HU204305B - Process for 1,2-dehydrogenating 3-ketopregnen-21-esters with arthrobacter symplex or bacterium cyclooxydans - Google Patents

Process for 1,2-dehydrogenating 3-ketopregnen-21-esters with arthrobacter symplex or bacterium cyclooxydans Download PDF

Info

Publication number
HU204305B
HU204305B HU881473A HU147388A HU204305B HU 204305 B HU204305 B HU 204305B HU 881473 A HU881473 A HU 881473A HU 147388 A HU147388 A HU 147388A HU 204305 B HU204305 B HU 204305B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
formula
pregna
hemiester
dihydroxy
starting
Prior art date
Application number
HU881473A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT50881A (en
Inventor
Leo A Kominek
Holly Jo Wolf
Paula S Steiert
Original Assignee
Upjohn Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Upjohn Co filed Critical Upjohn Co
Publication of HUT50881A publication Critical patent/HUT50881A/hu
Publication of HU204305B publication Critical patent/HU204305B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/02—Dehydrogenating; Dehydroxylating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J13/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17
    • C07J13/005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17 with double bond in position 16 (17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J13/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17
    • C07J13/007—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17 with double bond in position 17 (20)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J5/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond
    • C07J5/0046—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa
    • C07J5/0053—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa not substituted in position 16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J5/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond
    • C07J5/0046—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa
    • C07J5/0061—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa substituted in position 16
    • C07J5/0069—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa substituted in position 16 by a saturated or unsaturated hydrocarbon group
    • C07J5/0076—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond substituted in position 17 alfa substituted in position 16 by a saturated or unsaturated hydrocarbon group by an alkyl group
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/83—Arthrobacter

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

A találmány tárgya javított eljárás A4-3-ketoszteroidok, mégpedig az ismert A4-ketopregnén-, -pregnadién- és pregnatrién-21-alkoholok 1,2-dehidrogénezésére a megfelelő A1,4-származékokká, Arthrobacter símplex vagy Bacteríum cyclooxydans mikroorganiz- 5 musvagyüyenmikroorganizmusokbólnyertenzimkéJól ismert és ipari megvalósítás szempontjából is értékes eljárás A4-3-ketoszteroidok 1,2-dehidrogénezése amegfelelő A1,4-3-ketoszteroidokká Septomyxa af- 10 finis, Arthrobacter simplex (rövidítve A simplex) és
A 2 837 464 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban eljárást úrnak le A4-3-ketopregnének 1,2-dehidrogénezésére a megfelelő A1,4-preg- 15 nadíénekké, aminek során a C^j-hidroxilcsoport szabad állapotban vagy monokarbonsawal észterezett formában van; e dehidrogénezést Corynebacterium (Arthrobacter) simplex vagy Corynebacterium hoagii segítségévelvalósítjákmeg. 20
A2 902 410 és 2 902 411 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás eljárást ismertet A4-3ketoszteroidok 1,2-dehidrogénezésére A1,4-3-ketoszteroidokká olyan A simplex sejtek alkalmazásával, amelyeket előzőleg rövid szénláncú alkanollal vagy al- 25 kánonnál kezeltek. Az alábbiakban, a találmány értelmében olyan eljárást ismertetünk, amely a sejtek előkezelését nem teszi szükségessé, és a fermentlében jelenlévő élő sejtekkel hajtható végre. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy a sejteket levegővel, vagy forró 30 szárítással, vagy rövid szénláncú alkanonnal—például acetonnal — előkezeljük. E mikroorganizmusokban lévő szteroid-l-dehidrogenáz enzim sejtmentes alakban is alkalmazható.
A 3 770 586 számú amerikai egyesült államokbeli 35 szabadalmi leírásban javított eljárást közölnek lip,21-dihidr’oxi-pregna-l,4-17(20)-trien-3-on előállítására (lásd ott az 1. példát) és ΙΙβ^Ι-dehidroxi6a—metil-pregna-l,4-17(20)-trien-3-on előállítására (lásd ott az 5. példát), aminek során A4-3-ketosztero- 40 íd-21-hemiészter szubsztrátumok alkálifémsóit — ahol a dikarbonsav acilcsoportja 3-12 szénatomos — Septomyxa affínis alkalmazásával 1,2-dehidrogénezik. Ha lip,21-hidroxi-pregna-4,17(20)-dien-3-on21-hemiszukcinát-káliumsót alkalmaznak 5,0 g/1 kon- 45 centrációban, és az eljárást az 1. közegben végzik, akkora célzott Akl,4-termék5nap alatt lOOŰhozammal kapható (lásda 8. példát). Az 1. példa szerint keverővei ellátott tankokban dolgoznak, és a hozam alacsonyabb. A2. közeg alkalmazásával a lip,21-dihidroxi- 50 pregna-4,17(20)-dien-3-on-21-hemiszukcínát-káli umsót 2,0-7,0 g/1 koncentrációban alkalmazva 6 nap alatt 91,1-96,6% hozamot érnek el.
A4 524134 és 4 704 358 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban tökéletesített el- 55 járást írnak le mikrobák alkalmazásával, aminek során az 1,2-dehidrogénezett szteroidokat a megfelelő
1,2-telített A4-3-ketoszteroidokból levegőn szárított vagy hevítéssel szárított Arthrobacter simplex vagy Bacteríum cyclooxydacs segítségévelvalósítjákmeg. 60
A jelen találmány a fentebb ismertetett eljárások javítását célozza, és azon afelismerésen alapul, hogy a A4-3-ketopregnén-, -pregnadién- és -pregnatrién- (a továbbiakban összefoglalólag: A4-3-ketopregnén-) 21-alkoholokilletőleg -21-észterek A símplexvagyB. cyclooxydans alkalmazásával történő, önmagában ismert 1,2-dehidrogénezése a megfelelő A1,4-származékokká az eddig elértnél jobb hozammal és/vagy rövidebb reakcióidővel folytatható le, ha kiindulási szubsztrátumként a A4-3-ketopregnán-21-alkoholt valamely 3-11 szénatomos szerves dikarbonsavval képezett 21-hemiésztere vagy a hemiészter szabad karboxilcsoportjánképezett sója alakjában alkalmazzuk.
Ez az eljárás egyaránt jó eredménnyel folytatható le a 4,5-helyzetben és adott esetben a pregnánváz egy vagy két további helyén (természetesen az 1,2-helyzet kivételével) kettőskötést, továbbá a 3- és adott esetben a 20-helyzetben is oxocsoportot, továbbá adott esetben a pregnánváz további szubsztittuálhatő szénatomjain halogénatomot hidroxil- vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport szubsztituenseket tartalmazó pregnén-21alkohol-hemiészterével. Különösen előnyösen alkalmazható azonban az (I) általános képletű A4-3-ketopregnén-származékoknak—ebben a képletben R6 jelentése hldrognatom, halogénatom vagymetilcsoport;
R^ jelentése halogénatom vagy Rj j-gyel együtt egy másodíkkőtés a 9- és 11-szénatom között;
Rjj jelentése hidrogénatom, hídroxilcsoport vagy Rg-cel együtt egy második kötés a 9- és 11-szénatom között;
R16 jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport, vagy R17-tel együtt egy második kötés a 16- és 17szénatomközott;
Rj7 jelentése hidrogénatom vagy hídroxilcsoport, vagy Rjg-tal együtt egy második kötés a 17- és 16szénatomközött;
R20 jelentése oxigénatom vagy 2 hidrogénatom, vagy egy hidrogénatom és R17-tel együtt egy második kötés a 20- és 17-szénatom között — dehidrogénezésére.
A találmány szerinti eljárás tehát olyan javított eljárás a A4-3-ketopregnén-, -pregnadién- és -pregnatrién-21-alkoholok, különösen az ff) általános képletű A4-3-ketopregnén-21-alkoholok — ahol R6-R2q jelentése egyezik a fent megadottakkal — észtereinek 1,2-dehidrogénezésére a megfelelő A1,4-ketopregnadién- illetőleg -pregnatrién- vagy -pregnatetrén-származékokká Arthrobacter simplexvagy Bacillus cyclooxydans mikroorganizmusok vagy ezekből kapott enzimkészítmény alkalmazásával — adott esetben ismert exogén elektronakceptor jelenlétében —, amelybenkiindulási szubsztrátumként a A4-3-ketopregnén21-alkohol valamely 3-11 szénatomos szerves dikarbonsavval képezett 21-hemiészterét vagy ennek a hemiészter szabad karboxilcsoportján képezett sóját alkalmazzuk.
A találmány szerinti 1,2-dehídrogénezési eljárást — az ismert analóg mikrobiológiai 1,2-dehidrogénezési eljárásokhoz hasonlóan — vizes közegben, él2
Ηϋ 204 305 Β őmikroorganizmus-kultérával vagy szárított baktériumtestekkel, vagy pedig az említett mikroorganizmusokból készített sejtmentes enzimkivonattal folytathatjuk le. A A4-3-ketopregnénszármazék -21-hemiészter mikrogbiológiai 1,2-dehidrogénezésének termékeként a megfelelő, az 1,2-helyzetben is kettőskötést tartalmazó 21-alkoholt rendszerint a szabad 21alkohol és a 21-hemiészter elegyének oldataként kapjuk; az elegy az analóg 21-észterek esetében jól ismert hidrolízissel a tiszta 21-alkohol oldatává alakítható.
A találmány szerinti 1,2-dehidrogénezési eljárás kiindulási vegyületeiként alkalmazható ismert Á4-3ketopregnén-21-alkoholok (amelyek körébe, amint fentebb már említettük a 4,5-helyzetű kettőskötésen kívül az egy vagy két további, az 1,2-helyzettől különböző helyzetű kettőskötést tartalmazó ismert pregnadiének illetőleg pregnatriének és ismert szubsztituált származékaik 21 -hidroxidjai is beleértendők) sorában különösen előnyös kiindulási vegyületek a fentebbi meghatározásnak megfelelő (I) általános képletű Δ43-ketopregnén-21-alkoholok, amelyek, valamint a találmány szerinti eljárással belőlük kapott 1,2- és 4,5helyzetben (valamint a kiindulási vegyületeknek megfelelően esetleg egy vagy két további helyzetben is) kettőskötést tartalmazó 3-ketopregnén-21-aIkoholok, a korábbi irodalomból ismert vegyületek. Ismertek ezekneka 21-alkoholoknakkülönféle észterei és egyes esetekben hemiészterei is. Azok a A4-3-ketopregnén21-hemiészterek, amelyek a korábbi irodalomban nem voltak leírva, a megfelelő 21-alkoholokból könynyen előállíthatók ismert módszerekkel; ilyen módszereket például a 3 025 311,3 209 000 és 3 770 586 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások ismertetnek. Az (I) általános képletű A4-3-ketopregnén-21-hemiészterek a megfelelő A4-3-ketopregnén-21-halogén- vagy 21-hidroxilszármazékokból egyszerű, közismert kicserélési reakciókkal állíthatók elő: a A4-3-ketb-21-halogén-szteroidot — előnyösen a 21-ldórszármazékot—akívánt dikarbonsavvalamílyen sójával reagáltatva jutunk az (I) általános képletű Á4-3-ketopregnén-21-hemiészterhez. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy egy A4-3-keto-21-hidroxi-pregnént a kívánt dikarbonsav anhidridjével vagy savhalogenidjével reagáltatva állítjuk elő az (I) általános képletű vegyületeket.
A találmány szerinti eljárást és annakgyakorlati kiviteli módjait az alábbiakban a fentebb különösen előnyös kiindulási vegyületekként említett (I) általános képletű A4-3-ketopregnén-21-hemiészterekre és az ezekből 1,2-dehidrogénezéssel előállítható (Π) általános képlet, az 1,2-helyzetben is kettőskötést tartalmazó származékokra való utalással ismertetjük, de megjegyezzük, hogy az itt előadottak értelemszerűen vonatkoznak a fentebbi általános meghatározásnak megfelelő további ismert A4-3-ketopregnén-21-alkoholok szerves dikarbonsavakkal képezett 21-hemiésztereinek az A simplexvagy B. cyclooxydans mikroorganizmusokkal vagy enzimjeivel történő 1,2-dehidrogénezéséreis.
A találmány szerinti eljárásban kiindulási szubsztrátumként a fenti meghatározott 21-hemiésztereknek az észterképző dikarbonsav szabad karboxilcsoportján különféle szervetlen vagy szerves kationokkal kéa jelen leírás VIH. összehasonlító példája is szemlélteti.
Előnyös kiindulási anyagok a találmány szerinti eljárásban az alábbi 3-ketopregnén-származékok 21hemiészterei és ezek sói:
17a,21-dihidroxi-pregna-4,9(ll)-dién-3,20-díon, lip,21-dihidroxi-pregna-4,17(20)-dién-3-on, β, 17a,21 -trihidroxi-6a- metil-pregn-4-én-3-20dion,
113,21-dihidroxi-6a-metil-pregna-4,17(20)-dién3-on, np,17a,21-trihidroxi-pregn~4-én-3,20-dion,
17a,21-dihidroxi-6a- metil-pregna-4,9(l l)-dién3,20-dion,
17a,2lHlihidroxi-16p- etil-pregna-4,9(l l)-dién3.20- dion,
6a-fluor-21- hidroxi-pregna-4,9(l l),16-trién3.20- díon,
21-hidroxi-pregna-4,9(l l),16-trién-3,16-dion és
17a,21-dihidroxi-16a-metil-pregna-4,9(ll)-dién3.20- dion.
Legelőnyösebben alkalmazható a ΙΙβ-21-dihÍdroxi-pregna-4,17(20)-dién-3-on a 21-hemiszukcinátja alakjában.
Az A. simplex és B. cyclooxydans mikroorganizmusok például a 2 837 464,4 524134 és 4 704 358 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokból jól ismertek. A találmány szerinti eljárás bármelyik mikroorganizmusból származó szteroid-l-dehidrogenázzal több formában végrehajtható; előnyős azonban mikróbaf orrásként az A simplex alkalmazása. A biotranszformációt végezhetjük akár a sejtmentes szteroid-1 -dehidrogenázzal, akár a mikroorganizmus sejtjeivel. Előnyösen a fermentlében teljes mikróbasejteket használunk, hogy további gyártási lépéseket elkerülhessünk, Amennyiben elkülönített sejteket alkalmazunk, akkor ezeket úgy használhatjuk, hogy a tápközegből a szokásos módszerekkel — centrifugálással, flokkulálással és szűréssel, kicsapással és szűréssel, vagy ultraszűréssel — összegyűjtjük és betöményítjük. Az elkülönített sejteket alkalmazhatjuk nedves állapotban, vagy standardizált eljárással kollagénhez, algináthoz vagy karrageninhez köthetjük pásd például: Methods in Ezymoíogy, 44. kötet 11-317. old. (1976), Academic Press, Inc., New Yokr], vagy rövid szénláncú alkohollal vagy alkanonnal — például acetonnal —kezelve száríthatjuk (lásd a 3 360 439 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást), vagy melegítéssel vákuumban száríthatjuk, liofilizálhatjuk, levegőn hevítve, vagy permetformában száríthatjuk (lásd a 4 524134 és 4 704 358 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat). Sejtmentes formában a szteroid-l-dehidrogenázt továbbá oldatban vagy rögzített (immobilizált) alakban is alkalmazhatjuk a szteroíd-l-dehidrogénezés katalízisére. Nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti eljárás magá3
HU 204305 Β banfoglalja azA simplexből vagyB. cyclooxydans-ból származó bármilyen szteroid-l-dehidrogenáz készítmény alkalmazását az (I) általános képletű A4-3-ketopregnén-21-hemiészterek biotranszformációjára a megfelelő' (Π) általános képletű A1,4-3-ketopregnadié- 5 nekké.
Abiotranszformációtúgy valósítjukmeg, hoy az 0) általános képletű A4-3-ketopregnén-21-hemiészter szubsztrátumot szteroid-l-dehidrogenázt tartalmazó készítménnyel kezeljük főként vizes rendszerben, 6- 10 10 közötti pH-tartományban, előnyösen.7-8 pH-értéken. A vizes rendszer körülbelül 5%-nál kisebb menynyiségben vízzel elegyedő szerves' oldószert tartalmazhat. Vízzel elegyedő szerves oldószerként például dimetil-szulfoxidot, dimetil-formamidot, metanolt, eta- 15 nőit vagy acetont használhatunk. Adott esetben vízzel nem elegyedő szerves oldószert fe adhatunk a rendszerhez (azzal a feltétellel, hogy a szteroid-l-dehidrogenáz aktivitását károsan nem befolyásolja) körülbelül 2%-íól körülbelül 50%-ig terjedő mennyiségben. 20 Vízzel nem elegyedő szerves oldószerként például toluol, benzol, butil-acetát, heptán, diklór-metán használható; előnyösen toluolt használhatunk. A szerves oldószerekfelhasználhatókaz (I) általános képletű Δ43-ketopregnén-21-hemiészter szubsztrátum vagy va- 25 lamilyen exogén elektron-akceptor oldására vagy szuszpendálására, a szteroid-l-dehidrogenáz készítményhez való hozzáadása előtt. A szteroid szubsztrátum enzimkészítményhez való érintkeztetését előnyösen exogén elektronakceptor jelenlétében végezzük A 30 szakember számára ismert, hogy az exogén elektronakceptornak nem szükséges az ti) általános képletű A4-3-ketopregnén-21-hemiészter szubsztrátum teljes mennyiségével együttesen jelen lennie, azonban ez az előnyös. Különösen előnyösen úgy járunk el, hogy abi- 35 otranszformációt sejtmentes enzimkészítménnyel vagy szárított sejtekkel valósítjuk meg. Az exogén elektronakceptort abból a célból adhatjuk a rendszerhez, hogy elősegítsük a szteroíd-l-dehidrogénezést és/vagy elkerüljünk másirányú szteroid-lebom- 40 lást olyan készítmények esetében, ahol ezt a lebontó aktivitást előzőleg nem küszöböltük ki. Exogén elektronakceptorként előnyösen menadiont, menadíon-biszulfitot, 1,4-naftokinont, fenazin-metoszulfátot, benazín-etoszulfátot, diklórfenol-indofenolt vagy citok- 45 róm C-t alkalmazunk Exogén elektronakceptorként még előnyösebben menadiont, menadion-bfezulfitot vagy 1,4-naftokinonthasználhatunk. Azexogén elektronakceptort körülbelül 0,01 g/l-től körülbelül 3,0 g/1ig terjedő katalitikus mennyiségben — a 4 524 134 50 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölt módon — alkalmazzuk s így a hidrobiotranszformáció lezajlása alatt a keverékhez elŐnyösenmolekulárfe oxigént juttatunk, és keverjük A 55 rendszert körülbelül 5 ’C-tólkörülbelül 45 ’C-ig terjedő hőmérséklettartományban, előnyösen körülbelül 25 ’C-től körülbelül 35 ’C-ig terjedő hőmérsékleten tartjuk
Az (I) általános képletű szteroid szubsztrátum de- 60 hidrogénezésére alkalmazott biotranszformáció típusa az adott szubsztrátum szerkezetétől és természetétől függően változik: így például az 1. példában alkalmazott szubsztrátumot teljes biotranszformációnakvetjükaláafermentlében(fennentációsfolyadékmáció lényegesen rosszabb hozammal megy végbe, ha egyenértékű mennyiségben A simplex melegítéssel szárított sejtjeit alkalmazzuk Az enzimkészítmény legmegfelelőbb (optimális) típusát és koncentrációját, a szubsztrátum optimális koncentrációját, a szubsztrátum hozzáadagolásának időtartamát és a biotranszformáció időtartamát minden egyes szteroid-l-dehidrogénezésireakció esetére a tapasztalt szakemberszámára jól ismert, rutinszerű, előzetes kísérletekkel határozhatjukmeg. Alegtöbb (I) általános képletű Δ4-3ketopregnén-21-hemiészter szubsztrátum biotranszformációja csak akkor megy végbe kedvezően, ha a rendszer körülbelül 95% vagy ennél nagyobb mennyiségű vizet tartalmaz. Nem minden egyes (Γ) általános képletű szteroid alakul át megfelelően az összes, fentebb említett körülmények között. Egyes (I) általános képletű vegyületek csak vizes rendszerben biotranszformálhatók megfelelő módon, mások inkább vízzel elegyedő, vízzel nem elegyedő szerves oldószer jelenlétében; egyes (I) általános képletű vegyületek fermentlébenlévő sejtekkel, mások viszont szárított sejtekkel alakfthatókátkedvezőbben.
Az A simplex sejtekkel fermentációs folyadékokban végzett, ismert szteroid-l-dehidrogénező eljárások olyan A4-3-ketopregnén szubsztrátumokat alkalmaznak, amelyek C^j-helyzetben 21-hidroxiIcsoportot vagy 21-mono-karbonsav-észter csoportot — előnyösen ecetsav-észter-csoportot —> tartalmaznak. Ezeknek a 21-hidroxi-, illetve 21-acil-oxi-A4-3-ketopregnéneknekafermentációsközegbenlévőszubsztráciőja körülbelül 1,5 g/l-től körülbelül 5 g/l-íg terjed tiásd a2 837 464számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmileírást). AA4-3-ketopregnén-21-hemiészterek, azaz (I) általános képletű vegyületek 1-dehídrogénezésére eddig alkalmazott, ismert eljárásokban a szubsztrátum koncentrációja körülbelül 2 g/l-től körülbelül 10 g/l-ig terjed a 21-észter tömegére vonatkoztatva, illetve körülbelül 1,4 g/l-től körülbelül
7,1 g/l-ig terjed a 21-hidroxi-tőrzsvegyületre vonatkoztatva tiásd a 3 770 586 számú amerikai egyesültállamokbeli szabadalmi leírást). A jelen találmány szerinti eljárás, amelynek során A simplex mikroorganizmust alkalmazunk, lehetővé teszi, hogy a fermentlében az (1) általános képletű A4-3-ketopregnén-21hemiészter szubsztrátumot magasabb koncentrációban alkalmazzuk, és rövidebb időtartam alatt teljes reakciót (biotranszformációt) érjünk el.
A jelen találmány szerinti eljárás lehetővé teszi magasabb szubsztrátum-koncentrációk előnyös alkalmazását rövidebb reakcióidő (4-48 óra) alatt elérhető kedvező eredménnyel. A jelen találmány szerinti eljárás révén az (1) általános képletű A4-3-ketopregnén21-hemiésztereket körülbelül 4 g/l-től körülbelül 30 g/l-ig terjedő koncentrációban alkalmazhatjuk (a
HU 204305 Β nem-észterezett Á4-3-ketopregnénre vonatkoztatva). Dolgozhatunk körülbelül 4 gd-nél kisebb koncentrációban is, ez azonban ipari szempontból nem jelentős. Körülbelül 30 g/1 koncentráció felett a maradékok mennyisége annyira megnövekszik, hogy előnyösebb a reakciót kisebb szubsztrátum-koncentrációval végezni. Az (I) általános képletű A4-3-ketopregnén-származékot a 21-hidroxi-szteroid törzsvegyületre vonatkoztatva előnyösen körülbelül 4 g/l-től körülbelül 12 g/l-ig terjedő, egyenértékű mennyiségben alkalmazzuk.
A jelen találmány szerinti eljárás révén a (Π) általános képletű A1,4-3-ketopregnén-származékokat a technika jelenlegi állásához képest nagyobb hozammal, rövidebb reakcióidő alatt kapjuk. A (Π) általános képletű A1,4-3-ketopregnadiéneket eredményező reakció körülbelül 4 órától körülbelül 72 óráig terjedő időtartammal teljessé válik; ezzel szemben a jelenleg ismert szteroid-l-dehidrogénező eljárások átlagosan körülbelül 120 órát igényelnek, ha hemiésztereket és
S. affinis-t alkalmazunk 0ásd a 3 770 586 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást).
A A4-3-ketopregnén-21 -hemiészter kiinduló anyag biotranszformációja után a megfelelő (Π) általános képletű A1,4-3-ketopregnadién-származékot a 21-hemiészter és a szabad 21 -alkohol elegyének oldata alakjában kapjuk; az elegyben lévő 21-hemiésztert kívánt esetben in situ hidrolizálhatjúk ismert módon a megfelelő 21-alkohollá, és az így már csupán 21-alkoholt tartalmazó oldatból ez a termék ugyancsak ismert módon különíthető el. Minthogy azonban csak a termékek elsősorban különféle ismert gyógyhatású pregnadién származékok előállítására alkalmazhatók köztitermékként, így azok a legtöbb esetben közvetlenül, a reakcióelegyből való elkülönítés illetőlegszétválasztása nélkül kerülhetnek továbbfeldolgozásra.
A találmányt az alábbi, nem korlátozó jellegű kiviteli példákban részletesen ismertetjük. Véleményünk szerint az e területen jártas szakember a fenti leírást teljes mértékben képes átültetni a gyakorlatba. Az alábbi, részletes példákban leírjuk különböző vegyületek előállítását és/vagy a találmány szerinti eljárások kiviteli módjait; ezeket azonban csak illusztrálás céljából közöljük, és semmiképpen sem jelentik a találmány korlátozását. A tapasztalt szakember könnyen felismerheti az eljárás variációs lehetőségeit mind a reagensek, mind a reakció körülményei és végrehajtása vonatkozásában.
Definíciók
Az összes hőmérséklet-értékeket Celsius-fokokban adjuk meg.
A „HPLC” nagyteljesítményű (túlnyomásos) folyadékkromatográfiát jelent.
DMF jelentése: dimetil-formamid.
Amennyiben oldószerpárokat alkalmazunk, akkor az egyedi oldószerek arányát térf/térf.-ban adjuk meg.
Asimplex jelentése: Arthrobacter simplex.
B. cyclooxydans jelentése: Bacterium cyclooxydans
Az (I) általános képletű A4-3-ketoszteroid-21-hemiészter szubsztrátumok koncentrációját gramm/literben fejezzük ki, ahol a gramm (g) a megfelelő 21hidroxi-szteroid mennyiségét jelenti.
1. példa
11β,21- Dihidroxi-pregna-4,17(20)-dién-3-on-21hemiszukcinát-káliumsó biotranszformációja A. simplex alkalmazásával lip,21-hididroxi-pregna25 l,4,17(20)-trién-3-onná
A) A mikroorganizmus primer oltóközegének az előállítása
Arthrobacter simplex (UC582, ATCC 6946) ferde agaron tartott tenyészetéből származó sejteket 5 ml steril vízben reszuszpendálunk, és 300 ml térfogatú primer csíra-tápközegbe oltjuk, amely 12 g/1 Difco táptalajt tartalmazó táplevesből áll, és amelyet az oltás előtt 30 perccel 121 °C hőmérsékleten sterilizáltunk.
A keveréket 1 literes rázólombikokban 28 °C hőmérsékleten rázóasztalon 2 napig rázatunk (precenként 250 fordulattal, a rázás kitérése 5 cm).
B) A mikroorganizmus szekunder oltóközegének az előállítása
A mikroorganizmus szekunder szaporításához alkalmazott tápközeg az alábbi tápanyagokat tartalmazó vizes keverék:
A komponens koncentrációja A szállító cég
Kukoricáié szárazmaradéka (solulys A) 20gA ' RoquetteFreres
Zsírolaj (2.sz.) 15 g/1 Geo.PfauandSon
Szilikonos habzásgátló (SAB-471) 0,1 ml/1 Union Carbide
Kortizon-acetát 0,1 gű The Upjohn Company
A közeg pH-értékét a sterilizálás előtt reagens tisztaságú nátrium-hidroxiddal 7,0-ra állítjuk. A fenti primer fázisból származó két rázólombikot (300 ml) alkalmazunk 250 liter szekunder oltóközeg beoltására. A fermentort körülbelül 28 °C hőmérsékleten, 280 percenkénti fordulatszámú keveréssel működtetjük, miközben percenként 100 liter levegőt vezetünk át. A szekunder oltás során 2 napon át inkubálunk.
C) A találmány szerinti eljárás fermentációs (dehidrogénező) lépése g/1 mennyiségben kukoricalé-származékot (Solulys A), 20 g/12. sz. zsírolajat, 0,1 g/1 kortizon-acetátot és 0,2 ml/1 szilikont» habzásgátlót (SAG-471) tartalmazó vizes keveréket sterilizálás előtt nátrium-hidroxiddal 6,0 pH-ra állítunk, majd az így kapott közeget 60 121 °C-on 30 percig 250 liter hasznos térfogatú (mun5
HU 204305 Β katérfogatú) fermentorban sterilizáljuk. A tartályban lévő közeget 28 °C hőmérsékleten, percenként 280 fordulatszámmal, percenként 25 liter levegő átvezetése közben keverjük. A fermentor tartalmát A. simplex (ATCC 6946) 48 órás szaporodásából (a fenti szekunder oltóközegből) származó végső, fermentált térfogat 5 térfogat%-ával oltjuk. Az így kapott tenyésztőkeveréket 36 órán át szaporítjuk, s ennek során a pH értékét 7,5-re állítjuk, és kénsav vagy nátrium-hidroxid automatikus adagolásával ezen az értéken tartjuk. A pHbeállításaután akeverékhez 0,17 g/1 végkoncentráció eléréséig menadiont adunk. Az (I) általános képletű A4-3-ketoszteroid-21-hemiésZter szubsztrátumot, azazaz (I) általánosképletű lip,21-dihidroxi-pregna4,17(20)-dién-3-on-21-hemiszukcinát-káliumsót dimetil-fonnamidbanoldjukakeverékhezll,35g/lvégkoncentráció eléréséig (amely egyenértékű 8 g/1 megfelelő 21-hidroxi-A4-3-ketoszteroid koncentrációval). Ezután az elegyet 48órán át inkubáljuk.
A reakció befejeződését HPLC elemzéssel ellenőrizzük. A 48 órai inkubálás után 98,9% termelési hányaddal kapott termék (a szabad 21-alkoholra számítva) 30,5 t% szabad lip,21-dihidroxi-pregnal,4,17(20)-trién-3-on és 69,5 t% 21-hemiszukcinát elegye. Ezt az elegyet ahemiszukcinát szabad 21-alkohollá hidrolizálása céljából közvetlenül a vizes közegben bázissal kezeljük és leszűrjük; amikoris a most már teljesen lip,21-dihidroxi-pregna-l,4,17(20)trién-3-onból álló tennék a szűrőkalácsban marad, ahonnan ezt a terméket ezután vizes acetonnal extraháljuk, majd ismert módon átkristályosítjuk. A terméket autentikus mintákkal hasonlítjuk össze HPLC segítségével (sziíikagéles C-8 oszlop, 25 cm; az eluáláshoz acetonitril/víz/ecetsav 40:60:0,1 arányú keverékéből álló mobilis fázist alkalmazunk). A 21-hidro- xilvegyület retenciós ideje 12,5 perc, a 21-hemiszukcináté 28,5 perc.
2. példa
17a,21-Dihidroxí-pregna-4,9(ll)-dién-3,20-dion- 21-hemíszukcmátbiotranszformációjal7a,21-dihidroxi-pregna-l,4,9(l l)-trién-3,20-dionná
Az 1. példában leírt eljárást követjük, de kiindulási szubsztrátumként 17o,21-dihidroxi-pregna-4,9(ll)dién-3,20-dion-21-hemiszukcinátot alkalmazunk. 15 2 órai inkubálás után 99%-os termelési hányaddal kapjuk a 17a,21-díhidroxi-pregna-l,4,9(ll)-trién-3,20dion és 21-hemiszukcinátja elegyét, amelyetközvetlenül használhatunk!el további feldolgozásra.
f
3. példa
P,21-Dihidroxi-6a- metil-pregna-4,17(20)-dién-3-on-21-hemiszukcinát-nátriumsQ biotranszformációja lip,21-dihidroxí-6a-metil-pregnal,4,17(20)-triéu-3-onná S
Az l.példában leírt eljárást követjük, de kiindulási szubsztrátumként 11 p,21-dihidroxi-6a-metií-pregna-4,17(20)-dién-3-on-21-henuszukcinát-nátriums ót alkalmazunk. 48 órai inkubálás után 98%-os termelési hányaddal kapjuk a llp,21-diíudroxí-6-metil- 6 pregna-l,4,17(20)-trién-3-on (40 t%) és 21-hemiszukcinátja (60 t%) elegyét, amelyet az 1. példában leírt módon dolgozhatunkfel tovább.
4. példa
11β,17α,21- Trihidroxi-pregn-4-én-3,20-dion-21~ hemiszukcinát-(trietil-amin)-só biotranszformációja-lip,17a,21- trihidroxi-pregna-l,4-dién-3,20-dionná
Azl. példában leírt eljárást követjük, de kiindulási szubsztrátumként lip,17a,21-trihídroxi-pregna-4~ éu-3,20-díon-21-hemiszukcinát-(metil-amm)-sót alkalmazunk. 48 órai inkubálás után 91,4%-os termelési hányaddal kapjuk a lip,17c,21-trihidroxi-pregna5 l,4-dién-3,20-dion (a kiindulási pregnénre számítva
21,7 t%) és 21-hemiszukcinátja (69,7 t%) elegyét, amelyet az 1. példában leírt módon dolgozhatunk fel tovább.
Ό 5. példa
6a-Huor-21- hidroxi-pregna-4,9(l l),16(17)-trién3,20-díon-21-hemiszukcinát biotranszformációja 6a-fluor-pregna-l,4,9(ll),16(17)-tetraén-3,20-dionná, szárítottA. simplex sejtek alkalmazásával.
A 4 524 134 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölt általános módszert jelentősebb változtatás nélkül követve 1,0 g szárított A. simplexsejttömeget 100 ml 0,05 mólos ,7,5 pH-értékű kálium-foszfát-pufferben szuszpendálunk. 8,6 mgme0 nadiont 1 ml etanolban oldunk, és a sejtszuszpenzióhoz adjuk. A 6a-fluor-21-hidroxi-pregna4,9(ll),16(17)-trién-3,20-dion-21-hemiszukcmát szubsztrátumot dimetil-formamidban oldjuk, és 4,0 g/1 végkoncentráció eléréséig (a megfelelő 21-hid5 roxí-szteroidra vonatkoztatva) és körülbelül 5% dimetil-fonnamid végkoncentráció eléréséig adagoljuk a rázólombikba. A lombikot rázóasztalon 31 *C hőmérsékleten 3 napon át inkubáljuk. Ekkor a biotranszformációs keverék HPLC elemzése azt mutatja, hogy a ) kiinduló anyagként alkalmazott cím szerinti vegyületet 99%-ban dehidrogéneződött 6a-fluor-pregna1,4,9(11),16(17)-tetraén-3,20-dion (50 t%) és 21-hemiszukcinátja (501%) elegyévé.
A terméket autentikus mintákkal hasonlítjuk össze ί HPLC elemzéssel (sziíikagéles, 25 cm hosszúságú C-8 oszlop; az eluáláshoz acetonitril/tetrahidrofu. rán/víz/ecetsav 9:31:60:0,3 arányú elegyét alkalmazzuk). A 21-hídroxílvegyület retenciós ideje 8,19 perc, a 21-hemiszukcináté 12,51 perc és a szubsztrátumé
16,25perc.
6. példa
17a,21-Dihidroxi-16p- metil-pregna-4,9(1 l)-dién-3,20-dion-21-hemiszukcinát-nátriumsó biotranszformációja 17a,21-dihidroxi-16p-metil-pregna-l,4,9(ll)-trién-3,20-dionná
Az 5. példában leírt eljárást követjük, de kiindulási szubsztrátumként 17a,21-dihidroxi-16p-metil-pregna-4,9(ll)-diéu-3,20-dion-21-hemiszukcinát-nátri umsót alkalmazunk, és a biotranszformációt kísérleti
HU 204 305 Β üzemi reaktorban folytatjuk le, a kiinduló szubsztrátumra számítva 2,8 tömegekvivalens száraz sejt alkalmazásával. 1 napi inkubálás után 99%-os termelési hányaddal kapjuk a 17a,21-dihidroxi-16p-metil-pregna-l,4,9(ll)-trién-3,20-dion (35t%) és 21-hemiszukcinátja (651%) elegyét.
7, példa
17,21-Dihidroxi-pregna-4,9(ll)-dién-3,20-dion21-fumarát biotranszformációja 17,21-dihidroxipregna-l,4,9(l l)-trién-3,20-dionná az 1. példában leírt eljárást követjük, de kiindulási szubsztrátumként l,21-dihidroxi-pregna-4,9(l l)-dién-3,20-dion-2í-fumarátot alkalmazunk. 34 órai inkubálás után 99,7%-os termelési hányaddal kapjuk a
17,21-dihidroxi-pregna-l,4,9(ll)-trién-3,20-dion (41t%) és 2í-fumarátja (59t%) elegyét.
8, példa β, 17α,21- Trihidroxi-6a-metil-pregn-4-én3,20-dion-21-hemiszukcinát-szukcmát biotranszfortrihidroxi-6a-metil-pregna-l,4-dién-3,20-dionná
A 4 704 358 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölt általános módszer jelentősebb változtatás nélkül követjük, kiinduló anyagként azonban az (I) általános képletű cím szerinti vegyületet, és mikroorganizmusként B. cyclooxydans-t (ATCC 12673) alkalmazunk. A biotranszformációt úgy ellenőrizzük, hogy a keverékből kapott butil-acetátos kivonatot autentikus mintával vékonyréteg-kromatográfia útján hasonlítjuk össze. Erre a célra fluoreszkáló szilikagéles lemezeket alkalmazunk, és a kifejlesztést kloroform, metil-celluszolv és 95%-os etanol 87,5:5:7,5 arányú elegyével végezzük. 48 órai inkubálás után 90%-ot meghaladó mértékű biotranszformációt érünk el.
9, példa
11β,21- Dihidroxi-pregna-l,4,17(20)-trién-3-on21-hemiszukcinát 1,2-dehidrogénezése sejtmentes enzimkivonat alkalmazásával
Arthrobacter simplex baktériumok sejtjeit centrifugálással elkülönítjük a fermentációs léből és az elkülönített sejteket 0,05 mól/1 glicerin[20%]foszfátot tartalmazó, 7,5 pH-értékü pufferoldatban, amely 200 egység/ml lizozimet is tartalmaz, újból szuszpendáljuk. Ezt a sejtszuszpenziót 60 percig keverjük, miközben az első 30 perc után nuldeáz enzimet adunk a kő5 zeghez a sejtek elroncsolódása közben felszabaduló nukleinsav elbontása céljából. 1 óra elteltével a szuszpenziót mechanikai őrlőberendezésen vezetjük keresztül a sejtek teljes ehoncsolása céljából, majd a sejttörmeléket centrifugálással (10000 g) eltávolítjuk.
A tiszta oldatot dekantálással elkülönítjük és az alábbi összetételű biokonverziós elegyhez adjuk:
β,21- dihídroxi-pregna-1,3,17(20)-trién-3-on21-hemiszukcinát-káliumsó 1,0 g/1, . menadion 0,00033 mól/1, kataláz enzim 250 egység/ml kálium-foszfát-puffer (pH- 7,5) 0,05 mól/1.
A fenti elegyet forgatott rázópalackban, 28 °C hőmérsékleten 60 percig inkubáljuk, és ezután a képződött A1,4-szteroid-21-hemisziilccmát termék mennyi20 ségét meghatározzuk 1 óra alatt a biotranszformáció mértéke 15%.
Az alábbi példákban egyes, a találmány szerinti eljárást ismertető példákban szereplő A4-3-ketoszteroidok ismert módon szabad 21-hidroxid vagy 21-mono25 karbonsavészter alakjában. Arthrobacter simplex mikroorganizmussal történő 1,2-dehidrogénezését hasonlítjuk össze a találmány szerinti, dikarbonsavhemiészterrel történő 1,2-dehidrogénezésével. Ezekben a szubsztrátumként alkalmazott A4-3-ketosztero30 id gditerben megadott koncentrációját (az ekvimolekuláris mennyiségre vonatkoztatott összehasonlítás lehetővé tétele érdekében) mindenütt a kiindulási szteroid-alkohol, illetőleg észter szabad 21-alkohol alakjában mért tömegére vonatkoztattuk.
Az eredményeket az összefoglaló táblázatokban
21-OH minden esetben szabad 21-alkoholt, 21-bSu hemiszukcinát-észtert, 21-Ac acetátésztert, 21-Bzpedig benzoátésztert jelent. A százalékos adatok tömegszázalékban értendők
I. összehasonlító példa
Szubsztrátum: 11 p,21-dihidroxi-pregna-4,17(20)dién-3-on (az 1. példa szerinti vegyület)
Eljárás: a Á4-szteroid hozzáadása a fermentációs 45 léhez (az l.példa szerint)
Szteroid Koncentráció Hozam (%) Idő (óra)
21-Ac 4gd 3,6 47'
21-hSu 4g/l 98,8 4
21-hSu Sgű 99,9 48
Ugyanazzal a mikroorganizmus tenyészettel tehát a 21-acetát 1,2-dehidrogénezése 47 óra alatt csak 3,6%ban, a 21-hemiszukcináté már 4 óra alatt 98,8%-ban megy végbe, míg 48 óra alatt a konverzió 99,9%-os.
A hemiszukcináttal lefolytatott 1,2-dehidrogénezés közvetlenül kapott termékében a Á1,4-szteroid 69,5%-a 21-hemiszukcinát, 30,5%-os 21-alkohol alakjában van jelem; az l.példa szerinti bázisos hidrolízissel a Á1,4-szteroid teljes mennyisége 21-alkohollá alakul.
H. összehasonlító példa
Szubsztrátum: 17a,21-dihidroxi-pregna-4,9(l 1)dién-3,20-dion (a 2. példa szerinti vegyület)
HU 204305 Β
Eljárásazl.példaszerint,kevertlaboratóriumifer- mentorban
Szteroid Koncentráció Hozam (%) Idő (óra)
21-Ac 21-hSu 4g/l 4gd 50 50 99 32 66 15
A 21-hemiszukcinát 1,2-dehidrogénezése 15 óra alatt gyakorlatilag teljes, míg a 21-acetát 32 óra alatt elért 50%-os konverziója a kezelés további folytatásávalmár nem emelkedik. HL összehasonlító példa Szubsztrátum: llp,21-dihidroxi-6a-metil-pregna- 4,17(20)-dién-3-on (a 3. példa szerinti vegyület). Eljárás: a jelenleírás 1. példája szerint.
Szteroid Koncentráció Hozam (%) Idő (óra)
21-OH 21-hSu 0,8 g/1 4,0 g/1 50 98 46 45
A hemiszukcinát-észter tehát többszörös szubsztrátum-koncentráció esetén is gyakorlatilagteljes konverziót mutat 45 óra alatt, míg a szabad 21-alkohol csupán 50%-os konverziótad.
A 21-hemiszukcinát 1,2-dhidrogénezése útján kapott Á1,4-szteroid 40%-a 21-alkohol, 60%-a 21-hemiszukcinát.
JV. összehasonlító példa
Szubsztrátum: lip,17a,21-trihidroxi-pregn-4-én3,20-dion (a 4. példa szerinti vegyület)
Eljárás: az 1. példa szerint
Szteroid Koncentráció Hozam (%) Idő (óra)
21-Ac 10 g/1 3,7 48
21-hSu 20 g/1 91,4 48
(A 21-hemiszukcinátot káliumsó alakjában alkalmaztuk szubsztrátumként)
21-acetát esetében a kapott A1,4-szteroid 35%-a volt 21-acetát; a 21-hemiszukcinát szubsztrátum esetén a termék 69,7%-a hemiszukcinát, a többi 21-alkohol.
V. összehasonlító példa
Szubsztrátum: 6a-fluor-21-hidroxi-pregna4,9(1 l),16(17)-trién-3,20-dion
Eljárás: a jelen leírás 5. példája szerint.
Szteroid Koncentráció Hozam (%) Idő
21-Ac 4,0 gd 97,1 5 nap
21-hSu 4,0 g/1 98,0 2nap
Itt a 21-acetát 5 nap alatt már közel teljes konverziót adott, míg a 21-hemiszukcinát esetében a teljest még jobban megközelítő'konverzió már 2 nap alatt elérhető volt.
A kapott A1,4-szteroidban vékonyréteg kromatográfiai elemzés szerint a 21-acetát esetében 76% 21hidroxidot és 21% 21-acetátot, a 21-hemiszukcinát szubsztrátum esetében pedig 50% 21-hidroxidot és 50% 21-hemiszukcinátottartalmazott.
A hemiszukcinát-észter tehát többszörös szubsztrátum-koncentráció esetén is gyakorlatilag teljes konverziót mutat 45 óra alatt, míg a szabad 21-alkohol csupán 50%4as konverziót ad.
VT. összehasonlító példa
Szubsztrátum: 17a,21-dihidroxi-16p-metil-pregna-4,9(ll)-dién-3,20-dion (a 6. példa szerinti vegyület)
Eljárás: a 4 524134 sz. USA szabadalmi leírás szerint, kísérleti üzemi méretben.
Szteroid Koncentráció Hozam (%) Idő Tömeg-ekv. száraz sejt
21-Bz 3,5 g/1 91,5 5 nap 3,6
21-hSu 3,5 g/1 99 lnap 2,8
21-hSu 5,0gI 98 6 nap 2,0
HU 204305 Β
A 21-benzoát esetében 90%-ot meghaladó 1,2-dehidrogénezés 5 nap alatt volt elérhető, míg 21-hemiszukcínát esetében 1 nap alatt már 99%-os volt a dehidrogénezés, kisebb mennyiségű száraz sejt alkalmazásával is.
A kiindulási 21-hemiszukcinát 3,5 g/1 koncentrációja esetén a dehidrogénezett tennék 65%-a volt a 21hemiszukcinát és 35%-a 21-alkohol; 5 g/1 kiindulási koncentráció esetén a termékben 53% volt a 31-alkohol mennyiségi aránya (ami a megnövelt inkubációs időnek tulajdonítható), a 21-hemiszukcinát aránya 46% volt.
VII. összehasonlító példa
Szubsztrátum: 17,21-dihidroxi-pregna-4,9(l l)-dién-3,20-dion különféle sói
Eljárás: lényegileg a jelen leírás 1. példája szerint, 26 órai inkubációs idővel
Só Koncent- ráció W) 21-OH (%) 21-hSu (%)
Trisz+ 10 80 20
Na+ 10 80 15
K+ 10 80 15
karbamid+ 10 80 20
trietil-amin+ 10 80 20
tetrametil-guanidin+ 10 80 15
guanidin+ 10 80 15
2-imidazolidinon+ 10 80 20
kontroll
(szabad karboxil) 10 80 20
A fenti kísérletekben — amelyekben a rendszer érzékenységének kiemelésére alkalmaztunk 10 g/1 szubsztrátum-koncentrációt — azt kívántuk szemléltetni, hogy kiindulási szubsztrátumként a Á4-szteroid-hemiészterek a hemiészter szabad karboxilcsoportján képezett különféle sók alakjában egyaránt jó eredménnyel alkalmazhatók, csupán a kapott Á1,4-szteroidnak a szabad alkohol és a 21-hemiészter megoszlásarányában mutatkozik némi eltérés, a hozam ingadozásainak megfelelően.

Claims (15)

  1. SZABADALMIIGÉNYPONTOK
    1. Eljárás a 4-helyzetben és adott esetben a 9(11), 17(20) és 16(17) helyzetek közül egy vagy két további helyen kettőskötést és adott esetben a 6-, 9- és 16-szénatom valamelyikén halogénatomot vagy 1-3 szénatomos alkilcsoportot és/vagy all- és/vagy 17-szénatomon hidroxilcsoportot és adott esetben a 20-szénatomon oxocsoport szubsztituenst tartalmazó ismert 3ketopregnén-21-alkoholok 1,2-dehidrogénezésére a megfelelő, de az 1 ^-helyzetben is kettőkötést tartalmazó 3-ketopregnénekké 3-ketopregnén-21-észterek vizes közegben Arthrobacter simplex vagy Bacterium cyclooxydans mikroorganizmussal vagy az említett mikroorganizmusokból származó enzimkészítménnyel —adott esetben ismert exogén elektronakceptor jelenlétében — való kezelés útján, azzal jellemezve, hogy kiindulási szubsztrátumként a 3-ketopregnénszármazék-21-alkohol valamely 3-11 szénatomos szerves dikarbonsawal képezett 21-hemiészterét vagy eneka dikarbonsav szabad karboxilcsoport ján képezett sóját alkalmazzuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás a (Π) általános képletű 3-ketopregnén-21 -alkoholok—ahol
    Rö jelentése hidrognatom, halogénatom vagy metilcsoport;
    R9 jelentése halogénatom vagy Rj i -gyei együtt egy másodikkötés a 9- és 11-szénatom között;
    Rn jelentése hidrogénatom, hidroxilcsoport vagy Rg-cel együtt egy második kötés a 9- és 11-szénatom között;
    Rt 6 jelentésehidrogénatom vagy metilcsoport, vagy R17-tel együtt egy második kötés a 16- és 17-szénatom között;
    R17 jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport, vagy R16-tal együtt egy második kötés a 17- és lószén atom között;
    R2o jelentése oxigénatom vagy 2 hidrogénatom, vagy egy hidrogénatom és R17-tel együtt egy második kötés a 20- és 17-szénatom között — szabad 21-alkohol és 21-hemiészter elegye alakjában, majd kívánt esetben hidrolízissel 21 -alkohol dalijában történő előállítására, azzal jellemezve, hogyamegfelelő (I) általános képletű 3-ketopregnén-21-ol származék — ahol R6, Rg, Rj j,R16, R16, Ri7 és R20 jelentése egyezik a fent megadottal—valamely 3-11 szénatomos szerves dikarbonsawal képezett 21-hemiészterét vagy ennek sóját alkalmazzuk kiindulási szubsztrátumként.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiindulási 21-alkohol 3-11 szénatomos szerves dikarbonsawal képezett hemiésztereként hemiszukcinátot vagy fumarátot alkalmazunk.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hog ya kiindulási hemiészter szabad karboxilcsoport ján képezett sóként nátrium- vagy káliumsót alkalmazunk.
  5. 5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jeli emezve, hogy a kiindulási hemiészter szabad karboxilcsoportján képezett sóként valamely szerves aminnal, előnyösen trietil-aminnal, tetrametil-guanídinnal, guanidinnal vagy 2-amino-2-(hidroxi-metil)propán-l,3-diollalképezett sót alkalmazunk.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy exogén elektronakceptorként menadiont, menadíon-biszulfitot, 1,4-naftoldnont, fenazin-metoszulfátot, fenazin-etoszulfátot, düdórfenol-indofenolt vagy citokróm C-t alkalmazunk
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy exogén elektronakceptorként menadiont, menadion-biszulfitot vagy 1,4-naf toldnont alkalmazunk,
  8. 8. A2. igénypont szerinti eljárás az R6 helyén hidrogén- vagy fluoratomot tartalmazó (Π) általános képletű 3-ketopregnén-származékok előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelően szubsztituált (I) általános képletű kiindulási vegyületet alkalmazunk
    HU 204305 Β
  9. 9. A 2. igénypont szerinti eljárás Rj £ helyén hidroxilcsoportot tartalmazó (D) általános képletű 3-ketopregnén-származékok előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelően szubsztituált (Q általános képletű kiindulási vegyületet alkalmazunk.
  10. 10. A2. igénypont szerinti eljárás a 9- és
  11. 11-szénatomok között kettőskötést tartalmazó <Π) általános képletű 3-ketopregnán-származékok előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelően szubsztituált (I) általá11. A 2. igénypont szerinti eljárás a 17- és 20-szénatomok között kettőskötést tartalmazó (Π) általános képletű 3-ketopregnán-származékok előállítására, azzal jellemezve, hogymegfdelőenszubsztituált(I) általánosképletű kiindulási vegyületet alkalmazunk.
  12. 12. A2. igénypont szerinti eljárás az alábbi (Π) általános képletű 3-ketopregnén származékok 21-alkohol és 21-hemiészter elegye, illetőleg a reakciótermékhidrolizálása után 21-alkohol alakjában történő előállítására llp,21-dihidroxi-pregna-4,17(20)-dién-3-on,
    17m21-dihidroxi-pregna-4,9(ll)-tiien-3,20-dion, lip,21-dihidroxi-őa- metil-pregna-4,17(20)-dién3-on, llp,17a,21-trihidroxi-óo'- metil-pregn-4-én-3-20dion,
    17a,21-dihidroxi-16a- metil-pregna-4,9(ll)-dién3,20-dion.
    17,21-dihidroxi-pregiia-l,4,9(ll)-trién~3,20-dion,
    6a-fluor-pregna-l,4,9(ll),16-tetraén-3,20-dion, azzal jellemezve, hogy megfelelően szubsztitutált (I) általános képletű kiindulási 21-hemiésztereket alkalmazunk.
  13. 13. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelést az Arthrobacter simplex ATCC 6946 törzs vagy a Bacterium cyclooxidans ATCC 12673 törzs élősejtjeivel végezzük.
  14. 14. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelést az A simplex vagyB. cyclooxidansszárítottsejtjeivelvégezzük.
  15. 15. Az 1-12. igénypontok bánnelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelést az A simplex vagyB. cyclooxydans mikroorganizmusokból származó szteroid-AMehidrogenáz sejtmentes enzimkészítménnyelvégezzük.
HU881473A 1987-03-12 1988-02-19 Process for 1,2-dehydrogenating 3-ketopregnen-21-esters with arthrobacter symplex or bacterium cyclooxydans HU204305B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2512787A 1987-03-12 1987-03-12
PCT/US1988/000405 WO1988007092A1 (en) 1987-03-12 1988-02-19 1,2-dehydrogenation of steroidal 21-esters with a. simplex

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT50881A HUT50881A (en) 1990-03-28
HU204305B true HU204305B (en) 1991-12-30

Family

ID=21824196

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU881473A HU204305B (en) 1987-03-12 1988-02-19 Process for 1,2-dehydrogenating 3-ketopregnen-21-esters with arthrobacter symplex or bacterium cyclooxydans

Country Status (12)

Country Link
US (1) US5225335A (hu)
EP (1) EP0350488B1 (hu)
JP (1) JP2680870B2 (hu)
KR (1) KR960013094B1 (hu)
AT (1) ATE94212T1 (hu)
AU (1) AU1340888A (hu)
BG (1) BG50389A3 (hu)
DE (1) DE3883973T2 (hu)
DK (1) DK175173B1 (hu)
HK (1) HK153896A (hu)
HU (1) HU204305B (hu)
WO (1) WO1988007092A1 (hu)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1270660B (it) * 1994-10-13 1997-05-07 Poli Ind Chimica Spa Procedimento microbiologico per la preparazione di 3-oxo-4-azasteroidi-17beta-carbossi sostituiti e uso dei prodotti come inibitori dell'enzima 5alfa-riduttasi
AU5873300A (en) * 1999-07-07 2001-01-30 Pharmacia & Upjohn Company Process to prepare exemestane
WO2002102826A1 (en) * 2001-06-18 2002-12-27 Pharmacia & Upjohn Company PROCESS TO PREPARE 11β,17α,21-TRIHYDROXY-6α-METHYLPREGNA-1,4-DIENE-3,20-DIONE 21-ACETATE
HU227117B1 (en) 2002-05-10 2010-07-28 Richter Gedeon Nyrt Process for dehydrogenation of aza-androstane compounds
US20090142342A1 (en) * 2006-12-27 2009-06-04 Johns Hopkins University B7-h4 receptor agonist compositions and methods for treating inflammation and auto-immune diseases
KR101591482B1 (ko) 2008-05-28 2016-02-03 레베라겐 바이오파마 인코포레이티드 질환의 치료를 위한 ＮＦ-κＢ 의 비호르몬성 스테로이드 조절제
EP2556083A4 (en) 2010-04-05 2013-12-04 Validus Biopharma Inc NONHORMONAL STEROID MODULATORS OF NF-KAPPA-B FOR DISEASE TREATMENT
RU2480475C1 (ru) * 2011-11-16 2013-04-27 Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Промышленности И Торговли Российской Федерации Микробиологический способ получения 21-ацетоксипрегна-1,4,9( 11 ),16-тетраен-3,20-диона из 21-ацетоксипрегна-4,9( 11 ),16-триен-3,20-диона
CN103159817A (zh) * 2011-12-13 2013-06-19 辽宁海思科制药有限公司 一种琥珀酸甲泼尼龙的制备方法
CN104650172A (zh) * 2015-03-25 2015-05-27 浙江仙琚制药股份有限公司 琥珀酸甲泼尼龙的制备方法
US10799514B2 (en) 2015-06-29 2020-10-13 Reveragen Biopharma, Inc. Non-hormonal steroid modulators of NF-kappa beta for treatment of disease
US11382922B2 (en) 2019-03-07 2022-07-12 Reveragen Biopharma, Inc. Aqueous oral pharmaceutical suspension compositions

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2837464A (en) * 1955-01-11 1958-06-03 Schering Corp Process for production of dienes by corynebacteria
US2822318A (en) * 1956-12-07 1958-02-04 Olin Mathieson Production of 3-keto-delta pregnadienes by bacterium cyclo-oxydans
US2902411A (en) * 1957-06-28 1959-09-01 Upjohn Co Use of second steroid to accelerate 1-dehydrogenation of substrate steroid
US2902410A (en) * 1957-09-26 1959-09-01 Upjohn Co Process for the 1,2-dehydrogenation of a steroid with septomyxa
US3360439A (en) * 1964-08-19 1967-12-26 Squibb & Sons Inc Process for preparing 1-dehydro steroids
US3770586A (en) * 1971-03-24 1973-11-06 Upjohn Co Process for the microbiological 1-dehydrogenation of certain 4,9-(11)-pregnadienes
US4524134A (en) * 1982-07-30 1985-06-18 The Upjohn Company Process for preparing 1,2-dehydro steroids
DE3322120A1 (de) * 1982-07-30 1984-02-02 The Upjohn Co., 49001 Kalamazoo, Mich. Verfahren zur umwandlung von 1,2-gesaettigten 3-ketosteroiden in 1,2-dehydrosteroide
US4704358A (en) * 1982-10-25 1987-11-03 The Upjohn Company Δ1 -dehydrogenation with heat or air-dried B. cyclooxidans
US4749649A (en) * 1983-05-16 1988-06-07 The Upjohn Company Microbial Δ1-dehydrogenation process using a scavenger of toxic oxygen

Also Published As

Publication number Publication date
HK153896A (en) 1996-08-16
DK175173B1 (da) 2004-06-21
KR890700679A (ko) 1989-04-26
EP0350488A1 (en) 1990-01-17
BG50389A3 (en) 1992-07-15
EP0350488B1 (en) 1993-09-08
DE3883973D1 (de) 1993-10-14
AU1340888A (en) 1988-10-10
DK630988A (da) 1988-11-11
DK630988D0 (da) 1988-11-11
DE3883973T2 (de) 1994-02-17
KR960013094B1 (ko) 1996-09-30
ATE94212T1 (de) 1993-09-15
HUT50881A (en) 1990-03-28
JPH02502514A (ja) 1990-08-16
WO1988007092A1 (en) 1988-09-22
JP2680870B2 (ja) 1997-11-19
US5225335A (en) 1993-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU204305B (en) Process for 1,2-dehydrogenating 3-ketopregnen-21-esters with arthrobacter symplex or bacterium cyclooxydans
JPH0614874B2 (ja) ステロイド転化プロセス
US4749649A (en) Microbial Δ1-dehydrogenation process using a scavenger of toxic oxygen
FI72744B (fi) Foerfarande foer framstaellning av 3-oxo- / 1,4-steroider.
US4336332A (en) Process for the manufacture of hydroxylated steroids
US4898693A (en) Process for production of 6α,9α-difluoro-11β,17α-dihydroxy-16α-methyl-4-pregnene-3,20-dione and its derivatives
US6828120B2 (en) Process to prepare 11β, 17α,21-trihydroxy-6α-methylpregna-1,4-diene-3,20-dione 21-acetate
US4588683A (en) Method of preparing 11β, 17α, 20, 21-tetrahydroxy steroids and corresponding 11β, 17α, 21-trihydroxy-20-oxo steroids
US4353985A (en) Process for the preparation of 11 β-hydroxy steroids
US3080298A (en) Method of 9alpha-hydroxylating steroids
US3623954A (en) Process for making 6-hydroxy-3-keto-{66 1,4-steroids of the pregnane and androstane series
US3431173A (en) Process for the preparation of 17alpha-acyloxy-21-hydroxy-pregnanes
US3998701A (en) Process for the preparation of 17-acyl esters of 17α, 21-dihydroxysteroids of the pregnane series and novel products
US3956349A (en) Process for preparing 3-enol ethers of 11β-hydroxy-Δ4 -pregnene-3-ones and derivatives thereof
US3009936A (en) Process for the manufacture of 21-hydroxy pregnenes and intermediates obtained thereby
US3056731A (en) Dehydrogenation of steroids by microorganisms of the genus mycococcus
JP3034602B2 (ja) ４―プレグネン―３，２０―ジオン及びその誘導体の製法
DE3315722A1 (de) Verfahren zur herstellung von 3-oxo-(delta)(pfeil hoch)1(pfeil hoch)(pfeil hoch),(pfeil hoch)(pfeil hoch)4(pfeil hoch)-steroiden
EP0087787A1 (en) Pregnane derivatives and method of producing the same
Rolls et al. Δ 1 Dehydrogenation of corticoids without side chain degradation by Septomyxa
Weber et al. Preparation of 3-oxo-Δ 1, 4-steroids
AU2002311917A1 (en) Process to prepare 11beta,17alpha,21-trihydroxy-6alpha-Methylpregna-1,4-diene-3,20-dione 21-acetate
JPS6075297A (ja) ステロイド医薬中間体の微生物学的製造法
DK144422B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af 11beta-hydroxy-pregn-4-en-3,20-dioner