PL189339B1 - Sposób wytwarzania związków epoksy - Google Patents

Abstract

1 Sposób wyWaarzania związków <^j^<^kksy, obejmujący zetknięcie związku substratowego, zawierającego podwójne wiązanie olefinowe, ze związkiem nadtlenkowym w obecności aktywatora nadtlenkowego, przy czym wymieniony aktywator nadtlenkowy oznacza chlorodifluoroacetamid lub odpowiada związkowi o wzorze: X1 O x2-c-rp-c-nh2 'ί X3 znamienny tym, że Rp wybiera się z grupy, składającej się z grupy alkenylowej, alkinylowej i -(ΈΧ'λ5)?-, X1, X , X3, X4 i Χ^ν^ΐτ^ sęę nłeinleżnie spośród atomu fluorowca, atomu wodoru, grupy alkilowej, fluorowcoalkilowej i cyjanowej oraz cyjanoalkilowej, pod warunkiem, że co najmniej jeden z χ4 i X5 oznacza chlorowiec.

Description

Tło wynalazku

Wynalazek ten dotyczy nowych sposobów wytwarzania związków 9,11-epoksysteroidowych, zwłaszcza tych z szeregów 20-spiroksanu, oraz ich analogów. Najbardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy nowych i korzystnych sposobów wytwarzania wodorometylo-9,11a-epoksy-17a-hydroksy-3-oksopregn-4-en-7a,21-dikarboksylanu, γ-laktonu (przytaczanego także jako eplerenon lub epoksymeksrenon).

Metody wytwarzania związków z szeregu 20-spiroksanu opisuje się w opisie patentowym U.S.nr4559332. Związki wytworzane zgodnie z procesem z tego opisu, mają otwarty pierścień E, zawierający atom tlenu, o ogólnym wzorze:

189 339

w którym -A-A- reprezentuje grupę -CH2-CH2 lub -CH=CH-; R¹ reprezentuje niższą grupę alkoksykarbonylową o orientacji a, albo grupę hydroksykarbonylową -B-B- reprezentuje grupę -CH2-CH2- lub a- albo β-zorientowaną grupę r⁶x r⁷ \ ✓

CH-CH

I I

-CH —CH₂ — CH —

III przy czym R6 i r7 oznaczają atom wodoru; X reprezentuje dwa atomy wodoru lub grupę okso; Y i Y jednocześnie reprezentują mostek tlenowy -O- albo Y¹ reprezentuje grupę hydroksy i Y² reprezentuje grupę hydroksy, niższą alkoksy lub, jeśli X reprezentuje H₂^ także nizszą alkanoiloksy; oraz sole takich związków, w których X reprezentuje grupę okso i Y~ reprezentuje grupę hydroksy, czyli odpowiadających kwasom 17p-hydroksv-21-karboksylowych.

Opis patentowy U.S. nr 4 559 332 opisuje liczne metody wytwarzania epoksymeksrenonu i związków pokrewnych o wzorze IA. Ukazanie się nowych i rozszerzenie klinicznych zastosowań dla epoksymeksrenonu stwarzają potrzebę ulepszenia procesów produkcji tego i innych pokrewnych steroidów.

Streszczenie wynalazku

Pierwszym przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie ulepszonych sposobów wytwarzania epoksymeksrenonu, innych 20-spiroksanów i innych steroidów, mających wspólne cechy strukturalne. Wśród poszczególnych przedmiotów wynalazku znajduje się: zapewnienie ulepszonego sposobu, który wytwarza produkty o wzorze LA i inne związki pokrewne, z wysoką wydajnością; dostarczenie takich sposobów, które obejmują minimum etapów izolacji; oraz dostarczenie takich sposobów, z których można się wywiązać, dysponując rozsądnym kapitałem i przeprowadzić przy rozsądnych kosztach przemian.

W związku z tym, niniejszy wynalazek odnosi się do szeregów schematów syntez epoksymeksrenonu; związków pośrednich użytecznych w wytwarzaniu epoksymeksrenonu; oraz syntezy takich nowych związków pośrednich.

Nowe schematy syntezy opisuje się szczegółowo w opisie zalecanych postaci realizacji. Wśród nowych związków pośrednich według tego wynalazku znajdują się opisane bezpośrednio poniżej.

Związek o wzorze IV odpowiada strukturze:

IV

189 339 gdzie: -A-A- reprezentuje grupę -CHR⁴-CHR⁵- lub -CR⁴=CR⁵-; R³, R⁴ i R⁵ wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, chlorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy; R¹ reprezentuje «-zorientowaną grupę niŻszą alkoksykarbonylową lub grupę hydroksykarbonylową; R oznacza grupę pozostającą 11α, której usunięcie powoduje skuteczne utworzenie podwójnego wiązania między atomami węgla w pozycji 9 i 11; -B-B- reprezentuje grupę -CHR⁶-CHR⁷ lub α-albo β-zorientowaną grupę:

-CH—CH₂-CH—

III gdzie R i R wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, chlorowca, niższej alkoksy, acylowej, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy; oraz R⁸ i r9 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydroksy, chlorowca, niższej grupy alkoksy, acylowej, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, albo Ri R⁹ razem obejmująkarbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, albo R⁸ i r9 razem z R⁶ i R7 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D.

Związek o wzorze IVA odpowiada wzorowi IV, gdzie R8 i r9 razem z atomem węgla pierścienia, do którego są dołączone, tworzą strukturę:

7) mil( ch₂) ₂

Y‘

I

C - X

XXXIV gdzie X, Y¹, Y² i C(17) są takie jak określono powyżej.

Związek o wzorze IVB odpowiada wzorowi IV, gdzie R8 i r9 razem tworzą strukturę o wzorze XXXHI:

o

XXXIII

Związki o wzorach odpowiednio IVC, IVD i IVE, odpowiadają każdemu wzorowi IV, IVA Iub IVB, gdzie każdy z -A-A- i -B-B- oznacza -CH2-CH2-, R³ oznacza atom wodoru i R¹ oznacza grupę alkoksykarbonylową. korzystnie meloksykarbonylową. Związki, wchodzące w zakres wzoru IV można wytwarzać przez reakcję niższego odczynnika alkilosulfonylującego Iub acylującego, albo czynnika tworzącego halogenek, z odpowiadającym związkiem wchodzącym w zakres wzoru V.

Związek o wzorze V odpowiada strukturze:

V

189 339 gdzie -A-A-, R¹, R³, R⁸ i R⁹ są takie jak określono we wzorze IV.

Związek VA odpowiada wzorowi V gdzie R8 i R⁹ razem z atomem węgla pierścienia, do którego są dołączone, tworzą strukturę:

C^I 7) inii( CHg) ₂ XXXIV gdzie X, y1, Y² i C(17) są takie jak określono powyżej.

Związek o wzorze VB odpowiada wzorowi V gdzie r8 20 i r9 razem tworzą strukturę o wzorze XXXIII:

o '•mir

XXXIII

Związki o wzorach odpowiednio VC, VD i VE odpowiadają każdemu wzorowi V, VA lub VB gdzie każdy z -A-A- i -B-B- oznacza -CH2-CH2, R³ oznacza atom wodoru i Ri oznacza grupę alkoksykarbonylową, korzystnie metoksykarbonylową. Związki wchodzące w zakres wzoru V można wytworzyć przez reakcję alkoholami metalu alkalicznego z odpowiadającym związkiem o wzorze VI.

Związek o wzorze VI odpowiada strukturze:

VI

OO Q gdzie -A-A-, -B-B-, R , R i R są takie jak określono we wzorze IV.

Krótki opis rysunków ·

Figura 1 jest schematem sposobu biokonwersj i kanrenonu lub pochodnej kanrenonu do odpowiadającego związku 11a-hydroksylowego;

Figura 2 jest schematem zalecanego sposobu biokonwersj 11a-a hydroksylacji kanrenonu i pochodnych kanrenonu;

Figura 3 jest schematem szczególnie zalecanego sposobu biokonwersj i/11a-hydroksylacji kanrenonu i pochodnych kanrenonu;

Figura 4 ukazuje rozkład wielkości cząstek dla kanrenonu jaki wytworzono zgodnie ze sposobem według fig. 2; oraz

Figura 5 ukazuje rozkład wielkości cząstek dla kanrenonu jaki wyjałowiono w bioreaktorze transformacyjnym zgodnie ze sposobem według fig. 3.

Odpowiednie litery odniesienia wskazują odpowiadające części w rysunkach.

Opis zalecanych postaci realizacji

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, wymyślono różne nowe schematy sposobu wytwarzania epoksymeksrenonu i innych związków, odpowiadających wzorowi I:

189 339

I gdzie: -A-A- reprezentuje grupę -CHR⁴-CHR⁵- lub -CR⁴=CR⁵-; R³, R⁴ i R⁵ wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, chlorowca, grupy hydroksy, niższej alkilowej , nisszej alkoksy, hydrossyalkilowej, tkkossyalkilowej , hddroksykarooyylowej, cyjano i ydcloksy; R¹ reprezentuje a-zorientowaną grupę niższą alykysyyydbonylową lub grupę hydroysykyrbooylnwą; -B-B-reprezeotuje grupę -CHR⁶-CHR⁷ lub α-albo p-zorientowana grupę:

^R\ z^R?

CH-CH

-CH— CH₂—CH—

III gdzie R⁶ i R7 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, chlorowca, niższej alkoksy, acylkwej, hyydoksyalyilnwej, alyoksyalyilkwej, hyddoysyyadbnnylkwej, alkilowej, alynysykyrbonylowej, acylkksyalyilkwej, cyjano i adylkysy; oraz R⁸ i r9 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hcdroysy, chlorowca, nizszej grupy alynksy, acylowej, hydrkksyylyilowej, alykysyylyilowej, hydroysykadboohlkwej, alkilowej, alykyscyadbonylowej, ycyloysyylkilkwej, cyjano i arylkysy. albo R⁸ i R9 razem nbejmująyyrbocyyliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, albo R⁸ i R9 razem z R6 i r7 obejmują yjdbkcykliczną lub heterocykliczną, strukturę pierścieniową połączoną z peotycykliczocm pierścieniem D.

Z wyjątkiem oznaczeń przeciwnych, grupy organiczne przytaczane jako „niższe” w niniejszym opisie zawierają w większości 7, a korzystnie od 1 do 4 atomów węgla.

Nizszą. grupę ylykysykarbonylową. oznacza korzystnie grupa, pochodząca od grupy alkilowej, mającej od 1 do 4 atomów węgla, takiej jak grupa metylowa, etylowa, propylowa, izopropylowa, butylowa, izobutylkwa sec-butylowa i tert-butylowa; zwłaszcza zaleca się grupę metkysyyjrbkoylową, etoysykyrbonylową i izopropoksykarboohlową. Niższa grupa yIynysy korzystnie oznacza grupę, pochodzącą od jednej z wyżej wspomnianych grup C1-C4 alkilowych, zwłaszcza od pierwszorzędowych grup C1-C4 alkilowych, szczególnie zaleca się grupę metky'sy. Niższą grupę ylyannilową oznacza korzystnie grupa, pochodząca od prostołańcuchowej grupy alkilowej, mającej od 1 do 7 atomów węgla; zwłaszcza zaleca się grupę formylową i acetylową.

Mostek metylenowy w pozycji 15, 16 jest korzystnie β-zorientrlwyoy.

Zalecaną klasą związków, które można wytwarzać zgodnie ze sposobami według wynalazku, s. związki 20-spiroysyokwe opisane w opisie patentowym U.S. nr 4 559 332, to jest tych, które odpowiadaj. wzorowi IA:

IA

189 339 w którym -A-A- reprezentuje grupę -CH2-CH2 lub -CH=CH-; -B-B- reprezentuje grupę -CH2-CH2- lub a- albo β-zorientowaną, grupę o wzorze IIIA:

CH— CH_a—CH—

IIIA

R¹ reprezentuje niższą grupę alkoksykarbonylową o orientacji a, albo grupę hydroksykarbonylową; X reprezentuje dwa atomy wodoru, grupę okso lub =S; Y¹ i Y² razem reprezentują mostek tlenowy -O- albo γΐ reprezentuje grupę hydroksy i γ2 reprezentuje grupę hydroksy, niższą alkoksy lub, jeśli X reprezentuje H2, także niższą alkanoiloksy.

Korzystnie, związki 20-spiroksanowe wytwarzane nowymi sposobami według wynalazku są tymi związkami o wzorze I, w których Y¹ i γ2 razem reprezentują mostek tlenowy -O-.

Zwłaszcza zalecanymi związkami o wzorze I są te, w których X reprezentuje grupę okso. Ze związków 20-spiroksanowych o wzorze IA, w których X reprezentuje grupę okso, najbardziej zaleca się te, w których γΐ razem z γ2 reprezentują mostek tlenowy -O-.

Jak już wspomniano, kwas 17e-hydroksy-21-karboksylowy może także występować w postaci swej soli. Bierze się pod uwagę, zwłaszcza sole metalu i amonowe, takie jak metali alkalicznych i sole metali ziem alkalicznych, np. sodu, wapnia, magnezu i korzystnie sole potasowe, oraz sole amonowe, pochodzące od amoniaku lub odpowiednich, korzystnie fizjologicznie tolerowanych organicznych zasad, zawierających azot. Zasadami branymi pod uwagę są nie tylko aminy, np. niższe alkiloaminy (takie jak trietyloaminą), hydroksy-niższe-alkiloaminy (takie jak 2-hydroksyetyloamina, di-(2-hydroksyetylo)amina lub tri-(2-hydroksyetylo)-amina, cykloalkiloaminy (takie jak dicykloheksyloamina) lub benzyloaminy (takie jak benzyloamina i N,N'-dibenzyloetylenodiamina), lecz także związki heterocykliczne, zawierające azot, np. te o charakterze aromatycznym (takie jak pirydyna i chinolina) lub te, które mają co najmniej częściowo nasycony pierścień heterocykliczny (takie jak N-etylopiperazyna, morfolina, piperazyna lub N,N'-dimetylopiperazyna).

Wśród objętych zalecanych związków są także sole metali alkalicznych, zwłaszcza sole potasowe, związków o wzorze IA, w którym R¹ reprezentuje grupę alkoksykarbonylową, przy czym X reprezentuje grupę okso i każdy z Y¹ i γ2 reprezentuje grupę hydroksy.

Szczególnie zalecanymi związkami o wzorze I i LA są np. następujące:

9α, 11 α-epoksy-7a-metoksykarbonylo-20-spiroks-4-eno-3,21 -dion,

9α, 11 α-epoksy-7 a-etoksykarbonylo-20-spiroks-4-eno-3,21 -dion,

9a,11a-epoksy-7a-izopropoksykarbonylo-20-spiroks-4-eno-3,21-dion, oraz analogi 1,2-dehydro każdego ze związków:

9α, 11 α-epoksy-6α,7α-metyleno-20-spiroks-4-eno-3,21 -dion,

9α, 11 a-e^f^ok^i^y^-6e,7e-m^e1yleno-2C^^s5p^ir^ok^s-4-eno-3,21 -dion,

9a,11a-epoksy-6β, 7β; 15β, 16e-bismetyleno-20-spiroks-4-eno-3,21-dion, oraz analog 1,2-dehydro każdego z tych związków;

kwas 9a, 11 a-epoksy-7a-metoksykarbonylo-17e-hydroksy-3-oksopregn-4-eno-21 -karboksylowy, kwas 9a, 11 a-epoksy-7a-etoksykarbonylo-17e-hydroksy-3-oksopregn-4-eno-21 -karboksylowy.

kwas 9a, 11 a-epoksy-7a-izopropoksykarbonylo- 17e-hydroksy-3-oksopregn-4-eno-21 -karboksylowy, kwas 9a, 11 a-epoksy-17 e-hydroksy-6a,7a-metyleno-3 -oksopregn-4-eno-21 -karboksylowy,

Ir,, ,α , 11 e 30» λΖλπτ 1 1 βQ Kł γιΌλΙγα» t ιββ ^β łme+r ri 0—3 O z\1zn r\«gA —^41 A no»— 2 O 1 Ir 3-t*0nkZ.r yio 0 Λ7 ΙΠ f

JAWdó 7U,i / p-iiyuj.urkoj^up, / p-ixivŁ^iviiu-^“vr\.ovpi vgn—r-vuv-x.a -utu durojιυ kw_as 9a, 11 a-epoksy-17β-hydroksy-6β,7β; 15 β, 17β-bisme1yΊeno-3-oksopregn-4-eno-21 karboksylowy, oraz sole metali alkalicznych, zwłaszcza sole potasowe lub amonowe k_ażdego z ty_ch kwasów, a także odpowiadające analogi 1,2-dehydro każdego ze wspommanych k_wasów karboksylowych lub ich soli;

_est_er metylowy, ester etylowy i ester izopropylowy, kwasu 9a, 11a-epoksy-15 β,16β -metyl_eno-3,21 -diokso-20-spiroks-4-eno-7a-karboksylowego,

183 339 ester metylowy, ester etylowy i ester izopropylowy, kwasu 9α, 11α-epoksy-15-,16 β-metyleno-3,21 -diokso-20-spiroksa-1,4-dieno-7a-karboksylowego, ester metylowy, ester etylowy i ester izopropylowy, kwasu 9α, 11 α-epoksy-20-spiroks-4-eno-7a-karboksylowego,

9α,11α-eβoksy-6β, 7 --metyleno-20-spiroks-4-en-3-on,

9α,11a-epoksy-6-,7-; 15-,16--bismetyleno-20-spiroks-4-en-3-on, ester metylowy, ester etylowy i ester izopropylowy, kwasu 9α,11 cn-epoksy- 17e-hydroksy-17 α-(3-hydroksypropyio)-3 -oksoandrost-4-eno-7a-karboksylowego,

-ad i a-epoksy-17β-hydroksy-17α-(3-hydroksypropylo)-6α,7α-metylenoandrost-4-en-3-on,

9α, 11 a-epoksy-17--hydroksy-17α-(3-hydroksyβroβylo)-6β,7β-metylenoandrost-4-en-3-onl

9α,11 α-epoksy-17 p-hydroksy- 17a-(3 -hydroksypropylo)-6-,7-; 15 β,16--bismetylenoandrost-4-en-3-on, łącznie z analogami l7α-(3-acetoksyβropylo) i 17α-(3-formyloksyβropylo) wspomnianych związków androstanowych, a także analogi 1,2-dehydro wszystkich wspomnianych związków szeregu androst-4-en-3-onu i 20-sproks-4-en-3-onu.

Nazwy chemiczne związków o wzorach I i IA i związków analogicznych, mających takie same charakterystyczne cechy strukturalne, są zgodne z aktualnym nazewnictwem w następujący sposób: dla związków, w których Y’ razem z Y² reprezentują -O-, od 2-spiroksanu (np. związek o wzorze LA, w którym X reprezentuje grupę okso i Y’ razem z Y² reprezentują -O- pochodzi od 20-spiroksan-21-onu); dla tych, w których każdy z Y’ i Y² reprezentuje grupę hydroksy i X reprezentuje grupę okso. od kwasu 17--hydroksy-17a-pregneno-21 karboksylowego; i dla tych, w których każdy z Y’ i Y² reprezentuje grupę hydroksy i X reprezentuje dwa atomy wodoru, od 17β-hydroksy-17α-(3-hydrokspropylo)androstanu. Ponieważ postacie cykliczne i o otwartych łańcuchach, czyli laktony oraz kwasy 17--hydroksy-21-karboksylowe i ich sole, odpowiednio, są ściśle spokrewnione jeden z drugim tak, ze ten drugi może być uznany jedynie za postać hydratu tego pierwszego, należy rozumieć, że to co było wcześniej w niniejszym i to co nastąpi w niniejszym, z wyjątkiem oznaczeń przeciwnych, w obu produktach końcowych o wzorze I i w materiałach wyjściowych oraz produktach pośrednich o analogicznej strukturze, w każdym wypadku wszystkie wymienione postacie razem.

Zgodnie z wynalazkiem, obmyślono kilka oddzielnych schematów sposobu wytwarzania związków o wzorze I w wysokiej wydajności i przy rozsądnych kosztach. Każdy ze schematów syntezy następuje poprzez wytworzenie szeregów związków pośrednich. Liczne z tych związków pośrednich są związkami nowymi, i sposoby wytwarzania tych związków pośrednich są sposobami nowymi.

Schemat 1 (poczynając od kanrenonu lub materiału pokrewnego)

Jednym zalecanym schematem sposobu wytwarzania związków o wzorze I, korzystnie rozpoczyna się kanrenonem lub pokrewnym materiałem odpowiadającym wzorowi XIII (albo alternatywnie, sposób może się zacząć androstendionem lub pokrewnym materiałem wyjściowym)

XIII gdzie -A-A- reprezentuje grupę CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-; r3, r4 i r5 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, chlorowca, grupy hydroksy, niższej alkilowej, niższej alkoksy, hydroksyalkilowej. alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy; -B-B- reprezentuje grupę -CHR-CHR⁷ lub a-albo β-zorientowaną grupę:

189 339

CH

Z

CH

-CH —CHj-CMIII gdzie R i R wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, chlorowca, niższej alkoksy, acylowej, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy; oraz R⁸ i R⁹ wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydroksy, chlorowca, niższej grupy alkoksy, acylowej, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, albo r8 i r9 razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, albo R⁸ i R9 razem z R⁶ i R7obejmują karbocykliczną Iub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D.

Stosując sposób biokonwersji typu zilustrowanego w fig. 1 i 2, grupę 11-hydroksy o orientacji a wprowadza się do związku o wzorze XIII, wytwarzając przez to związek o wzorze VIH:

VIII gdzie -A-A-, -B-B-, R3, R⁸ i r9 są takie jak określono we wzorze XIII. Korzystnie, związek o wzorze XIII ma strukturę

ΧΙΙΙΑ i produkt lla-hydroksy ma strukturę

VIIIA

189 339 w której każda -A-A- reprezentuje grupę -CH2-CH2- lub -CH=CH=; -B-B- reprezentuje grupę -CH2-CH2- lub grupę α lub β-zurientuwaną:

-Ch- CH.— CH—

IIIA β

R uznacza atum wuduru, niższą grupę alkiluwą lub nizszą alkuksa; X reprezentuje dwa atuma wudum, grupę uksu lub =S; Y¹ i γ2 razem reprezentują mustek tlenuwa -O- lub Y ‘reprezentuje grupę hadruksa i Y² reprezentuje nizszą grupę alkuksa albu, jeśli X reprezentuje H2, także nizszą alkanuiluksy; uraz sule związków, w którach X reprezentuje grupę uksu i γ2 reprezentuje grupę hydruksy. Kurzastniej, związek u wzurze V1HA wytwarzana w reakcji, udpuwiada związkowi u wzurze VDIA gdzie -A-A- i -B-B- uznaczają każda grupę -CH2-CH2-; R3 uznacza atum wuduru; Y\ γ2 i X są takie jak oSreślonu we wzurze XHLA; i R8 i r9 razem twurzą strukturę 20-spiruksanu:

A /

XXXIII.

Wśród zalecanach urganizmów, które mużna stosuwać w tam etapie hydruksylacJi, są Aspergillus uchraceus NRRL 405, Aspergillus uchraceus ATCC 18500, Aspergillus niger ATCC 16888 i ATCC 26693, Aspergillus nidulans ATCC 11267, Rhizupus urazae ATCC 11145, Rhizupus stolunifer ATCC 6227b, Streptumaces fradiae AtCc 10745, Bacillus megaterium ATCC 14945, Pseudumunas cruciviae ATCC 13262 i Trichuthecium roseum ATCC 12543. Innami zalecanami organizmamS są Fusarium uxaspurum f.sp.cepae ATCC 11171 i Rhisupus arrhizus ATCC 11145.

Inne urganizma, które wykazały aktawnuść dla tej reakcji ubejmują Absidia cuerula ATCC 6647, Absidia glauca ATCC 22752, Actinumucur elegans ATCC 6476, Aspergillus flavipes AtCc 1030, Aspergillus fumigatus ATCC 26934, Beauveria bassiana ATCC 7159 i ATCC 13144, Bub-auspl^^a ubtusa IMI 038560, Calunectria decura ATCC 14767, 5 Chaetumium cuchliudes ATCC 10195, Curanespura cassiicuia ATCC 16718, Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688a, Cunninghamella echinulata ATCC 3655, Cunninghamella elegans ATCC 9245, Curvularia ciavata ATCC 22921, Curvularia lunata ATCC 12017, Calindrucarpun radicicula ATCC 1011, Epicuccum humicula ATCC 12722, Gungrunella butleri ATCC 22822, Hapumaces chrysuspermus ATCC IMI 109891, Mortierelia isabellina ATCC 42613, Mucur mucedu ATCC 4605, Mucur griseo-caanus ATCC 1207A, Myrothecium verrucaria ATCC 9095, Nucardia curallina ATCC 19070, Paecilumysces cameus ATCC 46579, Penicillum patulum ATCC 24550, Pithumaces atro-ulivaceus IFO 6651, Pithcimaces canuduntis ATCC 26150, Pacnuspurium sp. ATCC 12231, Saccharopolyspora er^^thrae ATCC 11635, Sepedunium chrasuspermum ATCC 13378, Stachalidium biculur ATCC 12672, Streptomaces hagruscupicus ATCC 27438, Streptomaces purpurascens ATCC 25489, Saneephalastrum racemusum ATCC 18192, Thamnostylum pirifurme ATCC 8992, Thielavia terricula ATCC 13807 i Verticillium theubromae AtCc 12474.

Inne urganizmy. u których mużna spudziewać się aktawnuści dla lif-h^ą^droS^;są^l^cJi, ubejmują Cephaluspurium aphidicula (Phatochemistry (1996), 42(2), 411-415), lunatas (J.Biutechnul. (1995), 42(2), 145-150), Tieghemella urchidis (Khim.-Farm.Zh. (1986), 20(7), 871-876), Tieghemella haaiuspora (Khim.-Farm.Zh. (1986), 20(7), 871-876), Munuspurium ulwaceum (Acta Micrubiul.Pul.Ser.B. (1973), 5(2), 103-110), Aspergillus ustus (Acta Mierubiul.Pul.Ser.B. (1973), 5(2), 103-110), Fusarium graminearum (Acta MSerubiol.-Pui.Ser.B. (1973), 5(2), 103-110), Verticilhum glaucum (Acta Microbiol.PuS.Ser.B. (1973), 5(2), 103-110), i Rhizupus nigricans (J. Steruid Biuchem. (1987), 28(2), 197-201).

189 339

Pochodne 11 β-hydroksy androstendionu i meksrenonu można wytwarzać zgodnie ze sposobem biokonwersji przedłożonym w przykładach 19A i 19B, odpowiednio. Wynalazcy zakładają przez analogię, że odpowiadający izomer β-hydroksy związku o wzorze VIII, mający podstawnik β-hydroksy przy Cli zamiast podstawnika a-hydroksy przy Cli, można także wytworzyć przy użyciu podobnego sposobu biokonwersji, wykorzystując odpowiednie drobnoustroje zdolne do przeprowadzenia llβ-hydroksylacji, takich jak jeden lub więcej drobnoustrojów opisanych w niniejszym.

Wytwarza się szczep komórek przygotowawczy do fermentacji na skalę produkcyjną hydroksylacji kanrenonu lub innych substratów o wzorze XIII, w układzie fermentacyjnym z posiewaniem, obejmującym bioreaktor do posiewania lub szeregi dwóch lub więcej bioreaktorów do posiewania. Pracującą podstawową zawiesinę spór wprowadza się do pierwszego bioreaktora do posiewania, razem z roztworem odzywczym dla wzrostu komórek. Jeśli objętość szczepu Żądana lub potrzebna do produkcji przekracza tę w pierwszym bioreaktorze do posiewania, objętość szczepu można postępowo i geometrycznie powielać przez namnażanie w pozostałych bioreaktorach, w ciągu bioreaktorów z posiewaniem. Korzystnie szczep wytworzony w układzie bioreaktorów z posiewaniem ma korzystną objętość i żywe komórki do osiągnięcia szybkiego początku reakcji w bioreaktorze produkcyjnym, relatywnie krótkie cykle produkcyjne fermentacji i wysoką aktywność bioreaktora produkcyjnego. Obojętnie jaka będzie ilość naczyń w ciągu bioreaktorów do posiewania, drugi i następne bioreaktory do posiewania są korzystnie takiej wielkości, aby wielkość rozcieńczenia w każdym etapie w ciągu była zasadniczo taka sama. Początkowe rozcieńczenie szczepu w każdym bioreaktorze do posiewania może być w przybliżeniu taka sama jak rozcieńczenie w bioreaktorze produkcyjnym. Kanrenon lub inny substrat o wzorze XIII ładuje się do bioreaktora produkcyjnego razem ze szczepem i roztworem odzywczym i zachodzi tam reakcja hydroksylacji.

Zawiesinę zarodników ładowaną do układu bioreaktorów do posiewania otrzymuje się z fiolek pracującej podstawowej zawiesiny zarodników; wziętych z wielu fiolek, stanowiących bank podstawowych komórek pracujących, który przechowuje się przed użyciem w warunkach kriogenicznych. Bank podstawowych komórek pracujących na odwrót, pochodzi z głównego banku zbioru komórek, wytworzonego w następujący sposób. Próbkę zarodników otrzymanych z odpowiedniego źródła, np. ATCC zawiesza się początkowo w pożywce wodnej, takiej jak np. roztwór soli, roztwór odzywczy lub roztwór środka powierzchniowo-czynnego (np. środka powierzchniowo-czynnego anionowego, takiego jak Tween 20 o stężeniu około 0,001% wagowego), i zawiesinę rozprowadza się wśród płytek hodowlanych, przy czym każda płytka niesie stałą mieszaninę odzywczą, zwykle opartą o niestrawne polisacharydy, takie jak agar, gdzie zarodniki namnażają się. Stała mieszanina odzywcza zwykle zawiera między około 0,5% i około 5% wagowych glukozy, między około 0,05 i około 5% wagowych źródła azotu, np. peptonu, między około 0,05 i około 0,5% wagowych źródła fosforu, np. fosforanu amonowego lub metalu alkalicznego, takiego jak wodorofosforan dipotasowy, między około 0,25% i około 2,5% wagowych lizatu drożdżowego lub ekstraktu (albo innego źródła aminokwasów, takiego jak ekstrakt mięsny lub infuzji mózgowo-sercowej), między około 1% i około 2% wagowych agaru lub innego niestrawnego polisacharydu.

Ewentualnie, stała mieszanina odżywcza może dodatkowo obejmować i/lub zawierać między około 0,1% i około 5% wagowych ekstraktu słodowego. pH stałej mieszaniny odżywczej wynosi korzystnie między około 5,0 i około 7,0, ustawionego zgodnie z potrzebą wodorotlenkiem metalu alkalicznego lub kwasem ortofosforowym. Wśród uzytecznych pożywek wzrostowych są następujące:

1. Pożywka stała #1: 1% glukoza, 0,25% ekstraktu drożdżowego, 0,3% K2HPO4 i 2% agar (Bacto); pH ustawione do 6,5 203^ NaOH

2. Pożywka stała #2: 2% pepton (Bacto), 1% ekstrakt drożdżowy (I^ac^tc^) 2¹% giukoz.a. i 2% agar (Bacto), pH ustawione do 5 10% H3PO43. Pożywka stała #3: 0,1% peptydon (Bacto), 2% ekstrakt słodowy (Βα^ο), 2% glu^z i 2% agar (Bacto); pH jakie jest 5,3.

4. Płynna pożywka: 5% melasa z trzciny cukrowej, 0,5% płynu z moczenia kukurydzy, 0,25% glukoza, 0,25 NaCl i 0,5% KH2PO4, pH ustawione do 5,8.

5. Agar Difco Mycological (niskie pH).

189 339

Wiele z płytek agarowych umywanych w rozwoju głównego banku zbioru komórek można selekcjonować pod względem przyszłych wymagań dla głównego zbioru, lecz zwykle wytwarza się tak około 15 do około 30 płytek. Po odpowiednim okresie wzrostu, np. 7 do 10 dni, płytki zdrapuje się w obecności wodnego podłoża, zwykle roztworu soli lub buforu, w celu zebrania przetrwalników, i ktrscmyoą główną zawiesinę zbiorczą dzieli się między małe fiolki, np. jednominutowe w każdej z wielu 1,5 ml fiolek. Aby wytworzyć pracująca zawiesinę zbiorczą prsetrwyloików do użytku w badaniach lub operacjach fermentacji produkcyjnej, zawartości jednej lub więcej tych fiolek z głównym zbiorem drugiego pokolenia, można porozdzielać i ioyubować na płytkach agarowych w sposób opisanych powyżej dla wytwarzania głównej zawiesiny podstawowej przetrwalników. Jeśli rozważa się rutynowe operacje produkcyjne, można stosować aż 100 do 400 płytek do wytworzenia zbioru pracującego drugiego pokolenia. Każdą płytkę zdrapuje się do oddzielnej fiolki ze zbiorem pracującym, przy czym każda fiolka zwykle zawiera jeden ml wytworzonego szczepu. Dla stałej obserwacji, zarówno główną zawiesinę zbiorczą jak i szczep produkcyjny drugiego pokolenia korzystnie przechowuje się w parującej strefie naczynia do przechowywania ydikgeoiczoego, zawierającego ciekły N lub inny płyn kriogeniczny.

W sposobie ilustrowanym w fig. 1, wytwarza się wodną pożywkę wzrostową, która zawiera źródło azotu, takie jak pepton, pochodną drożdży lub równoważnik, glukozę i źródło fosforu, takie jak sól fosforanowa. PrzetrwalniU drobnoustroju hoduje się w tej pożywce w układzie fermentacyjnym do posiewania. Zalecanym drobnoustrojem jest Aspergillus nchdaceus NRRL 405 (ATCC 18500). Tak wytworzony szczep podstawowy wprowadza się następnie do binreyytory produkcyjnego z substratem o wzorze XIII. Bulion fermentacyjny miesza się i napowietrza przez czas wystarczający do postępu reakcji do żądanego stopnia zakończenia.

Pożywka do bioreaytora do posiewania korzystnie obejmuje wodną mieszaninę, która zawiera: między oykłn 0,5% i około 5% wagowo glukozę, między około 0,05% i kyołn 5% wagowo źródło azotu, np. pepton, między około 0,05% i okkłn 0,5% wagowo źródło fosforu, np. fosforan amonowy Iub metalu alkalicznego, taki jak monozysaynwh fosforan amonowy lub wndnrofksfnran dipotasowy, między około 0,25% i 2,5% wagowo lizat drozdzowy lub ekstrakt (lub inne źródło aminokwasów, takie jak gorzelniane substancje rozpuszczalne), między około 1% i około 2% wagowo agar lub inny niestrawny polisacharyd. Szczególnie zalecana pożywka wzrostowa do posiewania zawiera około 0,05% i około 5% wagowo źródło azotu, takie jak pepton, między około 0,25% i około 2,5% wagowo autolizowane drożdże lub ekstrakt drozdzowy, między około 0,5% i około 5% wagowo glukozę i między około 0,05% i nyołn 0,5% wagowo źródło fosforu, takie jak mookzasadowh fosforan amonowy. Szczególnie ekonomicznymi operacjami w sposobie uzyskuje się przez użycie innej zalecanej hodowli do posiewania, która zawiera między około 0,25% i około 5% wagowych płynu z oamaczyoia kukurydzy, między około 0,25% i około 2,5% yutolizkwjoych drożdży lub ekstraktu drożyżowegk, między około 0,5% i około 5% wagowych glukozy i około 0,05% i około 0,5% wagowych mnnozasyyowego fosforanu amonu. Płyn z oymaczyoiy kukurydzy jest szczególnie eynoomicsncm źródłem białek, peptydów, węglowodanów, kwasów organicznych, witamin, jonów metali, pierwiastków śladowych i fosforanów. Płyny zacierowe z innych zbóż można stosować w miejsce, lub jako dodatek do płynu z oamaczania kukurydzy. pH pożywki korzystnie reguluje się w zakresie między około 5,0 i około 7,0, np. przez dodanie wodorotlenku metalu alkalicznego lub kwasu ortofosforowego. Jeśli płyn z oymaczyoia kukurydzy służy jako źródło azotu i węgla, pH reguluje się korzystnie w zakresie około 6,2 do około 6,8. PożcwOc, zawierającą pepton i glukozę reguluje się korzystnie do pH między około 5,4 i nyoło 6,2. Wśród uz^tecznych pożywek do stosowania w fermentacji do posiewania:

1. Pożywka #1: 2% pepton, 2% drożdże autolizkwjoe (Iub ekstrakt drozdżowy) i 2% glukoza; pH ustawione do 5,8 20% NaOH.

2. Pnżcwka #2: 3% płyn z nymaczyoiy kukurydzy, 1,5% ekstrakt drożdżowy, 0,3% moonzysydnwy fosforan amonu 13% glukoza; pH ustawione do 6,5 20% NaOH.

Przetrwalniki drobnoustroju wprowadza się do tej pożywki z fiolki zwykle zawierającej około IO⁹ przetrwalników na ml zawiesiny. Optymalną.produktywność pokolenia do posiewania realizuje się jeśli rozcieńczenia pożywki wzrostowej na początku hodowli do posiewania

189 339 nie zmniejsza gęstości populacji przetrwalników poniżej około IO7 na ml. Korzystnie, przetrwalniki hoduje się w układzie fermentacyjnym do posiewania dotąd aż objętość upakowanych miceli (PMV) w bioreaktorze wynosi co najmniej około 20%, korzystnie około 35% do około 45%. Ponieważ cykl w naczyniu fermentacyjnym do posiewania (lub każdym naczyniu z wielu, które obejmują ciąg fermentacyjny do posiewania) zalezy od początkowego stężenia w tym naczyniu, może być pożądane zapewnienie dwóch lub więcej etapów fermentacji z posiewaniem, w celu przyspieszenia całości procesu. Jednakże, korzystne jest unikanie stosowania znacznie więcej niz trzech bioreaktorów do posiewania w szeregu, ponieważ aktywność może być kompromisowa jeśli fermentację z posiewem przeprowadza się przez nadmierną ilość etapów. Fermentację kultury do posiewu przeprowadza się przy mieszaniu w temperaturze w zakresie około 23° do około 37°C, korzystnie w zakresie między około 24° do około 37°C.

Kulturę z układu fermentacji do posiewu wprowadza się do bioreaktora produkcyjnego razem z produkcyjną pożywką wzrostową. W postaci realizacji według wynalazku, nie wyjałowiony kanrenon lub inny substrat o wzorze XIII służy jako substrat dla reakcji. Korzystnie, substrat dodaje się do bioreaktora produkcyjnego w postaci 10% do 30% wagowych zawiesiny w pożywce wzrostowej. W celu zwiększenia powierzchni dostępnego obszaru dla reakcji llix-hydroksylacji, wielkość cząstek substratu o wzorze XIII zmniejsza się przez przepuszczenie substratu przez rozdrabniacz mikrocząsteczkowy wyłączony z linii, przed wprowadzeniem do bioreaktora. Wprowadza się także oddzielnie jałową pożywkę podstawową, zawierającą glukozę, oraz drugi roztwór odżywczy, zawierający pochodna drozdżową, taką jak poddane autolizie drożdże (lub równoważny preparat aminokwasowy na podstawie alternatywnych źródeł, takich jak rozpuszczalne substancje gorzelniane). Pożywka obejmuje wodną mieszaninę, zawierającą: między około 0,5% i około 5% wagowo glukozę, między około 0,05% i około 5% wagowo źródło azotu, np. pepton, między około 0,05% i około 0,5% wagowo źródła fosforu, np. fosforan amonowy lub metalu alkalicznego, takiego jak wodorofosforan dipotasowy, między około 0,25% i około 2,5% wagowo lizat drozdżowy lub ekstrakt (lub inne źródło aminokwasów, takie jak rozpuszczalne substancje gorzelniane), między około 1% i około 2% wagowo agar lub inny niestrawny polisacharyd. Szczególnie zaleca się produkcyjną pożywkę wzrostową, zawierającą około 0,05% i około 5% wagowo źródło azotu, takiego jak pepton, między około 0,25% i około 2,5% wagowo drożdże poddane autolizie lub ekstrakt drozdżowy, między około 0,5% i około 5% wagowo glukozę i między około 0,05% i około 0,5% wagowo źródło fosforu, takie jak monozasadowy fosforan amonu.

Inna zalecana produkcyjna pożywka wzrostowa zawiera między około 0,5% i około 5% wagowo płyn z namaczania kukurydzy, między około 0,25% i około 2,5% drożdże poddane autolizie lub ekstrakt drozdzowy, między około 0,5% i około 5% wagowo glukozę i około 0,05% i około 0,5% wagowo monozasadowy fosforan amonu. pH produkcyjnej pożywki fermentacyjnej korzystnie reguluje się w sposób opisany powyżej, w takich samych zakresach dla pH pożywki opartej o pepton/glukozę i pożywek opartych o płyn z namaczania kukurydzy, odpowiednio. Uzyteczne pożywki wzrostowe do biokonwersji przedłożono poniżej:

1. Pożywka #1: 2% pepton, 2% drożdże po autolizie (lub ekstrakt drożdzowy) i 2% glukoza; pH ustawione do 5,8 20% NaOH.

2. Pożywka #2: 1% pepton, 1% drożdże po autolizie (lub ekstrakt drożdżowy) i 2% glukoza; pH ustawione do 5,8 20% NaOH.

3. Pożywka #3: 0,5% pepton, 0,5% drożdże po autolizie (lub ekstrakt drozdzowy) i 0,5% glukoza; pH ustawione do 5,8 20% NaOH.

4. Pożywka #4: 3% płyn z namaczania kukurydzy, 1,275% ekstrakt drozdzowy. 0,3% monozasadowy fosforan amonu i 3% glukoza; pH ustawione do 6,5 20% NaOH.

5. Pożywka #5' 2,55% płyn z namaczania kukurydzy, 1,1275% ekstrakt drozdzowy, 0,255% monozasadowy fosforan amonu i 3% glukoza; pH ustawione do 6,5 20% NaOH.

6. Pożywka #6: 2,1% płyn z namaczania kukurydzy, 1,05% ekstrakt drożdżowy, 0,21% monozasadowy fosforan amonu i 3% glukoza; pH ustawione do 6,5 20% NaOH.

Nie wyjałowowiony kanrenon i jałowe roztwory odzywcze podaje się łańcuchowo do bioreaktora produkcyjnego w około pięciu do około dwudziestu, korzystnie około dziesięciu do około piętnastu, korzystnie zasadniczo równych porcjach do każdego cyklu produkcji seryjnej. Korzystnie, substrat wprowadza się początkowo w ilości wystarczającej do ustalenia

189 339 stężenia, wynoszącego między około 0,1% wagowo i około 3% wagowo, korzystnie między około 0,5% i około 2% wagowo, przed zaszczepieniem posiewowym bulionem fermentacyjnym, następnie dodaje się okresowo, dogodnie co 8 do 24 godzin, do podstawowego stężenia, wynoszącego między około 1% i około 8% wagowych. Jeśli dodatkowo substrat dodaje się co 8 godzin, całość dodatku może być nieco niższa, np. 0,25% do 2,5% wagowych, niż w wypadku gdy substrat dodaje się tylko na podstawie dziennej. W drugim przypadku łączne dodanie kanrenonu może wynosić w zakresie 2% do około 8% wagowych. Uzupełniającą mieszaninę odżywczą dodawaną podczas reakcji fermentacji jest korzystnie koncentrat, np. mieszanina, zawierająca między około 40% i około 60% wagowo jałową glukozę i między około 16% i około 32% wagowo jałowy ekstrakt drożdżowy lub inne jałowe źródło pochodnej drożdzowej (lub inne źródło aminokwasów). Ponieważ substrat dodawany do bioreaktora produkcyjnego z fig. 1 nie jest jałowy, okresowo do bulionu fermentacyjnego dodaje się antybiotyki, w celu kontroli niepożądanych organizmów. Antybiotyki, takie jak kanamycyna, tetracyklina i cefaleksyna można dodawać bez niekorzystnego wpływu na wzrost i biokonwersję. Korzystnie, wprowadza się je do bulionu fermentacyjnego w stężeniu, wynoszącym np. między około 0,0004% i około 0,002% na podstawie całej ilości bulionu, zawierającego np. między około 0,0002% i około 0,0006% siarczanu kanamycyny, między około 0,0002% i około 0,006% tetracykliny HCl i/lub między około 0,001% i około 0,003% cefaleksyny, ponownie na podstawie całej ilości bulionu.

Zazwyczaj, cykl produkcji seryjnej wynosi około 80-160 godzin. Tak więc, części każdego z substratów o wzorze XIII i roztwory odżywcze, dodaje się zwykle co około 2 do 10 godzin, korzystnie co około 4 do 6 godzin. Korzystnie, do układu fermentacyjnego z posiewem oraz do bioreaktora produkcyjnego wprowadza się także środek zapobiegający tworzeniu się piany.

Korzystnie, w sposobie według fig. 1 ładunek szczepu do bioreaktora produkcyjnego wynosi około 0,5% do około 7%, korzystniej około 1% do około 2% objętościowo na podstawie całości mieszaniny w bioreaktorze, a stężenie glukozy utrzymuje się między około 0,01% i około 1,0%, korzystnie między około 0,025% i około 0,01%, korzystniej między około 0,05% i około 0,25% wagowych z okresowymi dodawaniami, które korzystnie są porcjami o około 0,05% do około 0,25% wagowych, w oparciu o całość ładunku. Temperaturę fermentacji kontroluje się dogodnie w zakresie, wynoszącym około 20° do około 37°C, korzystnie około 24°C do około 28°C, lecz może być potrzebne obniżenie temperatury podczas reakcji, np. w 2°C przyrostach, w celu zachowania objętości upakowanych miceli (PMV) poniżej około 60%, korzystnie poniżej około 50%, i przez to zapobiec zakłócaniu odpowiedniego mieszania dzięki lepkości bulionu fermentacyjnego. Jeśli rosnąca biomasa wychodzi ponad powierzchnię płynu, substrat pozostający wewnątrz biomasy może zostać przeniesiony poza strefę reakcji i stać się niedostępnym dla reakcji hydroksylacji. W celu produktywności, pożądane jest aby osiągnąć PMV w zakresie 30 do 50%, korzystnie 35% do 45% w ciągu pierwszych 24 godzin reakcji fermentacji, lecz potem warunki korzystnie są w stanie kontrolować dalszy wzrost w granicach ustalonych powyżej. Podczas reakcji, pH pożywki fermentacyjnej kontroluje się w zakresie między około 5,0 i około 6,5, korzystnie między około 5,2 i około 5,8, a bioreaktor poddaje się mieszaniu w tempie, wynoszącym między około 400 i około 800 obrotów na minutę. Poziom rozpuszczonego tlenu, wynoszący co najmniej około 10% nasycenia, uzyskuje się przez napowietrzanie ładunku przy między około 0,2 i około 1,0 wm i utrzymywanie ciśnienia w głównej przestrzeni bioreaktora między około ciśnieniem atmosferycznym i około 0,1 MPa, najkorzystniej około 0,07 MPa.

Tempo mieszania można także zwiększać według potrzeby, aby utrzymać minimum poziomu rozpuszczonego tlenu. Korzystnie, rozpuszczony tlen utrzymuje się dobrze ponad około 10%, w rzeczywistości aż około 50% w celu pobudzenia konwersji substratu. Utrzymywanie pH w zakresie 5,5±0,2 jest także optymalne dla biokonwersji. Pienienie kontroluje się według potrzeby przez dodanie zwykłego środka zapobiegającego pienieniu. Po dodaniu całego substratu reakcję korzystnie kontynuuje się aż do uzyskania stosunku molowego produktu o wzorze VIII do pozostałego nie przereagowanego substratu o wzorze ΧΠΙ, wynoszącego co najmniej około 9 do 1. Taką konwersję można uzyskać w ciągu 80-160 godzin cyklu fermentacyjnego zaznaczonego powyżej.

189 339

Odkryto, że wysokie przemiany wiążą się z wyczerpaniem początkowego poziomu odzywki poniżej początkowego poziomu załadunku, i przez kontrolę tempa napowietrzania oraz tempa mieszania w celu uniknięcia wylania się substratu poza płynny bulion. W sposobie według fig. 1 poziom odżywki wyczerpał się a potem utrzymywał na poziomie nie większym od około 60%, korzystnie około 50% początkowego poziomu załadunku; podczas gdy w sposobach według fig. 2 i 3 poziom odżywki zmniejszył się i utrzymywał na poziomie nie większym od około 80%, korzystnie około 70% początkowego poziomu załadunku. Tempo napowietrzania wynosi korzystnie nie więcej niż jeden wm, korzystniej w zakresie około 0,5 wm; podczas gdy tempo mieszania wynosi korzystnie nie więcej niż 600 obrotów na minutę.

Szczególnie zalecany sposób wytwarzania związku o wzorze VIII zilustrowano w fig. 2. Zalecanym drobnoustrojem dla lla-hydroksykicji związku o wzorze XIII (np. kanrenonu) jest Aspergillus ochraceus NRRL 405 (ATCC 18500). W tym sposobie, pożywka wzrostowa korzystnie obejmuje między około 0,5% i około 5% wagowo płyn z namaczania kukurydzy, między około 0,5% i około 5% wagowo glukozę, między około 0,1% i około 3% wagowo ekstrakt drożdżowy i między około 0,05% i około 0,5% wagowo fosforan amonu. Jednakże, można także stosować inne produkcyjne pożywki wzrostowe, jakie opisano w niniejszym. Kulturę posiewową wytwarza się zasadniczo w sposób opisany w sposobie według fig. 1, przy użyciu każdej z posiewowych pożywek fermentacyjnych opisanych w niniejszym. Zawiesinę kanrenonu nie przepuszczonego przez rozdrabniacz makrocząsteczkowy lub innego substratu 0 wzorze XIII w pożywce wzrostowej, wytwarza się aseptycznie w blenderze, korzystnie przy stosunkowo wysokim stężeniu, wynoszącym między około 10% i około 30% wagowych substratu. Korzystnie, aseptyczne wytwarzanie może obejmować wyjaławianie lub pasteryzację zawiesiny po mieszaniu. Całą ilość jałowej zawiesiny substratu wymaganą dla wsadu produkcyjnego wprowadza się do bioreaktora produkcyjnego na początku wsadu lub przez okresowe karmienie łańcuchowe. Wielkość cząstek substratu zmniejsza się przez mielenie na mokro w pompie ścinającej włączonej w linię, która przenosi zawiesinę do bioreaktora produkcyjnego, wyjaśniając potrzebę użycia rozdrabniacza mikrocząsteczkowego wyłączonego z linii. Jeśli warunki aseptyczne uzyskuje się raczej przez pasteryzację niż wyjaławianie, rozmiar aglomeracji może być nie znaczący, lecz stosowanie pompy ścinającej może być pożądane w celu zapewnienia dodatniej kontroli wielkości cząstek. Jałową pożywkę wzrostową i roztwór glukozy wprowadza się do bioreaktora produkcyjnego zasadniczo w taki sam sposób, jak opisano powyżej. Wszystkie składniki pożywki do bioreaktora produkcyjnego wyjaławia się przed wprowadzeniem tak, ze antybiotyki nie są potrzebne.

Korzystnie, w operacji sposobu według fig. 2, szczep wprowadza się do bioreaktora produkcyjnego w proporcji, wynoszącej między około 0,5% i około 7%, temperatura fermentacji wynosi między około 20° i około 5 37°C, korzystnie między około 24°C i około 28°C, a pH kontroluje się w zakresie między około 5,3 i około 5,5 np. przez wprowadzenie gazowego amoniaku, wodnego roztworu wodorotlenku amonu, wodnego roztworu wodorotlenku metalu alkalicznego lub kwasu ortofosforowego. Tak jak w sposobie według fig. 1, temperaturę obniża się korzystnie w celu kontrolowania PMV, tak aby nie przekraczała 55-60%. Początkowy załadunek glukozy wynosi korzystnie między około 1% i około 4% wagowo, najkorzystniej 2,5% do 3,5 wagowych, lecz korzystnie pozwala się na opadnięcie poniżej około 1,0% wagowych podczas fermentacji. Dodatkową glukozę dodaje się okresowo w porcjach, wynoszących między około 0,2% i 1,0% wagowych na podstawie całego ładunku tak, aby utrzymać stężenie glukozy w strefie fermentacji w zakresie między około 0,1% i około 1,5% wagowych, korzystnie między około 0,25% i około 0,5% wagowych. Ewentualnie, można uzupełniać źródła azotu i fosforu razem z glukozą. Jednakże, ponieważ cały załadunek kanrenonu wykonuje się na początku cyklu fermentacyjnego, w tym czasie można wprow'adzic także pozostałe uzupełnienie odzywkami, niosącymi azot i fosfor, co pozwala na stosowanie dokarmiania roztworem glukozy tylko podczas reakcji. Tempo i charakter mieszania jest w znacznej mierze zmienny. Średnio energiczne mieszanie pobudza przenoszenie masy między stałym substratem 1 fazą wodną.

Jednakże, powinno się stosować wirnik niskoobrotowy, w celu zapobieżenia rozkładowi mieliny drobnoustrojów. Optymalna prędkość mieszania zmienia się w zakresie, wynoszącym 200 do 800 obrotów na minutę, w zalezności od lepkości bulionu hodowlanego, stężenia tlenu

189 339 i warunków mieszania jak wpływ naczynia, przegroda i konfiguracja wirnika. Zwykle, zalecane tempo mieszania wchodzi w zakres 350-600 obrotów na minutę. Korzystnie wirnik mieszający zapewnia funkcję pompowania osiowo w dół tak, aby sprzyjać dobremu mieszaniu fermentowanej biomasy. Masę korzystnie napowietrza się w tempie, wynoszącym między nynło 0,3 i około 1,0 vvm, korzystnie 0,4 do 0,8 vvm, a ciśnienie w głównej przestrzeni Ηπreaktora wynosi korzystnie między około 0,05 i około 0,1 MPa.

Temperaturę, mieszanie, napowietrzanie i ciśnienie wsteczne kontroluje się korzystnie w celu utrzymania rozpuszczonego tlenu na poziomie co najmniej około 10% objętościowych podczas binyonwersji. Cykl całej masy trwa zwykle między około 100 i około 140 gnysio

Mimo, że zasada operacji dla sposobu według fig. 2 opiera się o wczesne wprowadzenie zasadniczo całości załadunku yanrennnu, zrozumiałym będzie, że wzrost bulionu fermentacyjnego można przeprowadzać przed załadunkiem masy yaodeooou. Ewentualnie, część porcji yaodenoou można także dodać do masy później. Jednak generalnie, co najmniej około 75% jałowego yyndenonu powinno się wprowadzić do bioreaktora transformacyjnego w ciągu 48 godzin po zapoczątkowaniu fermentacji. Ponadto, pożądane jest wprowadzenie co najmniej około 25% wagowych kyo.reoonu na początku fermentacji, albo co najmniej w ciągu pierwszych 24 godzin, w celu pobudzenia tworzenia się enzymu^w) biokonwersji.

W dalszym zalecanym sposobie jaki zilustrowano w fig. 3, całość ładunku fermentacyjnego i roztworu odzywczego wyjaławia się w naczyniu do fermentacji produkcyjnej przed wprowadzeniem szczepu. Roztwory odżywcze, które można stosować, jak również preferencje wśród nich, są zasadniczo takie same jak w sposobie według fig. 2. W tej postaci realizacji wynalazku działanie ścinające wirnika mieszającego rozbija aglomeraty substratu, które z drugiej strony, mają tendencję do tworzenia się w czasie wyjaławiania. Stwierdzono, że reakcja zachodzi z powodzeniem jeśli średnia wielkość cząstek kandeonnu wynosi mniej niż 300 μ i co najmniej 75% wagowych cząstek jest mniejszych niż 240 μ. Stosowanie odpowiedniego wirnika, np. wirnika z turbiną talerzową, przy odpowiedniej prędkości w zakresie 200 do 800 obrotów na minutę, przy prędkości szczytowej, wynoszącej co najmniej 400 cm/sekundę, jak stwierdzono, zapewnia współczynnik ścinania wystarczający do utrzymania takiej charakterystyki wielkości cząstek mimo tendencji do aglomeracji, występującej w czasie wyjaławiania wewnątrz bloreaytory produkcyjnego. Pozostałe operacje sposobu według fig. 3 są zasadniczo takie same jak w sposobie według fig. 2. Sposoby według fig. 2 i 4 oferują kilka różnych korzyści w stosunku do sposobu według fig. 1. Szczególną korzyścią jest odpowiedzialność wobec stosowania bazy odżywczej o niskich kosztach, takiej jak płyn z oymacsaola kukurydzy. Ale dalsze korzyści realizuje się poprzez eliminację potrzeby antybiotyków, uproszczenie procedur yiyyrmiaoia i pozwalanie na masowe wyjaławianie yanrenknu Iub innego substratu o wzorze XIII. Inną szczególną korzyścią jest możliwość stosowania raczej prostego roztworu glukozy niż kompleksowego roztworu odżywczego do uzupełniania w czasie cyklu reakcyjnego.

W sposobach opisanych w fig. 1 do 3, produkt o wzorze VIII jest yrhstaliczocm ciałem stałym, które razem z biomasą, można oddzielić od bulionu reakcyjnego przez filtrację Iub wirowanie z niską prędkością. Alternatywnie, produkt można ekstrahować z całości bulionu reakcyjnego rozpuszczalnikami organicznymi. Produkt o wzorze VIII odzyskuje się przez ekstrakcję rozpuszczalnikami. W celu maksymalnego odzysku, zarówno przesącz fazy ciekłej jak i filtr biomasy Iub placek z wirówki traktuje się rozpuszczalnikiem do ekstrakcji, lecz zwykle >95% produktu wiąże się z biomasą- Zazwyczaj do ekstrakcji można stosować rozpuszczalniki estru węglowodoru, chlorowanego węglowodoru, i ketonowe. Zalecanym rozpuszczalnikiem jest octan etylu. Inne, zwykle odpowiednie rozpuszczalniki obejmują toluen i keton meη,Ι oi toNi ihrUini Πη ekrttclroii z fii7is i^ik^ljłpj ScjσnOnJ» ΐ-ιρι^ΐρ nędzni p iΊ^cizrίr<jp1’ mymi stocz anika w przybliżeniu równej objętości roztworu reakcyjnego, z którą się styka. Aby odzyskać produkt z biomasy, te ostatnią zawiesza się w rozpuszczalniku, korzystnie w wielkim nadmiarze w stosunku do początkowego ładunku substratu, np. 50 do 100 ml rozpuszczalnika na gram początkowego ładunku yaodenonu, i uzyskaną zawiesinę korzystnie ogrzewa się w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin przez okres około 20 minut do kilku godzin, w celu zapewnienia przeniesienia produktu do fazy rozpuszczalnika z zagłębień i porów biomasy. Następnie, biomasę usuwa się przez filtrację Iub wirowanie i placek filtracyjny

189 339 korzystnie przemywa się zarówno świeżym rozpuszczalnikiem jak wodą dejonizowaną. Produkt przemycia wodą i rozpuszczalnikiem łączy się potem i fazy pozostawia do rozdzielenia. Produkt o wzorze VIII odzyskuje się przez krystalizację z roztworu. Aby zmaksymalizować wydajność, grzybnię styka się dwukrotnie ze świeżym rozpuszczalnikiem. Po osadzeniu w celu zakończenia rozdzielania fazy wodnej, produkt odzyskuje się z fazy rozpuszczalnika. Najkorzystniej, rozpuszczalnik usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem do rozpoczęcia krystalizacji, następnie zatęzony ekstrakt chłodzi do temperatury około 0° do około 20°C, korzystnie około 10° do około 15°C przez okres czasu wystarczający do wytrącenia kryształów i wzrost, zwykle około 8 do około 12 godzin.

Sposoby według fig. 2, a zwłaszcza według fig. 3 zaleca się szczególnie. Sposoby te działają przy niskiej lepkości i są odpowiedzialne za ścisłą kontrolę parametrów procesu, takich jak pH, temperatura i rozpuszczony tlen. Ponadto, jałowe warunki łatwo jest zabezpieczyć bez uciekania się do antybiotyków.

Proces bizkznwersji jest egzotermiczny tak, ze ciepło powinno się usuwać przy użyciu bioreaktora z płaszczem lub osłoną chłodzącą wewnątrz bioreaktora produkcyjnego. Alternatywnie, bulion reakcyjny może krążyć przez zewnętrzny wymiennik ciepła. Rozpuszczony tlen utrzymuje się korzystnie na poziomie co najmniej około 5%, korzystnie co najmniej około 10% objętościowych, wystarczających do zapewnienia energii dla reakcji i zapewnienia przemiany glukozy w CO2 i H2O, przez regulację tempa wprowadzania powietrza do reaktora w odpowiedzi na pomiar potencjalnego tlenu w bulionie. pH kontroluje się korzystnie w zakresie między około 4,5 i około 6,5.

W każdym z alternatywnych sposobów dla 11-hydroksylacji substratu o wzorze XIII, produktywność ograniczana jest przez transfer masy ze stałego substratu na fazę wodną lub powierzchnię stykania się faz, gdzie, jak wiadomo, zachodzi reakcja. Jak zaznaczono powyżej, produktywność nie jest zasadniczo ograniczona przez tempo przeniesienia masy, tak długo jak średnia wielkość cząstek substratu zmniejsza się do mniej niz około 300 μ i co najmniej 75% wagowych cząstek jest mniejszych niz 240 fi. Jednakże produktywność tych procesów można dodatkowo wzmocnić w pewnych alternatywnych postaciach realizacji, które zapewniają zasadniczy załadunek kanrenonu lub innego substratu o wzorze XIII do bizreaktora produkcyjnego w rozpuszczalniku organicznym. Zgodnie z jedną opcją, substrat rozpuszcza się w rozpuszczalniku nie mieszającym się z wodą i miesza ze szczepem w wodnej pożywce wzrostowej oraz środkiem powierzchniowo czynnym. Uzyteczne rozpuszczalniki nie mieszające się z wodą obejmują np. DMF, DMSO, kwasy tłuszczowe C6-C12, n-alkany C6-C12, oleje roślinne, sorbitany i wodne roztwory środków powierzchniowo-czynnych. Mieszanie tego ładunku tworzy układ reakcyjny emulsji, mający poszerzony obszar styku faz dla transferu masy substratu z ciekłej fazy organicznej do miejsc reakcji.

Druga opcja dotyczy początkowego rozpuszczenia substratu w rozpuszczalniku, mieszającym się z wodą, takim jak aceton, keton metylzetylzwy, metanol, etanol lub glicerol w stężeniu zasadniczo większym niż rozpuszczalność w wodzie. Przez wytworzenie początkowego roztworu substratu przy podwyższonej temperaturze rozpuszczalność zwiększa się zwiększając przez to dalej ilość substratu w postaci roztworu wprowadzanego do reaktora i niezwykle wzmagając ciężar ładunku reaktora. Ciepły roztwór substratu ładuje się do produkcyjnego reaktora fermentacyjnego razem z stosunkowo chłodnym ładunkiem wodnym, zawierającym pożywkę wzrostową i szczepionkę. Gdy roztwór substratu miesza się z wodną pożywką, występuje wytrącanie się substratu. Jednakże w warunkach zasadniczego nadnasycenia i średnio energicznego mieszania, sprzyja to raczej tworzeniu się zarodków kryształów niż ich wzrostowi i tworzą się bardzo drobne cząstki na dużym obszarze powierzchni. Duzy obszar powierzchni pobudza, przenoszenie masy między fazą ciekłą a stałym substratem. Ponadto, stężenie równowagi substratu w ciekłej fazie wodnej wzmacnia się także w obecności rozpuszczalnika mieszającego się z wodą. W związku z tym podnosi się produktywność.

Mimo, że drobnoustroje nie koniecznie tolerują wysokie stężenie etanolu, np. w zakresie, wynoszącym około 3% do około 5% wagowych, można go stosować według potrzeby.

Trzecia opcja dotyczy rozpuszczenia substratu w wodnym roztworze cykkidekstryny. Przykładowe cyklodekstryny obejmują hydroksyβrzβylz-β-cykłodekstrynę i metylo-p-cyklo20

189 339 dekstrynę. Stosunek molowy substrat:cyktodekktryna może wynosić około 1:0,5 do około 1:1,5, korzystniej około 1:0,8 do około 1:1. Mieszaninę substrat :cyklodekstryna można dodawać akepSycznie do reaktora biokonwersji.

11a-Hydroksykanrenon i inne produkty procesu 11 α-hydroksylacji (wzory VIII i YIIIA) są nowymi związkami, które można wyodrębniać przez filtrację środowiska reakcyjnego i ekstrahowanie produktu z biomasy zebranej na środowisku filtracji. Konwencjonalne rozpuszczalniki organiczne, np. octan etylu, aceton, toluen, chlorowane węglowodory i keton metyloizobutylowy można stosować do ekstrakcji. Produkt o wzorze VIII można potem rekrystalizować z rozpuszczalnika organicznego tego samego typu. Związki o wzorze VIII mają zasadniczą wartość jako pośrednie do wytwarzania związków o wzorze I, a zwłaszcza o wzorze IA.

Korzystnie związki o wzorze VIII odpowiadają wzorowi VHIA, w którym -A-A- i -B-Boznaczają grupę -CH2-CH2-, R³ oznacza atom wodoru, nizszą grupę alkilową lub niższą alkoksy, a R.8 i R⁹ razem stanowią pierścień 20-spiroksanowy:

o

XXXIII

Dalej, zgodnie ze sposobem według schematu 1, związek o wzorze VIII poddaje się reakcji w warunkach alkalicznych ze źródłem jonu cyjankowego, w celu wytworzenia związku

VII gdzie -A-A-, -B-B-, r3, R⁸ i r9 są takie jak określono powyżej. Jeśli substrat odpowiada związkowi VIHA., produkt ma wzór VIIA

VIIA gdzie gdzie -A-A-, -B-B-, R3, Y¹, Y² i X są takie jak określonowe wzorze XIIIA. Korzystnie R, oznacza atom wodoru.

189 339

Cyjanowanie substratu Πα-hydroksylowego o wzorze VIII można przeprowadzać przez jego reakcję ze źródłem jonu cyjankowego, takim jak ketono-cyjanohydryna, najkorzystnie acetono-cyjanohydryna, w obecności zasady i soli metalu alkalicznego, najkorzystniej LiCl. Alternatywnie, cyjanowanie można uzyskać bez cyjanohydryny przez użycie cyjanku metalu alkalicznego w obecności kwasu.

W procesie ketono-cyjanohydryny, reakcję prowadzi się w roztworze, korzystnie przy użyciu aprotycznego rozpuszczalnika polarnego, takiego jak dimetyloformamid lub sulfotlenek dimetylu. Tworzenie się enaminy wymaga co najmniej dwóch moli źródła jonu cyjankowego na mol substratu, a korzystnie stosuje się lekki nadmiar źródła jonu cyjankowego. Zasadą jest korzystnie zasada azotowa, taka jak dialkiloamina, trialkiloamina, alkanoloamina, pirydyna Iub inne. Jednakże, zasady nieorganiczne, takie jak węglany metali alkalicznych Iub wodorotlenki metali alkalicznych także można stosować. Korzystnie, substrat o wzorze VIII jest początkowo obecny w proporcji, wynoszącej około 20 i około 50% wagowych, a zasada jest obecna w proporcji, wynoszącej około 0,5 do dwóch równoważników na równoważnik substratu. Temperatura reakcji nie jest krytyczna, lecz produktywność wzmaga się przez operację przy temperaturze podwyższonej. Tak więc, np. jeśli stosuje się trietyloaminę jako zasadę, reakcję korzystnie prowadzi się w temperaturze w zakresie około 80°C do około 90°C. Przy takiej temperaturze reakcja postępuje do zakończenia w ciągu około 5 do około 20 godzin. Jeśli stosuje się diizopropyloaminę jako zasadę i rekację prowadzi w temperaturze 105°C, reakcja kończy się w ciągu 8 godzin. Przy końcu okresu reakcji, rozpuszczalnik usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostały olej rozpuszcza w wodzie i zobojętnia do pH 7 rozcieńczonym kwasem, korzystnie chlorowodorowym. Produkt wytrąca się z tego roztworu i następnie przemywa się go wodą destylowaną i suszy na powietrzu. Uwolniony HCN można odpędzać obojętnym gazem i gasić w zasadowym roztworze. Wysuszony osad odbiera się w chloroformie Iub innym odpowiednim rozpuszczalniku, następnie ekstrahuje stężonym kwasem, np. 6N HCl. Ekstrakt zobojętnia się do pH 7 przez dodanie zasady nieorganicznej, korzystnie wodorotlenku metalu alkalicznego i chłodzi do temperatury w zakresie 0°C. Otrzymany osad przemywa się i suszy, potem rekrystalizuje z odpowiedniego rozpuszczalnika, np. acetonu, w celu wytworzenia produktu o wzorze VII odpowiedniego do użytku w następnym etapie procesu.

Alternatywnie, reakcję można prowadzić w układzie rozpuszczalników wodnych, obejmującym rozpuszczalnik mieszający się z wodą, taki jak metanol Iub w dwufazowym układzie, zawierającym wodę i rozpuszczalnik organiczny, taki jak octan etylu. W tej alternatywie, produkt można odzyskiwać przez rozcieńczenie roztworu reakcyjnego wodą i potem ekstrakcję produktu przy użyciu rozpuszczalnika organicznego, takiego jak chlorek metylenu Iub chloroform, a potem ponownie ekstrakcję z ekstraktu organicznego przy użyciu stężonego kwasu mineralnego, np. 2N HCl. Patrz, opis patentowy nr 3 200 113.

Zgodnie z jeszcze inną alternatywą, reakcję można prowadzić w rozpuszczalniku mieszającym się z wodą, takim jak dimetyloformamid, dimetyloacetamid, N-metylopirolidon Iub sulfotlenek dimetylu, po której roztwór produktu reakcji rozcieńcza się wodą i czyni zasadowym, np. przez dodanie węglanu metalu alkalicznego, potem chłodzi do temperatury 0°C do 10°C, powodując przez to wytrącenie się produktu. Korzystnie, układ gasi się podhalogeninem metalu alkalicznego Iub innym odczynnikiem skutecznym do zapobiegania tworzenia się cyjanku. Po przesączeniu i przemyciu wodą, wytrącony osad jest odpowiedni do użycia w następnym etapie procesu.

Zgodnie z jeszcze dalszą alternatywą, produkt enaminowy o wzorze VII można wytworzyć przez reakcję substratu o wzorze VIII w obecności źródła protonów, z nadmiarem cyjanVu·» r»1 ηΓζΜΛσΛ Ik/yr^motnia Ή,Τν^^Τ uw rmmnorrfwalnil/n

A.U lilVlCUU RUiZjj OUliv V» X*JXjpUKJXjVX^UXXXXlvu MUUlijiiA, uvpiv tyczny polarny rozpuszczalnik mieszający się z wodą, taki jak dimetyloformamid Iub dimetyloacetamid. Źródło protonów jest korzystnie kwasem mineralnym Iub C’ do C5 kwasem karboksylowym, przy czym szczególnie zaleca się kwas siarkowy. Wyjątkowo, nie potrzeba dodawać oddzielnego źródła protonów, jeśli odczynnikiem cyjanowania jest handlowy LiCN w DMF.

Źródło jonu cyjankowego, takiego jak sól metalu alkalicznego, ładuje się korzystnie do reaktora w proporcji, wynoszącej około 2,05 do około 5 równoważników molowych na równoważnik substratu. Uważa się, ze kwas mineralny Iub inne źródło protonów pobudza dodanie

189 339

HCN puprzez 4,5 i 6,7 wiązania pudwójne, i jest kurzastnie ubecna w pruporeJi, wanuszącej cu najmniej jeden równuważnik muluwa na mul równowaZnSka substratu; lecz układ reakcajna powinien puzustawać zasaduwy przez utrzamanie nadmiaru cajanku metalu alkaiicznego wubec ubecnegu kwasu. Reakcję przeprowadza się kurzastnie w temperaturze cu najmniej ukuto 75°C, zwykle 60°C du 100°C, przez ukres ud 1 du ukułu 8 g()dzin, kurzastnie ukułO 1,5 du ukuto 3 gudzin. Przy' kuńcu ukresu reakcajnegu, mieszaninę reakcajną chłudzi się, kurzastnie du temperatura ρukuJowej; i produkt, będąc' enaminą wytrąca się przez zakwaszenie mieszanina reakcajnej i mieszanie z zimną wudą, kurzastnie u temperaturze bliskiej temperatura łaźni lodowej. Uważa się, ze zakwaszenie zamaka 17-laktun, która ma tendencje du utwierania w warunkach zasaduwyeh, przewazaJąeych prza cajanuwaniu. Mieszaninę reakcajną zakwasza się dugudnie prza użaciu tegu samegu kwasu, jaki jest ubecn' pudczas reakcji, kurzastnie kwasu siarkuwegu. Kurzastnie dudaje się wudę w prupurcji, wanuszącej między ukuto 10 i ukułu 50 rOwnowazników muluwach na mul produktu.

Związki u wzurze VII są związkami nuwami i mają zasadniczą wartość jaku puśrednie w wytwarzaniu związków u wzurze I, a zwłaszcza u wzurze LA. Kurzastnie związki u wzurze VIII udpuwiadają wzuruwi VIIIA, w któram -A-A- i -B-B- uznaczają2 grupę -CH2-CH2-, R3 uznacza atum wuduru, nizszą grupę alkiluwą Iub niższą alkuksa, a R/i R9 razem stanuwią pierścień 20-spiroksanuwy:

o 'lltllf

XXXIII

Najkorzastniej, związek u wzurze VII uznacza 5'R(5'α),7'β-20'-ίmsmoheks^κiekahyclru-11' e-hadroksa-10-a, l3'α-dimetylo-3',5-dSuksospiro[fUran-2(3H), 17'α(5Ή)-[7,4]meteno[4H]-eakiupenta[a]fenantreno]-5'-karbunitryl.

W przemianie związku u wzurze VIH w enaminę u wzurze VII, puchudną 7-cajanuwą związku u wzurze Vm ubserwuwanu przez chromatografię w suruwam produkcie. Załużunu, że związek 7-eyjanuwa jest puśrednim w procesie przemiana. Zakłada się dalej, ze związek pu>średni 7-eajanuwa sam reaguje tworząc drugi związek puśredni, puchudną S^-cajanową związku u wzurze VIII, która udwrutnie reaguje twurząc enester. Patrz np. R. Christiansen i in., The Reactton uf Steruidal 4,6-Dien-3-Ones With Cyanide, Steroids, tum 1, czerwiec 1963, która załącza się w niniejszym jaku udniesienie. Te nuwe związki mają także zastusuwanie jaku markera chromatograficzne, jak również są santetacznami związkami puśrednimi. W zalecanej pustaci realizacji tegu etapu całuści schematu 1 prucesu santezy, te związki puśrednie tu kwas 7α-eyjano-11α,17-diha<dΌksy-3-ukso-17α-pregn-4-enu-21-dikarboksytowa γ-laktun i kwas 5β,7σ-dicaj anu- 11α ,17-dih YdroksaU -uksu-17 a-pregnanu-21 diSarbc)Ssalowa. γ-lakton.

W następnam etapie schematu 1 santez', enamina u wzurze VII ulega hadrohzie w celu wytworzenia związku diketonuwegu u wzurze VI

VI

189 339 gdzie -A-A-, -B-B-, R , R i R są takie jak określono we wzorze XIII. Do hydrolizy można stosować każdy wodny kwas organiczny Iub mineralny. Zaleca się kwas chlorowodorowy.

Aby wzmóc produktywność, korzystnie stosuje się rozpuszczalnik mieszający się z wodą, taki jak dimetyloacetamid Iub niższy alkanol, jako równoczesny rozpuszczalnik. Korzystniej, rozpuszczalnikiem jest dimetyloacetamid. Kwas powinien być obecny w proporcji co najmniej jednego równoważnika na równoważnik substratu o wzorze VII. W układzie wodnym enaminowy substrat o wzorze VII można zasadniczo przekształcić w diketon o wzorze VI, w okresie około 5 godzin, w temperaturze około 80°C Operacja przy podwyższonej temperaturze zwiększa produktywność, lecz temperatura nie jest krytyczna. Odpowiednie temperatury wybiera się na podstawie lotności układu rozpuszczalnika i kwasu.

Korzystnie, enaminowy substrat o wzorze VII odpowiada wzorowi VIIA

VIIA

VIA z których każdy -A-A-, -B-B-, R3, y1 γ2 i X są takie jak określono we wzorze XIIIA. Korzystnie R³ oznacza atom wodoru.

Przy końcu okresu reakcyjnego, roztwór chłodzi się do temperatury między około 0°C do około 25°C w celu krystalizacji produktu. Kryształy produktu można rekrystalizować z odpowiedniego rozpuszczalnika, takiego jak izopropanol lub metanol w celu wytworzenia produktu o wzorze VI odpowiedniego do użytku w następnym etapie procesu; lecz rekrystalizacja nie jest zwykle konieczna. Produkty o wzorze VI są związkami nowymi, które mają zasadniczą wartość w wytwarzaniu związków o wzorze I, a zwłaszcza o wzorze IA. Korzystnie związki o wzorze VIII odpowiadają wzorowi VIIIA, w którym -A-A- i -B-B- oznaczają grupę _C„T (_CT T5 R 3 aj + τ trnriższ Tłłrup r\ 11ikl ΛΟ1 rrt Ί lUb olVoVoV a D° i

-«. ΙΙΤ-νΐ 1T-. JY U/llLlttil tŁLAJJli WULIUIU. lll/.AZ.ĆlLi Lipy CllJYl lAJ W ti ŁtiL/ 1 ll/..JZ_tp ttllttiltop, tt .......

zem stanowią pierścień 20-spiroksanowy:

XXXIII

189 339

Najkorzystniej, związek o wzorze VI jest 4'S (4'a),7>heksadek.ahydro-ll.'a-hydroksy-10' β 113' P-dimetylo-3' ,5,20'-triokkosplro[fsran-2(3H), 17' P[4,7]metano[17H]cyklopenta[a]fenantreno] -5' e(2,H)karbonitrylem.

W szczególnie zalecanej postaci realizacji wynalazku, enaminowy produkt o wzorze VII wytwarza się ze związku o wzorze VIII w sposób opisany powyżej i przekształca in situ w diketon o wzorze VI. W tej postaci realizacji wynalazku, substrat o wzorze VIII poddaje się reakcji z nadmiarem cyjanku metalu alkalicznego w rozpuszczalniku wodnym, zawierającym źródło protonów Iub ewentualnie nadmiarem ketonocyjanohydryny w obecności zasady i LiCl, jak opisano w niniejszym powyżej. Jednakże, zamiast chłodzenia mieszaniny nej, zakwaszenie i dodanie wody w proporcjach obliczonych dla spowodowania wytrącenia enaminy, zasadniczo, korzystnie omija chłodzenie mieszaniny reakcyjnej. Zamiast tego, do mieszaniny reakcyjnej dodaje się wodę i kwas, korzystnie kwas mineralny, taki jak siarkowy, przy końcu reakcji cyjanowania. Proporcja dodanego kwasu jest wystarczająca do zobojętnienia nadmiaru cyjanku metalu alkalicznego, który zwykle wymaga wprowadzenia co najmniej jednego równoważnika molowego na mol substratu o wzorze VIII, korzystnie między około 2 i około 5 moli równoważników na równoważnik substratu. Jednakże, utrzymuje się wystarczająco wysoką temperaturę i wystarczająco wysokie rozcieńczenie aby unikać zasadniczego wytrącania, a hydrolizę enaminy do diketonu pozostawia się do postępowania w fazie ciekłej. Tak więc, proces przebiega z minimum przerwań i z wysoką produktywnością. Hydrolizę prowadzi się korzystnie w temperaturze co najmniej 80°C, korzystnie w zakresie, wynoszącym około 90°C do około 100°C, przez okres zwykle wynoszący około 2 do około 5 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną chłodzi się, korzystnie do temperatuty. wynoszącej między około 0°C i około 15°C, korzystnie w łaźni lodowej do około 5°C do około 10°C, w celu wytrącenia dikjtonowjgo produktu o wzorze VI. Stały produkt można odzyskiwać, np. przez filtrację, a zanieszczyszczenia zmniejsza się przez przemycie wodą.

W następnym etapie schematu 1 syntezy, związek diketonowy o wzorze VI poddaje się reakcji z alkoholanem metalu w celu otworzenia mostka ketonowego między pozycjami 4 i 7 poprzez rozszczepienie wiązania między grupą karbonylową i atomem węgla w pozycji 4, utworzenia α-zorientowanej grupy alkohksykarbonylowej w pozycji 7 i usunięcia cyjanku przy atomie węgla w pozycji 5. Produkt tej reakcji jest związkiem hydroksyjstrowym, odpowiadającym wzorowi V

gdzie -A-A-A, -B-B-, R3, r8 i r9 są takie jak określono we wzorze XIII i R1 oznacza niższą grupę alkoksykarbonylową lub hydroksykarbonylową. Alkoholan metalu stosowany w reakcji odpowiada wzorowi R ^KOM gdzie M jest metalem alkalicznym i r1°O- odpowiada grupie alkoksy R1 Wydajności tej reakcji są w większości zadowalające jeśli alkonolanem metalu jest metanolan potasu lub metanolan sodu, lecz można stosować inne niższe alkoholany. Alkoholan potasu zaleca się szczególnie. Fenolany, inne aryloalkoholany można także stosować, jak również arylosiarczki. Reakcję dogodnie przeprowadza się w obecności alkoholu, odpowiadającego wzorowi r1°OH gdzie R1°jest takie jak określono powyżej. Można stosować inne konwencjonalne rozpuszczalniki. Korzystnie, substrat o wzorze VI jest obecny w proporcji, wynoszącej między około 2% i około 12% wagowych, korzystniej co najmniej około 6% wagowych. Korzystnie, R^WOM jest obecny w proporcji, wynoszącej między około 0,5 i około 4 moli na mol substratu, korzystniej między około 1 i około 2 molami na mol substratu, a jeszcze korzystniej około 1,6 mola na mol substratu. Temperatura nie jest krytyczna, lecz podwyższenie temperatury wzmaga produktywność. Czas reakcji wynosi zwykle około

189 339 i około 24 godzin, korzystnie około 4 do około 16 godzin. Dogodnie, reakcję prowadzi się w atmosferycznej temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin w zalezności od użytego rozpuszczalnika.

Czas wymagany dla reakcji w celu osiągnięcia równowagi, zalezy od ilości alkoholanu dodanego do mieszaniny reakcyjnej i sposobu w jaki dodaje się alkoholan. Alkoholan można dodawać w pojedynczej porcji lub w wielu porcjach, albo można go dodawać w sposób ciągły. Jeśli alkoholan dodaje się w wielu porcjach, korzystne jest dodanie około 1,6 równoważnika metanolanu sodu w dwóch etapach. W tym dwuetapowym dodaniu, do mieszaniny reakcyjnej dodaje się początkowo 1 równoważnik metanolanu potasu, po czym 0,6 równoważnika metanolanu potasu około 90 minut później. Ten dwuetapowy sposób dodawania skraca czas osiągnięcia równowagi w stosunku do dodania w pojedynczej porcji 1,6 równoważnika metanolanu potasu.

Ponieważ równowaga jest korzystniejsza dla wytwarzania hydroksyestru o niskim stężeniu diketonu, reakcja przebiega korzystnie raczej przy wysokim rozcieńczeniu, np. 40:1 dla reakcji z metanolanem sodu. Odkryto, ze znacznie wyższą produktywność można zrealizować przez użycie metanolanu potasu niż metanolanu sodu, ponieważ rozcieńczenie w zakresie 20:1 jest generalnie wystarczające dla minimalizacji rozmiaru odwrotnego cyjanowania, jeśli odczynnikiem jest metanolan potasu.

Zgodnie z wynalazkiem, stwierdzono dalej, że reakcję odwrotnego cyjanowania można zahamować przez wzięcie odpowiedniego odczynnika chemicznego lub miar fizycznych w celu usunięciu pobocznego produktu jonu cyjankowego ze strefy reakcyjnej. Tak więc, w dalszej postaci realizacji wynalazku reakcję diketonu z alkoholanem metalu alkalicznego, można prowadzić w obecności czynnika strącającego dla jonu cyjankowego, takiego jak np. soli, zawierającej kation, który tworzy nierozpuszczalny związek cyjankowy. Takimi solami mogą być np. jodek cynku, siarczan żelazowy lub zasadniczo każdy halogenek, siarczan lub inna sól ziem alkalicznych lub metal przejściowy, który jest bardziej rozpuszczalny niż odpowiadający cyjanek. Jeśli jodek cynku jest obecny w proporcjach w zakresie około jednego równoważnika na równoważnik substratu diketonowego, zaobserwowano, że produktywność reakcji zwiększa się znacznie w porównaniu z procesem prowadzonym przy nieobecności halogenku metalu alkalicznego.

Nawet jeśli czynnik strącający stosuje się do usunięcia jonu cyjankowego, pozostaje korzystnym przebieg przy dość wysokim rozcieńczeniu, lecz przez stosowanie czynnika strącającego, stosunek molowy rozpuszczalnika do substratu diketonowego można zmniejszyć znacznie w porównaniu z reakcjami przy nieobecności takiego czynnika. Odzyskanie hydroksyestru o wzorze V można przeprowadzić albo zgodnie z procedurami ekstrakcji lub bez ekstrakcji, opisanymi poniżej.

Równowagę reakcji można także kontrolować pod względem wytwarzania hydroksyestru o wzorze V przez usuwanie tego hydrotoyestru z mieszaniny reakcyjnej, po jego syntezie. Usuwanie hydroksyestru może postępować albo etapami albo w sposób ciągły, środkami takimi jak filtracja. Usuwanie hydroksyestru można stosować do kontroli równowagi albo pojedynczo albo w połączeniu z chemicznym lub fizycznym usuwaniem cyjanku z mieszaniny reakcyjnej. Ogrzewanie otrzymanego przesączu kieruje potem równowagą reakcji pod względem przemiany pozostającego diketonu o wzorze VI w hydroksyester wzorze V.

W przemianie diketonu o wzorze VI w hydroksyester o wzorze V, ó-cyjanohydroksyester obserwowano w surowym produkcie w małych ilościach, zwykle mniejszych niż około

5% wagowych. Zakłada się, że ten 5-cyjanohydroksyester jest pośrednim związkiem równowagi między uikeLoiiem o wzoize VI i hydroksycstrem o wzorze V. Zakłada się dalej, ze ten pośredni związek równowagi tworzy się z diketonu przez atak metanolanu na grupę 5,7-okso i protonowanie enolanu, oraz z hydroksyestru przez addycję Michaela produktu ubocznego jonu cyjankowego wobec grupy funkcyjnej .I-keto-A⁴' hydroksyestru.

Oprócz 5-cyjano-7-kwasu i H-alkoholanu hydroksyestru o wzorze V, zaobserwowano, ze pośredni 5-cyjano hydroksyester reaguje z ubocznym produktem jonu cyjankowego (obecnym jako wynik odcyjanowania, które wprowadza podwójne wiązanie Δ^4,5) w celu wytworzenia ć-cyjano-T-kwasu. Zakłada się, ze działanie jonu cyjankowego dealki26

189 339 luje grupę 7-estrową 5-cyjanohydroksyestru, do uzyskania 5-cyjano-7-kwasu i odpowiadającego alkilonitrylu.

Zakłada się dalej, że przejściowy związek pośredni 17-alkoholan tworzy się przez atak metanolanu na 17-spirolakton hydroksyestru (albo poprzedni związek pośredni, który następnie przekształca się w hydroksyester). 17-alkoholan łatwo przekształca się w hydroksyester przez traktowanie kwasem. Zatem, nie generalnie obserwuje się go w macierzy produktu.

5-Cyjanohydroksyester, 5-cyjano-7-kwas i 17-alkoholan są nowymi związkami, użytecznymi jako markery chromatografii i jako pośrednie w wytwarzaniu hydroksyestru. Można je wyodrębniać z surowego produktu tego etapu schematu 1 syntezy. Alternatywnie, można je syntetyzować bezpośrednio do użytku jako markery Iub związki pośrednie. 5-Cyjanohydroksyester można syntetyzować przez reakcję roztworu wyizolowanego diketonu o wzorze VI z zasadą, taką jak alkoholan Iub amina, i wyodrębnienie otrzymanego osadu. Wytworzony związek korzystnie jest wodoro-7-metylo-5β-cyjcno-11α.17-dihydroksy-3-okso-17α-pregncno-7a,2l-dikarboksylanem. y-laktonem.

Kwas 5-cyjano-7-karboksylowy można syntetyzować bezpośrednio przez reakcję diketonu o wzorze VI ze słabym wodnym roztworem zasady, takiej jak octan sodu Iub wodorowęglan sodu i wyodrębnienie otrzymanego osadu. Wytworzony związek jest korzystnie kwasem 5-P-cyjano-11a,17-dihydroksy-3-okso-17a-pregnano-7a,21-dikarboksylowym, y-laktonem.

17-Alkoholan można syntetyzować bezpośrednio przez reakcję roztworu hydroksyestru o wzorze V z alkoholanem, uzyskując mieszaninę 17-alkoholanu i odpowiadającego hydroksyestru. Wytworzony związek korzystnie jest dimetylo-11a, 17-dihydroksy-3-okso- 17a-pregnan-4-eno-7a,21 -dikarboksylanem, y-laktonem.

Korzystnie, substrat diketonowy o wzorze VI odpowiada wzorowi VIA

o VIA a produkt hydroksyestru odpowiada wzorowi VA

VA w których każdy z -A-A-, -B-B-, R³, Y1 Y2 i X są takie jak określono we wzorze XHIA i R¹1ess laki stun j określono we wzorze V. Korzzytnie R³ oznacza atom wodoru.

Produkty o wzorze V są związkami nowymi, które mają znaczącą wartość jako pośrednie w wytwarzaniu związków o wzorze I, a zwłaszcza o wzorze IA. Korzystnie, związki o wzorze V odpowiadają wzorowi VA, w którym -A-A- i -B-B- oznaczają grup? -CH2-CH2-, r3 oznacza atomi worodu, niższa grupa alkilowa lub niższa alkoksy, a Ri i Ri razem stanowią pierścień 20-spirokscnowy':

189 339

O

X2«III

Najkorzystniej, związek o wzorze V oznacza wodcrometylo-llα,17α-dihy1iroysy-3-okso-pregn-4-enk-7y, 21-diyyrnoysclao, ^^Μ.

Związek o wzorze V można wyodrębnić przez filtrację lub zakwaszenie roztworu reakcyjnego np. kwasem mineralnym, takim jak wodny roztwór HC1 lub kwasu siarkowego, ochłodzenie do temperatury otoczenia i ekstrakcję produktu rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak chlorek metylenu lub octan etylu. Ekstrakt przemywa się wodnym roztworem zasady, suszy i filtruje, po czym usuwa rozpuszczalnik. Alternatywnie, roztwór reakcyjny, zawierający produkt o wzorze V można zgasić stężonym kwasem. Roztwór produktu zatęza się, chłodzi do temperatury między około 0°C do 25°C i stały produkt izoluje przez filtrację.

W zalecanej postaci realizacji, metanol i HCN usuwa się przez destylację po zakończeniu okresu reakcyjnego, za pomocą kwasu mineralnego (takiego jak kwas chlorowodorowy lub kwas siarkowy) dodawanego przed destylacją, oraz wody dodawanej po destylacji. Kwas mineralny można dodawać w pojedynczym etapie, w wielu etapach i w sposób ciągły. W zalecanej postaci realizacji, kwas mineralny dodaje się w sposób ciągły przez okres, wynoszący nknłn 10 do około 40 minut, korzystniej około 15 do nynło 30 minut. Podobnie, wodę można dodawać na spód aparatu destylacyjnego w pojedynczym etapie, w wielu etapach lub ciągle. W zalzcynzj postaci realizacji, zatężoną mieszaninę reakcyjną chłodzi się od temperatury wrzenia wobec powrotu skroplin przed dodaniem wody. Korzystnie, mieszaninę chłodzi się do temperatury, wynoszącej między kynło 50°C do około 70°C, korzystnie między około 60°C do około 70°C i korzystniej nkołn 65°C przed dodaniem wody. Następnie dodaje się wodę, korzystnie w sposób ciągły przez nyres około 15 minut do około 3 godzin, a korzystniej przez około 60 minut do kykło 90 minut, utrzymując temperaturę w przybliżeniu stałą- Produkt o wzorze V zaczyna krystalizować od spodu aparatu do destylacji, w trakcie dodawania wody. Po dodaniu wody do mieszaniny, rozcieńczoną mieszaninę utrzymuje się w mniej więcej tej samej temperaturze przez około 1 godzinę, a potem chłodzi do temperatury kykłk 15°C przez dodatkowy okres, wynoszący około 4 do około 5 godzin. Mieszaninę utrzymuje się w temperaturze około 15°C przez okres około 1 do 2 godzin. Dłuższy okres utrzymywania w temperaturze 15°C zwiększa wydajność cyjanoestru w mieszaninie. Ten sposób odzyskiwania zapewnia wysokiej jakości krystaliczny produkt bez operacji ekstrakcji.

Zgodnie z innym zalecanym sposobem odzyskiwania produktu o wzorze V, metanol i HCN usuwa się przzz destyIacj po zakończemu okresu j·eakcyCj^eigk za pomoeci wody dodawanej przed lub w czasie destylacji. Dodawanie wody przed destylacją upraszcza operację, lecz postępowe dodawanie w czasie destylacji pozwala na utrzymanie zasadniczo stałej objętości w aparacie destylacyjnym. Produkt o wzorze V yrystalizujs od spodu aparatu w trakcie przebiegu destylacji. Ten sposób odzyskiwania zapewnia wysokiej jakości krystaliczny produkt bez operacji ekstrakcji.

Zgodnie z jeszcze dalszą alternatywą. roztwór reakcyjny, zawierający produkt o wzorze V można zgaisić kwjissm lnΐneraΐnymj np j 4N HCL po czym rozpuszczalnik usuwai się przez destylację. Usuwanie rozpuszczalnika jest tyyżs skuteczne do usuwania pozkstyłkści HCN z produktu reakcji. Stwierdzono, ze wielkyektns ekstrakcje rozpuszczalnika w celu oczyszczenia związku o wzorze V nie są yonlsczns jeśli związek o wzorze V służy jako pośredni w procesie wytwarzania spkksymskrsnonu, jaki opisano w niniejszym. W rzeczywistości takie ekstrakcje można często całkiem wyeliminować. Jeśli ekstrakcję rozpuszczalnika stosuje się do oczyszczania produktu, pożądane jest uzupełnienie przemywania rozpuszczalnika solanką i przemywania woyorotleoyiem sodu. Ale jeśli ekstrakcję rozpuszczalnika eliminuje się, przemywania solanką i sodą kaustyczną eliminuje się także. Eliminacja ekstrakcji i przemywania znacznie wzmaga produktywność procesu bez zmniejszania wydajności lub jakości produktu, a także eliminuje potrzebę suszenia przemywanego roztworu środkiem odwadniającym, takim jak siarczan sodu.

189 339

Surowa prudukt 11α-hydruksy-7α-alkuSsykarbunaluwy udbiera się punuwnie w rozpuszczalniku, du następnegu etapu reakcji, która jest przemianą grup' 11-hydruksyluwej w grupę puzustającą w puzacji 11, wytwarzając przez tu związek u wzurze IV:

IV gdzie -A-A-, R3, -B-B-, R8 i r9 są takie jak ukreślunu we wzurze XIII, R1 jest taki jak ukreślunu we wzurze V i R2 uznacza niższą grupę arylusulfunyluSsa, alkilosulfunaiuksa, acyluksa lub halugenek. KurzystnSe grupę 11α-hadruSsy estryfikuje się przez reakcję niższegu halugenku alSilosulfonylu, halugenku acylu lub bezwudnika Swasuwego, która dudaje się du ruztwuru, zawierającegu prudukt puśredni u wzurze V. Niższy bezwodnSS kwasowy, taki jak bezwudnik uctowy i trichiuruwcuwane bezwudniki kwasuwe, takie jak bezwudnik trifluuruuetuwy, mużna stusuwać du wytwarzania udpuwSednieh puzustających grup ac-luksy. Jednakże zaleca się niższe halugenki alkSlosuifonyluwe, a zwłaszcza chlurek metanusulfunylu.

Alternatywnie, grupę 11a-hydruksy mużna przekształcić w halugenek przez reakcję udpuwie-dniegu udczynnika, takSego jak bromek tiunylu, chlurek tiunylu, chlurek sulfurylu lub chlurek uSsalSiu. Inne udezynnSSS du twurzenia estrów kwasu 11α-sulfunuwego ubejmują ehiureS tusylu, ehlureS benzenusulfunalu i bezwudnik trifluorometanosulfonowy. Reakcję prowadzi się w rozpuszczalniku, zawierającym wymiatacz chtoruweuwudurowy, taki jak trietaluaminą lub pirydyna. Mużna także stusuwać zasady nieurganiczne, takie jak węglan putasu lub węglan sudu. PoezątSuwe stężenie hadruksyestru u wzurze V wynusi SorzastnSe między ukuto 5% i ukułu 50% waguwych. Odczynnik jest kurzystnie ubecny w lekkim nadmiarze. Chlurek metylenu jest szczególnie udp^rwiedi^m rozpuszczalnikiem dla reakcji, lecz mużna także wykurzastać inne rozpuszczalniki, takie jak dichtoruetan, pirydynę, ehiurufurm, keton metaiuwo-etyiuky, d^eteks-etan, keton metyluwu-izubutytowy, aceton, inne ketony, etery, acetunitryl, toluen i tetrahydrofuran. Temperaturę reakcji ustala się przede wszystkim ze względu na lutnuść rozpuszczalnika. W ehiurSumetylenu temperatura reakcji zawiera się kurzystnie w zakresie między ukułu -10°C i ukułu 10°C.

Kurzystnie, substrat hydruksyestrowy u wzurze V udpuwiada wzuruwi VA

VA a prudukt odpuwiada wzuruwi IVA

IVA

189 339 z których każdy z -A-A-, -B-B-, r3, y1 y2 i X są takie jak określono we wzorze XIIIA, R1 jest niższą grupą αlkoksykcebonylową lub hydroksykcrbonylową, a r2 jest taki jak określono we wzorze IV. Korzystnie r3 oznacza atom wodoru.

Produkty o wzorze IV są nowymi związkami, które mają zasadniczą wartość jako pośrednie w wytwarzaniu związków o wzorze I, a zwłaszcza o wzorze LA. Korzystnie, związki o wzorze V odpowiadają wzorowi VA, w którym -A-A- i -B-B- oznaczają grupę -CH2-CH2-, r3 oznacza atom wodoru, niższą grupę alkilową lub niższa alkoksy, a R⁸ i R razem stanowią pierścień 20-spiroksanowy:

o

A,.,/

XXXIII

Najkorzystniej związek o wzorze IV jest wodorometylo-17a-hydroksy-11a-(metylosulfonylo)oksy-3-oksopregn-4-eno-7a,21-dikceboksylanem. γ-laktonem. Jeśli pożądana jest pozostająca grupa acyloksy, związek o wzorze IV jest korzystnie 7-wodorometylo-17-hydroksy-3-okso-11 a-(2,2,2-triffuoro-1 -oksoetoksy)-17a-pregn-4-eno-7a,21 -dikarboksylanem, Y-laktonem; lub 7-metyyo-11 a-(acetylolk;yy) 17-hydroksy-317a-pregn-4-eno-7a,21-dikarboksylanem. γ-laktonem.

Jeśli trzeba, związek o wzorze IV można wyodrębniać przez usunięcie rozpuszczalnika. Korzystnie, roztwór reakcyjny najpierw przemywa się wodnym roztworem zasady, np. 0,5-2N NaOH, po czym przemywa kwasem, np. 0,5-2N HCl. Po usunięciu rozpuszczalnika reakcyjnego produkt rekrystalizuje się, np. przez odebranie produktu w chlorku metylenu, a potem dodanie drugiego rozpuszczalnika, takiego jak eter etylowy, który obniża rozpuszczalność produktu o wzorze IV, powodując wytrącanie się go w formie krystalicznej.

Przy odzyskiwaniu produktu o wzorze IV lub przy wytwarzaniu roztworu reakcyjnego do przemiany związku pośredniego o wzorze IV w związek pośredni o wzorze II, jak dalej opisano poniżej, wszystkie etapy ekstrakcji i/lub przemywania można pominąć jeśli roztwór zamiast tego traktuje się żywicą jonowymienną, następnie żywicą kationo-wymienną. Alternatywnie, roztwór reakcyjny można najpierw traktować adsorbentami nieorganicznymi, takimi jak zasadowy tlenek glinu lub zasadowa krzemionka, po czym przemyć rozcieńczonym kwasem. Krzemionka zasadowa lub zasadowy tlenek glinu można zwykle mieszać z roztworem reakcyjnym w proporcji, wynoszącej między około 5 i około 50 g na kg produktu, korzystnie między około 15 i około 20 g na kg produktu. Zarówno przy stosowaniu żywicy jonowymiennej jak i adsorbentów nieorganicznych, traktowanie można przeprowadzać przez proste zawieszenie żywicy lub adsorbenta nieorganicznego z roztworem reakcyjnym przy mieszaniu w temperaturze otoczenia, następnie usunięcie żywicy lub adsorbenta nieorganicznego przez filtrację.

W alternatywnej i zalecanej postaci realizacji wynalazku, produkt, będący związkiem o wzorze IV odzyskuje się w postaci surowej jako zatężony roztwór przez usunięcie części rozpuszczalnika. Ten zatężony roztwór stosuje się bezpośrednio w następującym etapie procesu, którym jest usunięcie grupy pozostającej 11a ze związku o wzorze IV, tworząc w ten sposób enester o wzorze II:

II

189 339 gdzie -A-A-, -B-B-, R³ R i r9 są takie jak określono we wzorze XIII i R¹ jest takie jak określono we wzorze Y. Dla celów tej reakcji, grupa R² związku o wzorze IV może być każdą grupą pozostającą, której usunięcie skutecznie tworzy wiązanie podwójne między atomami węgla w pozycji 9 i 11. Korzystnie, grupą pozostającąjest niższa grupa alkilosulfonyloksy lub acyloksy, którą usuwa się przez reakcję kwasu i soli metalu alkalicznego. Można stosować kwasy mineralne, lecz zaleca się nizsze kwasy alkanowe. Korzystnie, odczynniki do reakcji obejmuje dalej sól metalu alkalicznego wykorzystanego kwasu alkanowego. Szczególnie zaleca się, zeby grupa pozostająca obejmowała grupę mesyloksy i odczynnik do reakcji obejmował kwas mrówkowy lub kwas octowy oraz sól metalu alkalicznego jednego z tych kwasów lub innego niższego kwasu alkanowego. Jeśli grupą pozostającą jest mesyloksy i odczynnikiem usuwającym jest albo kwas octowy i octan sodu albo kwas mrówkowy i mrówczan potasu, obserwuje się relatywnie wysoki stosunek 9,1'1-olefiny do 11,12-olefiny. Jeśli w czasie usuwania grupy pozostającej obecna jest wolna woda, występuje tendencja do tworzenia zanieczyszczeń, szczególnie 7,9-laktonu

gdzie -A-A-, r3, -B-B-, r8 i R⁹ są takie jak określono we wzorze XIII, który jest trudny do usunięcia z końcowego produktu. Skutkiem tego, stosuje się bezwodnik octowy lub inny czynnik odwadniający do usunięcia wody obecnej w kwasie mrówkowym. Zawartość wolnej wody w mieszaninie reakcyjnej przed reakcją powinna być utrzymana na poziomie poniżej około 0,5%, korzystnie poniżej około 0,1% wagowych, zmierzonego przez analizę Karla Fischera pod względem wody, na podstawie całkowitego roztworu reakcyjnego. Mimo to, zaleca się, aby mieszaninę reakcyjną utrzymywać tak suchą jak tylko możliwe do wypraktykowania, przy czym zadowalające wyniki uzyskano przy 0,3% wagowych wody. Korzystnie, mieszanina ładunku reakcyjnego zawiera między około 4% i około 50% wagowych substratu o wzorze IV w kwasie alkanowym. Korzystnie obejmuje ona między około 4% i około 20% wagowych soli metalu alkalicznego kwasu. Jeśli stosuje się bezwodnik octowy jako czynnik odwadniający, korzystnie jest on obecny w proporcji, wynoszącej między około 0,05 mola i około 0,2 mola na mol kwasu alkanowego.

Stwierdzono, że proporcje produktu ubocznego 7,9-laktonu i 11,12-olefiny w mieszaninie reakcyjnej jest stosunkowo niska jeśli odczynik eliminujący zawiera połączenie kwasu trifluorooctowego, bezwodnika trifluorooctowego i octanu potasu jako odczynnika do eliminacji pozostającej grupy i tworzenia enestru (9,11-olefiny). Bezwodnik trifluorooctowy służy jako odczynnik odwadniający i powinien być obecny w proporcji co najmniej 5 około 3% wagowych, korzystniej co najmniej około 15% wagowych, najkorzystniej około 20% wagowych, na podstawie kwasu trifluorooctowego jako czynnika eliminującego.

Oprócz 7,9-laktonu, inne zanieczyszczenia i produkty uboczne, które sąuzyteczne jako pośrednie w syntezie oraz jako markery chromatograficzne, obserwowano w tym etapie schematu 1 syntezy. Nowy 4,9,13-trien enestru o wzorze II (np. 7-metylo-17-metylo-3-okso-18-nonpregna-4,9(ll), 13-trieno-13a,21-dikarboksylan) wyodrębniono chromatograficznie z roztworu produktu. Ilość tego wytworzonego związku wydaje się zwiększać ze wzrostem czasu reakcji dla tego etapu syntezy. Zakłada się, ze związek tworzy się w czasie protonowania laktonu i powstały jon karboniowy C17 ułatwia migrację kątowej grupy metylowej z pozycji C13. Odprotonowanie tego związku pośredniego daje 4,9,13-trien.

189 339

Nową grupę 5-cyjano-AH’12 enestru o wzorze II (np. wodoro-7-metylo-5p-cyjano-17-hydroksy-3-okso-17a-pregn-11-eno-17a,21-dikarboksylan, γ-lakton) także wyodrębniono chromatograficznie z surowego produktu. Zakłada się, ze te związki tworzą się poprzez odwodnienie pozostałego odpowiednio 5-cyjano-7-kwasu i 5-cyjanohydroksyestru, które są obecne w surowym roztworze produktu jako wynik trzeciego etapu syntezy według schematu 1.

Nowy epimer C17 enestru o wzorze II (np. wodoro-7-metylo-17-hydroksy-3-okso-17a-pregna-4„9(ll)-dieno-7,21 -dikarboksylan, γ-lakton) także wyodrębniono chromatograficznie z surowego produktu. Zakłada się, że warunki kwasowe reakcji eliminacji mogą powodować racemizację centrum chiralnego C17, dając 17-epimer enestru. 17-Epimer można syntetyzować bezpośrednio przez reakcję związku o wzorze IV z roztworem mrówczanu potasu, kwasu mrówkowego i bezwodnika octowego oraz izolację 17-epimeru.

Mimo, ze nie obserwowano go jako zanieczyszczenia w roztworze surowego produktu, 11-keton hydroksyestru o wzorze V można wytworzyć przez utlenienie grupy 11-hydroksy odpowiadającego hydroksyestru odpowiednim czynnikiem utleniającym, takim jak odczynnik Jonesa. Wytworzony 11-keton korzystnie jest wodoro-7-tnetylo-17-hydroksy-3.11-diokso-17a-pregna-4-eno-7a,21 -dikarboksylanem, γ-laktonem.

Alternatywnie, grupy pozostające 11a ze związku o wzorze IV można eliminować w celu wytworzenia enestru o wzorze II przez ogrzanie roztworu o wzorze IV w rozpuszczalniku organicznym, takim jak DMSO, DMF lub DMA.

Dalej zgodnie z wynalazkiem, związek o wzorze IV poddaje się reakcji początkowo z alkanianem alkenylu, takim jak octan izopropenylu w obecności kwasu, takiego jak kwas toluenosulfonowy lub bezwodnik kwasu mineralnego, takiego jak kwas siarkowy, w celu utworzenia estru 3-enolu:

IV(Z) związku o wzorze IV. Alternatywnie 3-enoloester można utworzyć przez traktowanie związku o wzorze IV bezwodnikiem kwasowym lub zasadą, takim jak kwas octowy i octan sodu. Dalszą alternatywą jest traktowanie związku o wzorze IV ketenem w obecności kwasu w celu wytworzenia związku o wzorze IV(Z). Pośredni związek o wzorze IV(Z) reaguje potem z mrówczanem metalu alkalicznego lub octanem w obecności kwasu mrówkowego lub octowego w celu utworzenia octanu A^{1 H}-enolu o wzorze IV(Y)

który można potem przekształcić w enester o wzorze II w rozpuszczalniku organicznym, krozystnie alkoholu, takim jak metanol, albo przez rozkład termiczny octanu enolu albo jego reakcję z alkoholanem metalu alkalicznego. Reakcja eliminacji jest wysoce selektywna wobec estru o wzorze II z pierwszeństwem wobec 11,12-olefmy i 7,9-laktonu, i ta selektywność jest zabezpieczona przez przemianę octanu enolu w enon.

189 339

Korzystnie, substrat o wzorze IV odpowiada wzorowi IVA

a produkt enestrowy odpowiada wzorowi IIA

IIA

1 2 gdzie każdy -A-A-, -B-B-, R Y i Y oraz X są takie jak określono we wzorze XIIIA i R1 jest takie jak określono we wzorze V. Korzystnie R3 oznacza atom wodoru.

Jeśli trzeba, związek o wzorze II można izolować przez usunięcie rozpuszczalnika, odebranie stałego produktu w zimnej wodzie i ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak octan etylu. Po odpowiednim przemyciu i etapach suszenia, produkt odzyskuje się przez usunięcie rozpuszczalnika do ekstrakcji. Następnie enester izoluje się przez dodanie wody do zatężonego roztworu produktu i filtrację stałego produktu, usuwając przez to korzystnie 7,9-lakton. Przemiana substratu o wzorze Π w produkt o wzorze IA można prowadzić w sposób opisany w opisie patentowym 4 559 332, który specjalnie załączono w niniejszym jako odniesienie, Iub korzystniej przez nową reakcję przy użyciu promotora chlorowcoacetamidu jaki opisano poniżej.

W innej postaci realizacji wynalazku, hydrokkyester o wzorze V można przekształcić w enester o wzorze II bez izolacji związku pośredniego o wzorze IV. W tej metodzie, hydroksyester odbiera się w rozpuszczalniku organicznym, takim jak chlorek metylenu; i do roztworu dodaje się albo czynnik acylujący, np. chlorek metanosulfonylu albo czynnik chlorowcujący, np. chlorek sulfurylu. Mieszaninę miesza się i jeśli wykorzystano chlorowcowanie, dodaje się środek wymiatający HC1, taki jak imidazol. Reakcja ta jest bardzo egzotermiczna i dlatego powinno się ją prowadzić w kontrolowanym tempie przy pełnym chłodzeniu. Po dodaniu zasady uzyskaną mieszaninę ogrzewa się do średniej temperatury, np. około 0°C do temperatury pokojowej albo nieco powyżej, i poddaje reakcji przez okres zwykle około 1 do około 4 godzin. Po zakończeniu reakcji, rozpuszczalnik odpędza się, korzystnie pod bardzo niskim ciśnieniem (np. około 600 do około 700 mmHg) w temperaturze około -10°C do około +15°C, korzystniej około 0° do około 5°C, w celu zatęzenia roztworu i usunięcia nadmiaru zasady. Substrat rozpuszcza się potem ponownie w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w chlorowcowanym rozpuszczalniku, takim jak chlorek metylenu w celu przemiany w ernster.

Odczynnik eliminujący grupy pozostające wytwarza się korzystnie przez mieszanie kwasu organicznego soli kwasu organicznego i czynnika odwadniającego, korzystnie kwasu mrówkowego, mrówczanu metalu alkalicznego i bezwodnika octowego, odpowiednio, w suchym reaktorze. Dodanie bezwodnika octowego jest egzotermiczne i daje uwalnianie CO, tak, że tempo dodawania musi być w związku z tym, kontrolowane. Aby pobudzić usuwanie wody, temperaturę tej reakcji utrzymuje się korzystnie w zakresie około 60°C do około 90°C, najko189 339 rzystniej oyołk 65°C do kyoło 75°C. Następnie dodaje się ten odczynnik do roztworu produktu związku o wzorze IV, aby wykonać reakcję eliminacji. Po kkkłk 4 do oynło 8 godzinach, mieszaninę reakcyjną ogrzewa się yorzystois do temperatury, wynoszącej co najmniej około 85°C, lecz korzystnie nie powyżej oykłk 95°C aż do usunięcia całego lotnego destylatu, a potem przez dodatkowy kydss do zakończenia reakcji, zwcOIs około 1 do kkołk 4 godzin. Mieszaninę reakcyjną chłodzi się i po oyzhskyniu przez standardową technikę ekstrakcji, ene^er można kyzysyać według potrzeby przez odparowanie rozpuszczalnika.

Stwierdzono dalej, ze enester o wzorze II mnżoy odzyskiwać z roztworu reakcyjnego przez alternatywną procedurę, która unika potrzeby etapu ekstrakcji po reakcji eliminacji, zapewniając przez to oszczędzanie kosztów, polepszenie wydajności i/lub poprawę produktywności. W tym procesie, produkt enestrowy wytrąca się przez rozcieńczenie mieszaniny reakcyjnej wodą po usunięciu kwasu mrówOowego. Produkt następnie izoluje się przez filtrację. Nie potrzeba żadnej ekstrakcji.

Zgodnie z dalszą alternatywą dla przemiany hcyroysyestru o wzorze V w ensster o wzorze II bez izolacji związku o wzorze IV, grupę llα-hyyroysy hcyroksyestru o wzorze V zamienia się na chlorowiec, a sosstsr o wzorze V tworzy się in situ przez odchlorowcowodnrowanie termiczne. Zamianę grupy hydroysy przez chlorowiec wykonuje się przez reakcję halogenku sulfurylu, korzystnie chlorku sulfurylu, w zimnie w knscnkści środka wymiatającego wkyorohylkgsoek, takiego jak imidazol. Hyyrnkscstter rozpuszcza się w rozpuszczalniku takim jak tetrahydrofuran i chłodzi do temperatury oynło 0°C do okkłk -70°C. Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się halogenek sulfurylu i ogrzewa się przez czas wystarczający do zakończenia reakcji eliminacji, zwykle nykłk 1 do około 4 godziny. Sposób według tej postaci realizacji nie tylko łączy dwa etapy w jednym, lecz eliminuje użycie: chlorowckwaosgk odczynnika odwadniającego (takiego jak bezwodnik octowy lub siarczan sodu). Ponadto, reakcja nie wymaga warunków refluksu i unika tworzenia produktu ubocznego CO, który powstaje przy stosowaniu kwasu octowego jako oyczhooiyy odwadniającego.

Zgodnie ze szczególnie zalecaną postacią realizacji wynalazku, związek diyetooowh o wzorze VI można przekształcać w epoysymsktrenno lub inny związek o wzorze I bez izolacji żadnego związku pośredniego w postaci oczyszczonej. Zgodnie z tym zalecanym spkskbem, roztwór reakcyjny, zawierający hhdroksyestsr gasi się silnym roztworem kwasu, chłodzi do temperatury otoczenia, a potem ekstrahuje odpowiednim rozpuszczalnikiem ekstrakcyjnym.

Kkdsystois, wodny roztwór soli niekrgyoicsosj, np. około 10% wagowo roztwór solanki, dodaje się do mieszaniny reakcyjnej przed ekstrakcją. Ekstrakt przemywa się i suszy przez destylację azektropowa w celu usunięcia rozpuszczalnika metyoolkwsgk, pozostałego z reakcji rozszczepienia ketonu.

Otrzymany zatężony roztwór, zawierający między około 5% i kykłk 50% wagowych związku o wzorze V, styka się następnie w zimnie z oyczyooikism acyljącym lub ylyilsulfknującym w celu utworzenia estru sulfonowego lub estru kwasu yiyarbkysylnwegk. Po zakończeniu reakcji ylkilosulfooylycji lub karboysylacji, roztwór reakcyjny przepuszcza się przez kolumnę z żywicą wymienną kwasową a potem zasadową w celu usunięcia zanieczyszczeń zasadowych i kwasowych. Po każdym przejściu, kolumnę przemywa się odpowiednim rozpuszczalnikiem, np. chlorkiem metylenu w celu kdzcskaoly z niej pozostałego estru sulfonowego lub yiyadboysylowsgo. Połączone eluaty i frakcje przemywania łączy się i redukuje, yodzhstnis pod zmniejszonym ciśnieniem, w celu wytworzenia zatęzonego roztworu, zawierającego ester sulfonowy lub ester diyydnkksylowy o wzorze IV. Ten zytęzooy roztwór styka się następnie z odczynnikiem odwadniającym, zawierającym czynnik usuwający grupę pozostającą lla-estru i usuwający wodór, tworząc podwójne wiązanie 9,11. Korzystnie, odczynnik do usuwania grup pozostających zywisry roztwór nyczcoików yowadoiyjacych kwas mrówkowy/mrówczyn metalu alkalicznego/bezwodnik octowy, opisanych powyżej. Po ukończeniu reakcji, mieszaninę reakcyjną chłodzi się i usuwa kwas mrówyowh/iooe lotne składniki, pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość chłodzi się do temperatury otoczenia, poddaje odpowiednim etapom przemywanią a potem suszy uzyskując zatężony roztwór, zawierający sosster o wzorze Π. Ten enester można następnie przekształcać w epkysymeksreooo Iub inny związek o wzorze I przy użyciu sposobu opisanego w niniejszym lub w opisie patentowym 4 559 332.

189 339

W szczególnie zalecanej postaci realizacji wynalazku, rozpuszczalnik usuwa się z roztworu reakcyjnego pod zmniejszonym ciśnieniem i produkt o wzorze IV dzieli się między wodę i odpowiedni rozpuszczalnik organiczny, np. octan etylu. Warstwę wodną ekstrahuje się następnie z powrotem z użyciem rozpuszczalnika organicznego i powrotny ekstrakt przemywa roztworem zasadowym, korzystnie roztworem wodorotlenku metalu alkalicznego, zawierającym halogenek metalu alkalicznego. Fazę organiczną zatęża się, korzystnie pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując enestrowy produkt o wzorze II. Produkt o wzorze II można potem odbierać w rozpuszczalniku organicznym np. chlorku metylenu i dalej poddawać reakcji w sposób opisany w opisie '332 w celu wytworzenia produktu o wzorze I.

Jeśli w reakcji epoksydacji stosuje się trichlzrzwcoacetonitryl, stwierdzono, że wybór rozpuszczalnika jest istotny, przy czym najbardziej zaleca się rozpuszczalniki chlorowcowane, a szczególnie zaleca się chlorek metylenu. Rozpuszczalniki, takie jak dichloroetan i chlorobenzen dają rozsądnie zadowalające wydajności, lecz wydajności są generalnie lepsze w środowisku reakcji chlorku metylenu. Rozpuszczalniki takie jak acetonitryl i octan etylu dają słabe wydajności, podczas gdy reakcja w rozpuszczalnikach takich jak metanol lub mieszanina woda/tetrahydrokfuran daje niewiele żądanego produktu.

Dalej zgodnie z niniejszym wynalazkiem, stwierdzono, że liczne ulepszenia w syntezie epoksymeksrenonu można zrealizować raczej przez użycie trichlorzwcojcetamidu niż trichlorzwcoacetznitrylu jako aktywatora nadtlenkowego przy reakcji epoksydacji. Zgodnie ze szczególnie zalecanym sposobem, epoksydację przeprowadza się przez reakcję substratu o wzorze IIA z nadtlenkiem wodoru w obecności trichlzroacetamidu i odpowiedniego buforu. Korzystnie, reakcję prowadzi się przy pH w zakresie około 3 do około 7, najkorzystniej między około 5 i około 7. Jednakże mimo tych warunków, zadowalającą reakcję realizowano poza zalecanymi zakresami pH.

Szczególnie korzystne warunki otrzymuje się przy buforze, zawierającym wodorofosforan dipotasowy i/lub buforze, zawierającym połączenie wodorofosforanu dipotasowego i diwodorofosforanu potasu w stosunku między około 1:4 i około 2:1, najkorzystniej w zakresie około 2:3. Można także stosować bufory boranowe, lecz generalnie dają one niższe przemiany niż fosforan dipotasowy lub mieszaniny K2HPO4/KH2PO4. Jakiby nie był zestaw buforu, powinien on zapewnić pH w zakresie wskazanym powyżej. Oddzielnie od całości kompozycji buforu lub dokładnego pH, które może zapewniać, zaobserwowano, że reakcja postępuje znacznie efektywniej jeśli co najmniej część buforu zawiera dizasadowy jon wdorofosforanowy. Uważa się, ze ten jon może uczestniczyć zasadniczo jako katalizator homogeniczny w tworzeniu adduktu lub kompleksu, obejmującego promotor i jon nadtlenku wodoru, którego tworzenie może być, odwrotnie, zasadnicze dla całości mechanizmu reakcji epoksydacji. Tak więc, wymaganiem ilościowym dla dizaoadowegz wodorofosforanu (korzystnie z K2HPO4) może być tylko małe stężenie katalityczne. Generalnie, zaleca się, aby K2HPO4 był obecny w proporcji co najmniej około 0,1 równoważnika, np. między około 0,1 i około 0,3 równoważnika na równoważnik substratu.

Reakcję przeprowadza się w odpowiednim rozpuszczalniku, korzystnie chlorku metylenu, lecz alternatywnie można stosować inne chlorowcowane rozpuszczalniki, takie jak chlorobenzen lub dichloroetan. Toluen i mieszaniny toluenu i aceton^lu także okazały się zadowalające. Bez wiązania się z konkretną teorią, sądzi się, że reakcja przebiega najefektywniej w układzie dwufazowym, w którym tworzy się pośredni nadtlenek wodoru i rozkłada w stosunku do fazy organicznej o niskiej zawartości wody, a reaguje z substratem w fazie organicznej. Tak więc zalecanymi rozpuszczalnikami są te, w których rozpuszczalność w wodzie jest niska. Efektywny odzysk z toluenu pobudzany jest przez inkluzję innego rozpuszczalnika, wpuugu J^ŁŁJV avvlviuu ji.

W przemianie substratów o wzorze II w produkty o wzorze I, toluen zapewnia korzyść sposobu, ponieważ substraty swobodnie rozpuszczają się w wodzie, a produkty nie. Tak więc, produkt osadza się podczas reakcji jeśli przemiany sięgają zakresu 40-50%, tworząc trójfazową mieszaninę, z której produkt można dogodnie wydzielić przez filtrację. Metanol, octan etylu, sam acetonitryl, THF i THF/woda nie okazały się tak efektywne jak rozpuszczalniki chlorzwzczwane lub toluen, w przeprowadzaniu przemiany tego etapu sposobu.

189 339

Mimu, że trichloruaeetamid jest szczególnie zalecanym udczynnikiem, mużna także stusuwać inne trichuiorowcuaeetamπdy, takie jak trifluuruacetamid i chlurodiliuoroaeetamid. Mużna także stusuwać trichluroweumetylubenzamid i inne związki, mające cząstkę arylenuwą, aiSilenową lub alkinyluwą (lub inną grupę, która puzwala na przeniesienie efektu wycufania elektrunu grupy wycufującej elektrun du grupy SarbunaloweJ amidu) między grupą trichloruwcumetyluwą w^-cufującą elektrun i grupą karbunylową amidu. Mużna także stusuwać heptafluurubutyruamidy, lecz z mniej kurzystnymi wynikami. Generalnie, aktywator nadtlenkuwy muże odpuwSadać wzuruwi:

R°C(O)NH2 gdzie R° uznacza grupę, mającą siłę wycufyw-azia elektrunu (jak zmierzunu przez stałą sigma) cu najmniej tak dużą jak grupa munochlurometyluwa. Grupa, wyeofuJąea elektrun kurzastnie łączy się bezpuśredniu z karbunylem amidu dla maksymalnej efektawnuści. KunSretnSeJ, aktywator nadtlenkuwy muże odpuwiadać wzuruwi:

x’ O x² —C—R^-C—MH₂ gdzie R^p uznacza grupę, która puzwala na przeniesienie efektu wycufania elektrunu grupy wacofuJąceJ elektrun du grupy SarbonaluweJ amidu, a kurzystnie wybiera się ją spuśród grupy aryienoweJ, alSeny|uweJ, alSinyluweJ i (CX4X⁵)n-, x1 χ2, X³, x4 i x5 wybiera się niezależnie spuśród ehlurowea, atumu wuduru, grupy alSiluwęj, ehluruwcualkiluweJ i cajanuwej uraz cyjanualkiluwei; uraz n wynusi 0, 1 lub 2; pu warunkiem, że gdy n wynusi 0 wtedy cu najmniej jeden z X^r, X² 2 XC³ oznacza chlorowieCz 2 gdy R^p oznacza -((Χ'^Τχ5)η_ _oraz gdy n wynusi 1 Iub 2 , wtedy cu najmniej jeden z X⁴ i x‘ uznacza ehloruwiee. Jeśli każdy z X⁴, χ2, χ3, χ4 i χ5 nie jest ehluruweem, kurzystnie jest grupą chiurowcualkilową, najkurzystniej nadehloroweualSilową. Szczególnie zaleca się aktywatory, w których n wynusi 0 i cu najmniej dwa χ1, χ2 i X³ są chlorowcem bib te , w kóóąych R^p jss2 -(CX⁴X⁵n_n- , n π-ζυ^ΐ 1 lub 2, co najmniej jeden z X⁴i X⁵ oznccaa chtorowicc, inna z X⁴ i X' oznaczają chloro wica bub aadehlurowcualkSl i X\ χ2 i χ3 uznaczają chluruwSte lub zadehiurowcualkil. Każdy z X\ X², χ3, χ4 i X⁵ oznacca kurz-staie Cl lub F, naJSurzysSnieJ Cl, chuć mieszane haiogtzks są także udpuwitdzie, jak nadchiorualSil lub zadUrumualSil i ich pułączenia, pud warunkiem, że atum węgla UezpuśrednSu dołąecona du grupy Sarbonalowęj amidu podsSawiuzy jest cu najmniej jedną grupą chlurowcową.

KorzystzSe aStywaSur nadtlenowy jest obtcza w prupurcji, wyzuszącej cu najmniej jeden rOwzuwazzSk, korzystnieJ między ukuto 1,5 i ukułu 2 rOwzowaZzSki substratu uUtcnegu początSowo. Nadtlenek wuduru powSniez być załaauwana du reakcji w cu najmniej średnim nadmiarze, lub aodawazy progresywnie w trakcie trwania reakcji tpuksadacJi. Chuć reakcja zużywa tylku jeden lub dwa rOwzuwazniSi nadtlenku wuduru na md substratu, nadtlenek wuduru ładuje się kurzystnit w znacznym nadmiarze w stusunku du aktywatora obteztgu poezątkowu. Bez ugraziezania wynalazku du poszeztgOlzeJ SturSi, uważa się, że mechanizm reakcji wiąże się z Sworztnitm adaukSu aktywatora i aniunu nadtlenku, że twurzeme się tej reakcji jest udwraealze przy rOwzuwadct z przewagą reakcji odwrutneJ, uraz że znaczny puecąSSowy nadmiar nadtlenku wuduru jest zatem SozStecny w celu napędzania reakcji naprzód. Temperatura tej reakcji zit jest ściśle Sr·ySyezza, i mużna ją efektywzie pruwadzić w^r zakresie.

w i r\ns~\ c 1_ i_ 1100 c _ _ -_ _ a - 1 _________r — Ό i — J^_ «.K — wynoszącym οκυιυ o w uo οκοιυ juk . ejcnefamic, zalecana iciupciaiuia wynusi nuęu/,γ ukuto 20°C i ukułu 30°C lecz przy pewnych rozpuszczalnikach, np. toluenie, reakcję mużna kurz-stnie pruwadzić w zakresie ukułu 60°C du ukułu 70°C. Przy uSoło 25°C reakcja zwykle wymaga mniej ziż 10 goaciz, zwykle ukułu 3 du ukułu 6 gudzin. Jeśli trzeba, w celu uzyskania pełnej przemiany substratu, mużna dudać dudaSSuwy aktywator i nadtlenek woaoru, przy kuńcu cyklu reaSeaJzegu.

Przy kuńcu cyklu rtaSeaJzegu usuwa się fazę wudną, roztwÓr orgaziczzy kurzystnie przemywa się w celu usunięcia zazSeezasceztń rozpuszczalnych w woazie, pu którym prudukt

189 339 można odzyskiwać przez usunięcie rozpuszczalnika. Przed usunięciem rozpuszczalnika, roztwór reakcyjny powinno się przemyć środkiem do przemywania co najmniej łagodnym do średnio zasadowego, np. węglanem sodu. Korzystnie, mieszaninę reakcyjną, przemywa się sukcesywnie z użyciem: łagodnego roztworu redukującego, takiego jak słaby (np. około 3% wagowo) roztworem siarczynu sodu; roztworem zasadowym, np. NaOH lub KOH (korzystnie około 0,5N); roztworem kwasu, takiego jak HCl (korzystnie około 1N); i na koniec przemycie środkiem obojętnym, zawierającym wodę lub solankę, korzystnie nasyconą solanką, w celu zminimalizowania strat produktu.

Przed usunięciem rozpuszczalnika reakcyjnego, można korzystnie dodać drugi rozpuszczalnik, taki jak rozpuszczalnik organiczny, korzystnie etanol tak, że produkt można odzyskiwać przez krystalizację po destylacji w celu usunięcia bardziej lotnego rozpuszczalnika.

Powinno się zrozumieć, że nowy sposób epoksydacji, wykorzystujący trichloroacetamid lub inny nowy aktywator nadtlenku, ma zastosowanie poza różnymi schematami wytwarzania jpoksymjkrenonu i w rzeczywistości można go stosować do tworzenia epoksydów poprzez podwójne wiązania olefinowe w wielu różnych substratach poddanych reakcji w fazie ciekłej. Reakcja jest szczególnie efektywna przy związkach nienasyconych, w których olefiny poddaje się tetrasubstytucji i trisubstytucji, to jest R^aR^bC=R^cR^d oraz RaR^bC=CR^cH gdzie R^a do R^d oznacza podstawniki inne niż atom wodoru. Reakcja postępuje najszybciej i w sposób pełny przy wiązaniu podwójnym poddanym tetrakubstytucei. Przykłady substratów dla reakcji epokkydacei obejmują Δ⁹Ί ^r-kanrenon i następujące substraty:

o

189 339

Ponieważ reakcja postępuje szybciej i pełniej z wiązaniami podwójnymi poddanymi trisubstytucji i tetrasubstytucji, jest to szczególnie efektywne dla selektywnej epoksydacji przez takie wiązanie podwójne w związkach, które mogą obejmować inne wiązania podwójne, gdzie atomy węgla olefiny poddaje się monosubstytucji lub nawet disubstytucji.

Innymi nie ograniczającymi przykładami ilustrującymi ogólnej reakcji epoksydacji są następujące reakcje epoksydacji:

Powinno się dalej zrozumieć, że reakcję można stosować korzystnie w epoksydacji monopodstawionych lub nawet dipodstawionych wiązań podwójnych, takich jak 11,12-olefinowych w różnych substratach steroidowych. Jednakże, ponieważ przeważnie epoksyduje ona więcej wysoko podstawionych wiązań podwójnych, np. 9,11-olefinowych, z wysoką selektywnością, sposób według tego wynalazku jest szczególnie efektywny dla uzyskiwania wysokich wydajności i produktywności w etapach epoksydacji różnych schematów reakcji opisanych gdzie indziej w niniejszym.

189 339

Ulepszony sposób okazał się szczególnie korzystnym zastosowaniem w wytwarzaniu:

IB przez epoksydację:

i wytwarzanie

przez epoksydację:

Wiele korzyści przedstawiono dla sposobu według wynalazku, w którym stosuje się trichloroacetamid zamiast trichloroacetonitrylu jako odczynnika przenoszącego atom tlenu dla reakcji epoksydacji. Układ odczynnika trichloroacetamidu ma niskie powinowactwo do olefin ubogich w elektrony w substratach, zawierających oba typy wiązań podwójnych. Dodatkowo, w substratach kompleksowych, takich jak steroidy, olefiny dipodstawionę i tripodstawione można różnicować przez reakcję. Tak więc, obserwuje się dobrą selektywność w epoksydacji izomerycznych związków Δ-9,11 i Δ-11,12. W tym wypadku, epoksyd 9,11 tworzy się z minimalną reakcją izomeru, zawierającego wiązanie podwójne Δ-11,12. W związku z tym, wydajność reakcji, profil produktu i końcowa czystość są znacznie wzmocnione w porównaniu z reakcjami, w których stosuje się trichlorowcoacetonitryl. Stwierdzono także dodatkowo, że znaczny nadmiar tworzenia się tlenu obserwowany przy stosowaniu trichlorowcoacetonitrylu jest zminimalizowany przy trichloroacetaniidzie, powodując poprawę bezpieczeństwa procesu epoksydacji. Dalej, w przeciwieństwie do reakcji pobudzanej przez trichloroacetom189 339 tryl, reakcja z trichloroacetcmidtm wykazuje minimum efektów egzotermicznych, ułatwiając w ten sposób kontrolę profilu cieplnego reakcji. Efekty mieszania obserwuje się jako minimalne i wydajność reaktora bardziej stałą, co jest dalszą korzyścią nad procesem z trichloroacetomtrylem. Reakcja jest łatwiejsza do zwiększania skali niz reakcja pobudzana trichloroacetonitrylem. Izolacja produktu i oczyszczanie jest proste. Nie obserwuje się utleniania Bayteα-Villαgtra karbonylowej grupy funkcyjnej (przemiana ketonu w ester pobudzana nadtlenkiem) jak doświadczono przy użyciu kwasu m-chloeopeeoksybenzotsowego lub innych nadkwasów. Odczynnik jest niedrogi, łatwo dostępny i łatwo go obrabiać.

Oprócz tego, następujące związki obserwowano przez chromatografię w surowym produkcie z etapu schematu 1 syntezy, w którym enester o wzorze II przekształca się w związek o wzorze I:

(1) nowy 11a,12a epoksyd enestru o wzorze Π, np. wodoro-7-metylo-11a,12a-tpoksy-17-hydroksy-3 -okso-17a-pregn-4-eno-7a,21 -dikarboksylan, γ-lakton;

(2) nowy 4,5 : 9,11-ditpoksyd enestru o wzorze II np. wodoro-7-metylo-4a, 5a; 9a, 11 a ldiepoksy-17-hydroksylI-okso-17a-pregnanOl7a,21-dikarboksylan, γ-lakton;

(3) nowy 12-keton ^estru o wzorze II np. wodoro-7-^e1t^ll^-17^1^;ydroksy-3,12-diokso17a-prtgna-4-ditno-7a,21 -dikarboksylan, γ-lakton;

(4) nowy 9,11-dihydroksy enestru o wzorze II np. wodoro-7-metylo-9α,11β,17-dihydroksy-I-okso-17α-pregna-4-eno-7α,21-dikceboksylcn, Y-lakton;

(5) nowy analog 12-hydroksy enestru o wzorze II, np. wodoro-7-metylo-12a,17-dihydroksy-3-okso-17a-pregna-4, 9(ll)-^dicno-7 a,21-dikarboksylan, γ-lakton; oraz (6) nowy 7-kwas związku o wzorze I, np. kwas 9,11α-tpoksy-17-hydroksy-3-oksOl17α-pregn-4-tno-7a,21 -dikarboksylowy, γ-lakton.

Związki te mają wykorzystanie jako syntetyczne związki pośrednie i/lub markery chromatograficzne w wytwarzaniu związku o wzorze I, szczególnie epoksymeksrenonu.

Zakłada się, że 11a, 12a,-epoksyd enestru o wzorze II tworzy się przez zanieczyszczenia wytworzone podczas poprzedniego etapu, w którym związek o wzorze IV przekształca się w enester o wzorze Π. To zanieczyszczenie wyizolowano choromatograficznie i jest to Δ¹¹’^ tester. Tworzy się on zwykle z enestrem Δ ’ w stosunku około 90:10 (enestru Δ ’ : ernestru Δ ’ ), chociaż ten stosunek może się zmieniać. Utlenianie enestru Δ^ηΊ podczas przemiany enestru o wzorze II w związek o wzorze I daje Ua^a-epoksyd.

4,5 : 9,11-epoksyd enestru o wzorze I wyizolowano chromatograficznie. Zakłada się, ze pochodzi on z nadepoksydacji enestru. Obserwuje się go zwykle w surowym produkcie na poziomie około 5% wagowych lub mniej, chociaż ilość ta może się zmieniać.

12-Keton enestru o wzorze II wyizolowano chromatograficznie. Zakłada się, że powstaje on z allilicznego utleniania enestru. Obserwuje się zwykle w surowym produkcie na poziomie około 5% wagowych lub mniej, chociaż ilość ta może się zmieniać. Poziom 12-ketonu wykrytego w surowym produkcie, po użyciu trichloroacttonitrylu jako aktywatora nadtlenku wodoru, był wyższy niż poziom wykryty przy stosowaniu trichloroacetamidu jako aktywatora.

9,11-dihydroksytntsttr o wzorze Π wyizolowano chromatograficznie. Obserwuje się go zwykle w surowym produkcie na poziomie około 5% wagowych lub mniej, chociaż ilość ta może się zmieniać. Zakłada się, że powstaje on z hydrolizy epoksydu o wzorze I.

12-Hydroksytnester o wzorze II wyizolowano chromatograficznie. Obserwuje się go zwykle w surowym produkcie na poziomie około 5% wagowych lub mniej, chociaż ilość ta może się zmieniać. Zakłada się, że powstaje on z hydrolizy 11,12-epoksydu z późniejszą eliminacją 11 β-hydroksy.

Poza tym, związki o wzorze I wytworzone zgodnie z tym opisem, można dodatkowo modyfikować w celu uzyskania metabolitu, pochodnej, proleku lub innego o ulepszonych h tt!cHr'h iac i l1cnc'7nαr τϊt'7nll<i'cr·':—ilnnic i ahśnmriat ctńrr óIś twiaia nndaa^anie i/lub skuteczność epoksymtksrenonu. Grupa 6-hydroksy związku o wzorze I (np. wodoro-7-metylo-6P, 17-dihyaeoksy-⁽^, 11 α-epoksy-3-okso- 17a-pregn-4-eno-7a,21 -dikarboksylan, γ-lakton) jest nowym związkiem, który zidentyfikowano jako możliwy metabolit u szczura. Metabolit hydroksy można wytwarzać z odpowiadającego eteru etyloenolu (np. wodoro-7-mttylo-9,11αlepoksy-17-hydroksy-17a-pregn-4-tno-7a,21-dikceboksylan, γ-lakton). Eter etyloenolowy związku o wzorze I można wytworzyć zgodnie z procedurą przedłożoną w publikacji R^Weier i L.M.Hofman (J.Med.Chem. 1977, 1304), którą załącza się w niniejszym jako

189 339 odniesienie, eter etyloenolowy poddaje się potem reakcji z kwasem m-chloronadbenzoesowym, uzyskując odpowiadającą pochodną 6-hydroksy związku o wzorze I.

Zakłada się dalej, ze sole monokarboksylowe epoksymeksrenonu, szczególnie sole potasowe i sodowe, są odpowiednią alternatywą wobec ułatwienia podawania związku o wzorze I osobom, dla których wskazane jest podawanie pochodnych aldosteronu. W warunkach łagodnie zasadowych możliwe jest selektywne otwarcie spirolaktonowych związków o wzorze I, bez hydrolizy grupy estrowej C7, dając odpowiadający analog kwasu 17--hydroksy-17a-(3-propionowego). Te analogi o otwartym łańcuchu są bardziej polarne niż ich odpowiedniki laktonowe i mają krótszy czas retencji przy analizie przez HPLC z odwrotną fazą. Warunki kwasowe generalnie powodują regenerację pierścienia laktonowego.

W warunkach bardziej wymuszonych, spirolakton otwiera się i ester C7 hydrolizuje, dając odpowiadające produkty uboczne, analogi kwasu 17β-hydroksy-17α-(3-βroβiono'wego) związków o wzorze I. Te kwasy karboksylowe mają krótszy czas retencji niż kwasy monokarboksylowe przy analizie przez HPLC z odwrotną fazą. Warunki kwasowe (np. traktowanie rozcieńczonym kwasem, takim jak 0,1-4 M kwasem chlorowodorowym) generalnie powodują regenerację pierścienia laktonowego kwasu dikarboksylowego.

Nowy sposób epoksydacji według wynalazku jest wysoce użyteczny jako kończący etap syntezy według schematu 1. W szczególnie zalecanej postaci realizacji, całość procesu według schematu postępuje następująco:

HCL CHgOH, H_tO. 80 ‘C.Ib

O

Schemat 2

Według trzech pierwszych etapów schematu 2 wytwarza się związek pośredni o wzorze XVII, zaczynając od związku, odpowiadającego wzorowi XX.

189 339

Synteza w tym etapie zaczyna się substratem odpowiadającym wzorowi XX

XX * ·3 · gdzie -A-A-1 R są takie jak określono we wzorze ΧΠΙ, -B-B- jest taki jak określono we wzorze ΧΠΙ z wyjątkiem, ze ani R⁶ ani R⁷ nie jest częścią pierścienia dołączonego do pierścienia D w pozycjach 16,17, a R²⁶ oznacza niższą grupę alkilową korzystnie metylową Korzystnie R³ oznacza atom wodoru. Reakcję substratu o wzorze XX z ylidem sulfoniowym daje epoksydowy związek pośredni, odpowiadający wzorowi ΧΕΧ

gdzie -A-A-, -B-B-, R³ i R²⁵ są takie jak określono we wzorze XX. Korzystnie R³ oznacza atom wodoru.

W następnym etapie schematu 3 syntezy, pośredni związek o wzorze XIX przekształca się w dalszy związek pośredni o wzorze XVIII

XVIII gdzie -A-A-, -B-B-, R³ są takie jak określono we wzorze XX. Korzystnie R³ oznacza atom wodoru. W tym etapie, substrat o wzorze XIX przekształca się w pośredni związek o wzorze XVIII przez reakcję z NaCH(COOEt)₂ w obecności zasady w rozpuszczalniku.

Ekspozycja związku o wzorze XVIII wobec gorącą wody i halogenku alkalicznego daje pośredni związek dekarboksylowany, odpowiadający wzorowi XVII

189 339

gdzie -A-A-, -B-B- i R są takie jak określono we wzorze XX. Korzystnie R³ oznacza atom wodoru. Sposób przemiany związku o wzorze XX w związek o wzorze XVII odpowiada zasadniczo opisanemu w opisach patentowych 3 897 417, 3 413 288 i 3 300 489, które wyraźnie załączono w niniejszym jako odniesienie. Mimo, że substraty różnią się, mechanizm i warunki wprowadzania cząstki 17-spirolaktonowjJ są zasadniczo takie same.

Następnie, związek pośredni o wzorze XVII epoksyduje się, np. stosując proces z opisu patentowego 4 559 332, w celu wytworzenia związku o wzorze XXIV

gdzie -A-A-, -B-B- i r3 są takie jak określono we wzorze XX. Jednakże, w szczególnie zalecanej postaci realizacji wynalazku, substrat o wzorze XVII epoksyduje się poprzez podwójne wiązanie 9,11 przy użyciu odczynnika utleniającego, zawierającego aktywator nadtlenkowy typu amidu, najkorzystniej trichloroacetamid, zgodnie ze sposobem opisanym powyżej w schemacie 1 dla przemiany enestru o wzorze II w produkt o wzorze I. Warunki i proporcje odczynników dla tej reakcji są zasadniczo takie jak opisano dla przemiany enestru o wzorze II w jpoksymeksrenon. Szczególnie zalecanymi związkami o wzorze XXIV są te, w których -A-A- i -B-B- są takie jak określono we wzorze XIII i r3 oznacza atom wodoru.

Stwierdzono, ze epoksydację substratu o wzorze XVII można wykonać z bardzo dobrą wydajnością przy użyciu nadkwasu, takiego jak np. kwas m-chloronadbenzojsowjgo. Jednakże, odczynnik trichloroacetamidowy zapewnia lepsze wyniki jeśli chodzi o minimalizację tworzenia się produktu ubocznego utlenienia Bayera-Villagera. Ten ostatni produkt uboczny można usuwać lecz wymaga to ucierania z rozpuszczalnikiem, takim jak octan etylu, po czym krystalizacji z drugiego rozpuszczalnika, takiego jak chlorek metylenu. Związek epoksy o wzorze XXIV odwodornia się w celu utworzenia podwójnego wiązania między atomami węgla w pozycji 6 i 7 przez reakcję z czynnikiem odwodorniającym (utleniającym), takim jak DDQ lub chloranil, albo przy użyciu sekwencji bromowania/odbromowania (lub innego chlorowcowania/odchlorowcowywania), w celu utworzenia drugiego nowego związku pośredniego o wzorze XXIII

XXIII gdzie -A-A-, -B-B-, R . R i R⁹ 0^68^0 we wzorze XX.

189 339

Szczególnie zalecanymi związkami o wzorze XXIII są te, w których -A-A- i -B-B- są takie jak określono wzorze XIII i R³ oznacza atom wodoru.

Mimo, ze bezpośrednie utlenienie jest efektywne do tworzenia się produktu o wzorze XXIII, wydajności są generalnie niskie. Korzystnie zatem, utlenienie przeprowadza się w dwóch etapach, pierwszym chlorowcowania substratu o wzorze XXIV w pozycji C-6, następnie odchlorowcowodorowania wobec olefiny 6,7. Chlorowcowanie korzystnie uzyskuje się z użyciem odczynnika N-chlorowcoorganicznego, takiego jak np. N-bromosukcynoimid.

Bromowanie przeprowadza się w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak np. acetonitryl, w obecności promotora chlorowcowania, takiego jak nadtlenek benzoilu. Reakcja postępuje efektywnie w rozpuszczalniku, takim jak tetrachlorek węgla, acetonitryl lub ich mieszanina.

Jednakże reakcja zwykle wymaga od 4 do 10 godzin do zakończenia. Rozpuszczalnik reakcyjny odpędza się i pozostałość odbiera w rozpuszczalniku mieszającym się z wodą, np. octanie etylu. Uzyskany roztwór przemywa się kolejno średnio alkalicznym roztworem (takim jak wodorowęglan metalu alkalicznego) i wod;ą Iub korzystnie nasyconą solanką w celu zminimalizowania strat produktu, po którym rozpuszczalnik się odpędza i pozostałość odbiera w następnym rozpuszczalniku (takim jak dimetyloformamid), odpowiednim do reakcji odchlorowcowodorowania.

Do roztworu dodaje się odpowiedni odczynnik do odchlorowcowodorowania np. 1,4-diazabicyklo[2,2,2]oktan (DABCO) razem z halogenkiem metalu alkalicznego, takiego jak LiBr, roztwór ogrzewa się od odpowiedniej temperatury reakcji, np. 60°C do 80°C, i kontynuuje reakcję przez kilka godzin, zwykle 4 do 15 godzin, w celu ukończenia odbromowodorowania. Można dodać dodatkowy odczynnik do odbromowodorowania, zgodnie z potrzebą podczas cyklu reakcyjnego, aby kierować reakcją_ do końca. Potem, produkt o wzorze XXIII można odzyskać, np. przez dodanie wody do osadu produktu, który następnie oddziela się przez filtrację i korzystnie przemywa dodatkową ilością wody. Produkt korzystnie rekrystalizuje się np. z dimetyloformamidu.

Produkty o wzorze XXIII, takie jak 9,11-epoksykanrenon są związkami nowymi, które można izolować przez ekstrakcję/krystalizację. Mają one zasadniczą wartość w wytwarzaniu związków o wzorze I, a zwłaszcza o wzorze IA. Przykładowo, można je stosować jako substraty do wytwarzania związków o wzorze XXII.

Stosując zasadniczo sposób opisany powyżej dla wytwarzania związków o wzorze VII, związki o wzorze XXIII reagują z jonem cyjankowym, aby wytworzyć nowe związki epoksyenaminowe, odpowiadające wzorowi XII

XXII gdzie -A-A-, -B-B-, R3, r8 i r9 są takie jak określono we wzorze XX. Szczególnie zalecanymi związkami o wzorze XXII są te, w których -A-A- i -B-B- są takie jak określono we wzorze XDI i R³ oznacza atom wodoru.

Produkty o wzorze XXII są związkami nowymi, które można izolować przez wytrącenie i filtrację. Mają one zasadniczą wartość jako pośrednie w wytwarzaniu związków o wzorze I, a zwłaszcza o wzorze IA. W najbardziej zalecanych związkach o wzorze XXII, -A-A- i -B-Boznaczają-CH2-CH2-, a R³ oznacza atom wodoru.

189 339

Przy użyciu zasadniczo spksknu kpisyosgo powyżej do wytwarzania związków o wzorze VI, związki epoksysoyminows o wzorze XXII przekształca się w nowe związki epoksydiyetknows o wzorze XXI

XXI gdzie -A-A-, -B-B-, R3, R⁸ i R⁹ są takie jak określono we wzorze XIII. W najbardziej zalecanych związkach o wzorze XXI, -A-A- i -B-B- oznaczają -CH₂-CH₂-, a R3 oznacza atom wodoru.

Produkty o wzorze XXI są związkami nowymi, które można izolować przez wytrącenie i filtrację. Mają one zasadniczą wartość jako pośrednie w wytwarzaniu związków o wzorze I, a zwłaszcza o wzorze LA. W najbardziej zalecanych związkach o wzorze XXI -A-A- i -B-Bsą takie jak określono we wzorze XIII. W najbardziej zalecanych związkach o wzorze XXI -A-A- i -B-B- oznaczają-CH₂-CH₂-, a R3 oznacza atom wodoru.

Stosując zasadniczo sposób opisany powyżej dla wytwarzania związków hydroksyestrowych o wzorze V ze związków yiyetknowhch o wzorze VI, związki epoktydiketooowe o wzorze XXI przekształca się w związki o wzorze XXXII

gdzie -A-A-, -B-B- i R są takie jak określono we wzorze XX, a R1 jest takie jak określono we wzorze V.

Tak jak w przemianie dlketkou o wzorze V w hhyrkysyester o wzorze VI, związek pośredni 5-β-cyjaoo-7-estrowy tworzy się także w przemianie eprlysyylkstonu o wzorze XXI w związki o wzorze XXXII. Pośrednie 5-β-cyjyno-7-estdh w obu szeregach można izolować przez traktowanie odpowiadającego yiyetonu alkoholem, takim jak metanol w obecności zasady, takiej jak tdietyloymioa. Korzystnie, pośrednie związki wytwarzania się przez ogrzewanie w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin mieszaniny diyetoou w ylyohklu, takim jak metanol, zawierającym kyoło 0,1 do oykłk 2 równoważników triethlkymioy na moi diketonu przez około 4 do oykłk 16 godzin. Produkty izoluje się w postaci czystej przez kchłkyzsnie mieszaniny do temperatury oykłk 25°C, po czym filtruje się. Wyizklkwyoe związki pośrednie .można przekształcać w związki o wzorze XXXII traktując je zasadą, taką jak alkoholan metalu alkyllczosgk w rozpuszczalniku, korzystnie alkoholu, takim jak metanol. Użycie alkoholanu w alkoholu stabilizuje równowagę mieszaniny podobną do tej utworzonej przy traktowaniu odpowiadającego diketkou o wzorze XXI w takich samych warunkach.

189 339

Oprócz tego, 7p-ester związku o wzorze ΧΧΧΠ (np. wodoro-7-metylo-9,lla-epoksy17-hydroksy-3-okso-17a-pregn-4-eno-7p,21-dikarboksylan, γ-lakton) obserwowano przez chromatografię w surowym produkcie końcowego etapu sposobu według schematu 4. Alkoholan i/lub cyjanek w roztworze reagują z produktem przekształcenia 7a-estru w mieszaninę epimeryczną 7a-estru i jego epimeru 73-estru. Czysty 7P-ester można izolować z mieszaniny epimerycznej przez krystalizację selektywną.

Korzystnie, związek o wzorze oznacza 4'S(4'a), 7'a-9'lla-epoksyheksadekahydro2(3H), 17'3-dimetylo-3'5,20'-trioksospiro-[furan-2(3H), 17'(3-[4,7]metano[17H]-cyklopenta-[a]-fenantreno-5'-karbonitryl; związek o wzorze XXII oznacza 5' R(5⁷a), 7'3-20'-amino-9,113-epoksyheksadekahydro-10', 13'-dimetylo-3',5,10'-trioksotrioksospiro[iuran-2(3H), 17'a-(5'H)[7,4]meteno[4H]-cyklopenta[a]fenantreno-5'-karbonitryl; i związek o wzorze ΧΧΠΙ oznacza kwas 9,11 α-epoksy-17a-hydroksy-3-oksopregna-4,6-dieno-21 -karboksylowy, γ-lakton.

W szczególnie zalecanej postaci realizacji, całość sposobu według schematu 2 postępuje następująco:

Ze schematów zilustrowanych powyżej, będzie zrozumiałe, że etapy reakcji wybrane do stosowania według wynalazku, zapewniają zasadniczą elastyczność w produkcji epoksymeksrenonu i związków' pokrewnych. Kluczowa cechy obejmują między innymi: (a) biokonwersję substiatu, takiego jak kanrenon, androstendion lub β-sitosterol w pochodną lla-lub 9a-hydroksylową (z równoczesną przemianą β-sitosterolu w strukturę 17-ketonowa; (b) wprowadzenie podwójnego wiązania 9,11 przez odwodnienie związku zawierającego albo grupę 11 α-albo 9a-hydroksylową po czym wprowadzenie grupy epoksy przez utlenienie podwójnego wiązania 9,11; (c) dołączenie 7a-alkoksykarbonylu przez utworzenie enaminy, hydrolizę enaminy do diketonu i reakcję diketonu z alkoholanem metalu alkalicznego; (d) tworzenie pierścienia 20-spiroksanowego w pozycji 17; (e) tworzenie 5,7-laktonu i estryfikację laktonu do 7-alkoksykarbonylu; (f) zabezpieczenie 3-ketonu przez przemianę w 3-enoloeter lub 3-ketal

189 339 podczas różnych przemian przy innych pozycjach (łącznie z tworzeniem się pierścienia 20-spiroksanowego w pozycji 17). Z kilkoma ograniczeniami, te cztery elementy składowe sposobu (b) do (d) można prowadzić w prawie każdej kolejności. Elementy sposobu (e) i (f) oferują porównywalną elastyczność. Zapewniają one drogę do epoksymeksrenonu i innych związków o wzorze I, które są znacznie prostsze w porównaniu z procesem z opisu patentowego U.S. nr 4 559 332. Ponadto, zapewniają ważne korzyści w produktywności i wydajności.

W opisach schematów reakcji jakie przedłożono powyżej, odzyskiwanie, izolację i oczyszczanie produktów reakcji, można generalnie przeprowadzić metodami dobrze znanymi dla specjalistów. Z wyjątkiem oznaczeń przeciwnych, warunki, rozpuszczalniki i odczynniki są albo konwencjonalne, nie specjalnie krytyczne, albo oba.

Jednakże, pewne konkretne procedury jakie szczególnie opisano powyżej, zapewniają korzyści, które nadają przeważającą wydajność całości i/lub produktywność różnych etapów sposobu i schematów sposobu, i/lub wysoką jakość związków pośrednich oraz ostatecznych produktów 9,11-epoksysterodiowych.

Wykorzystanie związków 20-spiroksanowych wytworzonych według wynalazku opisuje się w opisie patentowym Groba U.S. nr 4 559 332, który specjalnie załącza się w niniejszym jako odniesienie.

Związki 20-spiroksanowe wytworzone według wynalazku, odróżnia się przez przeważające biologiczne właściwości i są zatem wartościowymi aktywnymi składnikami farmaceutycznymi. Przykładowo, mają silne działanie antagonistyczne wobec aldosteronu, redukując i normalizując nadmiernie wysoką retencję sodu i wydzielanie potasu powodowane przez aldosteron. Mają zatem, jako diuretyki chroniące potas, ważne zastosowania terapeutyczne, np. w leczeniu nadciśnienia, niewydolności serca lub marskości wątroby.

Pochodne 20-spiroksanowe, mające działanie antagonistyczne wobec aldosteronu, są znane, patrz np. Fieser i Fieser: Steroids; strona 708 (Renhold Publ.Corp., Nowy Jork, 1959) oraz brytyjska publikacja patentowa nr 1 041 534; znane są także analogicznie aktywne kwasy 17P-hydroksy-21-karboksylowe i ich sole, patrz np. opis patentowy nr U.S 3 849 404. Związki z tego rodzaju, które dotychczas stosowano w terapii, mają jednak poważne wady, ponieważ posiadają pewną aktywność specyficzną wobec seksualności, która prędzej czy później, daje kłopotliwe konsekwencje w zwyczajowej terapii długoterminowej. Zwłaszcza niepożądane są kłopotliwe skutki, które można przypisywać aktywności anty-androgenicznej znanych preparatów anty-aldosteronowych.

Sposoby, procesy i kompozycje według wynalazku i warunki oraz odczynniki stosowane w niniejszym, opisuje się dalej w następujących przykładach.

Przykład 1

Schemat 1: Etap 3D: Metoda B: Synteza γ-laktonu 9,lla-epoksy-17a-hydroksy-3-oksopregn-4-eno-7a,21 -dikarboksylanu wodoro-metylowego

W gruszkowatej kolbie o pojemności 50 ml przy mieszaniu enester o wzorze IIA (1,07 g o zawartości 74,4% enestru), trichloroacetamid (0,32 g), wodorofosforan dipotasowy (0,70 g) jako ciała stałe zmieszano z chlorkiem metylenu (15,0 ml). Dodano pipetą nadtlenek wodoru (30% wagowych; 5,0 ml) w ciągu 1 minuty. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 6 godzin w temperaturze pokojowej i wtedy analiza HPLC pokazała, że stosunek epoksymeksrenonu do enestru w mieszaninie reakcyjnej wynosił w przybliżeniu 1:1. Dodano do mieszaniny reakcyjnej dodatkowy trichloroacetamid (0,32 g) i kontynuowano reakcję przy mieszaniu jeszcze przez 8 godzin, po tym czasie okazało się, ze zawartość enestru zmniejszyła się do 10%. Wprowadzono dodatkowy trichloroacetamid (0,08 g) pozostawiono mieszaninę reakcyjną do stania przez noc, po tym czasie pozostało w mieszaninie tylko 5% nieprzereagowanego enestru w stosunku do epoksymeksrenonu.

Przykład 2

Schemat 1: Etap 3D: Metoda C: Synteza γ-laktonu 9,lla-epoksy-17a-hydroksy-3-oksopregn-4-eno-7a,21 -dikarboksylanu wodoro-metylowego

Do reaktora o pojemności 100 ml wprowadzono enester o wzorze ΠΑ (5,4 g, o zawartości 74,4% enestru). Do enestru dodano trichloroacetamid (4,9 g) i wodorofosforan dipotasowy (3,5 g) oba w stałej postaci, potem chlorek metylenu (50 ml). Mieszaninę ochłodzono do tem189 339 peratury 15°C i dodano 30% nadtlenek wodom (25 g) w ciągu 10 minut. Pozwolono dojść mieszaninie reakcyjnej do temperatury 20°C i mieszano w tej temperaturze przez 6 godzin, po tym czasie sprawdzono konwersję na drodze HPLC. Oznaczono pozostały enester jako mniej niz 1% wagowo.

Mieszaninę reakcyjną dodano do wody (100 ml), pozostawiono fazy do rozdzielenia i usunięto warstwę chlorku metylenu. Dodano do warstwy chlorku metylenu wodorotlenek sodu (0,5N; 50 ml). Po 20 minutach fazy pozostawiono do rozdzielenia i dodano HC1 ((0,5N; 50 ml) do warstwy chlorku metylenu, po czym fazy pozostawiono do rozdzielenia i fazę organiczną przemyto nasyconą solanką (50 ml). Warstwę chlorku metylenu wysuszono nad siarczanem magnezu i usunięto rozpuszczalnik. Otrzymano białe ciało stałe (5,7 g). Wodną warstwę wodorotlenku sodu zakwaszono i ekstrahowano, a ekstrakt poddano obróbce, otrzymując dodatkowe 0,2 g produktu. Wydajność epzksymeksrenonu wyniosła 90,2%.

Przykład 3

Schemat 1: Etap 3D: Metoda D: Synteza y-laktonu 9,11 a-epoksy-17a-hydroksy-3-okso pregn-4-eno-7a,21 -dikarboksylanu wodoro-metylowego

Enester o wzorze IIA przekształcono na eβoksymeksrenzn, jak opisano w przykładzie 9, z następującymi różnicami: początkowy załadunek obejmujący enester (5,4 g o zawartości 74,4% enestru), trichlzroacetjmid (3,3 g) i wodorofosforan dipotasowy (3,5 10 g). Dodano roztwór nadtlenku wodom (12,5 g). Reakcję prowadzono przez noc w temperaturze 20°C, po czym HPLC wykazała 90% konwersji enestru do epoksymeksrenonu. Dodano dodatkowy trichłoroacetamid (3,3 g) i 30% nadtlenek wodom (5,0 ml) i reakcję prowadzono przez dodatkowe 6 godzin, w tym punkcie pozostały enester wynosił tylko 2% wobec załadunku enestru. Po obróbce, jak opisano w przykładzie 9, otrzymano 5,71 g epoksymeksrenonu.

Przykład 4

Schemat 1 Etap 3D: Metoda E: Synteza y-laktonu 9,11 a-epoksy- i7(j-hydrzksy-3-oksopregn-4-eno-7a,21 -dikarboksylanu wodoro-metylowego

Enester o wzorze IIA przekształcono na eβzksymeksrenon, jak opisano w przykładzie 9. W reakcji w tym przykładzie załadunek enestm wyniósł 5,4 g (o 25 zawartości 74,4% enestm), załadunek trichlzrzacetjmidu wyniósł 4,9 g, załadunek nadtlenku wodom wyniósł 25 g, załadunek wodorofosforanu dipotasowego wyniósł 3,5 g. Reakcja biegła w temperaturze 20°C w ciągu 18 godzin. Pozostałość enestm wyniosła poniżej 2%. Po obróbce otrzymano 5,71 g epzkoymeksrenznu.

Przykład 5

Schemat 1: Etap 3D: Metoda F: Synteza y-laktonu 9,l l «.-epoksy-i7j^-h('droksy-3-okoί:>pregn-4-eno-7a,21 -dikarboksylanu wzdzrz-metylowegz

Enester o wzorze IIA przekształcono na eβoksymeksrenzn, jak opisano w przykładzie 9, z wyjątkiem tego, ze temperatura reakcji w tym przykładzie wynosiła 28°C. Materiały załadowane do reaktora obejmowały enester (2,7 g), trichlorzacetamid (2,5 g), wodorofosforan dipotasowy (1,7 g), nadtlenek wodom (17,0 g) i chlorek metylenu (50 ml). Po 4 godzinach reakcji pozostałość enestm wyniosła poniżej 2% wobec załadunku enestm. Po obróbce, jak opisano w przykładzie 9, otrzymano 3,0 g epoksymeksrenonu.

Przykład 6

Schemat 1: Etap 3D: Metoda G: Synteza y-laktonu 9,11 α-eβoksy-17α-hydrzksy-3-oksopregn-4-eno-7a,21 -dikarboksylanu wodoro-metylowego

Enester o wzorze IIA (40,0 g o zawartości 68,4% enestm) załadowano do reaktora z płaszczem o pojemności 1000 ml i rozpuszczono w 175 ml chlorku metylenu. Roztwór mieszano, kiedy dodano trichlzroacetjmid (22,3 g) i 25 wodorofosforan dipotasowy (6,0 g) jako ciała stałe. Całość mieszano przy 400 obrotach/minutę i w temperaturze doprowadzonej do 27°C przy stałej temperaturze łaźni kontrolow-anej przez płyn, cyrkulujący w płaszczu reaktora. Dodano w ciągu 3-5 minut nadtlenek wodom (72,8 ml o zawartości 30%) Po dodaniu nadtlenku wodom mieszano całość przy 400 obrotach/minutę i temperaturze 27°C. Oznaczenie HPLC wykazało, ze reakcja zaszła w 99% w ciągu 5 godzin. W końcu 6 godzin dodano 72,8 ml wody. Oddzielono wodny nadtlenek wodom i powtórnie ekstrahowano jeden raz 50 ml chlorku metylenu. Połączony chlorek metylenu przemyto 6% siarczynem sodu (62,3 ml), aby roz48

189 339 łożyć ewentualnie zawarty nadtlenek. Usuwanie chlorku metylenu rozpoczęto przez destylację pod ciśnieniem atmosferycznym i skończono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano żółtawą pozostałość (48,7 g, 55,4% zawartości). To odpowiadało oznaczeniu 94,8% molowej wydajności.

Porcję (47,8 g) pozostałości połączono z 498 ml etanolu 3A (95% etanol denaturowany 5% metanolu). Mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin i usunięto 249 ml destylatu pod ciśnieniem atmosferycznym. Mieszaninę ochłodzono do temperatury 25°C i przesączono. Przemycie etanolem 3A (53 ml) użyto do ułatwienia przejścia. Suche ciało stałe ważyło 27,6 g (oznaczono 87,0%), co odpowiadało 91% odzysku. Porcję ciała stałego (27,0 g) rozpuszczono w 292 ml ketonu metylowo-etylowego w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin. Gorący roztwór przesączono przez wkład solka floc (sproszkowana celuloza) z drugą porcją 48,6 ml ketonu metylowo-etylowego użytego do ułatwienia przejścia. Porcję 146 ml ketonu metylowo-etylowego usunięto przez destylację pod ciśnieniem atmosferycznym. Roztwór ochłodzono do temperatury 50°C i mieszano przez jedną godzinę w miarę jak produkt krystalizował. Po 1 godzinie mieszaninę ochłodzono do temperatury 25°C. Mieszanie kontynuowano przez 1 godzinę i przesączono ciało stałe z 48,6 ml ketonu metylowo-etylowego użytego jako przemycie. Ciało stałe wysuszono do stałego ciężaru 20,5 g, który oznaczał 87,2% odzysku z rekrystalizacji. Wydajność reakcji i odzysk z etanolu i ketonu metylowo-etylowego dały łącznie 75% ogólnej wydajności.

Ług macierzysty ketonu metylowo-etylowego nadawał się do recyklingu z dodanym roztworem chlorku metylenu z następnej reakcji. Połączoną mieszaninę chlorku metylenu i ketonu metylowo-etylowego odparowano do sucha przez destylację pod ciśnieniem atmosferycznym i pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość połączono z 19 objętościami etanolu 3A, opierając się na zawartości epoksymeksrenonu. Połowę rozpuszczalnika usunięto przez destylację pod ciśnieniem atmosferycznym. Po ochłodzeniu do temperatury 25°C odsączono ciało stałe i wysuszono. Suche ciało stałe rozpuszczono w 12 objętościach ketonu metylowoetylowego w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin. Gorący roztwór przesączono przez wkład solka floc z 2 objętościami ketonu metylowo-etylowego użytego jako przemycie. Przesącz zatężono przez oddestylowanie pod ciśnieniem atmosferycznym 6 objętości ketonu metylowo-etylowego. Roztwór ochłodzono do temperatury 50°C i mieszano przez 1 godzinę, w miarę jak produkt krystalizował. Po 1 godzinie mieszaninę ochłodzono do temperatury 25°C. Mieszanie kontynuowano przez 1 godzinę i przesączono ciało stałe z 2 objętościami ketonu metylowo-etylowego użytego jako przemycie. Ciało stałe wysuszono do stałego ciężaru. Włączenie ługu macierzystego ketonu metylowo-etylowego podniosło ogólną wydajność do 80-85%.

Ta metoda okazuje się szczególnie odpowiednia do zwiększonej skali, ponieważ maksymalizuje wydajność i minimalizuje objętość przemywek i straty.

Przykład 6A

Schemat 1\ Etap 3D: Metoda H: Synteza y-laktonu 9,lla-epokyy1l7a-hydroksy-3-oksopregn-4-eno-7a,21 -dikarboksylanu wodoro-metylowego

Enester o wzorze ILA (17 g o zawartości 72% enestru) rozpuszczono w chlorku metylenu (150 ml), po czym dodano trichloroacetamid (14,9 g) przy wolnym mieszaniu. Temperaturę mieszaniny ustalono na 25°C i roztwór wodorofosforanu dipotasowego (10,6 g) w wodzie (10,6 ml) zmieszano z roztworem substratu enestru, mieszając przy 400 obrotach na minutę. Do mieszaniny substrat/fosforan/trichloroacetamid dodano nadtlenek wodoru (roztwór 30% wagowo; 69,4 ml) w ciągu 3-5 minut. Nie zauwazono wydzielania ciepła lub wydzielania tlenu. Mieszaninę reakcyjną tak wytworzoną mieszano przy 400 obrotach na minutę w temperaturze 25°C przez 18,5 godziny. Nie zauważono wydzielania tlenu w przebiegu reakcji, ale analiza zuzycia nadtlenku wodoru wykazała, ze tworzyła się pewna ilość tlenu podczas reakcji. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono wodą (69,4 ml) i całość mieszano przy 250 obrotach na minutę przez 15 minut. Przy tej operacji nie była potrzebna kontrola temperatury i prowadzono ją zasadniczo w temperaturze pokojowej (temperatura w zakresie 5-25°C jest dopuszczalna). Wodną i organiczną warstwę pozostawiono do rozdzielenia i usunięto dolną warstwę chlorku metylenu.

Wodną warstwę znów ekstrahowano chlorkiem metylenu (69,4 ml) przez 15 minut, mieszając przy 250 obrotach na minutę. Warstwy pozostawiono do rozdzielenia i usunięto dolną

189 339 warstwę chlorku metylenu. Wodną warstwę (177 g; pH = 7) poddano oznaczeniu na obecność nadtlenku wodoru. Wynik (12,2%) wskazywał, że 0,0434 mola nadtlenku wkykru zużyto w reakcji 0,0307 mola mlefmY. Nadmiar zużycia nadtlenku wodoru był miarą tworzenia tlenu w reakcji. Powtórna ekstrakcja małą ilością objętości chlorku metylenu była wystarczająca, aby zabezpieczyć się przed stratą epoksymeksrsnoou w wodnej warstwie. Wynik ten potwierdzono zastosowaniem drugiej dużej ekstrakcji chlndyism metylenu, w której kyzyskyoo tylko trichlnrkacetamid.

Roztwory chlorku metylenu z ekstrakcji opisanych wyżej połączono i przemyto 3% (wagowo) roztworem siarczynu sodu (122 ml) przez co najmniej 15 minut przy kkołk 250 obrotach na minutę. Obserwowano ujemny wynik próby joyynwo-skroniowej (papierki KJ; brak zabarwienia; w pozytywnym wyniku próby purpurowe sanyrwienie wykazuje obecność nadtlenku) na końcu kydesu mieszania.

Wodną i organiczną warstwę pozostawiono do rozdzielenia i usunięto dolną warstwę chlorku metylenu. Wodną warstwę (pH = 6) odrzucono. Trzeba zauważyć, że dodanie roztworu siarczynu sodu może powodować lekkie wydzielanie ciepła, tak że takie dodawanie powinno przebiegać pod kontrolą temperatury.

Fazę chlorku metylenu przemyto 0,5 N wkyorotlsnkism sodu (61 ml) przez 45 minut przy około 250 onrotych na minutę i w zakresie temperatury 15-25°C (pH ~ 12-13). W tym procesie usunięto zanieczyszczenia pochodzące z trichlnroacetymidu. Zakwaszenie alkalicznej wodnej frakcji i następna ekstrakcja chlorkiem metylenu potwierdziły, że w tej operacji stracono bardzo małą ilość epnksymsksreokou.

Fazę chlorku metylenu przemyto raz 0,1 N kwasem chlorowodorowym (61 ml) przez minut, mieszając przy 250 obrotach na minutę i w zakresie temperatury 15-25°C.

Następnie warstwy posnstywlknk do rozdzielenia, usunięto dolną warstwę chlorku metylenu i przemyto znów 10% (wagowo) wodnym roztworem chlorku sodu (61 ml) przez 15 minut przy 250 obrotach na minutę i w zakresie temperatury 15-25°C. Znowu warstwy pozostawiono do rozdzielenia i usunięto warstwę organiczną. Organiczną warstwę przesączono przez wkład z Solkyfloc i następnie odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Suszenie dokończono w temperaturze łaźni wodnej 65°C. Otrzymano białawe ciało stałe (17,95 g) i poddano oznaczeniu przez HPLC. Oznaczono 66,05% spoksymeksrsooou. Potwierdzona molowa wydajność wyniosła dla reakcji 93,1%.

Produkt rozpuszczono w gorącym ketonie metclnwo-stylowym (189 ml) i powstały roztwór destylowano pod ciśnieniem atmosferycznym do usunięcia 95 ml rozpuszczalnika ystoonwego. Temperaturę obniżono do 50°C, w miarę jak produkt krystalizował. Mieszanie kootynunwyon w temperaturze 50°C przez 1 godzinę. Następnie temperaturę onoiżkok do 20-25°C i mieszanie kontynuowano przez dalsze 2 godziny. Ciało stałe odsączono, przemyto MEK (24 ml) i suszono ciało stałe do stałego ciężaru 9,98 g, które według oznaczenia HPLC zawierało 93,63% epkkscmeksrenonu. Produkt ten znów rozpuszczono w gorącym MEK (106 ml) i gorący roztwór przesączono p^^^^ sączek o szczelinach 10 mikronów pod ciśnieniem. Zastosowano jako przemycie inną porcję 18 ml MEK i przesączony roztwór MEK destylowano pod ciśnieniem atmosferycznym do usunięcia 53 ml rozpuszczalnika. Temperaturę obniżono do 50°C, w miarę jak produkt krystalizował; mieszanie kkntcouowyoo w temperaturze 50°C przez 1 godzinę. Następnie nnoiżooo temperaturę do 20-25°C i utrzymywano tę temperaturę, podczas gdy mieszanie kkntyoukwjok przez dalsze 2 godziny. Ciało stałe odsączono i przemyto MEK (18 ml). Suszono ciało stałe do stałego ciężaru 8,32 g, które zawierało 99,6% spoksymeksrenonu według ilościowego oznaczenia HPLC. Końcowe straty przy suszeniu były mniejsze od 1,0%. Ogólna wydajność spoksymeysrsoonu z reakcji i obróbki w tym przykłayzis wyniosła 65,8%. Ta ogólna wyyyjokść odzwierciedla wydajność rea-kcji 93%, oysysk z początkowej krystalizacji 78,9% i odzysk z krystalizacji 89,5%.

Przykład 6B

Wytwarzanie c-lyytkou 1lα,12α-epoksy-17-hcyr·kksy-3-kksk-17α-prego-4-eok-7y,21-wkdkrodikarnkksylaou 7-metylowego

189 339

Olefina Δ^ηΊ² z enestru jest produktem ubocznym eliminacji 11-mesylanu. Wydzielono czystą próbkę z mieszaniny reakcyjnej wytworzonej jak w przykładzie 10 przez powtarzaną preparatywną chromatografię cieczową. Tak więc 73 g pozostałości (wytworzonej jak opisano w przykładzie 10) chromatografowano na 2,41 kg żelu krzemionkowego Mercka (40-63μ) z gradientem układu elucyjnego octan etylu; toluen (20:80, 30:70, 40:60, 60:40, objętościowo). Połączono wzbogacone porcje olefiny Δ^Ί² z wybranych frakcji 30:70. tLc na płytkach EMF, stosując octan etylu/toluen 60:40 (objętościowo) z wizualizacją przy użyciu kwasu siarkowego i SWUV służyła jako wskazówka do wyboru odpowiednich frakcji. 7,9 g surowej olefiny Δ^ηΊ² (80% powierzchni według HPLC) otrzymanej po usunięciu rozpuszczalnika, chromatografowano na 513 g żelu krzemionkowego Mercka (40-63 μ) z gradientem układu elucyjnego octan etylu/chlorek metylenu (10:90, 20:80, 35:65, objętościowo). Czysty γ-lakton 17-hydroksy-3-okso-17a-pregna-4,11-dieno-7a,21-wodorodikarboksylanu 7-metylowego (3,72 g) otrzymano z wybranych frakcji 20:80. Selekcja frakcji opierała się na ocenie przez TLC jak w sytuacji poprzedniej.

MIR cm'1 1767 (lakton), 1727 (ester), 1668 i 1616 (3-keto^⁴·⁵).

NMR ¹H (CDClj) ppm: 1,05 (s,3H), 115 (s,3H), 3,66 (s,3H), 5,58 (dd,1H), 5,80 (s,1H), 5,88 (dd,1H)

NMR ^C (CDCI3) ppm: 17,41, 18,58, 21,73, 28,61, 32,28, 33,63, 34,91, 35,64, 35,90,

38,79, 42,07, 44,12, 5 48,99, 49,18, 51,52 93,81, 126,43, 126,69, 133,76, 166,24, 172,91, 176,64, 198,56.

Roztwór 1,6 g (3,9 mmola) γ-laktonu 17-hydroksy-3-okso-17a-pregna-4,11-dieno-7a,21-wodorodikarboksylanu 7-metylowego w 16 ml chlorku metylenu zmieszano z 2,2 ml trichloroacetonitrylu (22,4 mmola) i 0,75 g fosforanu dipotasowego (4,3 mmola). Całość mieszano i połączono z 6,7 ml 30% nadtlenku wodoru (66 mmoli). Mieszanie kontynuowano w temperaturze 25°C przez 45 godzin. Po tym czasie dodano 28 ml chlorku metylenu i 3 9 ml wody. Część organiczną oddzielono i przemyto kolejno a) 74 ml 3% siarczynu sodu, b) 62 ml 1N wodorotlenku sodu, c) 74 ml 1N kwasu chlorowodorowego i d) 31 ml 10% solanki. Znów oddzielono część organiczną, wysuszono nad siarczanem magnezu i odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. 1,25 g pozostałości chromatografowano na 138,2 g żelu krzemionkowego Mercka (40-63 μ), stosując gradientowy układ eter metylowo-tert-butylowy, toluen (40:60, 60:40, 75:25, objętościowo). Odpowiednie części frakcji 60:40 i 75:25 połączono po ocenie przez TLC, otrzymując 0,66 g czystego γ-laktonu 11a,12a-epoksy-17-hydroksy-3-okso-17a-eregn-4-eno-7a,21-wodorodikarboksylanu 7-metylowego. Stosowano TLC na płytkach EMF z układem elucyjnym eter metylowo-tert-butylowy, toluen 75:25 (objętościowo) i wizualizacją kwasem siarkowym i SWUV.

NMR 'H (CDCI3) ppm: 1,09 (s,3H), 1,30 (s,3H), 3,05 (AB^nj2 2H), 3,67 (S,3H). 5,80 (s,1H).

NMR ¹³C (CDCI3) ppm: 14,2, 18,0, 21,2, 28,8, 31,9, 33,5, 34,6, 34,7, 35,1, 35,5, 37,4, 38,3, 41,8,46,0, 5 47,2, 50,4, 51,7, 56,7, 94,0,126,7, 165,2, 172,5, 176,7, 198,1.

Teoria: C 69,54 i H 7,30; Znaleziono: C 69,29 i H 7, 17.

Przykład 6C

Schemat 1: Etap 3D: Metoda I: Synteza γ-laktonu 9,11a-eeoksy-17a-hydroksy-3-oksopregn^-eno^a^ 1 -dikarbo k syl an u

189 339

0,2 M roztwór enestru o wzorze IIA w chlorku metylenu połączono z 2 równoważnikami fosforanu dipotasowego rozpuszczonego w równym ciężarze wody (50% (wagowo) wodny roztwór), 3 równoważnikami chlorodifluoro-acetamidu i 22 równoważniami nadtlenku wodoru (dodanego jako 30% wodny roztwór). Całość mieszano w temperaturze 25°C przez 23 godziny. Środowisko reakcji rozcieńczono ilością wody równą załadunkowi nadtlenku wodoru i oddzielono chlorek metylenu. Porcję chlorku metylenu przemyto raz 3% roztworem siarczynu sodu (objętość równa 1,75 załadunku nadtlenku wodoru). Oddzielono porcj chlorku metylenu i wysuszono nad siarczanem sodu. Roztwór zatężono przez destylację pod ciśnieniem atmosferycznym, aż temperatura głowicy osiągnęła 70°C. Pozostałość oceniono przez HPLC, 'h i ¹³C NMR (CDCI3). Wydajność epoksymeksrenonu oznaczono jako 54,2% powierzchni przez HPLC.

Przykład 6D

Schemat 1: Etap 3D: Metoda J: Synteza γ-laktonu 9,1l7-eβoksy-17α-hydroksy-3-okso-pregn^-eno^^ 1 -dikarboksylanu wodoro-metylowego

Procedurę z przykładu 6C powtórzono, stosując heptafluorobutyroamid (CF3CF2CF2-CONH2) zamiast chlorodifluoroacetamidu. Wydajność epoksymeksrenonu oznaczono jako 58,4% powierzchni przez HPLC.

Przykład 7: Epoksydowanie enestru o wzorze IIA przy użyciu toluenu

Schemat 1: Etap 3D: Metoda K: Synteza γ-laktonu 9,1l7-epoksy-17-hydroksy-3-okso-pregn^-eno^^ 1 -dikarboksylanu wodoro-metylowego

Enester o wzorze IIA przekształcono epoksymeksrenon metodą generalnie opisaną w przykładzie 11, z wyjątkiem tego, że użyto toluenu jako rozpuszczalnika. Materiały załadowane do reaktora obejmowały enester (2,7 g), trichloroacetamid (2,5 g), wodorofosforan dipotasowy (1,7 g), nadtlenek wodoru (17,0 20 g) i toluen (50 ml). Pozwolono na wydzielanie się ciepła w reakcji do temperatury 28°C i zakończyła się po 4 godzinach. Otrzymaną trójfazową mieszaninę ochłodzono do temperatury 15°C, przesączono, przemyto wodą i suszono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 2,5 g produktu.

Przykład 8

Schemat 2. Metoda C: Epoksydowanie związku XVIIA przy użyciu trichloroacetamidu

Związek XVIIA (2 g) rozpuszczono w 25 ml chlorku metylenu. Dodano trichloroacetamid (2 g), fosforan dipotasowy (2 g). Przy mieszaniu w temperaturze pokojowej dodano 30% nadtlenek wodoru (10 ml) i mieszanie kontynuowano przez 18 godzin, uzyskując epoksyd (1,63 g). Nie utworzył się produkt Baeyera-Villigera.

Przykład 9

Schemat 1: Etap 3D: Metoda C: Synteza γ-laktonu 9,1 l7-epoksy-17α-hydroksy-3-oksoprogn^-eno^^ 1 -dikarboksylanu wodoro-metylowego

Do reaktora o pojemności 100 ml wprowadzono enester o wzorze IIA (5,4 g, o zawartości 74,4% enestru). Do enestru dodano trichloroacetamid (4,9 g) i wodorofosforan dipotasowy (3,5 g) oba w stałej postaci, potem chlorek metylenu (50 ml). Mieszaninę ochłodzono do temperatury 15°C i dodano 30% nadtlenek wodoru (25 g) w ciągu 10 minut. Pozwolono dojść mieszaninie reakcyjnej do temperatury 20°C i mieszano w tej temperaturze przez 6 godzin, po tym czasie sprawdzono konwersję na drodze HPLC. Oznaczono pozostały enester jako mniej niż 1% wagowo.

Mieszaninę reakcyjną dodano do wody (100 ml), pozostawiono fazy do rozdzielenia i usunięto warstwę chlorku metylenu. Dodano do warstwy chlorku metylenu wodorotlenek sodu (0,5N; 50 ml). Po 20 minutach fazy pozostawiono do rozdzielenia i dodano HCl ((0,5N; 50 ml) do warstwy chlorku metylenu, po czym fazy pozostawiono do rozdzielenia i fazę organiczną przemyto nasyconą solanką (50 ml) Warstwę chlorku metylenu wysuszono nad siarczanem j-* —--—---j-----c--------<_ \- - ----, ---- t ----------^w J magnezu i usunięto rozpuszczalnik. Otrzymano białe ciało stałe (5,7 g). Wodną warstwę wodorotlenku sodu zakwaszono i ekstrahowano, a ekstrakt poddano obróbce, otrzymując dodatkowe 0,2 g produktu. Wydajność epoksymeksrenonu wyniosła 90,2%.

Przykład 10

Schemat 1: Etap 3C: Metoda E: Wytwarzanie γ-laktonu 17α-hydroksy-3-oksopregnα4,9(11)-dieno-7α,21-dikarboksylanu wodoro-metylowego

189 339

Do tróJsryenee okrągłodennej kolby o pojemności 2 litrów, zaopatrzonej w mieszadło mechaniczne, wkraplacz i termoparę wprowadzono hydroksyester (100 g; 0,22 mola). Używano obiegowej łaźni chłodzącej z automatyczną kontrolą temperatury. Przed reakcją kolbę wysuszono ze względu na wrażliwość chlorku metanosulfonylu na wodę.

Do kolby wprowadzono chlorek metylenu (1 litr) i hydroksyester rozpuścił się w nim przy mieszaniu. Roztwór ochłodzono do temperatury 0°C i przez wkraplacz dodano do kolby chlorek metanosulfonylu (25 ml; 0,32 mola). Do reaktora dodano przez wkraplacz trietyloaminę (50 ml; 0,59 mola) i wkraplacz przemyto dodatkowo chlorkiem metylenu (34 ml). Dodanie trietyloaminy było bardzo egzotermiczne. Czas dodawania wyniósł około 10 minut przy mieszaniu i chłodzeniu. Mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C i utrzymywano w tej temperaturze przy mieszaniu przez dodatkowe 45 minut, podczas gdy górną przestrzeń kolby reakcyjnej przedmuchano azotem. Próbkę mieszaniny reakcyjnej analizowano potem przy użyciu chromatografii cienkowarstwowej i wysokosprawnej chromatografii cieczowej dla sprawdzenia zakończenia reakcji. Mieszaninę następnie mieszano w temperaturze 0°C przez dodatkowe 30 minut i ponownie sprawdzono zakończenie reakcji. Analiza wykazała, że reakcja istotnie zakończyła się w tym punkcie; rozpuszczalnik chlorek metylenu odpędzono w temperaturze 0°C przy 660 mm Hg. Analiza przez chromatografię gazową destylatu wykazała obecność zarówno chlorku metanosulfonylu jak trietyloaminy. Potem dodano do reaktora chlorek metylenu (800 ml) i powstałą mieszaninę mieszano przez 5 minut w temperaturze w zakresie 0-15°C. Rozpuszczalnik znów odpędzono w temperaturze 0-5°C przy 660 mm Hg, uzyskując mesylan o wzorze IV, w którym r9 oznacza H, -A-A- i -B-B- oznacząją-CH2-CH2-, a R¹ oznacza metoksykarbonyl. Czystość produktu wyniosła 90-95 w % powierzchni.

Aby wytworzyć reagent eliminujący zmieszano mrówczan potasu (23,5 g; 0,28 mola), kwas mrówkowy (80 ml) i bezwodnik octowy (40 ml) w oddzielnym suchym reaktorze. Kwas mrówkowy i bezwodnik octowy przepompowano do reaktora i podczas dodawania bezwodnika octowego utrzymywano temperaturę nie wyższą niż 40°C. Mieszaninę stanowiącą reagent eliminujący ogrzewano do temperatury 70°C, aby pozbyć się wody z układu reakcyjnego. Tę reakcję kontynuowano, aż zawartość wody była nizszą niż 0,3% wagowo, jak mierzono przy pomocy analizy Karla Fishera. Roztwór reagenta eliminującego przeniesiono następnie do reaktora, zawierającego stężony roztwór surowego mesylanu, wytworzony jak opisano wyżej. Otrzymaną mieszaninę ogrzewano do temperatury najwyżej 95°C i odbierano lotny destylat, aż destylat juz się nie tworzył. Destylację przerwano w temperaturze około 90°C. Po zakończeniu destylacji mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 95°C przez dodatkowe 2 godziny i zakończenie reakcji sprawdzono przez chromatografie cienkowarstwową. Gdy reakcja zakończyła się, ochłodzono reaktor do temperatury 50°C i usunięto z mieszaniny reakcyjnej kwas mrówkowy oraz rozpuszczalnik przy 660 mm Hg w temperaturze 50°C. Koncentrat ochłodzono do temperatury pokojowej, dodano potem octan etylu (688 ml) i mieszaninę octanu etylu i koncentratu mieszano przez 15 minut. Wtedy wprowadzono 12% roztwór solanki (688 ml), żeby pomóc w usunięciu zanieczyszczeń rozpuszczalnych w wodzie z fazy organicznej. Następnie pozostawiono fazy do odstania na 20 minut. Warstwę wodną przeniesiono do innego naczynia, do którego wprowadzono dodatkową ilość octanu etylu (350 ml). Powtórną ekstrakcję warstwy wodnej wykonano przez 30 minut, po czym pozostawiono fazy do odstania i połączono warstwy octanu etylu. Do połączonych warstw octanu etylu dodano nasycony roztwór chlorku sodu (600 ml) i prowadzono mieszanie przez 30 minut. Potem fazy pozostawiono do odstania. Warstwę wodną usunięto. Wykonano dodatkowe mycie chlorkiem sodu (600 ml). Fazę organiczną oddzielono od drugich końcowych przemywek. Następnie fazę organiczną przemyto IN wodorotlenkiem sodu (600 ml) przy mieszaniu przez 30 minut. Fazy odstawały się przez 30 minut, żeby usunąć wodną warstwę. Sprawdzono pH wodnej warstwy i znaleziono, ze wynosi >7. Prowadzono dalsze mycie nasyconym roztworem chlorku sodu (600 ml) przez 15 minut.

Ostatecznie zatężono fazę organiczną przy 660 mm Hg w temperaturze 50°C i produkt odzyskano przez filtrację. Końcowy produkt był piankowatym brązowym ciałem stałym, które suszono. Dalsze suszenie w temperaturze 45°C pod zmniejszonym ciśnieniem przez 24 godziny dało 95,4 g produktu, enestru, γ-laktonu 17a-hydroksy-3-oksopregna-4,9(l l)-dieno189 339

7α,21-aSkarUoksylanu wuaorunmeSyiowego, w którym ozzaczozu 68,8%. Muluwa wydajnuść wyziusła 74,4% skuryguwaza dla wyJśeiuwego hydroSsaesSru i kuńcuwegu enestru.

Przykład 11

Schemat 1: Etap 3D: Metoda F: Synteza Y-laktozu 9,21α-epuSsa-17α-hyaruSsy-3-uSso-pregz-4neno-7α,21 -aikarUoksylanu woauru-meSyluwtgu

Ezester u wzurze ΠΛ przekszSałcuno na epuSsymeksrenun, jak upisazu w przykładzie 2, z wyjątkiem tegu, że temperatura reakcji w tym przykładzie wyzusiła 28°C. Materiały załaaowaze du reaktora uUeJmowała ezester (2,7 g), triehiuruaeeSamSd (2,5 g), woaurufusfuraz diputasuwy (1,7 g), nadtlenek wuduru (17,0 g) i chloreS metylenu (50 ml). Pu 4 godzizach reakcji puzustatość ezestru wyziusła puniżej 2% wubec załadunku ezestru. Pu oUr0bee, jak upisazu w przykładzie 2, utrzymanu 3,0 g tpoSsymtS:srezuzu.

Claims (8)

1. Sposób wytwarzania, związków epoksy, obejmujący zetknięcie zwiąeku suZstratowego, zawierającegu podwójne wiązanie ulefinuwe, ze związkiem nadtlenku wam w ubecnuści aktywatora nadtlenkuwegu, przy czym wamieniuna aktawatur nadtlenkuwa uznacza chlurudifluuruacetamid lub udpuwiada związkuwi u wzurze:

X¹ O

9 I n H x²-c-r^p-c-nh₂

X³ znamienny tym żeR wabiera się z grupa, składającej się z grupa alkenaluwej, alkinaluwej i -(CX⁴X⁵)2-, Χί, X², X³, X⁴ i X⁵ wabiera się niezależnie spuśród atumu fluurowca, atumu wuduru, grupa alkiluwej, fluoruwcualSiluwej i cajanuwej uraz cajanoalSSluwej, pud warunkiem, ze cu najmniej jeden z X4 i X5 uznacza chluruwiec.

2. Spusób według zastrz. 1, znamienny tym, ze n wanusi 0 i cu najmniej dwa X¹, X2 i X3 uznaczają chluruwiec lub nadfluuruwcualkSl.

3. Spusób według zastrz. 1, znamienny tym, że wszystkie X1 X2, x3 chlorowiec lub nadfluorowcoalSil.

4. Spusób według zastrz. 1, znamienny tym, że wymienSony aktawatur nadtlenkuwa wabiera się z grupa, składającej się z chlurudifluoruacetamSdu i heptafluurubutyroamidu.

5. Spusób według zastrz. 1, znamienny tym, że wymieniuny związek substratowa udpuwiada wzurowi II:

X4 i X5 uznaczają znamienny tym, ze -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i r5 wabiera się niezależnie z grupa składającej się z atumu wuduru, fluoruwca, grupa hadruksa, niższej alkSloweJ, niższej alkuksa, ,hadroksyalkSlowęj, alkoksyalkiloweJ, hydroksySarbonylowej, cą-janu i araluksa, R1 reprezentuje alfa-zurientowaną niższą grupę alkuSsykarbunyluwą lub grupę hadroksySarbunaluwą, -B-B-reprezentuJe grupę -CHR⁶-CHr⁷ lub α-albu β-zurientuwaną grupę:

—ch-ch₂-ch— iii gdzie R5 i r7 wabiera się niezależnie z grupa składającej się z atumu wuduru, fluoruwca, niższej a^ks^ acylOwej, had’ruSsyalkSluweJ, aίkoksaalkSlowej, hydruSsakarbonyluwej, alkiluwej, alSuSsySarbunaluweJ, acyluSsaalkiloweJ, cajanu i aryloksa, uraz R⁸ i R⁹ wabiera się niezaleznie z grupa składającej się z atumu wuduru, grupa hadruksa, fluurowca, niższej grupa al^ksy acaluwej, hadroSsaalSsluwej, alkuSsyalSSluweJ, hadruSsaSarbunalualkSluwęj, al^ksaSarbonyloalkiluweJ, acaluksaalSSluweJ, cyJanu i a^^ksy albu R i r9 razem ubejmują karbucykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścienioawą, albu r8 i r9 razem z R⁶ i r7 ubejmują

189 339 karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D.

6. Sposób według z zastrz. 5, znamienny tym, że R³ oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR-CHR⁵-, -B-B- reprezentuje grupę -CHR⁶-CHR⁷-, R⁴, R⁵, R⁶ i R⁷ każdy oznacza atom wodoru.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wymieniony substrat związku wybiera się z grupy, składającej się z:

i produkt reakcji epoksydacji wybiera się z grupy, składającej się z:

o

189 339

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze wymieniony substrat związku wybiera się z grupy, składającej się z:

i produkt reakcji epoksydacji wybiera się z grupy, składającej się z: