JPS59186998A - １７−シアノ−１２，１７−ジヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−３−オン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 憂 （式中、波線〜はヒドロキシ基又はシアノ基がα−立体
配置又はβ−立体配置のいずれかＫあることを示す。）
で示される１７−ジアツー１２．１７−シヒドロキシア
ンドロスター１，４−ジエン−３−オンに関する。

本発明により提供される１７−ジアツー１２．１７−シ
ヒドロキシアンドロスター１．４−ジエン−３−オンは
公知文献に未記載の新規化合物であり、１− プロゲステロン又はプレドニゾン、プレドニゾロンなど
で代表されるコルチコイドの合成中間体として有用であ
る。

１７−ジアツー１２．１７−シヒドロキシアンドロスタ
ー１．４−ジエン−３−オンは、１２−ヒドロキシアン
ドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオン（以下、
これを１２−ヒドロキシＡＤＤと称す）を低級アルコー
ル及びシアノ化合物の存在下　　　゛にシアン化水素と
反応させることにより製造される。溶媒として用いる低
級アルコールとしてはメタノール、エタノール、プロパ
ツールなどが挙げられる。またシアン化合物としてはシ
アン化カリウム、シアン化ナトリウムなどが例示される
。シアノ化合物の使用量は１２−ヒドロキシＡＤＤに対
して約１〜１０倍モル量が好ましい。シアン化水素は反
応系内に直接加えてもよいし、系内に存在するシアン化
合物に酢酸、プロピオン酸などの有機酸又は塩酸、硫酸
などの無機酸を作用させることにより反応系内で発生さ
せてもよい。シアン化水素は１２−ヒドロキシＡＤＤに
対して約１〜２− ８モル倍量用いるのが好ましい。この反応は約０〜３０
℃の温度で行なう。

また１７−ジアツー１２．１７−シヒドロキシアンドロ
スター１，４−ジエン−３−オンは、１２−ヒドロキシ
Ａ、Ｄ　Ｄにアセトンシアンヒドリンを少量のピリジン
の存在下に反応させるか、又は１２−ヒドロキシＡＤＤ
に直接シアン化水素を付加反応させることによっても製
造される。

反応終了後、反応混合物を水にあけ、塩化メチレンなど
で抽出し、抽出液を水、重曹水などで洗滌し、乾燥した
のち、これより低沸点物を留去するととＫより１７−ジ
アツー１２．１７−シヒドロキシアンドロスター１．４
−ジエン−３−オンの粗生成物が得られる。この粗生成
物を例えばエタノールなどから再結晶することにより高
純度の１７−ジアツー１２．１７−シヒドロキシアンド
ロスター１．４−ジエン−３−オンを得ることができる
。

原料化合物である１２−ヒドロキシＡＤＤは公知化合物
であるが、本発明者らのうちの数人が先に見出した方法
によれば、デオキシコール酸及び３− ／又はその塩を基質として１２−ヒドロキシＡＤＤを生
産するシュードモナス・プチダ又はシュードモナス・オ
バリスに属する細菌を、デオキシコール酸及び／又は千
の塩を含む培地に培養することにより得ることができる
。

上記のシュードモナス・プチダに属する細菌としては、
シュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ１０９９（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　Ｄ４０１４−Ａ１
　ｃ）　ｇ　ｇ　）菌株（微工研条寄第２０７号）があ
る。この菌株は土壌中よ秒採取したシュードモナス・プ
チダＤ４０１４（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄ
ａ　Ｄ　４０１４　）菌株（微工研条寄第２０５号）に
突然変異処理を施して得られた変異株である。またシュ
ードモナス・オバリスに属する細菌としては、シュード
モナス・オバリスＤ−４０（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
ｏｖａｌｉｓ　Ｄ　−４０）菌株（微工研菌寄第６１４
７号）がある。

シュードモナス・プチダＤ　４０１４　菌ａ　、シュー
ドモナス・プチダＤ４０１４−Ａｌ　０９９菌株及びシ
ュードモナス・オバリスＤ−４０菌株の菌学的性質を列
挙すると第１表及び第２表のとおりである。

４− 第２表 −７− ８− 糖類に対する態度（注３） 及び寒天１５．（１／Ｊ ９− （注２）：生理学的性質において、＋、士及び−は次の
ことを意味する。

＋・・・・・・その性質又はその生成あり士・・・・・
・その性質又はその生成の有無が判定し難い−・・・・
・・その性質又はその生成なしく注３）：ヒュー・アン
ド・ライフソン培地の炭素源をそれぞ　　　　　。

れ糖類１〜１５と代えた培地での菌による糖類からの酸
の生成及びガスの発生を観察したものである０十・・・
・・・酸の生成又はガスの発生あり士・・・・・・酸の
生成又はガスの発生の有無が判定し難い −・・・・・・酸の生成又はガスの発生なし上記の表に
示した菌学的性質に基づき、シュードモナス・プチダＤ
４０１４菌株、シュート°モナス・プチダＤ４０１４−
Ａ１０９９囚株及びシュート°モナス・オバリスＤ−４
０菌株の同定を行なった。シュードモナス・プチダＤ４
０１４菌株は、桿菌であること、極鞭毛を有しているこ
と、ダラム染色≠裟陰性であることなどの顕微鏡的所見
並びにオキシタ”−ゼ反応及びカタラーゼ反応がともに
陽性である１０− こと、好気性であること、０−Ｆテストの結果が酸化的
（０ｘｉｄａｔｉｖｅ　）であることなどの生理学的性
質カラパージエイズ・マニュアル・オプ・デイターミネ
イティブ・バクテリオロジー第７版及び第８版に基づき
、シュードモナス属に属する細菌であると同定した０さ
らにシュードモナス・プチダＤ４０１４菌株は、培養液
が螢光色を帯びる点、ゼラチンを液化しない点、３７℃
で生育する点、アルギニン・ジヒドロラーゼを生成する
点などからシュードモナス属のプチダ種に属する細菌で
あると同定した。一般に突然変異株はその親株と同じ種
に属するものと考えられておシ、シュードモナス・プチ
ダＤ４０１４−Ａ１０９９菌株はシュードモナス属のプ
チダ種に属する細菌であると判定した。

また、シュードモナス・オバリスＤ−４０菌株は、桿菌
であること、極鞭毛を有していること、ダラム染色が陰
性であることなどの顕微鏡的所見及び好気性であること
、０−Ｆテストの結果がマイナスであることなどの生理
学的性質からノく−ジエイズΦマニュアル番オプ・デイ
ターミネイティブ・１１− バクテリオロジー第７版及び第８版に基づき、シュード
モナス属に属する細菌であると同定した。

さらにシュードモナス・オバリスＤ−４０菌株１ｄ、両
端に丸みを持った短桿菌である点、寒天平板上で形成す
るコロニーが円形で光沢を有する点、インドールを生成
しない点並びに糖類から酸及びガスの生成が認められな
い点から、シュードモナス属のオバリス種に属する細菌
であると同定した。

上記の微生物を利用した１２−ヒドロキシＡＤＤの製造
方法では、デオキシコール酸及び／又はその塩を基質と
して用いる。デオキシコール酸の塩としては具体的には
デオキシコール酸のナトリウム、カリウムなどのアルカ
リ金属の塩又はカルシウム、マグネシウムなどのアルカ
リ土類金属の塩である。デオキシコール酸及び／又はそ
の塩の濃度は通常的１〜２００９／ｌの範囲でよいが、
生産される１２−ヒドロキシＡＤＤの収量、培養条件及
び操作性などの経済的観点から約２〜５０ｇ／ｌの範囲
が好ましい０培養方法は原則的には一般微生物の好気培
養で採用される方法と同じであるが、１２− 通常は液体培地による振盪培養法又は通気攪拌培養法が
用いられる。培地は上記のデオキシコール酸及び／又は
その塩を基質として１２−ヒドロキシＡＤＤを生産する
シュードモナス・プチダ又はシュードモナス・オバリス
に属する細菌が資化利用できる栄養源を含有するもので
あればよい。炭素源としてはデオキシコール酸及び／又
はその塩を単一炭素源としてもよいが好ましくはデオキ
シコール酸及び／又はその塩にグルコース、グリセリン
、ペプトン、肉エキス、麦芽エキス、酵母エキスなどを
併用するのがよい０また窒素源としては、例えば硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、燐酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの
無機窒素源、又はポリペプトン、ペプトン、肉エキスな
どの有機窒素源が用いられる。また、この他に燐酸水素
２カリウム、燐酸２水素カリウム、硫酸マグネシウムな
どの無機塩類が添加される。培養条件に特徴はないが、
通常２５〜３５℃で１０時間〜７日間振盪培養又は通気
攪拌培養を行なう。

このようにして培養液中に蓄積された１２−ヒドロキシ
ＡＤＤを分離、採取するには、培養液を所望によジアル
カリ性にしたのち、１２−ヒドロキシＡＤＤを溶解しか
つ水と相分離する有機溶媒、例えば酢酸エチル、クロロ
ホルム、クロロホルムとメタノールの混合液などを用い
て抽出する方法が採られる。この有機溶媒による抽出は
、菌体を含んだ状態の培養液について行なってもよいし
、予め培養液中の菌体その他の不溶成分を濾過又社遠心
分離などによシ分離除去し、得られた培養濾液又は上清
について行なってもよい。後者の抽出方法を採る場合に
は、必要に応じて濾過又は遠心分離などによって分離除
去される不溶成分について上記の有機溶媒による抽出操
作を行なうことによシ、培養液中に析出又は沈澱してい
る１２−ヒドロキシＡＤＤを回収することができる。こ
のようにして得られた抽出液を集め、これより溶媒を溜
去することによって１２−ヒドロキシＡＤＤをけじめと
するデオキシコール酸の酸化物及び未変換デオキシコー
ル酸をほぼ全量回収することができる０得られた抽出物
を例えば酢酸エチル、ジクロルメタン／メタノールなど
から再結晶するか、又はシリカゲルカラムに吸着させ、
クロロホルムとエタノールの混合液で溶出させること釦
より１２−ヒドロキシＡＤＤを取得することができる。

本発明により提供される１７−ジアツー１２．１７−シ
ヒドロキシアンドロスター１．４−ジエン−３−オンは
、（１）これを脱水反応に付したのち部分水素添加を行
ない、得られた生成物の３位のケトン部分を保護し、こ
れをメチルマグネシウムハライドと反応させ、さらにそ
の生成物を必要に応じて部分水素添加反応に付すること
にようプロゲステロンに誘導することができ、また（Ｉ
ｔ）　１７−ジアツー１２．１７−シヒドロキシアンド
ロスター１，４−ジエン−３−オンの１２位の永酸基を
常法によシ１１位のβ−水酸基に転換させ、１７位のシ
アノ基を利用して側鎖を誘導することによりプレドニゾ
ン、プレドニゾロンなどに代表されるコルチコイドに導
くことができる。

以下に、本発明を実施例及び参考例により具体１５− 的に説明する。

参考例１ シュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ１０９９菌株の
取得方法培地１（組成：デオキシコール酸０．５％、水
酸化ナトリウムｏ、　ｏ　ｓ　％　ｓペプトン０．５％
、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５チ及び寒
天１．５％）のスラントに生育させたシュードモナス・
プチダＤ４０１４菌株の一白金耳を、予め試験管内に準
備した培地２（組成：デオキシコール酸２チ、水酸化ナ
トリウム０．２％、硝酸アンモニウム０．２　％　、燐
酸２水素カリウム０．１％、燐酸水素２カリウム０．６
チ、硫酸マグネシウム・７水和物０．０２％及び酵母ｘ
　キｙ、　０．０２％）（０１０ｔｇＫ植菌り、３０”
Ｃｆ１４〜１５時間振盪培養した。この培！液の０．３
　ｄを予め試験管に準備した培地３（組成：デオキシコ
ール酸０．５　％　、水酸化ナトリウムｏ、　ｏ　ｓ　
ｑＡ　ｓグルコース０．１％、硝酸アンモニウム０．２
％、燐酸２水素カリウム０．１　％　、燐酸水素２カリ
ウムｏ、６％５ｖｔｔｒＲマグネシウム・７水和物０．
０２１Ｊｉ及び酵母エキス０．０２チ）の１０−に加え
、３０℃で８〜９時間培１６− 養した。ついで、この対数増殖期にある菌体を０．４５
μのメンブレンフィルターで無菌的に濾過集菌し、０．
１Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ：　７．０　）　２０１＋１／
で洗滌後、同じ緩衝液２５ｄＫ懸濁させた。これに終濃
度が５０μ９／ｌｄＫなるようにＮ−メチル−Ｎ′−二
トローＮ−二トロングアニジンを添加し、３〜４分放置
することによシ突然変異処理を行なった。突然変異処理
を施した菌体を０．４５μのメンブレンフィルターで濾
過集菌し、Ｏ，１Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨニア、０）２０
ｄで洗滌後、同じ緩衝液２０＋ｔ／に晋濁した。得られ
た菌懸濁液を滅菌生理食塩水で希釈し、それを培地４（
組成：デオキシコール酸０．５％、水酸化ナトリウム０
．０５％、硝酸アンモニウム０．２チ、燐酸２水素カリ
ウム０．１％、燐酸水素２カリウム０．６％、硫酸マグ
ネシウム・７水和物０．０２％、酵母エキス０．０２　
％及び寒天１．５％）の寒天平板上に５００〜１０００
個のコロニーを出現させるように塗布したのち、３０℃
で３〜４日間培養した。

出現したコロニー中の罹小コロニーを培地１のスラント
に単離したのち、その−白金耳を予め試験管に準備した
培地５（組成：デオキシコール酸０．２チ、水酸化ナト
リウム０．０２％、グルコース０．１チ、硝酸アンモニ
ウム０．２％、燐酸２水素カリウム０．１チ、燐酸水素
２カリウム０．６％、硫酸マグネシウム・７水和物０．
０２％及び酵母エキス０．０２％〕の１０ｓｌに植菌し
、３０℃で２４時間振盪培養した。

得られたそれぞれの培養液中の生産物を薄層クロマトグ
ラフィーにより検定し、目的とする１２α−ヒドロキシ
アンドロスター１．４−ジエン−３，１７−ジオン（以
下、これを１２α−ヒドロキシＡＤＤと称す）を選択的
に蓄積している一菌株を見い出し、これをシュードモナ
ス・プチダＤ４０１４−Ａ１０９９と命名した。

参考例２ シュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ１０９９菌株（
微工研菌寄第６３２７号）を次に示す方法で培　　　“
養した。デオキシコール酸ｏ、５ｆｌ、！ルコース０．
１１１硝酸アンモニウムｏ、　２９　、燐酸２水素カリ
ウム０．１　ｇ、燐酸水素２カリウム０．６ｇ、硫酸マ
グネシウム・７水和物０．０２，９．酵母エキス０．０
２．９及び水酸化ナトリウム０．０５ｇに水道水を加え
て容量を１００ｄ（ｐＨ：　８．４　）に調整し、これ
を培地とした。この培地を５００ｄ容坂ロフラスコに入
れ、１２０℃で１５分間、蒸気殺菌を行なった。予め上
記の培地と同じ培地で試験管振盪機にて１５時間増殖さ
せた種菌の１０ｄを上記の５００ｍ／容坂ロフラスコに
添加し、３０℃で２８時間振盪培養した。

培養後、この培養液を集め、遠心分離機で菌体を除去後
、得られた培養液上清に１規定の水酸化ナトリウム水溶
液を加えることによシ、この培養液上清のｐＨを１２附
近に調整した。ついで、培養液上清を酢酸エチル３００
ｗＬｌで抽出し、抽出液から酢酸エチルをロータリー・
エバポレーターで溜去することによシ１２α−ヒドロキ
シＡＤＤを３６０　ｍｌｌ得た０ 得られた１２α−ヒドロキシＡＤＤの一部を取シ、これ
にメタノールを加えて２チ溶液とし、この溶液２５ｔＬ
ｔをミクロボンダバックＣ−１８カラムを備えた高速液
体クロマトグラフィー（米国ウォーターズ社製、ＨＬＣ
−ＧＰＣ−２４４型）に注入１９− した。移動相としてｐＨ４，０に調整した水／メタノー
ルの３０／７０答量比の混合液を流速ＩＷＬｌ／分で流
し、検出を屈折率方式で行なった。得られた液体クロマ
トグラフにおける各ピークの面積比を積分計（高滓製作
所製、高滓クロマトパックＣ−ＲＩＡ）で求め、この面
積比から上記の１２α−ヒドロキシＡＤＤの純度を求め
たところ、９９．５％であった。

また、上記で得られた１２α−ヒドロキシＡＤＤの確認
を下記の方法で行なった。

マススペクトルｍ／ｚ：３００〔Ｍゾ ２８２　［Ｍ−ＨｚＯ］“。

またｍ／Ｚセ１２１及び１２２より３−ケト−１，４−
ジエンの存在が確認された。

ＤＭＳＯ−ｄｓ ＮＭＲスペクトル（９０ＭＨｚ　）δＨＭＳ　　　　’
０．７５　（３Ｈ、ｓ　）　１８−ＣＨ３Ｉ、１３　（
３Ｈ、ｓ　）　１９−ＣＨ５３，８５（ＩＨ，ｄ）１２
β−Ｈ ４，５５（ＩＨ，ｄ）１２α−０Ｈ ５，９５（ＬＨ）４−Ｈ ２０− ６．１５（ＩＨ，ｄ）２−Ｈ ７，１０（ＩＨ，ｄ）１−Ｈ 参考例３ シュードモナス・オバリスＤ−４０菌株（微工研菌寄第
６１４７号）を次に宗す方法で培養した。

デオキシコールｅ５０１ｓ硝ｅアンモニウム２．０ｇ１
燐酸２水素カリウム１．０９、燐酸水素２カリウム５．
０　ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｐ。

酵母エキス０．２．９及び水酸化ナトリウム５、Ｏｙに
水道水を加えて容量をｉｚ＜調整し、これを培地とした
。この培地を５００ｍ／容坂ロフラスコに１００ｄ宛１
０本に分注し、１２０℃で１５分間、蒸気殺菌を行なっ
た。予め上記の培地と同じ培地で試験管振盪機にて２日
間増殖させた種菌を上記の５００ｄ容坂ロフラスコあた
）１０ｄ宛添加し、３０℃で５日間振盪培養した。培養
後、これらの培養液を集め、遠心分離機で菌体を除去後
、得られた培養液上清をクロロホルム／メタノールの２
／１容景比の混合液１，５ｔで抽出し、ロータリー・エ
バポレーターでクロロホルム／メタノール混合液を溜去
することにより、３４ｇのデオキシコール酸の酸化生成
物及び未変換のデオキシコール酸の混合物を得た。

上記の混合物２０ｇを少量のクロロホルム／エタノール
の９９．５７０．５容量比の混合液に溶解させ、６００
Ｉのシリカゲルカラムに吸着させた。このカラムをクロ
ロホルム／エタノールの９９．５７０．５容量比の混合
液１ｔで洗滌後、クロロホルム／エタノールの９９７１
答ｉ比の混合液２ｔをカラムに流し、得られた溶出液か
ら溶媒を溜去することにより、１２β−ヒドロキシアン
ドロスタ−１，４−ジエン−３，１７ジオン（以下、こ
れを１２β−ヒドロキシＡＤＤと称す）３．４ｇを単離
した。

上記で単離された１２β−ヒドロキシＡＤＤの確認を下
記の方法で行なった。

融点＝２１３℃ −ｒｘスベｙ）　ルｍ／ｚ　：　３００（Ｍ）”２８５
　（Ｍ−ＣＨｓ：）”°　　　　　・２８２　（：Ｍ−
Ｈ２０）“。

またｍ／ｚ−１２２より３−ケト−１，４−ジエンの存
在が確認された。

ＣＤα３゜ ＮＭＲスペクトル（９０ＭＨｚ　）δＥＭＳ　　’０．
９６　（３Ｈ，ｓ　）　１ｇ　−ＣＨ５１，２１（３Ｈ
，ｓ　）　１９−ＣＨ５２，３０〜２．５０　（２Ｈ、
ｍ　）　１６−ＣＨ２３，７２（ｔＨ，ｄｄ、Ｊ−５Ｈ
ｚ及び１０Ｈｚ）１２α−Ｈ６，０６（ＩＨ，ｓ　）　
４−Ｈ ６，２０（ＩＨ、ｄ　、　Ｊ−１０Ｈｚ　）　２−Ｈ６
，９８（ＩＨ、ｄ　、　Ｊ−１０Ｈｚ　）　１−Ｈ実施
例１ メタノール２０ｔｔｌに１２α−ヒドロキンＡＤＤ３、
ＯＯｇ及びシアン化カリウム３．２１Ｆを添加し、室温
で攪拌した。この溶液に氷酢酸３ＪＦを５時間を要して
滴下し九のち、−夜攪拌した。次いで、反応液に氷酢酸
２ｇを加えたのち、この溶液を２００−の水に注ぎ、塩
化メチレンで抽出した。抽出液を水で洗滌したのち、無
水硫酸す）　＋）ラムで乾燥し、減圧下に低沸点物を留
去することによシ、１７−ジアツー１２α、１７−シヒ
ドロキシアンドロスター１．４−ジエン−３−オンの粗
結晶を３．２４．９２３− 得た。この粗結晶をエタノールから再結晶したものの性
状は次のとおシであった。

Ｎ　Ｍ　Ｒスヘ／トル（９０ＭＨｚ　）ｄ−ＤＭＳＯ。

’ＨＭＳ　　　’ ０．８８（ｓ、３Ｈ）；　１．１ｇ（ｓ、３Ｈ）；４．
０９〜４．２４（ｍ、ＩＨ）； ５．９９　、６．０３〜６．２１　（ｂｓ、ｍ、　３Ｈ
）　；？、１０　、７．１３　（ｓ　、　ｄ　、　２Ｋ
）δｄ−ＤＭＳＯ／Ｄ２０　。

ＨＭＳ　　　　’ ０．８７（ＩＩ、３Ｈ）；　１．１６（！１，３Ｈ）；
４．０８〜４．２２（ｍ、　ＩＨ）　；　５．９９（ｂ
ｓ、　ＩＨ）；６．１０　、６．１２　（ｅａｃｈ　ｄ
　、　Ｉ　Ｈ）　；７、ｔ３（ｄ、ｔＨ） ＦＤ−Ｍａｓｓ　ｙ、ヘク）ルｍ／ｚ　：３２７（Ｍ）
”、３２Ｂ（Ｍ＋１）” ３００　（Ｍ−ＨＣＮ）”、　３０１　（Ｍ＋１−ＨＣ
Ｎ）ＩＩ　Ｒスヘクトル（ＫＢｒ、ｔｌｆＩ−’）：　
１６１３，１６５ｏ、２２３５実施例２ 実施例１においてシアン化カリウム３．２６９の代シに
シアン化ナトリウム２．４５ｇを用いる以外は同２４− 様に反応及び分離精製を行なうことによシ、１７−ジア
ツー１２α、１７−シヒドロキシアンドロスター１．４
−ジエン−３−オンを２．８２９得た。

特許出願人　株式会社　り　ラ　し 代理人弁理士　本多　堅 ２５− ９０８−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １７−ジアツー１２．１７−シヒドロキシアンドロスタ
   ー１，４−身エンー３−オン。