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Verfahren zvr Herstellung von Steroidglykosiden Die Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Herstellung von Steroidglykosiden der allgemeinen Formel I
worin i 1 -A-B-C-D- die Gruppierungen -CH2-CH2-CH-CH-, -CH2-CH=C-CH-oder -CH=CH-C=C-,
R1 eine Methylgruppe oder eine Äthylgruppe,
R2 und R3 Wasserstoffatome
oder Acylgruppen, 24 ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Acylgruppe,
V und W jeweils ein Wasserstoffatom und Z ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe,
oder V und W gemeinsam eine Oxogruppe und Z ein Wasserstoffatom, ein Alkalimetallatom
oder eine Altylgruppe und X und Y gemeinsam eine Oxogruppe oder X eine HydroXygruppe
oder eine Acyloxygruppe und Y ein Wasserstoffatom oder ein niederer aliphatischer.
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Kohlenwasserstoffrest bedeuten, weiches dadurch gekennzeichnet ist,
daß man ein Steroid der allgemeinen Formel II
worin X, Y, R1 und die Gruppierung -A-B-C-D- die obengenannte
Bedeutung
besitzen, in einem kohlehydrathaltigen Nährmedium mit einer.lebenden Kultur eines
Pilzstammes der Gattungen Rhizopus, Sporotrichum oder Absidia fermentiert, die Glucoside
der allgemeinen Formel I isoliert, gewünschtenfalls die Glucoside zu den Glucuroniden
der allgemeinen Formel I oxydiert, freie Hydroxylgruppen und/oder freie Carboxylgruppen
verestert oder freie Carboxylgruppen in ihre Alkalisalze überführt Unter Acylgruppen
sollen vorzugsweise solche Gruppen verstanden werden, die sich von einer Carbonsaure
mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen ableiten. Insbesondere sollen unter Acylgruppen niedere,
geradkettige oder verzweigte Alkanoylreste mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder der
Benzoylrest verstanden werden. Als Acylreste seien beispielsweise genannt: der Formyl-,
Acetyl-, Propionyl-, Dimethylace-tyl-, Trimethylacetyl-, Butyryl-, 3,3-Dimethylbutyryl-,
Pentanoyl-, llexanoyl- oder Benzoylrest Unter einer Acyloxygruppe soll vorzugsweise
eine Gruppe verstanden werden, deren Acylrest die obengenannte Bedeutung besitzt.
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Unter einer Alkylgruppe soll vorzugsweise eine geradkettige
oder
verzweigte Alkylgruppe mit 3. bis 6 Kohlenstoffatc."en verstanden werden Als geeignete
Alkylgruppen seien beispielsweise genannt: die Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-,
Butyl-, t ert.-Butyl-, Pentyl- und Hexylgruppe.
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Unter einem niederen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest soll vorzugsweise
ein gesättigter oder unge sättigter aliphatischer Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis
4 Kohlenstoffatomen verstanden werden. Als niedere aliphatische Kohlenwasserstoffreste
seien beispielsweise genannt: der Methyl-, Äthyl-, Vinyl-, Äthinyl-, Propyl-, l-Propenyl-,
1-Propinyl- und Butylrest.
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Einige Steroidglykoside und Steroidglucuronide der allgemeinen Formel
I sind bekannt (Deutsche Offenlegungsschrift 1.945.620).
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Ferner ist bekannt, daß diese Verbindungen hormonwirksame ihre Substanzen
sind, die sich insbesondere durch/östrogene Wirksamkeit auszeichnen.
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Die 4-Nethylglucoside und 4-Methylglucuronide der allgemeinen Formel
I sind nicht vorbeschrieben. Diese Verbindungen können ebenfalls in der Hormontherapie
angewendet werden.
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Somit betrifft die Erfindung auch die Steroidglykoside der allgemeinen
Formel III
worin X, Y, R1, R2, R3, V, W, Z und die Gruppierung | | -A-B-C-D- die gleiche Bedeutung
wie in Formel I besitzen.
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Ferner sind Verbindungen der allgemeinen Formel I unbekannt, die als
Substituenten X eine Hydroxygruppe oder Acyloxygruppe und als Substituenten Y einen
niederen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest tragen Diese Verbindungen sind ebenfalls
hormonwirksame Substanzen, welche als Wirkstoffe für pharmazeutische Präparate verwendet
werden können.
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Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch die Steroidglykoside
der allgemeinen Formel IV
worin V, W, Z, R1, R2, R3, R4 und die Gruppierung -A-B-C-D- die gleiche Bedeutung
wie in Formel I besitzen und I' eine Hydroxylgruppe oder eine Acyloxygruppe sowie
Y' ein niederer aliphatischer Kohlenwasserstoffrest darstellen.
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Der Dentschen Offenlegungsschrift 1.945,620 kann man entnehmen, daß
die bekannten Steroidglykoside der allgemeinen Formel 1 in der Weise hergestellt
werden können, daß man die Steroide der allgemeinen Formel II in Gegenwart von Cadmiumsalzen
mit Halogenzuckern kondensiert. Diese rein
chemische Glykosidierung
hat aber den Nachteil, daß sie einerseits sehr aufwendig ist und andererseits nicht
stereospezifisch verläuft dann bei dieser Kondensation bilden sich Gemische der
entsprechenden a-Glykoside und ß-Glykoside.
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Ds wurde nun gefunden, daß Pilzstämme der Gattungen Rhizopus, Sporotrichum
und Absidia überraschenderweise die Fähigkeit besitzen, die in der 3-Position ständige
Phenol gruppe von Steroiden der allgemeinen Formel II zu glykosidieren Bei dieser
technisch einfach durchführbaren mikrobiologischen Glykosidierung entstehen stereospezifisch
nur Steroid-ß-glykoside.
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Die Durchführung der Fermentation erfolgt unter den gleichen Bedingungen,
wie die bekannten fermentativen Umwandlungen von Steroiden mit Pilzkulturen. Vorzugsweise
wird die fermentative Glykosidierung von Steroiden der allgemeinen Formel II in
Submerskulturen der obengenannten Stämme unter aeroben Bedingungen durchgeführt.
Hierzu werden die Pilzkulturen unter Belüftung in einem Nährmedium, das die für
das Wachstum der Pilze erforderlichen Kohlehydrate, Eiweißstoffe, Nährsalze und
Wuchsstoffe enthält, angezüchtet. Nach erfolgter Anzucht setzt man den Kulturen
das
Substrat als wässrige Suspension oder in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Methanol,
Äthanol, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd, gelöst zu
und fermentiert bis die Umsetzung beendet ist.
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Wie bei allen bekannten mikrobiologischen Umwandlungen von Steroiden,
so ist auch bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die optimale Substratkonzentration
und die optimale Fermentationszeit von der spezifischen Struktur des Substrats und
von den Fermentationsbedingungen selbst abhängig und muß mittels der dem Fachmann
geläufigen Vorversuche ermittelt werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise unter Verwendung
der folgenden Pilzstämme durchgeführt werden: Rhizopus nigricans, Rhizopus arrhizus,
Rhizopus stolonifer, Rhizopus oryzae, Rhizopus javanicus, Rhizopus tritici, Rhizopus
circinans, Rhizopus shanghaiensis, Rhizopus kansanensis, Rhizopus cohinil, Absidia
orchidis, Sporotrichum carnis, Sporotrichum bombycium, Sporotrichum epiganeum und
Sporotrichum sulfurescens.
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Je nach Wahl des Fermentationsstammes, des Substrats und der Fermentationsbedinungen
entstehen bei der mikrobiologischen Glykosidierung die Glucoside oder die 4-Methylglucoside
der allgemeinen Formel 1.
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Nach erfolgter Fermentation werden die Verfahrensprodukte in an sich
bekannter Weise isoliert. Diese Isolierung kann ZUB1 Beispiel in der Weise erfolgen,
daß man die formentationsansatze mit einem polaren, nicht wasserlöslichen Lösungsnittel,
wie Äthylacetat, Butylacetat oder Methylisobutylketon, extrahiert die Extrakte einengt
urud die so erhaltenen Rohprodukte gegebenenfalls durch Chromatographie und/oder
Kristallisation reinigt Die so erhaltenen Glucoside der allgemeinen Formel I können.
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gewüngchtenfalls mittels der bekannten Arbeitsmethoden zu deji entsprechenden
Glucuroniden der allgeineinen Formel I oxydiert werden. Diese Oxydation kann beispielsweise
mittels der-Methode durchgeführt werden, welche von K. Maurer und G Drefahl beschrieben
ist (Ber. 80,1947,94).
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Die sich gegebenenfalls anschließende Veresterung der Uronsäuren erfolgt
ebenfalls nach an sich bekannten Arbeitsmethoden.
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So kann man die Uronsäuren beispielsweise mit Diazomethan oder Diazoäthan
umsetzen und erhält die entsprechenden Methyl- oder Äthylester. Eine allgemein anwendbare
Methode ist die Umsetzung der Uronsäuren mit den Alkoholen in Gegenwart von Carbonyldiimidazol,
Dicyclohexylcarbodiimid oder Trifluoressigsäureanhydrid Ferner ist es beispielsweise
möglich, die Uronsäuren
in Gegenwart von Kupfer(I)-oxid oder Silberoxid
mit Alkyl halogeniden umzusetzen.
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Eine weitere Methode besteht darin, daß man die Uronsäuren mit den
entsprechenden Dimethylformamidalkylacetalen in die entsprechenden Säurealkylester
überführt.
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Die Salze der Uronsäuren entstehen beisnelsuTeise bei der Neutralisation
der Uronsäuren mittels Alkalicarbonaten oder Alkalihydroxiden, wie zum Beispiel
Natriumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat, Natriumhydroxid, Kaliumcarbonat, Kaliumhydrogencarbonat
oder Kaliumhydroxid.
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Die sich gegebenenfalls anschließende Veresterung der freien Hydroxygruppen
erfolgt ebenfalls nach bekannten Verfahren. So kann man die Hydroxyverbindungen
der allgemeinen Formel I beispielsweise mit den entsprechenden Garbonsäuren in Gegenwart
von Carbonyldiimidazol, Dicyclohexylcarbodiimid oder Trifluoressigsäureanhydrid
umsetzen. Ferner ist es möglich, die
Hydroxyverbindungen mit den
entsprechenden Säureanhydriden oder Säurechloriden in Gegenwart saurer oder basIscher
Katalysatoren, wie zum Beispiel pToluolsulfonsäure, kaliumhydrogencarbonat, Pyridin,
Lutidin, Collidin oder 4-Dimethylaminopyridin, umzusetzen Die unbekannten Verbindungen
der allgemeinen Formeln III und IV können insbesondere zur Herstellung pharmazeutischer
Präparate verwendet werden, die einerseits zur Behandlung gynäkologischer Störungen
verwendet werden können, andererseits aber auch als Konrazeptiva verwendbar sind
Zum therapeutischen Gebrauch werden die neuen Steroidglykoside mit den in der galenischen
Pharmazie üblichen Zusätzen, Gragersubstanzen un.d gegebenenfalls auch mit Geschmackskorregentien
nach an sich bekannten Methoden zu den üblichen Arzneimittelformen verarbeitet.
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Die neuen Arzneimittel eignen sich sowohl zur oralen, als auch zur
parenteralen Applikation.
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Für die orale Applikation kommen insbesondere Tabletten, Dragées,
Kapseln, Pillen, Suspensionen oder Lösungen infrage.
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Für die parenterale Applikation kommen insbesondere wässrige Lösungen
infrage.
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Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemäßen
Verfahrens.
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B e i s p i e 1 1: 2 Erlenmeyerkolben mit je 2 1 Fassungsvermögen
werden mit jeweils 500 ml Nährmedium enthaltend 3% Glucose, 1% corn-steep liquor,
O,2% Natriumnitrat, O,2% Dikaliumhydrogenphosphat, O,1% Kaliumdihydrogenphosphat,
0,05% Magnesiumsulfat, 0,05' Kaliumchlorid und 0,002% Eisen(II)-sulfat, beschickt,
sterilisiert mit einer Rhizopus nigricans (ATCC 6227 b -) Suspension beimpft und
48 Stunden lang bei 30°C geschüttelt.
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Die so erhaltene Vorkultur wird in einen 50 1 Stahlfermenter überführt,
der 29 1 des gleichen Nährmediums enthält und 12 Stunden lang bei 2900 unter Belüftung
(30 l/Minute) mit 220 Umdrehungen pro Minute gerührt.
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Dann setzt man der Kultur 3,0 g 17α-Äthinyl-1,3,5(10)-östratrien-3,17ß-diol
in 100 ml Dimethylformamid gelöst, zu und fermentiert weitere 43 Stunden bei 29°C
unter Belüftung und Rühren.
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Nach Beendigung der Fermentation wird das Pilzmycel abgesaugt, das
Kulturfiltrat mit Methylisobutylketon extrahiert, der Extrakt
im
Vakuum auf ca. 500 ml eingeengt und 20 Stunden lang bei 5°C aufbewahrt.
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Dann saugt man die abgeschiedenen Kristalle ab, trocknet sie im Vakuum
und erhält 2,13 g 17ß-Hydroxy-17α-äthinyl-1,3,5(10)-östratrien-3-yl-ßD-glucosid
vom Schmelzpunkt 158-160°C.
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Aus den Mutterlaugen lassen sich durch Einengen weitere O,91 g dieses
Glucosids gewinnen. Gesamtausbeute 3,04 g = 66% der Theorie. Nach Umkristallisation
aus Essigester-Aceton schmilzt das Produkt bei 162-164°C.
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B e i s p i e l 2: Unter den Bedingungen des Beispiels 1 läßt sich
17α-Äthinyl-1,3,5(10)-ostratrienw3,17ß-diol mit Rhizopus arrhizus ( ATCC 10260
), Rhizopus stolonifer ( ATCC 10404 ), Rhizopus oryzae ( ATCC 4858 ), Rhizopus javanicus
( IFO 5441 ), Rhizopus tritici ( ATCC 1230 ), Rhizopus circinans Brooks et ( ATCC
1225 ), Sporotrichum carnis ( CBS, ) oder Hansford Sporotrichum bombycium ( CBS,
Cda.Rabenh.) glykosidieren,und man erhält ebenfalls das 17ß-Hydroxy-17α-äthinyl-1,3,5(10)-östratrien-3-yl-ßD-glucosid.
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B e i s p i e l 3: Unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen
werden 3,0 g 1,3,5(10)-Östratrien-3,17ß-diol mit Rhizopus arrhizus ( ATOG 10260
) glykosidiert, und man erhält das 17ß-Hydroxy-1,3,5(10)-östratrien-3-yl-ßD-glucosid
vom Schmelzpunkt 214-216°C.
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B e i s p i e l 4: Unter den Bedingungen des Beispiels 3 läßt sich
1,3,5(10)-Östratrien-3,17ß-diol mit Rhizopus arrhizus ( ATCC 10260 Rhizopus stolonifer
( ATCC 10404 ), Rhizopus oryzae ( ATCC 4858 Shizopus tritici ( ATOG 1230 ), Rhizopus
shangaiensis ( ATCC 10329 ), Rhizopus kazanensis ( ATCC 8998 ) oder Rhizopus cohnii
( ATCC 8996 ) glykosidieren,und man erhält ebenfalls das 17ß-Hydroxy-1,3,5(10)-östratrien-3-yl
ßD-glucosid.
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B e i s p i e l 5: Unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen
läßt sich 1,3,5(10),6,8-Östrapentaen-3,17ß-diol mit Rhizopus arrhizus ( ATOG 10260
) glykosidieren, und man erhält das 17ß-Hydroxy-1,3,5(10),6,8-östrapentaen-3-yl-BD-glucosid
als amorphes Pulver.
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B e i s p 1 e 1 6: Zwei Erlenmeyerkolben mit 2 1 Fassungsvermögen
werden jeweils mit 500 ml einer Nährlösung aus 5% Stärkezucker und 20% corn-steep
liquor beschickt, sterilisiert und mit einer Kultur von Absidia orchidis ( ATCC
6811 ) beimpft. Man schüttelt die Kultur 72 Stunden lang bei 3000.
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Die so erhaltene Vokultur wird in einem 20 l-fassenden Glasfermenter,
der 14,5 1 der gleichen Nährlösung enthält, überführt und 24 Stunden lang bei 29°C
unter Belüften (15 l/Minute) mit 220 Umdrehungen pro Minute gerührt.
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Dann setzt man der Kultur 4.5 g 3-Hydroxy-1,3,5(10)-östratrien-17ß-on
in Form einer wässrigen Suspension zu und fermentiert weitere 79 Stunden.
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Nach Beendigung der Fermentation wird das Mycel abgetrennt, das Filtrat
mit Methyli.sobutylketon extrahiert und der Extrakt im Vakuum zur Trockne eingeengt.
Der Rückstand wird durch Chromatographie an einer Kieselgelsäule gereinigt, av.s
Essigester umkristallisiert, und man erhält das 17-Oxo-1,3,5(10)-östratrien-3-yl-ßD-glucosid
vom Schmelzpunkt 155-157°C.
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B e i s p i e l 7: Unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen
wird 3-Hydroxy-1,3,5(10)-östratrien-17-on mit Rhizopus nigricans ( ATCC 6227 b ),
Rhizopus arrhizus (ATCC 10260), Rhizopus stolonifer ( ATCC 10404 ), Rhizopus oryzae
( ATOG 4-858 ), Rhlzopus javanicus ( lFG 5441 Rhizopus tritici ( ATCC 1230 ), Rhizopus
circinans ( ATCC 1225 ), Rhizopus shanghaiensis ( ATCC 10329 Rhizopus kazanensis
( ATCC 8998 ) oder Rhizopus cohnii ( ATCC 8996 ) fermentiert.
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Nach Beendigung der Fermentation arbeitet man die Kultur auf wie im
Beispiel 6 beschrieben und erhält ebenfalls das 17-Oxo-1,3,5(10)-östratrien-3-yl-ßD-glucosid.
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B e i s r 1 e 1 8: Unter den Bedingungen des Beispiels 1 werden 7,5
g 17α-Äthinyl-1,3,5(10)-östratrien-3,17ß-diol mit Sporotrichum sulfurescens
( ATCC 7159 ) umgesetzt, und man erhält 5,72 g 17ß-Hydroxy-17α-äthinyl-1,3,5(10)-östratrien-3-yl-ßD-(4'-methyl-glucosid)
vom Schmelzpunkt 210-217°C.
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B e i s p i e 1 9: Unter den Bedingungen des Beispiels 1 läßt sich
17a-Athinyl-
1,3,5(10)-östratrien-3,17ß-diol mit Rhizopus shanghaiensis
( ItTCC 10329 ), Rhizopus cohnii ( ATCC 8996 ), Rhizopus kazanensis ( ATOG 8998
) oder Sporotrichum epigaeum ( ATCC 7145 ) glykosidleren, und mw-1 erhält Gemische
aus 17ß-Hydroxy-17α-äthinyl-1,3,5(10)-östratrien-3-yl-ßD-glucosid und 17ß-Hydroxy-17α-äthinyl-1,3,5(10)-östratrien-3-yl-(4'-methylglucosid).
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B e i s p i e l 10: 1,8 g 17-Oxo-1,3,5(10)-östratrien-3-yl-ßD-$glucosid
werden In 5 ml getrocknetes, auf 500 gekühltes Distickstofftetroxyd gegeben und
die Mischung in einem Glasautoklaven unter gelegentlichem Schütteln 20 Stunden lang
bei -5°C aufbewahrt.
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Dann engt man die Reaktionsmischung im Vakuum zur Trockne ein und
reinigt den Rückstand durch Chromatographie über eine Amberlite IR4b enthaltende
Säule. Das erhaltene Produkt wird mit Natronlauge neutralisiert, zweimal aus Äthanol
umkristallisiert, und man erhält das Natriumsalz des 17-Oxo-1,3,5(10)-östratrien-3-yl-ßD-glucuronids
vom Schmelzpunkt 282-286°C (Zersetzung).
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B e i s p i e 1 11: 1 g 17ß-Hydroxy-17α-äthinyl-1,3,5(10)-östratrien-3-yl-ßD-glucosid
werden
mit 4 ml Pyridin und 1 ml Acetanhydrid versetzt; und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur
gerührt.
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Anschließend gießt man die Reaktionsmischung in 120 ml 8%ige Schwefelsäure,
saugt den ausgefallenen Niederschlag ab, wäscht ihn neutral, kristallisiert ihn
aus Aceton um um.d erhält das 17ß-Hydroxy-17α-äthinyl-1,3,5(10)-östratrien-3-yl-ßD-tetraacetylglucosid
vom Schmelzpunkt 126-129°C.
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B e i s p i e l 12: 100 mg 17-Oxo-1,3,5(10)-östratrien-3-yl-ßD-glucosid
werden mit 10 ml Pyridin und 5 ml Acetanhydrid versetzt und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur
stehengelassen.
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Dann gießt man die Reaktionsmischung in 50 ml gekühlte 8%ige Schwefelsäure,
saugt das abgeschiedene Produkt ab, wäscht es neutral, trocknet es, kristallisiert
es aus EssigesterJBexan um und erhält das 17-Oxo-1,3,5(10)-östratrien-3-yl-ßD-tetraacetylglucosid
vom Schmelzpunkt 200-201°C.
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B e i s p i i e 1 13: Unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen
läßt sich 1,3,5(10),7-östratetraen-3,17ß-diol mit Rhizopus arrhizus (ATCC 10260)
glykosidieren und man erhält 17ß-Hydroxyl-1,3,5(10),7-östratetraen-3-yl-ßD-glucosid
als amorphes Pulver.