ ist:

(1) -H;
(2) -CO-R₄

₄

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₁₇

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(1) In-Kontakt-Bringen eines 7β-Hydroxysteroids der Formel (II)
worin R₃, R₁₇ und R₁₈ wie oben definiert sind und worin Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, mit 11α-Hydroxylase von Aspergillus, zum Beispiel Aspergillus ochraceus. Ein Beispiel des 7β,11α-Dihydroxysteroids (IV) ist 5-Androsten-3β,7β,11α-triol-17-on. Das Verfahren des In-Kontakt-Bringens kann mittels Fermentation, Zellkonzentrat, ganzer Zellen oder zellfreier Reaktion sein bzw. geschehen.

In einem noch weiteren Aspekt bietet die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines 7β,11α-Dihydroxysteroids der Formel (IV)
worin R₃ ist:

(1) -H;
(2) -CO-R₄

₄

₁

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₁₇

₁₈

₁₇

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(1) In-Kontakt-Bringen eines Δ⁵-Steroids der Formel (I)
worin R₃, R₁₈ und R₁₇ wie oben definiert sind und worin Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, mit 7β-Hydroxylase von Diplodia, zum Beispiel Diplodia gossypina, um ein 7β-Hydroxysteroid der Formel (II) zu erzeugen,
worin R₃, R₁₇ und R₁₈ wie oben definiert sind; und
(2) In-Kontakt-Bringen des 7β-Hydroxysteroids (II) aus Schritt (1) mit 11α-Hydroxylase von Aspergillus, zum Beispiel Aspergillus ochraceus. Ein Beispiel des 7β,11α-Dihydroxysteroids (IV) ist 5-Androsten-3β,7β,11α-triol-17-on. Das Verfahren zur Herstellung eines 7β,11α-Dihydroxysteroids (IV), wobei man das 7β-Hydroxysteroid (II) von Schritt (1) vor dem In-Kontakt-Bringen von Schritt (2) nicht isolieren kann.

In einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines 7β,11α-Dihydroxysteroids der Formel (IV)
worin R₃ ist:

(1) -H;
(2) -CO-R₄

₄

₁

₅

₁₇

₁₈

₁₇

₁₈

(1) In-Kontakt-Bringen eines Δ⁵-Steroids der Formel (I)
worin R₃, R₁₈ und R₁₇ wie oben definiert sind und worin Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, mit der/den 7β,11α-Hydroxylase(n) von Absidia, zum Beispiel Absidia coerulea. Ein Beispiel des 7β,11α-Dihydroxysteroids (IV) ist 5-Androsten-3β,7β,11α-triol-17-on. Das Verfahren des In-Kontakt-Bringens kann mittels Fermentation, Zellkonzentrat, ganzer Zellen oder zellfreier Reaktion sein bzw. geschehen.

Ausführungsformen jedes Aspekts der Erfindung können ein oder mehrere der folgenden einschließen. R₃ ist H. R₃ ist -C(O)-CH₃. R₃ ist -C(O)-H. R₁₇ und R₁₈ bilden =O. R₁₇, R₁₈ und das C17-Kohlenstoffatom des Steroidgerüsts bilden den oben gezeigten Lactonring. Der Lactonring weist die α- und β-Stereochemie, gezeigt in der folgenden Formel, auf:
DEFINITIONEN UND KONVENTIONEN
Die Definitionen und Erklärungen unten gelten für die Ausdrücke, wie sie durch das gesamte Dokument hindurch verwendet werden, einschließlich sowohl der Beschreibung und der Ansprüche.
KONVENTIONEN FÜR FORMELN UND DEFINITIONEN VON VARIABLEN
Die chemischen Formeln, die in der Beschreibung und den Ansprüchen verschiedene Verbindungen oder molekulare Fragmente repräsentieren, können zusätzlich zu ausdrücklich definierten strukturellen Eigenschaften variable Substituenten enthalten. Diese variablen Substituenten sind durch einen Buchstaben definiert oder einen Buchstaben, gefolgt von einem numerischen Subskript, zum Beispiel „Z_i" oder „R_i", wobei „i" eine ganze Zahl ist.
DEFINITIONEN
Die unten stehenden Definitionen und Erklärungen gelten für die Ausdrücke, die durch dieses gesamte Dokument hindurch, einschließlich sowohl der Beschreibung als auch der Ansprüche, verwendet werden.
Alle Temperaturen sind in Grad Celsius.

U.p.M.: bezieht sich auf Umdrehungen pro Minute.
DC: bezieht sich auf Dünnschicht-Chromatographie.
HPLC: bezieht sich auf Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie.
psig: bezieht sich auf „pounds per square inch gage".
DO: bezieht sich auf gelösten Sauerstoff („dissolved oxygen").
RO: bezieht sich auf Revers-Osmose.
SLM: bezieht sich auf Standard-Liter pro Minute.
VVM: bezieht sich auf Volumen pro Minute.
OUR: bezieht sich auf Sauerstoff-Aufnahmerate („oxygen uptake rate").

Wenn Lösungsmittelgemische verwendet werden, sind die Verhältnisse verwendeter Lösungsmittel Volumen/Volumen (V/V).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Im Allgemeinen betrifft die Erfindung 7β,11α-Dihydroxysteroide und Verfahren für ihre Herstellung. Verbindungen dieser Erfindung können bei der Herstellung von Eplerenon verwendet werden. Schema I illustriert ein mögliches Verfahren zur Verwendung eines 7β,11α-Dihydroxysteroids, um Eplerenon herzustellen.
Bezug nehmend auf Schema I kann Intermediat 2 hergestellt werden durch Zugeben von Hexamethyldisilazan (HMDS) (100 ml) zu einer gerührten Aufschlämmung von 50,0 g Triol 1 in 400 ml Methylenchlorid. Saccharin (0,57 g) wird dann zugegeben, und das Gemisch wird unter Rückfluss 3 Stunden lang erwärmt, während welcher Zeit die Aufschlämmung sich schrittweise zu einer klaren, bernsteinfarbenen Lösung auflösen wird. Wasser (5 ml) wird zugegeben, um irgendwelches überschüssiges HMDS zu quenchen. Nach 5 Minuten bei Rückfluss wird das Gemisch durch eine CH₂Cl₂-nasse Schicht aus 32,6 g Magnesol auf einem 350 ml-Grobfrittenfiltertrichter filtriert. Das Filtrat sollte klar und nahezu farblos sein. Der Filterkuchen wird mit 2 × 100 ml CH₂Cl₂ gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden unter reduziertem Druck filtriert und verbleibendes Methylenchlorid wird entfernt durch Evaporieren mit 2 × 500 ml Portionen Tetrahydrofuran (THF), Konzentrieren zur Trockene nach jeder Zugabe, um einen weißen Feststoff zu ergeben.
Eine Suspension von Kalium-t-butoxid (42,0 g) in 500 ml THF wird mit einem Eis/Methanol-Bad auf –9° ± 5°C abgekühlt. Acetylen wird mit moderatem Rühren für wenigstens 1 Stunde knapp unter der Oberfläche in die Mischung geperlt. Das silylierte Steroid-Intermediat von oben in THF (400 ml) wird über 30 min. zugegeben, während eine Reaktionstemperatur von 0° ± 5°C aufrechterhalten wird. Nach der Zugabe wird das Gemisch eine weitere Stunde lang bei 5° ± 5°C gerührt. Wasser (100 ml) wird langsam zugegeben, was dem Reaktionsgemisch erlaubt, sich auf 15° ± 5°C zu erwärmen. 125 ml 10% HCl werden langsam zugegeben, um den pH auf 2,5 bis 3 zu erniedrigen. Das Gemisch wird bei pH 2,5 bis 3 1 bis 2 Stunden bei 20°C ± 5°C gerührt, wobei kleine Mengen 5%-iger HCl, wie erforderlich, um einen pH von 2,5 bis 3 beizubehalten, zugegeben werden. Wenn die Hydrolyse komplett ist, wird halbgesättigte NaHCO₃-Lösung zugeben, um den pH auf 5,5 bis 6 zu erhöhen. Das Gemisch wird mit Ethylacetat (500 ml) verdünnt und die Phasen getrennt. Die wässrige Phase wird mit Ethylacetat extrahiert und die vereinigten Ethylacetatphasen werden mit Wasser, Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und konzentriert, um das Additionsprodukt 2 zu ergeben.
Das Intermediat 2 kann durch Auflösen von Tetraol 2 (50,00 g, 144 mmol) in Pyridin (150 ml) und Abkühlen des resultierenden Gemisches auf < 10°C in einem Eisbad acyliert werden. Dimethylaminopyridin (DMAP) (1,7 g, 14 mmol) wird zugegeben, gefolgt von langsamer Zugabe von Essigsäureanhydrid (41,4 ml, 439 mmol) bei einer Rate, um die Lösungstemperatur unterhalb von 10°C beizubehalten. Auf die Zugabe folgend wird das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmt. Das Gemisch wird mit Ethylacetat (75 ml) und Wasser (50 ml) verdünnt, 5 Minuten lang gerührt und die Schichten bzw. Phasen werden getrennt. Die organische Phase wird mit 10% HCl (4 × 25 ml), gefolgt von H₂O (2 × 50 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und konzentriert. Das Produkt wird aus Toluol (100 ml) umkristallisiert.
Hydroformylierung des acylierten Intermediats 3 kann produziert werden durch Erwärmen von Verbindung 3 (25,4 g, 54 mmol) mit PPh₃ (2,13 g, 8,1 mmol) und Rh₂(OAc)₄ (716 mg, 1,62 mmol) in Ethylacetat (200 ml) auf etwa 80°C unter einem 1/1-Gemisch von Wasserstoff/Kohlenmonoxid bei einem Druck von 170 psi für 12 Stunden. Das Gemisch wird unter reduziertem Druck konzentriert und das Produkt 4 durch Säulenchromatographie (70/30 EtOAc/Hex und 500 g Silica) gereinigt.
Oxidation der Lactolverbindung 4 kann durch Mischen des Lactols 4 (25 g, 50 mmol), von Methylenchlorid (250 ml), Wasser (38 ml), 2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1oxyl (TEMPO) (156 mg, 1 mmol), KBr (595 mg, 5 mmol) und NaHCO₃ (5,5 g, 65 mmol) und Abkühlen des Gemisches auf ≤ 10°C in einem Eisbad erreicht werden. Eine Lösung von 1,1 M Natriumhypochlorit (NaOCl) (50 ml, 55 mmol) wird langsam zugegeben. Das Gemisch wird auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und mit Wasser (50 ml) verdünnt. Die Phasen werden getrennt und die organische Phase mit Salzlösung (2 × 50 ml) gewaschen. Die organische Phase wird mit MgSO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert, um 5 als einen cremefarbenen Schaum hervorzubringen.
Das Erwärmen eines Gemisches des Triacetats 5 (2,0 g), von Pd(dppp)Br₂ (126 mg), Diisopropylamin (0,78 ml), Et₄NBr (260 mg), NaBr (1,09 g) in 20 ml Methanol unter 1200 psi CO bei 65°C für zwölf Stunden, gefolgt von Kühlen, Konzentrieren und Chromatographieren des Rückstands an Silicagel mit 40–75% Ethylacetat/Hexan ergibt den Methylester 6.
Eine Lösung des Diacetylesters 6 (5,01 g) in 0,15 N Kaliumcarbonat in Methanol (50 ml) wird bei Raumtemperatur gerührt und die Reaktion mittels TC überwacht. Wenn das Ausgangsmaterial 6 nicht mehr detektiert wird, wird das Gemisch mit Wasser (200 ml) verdünnt und mit Ethylacetat (3 × 200 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser (100 ml), Salzlösung (100 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und bei reduziertem Druck zur Trockene konzentriert. Der Rückstand wird chromatographiert über Silicagel mit Ethylacetat/Hexan ergibt die 3-Hydroxyverbindung 7.
Ein Gemisch des Alkohols 7 (6,0 g), von CH₂Cl₂ (40 ml), Wasser (9,0 ml), 2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-oxyl (TEMPO) (38 mg), KBr (142 mg) und Natriumbicarbonat (4,0 g) wird auf 5°C abgekühlt. Zu diesem Gemisch werden langsam 14,1 ml 1,1 M NaOCl zugegeben. Nach der Zugabe wird das Gemisch eine zusätzliche Stunde lang rühren gelassen und mit verdünnter HCl angesäuert. Das Produkt 8 wird mit CH₂Cl₂ isoliert.
Eine Lösung der Verbindung 8 (5,01 mg) in 0,15 N Kaliumcarbonat in Methanol (50 ml) wird bei Raumtemperatur gerührt und die Reaktion mit DC überwacht. Wenn das Ausgangsmaterial 8 nicht mehr detektiert wird, wird das Gemisch mit Wasser (200 ml) verdünnt und mit Ethylacetat (3 × 200 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser (100 ml), Salzlösung (100 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und bei reduziertem Druck zur Trockene konzentriert. Der Rückstand wird über Silicagel mit Ethylacetat/Hexan chromatographiert, um Verbindung 9 zu ergeben.
PCl₅ (1,08 g) wird zu einer Lösung der Verbindung 9 in THF bei –51°C gegeben, was in einer Temperaturerhöhung auf –48°C resultiert. Nach 2 Stunden wird das Gemisch in wässriges NaHCO₃ gegossen und mit EtOAc extrahiert und konzentriert. Das Material wurde auf Silicagel mit EtOAc/Hexan chromatographiert, um die Dienverbindung 10 hervorzubringen.
Eperlenon wird durch Epoxidierung von Verbindung 10 mittels bekannter Verfahren, beschrieben beispielsweise in US-Patent Nrn. 4 559 332 und 5 981 744, deren Inhalte in ihrer Gesamtheit mittels Referenz hierin inkorporiert sind, hergestellt.
Bezug nehmend auf Diagramm A können Androst-5-en-17-on-Verbindungen der Formel (I) über Pilz-Reaktionen in unterschiedliche Steroid-Intermediate umgewandelt werden. Beispielsweise erzeugt In-Kontakt-Bringen von Androst-5-en-17-on-Verbindungen der Formel (I), wo Z₁-Z₂ entweder eine Einfachbindung oder eine Dop pelbindung ist, mit Diplodia gossypina 7β-Hydroxyandrost-5-en-17-on-Verbindungen der Formel (II). 11α-Hydroxyandrost-5-en-17-on-Verbindungen der Formel (III) werden erzeugt durch In-Kontakt-Bringen von Androst-5-en-17-on-Verbindungen der Formel (I), wo Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, mit Aspergillus ochraceus. Überraschenderweise erzeugt das In-Kontakt-Bringen von 11α-Hydroxyandrost-5-en-17-on-Verbindungen der Formel (III) mit Diplodia gossypina nicht die 7β,11α-Dihydroxyandrost-5-en-17-on-Verbindungen der Formel (IV), wohingegen das In-Kontakt-Bringen von 7β-Hydroxyandrost-5-en-17-on-Verbindungen der Formel (II), wo Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, mit Aspergillus ochraceus 7β,11α-Dihydroxyandrost-5-en-17-on-Verbindungen der Formel (IV) produziert. Unerwartet produziert das In-Kontakt-Bringen von Androst-5-en-17-on-Verbindungen der Formel (I), wo Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, mit Absidia coerulea direkt 7β,11α-Dihydroxyandrost-5-en-17-on-Verbindungen der Formel (IV).
DIAGRAMM A
Die Fadenpilz-Reaktanten gehören zu den Genera Dipodia (Synonyme Botryodiplodia, Lasiodiplodia), Aspergillus und Absidia coerulea und werden im Allgemeinen durch eine primäre und eine sekundäre vegetative Impfstufe hergestellt. Das sekundäre Impfgut wird verwendet, um die Steroid-Bioumwandlungsstufe anzuimpfen.
Die hierein offenbarten Verfahren können verwendet werden, um Steroidverbindungen der Formel (I), (II), (III) und (IV) herzustellen, die als Intermediate für die Herstellung von pharmazeutisch aktiven Steroiden, wie zum Beispiel Aldosteronrezeptor-Antagonisten verwendbar sind. Zusätzlich ist 5-Androsten-3β,7β-diol-17-on (Formel II, worin R₃ ein Wasserstoff ist und R₁₇ und R₁₈ zusammen ein Keton sind und Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist) ein attraktives Intermediat für die Synthese von 5-Androsten-3β-ol-7,17-dion, einem kommerziell erhältlichen Steroid-Supplement, bei dem postuliert worden ist, dass es nützliche Effekte auf Herzerkrankungen, Immunfunktion, Altern und allgemeines Wohlbefinden aufweist.
Detaillierte Beschreibung des 7b-Hydroxylierungsschritts
Steroidverbindungen der Formel (I), wo Z₁-Z₂ eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung ist, werden mikrobiologisch an der 7-Position hydroxyliert, um Steroidverbindungen der Formel (II) zu erzeugen, wo Z₁-Z₂ eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung ist.
Jeder filamentöse Pilz bzw. Fadenpilz vom Genus Diplodia, Botryodiplodia oder Lasiodiplodia, fähig zum 7β-Hydroxylieren von Steroiden der Formel (I), kann in dem Erfindungsverfahren verwendet werden. Vorzugsweise werden Diplodia gossypina ATCC 20571 (Synonym Botryodiplodia theobromae IFO 6469) oder Botryodiplodia malorum ATCC 24444 (Synonym CBS 134.50) verwendet. Bevorzugter wird Diplodia gossypina ATCC 20571 (Synonym Botroydiplodia theobromae IFO 6469) verwendet.
Die Pilz-Hydroxylase kann in der Form einer aktiv wachsenden Kultur, eines Konzentrats ganzer Zellen oder eines zellfreien Extraktes eingesetzt werden. Vorzugweise wird der Pilz in Flüssigkultur unter aeroben Bedingungen unter Verwendung eines beliebigen im Fachgebiet anerkannten Verfahrens kultiviert und die 7β-Hydroxylierungsreaktion in situ durchgeführt.
Der gewünschte Pilz kann kultiviert werden unter Bedingungen, dargelegt in BEISPIELEN 1 und 2 unter Verwendung der angegebenen Inhaltsstoffe, oder anderer geeigneter Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Im Allge meinen wird eine Prozedur mit primärem und sekundärem vegetativem Impfgut bei der Herstellung für die Pilz-7β-Hydroxylierung verwendet. Alternativ kann ein primäres vegetatives Impfgut direkt verwendet werden, um Bioumwandlungsmedien anzuimpfen.
Primäre vegetative Impfkulturen können über einen Zeitraum von etwa 24 bis etwa 96 Stunden (vorzugsweise etwa 48–72 Stunden) bei einer Temperatur zwischen etwa 20'' und etwa 37° (vorzugsweise etwa 28°) und einem pH zwischen etwa 3,0 und etwa 7,5 inkubiert werden. Sekundäres vegetatives Impfgut-Medium wird mit etwa 0,006% bis etwa 0,1% (V/V) primärer vegetativer Impfkultur, jedoch typischerweise etwa 0,012% (V/V) angeimpft und über einen Zeitraum von etwa 36 bis etwa 72 Stunden (vorzugsweise etwa 60 Stunden) bei einer Temperatur zwischen etwa 20° und etwa 37° (vorzugsweise etwa 28°) inkubiert. Der pH des Sekundär-Impfgutmediums kann zwischen etwa 2,5 und etwa 7,0 sein, jedoch vorzugsweise zwischen etwa 3,0 und etwa 5,0. Das Bioumwandlungsmedium, welches das gleiche wie das sekundäre vegetative Impfgutmedium sein kann oder ähnlich dazu sein kann, wird mit etwa 1% bis etwa 10% (V/V) sekundärer vegetativer Impfkultur (vorzugsweise etwa 3% bis etwa 5%) angeimpft. Nach einem anfänglichen Inkubationszeitraum von etwa 12 bis etwa 72 Stunden (vorzugsweise etwa 16 bis etwa 24 Stunden) werden Steroidsubstrate der Formel (I), vorzugsweise mikronisiert, zu der Bioumwandlungskultur zugegeben. Mikronisierte Steroidsubstrate der Formel (I) können als ein trockenes Pulver oder eine wässrige Aufschlämmung, entweder als Einzelzugabe, eine Reihe von Zugaben oder eine kontinuierliche Zuführung, zugegeben werden. Es ist bevorzugt, die mikronisierten Steroidsubstrate der Formel (I) bei einer Konzentration größer als 1 g/l, bevorzugter größer als 2,5 g/l, noch stärker bevorzugt größer als 5 g/l, zu verwenden. Die biologische Umwandlung von Steroidsubstraten der Formel (I), um entsprechend 7β-hydroxylierte Produkte der Formel (II) zu bilden, wird zwischen etwa 2 und etwa 6 Tage lang, jedoch typischerweise etwa 3 bis etwa 4 Tage lang, fortschreiten gelassen.
Die Rate und das Ausmaß von 7β-Hydroxylierung kann in großem Ausmaß verbessert werden durch: (i) Kultivieren des ausgewählten Pilzes und Durchführen der biologischen Stoffumwandlung bzw. Bioumwandlung in Gegenwart eines Detergens. Das Detergens kann ausgewählt sein aus der Gruppe, bestehend aus nicht-ionischen Detergentien, jedoch vorzugsweise den Untergruppen, bestehend aus ethoxylierten Al kylphenolen und Polyoxyethylensorbitanestern. Bevorzugter wird Polyoxyethylensorbitanmonooleat verwendet; (ii) Kultivieren des ausgewählten Pilzes und Durchführen der biologischen Stoffumwandlung in Gegenwart eines natürlichen Öls. Das natürliche Öl kann ausgewählt sein aus, ist jedoch nicht beschränkt auf, der/die Gruppe bestehend aus Rizinusöl, Maiskeimöl, Baumwollsamenöl, Schweineschmalzöl, Leinsamenöl, Olivenöl, Erdnussöl, Rapssamenöl, Distelsamenöl, Sojabohnenöl, Sonnenblumensamenöl und Weizenkeimöl. Vorzugsweise wird Sojabohnenöl verwendet; (iii) Verwenden einer Kombination der in (i) und (ii) identifizierten Methodologien.
Sobald die biologische Umwandlung von Steroidsubstraten der Formel (I) zu 7β-hydroxylierten Produkten der Formel (II) abgeschlossen ist, können Verbindungen der Formel (II) unter Verwendung irgendeines einer Anzahl im Fachgebiet anerkannter Verfahren isoliert werden. Vorzugsweise werden filtrierte oder zentrifugierte Bierfeststoffe unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels wie zum Beispiel Methanol, Aceton, Butylacetat oder Methylenchlorid extrahiert und wird das 7β-hydroxylierte Produkt der Formel (II) mittels Kristallisation isoliert. Die Kristallisationslösungsmittel schließen ein Lösungsmittel ein, ausgewählt aus, jedoch nicht beschränkt auf, der/die Gruppe bestehend aus Wasser, Methanol, Aceton, Butylacetat, Methylenchlorid oder Kombinationen davon. Das bevorzugte Extraktions- und Kristallisationslösungsmittel für das 7β-hydroxylierte Produkt von Formel (II) ist Methylenchlorid.
Detaillierte Beschreibung des 11α-Hydroxylierungsschritts
Steroidverbindungen der Formel (I) oder (II), wo Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, werden mikrobiologisch an der 11-Position hydroxyliert, um Steroidverbindungen der Formel (III) bzw. (IV) herzustellen.
Jeder filamentöse Pilz des Genus Aspergillus, fähig zum 11α-Hydroxylieren von Steroiden der Formel (I) oder (II), wo Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, kann in dem Erfindungsprozess verwendet werden. Vorzugsweise wird Aspergillus ochraceus ATCC 18500 (Synonym NRRL 405) verwendet.
Die Pilz-Hydroxylase kann in der Form einer aktiv wachsenden Kultur, eines Ganzzellkonzentrats oder eines zellfreien Extraktes eingesetzt werden. Vorzugsweise wird der Pilz in Flüssigkeitskultur unter aeroben Bedingungen unter Verwendung eines beliebigen, im Fachgebiet anerkannten Verfahrens kultiviert und wird die 11α-Hydroxylierungsreaktion in situ durchgeführt.
Der gewünschte Pilz kann kultiviert werden unter Bedingungen, dargelegt in BEISPIELEN 3 und 4, unter Verwendung der angegebenen Inhaltsstoffe oder anderer geeigneter Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Im Allgemeinen wird eine Prozedur mit primärem und sekundärem vegetativem Impfgut bei der Zubereitung für die Pilz-11α-Hydroxylierung verwendet. Alternativ kann ein primäres vegetatives Impfgut direkt verwendet werden, um die Bioumwandlungsmedien anzuimpfen.
Primäre vegetative Impfkulturen können über einen Zeitraum von etwa 24 bis etwa 96 Stunden (vorzugsweise etwa 48–72 Stunden) bei einer Temperatur zwischen etwa 20° und etwa 37° (vorzugsweise etwa 28°) und einem pH zwischen etwa 3,0 und etwa 7,5 inkubiert werden. Sekundäres vegetatives Impfgut-Medium wird mit etwa 0,006% bis etwa 0,1% (V/V) primärer vegetativer Impfkultur, jedoch typischerweise etwa 0,012% (V/V), angeimpft und über einen Zeitraum von etwa 36 bis etwa 72 Stunden (vorzugsweise etwa 60 Stunden) bei einer Temperatur zwischen etwa 20° und etwa 37° (vorzugsweise etwa 28°) inkubiert. Der pH des Sekundär-Impfgutmediums kann zwischen etwa 2,5 und etwa 7,0 sein, jedoch vorzugsweise zwischen etwa 3,0 und etwa 5,0. Das Bioumwandlungsmedium, welches das gleiche wie das sekundäre vegetative Impfgutmedium sein kann oder ähnlich dazu sein kann, wird mit etwa 1% bis etwa 10% (V/V) sekundärer vegetativer Impfkultur (vorzugsweise etwa 3% bis etwa 5%) angeimpft. Nach einem anfänglichen Inkubationszeitraum von etwa 12 bis etwa 72 Stunden (vorzugsweise etwa 16 bis etwa 24 Stunden) werden Steroidsubstrate der Formel (I) oder der Formel (II), wo Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, zu der Bioumwandlungskultur gegeben. Vorzugsweise sind die Substrate mikronisiert. Mikronisierte Steroidsubstrate der Formel (I) oder (II), wo Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, können als ein trockenes Pulver oder eine wässrige Aufschlämmung, entweder als Einzelzugabe, eine Reihe von Zugaben oder eine kontinuierliche Zuführung, zugegeben werden. Es ist bevorzugt, die mikronisierten Steroidsubstrate der Formel (I) oder (II), wo Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, bei einer Konzentration größer als 1 g/l, bevorzugter größer als 2,5 g/l, noch stärker bevorzugt größer als 5 g/l, zu verwenden. Die biologische Umwandlung der Steroidsubstrate der Formel (I) oder (II), wo Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, um 11α-hydroxylierte Produkte der Formel (III) bzw. (IV) zu bilden, wird zwischen etwa 1 und etwa 6 Tage lang, jedoch typischerweise etwa 2 bis etwa 3 Tage lang, fortschreiten gelassen.
Die Rate und das Ausmaß an 11α-Hydroxylierung kann in großem Ausmaß verbessert werden durch: (i) Kultivieren des ausgewählten Pilzes und Durchführen der biologischen Umwandlung in Gegenwart eines Detergens. Das Detergens kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus nicht-ionischen Detergentien, jedoch vorzugsweise den Untergruppen, bestehend aus ethoxylierten Alkylphenolen und Polyoxyethylensorbitanestern. Bevorzugter wird Octylphenoxypolyethoxyethanol oder Nonlyphenoxypolyethoxyethanol verwendet; (ii) Kultivieren des ausgewählten Pilzes und Durchführen der biologischen Umwandlung in Gegenwart eines natürlichen Öls. Das natürliche Öl kann ausgewählt sein aus, ist jedoch nicht beschränkt auf, der/die Gruppe bestehend aus Rizinusöl, Maiskeimöl, Baumwollsamenöl, Schweineschmalzöl, Leinsamenöl, Olivenöl, Erdnussöl, Rapssamenöl, Distelsamenöl, Sojabohnenöl, Sonnenblumensamenöl und Weizenkeimöl. Vorzugsweise wird Sojabohnenöl verwendet; (iii) Verwenden einer Kombination der in (i) und (ii) identifizierten Methodologien.
Sobald die biologische Umwandlung von Steroidsubstraten der Formel (I) oder (II), wo Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, zu 11α-hydroxylierten Produkten der Formel (III) oder (IV) abgeschlossen ist, können Verbindungen der Formel (III) oder (IV) unter Verwendung irgendeines einer Anzahl im Fachgebiet anerkannter Verfahren isoliert werden. Vorzugsweise werden filtrierte oder zentrifugierte Bierfeststoffe oder Gesamtbiere unter Verwendung eines wassermischbaren organischen Lösungsmittels wie zum Beispiel Methanol oder Aceton bei Temperaturen von bis zu 15°C niedrig oder bis zu 55°C hoch extrahiert. Die bevorzugte Extraktionstemperatur ist etwa 45–50°C. Das rohe 11α-hydroxylierte Produkt der Formel (III) oder (IV) wird erzeugt durch evaporative Kristallisation, um das organische Lösungsmittel zu entfernen, und Abkühlen. Das bevorzugte Extraktionslösungsgemisch ist 80–85% Aceton/15–20% Wasser. Die eingesetzte wässrige Flüssigkeit wird verworfen.
Rohes kristallines 11α-hydroxyliertes Produkt der Formel (III) oder (IV) wird gereinigt durch Kohlenstoffbehandlung und Kristallisation. Es ist bevorzugt, dass die Kohlenstoff-Behandlung und nachfolgende Kristallisation unter Verwendung eines wassermischbaren Lösungsmittels, ausgewählt aus, aber nicht beschränkt auf, der/die Gruppe bestehend aus Methanol oder Aceton, ausgeführt wird. Das bevorzugte Lösungsmittel für Kohlenstoffbehandlung/Kristallisation ist Methanol. Nach dem Entfernen von Kohlenstoff bzw. Kohle mittels Filtration wird die Kristallisation durch Evaporieren des Lösungsmittels und Kühlen durchgeführt.
Verbindungen der Formel (I), wo Z₁-Z₂ eine Doppelbindung ist, können durch Eliminieren des 11α-Hydroxyls aus dem Produkt der Formel (III) unter Verwendung bekannter chemischer Verfahren hergestellt werden.
Detaillierte Beschreibung des 7β,11α-Dihydroxylierungsschritts
Steroidverbindungen der Formel (I), wo Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, werden in einem einzelnen Schritt mikrobiologisch an der 7- und 11-Position hydroxyliert, um Steroidverbindungen der Formel (IV) herzustellen.
Jeder filamentöse Pilz des Genus Absidia, fähig zum 7β,11α-Dihydroxylieren von Steroiden der Formel (I), wo Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, kann in dem Erfindungsverfahren verwendet werden. Vorzugsweise wird Absidia coerulea ATCC 6647 (Synonym Absidia orchidis) verwendet.
Die Pilz-Hydroxylase(n) kann/können in der Form einer aktiv wachsenden Kultur, eines Ganzzellkonzentrats oder eines zellfreien Extraktes verwendet werden. Vorzugsweise wird der Pilz in Flüssigkultur unter aeroben Bedingungen unter Verwendung irgendeines im Fachgebiet anerkannten Verfahrens kultiviert und die 7β,11α-Hydroxylierungsreaktionen werden in situ durchgeführt.
Der gewünschte Pilz kann kultiviert werden unter Bedingungen, dargelegt in BEISPIEL 5, unter Verwendung der angegebenen Inhaltsstoffe oder anderer geeigneter Kohlen stoff- und Stickstoffquellen, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Im Allgemeinen wird eine Prozedur mit primärem und sekundärem vegetativem Impfgut bei der Zubereitung für die Pilz-7β,11α-Dihydroxylierung verwendet. Alternativ kann ein primäres vegetatives Impfgut direkt verwendet werden, um Bioumwandlungsmedien anzuimpfen.
Primäre vegetative Impfkulturen können über einen Zeitraum von etwa 24 bis etwa 96 Stunden (vorzugsweise etwa 48–72 Stunden) bei einer Temperatur zwischen etwa 20° und etwa 37° (vorzugsweise etwa 28°) und einem pH zwischen etwa 3,0 und etwa 7,5 inkubiert werden. Sekundäres vegetatives Impfgut-Medium, welches das gleiche sein kann wie oder ähnlich sein kann zu das/dem primäres vegetatives Impfgut-Medium, wird mit etwa 0,006% bis etwa 0,1% (V/V) primärer vegetativer Impfkultur angeimpft, jedoch typischerweise etwa 0,012% (V/V), und über einen Zeitraum von etwa 36 bis etwa 96 Stunden (vorzugsweise etwa 70 bis 80 Stunden) bei einer Temperatur zwischen etwa 20° und etwa 37° (vorzugsweise etwa 28°) inkubiert. Der pH des sekundären Impfgut-Mediums kann zwischen etwa 2,5 und etwa 7,0 sein, jedoch vorzugsweise zwischen etwa 3,0 und etwa 7,0. Das Bioumwandlungsmedium, welches das gleiche wie das sekundäre vegetative Impfgutmedium sein kann oder ähnlich dazu sein kann, wird mit etwa 1% bis etwa 10% (V/V) sekundärer vegetativer Impfkultur (vorzugsweise etwa 3% bis etwa 5%) angeimpft. Nach einem anfänglichen Inkubationszeitraum von etwa 12 bis etwa 72 Stunden (vorzugsweise etwa 15 bis etwa 24 Stunden) werden Steroidsubstrate der Formel (I), wo Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, zu der Bioumwandlungskultur gegeben. Vorzugsweise sind die Substrate mikronisiert. Mikronisierte Steroidsubstrate der Formel (I), wo Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, können als ein trockenes Pulver oder eine wässrige Aufschlämmung, entweder als eine Einzelzugabe, eine Reihe von Zugaben oder eine kontinuierliche Zuführung, zugegeben werden. Es ist bevorzugt, die mikronisierten Steroidsubstrate der Formel (I), wo Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, bei einer Konzentration größer als 1 g/l, bevorzugter größer als 2,5 g/l, noch stärker bevorzugt größer als 5 g/l, zu verwenden. Die biologische Umwandlung von Steroidsubstraten der Formel (I), wo Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, um 11α-hydroxylierte Produkte der Formel (IV) zu bilden, wird zwischen etwa 2 und etwa 9 Tage lang, jedoch typischerweise etwa 5 bis etwa 7 Tage lang, fortschreiten gelassen. Sobald die biologische Umwandlung der Steroidsubstrate der Formel (I), wo Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, zu 7β,11α-dihydroxylierten Produkten der Formel (IV) abgeschlossen ist, können Verbindungen der Formel (IV) unter Verwendung irgendeines einer Anzahl von im Fachgebiet anerkannter Verfahren isoliert werden. Vorzugsweise werden filtrierte oder zentrifugierte Bierfeststoffe oder Gesamtbiere unter Verwendung eines wassermischbaren organischen Lösungsmittels wie zum Beispiel Methanol oder Aceton bei Temperaturen von bis zu etwa 15°C niedrig oder bis zu etwa 55°C hoch extrahiert. Die bevorzugte Extraktionstemperatur ist etwa 45–50°C. Das rohe 7β,11α-dihydroxylierte Produkt der Formel (IV) wird durch evaporative Kristallisation, um das organische Lösungsmittel zu entfernen, und Abkühlen erzeugt. Das bevorzugte Extraktionslösungsmittelgemisch ist 80% Aceton/20% Wasser. Die eingesetzte wässrige Flüssigkeit wird verworfen.
Rohes kristallines 7β,11α-dihydroxyliertes Produkt der Formel (IV) wird gereinigt durch ein Methylenchlorid-Verreiben, um ungewünschte Verunreinigungen zu entfernen, gefolgt von Kohlenstoffbehandlung und Kristallisation. Es ist bevorzugt, dass die Kohlenstoff Behandlung und nachfolgende Kristallisation unter Verwendung eines wassermischbaren Lösungsmittels, ausgewählt aus, aber nicht beschränkt auf, der/die Gruppe bestehend aus Methanol oder Aceton oder Gemischen, ausgeführt wird. Das bevorzugte Lösungsmittel für Kohlenstoffbehandlung/Kristallisation ist Methanol. Nach dem Entfernen von Kohlenstoff bzw. Kohle mittels Filtration wird die Produktkristallisation durch Evaporieren des Lösungsmittels und Kühlen erzielt.
BEISPIELE
Ohne weitere Erläuterungen wird angenommen, dass ein Fachmann unter Verwendung der voranstehenden Beschreibungen die vorliegende Erfindung in ihrem vollsten Ausmaß praktizieren kann. Die folgenden detaillierten Beispiele beschreiben die Herstellung der verschiedenen Verbindungen und/oder Durchführungen der verschiedenen Verfahren der Erfindung und sollen als lediglich veranschaulichend ausgelegt werden und nicht als Beschränkungen der vorliegenden Offenbarung in irgendeiner Weise. Der Fachmann wird prompt geeignete Variationen von den Verfahren, sowohl was Reaktanten als auch Reaktionsbedingungen und -techniken betrifft, erkennen.
3β-Hydroxyandrost-5-en-17-on, auch als 5-Androsten-3β-ol-17-on bezeichnet, ist von Jiangsu Wujin Pharmaceuticals, ansässig in China, erhältlich.
BEISPIEL 1

Biologische Umwandlung von 5-Androsten-3β-ol-17-on (I, wobei R₃=Wasserstoff, R_17,18=Keton und Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, zu 5-Androsten-3β,7β-diol-17-on (II, wobei R₃=Wasserstoff, R_17,18=Keton und Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist)

Die Bioumwandlung von 5-Androsten-3β-ol-17-on zu 5-Androsten-3β,7β-diol-17-on wird unter Verwendung einer Flüssigkultur von Diplodia gossypina ATCC 20571 (Synonym Botryodiplodia theobromae IFO 6469) in einem 10-L-Fermentationsmaßstab durchgeführt.
(A) Primär-Impfgut-Stufe
Gefrorene vegetative Zellen von Diplodia gossypina ATCC 20571 werden aufgetaut, auf Kartoffel-Dextrose-Agar-Platten (PDA) (potato-dextrose-agar plates) transferiert und bei 28° 72 Stunden lang inkubiert. Einzelne Myzel-Pfropfen („plugs") (6–7 mm Durchmesser) werden verwendet, um siliconisierte 500 ml-„stippled" Schüttelkolben, enthaltend 100 ml Primär-Impfgut-Medium anzuimpfen. Primär-Impfgut-Medium besteht aus (pro Liter RO-Wasser): Dextrin, 50 g; Sojamehl, 35 g; Cerelose, 5 g; Cobaltchloridhexahydrat, 2 mg; Siliconentschäumer (SAG 471), 0,5 ml; Vorsterilisations-pH 7,0–7,2, eingestellt mit Natriumhydroxid (2N). Diplodia gossypina ATCC 20571 wird 48 Stunden lang bei 28° inkubiert, indem ein Inkubator-Schüttler mit kontrollierter Umgebung, eingestellt auf 280 UpM verwendet wird (1''-Kreisschlag).
(B) Sekundär-Impfgut-Stufe
Zehn Liter Sekundär-Impfgut-Fermentationen werden angeimpft unter Verwendung von 1,2 ml vegetativer Primär-Impfkultur (0,012% [V/V] Animpfrate). Sekundär-Impfgut-Medium enthält (pro Liter RO-Wasser): Cerelose, 60 g; Sojamehl, 25 g; Sojabohnenöl, 30 ml; Magnesiumsulfatheptahydrat, 1 g; Kaliumdihydrogenphosphat, 0,74 g; Polyoxyethylensorbitanmonooleat, 2ml; Siliconentschäumer (SAG 471), 0,5 ml; Vorsterilisations-pH 3,95–4,00, eingestellt mit konzentrierter Schwefelsäure. Die Fermentoren, die Sekundär-Impfgut-Medium enthalten, werden 20 Minuten lang bei 121° unter Verwen dung von sowohl Mantel- als auch Injektionsdampf sterilisiert. Die Bewegungsrate während Sterilisation ist 200 UpM. Nach Sterilisation wird der pH des Mediums unter Verwendung steriler Schwefelsäure (5%) auf 4,0 eingestellt. Diplodia gossypina ATCC 20571 wird bei 28° unter Verwendung der folgenden Ausgangsparameter inkubiert: Bewegung bzw. Schütteln, 100 UpM; Gegendruck = 5 psig; Luftfluss = 2,5 SLM (0,25 VVM); Niedrig-DO-Einstellpunkt, 30%, pH-Kontrolle, keine. Wenn der DO das erste Mal auf 30% absinkt, wird der Luftfluss auf 5 SLM erhöht (0,5 VVM). Wenn die Kultur wiederum niedrigen DO erreicht, werden 30% DO unter Verwendung von Bewegungskontrolle aufrechterhalten. Sekundär-Impfgut-Kulturen werden bei ungefähr 60 Stunden nach Animpfen, wenn die OUR zwischen etwa 10 und etwa 15 mM/l/h ist, geerntet.
(C) Steroid-Bioumwandlung
Zehn Liter Steroid-Bioumwandlungs-Fermentationen werden unter Verwendung von 500 ml vegetativer Sekundär-Impfkultur (5% [V/V] Animpfrate) angeimpft. Steroid-Bioumwandlungs-Medium ist das gleiche wie Sekundär-Impfgut-Medium. Sterilisationsbedingungen und pH-Einstellen sind wie für Sekundär-Impfgut-Medium beschrieben. Diplodia gossypina ATCC 20571 wird bei 28° unter Verwendung der im wesentlichen gleichen Anfangsparameter wie jene, die für Sekundär-Impfgut-Kultivierung verwendet werden, mit der Ausnahme inkubiert, dass der Niedrig-DO-Einstellpunkt von 30% auf 50% erhöht ist. Wenn der DO das erste Mal auf 50% absinkt, wird der Luftfluss auf von 2,5 SLM (0,25 VVM) auf 5 SLM erhöht (0,5 VVM) erhöht. Wenn die Kultur wiederum niedrigen DO erreicht, werden 50% DO unter Verwendung von Bewegungskontrolle aufrechterhalten. Beginnend bei 24 Stunden nach Animpfen wird mikronisiertes 5-Androsten-3β-ol-17-on, aufgeschlämmt in einem minimalen Volumen an 0,2% Polyoxyethylensorbitanmonooleat zu der Fermentation in 1-Stunden-Intervallen zugegeben, bis insgesamt 400 g zugegeben sind. Bei etwa 3 Tagen nach Animpfen werden der 10-L-Fermentation zusätzliche 100 g Cerelose zugesetzt.
Bioumwandlungs-Kulturen werden auf einer täglichen Basis unter Verwendung von DC auf 5-Androsten-3β,7β-diol-17-on untersucht. Ein Milliliter Gesamtbier wird mit 10 ml Methanol extrahiert. Zellen werden von dem wässrigen Methanolgemisch mittels Zentrifugation (3.000 × g, 10 Minuten lang) abgetrennt, und einige Mikroliter auf eine DC- Platte appliziert. Die DC-Platte wird in Cyclohexan:Ethylacetat:Methanol (90:60:15) entwickelt und das Produkt durch Sprühen der DC mit 50% Schwefelsäure, gefolgt von Ankohlen in einem Ofen, visualisiert. Das Produkt wird mit authentischem Standard verglichen, welcher beim Besprühen mit 50% Schwefelsäure blau wird. Bioumwandlung von 5-Androsten-3β-ol-17-on in 5-Androsten-3β,7β-diol-17-on ungefähr 4 Tage nach Animpfen vollständig.
(D) Isolationsverfahren
Das Gesamtbier wird bei der Ernte zentrifugiert und die reichen Feststoffe werden mittels Zentrifugation zurückgewonnen. Die reichen Feststoffe werden mit 10 Litern Methylenchlorid extrahiert und der reiche Extrakt wird mittels Zentrifugation zurückgewonnen. Der Extrakt wird verfeinert („polished") und auf etwa 1 Liter mittels Destillation konzentriert und die Kristallaufschlämmung wird auf –10°C abgekühlt. Die Kristalle werden mittels Filtration zurückgewonnen, mit kaltem Methylenchlorid gewaschen, um Farbe zu entfernen, und getrocknet, um 227 Gramm gereinigtes kristallines 5-Androsten-3β,7β-diol-17-on zu ergeben.
BEISPIEL 2

Biologische Umwandlung von 5,9(11)-Androstadien-3β-ol-17-on (I, wobei R₃=Wasserstoff, R_17,18=Keton und Z₁-Z₂ eine Doppelbindung ist, zu 5,9(11)-Androstadien-3β,7β-diol-17-on (II, wobei R₃=Wasserstoff, R_17,18= Keton und Z₁-Z₂ eine Doppelbindung ist)

Die Bioumwandlung von 5,9(11)-Androstadien-3β-ol-17-on zu 5,9(11)-Androstadien-3β,7β-diol-17-on wird unter Verwendung einer Flüssigkultur von Diplodia gossypina ATCC 20571 (Synonym Botryodiplodia theobromae IFO 6469) bei einer 10-L-Fermentationsskala durchgeführt.
(A) Primär-Impfgut-Stufe
Primär-Impfkulturen werden wie in BEISPIEL 1 beschrieben hergestellt.
(B) Sekundär-Impfgut-Stufe
Zehn Liter Sekundär-Impfkulturen werden wie in BEISPIEL 1 beschrieben hergestellt.
(C) Steroid-Bioumwandlung
Zehn Liter Steroid-Bioumwandlungs-Kulturen werden wie in BEISPIEL 1 beschrieben hergestellt. Bei etwa 24 Stunden nach Animpfen werden 120 g mikronisiertes 5,9(11)-Androstadien-3β-ol-17-on, aufgeschlämmt in einem minimalen Volumen an 0,2% Polyoxyethylensorbitanmonooleat zu der 10-L-Fermentation gegeben.
Bioumwandlungs-Kulturen werden auf einer täglichen Basis auf 5,9(11)-Androstadien-3β,7β-diol-17-on unter Verwendung der in BEISPIEL 1 beschriebenen Vorgehensweise untersucht. Bioumwandlung von 5,9(11)-Androstadien-3β-ol-17-on in 5,9(11)-Androstadien-3β,7β-diol-17-on ist ungefähr 3 Tage nach Animpfen vollständig.
(D) Isolationsverfahren
Die reichen Feststoffe von dem Gesamtbier werden mittels Zentrifugation gewonnen. Die Flüssigbierphase wird unter Verwendung von 15 Litern Methylenchlorid extrahiert. Nach dem Absetzen wird die obere eingesetzte Bierschicht dekantiert und verworfen. Das verbleibende reiche Methylenchlorid wird dann verwendet, um die reichen Feststoffe zu extrahieren. Der resultierende reiche Methylenchloridextrakt wird von den eingesetzten Feststoffen abgelassen, verfeinert, mittels Destillation auf etwa 0,5 Liter konzentriert und auf –10°C abgekühlt. Die erhaltenen Kristalle werden mittels Filtration gewonnen, mit n-Butylacetat gewaschen, um Farbe zu entfernen, und getrocknet, um 52,2 Gramm gereinigtes kristallines 5,9(11)-Androstadien-3β,7β-diol-17-on zu ergeben.
BEISPIEL 3

Biologische Umwandlung von 5-Androsten-3β-ol-17-on (I, wobei R₃=Wasserstoff, R_17,18=Keton und Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, zu 5-Androsten-3β,11α-diol-17-on (II, wobei R₃=Wasserstoff, R_17,18=Keton und Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist)

Die Bioumwandlung von 5-Androsten-3β-ol-17-on zu 5-Androsten-3β,11α-diol-17-on wird unter Verwendung einer Submerskultur von Aspergillus ochraceus ATCC 18500 (Synonym NRRL 405) bei einem 10-L-Fermentationsmaßstab durchgeführt.
(A) Primär-Impfgut-Stufe
Primär-Impfkulturen von Aspergillus ochraceus ATCC 18500 werden wie für Diplodia gossypina ATCC 20571 in BEISPIEL 1 beschrieben hergestellt.
(B) Sekundär-Impfgut-Stufe
Zehn Liter Sekundär-Impfgut-Fermentationen werden unter Verwendung von 1,2 ml vegetativer Primär-Impfkultur (0,012% [V/V] Animpfrate) angeimpft. Sekundär-Impfgut-Medium enthält (pro Liter RO-Wasser): Cerelose, 40 g; Sojamehl, 25 g; Sojabohnenöl, 30 ml; Magnesiumsulfatheptahydrat, 1 g; Kaliumdihydrogenphosphat, 0,74 g; Nonlyphenoxypolyetehoxyethanol, 0,25 ml; Siliconentschäumer (SAG 471), 0,5 ml; Vorsterilisations-pH 3,95–4,00, eingestellt mit konzentrierter Schwefelsäure. Die Fermentoren, die Sekundär-Impfgut-Medium enthalten, werden 20 Minuten lang bei 121° unter Verwendung von sowohl Mantel- als auch Injektionsdampf sterilisiert. Die Schüttelrate während Sterilisation ist 200 UpM. Nach Sterilisation wird der pH des Mediums unter Verwendung steriler Schwefelsäure (5%) auf 4,0 eingestellt. Aspergillus ochraceus ATCC 18500 wird bei 28° unter Verwendung der folgenden Ausgangsparameter inkubiert: Schütteln, 100 UpM; Gegendruck = 5 psig; Luftfluss = 2,5 SLM (0,25 VVM); Niedrig-DO-Einstellpunkt, 50%, pH-Kontrolle, keine. Wenn der DO das erste Mal auf 50% absinkt, wird der Luftfluss auf 5 SLM erhöht (0,5 VVM). Wenn die Kultur wiederum niedrigen DO erreicht, werden 50% DO unter Verwendung von Bewegungskontrolle aufrechterhalten. Sekundär-Impfkulturen werden bei zwischen 50 und 54 Stunden nach Animpfen, wenn die OUR zwischen etwa 20 und etwa 26 mM/l/h ist, geerntet.
(C) Steroid-Bioumwandlung
Zehn Liter Steroid-Bioumwandlungs-Fermentationen werden unter Verwendung von 500 ml vegetativer sekundärer Impfkultur (5% [V/V] Animpfrate) angeimpft. Steroid-Bioumwandlungs-Medium ist im Wesentlichen das gleiche wie Sekundär-Impfgut- Medium, mit der Ausnahme, dass das Nonylphenoxypolyethoxyethanol von 0,25 ml/l auf 2 ml/l erhöht ist und der pH vor Sterilisation mit konzentrierter Schwefelsäure auf 2,95–3,00 eingestellt wird. Sterilisationsbedingungen sind wie für Sekundär-Impfgut-Medium beschrieben. Nach Sterilisation wird der Medium-pH unter Verwendung steriler Schwefelsäure (5%) auf 3,0 eingestellt. Aspergillus ochraceus ATCC 18500 wird unter Verwendung der im Wesentlichen gleichen Anfangsparameter wie jene verwendet, die für Sekundär-Impfgut-Kultivierung verwendet werden, bei 28° inkubiert, mit der Ausnahme, dass das Schütteln ursprünglich auf 200 UpM eingestellt ist. Bei etwa 18 Stunden nach Animpfung werden 200 g mikronisiertes 5-Androsten-3β-ol-17-on, aufgeschlämmt in einem minimalen Volumen an 0,2% Nonylphenoxypolyethoxyethanol zu der 10-L-Fermentation gegeben.
Bioumwandlungs-Kulturen werden auf einer täglichen Basis unter Verwendung von DC auf 5-Androsten-3β,11α-diol-17-on untersucht. Ein Milliliter Gesamtbier wird mit 19 ml Methanol extrahiert. Zellen werden von dem wässrigen Methanolgemisch mittels Zentrifugation (3.000 × g, 10 Minuten lang) getrennt und einige Mikroliter auf eine DC-Platte appliziert. Die DC-Platte wird in Cyclohexan:Ethylacetat:Methanol (90:60:15) entwickelt und das Produkt durch Besprühen der DC mit 50% Schwefelsäure, gefolgt von Ankohlen in einem Ofen, sichtbar gemacht. Bioumwandlung von 5-Androsten-3β-ol-17-on zu 5-Androsten-3β,11α-diol-17-on ist ungefähr 3 Tage nach Animpfen vollständig.
(D) Isolationsverfahren
Die Gesamtbierfeststoffe werden mittels Zentrifugation gewonnen. Die Flüssigkeit wird verworfen. Die reichen Feststoffe werden mit 10 Litern 85% Aceton/15% Wasser bei 45°C bis 50°C extrahiert und der reiche Extrakt mittels Zentrifugation zurückgewonnen. Der Extrakt wird mittels Destillation konzentriert, um Aceton zu entfernen, um eine wässrige Aufschlämmung von Rohkristallen zu erzeugen. Die Rohkristalle werden mittels Filtration zurückgewonnen und die Mutterlauge wird verworfen. Die wassernassen Rohkristalle werden in 700 Millilitern Methanol durch Erwärmen auf 55°C gelöst und dann mit 5 g Darco G-60-Kohlenstoff entfärbt. Nach Filtration, um Kohle zu entfernen, wird das Filtrat konzentriert, um das Produkt auszukristallisieren. Das Methanol wird ferner durch Zugeben von 300 ml n-Butylacetat und Konzentrieren zu einer dicken Kris tallaufschlämmung entfernt. Die Kristalle werden filtriert, mit n-Butylacetat gewaschen und getrocknet, um 174 Gramm gereinigtes kristallines 5-Androsten-3β,11α-diol-17-on zu ergeben.
BEISPIEL 4
Biologische Umwandlung von 5-Androsten-3β,7β-ol-17-on (II, wobei R₃=Wasserstoff, R_17,18=Keton und Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, zu 5-Androsten-3β,7β,11α-triol-17-on (IV, wobei R₃=Wasserstoff, R_17,18=Keton)
Die Bioumwandlung von 5-Androsten-3β,7β-ol-17-on zu 5-Androsten-3β,7β,11α-triol-17-on wird unter Verwendung einer Flüssigkultur von Aspergillus ochraceus ATCC 18500 (Synonym NRRL 405) in einem 10-L-Fermentationsmaßstab durchgeführt.
(A) Primär-Impfgut-Stufe
Primär-Impfkulturen von Aspergillus ochraceus ATCC 18500 werden wie in BEISPIEL 3 beschrieben hergestellt.
(B) Sekundär-Impfgut-Stufe
Zehn Liter Sekundär-Impfkulturen von Aspergillus ochraceus ATCC 18500 werden wie in BEISPIEL 3 beschrieben hergestellt.
(C) Steroid-Bioumwandlung
Zehn Liter Steroid-Bioumwandlungs-Kulturen von Aspergillus ochraceus ATCC 18500 werden wie in BEISPIEL 3 beschrieben hergestellt.
Bei etwa 18 Stunden nach Animpfung werden 200 g mikronisiertes 5-Androsten-3β,7β-diol-17-on, aufgeschlämmt in einem minimalen Volumen an 0,2% Nonylphenoxypolyethoxyethanol zu der 10-L-Fermentation gegeben.
Bioumwandlungs-Kulturen werden auf einer täglichen Basis unter Verwendung von DC auf 5-Androsten-3β,7β,11α-triol-17-on untersucht, wie in BEISPIEL 1 beschrieben. Bioumwandlung von 5-Androsten-3β,7β-diol-17-on zu 5-Androsten-3β,7β,11α-triol-17-on ist ungefähr 4 Tage nach Animpfen vollständig.
(D) Isolationsverfahren
Die Gesamtbierfeststoffe werden mittels Zentrifugation gewonnen. Die Flüssigkeit wird verworfen. Die reichen Feststoffe werden mit 10 Litern 80% Aceton/20% Wasser bei 45°C bis 50°C extrahiert und der warme Extrakt wird mittels Filtration aufgeklärt. Das reiche Filtrat wird mittels Destillation konzentriert, um Aceton zu entfernen, was eine wässrige Aufschlämmung von Rohkristallen erzeugt. Die Rohkristalle werden mittels Filtration gewonnen und die Mutterlauge wird verworfen. Die wassernassen Kristalle werden in 600 Millilitern Methylenchlorid verrieben, um Verunreinigungen zu entfernen, in 700 Millilitern Methanol (durch Erwärmen auf 55°C) gelöst und dann mit 5 g Darco G-60-Kohle entfärbt. Nach Filtration, um Kohle zu entfernen, wird das Filtrat konzentriert, um das Produkt auszukristallisieren. Das Methanol wird ferner durch Zugeben von 300 ml n-Butylacetat und Konzentrieren zu einer dicken Kristallaufschlämmung entfernt. Die Kristalle werden filtriert, mit n-Butylacetat gewaschen und getrocknet, um 158 Gramm gereinigtes kristallines 5-Androsten-3β,7β,11α-triol-17-on zu ergeben.
BEISPIEL 5

Biologische Umwandlung von 5-Androsten-3β-ol-17-on (I, wobei R₃=Wasserstoff, R_17,18=Keton und Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, zu 5-Androsten-3β,7βn,11α-triol-17-on (IV, wobei R₃=Wasserstoff, R_17,18=Keton)

Die Bioumwandlung von 5-Androsten-3β-ol-17-on zu 5-Androsten-3β,7β,11α-triol-17-on wird unter Verwendung einer Submerskultur von Absidia coerulea ATCC 6647 (Synonym Absidia orchidis) in einem 10-L-Fermentationsmaßstab durchgeführt.
(A) Primär-Impfgut-Stufe
Primär-Impfkulturen von Absidia coerulea ATCC 6647 werden wie für Diplodia gossypina ATCC 20571 in BEISPIEL 1 beschrieben hergestellt.
(B) Sekundär-Impfgut-Stufe
Zehn Liter Sekundär-Impfgut-Fermentationen werden unter Verwendung von 1,2 ml vegetativer Primär-Impfkultur (0,012% [V/V] Animpfrate) angeimpft. Sekundär-Impfgut-Medium enthält (pro Liter RO-Wasser): Dextrin, 50 g; Sojamehl, 35 g; Cerelose, 5 g; Cobaltchloridhexahydrat, 2 mg; Siliconentschäumer (SAG 471), 0,5 ml; Vorsterilisations-pH 4,95–5,00, eingestellt mit konzentrierter Schwefelsäure. Die Fermentoren, die Sekundär-Impfgut-Medium enthalten, werden 20 Minuten lang bei 121° unter Verwendung von sowohl Mantel- als auch Injektionsdampf sterilisiert. Die Schüttelrate während Sterilisation ist 200 UpM. Nach der Sterilisation wird der pH des Mediums unter Verwendung steriler Schwefelsäure (5%) auf 5,0 eingestellt. Absidia coerulea ATCC 6647 wird bei 28° unter Verwendung der folgenden Ausgangsparameter inkubiert: Schütteln, 100 UpM; Gegendruck = 5 psig; Luftfluss = 2,5 SLM (0,25 VVM); Niedrig-DO-Einstellpunkt, 50%, pH-Kontrolle, keine. Wenn der DO das erste Mal auf 30% absinkt, wird der Luftfluss auf 5 SLM erhöht (0,5 VVM). Wenn die Kultur wiederum niedrigen DO erreicht, werden 30% DO unter Verwendung von Bewegungskontrolle aufrechterhalten. Sekundär-Impfkulturen werden etwa 76 Stunden nach Animpfen geerntet, wenn die OUR zwischen etwa 4 und etwa 7 mM/l/h ist.
(C) Steroid-Bioumwandlung
Zehn Liter Steroid-Bioumwandlungs-Fermentationen werden unter Verwendung von 500 ml vegetativer sekundärer Impfkultur (5% [V/V] Animpfrate) angeimpft. Steroid-Bioumwandlungs-Medium enthält (pro Liter RO-Wasser): Dextrin, 50 g; Sojamehl, 35 g; Cerelose, 20 g; Siliconentschäumer (SAG 471), 0,5 ml; Vorsterilisations-pH 2,95–3,00, eingestellt mit konzentrierter Schwefelsäure. Sterilisationsbedingungen sind wie für Sekundär-Impfgut-Medium beschrieben. Nach Sterilisation wird der Medium-pH unter Verwendung steriler Schwefelsäure (5%) auf 3,0 eingestellt. Absidia coerulea ATCC 6647 wird bei 28° unter Verwendung der gleichen Anfangsparameter wie jener, die für Sekundär-Impfgut-Kultivierung verwendet werden, inkubiert. Bei etwa 17 Stunden nach Animpfung werden 200 g mikronisiertes 5-Androsten-3β-ol-17-on, aufgeschlämmt in einem minimalen Volumen an 0,2% Octylphenoxypolyethoxyethanol zu der 10-L-Fermentation gegeben.
Bioumwandlungs-Kulturen werden auf einer täglichen Basis unter Verwendung von DC, wie im BEISPIEL 1 beschrieben, auf 5-Androsten-3β,7β,11α-triol-17-on untersucht. Bioumwandlung von 5-Androsten-3β-ol-17-on zu 5-Androsten-3β,7β,11α-triol-17-on ist ungefähr 6–7 Tage nach Animpfen vollständig.
(D) Isolationsverfahren
Die Gesamtbierfeststoffe werden mittels Zentrifugation gewonnen. Die Flüssigkeit wird verworfen. Die reichen Feststoffe werden unter Verwendung von 10 Litern 85% Aceton/15% Wasser bei 45°C bis 50°C extrahiert und der warme Extrakt mittels Filtration aufgeklärt. Das reiche Filtrat wird durch Destillation konzentriert, um Aceton zu entfernen, was eine wässrige Aufschlämmung von Rohkristallen erzeugt. Die Kristallaufschlämmung wird filtriert und die Mutterlauge wird verworfen. Die wassernassen Kristalle werden in 600 Millilitern Methylenchlorid verrieben, um Verunreinigungen zu entfernen, in 700 Millilitern Methanol (durch Erwärmen auf 55°C) aufgelöst und dann mit 5 g Darco G-60-Kohle entfärbt. Nach Filtration, um Kohle zu entfernen, wird das Filtrat konzentriert, um das Produkt zu kristallisieren. Das Methanol wird durch Zugeben von 300 ml n-Butylacetat und Konzentrieren zu einer dicken Kristallaufschlämmung weiter entfernt. Die Kristalle werden filtriert, mit n-Butylacetat gewaschen und getrocknet, um 75,5 Gramm rohes kristallines 5-Androsten-3β,7β,11α-diol-17-on zu ergeben.
Die Rohkristalle werden in 600 Millilitern Methylenchlorid verrieben, um zusätzliche Verunreinigungen zu entfernen, in 700 Millilitern Methanol (durch Erwärmen auf 55°C) aufgelöst und dann mit 5 g Darco G-60-Kohle entfärbt. Nach Filtration, um die Kohle zu entfernen, wird das Filtrat konzentriert, um das Produkt zu kristallisieren. Das Methanol wird durch Zugeben von 300 ml n-Butylacetat und Konzentrieren zu einer dicken Kristallaufschlämmung weiter entfernt. Die Kristalle werden filtriert, mit n-Butylacetat gewaschen und getrocknet, um 42,1 Gramm gereinigtes kristallines 5-Androsten-3β,7β,11α-triol-17-on zu ergeben.
BEISPIEL 6: Herstellung von 5,9(11)-Androstadien-3β-ol-17-on aus 5-Androsten-3β,11α-diol-17-on
Stufe 1
Zu einer Aufschlämmung von 5-Androsten-3β,11α-diol-17-on (30,4 g, 100 mmol) in CH₂Cl₂ (300 ml) wurde TMEDA (18,1 ml, 120 mmol) gegeben. Die Aufschlämmung wurde auf –10°C abgekühlt und Methylchlorformiat (7,72 ml, 100 mmol) zugegeben. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen. Die Reaktion war mittels DC nicht vollständig, also wurde mehr Methylchlorformiat (772 μl, 10 mmol) zugegeben. Als mittels DC bestimmt wurde, dass die Reaktion fertig war, wurden EtOAc (300 ml) und H₂O (100 ml) zugegeben und die resultierenden Phasen getrennt. Die organische Phase wurde mit 50 ml H₂O gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und zu einem Öl konzentriert, das sich beim Stehenlassen verfestigte. Das Rohprodukt wurde aus heißem EtOAc/CH₂Cl₂ und Heptan umkristallisiert. Die Aufschlämmung wurde ferner auf 0–5°C abgekühlt und das Produkt mittels Filtration gesammelt (22 g, 60,8% chemisch). Das Carbonat wurde mit Säulenchromatographie über Silicagel unter Elution mit einem Gradienten von 5%–20% Aceton/CH₂Cl₂ weiter gereinigt, um reines Monocarbonat zu erhalten (20,57; 56,8%).
Stufe 2
Das Carbonat von Stufe 1 (38,0 g; 0,105 mol) wurde in 570 ml THF gelöst und auf –35°C abgekühlt. Festes PCl₅ (31,7 g; 0,178 mol) wurde langsam zugegeben, wobei die Temperatur unterhalb von –30°C gehalten wurde. Als DC eine vollständige Reaktion anzeigte, wurde das Gemisch in NaHCO₃ Lösung gegossen und das Produkt mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen wurden über MgSO₄ getrocknet und konzentriert, um ein Öl hervorzubringen.
Stufe 3
Dieses Öl von Stufe 2 wurde in Methanol gelöst (500 ml) und mit 36,1 g K₂CO₃ behandelt, und das Gemisch 15 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das verbleibende Carbonat wurde mittels Filtration entfernt. Die Lösung wurde partiell konzentriert und Wasser wurde zugegeben, um den gewünschten Dien-Alkohol („dienic alcohol") zu präzipitieren, welcher in einem Ofen bei 45°C getrocknet wurde. Ausbeute 29,52 g.

Claims

Ein 7β,11α-Dihydroxysteroid der Formel (IV)
worin R₃ ist: (1) -H; (2) -CO-R₄ worin R₄ H oder C₁-C₅-Alkyl ist; worin R₁₇ und R₁₈ zusammen =O bilden oder worin R₁₇ und R₁₈ zusammen mit dem C17-Kohlenstoffatom des Steroidgerüsts, an welches sie gebunden sind, einen Lactonring der folgenden Formel bilden:
Verfahren zur Herstellung eines der Formel (IV) nach Anspruch 1, umfassend (1) In-Kontakt-Bringen eines 7β-Hydroxysteroids der Formel (II)
worin R₃, R₁₇und R₁₈ wie in Anspruch 1 definiert sind und worin Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, mit 11α-Hydroxylase von Aspergillus.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (IV) nach Anspruch 1, umfassend (1) In-Kontakt-Bringen eines Δ⁵-Steroids der Formel (I)
worin R₃, R₁₈ und R₁₇ wie in Anspruch 1 definiert sind und worin Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, mit 7β-Hydroxylase von Diplodia, um ein 7β-Hydroxysteroid der Formel (II) zu erzeugen,
worin R₃, R₁₇und R₁₈ wie in Anspruch 1 definiert sind und worin Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist; und (2) In-Kontakt-Bringen des 7β-Hydroxysteroids (II) aus Schritt (1) mit 11α-Hydroxylase von Aspergillus.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (IV) nach Anspruch 1, umfassend (1) In-Kontakt-Bringen eines Δ⁵-Steroids der Formel (1)
worin R₃, R₁₈ und R₁₇wie in Anspruch 1 definiert sind und worin Z₁-Z₂ eine Einfachbindung ist, mit der/den 7β,11α-Hydroxylase(n) von Absidia.
Verbindung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei R₃ H ist.
Verbindung oder Verfahren nach Anspruch 5, wobei R₃ -C(O)-CH₃ ist.
Verbindung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei R₁₇ und R₁₈=O bilden.
Verbindung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei R₁₇, R₁₈ und das C17-Kohlenstoffatom des Steroidgerüsts den Lactonring bilden.
Verbindung oder Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Lactonring die in der folgenden Formel gezeigte α- und β-Stereochemie aufweist:
Verbindung nach Anspruch 1, worin das 7β,11α-Dihydroxysteroid (IV) 5-Androsten-3β,7β,11α-triol-17-on ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei das In-Kontakt-Bringen mittels Fermentation, Zellkonzentrat, gesamten Zellen oder zellfreier Reaktion ist bzw. geschieht.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das In-Kontakt-Bringen mittels Fermentation ist bzw. geschieht.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei Diplodia Diplodia gossypina ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 3, wobei der Aspergillus Aspergillus ochraceus ist.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (IV) nach Anspruch 3, wobei das 7β-Hydroxysteroid (II) von Schritt (1) vor dem In-Kontakt-Bringen von Schritt (2) nicht isoliert wird.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (IV) nach Anspruch 3, wobei das 7β-Hydroxysteroid (II) von Schritt (1) vor dem In-Kontakt-Bringen von Schritt (2) isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei Absidia Absidia coerulea ist.