CN111057734A - 一种甲基睾丸素高效转化生产11α-羟基-甲基睾丸素的方法 - Google Patents

一种甲基睾丸素高效转化生产11α-羟基-甲基睾丸素的方法 Download PDF

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申雁冰
王敏
骆健美
王喜波
王璐
李梦涵
夏梦雷
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    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/06—Hydroxylating
    • C12P33/08—Hydroxylating at 11 position
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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种11α‑羟基‑甲基睾丸素的生物合成方法。具体涉及生产菌株为经ARTP诱变与ARTP‑LiCl复合诱变选育获得的蓝色犁头霉CGMCC 14124，生产原料为甲基睾丸素(MT)。本发明利用蓝色犁头霉CGMCC 14124的选择性羟基化能力，将甲基睾丸素加入培养成熟的发酵培养基中，可以有效合成11α‑羟基‑甲基睾丸素。本发明利用微生物转化法实现了11α‑羟基‑甲基睾丸素的绿色高效合成，简化操作，降低生产成本和环境污染。

Description

一种甲基睾丸素高效转化生产11α-羟基-甲基睾丸素的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用微生物发酵法在11α-羟基-甲基睾丸 素生产方面的应用。
背景技术：
甾体化合物是含有四个环戊烷多氢菲的萜类化合物，广泛存在于动植物及一 些微生物细胞中。甾体化合物大都具有重要的生理活性，对机体起着非常重要的 调节作用，广泛应用于疾病治疗和医疗保健，是仅次于抗生素的第二大类药物。 11α-羟基甲基睾丸素是生物体内重要的活性物质，作为甲基睾丸丸素的羟基化 衍生物，具有更强的同化作用，抑制蛋白质的异生，增进食欲，临床时适用于慢 性消耗性疾病，严重感染，创伤、烧伤、手术后等的康复，对生命代谢活动具有 重要调节作用同时也可作为其他甾体激素的原料中间体。
目前工业上多采用化学合成的方法生产，存在工艺复杂、收率低、生产成本 高等问题，且大量化学试剂的使用对生态环境和操作人员都有较大危害，这些限 制了大规模工业化生产。自微生物首次合成甾体激素进入商业化以来，微生物转 化已经广泛应用于许多甾体药物或药物中间体合成。蓝色犁头霉是目前甾体药物 工业化生产中常见的菌株，且经ARTP诱变与ARTP-LiCl复合诱变选育获得的 蓝色犁头霉AL-172具有生长速度快、繁殖周期短、催化效率高的特点。其体内 含多种羟化酶，能够在甾体底物多个位点引入羟基，实现化学合成不易完成的反 应途径，目前对于甲基睾丸素的11α-羟基化未见研究。综上所述，本专利采用 高转化率的蓝色犁头霉菌株进行甲基睾丸素的11α-羟基化反应，为该类甾体药物的合成提供了新途径，具有重要市场经济价值。
发明内容：
为了实现上述目的，本发明将提供一种低能耗、低污染的微生物转化法高效生产11α- 羟基-甲基睾丸素的工艺，通过一株经ARTP诱变与ARTP-LiCl复合诱变选育获得的蓝色犁头 霉(Absidia coeralea)AL-172，实现了微生物在11α羟基甲基睾丸素工业化生产领域的应用。 该菌株已于2017年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号： CGMCC 14124。
应用上述菌株转化甲基睾丸素生成11α-羟基-甲基睾丸素的方法，其步骤如 下：
将蓝色犁头霉孢子悬浮液1mL接种于种子培养基中，在温度26-30℃，转速180-210r/min条件下培养至pH到3.6-4.0时，制得蓝色犁头霉种子液。将种子培 养液按7％-18％接种量转接入发酵培养基，25-30℃，170-200r/min发酵培养5-8 h后，加少量底物甲基睾丸素进行诱导，待培养pH至3.8时，调节发酵液pH至 5.6-6.0,补齐剩余底物使得总投料浓度为2-6g/L，添加有机助溶剂，转化过程中 定时对发酵液取样，有机溶剂萃取，取上清液，然后用高效液相色谱检测发酵情 况，发酵持续40-48h。
本发明所述的种子培养基成分如下(g/L)：玉米浆12，葡萄糖10.5，硫酸 铵5，酵母膏2.5；水配制，pH6.5。发酵培养基成分如下(g/L)：玉米浆12，葡 萄糖11，硫酸铵5，酵母膏2；pH6.5，121℃高压蒸汽下灭菌20min。
所述孢子悬浮液的制备方法如下：用无菌水将斜面菌丝洗下，将含有大量孢 子的悬浮液倒入附有4-8层灭菌纱布并装有玻璃珠的三角瓶中，充分震荡，配置 成浓度为3×107-1×108个/ml的孢子悬浮液。
所述助溶的有机溶剂包括甲醇、乙醇、乙二醇、丙二醇等。
优选地，所述的反应介质为无水乙醇，添加量为4％(V/V)。
优选地，转化时，发酵液中添加甲基睾丸素的浓度为5-6g/L。
优选地，添加底物甲基睾丸素进行诱导时，添加量为0.4-0.6g/L。
有益效果：
本发明首次提出利用蓝色犁头霉生物转化甲基睾丸素生产11α羟基-甲基睾 丸素的方法，反应条件温和，反应操作简单，解决了化学合成存在的工艺复杂、 收率低、大量有机试剂污染等问题。
附图说明：
图1蓝色犁头霉CGMCC14124生产11α-羟基-甲基睾丸素示意图。
图2产物11α-羟基-甲基睾丸素核磁共振H谱图
图3高投料浓度(5g/L)下11α-羟基-甲基睾丸素生产过程曲线
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施 例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用 以解释本专利，并不用于限定本发明。
实施例1
(1)蓝色犁头霉孢子悬浮液的制备：无菌条件下用适量无菌水洗下斜面上 菌丝，经含有孢子的悬浮液经6层纱布过滤后倒入盛有玻璃珠的三角瓶中，充分 震荡，使孢子悬浮液混匀，计数调整孢子悬浮液浓度为5×107个/ml。
(2)种子培养：将蓝色犁头霉孢子悬浮液1mL接种于种子培养基中，在 27℃，转速180r/min条件下培养pH到4.0，制得蓝色犁头霉种子液。
(3)发酵培养及转化：种子液以10％接种量接入发酵培养基，27℃，180 r/min条件下培养发酵液pH至3.8，NaOH溶液调节发酵液pH至5.6，向发酵培 养基中一次性加入浓度5g/L甲基睾丸素,同时加入4％甲醇助溶。
所述发酵培养基组分如下：玉米浆12g/L,葡萄糖11g/L,酵母膏2g/L,硫酸 铵5g/L,去离子水配制，pH6.5。
在本实施例中，甲基睾丸素投料浓度为5g/L,转化结束后，测得产物11α羟 基-甲基睾丸素收率达到36.7％。
实施例2
(1)蓝色犁头霉孢子悬浮液的制备：无菌条件下用适量无菌水洗下斜面上 菌丝，经含有孢子的悬浮液经4层纱布过滤后倒入盛有玻璃珠的三角瓶中，充分 震荡，使孢子悬浮液混匀，计数调整孢子悬浮液浓度为1×108个/ml。
(2)种子培养：将蓝色犁头霉孢子悬浮液1ml接种于种子培养基中，在28℃， 转速200r/min条件下培养pH到4.0，制得蓝色犁头霉种子液。
(3)发酵培养及转化：种子液以10％接种量接入发酵培养基，28℃，200 r/min条件下培养发酵液pH至3.8，NaOH溶液调节发酵液pH至5.6，向发酵培 养基中一次性加入浓度5g/L甲基睾丸素,同时加入4％丙二醇助溶。
在本实施例中，甲基睾丸素投料浓度为5.5g/L,转化结束后，产物生成率达 到42.4％
实施例3
(1)蓝色犁头霉孢子悬浮液的制备：无菌条件下用适量无菌水洗下斜面上 菌丝，经含有孢子的悬浮液经6层纱布过滤后倒入盛有玻璃珠的三角瓶中，充分 震荡，使孢子悬浮液混匀，计数调整孢子悬浮液浓度为6×107个/ml。
(2)种子培养：将蓝色犁头霉孢子悬浮液1ml接种于种子培养基中，在28℃， 转速200r/min条件下培养pH到4.0，制得蓝色犁头霉种子液。
(3)发酵培养及转化：种子液以10％接种量接入发酵培养基，28℃，200 r/min条件下培养，培养第5h时，投加0.4g/L底物甲基睾丸素，待发酵液pH至 3.8，NaOH溶液调节发酵液pH至5.6，向发酵培养基中浓度5g/L甲基睾丸素, 同时加入4％乙醇助溶。。
在本实施例中，甲基睾丸素投料浓度为5g/L,转化48h后，产物生成率达到 到47.5％。
以上具体实施例对本发明做了进一步详述，但只是描述性的，不对本发明构 成任何限制。本领域技术人员应理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以 对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本 发明的保护范围。因此，本专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种甲基睾丸素高效转化生产11α-羟基-甲基睾丸素的方法，其特征在于，以蓝色犁头霉CGMCC.14124为生产菌株，经过孢子种子培养、发酵培养及生物转化底物甲基睾丸素得到产物11α-羟基-甲基睾丸素，具体步骤如下。
(1)种子培养
将蓝色犁头霉孢子悬浮液1mL接种于种子培养基中，在温度26-30℃，转速180-210r/min条件下培养至pH到3.6-4.0时，制得蓝色犁头霉种子液。
(2)发酵培养
将种子培养液按7％-18％接种量转接入发酵培养基，25-30℃，170-200r/min发酵培养5-8h后，先使用0.5-1.0g/L的MT进行诱导，待培养pH至3.8时，调节发酵液pH至5.6-6.0,补齐剩余底物使得总投料浓度为2-6g/L，开始转化。
(3)底物转化
底物加入发酵液后，在25-32℃，150-220r/min条件下转化40-48h。
2.如权利要求1所述的一种甲基睾丸素高效转化生产11α-羟基-甲基睾丸素的方法，其特征在于，所述发酵培养基组成(g/L)为：玉米浆12，葡萄糖11，硫酸铵5，酵母膏2；pH6.5，121℃高压蒸汽下灭菌20min。
3.如权利要求1所述的一种甲基睾丸素高效转化生产11α-羟基-甲基睾丸素的方法，其特征在于，所述种子培养基组成(g/L)为：玉米浆12，葡萄糖10.5，硫酸铵5，酵母膏2.5，pH6.5，121℃高压蒸汽下灭菌20min。
4.如权利要求1所述的一种甲基睾丸素高效转化生产11α-羟基-甲基睾丸素的方法，其特征在于，所述蓝色犁头霉孢子悬浮液的制备方法如下：无菌水将菌种斜面孢子洗下，6层纱布过滤，振荡摇匀，血球计数板计数，调整孢子悬浮液浓度1.5×108个/mL。
5.如权利要求1所述的一种甲基睾丸素高效转化生产11α-羟基-甲基睾丸素的方法，其特征在于，投加底物进行转化时，底物需先经1-4％有机溶剂助溶处理。
6.如权利要求5所述的一种甲基睾丸素高效转化生产11α-羟基-甲基睾丸素的方法，其特征在于，助溶的有机溶剂包括甲醇、乙醇、乙二醇、丙二醇等，优选为乙醇。
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