TW200406419A - 5-Androsten-3 β- ol steroid intermediates and processes for their preparation - Google Patents

Description

200406419 ί久、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係提供5-雄错烯_3β-醇類固醇中間物及其製備方 法0 【先前技術】 ^固S子中間物常用於生產醫藥試劑。5-雄留烯 β —醇1 7、_係生產依晋利g同（epierenone)有用的 類固醇中間物。 【發明内容】 廣。之本發明係提供以通式（I)之5-雄留烯-3 β-醇-1: 酉同及其它相關的翻彳 員似物之7β-及1 Ια-羥基化作用產生通3 (II及IV)之5-雄留惊Γ π n ^ 布-β，7β，1 Ια-三醇-17-酮及其它相關的| 似物的實用性真菌方法。

在一個觀點中，太恭日日& L 本毛月係以式（II)之7 β-羥基類固醇為半 點

(") 其中R3係： ⑴-H ; (2) -CO-R, 其中R4係11或〇1-(：5烷基； 其中R17及R18~起形成或 84441 '6- 200406419 其中R17及R18和與彼結合之類固醇主鏈之C17碳原子一 起形成下式之内酯環

其中ZrZ2係或單鍵或雙鍵。7β-羥基類固醇（II)之實例包括 (但不限於此）5-雄留烯-3β，7β-二醇-17-酮及5,9(11)-雄甾二 烯-3β，7β-二醇-17-酮。 在另一個觀點中，本發明係以式（III)之11α-羥基類固醇 為特點

其中R3係： (1) -H ； (2) -CO-R4 其中烷基； 其中Rl7及Rl8—起形成=〇或 其中Ri7及R18和與彼結合之類固醇主鏈之C1 7碳原子一 起形成下式之内酯環 84441 200406419 式（III)之11α-羥基類固醇之實例係5-雄甾烯-3β，1 Ια-二醇 -1 7 -酉同。 在另一個觀點中，本發明係以式（IV)之7β，11α-二羥基類 固醇為特點

其中R3係： (1) -H ； (2) -CO-R4 其中R4係烷基； 其中Rl7及Ri8 —起形成=〇或 其中R17及R18和與彼結合之類固醇主鏈之C17碳原子一 起形成下式之内酯環

84441 200406419 式（IV)之7β，11α-二羥基類固醇之實例係5-雄甾烯 -3β，7β，11α_ 三醇-17 -酉同。 在尚有的另一個觀點中，本發明係以式（II)之7β-羥基類 固醇之製備方法為特點

其中113係： (1) -Η ； (2) -C〇-R4 其中R4係烷基； 其中R17及R18—起形成=0或 其中R!7及R18和與彼結合之類固醇主鏈之C1 7碳原子一 起形成下式之内酯環

其中ZrZ2係或單鍵或雙鍵， 該方法包含 將式（I)之△ 5-類固醇 84441 200406419

(其中R3、R17、R18及ΖγΖ2係如以上之定義）與色二孢菌 (Dipiodia)(例如，棉鈴色二孢菌（Dipl〇diag〇ssypina))之ζβ_ 羥化酶接觸。基類固醇（π)之實例包括（但不限於此）5_ 雄留稀-3β，7β-二醇 _17，及 5,9(11)_雄 H3p，7(3_ 二醇 -同接觸方去可以藉由發酵作用、細胞濃縮液、全細 胞或無細胞反應。 在另一個觀1¾ φ . * ’本發明係以式（III)之11 α_經基類固醇 之製備方法為特點

⑴屮； (2)、C〇、R4

=4係〜綠 其中及P 其中R17 18 一起形成=〇或 起形忐T Rl8和與彼結合之類固醇主鏈之C17> 下式之内I旨環 84441 -10 - 200406419 入

該方法包含： (1)將式（I)之△ 5-類固醇 r3—〇

Rl8 Ο) (其中R3、17和18係如以上之定義及其tZi_Z2係單鍵） 與麴菌（Aspergiuus)(例如，褚趣菌（AspergiUus〇ch麗us)) 之11 a -沒化每接觸。11 α -經其φ > 卷頬固醇之實例係5-雄留烯 P，11 α -二醇-1 7 _酮。接觸方、、表 缩液、全細胞或無細胞反應以藉由發酵作用、細胞濃 在尚有的另一個觀點中，又 羥基類固醇之製備大 毛明係以式 點 乃法為特

84441 •11- (IV) (2)、C〇-R4 其中R4係Η或cvc5烷基； '中 T? 、 17及ΙΙΙδ—起形成=〇或 及R18和與彼結合之類固醇主鏈的之C17碳原子 t肜成下式之内酯環 0

該方法包含 (1)將式（II)之7β-羥基類固醇 r3—〇

(II)

(其中R3、尺17和R 與麴菌（例如，_ 之疋義及其中™單鍵） 類固醇（IV)之實=:)之心經化酶接觸m經基 方法可以|£由、5雄請-3(3,7{3,11心三醇]7-酮。接觸 /ΪΓ J以藉由發酵你 應。 、、、、田胞濃縮液、全細胞或無細胞反 在尚有的另一個觀點 _員固醇之製備方:去太，本㈣係以式(IV)之7β，11α-二 爾方去為特點 84441 ' 12- 200406419 r3—〇

其中113係： (1) -Η ; (2) -CO-R4 其中R4係11或<^-(：5烷基； 其中R17及R18 —起形成=0或 其中R〗7及R18和與彼結合之類固醇主鏈之C1 7碳原子一 起形成下式之内酯環

，該方法包含 (1)將式（I)之Δ5-類固醇

(其中R3、R18和R17係如以上之定義及其中Z〗-Z2係單鍵） 與色二孢菌（例如，棉鈴色二孢菌）之7β-羥化酶接觸，以產 84441 -13 - 200406419 生式（Π)之7β·輕基類固醇

(II) (其中R3、Rn、R18#〇Zl_Z2係如以上之定義）.及 ⑺將步驟⑴之7β-經基類固醇（11)與麴菌（例如 之11α·經化酶接觸。H二經基類固醇麵菌） 雄留烯-3β，7β，11α-三醇_17,。在步驟⑺的接觸：：係5、 以不分離在7 β 11 a L 則’可 ，經基類固醇（IV)之製備方法的+ 之7β-羥基類固醇（n)。 y私（1) 在另一個觀點中，本發明係以式（IV)之Ua 固醇之製備方法為特點 l基4

(IV) 其中R3係： (1) -H ； (2) -CO-R4

其中R4係Η或C

i、C 烷基 之C 1 7碳原子一 δ—起形成=〇或 8和與彼結合之類固醇主鏈 84441 -14- 200406419 & %成下式之内酯環 0

，該方法包含 (1)將式（I)之Δ5-類固醇

(I) (其中R3、R1S和R〗7係如以上之定義及其中Ζι_Ζ2係單鍵） 與犁頭黴（Absidia)(例如，藍色翠頭黴（Absidia 之7β，11α-羥化酶（類）接觸。7β，Πα_二羥基類固醇（ιν)之實 例係5-雄留烯1α•三醇_17♦接觸方法可以藉由發 酵作用、細胞濃縮液、全細胞或無細胞反應。 在尚有的另-個觀點中，本發明係以式m,9(ii)_雄留 一坤之製備方法為特點 尺3—-〇

^18 其中R3係： 84441 -15- (I) 200406419 (1) -Η ; (2) -CO-R4 其中R4係烷基； 其中Rl7及Rl8 —起形成=〇或 其中R17及R18和與彼結合之類固醇主鏈之C17碳原子一 起形成下式之内酯環

，及其中Zi-Z2係雙鍵，該方法包含：（1)提供式（III)化合物

(其中R3、R!7和R!8係如以上之定義）；及（2)消除1 Ια羥基 ，以形成介於义丨與义〗之間的雙鍵（式I)。提供式III化合物之 步驟可以包括將式（I)之Δ5-類固醇

(其中R3、R17和R18係如以上之定義及其中Ζ〗-Ζ2係單鍵）與 84441 -16- 麴菌（例如，鍺 是囷）之11 α -經化酶接觸。

本菸日日> J 的實二母一個觀點的具體實施例可以包括-或多個以下 貝 ％ 例。M 。/ R ’、、3係-C(0)-CH3。R3係-C(0)-H。R17及 1 〇 j+y Λ.'' __ 以上/ 。 17、R〗8及類固醇主鏈之Cl 7碳原子形成 ^不之内酯環。內妒援1古 學性 内知％具有下式所示之α及β立體化

〇 定義及慣例 申請專利 #以下的定義及解釋係用於在整個包括申請書及 範圍之本文件内所使用之術語。 置例及變異體定義 在申明書及中睛專利範圍中代表各種化合物或分子片段 、予式可以包括除了明確定義之結構特性之外的變異體 取代基° w子母或以底下有數字跟隨之字母確認這些變里 體取代基，例如，’’Zi’’或"Ri，，，其中？，係整數。—/、 定義 以下的定義及解釋係、用於在整個包括中請書及中請專利 範圍之本文件内所使用之術語。 所有的溫度係以攝氏度數計。 r.p.m·表示迴轉數/分鐘。 TLC表示薄層色層分離法。 84441 -17- 200406419 HPLC表示高摩、為 ^ 乂，夜相色層分離法。 psig表示磅/平方 乃央吋表壓。 D〇表不溶氧。 RO表示逆渗透。 SLM表示標準公升/分鐘。 VVM表示體積/分鐘。 OUR表示攝氧率。 在使用溶劑混合物時，所使用之溶劑比係體積/體積（v/v)。 【實施方式】 廣言之，本發明係關於γβ，！ 1α_二羥基類固醇及其製備方 法。可以使用本發明的化合物生產依普利酮。流程I係例證 一種使用7β，11α-二羥基類固醇生產依普利酮的可行性方 法0 84441 -18- 2Q〇40^419

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〇H 200406419 參閱流程I，將六甲基二矽氮烷（HMDS)(l〇〇毫升）加入在 400毫升二氯甲烷中的5〇.〇公克三醇1之攪拌泥漿中，可以 生產中間物2。接著加入糖精（0.57公克），並將混合物在回 流下加熱3小時，在此時泥漿將逐漸溶解成澄清的琥珀色溶 液。以加入水（5毫升）中止過量的HMDS。在回流下5分鐘之 後’將混合物經由在3 5 0毫升粗濾片漏斗上的3 2 · 6公克麥格 尼素之CH^Cl2濕層過濾。過濾物應該是澄清的及幾乎無色 。將濾塊以2 X 1〇〇毫升CEhCh清洗。將合併的過濾物在減 壓下濃縮，並與2 X 500毫升份量之四氫呋喃（thF)以蒸發作 用除去殘餘的二氯甲烷，在每一次加完之後濃縮至乾燥， 以得到白色固體。 將在500毫升THF中的特丁醇鉀（42.0公克）之懸浮液以冰/ 甲醇浴冷卻至9。±5。(：。將乙炔以起泡經至少1小時只加入以 中度擾拌之混合物的表面之下。經3〇分鐘加入在Thf (4〇〇 毛升）中來自以上的甲矽烷基化類固醇中間物，同時維持 〇〜5 C之反應溫度。在加完之後，將混合物在$。土 5。(^下再 攪拌1小時。緩慢加入水（1 00毫升），允許反應混合物溫熱 至15。±5它。緩慢加入125毫升之i〇% HC卜使pH降低至2·5 至3。將混合物在ρΗ 2 5至3下攪拌，如必要時加入少量5% HC1，以維持2.5至3ipH，在2〇。±5。〇下維持工至]小時。當 火角午元成日寸’則加入NaHC〇3半飽和溶液，使pH上升至5.5 至6。將混合物以醋酸乙酯毫升）稀釋及將相分開。將 水相以醋酸乙酯萃取，並將合併的醋酸乙酯相以水及食鹽 水清洗，經硫酸鎂乾燥及濃縮，以得到加成產物2。 84441 -20- 200406419 將四醇2 (50.00公克，144毫莫耳）溶解在吼啶（150毫升） 中及將所得混合物在冰浴中冷卻至<1〇。〇，可將中間物2醯 化。加入二甲胺基吡啶（DMAP)(1.7公克，14毫莫耳），接著 以維持溶液溫度低於1 0°C之速度緩慢加入醋酸酐（4 1.4毫升 ，439毫莫耳）。在加完之後，將反應混合物溫熱至室溫。 將混合物以醋酸乙酯（75毫升）及水（50毫升）稀釋，攪拌5分 鐘及將層分開。將有機層以10% HC1 (4 X 25毫升）及接著以 出0 (2 X 5〇毫升）清洗，經MgS04乾燥及濃縮。自甲苯（100 毫升）再結晶產物。 將化合物3(25.4公克，54毫莫耳）與在醋酸乙酯（2〇〇毫升） 中的PPI13 (2.13公克，8.1毫莫耳）及Rh2(OAc)4 (716毫克， 1.62毫莫耳）在1/1之氫/一氧化碳混合物及17〇碌/平方英对 之壓力下加熱至約80°C經12小時，可以生成醯化中間物3 之醛化作用。將混合物在減壓下濃縮及將產物4以管柱色層 分離法（70/30之EtOAc/Hex及500公克二氧化石夕）純化。 將乳醇4 (25公克，50毫莫耳）、二氯曱烷（25〇毫升）、水（38 *升）、2,2,6,6-四曱基六氫吡啶-^氧基（Temp〇)(156毫克 ’ 1*莫耳）、KBr (595¾克，5毫莫耳）與NaHC〇3 (5_5公克 ’ 6 5耄莫耳）混合及將混合物在冰浴中冷卻至 < 丨〇，可以 完成乳醇化合物4之氧化作用。緩慢加入丨·丨克分子量次氯 酸鈉（NaOCl)溶液（50毫升，55毫莫耳）。允許混合物溫熱至 室溫及以水（50毫升）稀釋。將層分開及將有機層以食鹽水（2 X 50毫升）清洗。將有機層以MgS〇4乾燥，過濾及濃縮，以 得到成為灰白色泡沫之5。 84441 -21 - 200406419 將在20毫升甲醇中的二酷酸酯5(2.0公克）、？(1((1口口口）612 (126宅克）、二異丙胺（〇·78 毫升）、Et4NBr (260毫克）、NaBr (1 ·〇9公克）之混合物在C〇之1200磅/平方英吋及65°C下加熱 12小時，接著冷卻，濃縮及將殘餘物在以4〇_75%醋酸乙酯/ 己烧之石夕膠上經色層分離，以得到甲基酯6。 將在曱醇（50毫升）中的〇· 1 5當量碳酸鉀中的二乙醯基酯6 (5·〇1公克）之溶液在室溫下攪拌及以TLC監控反應。當不再 偵測出原料6時，則將混合物以水（2〇〇毫升）稀釋及以醋酸 乙酉旨（3 X 200毫升）萃取。將合併之萃取物以水（1〇〇毫升）及 食鹽水（1 00毫升）清洗，經硫酸鎂乾燥及在減壓時濃縮至乾 燥。將殘餘物以醋酸乙酯/己烷經矽膠色層分離，以得到3 _ 羥基化合物7。 將醇7 (6.0公克）、CH2C12(40 毫升）、水（9·〇毫升）、2,2,6,6- 四曱基六氫吡啶-1-氧基（TEMPO) (38毫克）、KBr (142毫克） 與碳酸氫鈉（4·0公克）之混合物冷卻至5。(：。將1 4· 1毫升之1 · 1 克分子量NaOCl緩慢加入該混合物中。在加完之後，允許 混合物再攪拌1小時及以稀釋的HC:酸化。將產物8以CH2C12 分離。 將在曱醇（5 〇耄升）中的〇. 1 5當量碳酸鉀中的化合物§ (5 ·〇1公克）之溶液在室溫下攪拌及以TLC監控反應。當不再 偵測出原料8時，則將混合物以水（2〇〇毫升）稀釋及以醋酸 乙酉曰（3 X 2 00毫升）萃取。將合併之萃取物以水（1〇〇毫升）及 食鹽水（1〇〇毫升）清洗，經硫酸鎂乾燥及在減壓時濃縮至乾 燥。將殘餘物以醋酸乙酯/己烷經矽膠色層分離，以得到化 84441 -22- 200406419 合物9。 將PC15 (1.08公克）加入在_5 1 °C下在THF中的化合物9之 各液中，其造成溫度上升至_48。(：。在2小時之後，將混合 物倒入水性NaHC〇3中，並以EtOAc萃取及濃縮。將物質在 以EtOAc/己烧之矽膠上經色層分離，以供應二烯化合物丨〇。 以例如在美國專利第4,559,332號及第5,981，744號所述 之已知方法’以化合物1 〇之環氧化作用產生依普利酮，將 彼以全文併入本文以供參考。 參閱圖表A，可將式（I)之雄留'酮化合物經由真 菌反應轉化成不同的類固醇中間物。例如，以式⑴之雄留 -5-烯-17-酮化合物（其中ζ^Ζ2係或簞鍵或雙鍵）與棉鈴色二 孢菌接觸會產生式（II)之7β-羥基雄留_5_烯-17-酮化合物。 以式（I)之雄甾-5-烯-17-酮化合物（其中Ζι-Ζ2係單鍵）與赭麴 菌接觸會產生式（III)之1 Ια-羥基雄甾-5-烯_ι 7-酮化合物。 驚§牙地疋以式（III)之1 Ια-羥基雄甾-5-烯-17-酮化合物與棉 鈴色二抱菌接觸無法產生式（IV)之71U心二羥基雄留_5_ 烯-17-酮化合物，反之，以式（„)之7β_羥基雄留_5_烯_17_ 酉同化合物（其中Ζ「Ζ2係單鍵）與赭麴菌接觸會產生式（IV)之 7 β，11 α - 一―基雄甾-5 -烯-1 7 -酮化合物。意外地是以式⑴之 雄甾-5-烯-17-酮化合物（其中ζ^Ζ2係單鍵）與藍色犁頭黴接 觸會直接產生式（IV)之7β，1 Ια-二經基雄甾-5-烯-17-酮化合 物。 84441 23- 200406419

A

(i)

其中ZrZ2係式I

(IV) 絲狀真菌反應物屬於色二孢菌（同義之可可球二胞菌 (B〇try〇diPlodia)、座腔二胞菌（Lasi〇dipi〇dia)、麴菌及藍色 犁頭黴種類，並通常以一期η - # J及一期營養種子階段製備。利 用二期種子接種類固醇生物轉換階段。 可以使用本文所揭示之大 法生產式（I)、（II)、（III)及（IV) 84441 '24. 200406419 之類固醇化合物，其係製造醫藥活性, r生犬員固醇（如醛 <名酮受體 拮抗劑）有用的中間物。此外，5_雄留烯_3β邛二铲 酮⑷！，其中μ、氫’ Rl7及Rl8—起係_，及鍵 係合成5-雄留烯-3β-醇-7,17-二酮有吸引力之中間物，其係 已主張對心臟疾病、免疫機能、老化及總體的健康具有利 的效應之市售的類固醇補充物。 7 β -每基化步驟之詳細説曰t 將式⑴之類固醇化合物（其中Zl_Z2係單鍵或雙鍵）在7_位 置上以微生物方式羥基化，以產生式（11)之類固醇化合物 (其中Zi-Z2係單鍵或雙鍵）。 可本在發明的方法中使用任何能夠使式⑴之類固醇蛵 7β-經基化之色二孢菌、可可球二胞菌或座腔二胞菌種類的 絲狀真菌。以使用棉鈴色二孢菌ATCC 2〇571(同義之可可球 -^(Botryodiplodia theobromae)IFO 6469) ^ B〇tryodipl〇dia ma1〇rum ATCC 24444(同義之⑽134 5〇)較佳。以使用棉 鈴色二孢菌ATCC 2〇571(同義之萊豆苗莖括病菌㈣6 更佳。 朴可以利用以活動生長之培養物、全細胞濃縮物或無細胞 卒取物形式之真菌羥化酶。使用任何本技藝認知之步驟， 以使真菌在需氧條件下的沉浸式培養液中生長及當場進行 7β-羥基化反應較佳。 可將預期的真菌在實例1及2所述之條件下使用指定之成 伤ρ養或以如那些热悉本技藝者已知的其它適合的碳及气 來源坧養通#在真菌7戸_羥基化製備作用中使用一期及^ 84441 -25- 200406419 期營養種子步驟。另一選擇係可以佔田 a蚀i ，干即j以使用一次營養種子直接 接種生物轉換介質。 可將一期％•養種子培養物在介於約20。至約37。之間的溫 度（以約28。較佳）及介於約3.0至約75之間的pH下保溫約二 至約96小時（以約48-72小時較佳）。可將二期營養種子介質 以約0.0嶋至約〇.1%(體積/體積）之一期#養種子培養物 接種（但是，典型係約0_012%(體積/體積）），並在介於約2〇。 至約37。之間的溫度下（以約28。較佳）保溫約％至約η小時 (以約60小時較佳）。二期種子介質之阳可介於、約2.$至約u 之間，但是以介於約3.〇至約5.〇之間較佳。料與二期營養 子"貝相同或頜似的生物轉換介質以約i 至約1 〇%(體 積/體積）之二期營養種子介質接種（以約3%至約％較佳/ 1約12至約72小時的初保溫期之後(以約16小時至約24小 時較佳），將式⑴之類固醇基質（以微粉型較佳）加入生物轉 ^養2中。可將成為乾粉末或水泥漿之式⑴之微粉型類 固酉子基質或以一次加入、或以連續加入或以連續進料的方 式加入。以使用濃度大於1公克/公升之式(I)之微粉型類固 醇基質錢，以大於2.5公克/公升更佳’以大於5公克/公升 更佳。允許以介於約2至約6天進行以式（I)之類固醇基 別形成式（II)之7β-羥基化產物之生物轉換，但是业型 係約3至約4天。 ” =(ι)培養所選擇之真菌及在清潔劑的存在下進行生物轉 、 《”丨可以璉自由非離子清潔劑所組成的群組，但是以 乙氧基介、p | 凡基酚及聚氧乙烯花椒聚糖酯所組成的副群組較 84441 -26- 200406419 佳’以使用聚氧乙烯花椒聚糖單油酸酯更佳）；（ϋ)培養所 選擇之真菌及在天然油的存在下進行生物轉換（天然油可 以選自（但不限於此）由篦麻油、玉米油、棉籽油、豬油、 亞麻子油、撖欖油、花生油、葡萄籽油、紅花籽油、大豆 油向日癸籽油及小麥胚芽油所組成的群組，以使用大豆 油較佳；（iii)使用在⑴及（ii)中確認的方法之組合可以明顯 改進7β-羥基化作用之速度及程度。 旦完成以式（I)之類固醇基質成為式（Η)之7β_羥基化產 物之生物轉換時，則可以使用任何一種許多本技藝認知之 步驟分離式（II)化合物。以使用有機溶劑（如甲醇、丙酮、 酉曰酉文丁酉曰或一氣甲烧）萃取過渡或離心之啤酒固體及以結 曰曰作用分離式（II)之7β-羥基化產物較佳。結晶溶劑包括（但 不限於此）選自由水、曱醇、丙酮、醋酸丁酯、二氯甲烷或 彼之結合物所組成的群組之溶劑。對式（11)之7卜羥基化產 物較佳的萃取作用及結晶溶劑係二氯甲烷。 ϋα-羥基化步驟之詳細說明 將式⑴或（II)之類固醇化合物（其中ζ「ζ2係單鍵）在n—位 置上以微生物方式羥基化，分別產生式（ΠΙ)或（IV)之類固醇 化合物。 可本在發明的方法中使用任何能夠使式⑴或（11)之類固 醇（其中ΖγΖ2係單鍵）經丨丨α-羥基化之麴菌種類的絲狀真菌 以使用赭麴菌ATCC 1 8500(同義之NRRL 405)較佳。 乂利用以活動生長之培養物、全細胞濃縮物或無細胞 卞取物形式之真菌羥化酶。使用任何本技藝認知的步驟， 84441 -27- 200406419 以使真菌在需氧條件下的沉浸式培養液中生長及當場進行 11 α -經基化反應較佳。 可將預期的真菌在實例3及4所述之條件下使用指定之成 份培養或以如那些熟悉本技藝者已知的其它適合的碳及礼 來源培養。通常在真菌11α_經基化製備作用中使用一期及 二期營養種子步.驟。另一選擇係可以<吏用一期營養種子直 接接種生物轉換介質。 可將一期營養種子培養物在介於約2〇。至約之間的溫 度（以約28。較佳）及介於約3·〇至約7·5之間的ρΗ下保溫約^ 至約96小時（以約48-72小時較佳）。可將二期營養種子介質 以約0.006%至約〇.1%(體積/體積）之一期營養種子培養物 接種（但是，典型係約0·012% (體積/體積）），並在介於約2〇。 至約37。之間的溫度下（以約28。較佳）保溫約％至約72小時 (以約60小日寺較佳）。二期種子介質之_可以介於約2·5至約 之間，但是以介於約3·〇至約5.0之間較佳。將可與二期 營養種子介質相同或類似的生物轉換介質以約1%至約 1 〇%(體積/體積）之二期營養種子介質接種（以約3%至約5% 較佳）。在約1 2至約72小時的初保溫期之後（以約i 6小時至 約24小時較佳），將式⑴或（11)之類固醇基質（其中Z「Z2係單 鍵）加入生物轉換培養物中。以微粉型基質較佳。可將成為 乾粉末或水泥漿之式（I)或（Η)之微粉型類固醇基質（其中 Ζ丨-Ζ2係單鍵）或以一次加入、或以連續加入或以連續進料的 方式加入。以使用濃度大於i公克/公升之式⑴或（π)之微粉 型類固醇基質（其中ΖγΖ2係單鍵）較佳，以大於2·5公克/公升 84441 -28- 200406419 更佳，以大於5公克/公升甚至更佳。允許以介於約丨至約6 天進行以式⑴或（π)之類固醇基質（其中Z]_Z2係單鍵）分別 形成式（III)或（IV)之11α-經基化產物之生物轉換，但是典型 係約2至約3天。 ' 以（1)培養所選擇之真菌及在清潔劑的存在下進行生物轉 換“办劑可以選自由非離子清潔齊:所組成的群組，但是以 乙氧基化烷基酚及聚氧乙烯花椒聚糖酯所組成的副群組較 佳’以使用纟基苯氧基聚乙氧基乙醇或壬基苯氧基聚乙氧 基乙醇更佳）；（ii)培養所選擇之真菌及在天然油的存在下 進仃生物轉換（天然油可以選自（但不限於此）由篦麻油、玉 米油、棉籽油、豬油、亞麻子油、橄欖油、花生油、葡萄 軒油、紅花軒油、大豆油、向日葵籽油及小麥胚芽油所組 成的群組，以使用大豆油較佳；（iii)使用在⑴及〇i)中確認 的方法之組合可以明顯改進11α_羥基化作用之速度及程度。 、一旦完成以式⑴或（II)之類固醇基質（其中ζ「ζ2係單鍵） 、為弋（III)或（IV)之11 基化產物之生物轉換時，則可以 2用任何一種許多本技藝認知之步驟分離式（III)或（IV)化 口物、以使用水互溶性有機溶劑（如甲醇或丙酮）在低至約 c或间達約5 5 c之溫度下萃取過濾或離心之啤酒固體或 ^ 酉較仏較佳的卒取溫度係約4 5 - 5 0 °C。以除去有機溶 劑之洛發結晶作用及冷卻產生式（III)或（IV)之粗11α-羥基 產物車又佳的卒取溶劑混合物係80-85%丙酮/1 5-20%水。 棄置所消耗之水性液體。 以石反處理及結晶作用純化式（ΠΙ)或（IV)之粗結晶狀11α— 84441 -29- 200406419 經基化產物。最妨:推用ώ 、、 取子使用砥自（但不限於此）由甲醇或丙酮所 組成的群組之水互滚^料、、交添卜 奋合Μ進行碳處理及接著的結晶作用 。較佳的碳處理/結晶溶劑係甲醇。在以過濾除去礙之後， 以溶劑的蒸發作用及冷卻進行結晶作用。 使用已知的化學方法消除式_產物之u喝，可以 產生式⑴化合物（其中Ζι-Ζ2係雙鍵）。 將式⑴之類固醇化合物（其中Ζι_Ζ2係單鍵）在7-位置及 1 1 -位置上以微生物方式A VL 令 工基化’以產生式（IV)之類固醇化 合物。 可本在發明的方法中使用任何能夠使式⑴之類固醇(其 Γ1_Ζ2係單鍵）經7β，ιΐα_二經基化之舉頭黴種類的絲狀真 困。以使用鱼色#頭黴ATCC 6647(同義之犁頭徽难佳。 “可乂利用以活動生長之培養物、全細胞濃縮物或無細胞 :取物形式，真菌經化酶（類）。使用任何本技藝認知的步 以使真菌在需氧條件下的沉浸式培養液中生長及當場 進行7β-及ΐΐα_羥基化反應較佳。 可將預期的直菌名每点丨< & e , 、、 〃 口在貝例5所述之條件下使用指定之成份 ^口養或以如那些熟悉本技藝者已知的其它適合的碳及氮來 源培養。通常在真菌7β，11α_二羥基化製備作用中使用一期 及』呂養種子步驟。另一選擇係可以使用一期營養種子 直接接種生物轉換介質。 " ”月呂養種子培養物在介於約20。至約37。之間的溫 度（以⑽。較佳）及介於約3·〇至約7 5之間的pH下保溫約Μ 84441 -30- 200406419 至約96小時（以約48-72小時較佳）。可將與一期營養種子介 質相同或類似的二期營養種子介質以約〇 〇〇6%至約〇1〇/。 (體積/體積）之一期營養種子培養物接種（但是，典型係約 0.01 2%(體積/體積）），並在介於約2〇。至約37。之間的溫度下 (以約28。較佳）保溫約36至約96小時（以約7〇至8〇小時較"佳） 。二期種子介質之pH可介於約2.5至約7·5之間，但是以介 於約3.0至約7.0之間較佳。將可與二期營養種子介質相同或 類似的生物轉換介質以約1%至約1〇%(體積/體積）之二期營 養種子介質接種（以約3%至約5%較佳ρ在約12至約72小日^ 的初保溫期之後（以約15小時至約24小時較佳），將式⑴之 類固醇基質（其中Ζι·Ζ2係單鍵）加人生物轉換培養物中。以 微粉型基質較佳。可將成為乾粉末或水泥聚之式⑴之微於 型類固醇基質（其中Ζ1_Ζ2係單鍵）或以—次加人、或以Μ 加入或以連續進料的方式加入。以使用濃度…公克/公 升之式（I)之微粉型類固醇基質（其中Ζι·Ζ2係單鍵）較佳，2 ;.5 Α克/公升更佳，以大於5公克/公升甚至更佳。允 =介於約2至約9天進行以式⑴之類固醇基質（其中^义係 早鍵）形成式（IV)之11α-經基化產物之生物轉換，但是血型 至約7天。一旦完成以式⑴之類固醇基質（其中Μ 係=成為綱之勒…基化產物之生物轉換時

:Μ使用任何—種許多本技藝認知之步驟分離式（IV 化。物。以使用水互溶性右六 有栈/奋鈉（如曱醇或丙酮）在低至 、、、 或高達約HI之溫度下萃取過滹戋離心之啤嘀$ μ 或全啤酒較佳。較佳的萃取、、”二“ #之卑/酉固體 十取7皿度係約45-5(TC。以除去有機 84441 -31 - 200406419 浴劑之療發結晶作用及冷卻產生式IV之粗7β，11α-二羥基 化產物。較佳的萃取溶劑混合物係8〇%丙酮/2〇%水。棄置 所消耗之水性液體。 以二氯曱燒濕磨除去不希望的雜質，接著以碳處理及結 晶作用，以純化式（IV)之粗結晶狀7β，11α-二羥基化產物。 最好使用選自（但不限於此）由甲醇或丙酮或混合物所組成 的群組之水互溶性溶劑進行碳處理及接著的結晶作用。較 佳的奴處理/結晶溶液係甲醇。在以過濾除去碳之後，以溶 劑的蒸發作用及冷卻達成產物結晶作用。 貫例 咸^熟悉本技藝的人在沒有進一步的推敲下使用前述說 明完整應用本發明。以下詳細的實例說明如何製備各種化 合物及/或進行本發明的各種方法，不論如何只是將其作為 例證解釋而已，不是以任何方式限制前述之揭示内容。那 些熟悉本技藝的人將迅速確認對反應物和反應條件兩者適 當的步驟及技術變化。 种-1 / •酮（也稱為 係取自位於中國之JiangSU Wujin製藥 實例1 5-雄甾烯-3曰-醇-17_酮（1，其中11|[， ^ K17,18 =酮 j Z「Z2係單鍵）成為5_雄留烯_3β，7β_二醇-酉同（ ，其中氫，hue酮及Zl_Z2係單鍵）之生物專 換 …、、爪I苺1枯病 IFO 6469)之沉浸式培養液以1〇-公升發酵規格進行$雄 84441 -32 - 200406419 烯-3卜醇-17-酮成為5-雄甾 換。 烯-3 β，7 β - 一醇-1 7 - S同之生物轉 ίΑΙ^翻^子階段 夕將冷凍之棉鈐色二孢菌ATCC 20571的營養細胞解凍，轉 移至馬鈴薯-右旋糖-瓊脂盤（PDA)中及在28。下保溫72小時 使用單菌絲體塞（6_7毫米直徑）接種包括1〇〇毫升一期種子 ^貝之矽化的500毫升刻度之搖動瓶中。一期種子介質係由 (每公升逆滲透水）·· 50公克糊精、35公克豆粉、5公克塞瑞 糖2¾克氯化鈷六水合物、〇.5毫升矽酮除泡劑471) 所組成的，並以氫氧化鈉（2當量）調整成消毒前7.〇_7.2 。將棉鈴色二孢菌ATCC 2〇571使用設定在28〇轉/分鐘。英 吋執道動程）之環控型保溫搖動器在28。下保溫48小時。 ⑵）一期種子階段 使用1.2笔升一期營養種子培養物接種1 〇公升二期種子 t酵液（0_012%[體積/體積]接種率）。二期種子介質包括（每 △升逻渗透水” 60公克塞瑞糖、25公克豆粉、3〇毫升大豆 油、1公克硫酸鎂七水合物、〇·74公克磷酸二氫鉀、2毫升 聚氧乙烯花椒聚糖單油酸酯、〇·5毫升矽酮除泡劑（SAQ AH) ，亚以濃縮硫酸調整成消毒前pH 3 95_4•⑼。將包括二期種 ^丨貝之gx酵液在1 2 1。下同時使用夾套及注射流消毒2 〇分 銨。在消毒期間的攪動率係2〇〇轉/分鐘。在消毒後，使用 …、菌石瓜&L (5 /〇)將介夤pH調整至4·0。將棉鈴色二孢菌ATcC 2057 1使用以下的初期參數在28。下保溫：1〇〇轉/分鐘之攪 動率，反壓-5磅/平方英吋表壓；氣流=2.5 SLM (〇.25 vvm) 84441 200406419 ’ 30%之低溶氧值設定點；無任何的阳控制。當溶氧值先 下卩牛至3〇%時，則將氣流增加至5 SLM (0.5 VVM)。當培養 物再達到低洛氧值時，則使用擾動控制維持浙。之溶氧值 。在接種後約60小時收成二期種子培養物，此 介於約1〇至約15毫莫耳/公升/小時之間。 “车係 LQ)類固遵__生物韓換 使用500毫升二期營養種子培養物接種1〇公升類固醇生 2轉換發酵液（5%[體積/體積]接種率）。類固醇生物轉換介 貝與一期種子介質相同。消毒條件及PH調整係如二期種子 介質所述者。將棉鈴色二孢菌ATCC 20571使用基本上與二 期種子培養所使用相同的初期參數（除了低溶氧設定點自 〇曰加至50/〇之外）在28。下保溫。當溶氧值先下降至50〇/〇 寸則將氣机自2.5 SLM (0.25 VVM)增加至5 SLM (0.5 VVM) 田k養物再達到低溶氧值時，則使用攪動控制維持5〇% 之溶氧值。在接種後24小時開始將在以最少量的ο.]%聚氧 乙稀花椒聚糖單油酸酯中製成泥漿之微粉型5_雄留烯_3 酉子1 7-酮以1小時間隔加入發酵液中，直到總共加入4〇〇公 克為止。在接種後約3天，將另外1 〇〇公克塞瑞糖加入丨〇公 升發酵液中。 使用TLC以每天為基礎檢定用於5-雄留烯-3β，7(3_二醇_17 酬1之生物轉換培養物。將1毫升全啤酒以丨〇毫升甲醇萃取。 將細胞以離心作用（以3,〇〇〇 ^經1〇分鐘）與水-甲醇混合物 分離’並將數微升加在TLC板上。將TLC板在環己烷：醋酸 乙酉曰·甲醇（90:60:15)中顯影，並以50%硫酸喷霧TLC及接 84441 -34- 200406419 著在烘箱中炭化，使產物影像化。將產物與真實性標準比 較，其在以5〇%硫酸噴霧時變成藍色。在接種後約—成 以雄留烯*醇-17-酮成為5-雄留稀_3β斗二醇π:之 生物轉換。 (D)分離步 將收成時之全啤酒離心及以離心回收富集固體。將富隼 :體以10公升二氯甲烷萃取及以離心回收富集萃取物：： 萃取物精煉及以蒸鶴濃縮成約1公升，並將晶體泥漿冷卻至 -10°C。以過濾回收晶體，以冷二氯甲烷清洗，以除去色彩 ，並乾燥，以得到227公克純化之結晶狀5_雄留浠_3β，7卜 二醇-17-酮。 ’ 貫例2 W1 雄甾二烯-3β-醇-17-酮（j，其中气 r17J8=酮及Zl-z2係雙鍵）成為5,9(11)_雄^ =烯 -3β，7β-二醇-17__(„ ’其中 &氫，Km，及 Ζι-Ζ2係雙鍵）之生物轉換 使用棉鈴色二孢菌ATCC 2057U同義之萊豆苗莖枯病w IFO 6469)之沉浸式培養液以10_公升發酵規格進行5,9(ι = 雄留二烯-3β-醇-17-酮成為5,9(11)_雄留二烯_3β,γ卜二醇 -1 7 - g同之生物轉換。 ~ 期種子階 如實例1所述製備一期種子培養物。 期種子階段 如實例1所述製備10公升二期種子培養物。 84441 -35- 200406419 L _c)類固醇生物轉換 後：貫二所述製備10公升類固醇生物轉換培養物。在接種 西…制：，將在以最少量的0.2%聚氧乙烯花椒聚糖單油 ^中衣成泥漿之120公克微粉型5,9⑴)_雄留二烯制 -17-酮加入10公升發酵液中。 使用如實例1所述之步驟，以每天為基礎檢定用於 ’（）A隹田一烯_叩，70_二醇_17_酮之生物轉換培養物。在 接種後約3天完成以5,9叫雄留二烯_3卜醇_17_綱成為 5,9(11)-雄留二烯_3(3,7|3_二醇_17__之生物轉換。 )分離步驟 乂離U回收來自全啤酒之富集固體。將液體啤酒相使用 15公升二鼠甲烧萃取。在沉降之後，傾析及棄置消耗之上 啤酒層。接著使用剩餘之富集二氣甲烷萃取富集固體。自 消耗之固體排出所得富集二氣甲烷萃取液，精煉，以蒸鶴 濃縮成約0.5公升及冷卻至_1〇t。以過濾回收所獲得的晶體 ，以醋酸正丁酯清洗，以除去色彩，並乾燥，以得到52二 公克純化之結晶狀5,9(U)_雄留二烯·3(3,7卜二醇_n_酮。 貫例3 5-雄甾烯醇_17_酮（1，其中Rs=氫，Ri7i8 =酮及

Zl_Z2係單鍵）成為5-雄甾烯-3β，11α-二醇-17-酮（π ，其中R3=氫，R1718=酮及Zl-Z2係單鍵）之生物轉 換 使用赭麴菌AT CC 18500(同義之NRRL 4〇5)之沉浸式培養 液以10-公升發酵規格進行5_雄留烯(3-醇4 7_酮成為5_雄 甾烯-3 β，11 α -二醇-1 7 - _之生物轉換。 84441 -36 - 200406419 (A)—期種子階段 如以棉鈴色二孢菌ATCC 20571所述之實例1製備赭麴菌 ATCC 1 8500之一期種子培養物。 (B)二期種子階段 使用1 _ 2毫升一期營養種子培養物接種1 〇公升二期種子 發酵液（0.01 2%[體積/體積]接種率）。二期種子介質包括（每 公升逆摩透水）· 40公克塞瑞糖、25公克豆粉、30毫升大豆 油、1公克硫酸鎂七水合物、0.74公克磷酸二氫鉀、〇25毫 升壬基本氧基I乙氧基乙醇、0.5¾升石夕_除泡劑（sag 471) ’並以》辰細硫酸調整成消毒前pH 3 ·95 -4 · 0〇。將包括二期種 子介質之發酵液在121。下同時使用夾套及注射流消毒2〇分 鐘。在消毒期間的攪動率係2〇〇轉/分鐘。在消毒後，使用 無菌硫酸（5%)將介質pH調整至4.〇。將豬麴菌atcc 185⑻ 使用以下的初期參數在28。下保溫：1〇〇轉/分鐘之攪動率； 反壓=5碌/平方英叶表壓；氣流=2.5SLM(().25 VVM); 5〇% 之低溶氧設定點；無任何的阳控制。#溶氧值先下降至观 時：則將氣流增加至5 SLM (〇 5 VVM)。當培養物再達到低 溶氧值時，則使用攪動控制維持观之溶氧值 種後50至54小時之間你士 —如接2 、， 、接 介於約20至約26毫莫耳/公升/小時之間。 暴乳车係 懇固醇生物 使用500笔升二期營養種子培養物接種1〇公升 物轉換發料（5%[體積/體積]接:二 質基本上與二期種1颂口 S予生物轉換介 種子介質相同’除了將壬基苯氧基聚乙氧 84441 -37- 200406419 基乙醇自0.25毫升/公升增加至2毫升/公升及使用濃縮硫酸 將消毒前PH調整至2.95_3·⑽之外。消毒條件係、如二期種子 介質所述。在消毒後，使用無菌硫酸(5%)將介質pH調整至 3.0。將M gATCC 18500㈣基本上與二期種子培養所使 用相同的初期參數（除了將初期檀動設定在轉/分鐘之 外）在28°下保溫。在接種後約18小時’將在以最少量的ο.]% 壬基苯氧基聚乙氧基乙醇中製成泥漿之2〇〇公克微粉型％ 雄甾烯-3β-醇-17-酮加入1〇公升發酵液中。 使用TLC以每天為基礎檢定用於5_雄留烯，，二醇 -17-酮之生物轉換培養物。將丨毫升全啤酒以19毫升甲醇萃 取。將細胞以離心作用（以3,〇〇〇 ^經1〇分鐘）與水-甲醇= 合物分離，並將數微升加在。將TLC板在環己烧： 醋酸乙酯：曱醇（90:60:15)中顯影，並以5〇%硫酸噴霧tlc 及接著在烘箱中炭化’使產物影像化。在接種後約3天完成 以5-雄留烯斗醇_17_酮成為5•雄㈣_3β,ιΐα_二醇同 之生物轉換。 (D)分離步驟 以離心回收全啤酒固體。將液體棄置。將富集固體在C 。。至50。。下以10公升之85%丙酮與15%水萃取及以離心回 收富集萃取物。以蒸餾除去丙酮的方式濃縮萃取物，以產 生粗晶體水性泥漿。以過濾回收粗晶體及將母液棄置。將 水濕性粗晶體以加熱至5 5溶解在7〇〇毫升甲醇中及接著 以5公克DarcoG-60-碳脫色。在以過濾除去碳之後，將過濾 物濃縮，使產物結晶。以加入3〇〇毫升醋酸正丁酯及濃縮成 84441 -38 - 200406419 厚晶體泥漿的方式進一步除去"。將晶體過濾，以醋酸 正丁醋清洗及乾燥’以得到】7 4公克純化之結晶狀5 _ -3 β，1 1 α -二醇-1 7 -酉同。 實例4 5-雄留烯,π-二醇_17_酮(11，其中 酮及Ζι·Ζ2係單鍵）成為5-雄甾烯-3β，7β，1ΐα_三醇 -17-酮（1从，其中尺3==氫，1117,18 =酮）之生物轉換 使用赭麴囷ATCC 1 8500(同義之NRRL4〇5)之沉浸式讲養 液以⑻公升發酵規格進行5⑽烯_3β，7卜二醇] η”烯观11α_三醇_17,之生物轉換。 種子階段 如實例3所述製備赭麴菌ATCC 185〇〇之一期種子培養物。 期種子卩皆段 士貝、例3所返製備1〇公升褚麵菌atcc ⑻之二 培養物。 一μ裡卞 生物韓換 如男、例3所达製備10公升赭麴菌atcc 18則之類固醇生 物轉換培養物。 、- ^接種後約18小時，將在以最少量的0.2%壬基笨氧基聚 ^氧基乙％中製成泥浆之·公克微粉型5_雄留烯 二醇-17-酮加入10公升發酵液中。 ， /吏用如貫例1所述之步驟，以每天為基礎檢定用於5_雄留 稀HUai醇之生物轉換培養物。在接種後約4 天&成以5-雄甾烯_3β，7β_二醇_17_酮成為^雄甾烯 _3β，7β，11α-三醇之生物轉換。 84441 -39- 200406419 (D)分離步 以離、回收全啤酒固體。將液體棄置。將富集固體在Μ C至50 C下以1〇公升之8〇%丙酮與2〇%水萃取及以過濾澄 清溫卒取液。以蒸餾除去丙酮的方式濃縮富集過濾物，以 產生粗日日肖五水性泥漿。以過濾回收粗晶體及將母液棄置。 將水濕性晶冑以600毫升二氯甲烧濕磨"以除去痒隹質，溶解 在7〇〇寬升甲醇中（以加熱至55t )及接著以5公克Darco G-60-奴脫色。在以過濾除去碳之後，將過濾物濃縮，使產 物結晶。以加入300毫升醋酸正丁酯及濃縮成厚晶體泥漿的 方式進步除去曱醇。將晶體過濾，以醋酸正丁酯清洗及 乾燥，以得到158公克純化之結晶狀5_雄㈣三 Sy* -1 7 - §同。 貫例5 5-雄留稀-3β_醇]7_酮（1，其中R3 =氫，Ri7，〗8 =嗣及 Z〖-Z2係單鍵）成為5·雄留烯_3β，7β,11α_三醇_ΐ7·酮 (IV，其中Rf氫，Ri?18 =酮）之生物轉換 使用藍色犁頭黴ATCC 6647(同義之犁頭黴）之沉浸式谇 養液以1〇-公升發酵規格進行5_雄留烯_3卜醇_17__成為 雄留烯_30，70，11.三醇_17-酮之生物轉換。 子階段

如以棉鈴色二孢菌ATCC 20571所述之實例i製備藍色犁 頭黴ATCC 6647之-期種子培養物。 I 子階段 使用1.2宅升一期營養種子培養物接種丨〇公— 1 一檀子 叙酵液（0.01 2%[體積/體積]接種率）。二期種子介質包括（每 84441 -40. 200406419 公升逆滲透水）· 50公克糊精、35公克豆粉、5公克塞瑞糖 、2毫克氯化鈷六水合物、〇·5毫升矽酮除泡劑（SAG 471); 並以濃縮硫酸调整成消毒前pH 4 · 9 5 - 5.0〇。將包括二期種子 介質之發酵液在121。下同時使用夾套及注射流消毒⑼分鐘 。在消毒期間的攪動率係200轉/分鐘。在消毒後，使用無 菌硫酸（5%)將介質pH調整至5·〇。將藍色犁頭黴ATCC 6647 使用以下的初期參數在28。下保溫：鐘之攪動率； 反壓=5磅/平方英吋表壓；氣流=2.5SLM(〇 25 vvm); 5q% 之低溶氧設定點；無任何的pH控制。當溶氧值先下降至3〇% 時，則將氣流增加至5 SLM (0.5 VVM)。當培養物再達到低 溶氧值時，則使用攪動控制維持30%之溶氧值。在接種後 約76小時收成二期種子培養物，此時攝氧率係介於約4至約 7毫莫耳/公升/小時之間。

Lg)類固醢峰物轉挣 使用5 00耄升一期營養種子培養物接種丨〇公升類固醇生 物轉換發酵液（5%[體積/體積]接種率）。類固醇生物轉換介 質包括（每公升逆滲透水）：5〇公克糊精、35公克豆粉、加 公克塞瑞糖、〇·5毫升矽酮除泡劑（SAG 471);以濃縮硫酸 凋整成消毒前pH 2.95-3.00。消毒條件係如二期種子介質所 ^ 在’肖毋後，使用媒囷硫酸（5%)將介質pH調整至3 ·〇 j將 監色犁頭黴ATCC 6647使用與二期種子培養所使用相同的 不刀期芩數在28。下保溫。在接種後約17小時，將在以最少量 的〇·2%辛基苯氧基聚乙氧基乙醇中製成泥漿之200公克微 知型5-雄留烯_3β-醇-17-酮加入1〇公升發酵液中。 84441 -41 - 200406419 如實例1所述，使用TLC以每天為基礎檢定用於5_雄留烯 -3β，7β，11α-三醇-17-酮之生物轉換培養物。在接種後約6_7 天完成以5-雄甾烯-3β-醇-17-酮成為雄甾烯1(χ_ 三醇-1 7 ·酮之生物轉換。 (D)分離步驟 以離心回收全啤酒固體。將液體棄置。將富集固體在45 。(：至50°C下以10公升之85%丙酮與15%水萃取及以過濾澄 清溫萃取液。以蒸餾除去丙酮的方式濃縮富集過濾物，以 產生粗晶體水性泥漿。將晶體泥漿過濾及將母液棄置。將 水濕性晶體以6 0 0宅升二氯曱；I：完濕磨，以除去雜質，溶解在 700毫升甲醇中（以加熱至5yc)及接著以5公克Darco G-60_ 碳脫色。在以過濾除去碳之後，將過濾物濃縮，使產物結 晶。以加入3 00毫升醋酸正丁酯及濃縮成厚晶體泥漿的方式 進一步除去甲醇。將晶體過濾，以醋酸正丁酯清洗及乾燥 ’以得到75.5公克粗結晶狀5_雄甾烯-3β，7β，11α-三醇-17- 酉同0 將粗晶體以600毫升二氣曱烧濕磨，以除去另外的雜質， 溶解在700毫升曱醇中（以加熱至55它）及接著以5公克 Darco G-60-碳脫色。在以過濾除去碳之後，將過濾物濃縮 ，使產物結晶。以加入3 00毫升醋酸正丁酯及濃縮成厚晶體 泥漿的方式進一步除去甲醇。將晶體過濾，以醋酸正丁酯 清洗及乾燥，以得到42.1公克純化之結晶狀5-雄甾烯 -3β，7β，11α -三醇-17 -i同。 84441 -42- 200406419 實例6 :自5-雄甾烯-3 β，11α-二醇-17-酮製備5,9(11)-雄甾二 炸- 3β -酵-17 -酉同

步驟1 將TMEDA (18.1毫升，120毫莫耳）加入在CH2C12 (300毫 升）中的5-雄甾烯-3β，11α-二醇-17-酮（30.4公克，100毫莫耳） 之泥漿中。將泥將冷卻至-l〇t及加入氯基甲酸甲酯（7.72 毫升’ 100毫莫耳）。允許反應溫熱至室溫。以TLC測定反應 未完成，所以加入更多氯基曱酸曱酯（772微升，10毫莫耳） 。以TLC測定反應完成時，則加入Et〇Ac (3 00毫升）及^120 (100毫升），並將所得層分開。將有機相以5〇毫升H2〇清洗 ’經MgS〇4乾燥及濃縮成油，其會在靜置時固化。自熱 EtOAc/Ci^Cl2及庚烷再結晶粗產物。將泥漿進一步冷卻至 〇-5°C及以過濾收集產物（22公克，60·8%化學量）。將碳酸鹽 經以5%-20%丙_ /CHKl2梯度溶離之矽膠的管柱色層分離 法進一步純化，以獲得純單碳酸鹽（2〇·57公克，56.8%)。 步驟2 將步驟1之碳酸鹽（38.0公克，〇1〇5莫耳）溶解在57〇毫升 84441 -43- 200406419 THF中及冷部至。以維持溫度低於的緩慢方式加 入固月且PC1^37·1公克，〇·178莫耳）。當TLC顯示反應完成 ，，則將混合物倒人冷NaHc〇3溶液中及將產物以醋酸乙醋 卒取。將有機層經MgS〇4乾燥及濃縮，以供應油。 步驟3 將步驟2之該油溶解在甲醇（5〇〇毫升）中，並以％•丨公 ICO3處理及將混合物在室溫下攪拌15小時。以過濾除 殘餘碳酸鹽。將溶液部份濃縮，並以加入水沉殿預；： 稀系醇，將其在45t之洪箱中乾燥。產量29.52公克— 84441 44 -

Claims (1)

1. 200406419 拾、申請專利範圍： 1· 一種式（II)之7β-羥基類固醇，

   其中113係： (1) -Η ; (2) -CO-R4 其中R4係HSCVCs烷基； 其中R17及R18 —起形成=0或 其中R〗7及Ri8和與彼結合之類固醇主鏈之C17碳原子 一起形成下式之内酯環

   其中Z^Z2係單鍵或雙鍵。 2. 根據申請專利範圍第1項之7β-羥基類固醇（II)，其中R3 係Η。 3. 根據申請專利範圍第2項之7β-羥基類固醇（II)，其中R3 係-C(〇）-CH3。 4. 根據申請專利範圍第1項之7β-皂基類固醇（II)，其中R17 84441 200406419 及r18形成=〇。 5. 根據申明專利範圍第丨項之7卜羥基類固醇（η)，其中& 、11丨8及類固醇主鏈之Cl7碳原子形成内酯環。 6. 根據申明專利範圍第5項之7β-羥基類固醇（π)，其中該 内酯環具有以下式所示之以及β立體化學性 7·根據申請專利範圍第1項之7β-羥基類固醇（π)，其中該 7β-羥基類固醇（II)係5-雄留烯-3β，7β-二醇-17-酮。 8.根據申請專利範圍第1項之7β-羥基類固醇（Π)，其中該 7β-羥基類固醇（II)係5,9(11)-雄留烯-3β，7β-二醇-17-酮。 9· 一種式（HI)之11α-經基類固醇

   其中R3係： ⑴-Η ; (2) -CO-R4 其中R4係烷基； 其中Rl7及Rl8—起形成=〇或 84441 -2- 200406419 八 18和與彼結合之類固醇主鏈之C 1 7碳原子 起形成下-V、^ , 乂卜式之内酯環

   其中 10 ·根據申請專利篇图贫 觀圍弟9項之1 ια_羥基類固醇（ΙΠ) R3 係 Η。 其中 Π _根據申請專利蘇图$ 乾圍弟10項之Πα-羥基類固醇（ΠΙ) R3係 _C(〇)_ch3。 其中 1 2 ·根據申睛專利翁图楚 乾圍弟9項之1 ια —羥基類固醇（m) R17及 R18形成=：〇。 其中 1 3 ·根據申請專利範圊笛 J祀固乐9項之πα-羥基類固醇（111) R17 Ru及類固醇主鏈之C17碳原子形成内酯環。 14·根據申δ月專利範圍第13項之7β-羥基類固醇（II)，其中該 内酉曰玉衣具有以下式所示之α及β立體化學性

   1 5 ·根據申請專利範圚& 现㈤罘9項之11α-羥基類固醇（III)，其中 该11 oc -經基類固酸及 醇 I 5 雄甾細-3 β，11 α -二醇-1 7 - _。 1 6. —種式（IV)之7β 1】 ^ P’Uou二羥基類固醇 84441 '中汉3係： (1) 'Η ; (2) 'C〇，r4 ^中R4係11或（：1_〇5烷基； 〜 玟17及玟18—起形成二〇或 〜起y 〇及Rl8和與彼結合之類固醇主鏈之C17碳原子 %成下式之内酯環 17. 18· 19. 20. 极：申請專利範圍第16項之7ρ，ιΐα_:羥基類 '^中R3係Η 二羥基類固醇（IV) t二羥基類固醇（IV) 根據申請專利範圍第17項之7β，η 其中 R3係-C(〇)-CH3。 據申晴專利範圍第1 6項之7 β，1 1 其中Rl7及Ru形成=〇。 據申凊專利範圍第I6項之7β，ι ια-二羥基類固醇（IV) ，其中Rn、Ru及類固醇主鏈之Cl 7碳原子形成内酯環。 84441 -4- 200406419 21.根據申請專利範圍第16項之7β-二羥基類固醇（II)，其中 該内酯環具有以下式所示之α及β立體化學性

   22. 根據申請專利範圍第16項之7β,1 Ια-二羥基類固醇（IV) ，其中該7β，11α-二羥基類固醇（IV)係5-雄甾烯-3β，7β，1 1α·三醇-17-酮。 23. —種式（II)之7β-羥基類固醇之製備方法，

   其中113係： (1) -Η ; (2) -C〇-R4 其中R4係烷基； 其中Rl7及Rl8 —起形成=〇或 其中R17及R18和與彼結合之類固醇主鏈之C17碳原子 一起形成下式之内酯環 84441 ^0406419

   其中Z!-Z2係或單鍵或雙鍵， 該方法包含 將式（I)之Δ5-類固醇

   24. 25. 26. 27. 28. (I) ^ (其中R3、Rl7、心8及zi-l係如以上之定義）與色二孢 菌之7β-羥化酶接觸。 根據申明專利範圍第23項之7β-羥基類固醇（II)之製備 方法’其中R3係Η。 根據申请專利範圍第24項之羥基類固醇（Π)之製備 方法，其中r3係_c(o)-ch3。 根據申請專利範圍第23項之7β-羥基類固醇（II)之製備 方法’其中R17及R18形成二〇。 根據申請專利範圍第23項之7β-羥基類固醇（II)之製傷 方法’其中Rn、R1S及類固醇主鏈之C17碳原子形成内 酉旨環。 根據申請專利範圍第23項之7β-羥基類固醇（II)之製備 方法’其中該内酯環具有以下式所示之α及β立體化 84441 200406419 學性

   29·根據申請專利範圍第23項之7β-羥基類固醇（II)之製備 方法’其中該羥基類固醇（II)係5-雄留烯-3 β，7β-二醇 -1 7 -嗣。 3 〇·根據申凊專利範圍第23項之7β-羥基類固醇（II)之製備 方法，其中与Γ 7 D Τ羥基類固醇（π)係5,9(11)-雄留 -3β，7β-二醇 _17一§同。 “康申明專利範圍第23項之7β-羥基類固醇(II)之製備 2 ’其中該接觸係藉由發酵作用、細胞濃縮物、全么 胞或無細胞反應。 王細 32·根據申請專利範圍 ，一 方土 弟31員之7卜羥基類固醇（II)之萝供 33 其中該接觸係藉由發酵作用。 、脅 •概據申請專利範圍第 方法，里中^ β义基類固醇（Π)之製備 34. _ /、中μ色一孢菌係棉鈐色二孢菌。 之製備方法 種式（III)之11 OU羥基類固醇 D

   - R '18 84441 (III) 其中R3係·· (1) -Η ; (2) -CO-R4 其中114係11或cvq烷基； 其中R17及R18—起形成=〇或 其中R17及Ru和與彼結合之類固醇主鏈之⑺碳 〜起形成下式之内酯環 ’、子 0 ’該方法包含·· (1)將式（I)之A5-類固醇

   35. 36. 37. (其中R3、尺”和Ru係如以上之定義及其中Ζι_Ζ2係單 鍵）與麴菌之11α-羥化酶接觸。 根據申請專利範圍第34項之11α-羥基類固醇（ΠΙ)之製 備方法，其中R3係Η。 根據申睛專利範圍第35項之11α-羥基類固醇（III)之製 備方法，其中I係-C(0)-CH3。 根據申清專利範圍第34項之1 ία-羥基類固醇（III)之製 備方法，其中Rn及Ri8形成=〇。 84441 38. 39. 傷據申睛專利範圍第34項之11α_羥基類固醇（πι)之製 方去，其中h7、Ris及類固醇主鏈之cl7碳原子形 0鲦環。 備據申睛專利乾圍第34項之11α_羥基類固醇（m)之製 埤方法，其中該内酯環具有以下式所示之以及β立體化

   40. 41. 42. 43. 44. 根據申請專利範圍 備方法，其中該1 ；[ 醇-17，。 第34項之11α_羥基類固醇（III)之製 卜羥基類固醇係5-雄甾烯-3 β，11 (X、二 根據中請專利範圍第34項之11α，基類固醇（111)之$ 備方法’讓接觸係藉由發酵作用、細胞濃縮物1 細胞或無細胞反應。 根據申請專利範圍第4 1頊夕, 負之lloc-羥基類固醇（ΙΠ)之韋 備方法，其中該接觸係藉由發酵作用。 根據申請專利範圍第34頊 、 示4負之羥基類固醇（III)之韋 備方法’其中該麴菌係褚麴菌。 種式（IV)之 7β，11α-二 _ ^基類固醇之製備方法 84441

   200406419 其中R3係： (1) -Η ； (2) -CO-R4 其中R4係^1或(^-05烷基； 其中R17及R18—起形成=0或 其中R17及R18和與彼結合之類固醇主鏈之C17碳原子 一起形成下式之内酯環

   ，該方法包含 (1)將式（II)之7β-羥基類固醇

   (其中R3、R17和r18係如以上之定義及其中z!-z2係單 鍵）與麴菌之11 α -經化酶接觸。 84441 -10- 200406419 45·根據申請專利範圍第44項之7β，11α-二羥基類固醇（IV) 之製備方法，其中以3係Η。 46·根據申請專利範圍第45項之7β，11α-二羥基類固醇（IV) 之製備方法，其中心係-c(〇）_cH3。 47·根據申請專利範圍第44項之7β，11α-二羥基類固醇（IV) 之製備方法，其中ri7及Ri8形成=0。 48.根據申請專利範圍第44項之7ρ，11α_二羥基類固醇（IV) 之製備方法，其中Ri7、Ri8及類固醇主鏈之C17碳原子 形成内酯環。 根據申凊專利範圍第48項之7β，1 Ια-二羥基類固醇（IV) 之衣備方法’其中該内酯環具有以下式所示之α及β立 體化學性

   5〇.根據申請專利範圍第 固罘4以員之7β，11α-二羥基類固醇（1 之製備方法，其中兮7 R ^ 、μ β，11α-二羥基類固醇（IV)係5-雄 細·3β，7β，11α-三醇 _17_ 酮。 5 1.根據申請專利範圍第 之制供士 t ㈤弟48項之叩，11 二經基類固醇（I 之衣備方法，其中兮接 # 、全^… 错由發酵作用、細胞濃縮 王細胞或無細胞反應。 52.根據申請專利範圍第5丨項之 一 之製備方法，复中，接總\ 5 α·二羥基類固醇（I /、中σ亥接觸係藉由發酵作用。 84441 200406419 53·根據申請專利範圍第48項之7β，11α-二羥基類固醇（IV) 之製備方法，其中該麴菌係赭麴菌。 54. —種式（IV)之7β，11α-二羥基類固醇之製備方法

   其中尺3係： (1) -Η ; (2) -CO-R4 其中R4係烷基； 其中R17及R18 —起形成=〇或 其中R!7及Ri8和與彼結合之類固醇主鏈之C1 7碳原子 一起形成下式之内酯環

   ，該方法包含 (1)將式（I)之Δ5-類固醇

   84441 -12- (其中R3、R1S和係如以上之定義及其中Z「Z2係單 人色二孢菌之7β-羥化酶接觸，以產生式（π)之7β_羥 基_固醇

   (ID (其中R3、尺”和ru係如以上之定義及其中Ζι_Ζ2係 單鍵）；及 (2)將步驟（1)之7β-羥基類固醇（11)與麴菌之ιΐα-羥化 知接觸。 5 5 ·根搪 之制申請專利範圍第54項之7β，11心二羥基類固醇（IV) 製備方法，其中R^、h。 b ·才艮# & :申請專利範圍第55項之7p，u H呈基類固醇（Iv) 之衣備方法，其中心係_C(0)_CH3 〇 :申明專利範圍第54項之7PJ 1α-二羥基類固醇（a) 之製備方法，其中Ri7及Ris形成=〇。 5δ·根=申言青專利範圍第54項之7β，11α_:經基類固醇叫 之製備方法，其中以门及尺以和與彼結合之類固醇主鏈之 c 1 7碳原子形成内酯環。 59.根=申言青專利範圍第54項之7β,ηα_二經基類固醇⑽) 之製備方法，其中該内酯環具有以下式所示之以及β立 體化學性 84441 -13 - ο 60. 根據申請專利範圍第54項之7β，11α-二羥基類固醇（IV) 之衣備方法，其中該7β，11α-二羥基類固醇（IV)· 5_雄甾 歸·3β，7β，1 Ια-三醇-17-酮。 61. 62. 63. 64, 65 66 67 根據申請專利範圍第S4項之7P，1]La_二羥基類固醇（IV) 衣備方法’其中該接觸係藉由發酵作用、細胞濃縮物 全細胞或無細胞反應。 根據申睛專利範圍第61項之7β，1 Ια-二羥基類固醇（IV) 之製備方法，其中該接觸係藉由發酵作用。 根據申請專利範圍第6丨項之7β，11α-二羥基類固醇（IV) ¥備方去，其中5亥色一孢菌係棉鈐色二孢菌。 根據申請專利範圍第61項之7β，11α-二羥基類固醇（IV) 之製備方法，其中該麴菌係赭麴菌。 .根據申請專利範圍第54項之7β，11α_二羥基類固醇（IV) 之製備方法，其中在步驟（2)的接觸之前，先不分離步 （1)之7 β »經基類固醇（η )。 •根據申請專利範圍第54項之7β，1 Ια-二羥基類固醇（IV) 之製備方法，其中在步驟（2)的接觸之前，先分離步驟（1) 之7β-羥基類固醇（Π)。 .種式（IV)之7β，11α-二羥基類固醇之製備方法 84441 -14- 200406419

   其中R3係： (1) -Η ; (2) -CO-R4 其中R4係H或cvc5烷基； 其中R17及R18—起形成=0或 其中R!7及R!8和與彼結合之類固醇主鏈之C17碳原子 一起形成下式之内酯環

   ，該方法包含 (1)將式（I)之類固醇

   (其中R3、R18和R17係如以上之定義及其中Z!-Z2係單 鍵）與犁頭黴之7β，11α-羥北酶（類）接觸。 68.根據申請專利範圍第67項之7β，11α-二羥基類固醇（IV) 84441 -15- 200406419 之製備方法，其中以3係^。 69.根據申請專利範圍第68 負之7ρ， α'〜羥基類固醇（IV) 之製備方法，其中R3係、c(o)-ch3。 70·根據申睛專利範圍第67 一 負之邛，111二羥基類固醇（IV) 之衣備方法，其中Rn及R18形成=0。 71.根據申請專利範圍第67 々制讲七， 貝之/p，Ua、—羥基類固醇（IV) 之衣備方法，其中Rl7&R ^ ^ u不”攸、、σ合之類固醇主鏈之 C 1 7反原子形成内酯環。 72·根據申請專利範圍第67 之方半^ . 貝之7Ρ，11α-二羥基類固醇（IV) 之衣備方法’其中該内酸環 體化學性 「式所不之oc及β立

   73.根據申請專利範圍第67項之7β η 之製備方法，其中該7β,11α : ζ—經基類固醇（ 稀—工基頌固醇（IV)係5_趙 74·根據申請專利範圍第67項之 之製傷方法，其中該接觸，二二經基類固醇（ 、全細胞或無細胞反應。 1酵作用、細胞濃紹 75. 根據申請專利範圍第;4項 之製備方法，其中 ，羥基類固醇（ 76. 根據申a m 丁错由發酵作用。 甲叫專利乾圍第”項 Mia-二羥基類固醇（ 84441 -16- 200406419 之製備方法，其中該犁頭黴係藍色犁頭黴。 77_ —種式I之5,9(11)-雄甾二烯之製備方法

   其中113係： (1) -H ; (2) -CO-R4 其中R4係11或<：1-€5烷基； 其中R17及R18—起形成=0或 其中R〗7及R18和與彼結合之類固醇主鏈之C1 7碳原子 一起形成下式之内酯環

   ，及ΖγΖ2係雙鍵，該方法包含： (1)提供式（III)化合物

   84441 -17- 200406419 (其中R3、R17和R18係如以上之定義）；及 (2)消除11α羥基，以形成介於义丨與冗]之間的雙鍵（式I)。 78.根據申請專利範圍第77項之方法，其中提供式III化合物 之步驟包括將式（I)之Δ5-類固醇

   (I) (其中R3、R17和R18係如以上之定義及其中單 鍵）與麴菌之11α-羥化酶接觸。 84441 18- 200406419 柒、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（ ）圖。 (二) 本代表圖之元件代表符號簡單說明： 捌、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： 84441 :^00406419 4 第〇92106；331號專利申請案(劃線） 中文申請專利範圍修正本(92年10月） 拾、申請專利範圍： 1· 一種式（II)之7β-羥基類固醇，

   其中R3係： ⑴-Η ; (2) -C〇-R4 其中R4係11或（^(：5烷基； 固醇主鏈之C17碳原子 其中R17及R18—起形成戈 其中1^7及Rls和與彼結合 一起形成下式之内酯環

   其中Ζ!_Ζ2係單鍵或雙鍵。 2 ·根據申請專利範圍第1 g 系負之7β-羥基類固醇（II)，其中F 係Η。 3 _ 根據申請專利蘇圚笛？ s 摩Μ第2項之7β-羥基類固醇（II)，其中R 係-c(o)-ch3。 4 · 根據申請專利筋圍笛〗5 J乾圍弟1項之7β_羥基類固醇（π)，其中Ri 84441 及汉18形成=0。 5.根據申請專利範圍第丨項之7β_經基類固醇（π)，其中 、及類固醇主鏈之C17碳原子形成内酯環。 6·根據申請專利範圍第5項之7β-羥基類固醇（11)，其中該 内私環具有以下式所示之β立體化學性 Α。 7·根據申請專利範圍第1項之7β_羥基類固醇，其中該 7 3-經基類固醇（11)係5_雄留烯-30，70_二醇_17-酮。 8.根據申請專利範圍第1項之7β-羥基類固醇（II)，其中該 7β-羥基類固醇（II)係5,9(11)_雄留烯-30，70-二醇-17_酮。 9· 一種式（III)之11α-羥基類固醇

   其中R3係： (1) -H ； (2) -C0-R4 其中$ 4係Η或C i - C 5烧基； 其中Rl7及Rl8—起形成=〇或 84441 200406419 其中圬u及R18和 一起形成下式之内 u和與彼結合之類固醇主鏈之C1 7碳原子

   之11α-羥基類固醇（in)，其中 根據申請專利範圍第9項 尺3係Η 〇 粑據申明專利範圍第10項之1 Ια-羥基類固醇（III)，其中 R3係-C(〇)-CH3。 根據申凊專利範圍第9項之11α-羥基類固醇（III)，其中 R!7及R18形成=〇。 •根據申晴專利範圍第9項之11α-羥基類固醇（III)，其中 Ri7、及類固醇主鏈之C17碳原子形成内酯環。 4·根據申晴專利範圍第13項之；Lg4ia_羥基類固醇四⑴， 其中该内酿環具有以下式所示之a及β立體化學性

   15·根據申清專利範圍第9項之11α-羥基類固醇（ΠΙ)，其中 該11 a-經基類固醇係5 —種式（IV)之 7β，11α_. 你5-雄甾烯-3β，11α-二醇-17-酮。 心二羥基類固醇 84441 2UU4U6419

   (2) -C〇_r4 其中係H或CVC5烷基； 八中R17及Rl8 —起形成=〇或 /、中Ri7&Ru和與彼結合之类員固醇主鏈之C17碳原子 起形成下式之内酯環 根據申明專利範圍第16項之7β，11α_二經基類固醇（〗v) ’其中R3係Η。 8·根據申明專利範圍第丨7項之7p，i 1α_二羥基類固醇（ιν) ，其中 R3係-C(0)-CH3。 19·根據申請專利範圍第16項之7β，11α_二羥基類固醇（ιν) ’其中R17及r18形成=〇。 20.根據申請專利範圍第16項之7β，ΐ ια_二羥基類固醇（IV) ’其中Ri7、Ri s及類固醇主鏈之C1 7碳原子形成内酯環。 84441 -4- 200406419 21.根據申請專利範圍第16項之7(3JLloc-二羥基類固醇 ，其中該内酯環具有以下式所示之α及β立體化學性

   22. 根據申請專利範圍第16項之7β，11α-二羥基類固醇（IV) ，其中該7β，11α-二羥基類固醇（IV)係5 -雄甾烯-3β，7β，11α-三醇-17-酮。 23. —種式（II)之7β-羥基類固醇之製備方法，

   其中R3係： (1) -H ； (2) -CO-R4 其中R4係11或(：1-C5烷基； 其中R17及R18—起形成=〇或 其中R17及R18和與彼結合之類固醇主鏈之C17碳原子 一起形成下式之内酯環 84441 200406419

   其中Z^Z2係或單鍵或雙鍵， 該方法包含 將式⑴之類固醇

   R18 24. 25. 26. 27. 28. (其中 R3、R17、R ；5 7 7 ) — 18及Zl-Z2係如以上之定義）與色二孢 囷之7 β -經化酶接觸。 把據申明專利範圍第23項之7卜經基類固醇（II)之製備 方法，其中R3係Η。 根據申請專利範圍第24項之7β_羥基類固醇（π)之製備 方法，其中R3係-C(0)-CH3。 根據申請專利範圍第23項之7β_羥基類固醇（11)之製備 方法，其中R17及r18形成=〇。 根據申請專利範圍第23項之7β_羥基類固醇（11)之製備 方去，其中R1?、Rl8及類固醇主鏈之C17碳原子形成内 酉旨環。 根據申請專利範圍第23項之7β-羥基類固醇（H)之製備 方法，其中該内酯環具有以下式所示之以及β立體化 84441 200406419 學性 ο

   29·根據申請專利範圍第23項之7β_羥基類固醇（π)之製備 方法，其中該7β-經基類固醇（„)係5_雄留烯_3ρ，7β_二醇 -1 7 -酮。 30.根據申請專利範圍第23項之7β_羥基類固醇（π)之製備 方法，其中該7β-羥基類固醇（11)係5,9(11)_雄留烯 -3β，7β-二醇 _17_ 綱。 3 1·根據申清專利範圍第23項之7β-羥基類固醇（π)之製備 方法，其中該接觸係藉由發酵作用、細胞濃縮物、全細 胞或無細胞反應。 32·根據申請專利範圍第31項之7β•羥基類固醇（π)之製備 方法，其中該接觸係藉由發酵作用。 33·根據申請專利範圍第23項之邛_羥基類固醇（11)之製傷 方法，其中該色二孢菌係棉鈴色二孢菌。 34· —種式（III)之11 α_羥基類固醇之製備方法

   84441 200406419 其中R3係： (1) -η ; (2) "CO«R4 其中R4係H或CVC5烷基； 其中R!7及r18—起形成二〇或 其中R17及R18和與彼結合之類固#主鍵之C17碳原子 一起形成下式之内酯環

   λ ’該方法包含： (1)將式（I)之Δ5-類固醇

   35· 36· 37. («Ml φ -p .、甲反3、R〗7和Rls係如以上之定義及其中Zl_z2係單 鍵）與麴菌之11α-羥化酶接觸。 才艮才慶上 甲請專利範圍第34項之1ΐα-羥基類固醇（in)之製 備方法，其中R3係H。 才艮才虔由 豕甲請專利範圍第35項之11α-羥基類固醇（III)之製 備方法，其中R^、_C(0)_CH3。 據申請專利範圍第34項之ιΐα-羥基類固醇（III)之製 備^r、、冬 凌’其中Rl7及RlS形成=〇。 84441 200406419 38·根據申請專利範圍第34項之11α-羥基類固醇（ΙΠ)之製 備方法’其中R1?、R1S及類固醇主鏈之C17碳原子形成 内酯環。 3 9·根據申晴專利範圍第34項之1 ια_經基類固醇（η〗）之製 備方法，其中該内酯環具有以下式所示之以及β立體化 學性

   40. 根據申明專利範圍第34項之ιια_經基類固醇（hj)之製 備方法，其中該11α-羥基類固醇係5_雄留烯_3ρ，11α_: 醇-1 7 - S同。 41. 根據申請專利範圍第34項之11α★基類固醇⑽之製 備方法，其中該接觸係藉由發酵作用、細胞濃縮物、全 細胞或無細胞反應。 42. 43. 根據申請專利範圍第41項之基類固醇⑽之製 備方法，其中邊接觸係藉由發酵作用。 根據申請專利範圍第34項之lla選基類固醇（m)之製 備方法，其中該麴菌係赭麴菌。 44. 一種式（IV)之7β，11α_二經基類固醇之製備方法 84441

   200406419 其中R3係： (1) -Η ； (2) -CO-R4 其中R4係HSCVCs烷基； 其中Rl7及—起形成=〇或 其中R17及R18和與彼結合之類固醇主鏈之C17碳原子 一起形成下式之内酯環

   ，該方法包含 (1)將式（II)之7β-羥基類固醇

   (其中R 3、R 1 7和R 1 8係如以上之定義及其中Z 1 - Z 2係早 鍵）與麴菌之11α-羥化酶接觸。 84441 -10- 200406419 45.根據申言青專利範圍第44項之7β，11α_二羥基類固醇（jv) 之製備方法，其中1係Η。 46·根據申請專利範圍第45項之7β，11α-二羥基類固醇（IV) 之製備方法，其中1係_C(〇）_CH3。 47.根據中請專利範圍第44項之7β，11α•二羥基類固醇（IV) 之製備方法，其中r17及ri8形成=0。 48·根據申請專利範圍第44項之7β，；[ 1α_二羥基類固醇（IV) 之製備方法，其中r1?、r18及類固醇主鏈之C17碳原子 形成内S旨環。 49·根據申凊專利範圍第48項之7β，1 Ια-二羥基類固醇（IV) 之製備方法’其中該内酯環具有以下式所示之α及β立 體化學性

   烯-3β，7β，1 Ια-三醇-17-酮。

   、全細胞或無細胞反應。

   之製備方法，其中該 根據申請專利範圍第51項之7β，11α_二經基 之製備方法，其中該接觸係藉由發酵作用。 84441 -11 - 200406419 53. 根據申言青專利範圍第48項之7β，1 Ια-二羥基類固醇（IV) 之製備方法，其中該麴菌係赭麴菌。 54. —種式（IV)之7β，11α-二羥基類固醇之製備方法

   其中係： (1) -H ; (2) -CO-R4 其中R4係烷基； 其中Rl7及Rl8—起形成=〇或 其中R17及R18和與彼結合之類固醇主鏈之C17碳原子 一起形成下式之内酯環

   ，該方法包含 (1)將式(I)之A5-類固醇

   84441 -12- 200406419 (其中汉3、1118和1117係如以上之定義及其中2广：22係單 鍵）與色二孢菌之7β-羥化酶接觸，以產生式（π)之7β-羥 基類固醇

   55. 56. 57. 58. 59. (其中R3、1^7和Rls係如以上之定義及其中Ζι_Ζ2係 單鍵）；及 (2)將步驟（1)之7β-羥基類固醇（II)與麴菌之丨丨心經化 酶接觸。 根據申請專利範圍第54項之7β，11α-二羥基類固醇（IV) 之製備方法，其中r3係Η。 根據申請專利範圍第55項之7β，11 α -二羥基類固醇（IV) 之製備方法，其中r3係-C(0)-CH3。 根據申請專利範圍第54項之7β，11α-二羥基類固醇（ιν) 之製備方法，其中R17及R18形成=〇。 根據申請專利範圍第54項之7β，11心二羥基類固醇（IV) 之製備方法，其中尺口及尺！8和與彼結合之類固醇主鍵之 C17碳原子形成内酯環。 根據申請專利範圍第54項之^β，11α_二羥基類固醇（Iv) 之製備方法，其中該内酯環具有以下式所示之α及p立 體化學性 84441 -13- 200406419 ο

   經基類固醇（IV) 醇（IV)係5-雄甾 60·根據申請專利範圍第54項之7β，11α_二 之製備方法，其中該7β，11α-二羥基類固 知- 3β，7β，11α -三醇-17-銅 〇 羥基類固醇（IV) 用、細胞濃縮物 61.根據申請專利範圍第54項之7β，ι1α_二 之製備方法，其中該接觸係藉由發酵作 、全細胞或無細胞反應。 62. 根據申請專利範圍第61項之邛，丨二經基類固醇（ιν) 之製備方法，其中該接觸係藉由發酵作用。 63. 根據申請專利範圍第61項之7β，11α_二經基類固醇（ιν) 之製備方法，其中該色二孢菌係棉鈐色二孢菌。 64. 根據申請專利範圍第6丨項之7β，i丨α_二經基類固醇（ιν) 之製備方法，其中該麴菌係赭麴菌。 6 5 .根據申請專利範圍第5 4項之7 β，丨丨以_二羥基類固醇（j ν ) 之製備方法，其中在步驟（2)的接觸之前，先不分離步 驟（1)之7β-羥基類固醇（II)。 66.根據申請專利範圍第54項之1α_二羥基類固醇（ιν) 之製備方法，其中在步驟（2)的接觸之前，先分離步驟〇) 之7β-羥基類固醇（π)。 67· —種式（IV)之7β，11α-二羥基類固醇之製備方法 84441 -14- (IV)200406419

   其中R3係： (1) ; (2) "C〇.r4 其中R4係过或匕-^烷基； 其中Rl7及r18—起形成=0或 其中RnKRw和與彼結合之類固醇主鏈之C17碳原子 一起形成下式之内酯環 Ο ，該方法包含 (1)將式（I)之Δ5-類固醇 68. ω

   (其中R3、R18和R17係如以上之定義及其中ΖγΖ】係單 鍵）與犁頭黴之7β，11α-羥化酶（類）接觸。 根據申請專利範圍第67項之7β，1 Ια-二羥基類固醇（IV) (0 84441 200406419 之製備芩法，其中R3係H。 根據申明專利範圍第68項之7β，1 Ια-二羥基類固醇（IV) 之製備方法，其中反3係_c(〇)-CH3。 根據申巧專利範圍第67項之7β，1 Ια-二羥基類固醇（IV) 之製備方法，其中r17及Ri8形成=〇。 根據申明專利範圍第67項之70，〗1α_二羥基類固醇 之製備方去，其中尺口及Ris和與彼結合之類固醇主鏈之 c 1 7碳原子形成内酯環。 根據申明專利範圍第67項之7P，〗1α_二羥基類固醇（ιν) 之製備方法，其中該内酯環具有以下式所示之α&β立 體化學性

   ，二羥基類固醇（IV) 二羥基類固醇（IV)係5-雄甾 •根據申請專利範圍第6 7項之7 β，11 α _二 之製備方法’其中該7β，Πα_二經基類固 烯-3β，7β，11α-三醇-17-酮。 二羥基類固醇（IV) 酵作用、細胞濃縮物 7 4 ·根據申請專利範圍第β 7項之7 β，11 α _ 一声 之製備方法’其中該接觸係藉由發酵作用 、全細胞或無細胞反應。 二羥基類固醇（IV) 7 5 ·根據申請專利範圍第7 4項之7 β 11 α _ 二羥基類固醇（IV) 之製備方法’其中該接觸係藉由發酵作 7 6 ·根據申請專利範圍第6 7項之7 β 11 α 一 84441 -16- 20Q406419 之製備亨法，其中該犁頭黴係藍色犁頭黴。 77_ —種式I之5,9(11)-雄甾二烯之製備方法

   其中R3係： (1) -H ； (2) -CO-R4 其中R4係烷基； 其中Rl7及Rl8 —起形成=〇或 其中R17及R18和與彼結合之類固醇主鏈之C17碳原子 一起形成下式之内酯環

   ，及ΖγΖ2係雙鍵，該方法包含： (1)提供式（III)化合物

   84441 -17- 200406419 (其中R3、R17和R18係如以上之定義）；及 (2)消除11α羥基，以形成介於冗丨與冗〗之間的雙鍵（式I)。 78·根據申請專利範圍第77項之方法，其中提供式III化合物 之步驟包括將式（I)之Δ5-類固醇

   (I) (其中R3、R17和R18係如以上之定義及其中ΖγΖ〗係單 鍵）與麴菌之11α-經化酶接觸。 84441 18- 200406419 V 第092106331號專利申請案(劃線） 中文說明書修正頁(92年10月） 柒、指定代表圖：

   修正: 補充 (一) 本案指定代表圖為：第（ ）圖。 (二) 本代表圖之元件代表符號簡單說明： 捌、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：

   (ΠΙ) 84441