PL189757B1

PL189757B1 - 3-keto-7alfa-alkoksykarbonylo lub 7alfa-hydroksykarbonylo podstawione związki steroidowe

Info

Publication number: PL189757B1
Application number: PL97368692A
Authority: PL
Inventors: John S. Ng; Chin Liu; Dennis K. Anderson; Jon P. Lawson; Joseph Wieczorek; Sastry A. Kunda; Leo J. Letendre; Mark J. Pozzo; Yuen-Lung L. Sing; Ping Wang; Edward E. Yonan; Richard M. Weier; Thomas R. Kowar; Julio A. Baez; Bernhard Erb
Original assignee: Gdsearle & Co; Searle & Co
Priority date: 1997-06-11
Filing date: 1997-12-11
Publication date: 2005-09-30
Also published as: AR060624A2; ZA985088B; AR043268A1; TWI277620B; TWI248443B; TW200606174A

Abstract

1. Zwiazek o wzorze 301 : którym: R1 oznacza alfa-zorientowany nizszy alkoksykarbonyl lub hydroksykarbonyl; -A-A- oznacza grupe -CHR4 -CHR5 - lub -CR4 =CR5 -; R3 , R4 i R 5 sa niezaleznie wybrane z grupy obejmujacej wodór, fluorowiec, hydroksyl, nizszy alkil, nizszy alkoksyl, hydroksyalkil, alkoksyalkil, hydroksykarbonyl, cyjano, i aryloksyl; -B-B- oznacza grupe -CHR6 -CHR7 - lub alfa- albo beta-zorientowana grupe: gdzie R6 i R7 sa niezaleznie wybrane z grupy obejmujacej wodór, fluorowiec, nizszy alkoksyl, acyl, hydroksyalkil, alkoksyalkil, hydroksykarbonyl, alkil, alkoksykarbonyl, acyloksyalkil, cyjano, i aryloksy; i R8 i R9 sa niezaleznie wybrane z grupy obejmujacej wodór, hydroksyl, fluorowiec, nizszy alkoksyl, acyl, hydroksyalkil, alkoksyalkil, hydroksykarbonyloalkil, alkoksykarbonyloalkil,-acyloksyalkil cyjano aryloksyl lub R8 i R9 razem obejmuje karbocykliczna lub heterocykliczna strukture pierscieniowa, lub R albo R razem z R lub R7 obejmuja karbocykliczna lub heterocykliczna strukture pierscieniowa skondensowana z pentacyklicznym pier- scieniem D. PL PL PL

Description

Związek o wzorze V odpowiada strukturze:

V

3 8 ♦ 9 gdzie -A-A-, -B-B-, R , R , R i R są takie jak określono we wzorze IV.

Związek VA odpowiada wzorowi V gdzie r8 i r9 razem z atomem węgla pierścienia, do którego są dołączone, tworzą strukturę:

7) IIIH( CH,) , - C ° X

XXXIV

2 · . » gdzie X, Y , Y i C(17) są takie jak określono powyżej.

189 757

Związek o wzorze VB odpowiada wzorowi V gdzie r8 i r9 razem tworzą strukturę o wzorze XXXIII:

XXXIII

Związki o wzorach odpowiednio VC, VD i VE odpowiadają każdemu wzorowi V, VA lub VB gdzie każdy z -A-A- i -B-B- oznacza -CH2-CH2, R3 oznacza atom wodoru i R1 oznacza grupę alkoksykarbonylową, korzystnie metoksykarbonylową. Związki wchodzące w zakres wzoru V można wytworzyć przez reakcję alkoholanu metalu alkalicznego z odpowiadającym związkiem o wzorze VI.

Związek o wzorze VI odpowiada strukturze:

Q Q gdzie -A-A-, -B-B-, R , R i R są takie jak określono we wzorze IV.

Figura 1 jest schematem sposobu biokonwersji kanrenonu lub pochodnej kanrenonu do odpowiadającego związku Ha-hydroksylowego;

Figura 2 jest schematem zalecanego sposobu biokonwersji/ 11-a-hydroksylacj i kanrenonu i pochodnych kanrenonu;

Figura 3 jest schematem szczególnie zalecanego sposobu biokonwersji/11-α-hydroksylacji kanrenonu i pochodnych kanrenonu;

Figura 4 ukazuje rozkład wielkości cząstek dla kan^ienonu jaki wytworzono zgodnie ze sposobem według fig. 2;

oraz fig. 5 ukazuje rozkład wielkości cząstek dla kanrenonu jaki wyjałowiono w bioreaktorze tran sformacyjnym zgodnie ze sposobem według fig. 3.

Odpowiednie litery odniesienia wskazują odpowiadające części w rysunkach.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, wymyślono różne nowe schematy sposobu wytwarzania epoksymeksrenonu i innych związków, odpowiadających wzorowi I:

gdzie: -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR⁵- lub -CR⁴—CR⁵-; R³, R⁴ i R5 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, chlorowca, grupy hydroksy, niższej alkilowej,

189 757 niższej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy; Ri reprezentuje a-zorientowaną grupę niższą alkoksykarbonylową lub grupę hydro^ykarbonykwą; -B-B-reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo e-zorientowaną grupę:

r⁷

CH-CH

I I

-CH— CH₂ — CH —

III gdzie Rł i Rł wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, chlorowca, niższej alkoksy, acylowej, hydooksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hyZroklnkarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy; oraz R8 i r9 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydrok^, chlorowca, niższej grupy alkoksy, acylowej, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroklykαrbonylowej. alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i ary^^y, albo R^? i R9 razem obejmują karbocykliceną lub heterocykliczni strukturę pierścieniową, albo r8 i r9 razem z r6 i r7 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D.

Z wyjątkiem oznaczeń przeciwnych, grupy organiczne przytaczane jako „niższe” w niniejszym opisie zawierają w większości 7, a korzystnie od 1 do 4 atomów węgła.

Niższą grupę alkoksykarbonylową oznacza korzystnie grupa, pochodząca od grupy alkilowej, mającej od 1 do 4 atomów węgla, takiej jak grupa metylowa, etylowa, propylowa, izopropylowa, butylowa, ieobutwlowa, sec-butylowa i tert-butylową; zwłaszcza zaleca się grupę metoklykarbonylowo. etoklykarbonylową i izopropoksykarbonylową. Niższa grupa alkoksy korzystnie oznacza grupę, pochodzącą od jednej z wyżej wspomnianych grup C1-C4 alkilowych, zwłaszcza od pierwlzooeędowwch grup C1-C4 alkilowych, szczególnie zaleca się grupę metoksy. Niższą grupę alkanoilową oznacza korzystnie grupa, pochodząca od pooltoaańcuchowej grupy alkilowej, mającej od 1 do 7 atomów węgla; zwłaszcza zaleca się grupę formylowa i acetylową.

Mostek metylenowy w pozycji 15, 16 jest korzystnie ---orn^ier^o^^^aany.

Zalecaną klasą związków, które można wytwarzać zgodnie ze sposobami według wynalazku, są związki 20-lpiroklαnowe opisane w opisie patentowym U.S. nr 4 559 332, to jest tych, które odpowiadają wzorowi IA:

w którym -A-A- reprezentuje grupę -CH2-CH2 lub -CH=CH-; -B-B- reprezentuje grupę -CH2-CH2- lub a- albo β-zorientowaną grupę o wzorze IIIA:

— ch — ch₂—CH—

IIIA

R1 reprezentuje niższą grupę alkoksnkarbonylowo o orientacji a, albo grupę hyZroksnkarbonnlową_; X reprezentuje dwa atomy wodoru, grupę okso lub =S; YR γ2 razem reprezen18

189 757 tujo mostek tlenowy -O- albo γ¹ oepreeentuje grupę hydroksy i γ¹ rppreeentujp goupę hydooksy, niżseo alkoksy lub, jeśli X oypoeeen3uje H₂, także niżseo alkanoiloksy.

K305ystnip, ewioeki 2e-spiroksanowp wytwareane nowymi sposobami według wynalaeku so tymi ewioekami o weoree I; w których γ1 i γ² oazem oepoeeen3ujo mostek tlenowy -O-.

Zwłasecea ealecanymi ewioekami o w5oo5P I so te, w których X oepreeentuje goupę okso. Ze ewioeków 20-spiooksanowych o weoree IA, w których X oepopeentujp goupę okso, najbaoZeiej ealeca się te, w których γ1 raeem e γ² reprezentujo mostek tlenowy -O-.

Jak już wspomniano, kwas 173-hydroksy-21 -karboksylowy może także występować w postaci swej soli. Bieoee się pod uwagę ewłasecea sole metalu i amonowe, takie jak metali alkalicenych i sole metali eiem alkalicenych, np. sodu, wapnia, magneeu i kooeystnie sole potasowe, ooae sole amonowe, pochodeoce od amoniaku lub odpowiednich, kooeystnie fiejologicenie tolerowanych organicenych easad, 5awipoajocych aeot. Zasadami branymi pod uwagę so nie tylko aminy, np. niżsee alkiloaminy (takie jak trietyloamina), hyiroksy-niżseealkiloaminy (takie jak 2-hydooksyetyloaminr, Zi-(2-hyZooksyetylo)amina lub toi-(2-hydooksyp3ylo)rmina, cykloalkiloaminy (takie jak dicykloheksyloamina) lub beneyloaminy (takie jak beneyloamina i N,N^,-Zibeneyl-)etylenodiαmiea), lece także ewioeki heterocyklicene, eawierajoce aeot, np. te o chaoak3poee aromatycznym (takie jak pirydyna i chinolina) lub te, które majo co najmniej ceęściowo nasycony pierścień heterocykliceny (takie jak N-etylopl^pe^raeyna, moofolina, pipeoaeyna lub N,N'-dimetylopiperaehna).

Wśród objętych ealecanych ewioeków so także sole metali alkalicenych, ewłasecea sole potasowe, ewioeków o weoree IA, w któoym R1 reprezentuje goupę alkoksykaobonylowo. poey eeym X reprezentuje goupę okso i każdy e γ1 i N¹ oepreeentuje goupę hydroksy.

Sec5ególnie ealecanymi 5wioekami o wzoozp I i IA so np. następujoce:

α, 11 a-epoksy-7 α-metoksykaobonyIo-2e-spiooks-4-eno-3,21 -dion,

9α,11 u-ρpoksy-7α-etoksykaobonylo-20-spiooks-44eno-3,21 -dion,

9α,Πα-ppoksy-7α-izo^kry^moksykarbonylo-20-spi4oks-4-eno-3,21-dion, ooae analogi 1,2-dehydoo każdego ee ewiąeków':

9α, 11 α-αpzmry-6[^:k7α-mmt\^geno-20-spiooks-4-eno-3,21 -dion, ⁹a, ¹¹ a-ρp3^ksy-⁶β,7β-metyleno-²⁰-spⁱoo^ks-4-eno-3,2¹ -^dion,

9a,11a-pp3ksy-63,7β;15β,lPβ-bismety03kO-40-soiro2k-Zi3no-3,21-dion, oraz analog 1,2d^^^^ro pażdego z. 7ych zwi6zków;

Zwas ka, 11 a-ey oye9-dki0^^tóksykarbonylo-l 7β-hydroksy-3-oksopregn-4-eno-21 -karboksylowy, kwa, kwas

9α, 11 a-epoksy-7a-etoksykarbonylo-17β-hydroksy-3-oksopregn-4-eno-21 -karboksy9α, 11 a-epoksy-7a-izopropoksykarbonylo-17β-hydroksy-3-oksopregn-4-eno-21 -karbokg^rowy, kwao Wy, 11 α-epoksy-17a-hydroksy^^-metyleno-3-oksopregn-4-eno-21 -karboksylowy, kwas 9α, 11 a-epoksy-17β-hydroksy-6β,7β-metyleno-3-oksopregn-4-eno-21 -karboksylowy, ^kwas 90,11 a^^e^^p^^^ks^y-¹^-hydroLsy-óp^;^m53,Πβ-b^- ometylepg-3-o^pso^krk^ok-⁰-3no-21 -karboksytow^ oraz 1ale metali alkhlizon^h, zw^dcza 7ole potetyyye lu^- kmonow-e każdej k tych ^kwa-ów^, a także odpowiadające analogi 1,2-dehydro każdego ze wspomnianych kwasów karboksy-oadch lub ieh soh;

e^za metylowy, eatza etylowy i esteoi9hzoopkktzpg kwawu 9ml l«-heokskrl5-k 16β-meSyl3no-e ,2 1 -diohzo-HO-spiroksA-enoU a-karboksylowego, pctpr i7nnrnnv1nwv trwa ci i Qr* 1 1 n-pnnVcv-1 SR 1 6R-------- _{keass 9α},_{11α P}p-----y ₁₅z,₁₆ y pctpr mptvlmvv pcfpr ptx/lmxrv

------------ystw,

-Ziokso-2eospiookuo4l,e-dieno-aα-neuyokrprowego, ester metylowy, ester etylowy i ester izopropylowy, kwasu 9a,l la-epoksy-20-spiroks-4-eno-7a-karboksylowego,

9α, 11 a-epoksy-63,73-metyleno-20-spiroks-4-en-3 -on, 9a,lla-epoksy-63,73;153,163-bismetyleno-20-spiroks-4-en-3-on,

189 757 ester metylowy, ester etylowy i ester izopropylowy, kwasu 9a,11a-epoksy-17e-hydroksy-17(e(-3-hydroks)βiropylo)-3-oksoandrost-4eeno-7α-bαrboksylowego,

9a, 11 a-epoksy-17 fl^hyd^rri^ 17a(3-hydroksypropyloa-6a,7aemetylenoandroste4-en-3-on,

9a, 11 β-epoksy- 17[3^-h^<^riro^ 7a(3-hydrobsypropylo)e6β,7βeraetylenoandrost-4-en-3eon,

9a, 11 a-epoksy- 17e-hydroksy-17a(3ehydraksypropylo)-6β,7β, 15β, 16e-bismetylenoanderost-4-en-3ean, łącznie z analogami Ua-P-acetoksypropylo) i 17α-(3eformyloksypraβyla) wspomnianych związków androstanowych, a także analogi 1,2-dehydro wszystkich wspomnianych związków szeregu androst-4-erle3eonιl i 20-sproks-4-en-3-onu.

Nazwy chemiczne związków o wzorach I i IA i związków analogicznych, mających takie same charakterystyczne cechy strukturalne, są zgodne z aktualnym nazewnictwem w następujący sposób: dla związków, w których Y1 razem z Y2 reprezentują -O-, od 2-spiroksanu (np. związek o wzorze LA, w którym X reprezentuje grupę okso i Y^{1 * III} razem z Y¹ reprezentują O- pochodzi od 20espirabsan-21eonu); dla tych, w których każdy z Y1 i Y2 reprezentuje grupę hydroksy i X reprezentuje grupę okso. od kwasu 17βehydroksy-17α-pregnenoe21 karboksylowego; i dla tych, w których każdy z Y 'i Y2 reprezentuje grupę hydroksy i X reprezentuje dwa atomy wodoru, od 17e-hydroksy-17a-(3-hydrokspropylo)androstanu. Ponieważ postacie cykliczne i o otwartych łańcuchach, czyli laktony oraz kwasy 17β-hydroksy-21ekarboksylowe i ich sole, odpowiednio, są ściśle spokrewnione jeden z drugim tak, że ten drugi może być uznany jedynie za postać hydratu tego pierwszego, należy rozumieć, że to co było wcześniej w niniejszym i to co nastąpi w niniejszym, z wyjątkiem oznaczeń przeciwnych, w obu produktach końcowych o wzorze I i w materiałach wyjściowych oraz produktach pośrednich o analogicznej strukturze, w każdym wypadku wszystkie wymienione postacie razem.

Zgodnie z wynalazkiem, obmyślono kilka oddzielnych schematów sposobu wytwarzania związków o wzorze I w wysokiej wydajności i przy rozsądnych kosztach. Każdy ze schematów syntezy następuje poprzez wytworzenie szeregów związków pośrednich. Liczne z tych związków pośrednich są związkami nowymi, i sposoby wytwarzania tych związków pośrednich są sposobami nowymi.

Schemat 1 (poczynając od kanrenonu lub materiału pokrewnego)

Jednym zalecanym schematem sposobu wytwarzania związków o wzorze I, korzystnie rozpoczyna się kanrenonem lub pokrewnym materiałem odpowiadającym wzorowi XIII (albo alternatywnie, sposób może się zacząć androstendianem lub pokrewnym materiałem wyjściowym)

gdzie -A-A- reprezentuje grupę CHR4-CHR⁵- lub -CR4=CR⁵-; R³, r4 i r5 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, chlorowca, grupy hydroksy, niższej alkilowej, niższej alkoksy, hydroksyαlkilowej. alkoksyalkϊlowej. hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy; -B-B- reprezentuje grupę -CHIĆ-CI IR⁷ lub a- albo β-zorientowaną grupę:

π . n \ z

CH-CH

I I

-CH—CHj-CH—

III gdzie r6 i r7 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, chlorowca, niższej alkoksy, acylowej, hydroksyalkilowej, alkaksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy; oraz r8 i R9 wybiera się

189 757 niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydroksy, chlorowca, niższej grupy alkoksy, acylowej, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, albo R i R⁹ razem obejmują kar bocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, albo R⁸ i R^y razem z R° i R^z obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D.

Stosując sposób biokonwersji typu zilustrowanego w fig. 1 i 2, grupę 11-hydroksy o orientacji a wprowadza się do związku o wzorze ΧΙΠ, wytwarzając przez to związek o wzorze VIII:

gdzie -A-A-, -B-B-, R³, R⁸ i R⁹ są takie jak określono we wzorze XIII. Korzystnie, związek o wzorze ΧΠΙ ma strukturę

ΧΙΙΙΑ i produkt 1 Ια-hydroksy ma strukturę

VIIIA w której każdy -A-A- reprezentuje grupę -CH2-CH2- lub -CH=CH=; -B-B- reprezentuje grupę -CH2-CH2- lub grupę α lub β-zorientowaną:

-CH—CHj-CH—

IIIA

R³ oznacza atom wodoru, niższą grupę alkilową lub niższą alkoksy; X reprezentuje dwa atomy wodoru, grupę okso lub —S, Y i Y razem reprezentują mostek tlenowy -O- lub Y¹ reprezentuje grupę hydroksy i Y² reprezentuje niższą grupę alkoksy albo, jeśli X reprezentuje H2, także niższą alkanoiloksy; oraz sole związków, w których X reprezentuje grupę okso i Y² reprezentuje grupę hydroksy. Korzystniej, związek o wzorze VIIIA wytwarzany w reakcji, odpowiada związkowi o wzorze VIIIA gdzie -A-A- i -B-B- oznaczają każdy grupę

189 757

-CH2-CH2-; R3 oznacza atom wodoru; Y\ Y2 i X są takie jak określono we wzorze XIIIA; i R⁸ i R⁹ razem tworzą strukturę 20-spiroksanu:

o

UHII.

Wśród zalecanych organizmów, które można stosować w tym etapie hydroksylach, są Aspergillus ochraceus NRRL 405, Aspergillus ochraceus ATCC 18500, Aspergillus niger ATCC 16888 i ATCC 26693, Aspergillus nidulans ATCC 11267, Rhizopus oryzae ATCC 11145, Rhizopus stolonifer ATCC 6227b, Str^p^tomyces fradiae ATCC 10745, Bacillus megaterium ATCC 14945, Pseudomonas cruciviae ATCC 13262 i Trichothecium roseum ATCC 12543. Innymi zalecanymi organizmami są Fusarium oxysporum f.sp.cepae ATCC 11171 i Rhisopus arrhizus ATCC 11145.

Inne organizmy, które wykazały aktywność dla tej reakcji obejmują Absidia coerula ATCC 6647, Absidia glauca ATCC 22752, Actinomucor elegans ATCC 6476, Aspergillus flavipes ATCc 1030, Aspergillus fumigatus ATCC 26934, Beauveria bassiana ATCC 7159 i ATCC 13144, Botryosphaeria obtusa IMI 038560, Calonectria decora ATCC 14767, Chaetomium cochliodes ATCC 10195, Corynespora cassiicola ATCC 16718, Cunninghamaella blakesleeana ATCC 8688a, Cunninghamella echinulata ATCC 3655, Cunninghamella elegans ATCC 9245, Curvularia ciavata ATCC 22921, Curvularia lunata ATCC 12017, Cylindrocarpon radicicola ATCC 1011, Epicoccum humicola ATCC 12722, Gongronella butleri ATCC 22822, Hyporayces chrysospermus ATCC IMI 109891, Mortierella isabellina ATCC 42613, Mucor mucedo ATCC 4605, Mucor griseo-cyanus ATCC 1207A, Myrothecium verrucaria ATCC 9095, Nocardia corallina ATCC 19070, Paecilomysces carneus ATCC 46579, Penicillum patulum ATCC 24550, Pithomyces atro-olivaceus IFO 6651, Pithomyces cynodontis ATCC 26150, Pycnosporium sp. ATCC 12231, Saccharopolyspora erythrae ATCC 11635, Sepedonium chrysospermum ATCC 13378, Stachylidium bicolor ATCC 12672, Streptomyces hygroscopicus ATCC 27438, Streptomyces pur^Diinasieens ATCC 25489, Syncephalastrum racemosum ATCC 18192, Thamnostylum piriforme ATCC 8992, Thielavia terricola ATCC 13807 i Verticillium theobromae ATCC 12474. .

Inne organizmy, u których można spodziewać się aktywności dla l a a-hydrornsylacji, obejmują Cephalosporium aphidicola (Phytochemistry (1996), 42(2), 411-415), Cochliobolus lunatas (J.Biotechnol. (1995), 42(2), 145-150), Tieghemella orchidis (Khim.-Farm.Zh. (1986), 20(7), 871-876), Tieghemella hyalospora (Khim.-Farm.Zh. (1986), 20(7), 871-876), Monosporium olivaceum (Acta Microbiol.Pol.Ser.B. (1973), 5(2), 1O3-110), Aspergillus ustus (Acta Microbiol.Pol.Ser.B. (1973), 5(2), 103-110), Fusarium graminearum (Acta Microbiol.Pol.Ser.B. (1973), 5(2), 103-110), Verticillium glaucum (Acta Microbiol.Pol.Ser.B. (1973), 5(2), 103-110), i Rhizopus nigricans (J. Steroid Biochem. (1987), 28(2), 197-201).

Pochodne 11 β-hydroksy androstendionu i meksrenonu można wytwarzać zgodnie ze sposobem biokonwersji przedłożonym w przykładach 19A i 19B, odpowiednio. Wynalazcy zakładają przez analogię, że odpowiadający izomer β-hydroksy związku o wzorze VIII, mający podstawnik p-hydroksy przy Cl1 zamiast podstawnika α-hydroksy przy Cl1, można także wytworzyć przy użyciu podobnego sposobu biokonwersjii, wykorzystując odpowiednie dróbz i i 1 o + -»*n ·, e. o/óploz r^oT^łFan λ z ze /4 n ia i «» 110 F/Jrrtlznt/1 nm i łn ly·» ΐΛ/ΊίΙΜ /4'ΚοΤλτΛ d i iv uo li uj v ριζ,νριυ ννααΔΌΐιια i i ναιυικο tUAivu jua jvuvn ruu νινυκν· ustrojów opisanych w niniejszym.

Wytwarza się szczep komórek przygotowawczy do fermentacji na skalę produkcyjną hydroksylami Zanoenonu lub innych substratów o wzorze XIII, w układzie fermentacyjnym z posiewaniem, obejmującym bioreaktor do posiewania lub szeregi dwóch lub więcej bioreaktorów do posiewania. Pracującą podstawową zawiesinę spor wprowadza się do pierwszego bioreaktora do posiewania, razem z roztworem odżywczym dla wzrostu komórek. Jeśli objętość szczepu żądana lub potrzebna do produkcji przekracza tę w pierwszym bioreaktorze do posiewania, objętość szczepu można postępowo i geometrycznie powielać przez namnażanie

189 757 w pozostałych bioreaktorach, w ciągu bioreaktorów z posiewaniem. Korzystnie szczep wytworzony w układzie bioreaktorów z posiewaniem ma korzystną objętość i żywe komórki do osiągnięcia szybkiego początku reakcji w bioreaktorze produkcyjnym, relatywnie krótkie cykle produkcyjne fermentacji i wysoką aktywność bioreaktora produkcyjnego. Obojętnie jaka będzie ilość naczyń w ciągu bioreaktorów do posiewania, drugi i następne bioreaktory do posiewania są korzystnie takiej wielkości, aby wielkość rozcieńczenia w każdym etapie w ciągu była zasadniczo taka sama. Początkowe rozcieńczenie szczepu w każdym bioreaktorze do posiewania może być w przybliżeniu taka sama jak rozcieńczenie w bioreaktorze produkcyjnym. Kanrenon lub inny substrat o wzorze XIII ładuje się do bioreaktora produkcyjnego razem ze szczepem i roztworem odżywczym i zachodzi tam reakcja hydroksylacji.

Zawiesinę zarodników ładowaną do układu bioreaktorów do posiewania otrzymuje się z fiolek pracującej podstawowej zawiesiny zarodników, wziętych z wielu fiolek, stanowiących bank podstawowych komórek pracujących, który przechowuje się przed użyciem w warunkach kriogenicznych. Bank podstawowych komórek pracujących na odwrót, pochodzi z głównego banku zbioru komórek, wytworzonego w następujący sposób. Próbkę zarodników otrzymanych z odpowiedniego źródła, np. ATCC zawiesza się początkowo w pożywce wodnej, takiej jak np. roztwór soli, roztwór odżywczy lub roztwór środka powierzchniowo czynnego (np. środka powierzchniowo czynnego anionowego, takiego jak Tween 20 o stężeniu około 0,001% wagowego), i zawiesinę rozprowadza się wśród płytek hodowlanych, przy czym każda płytka niesie stalą mieszaninę odżywczą, zwykle opartą o niestrawne polisacharydy, takie jak agar, gdzie zarodniki namnażają się. Stała mieszanina odżywcza zwykle zawiera między około 0,5% i około 5% wagowych glukozy, między około 0,05 i około 5% wagowych źródła azotu, np. peptonu, między około 0,05 i około 0,5% wagowych źródła fosforu, np. fosforanu amonowego lub metalu alkalicznego, takiego jak wodorofosforan dipotasowy, między około 0,25% i około 2,5% wagowych lizatu drożdżowego lub ekstraktu (albo innego źródła aminokwasów, takiego jak ekstrakt mięsny lub infuzji mózgowo-sercowej), między około 1% i około 2% wagowych agaru lub innego niestrawnego polisacharydu. Ewentualnie, stała mieszanina odżywcza może dodatkowo obejmować i/lub zawierać między około 0,1% i około 5% wagowych ekstraktu słodowego. pH stałej mieszaniny odżywczej wynosi korzystnie między około 5,0 i około 7,0, ustawionego zgodnie z potrzebą wodorotlenkiem metalu alkalicznego lub kwasem ortofosforowym. Wśród użytecznych pożywek wzrostowych są następujące:

1. Pożywka stała #1: 1% glukoza, 0,25% ekstraktu drożdżowego, 0,3% K2HPO4 i 2% agar (Bacto); pH ustawione do 6,5 20% NaOH.

2. Pożywka stała #2: 2% pepton (Bacto), 1% ekstrakt drożdżowy (Bacto) 2% glukoza i 2% agar (Bacto), pH ustawione do 5 10% H3PO4.

3. Pożywka stała #3 : 0,1% peptydon (Bacto), 2% ekstrakt słodowy (Bacto), 2% glukoza i 2% agar (Bacto); pH jakie jest 5,3.

4. Płynna pożywka: 5% melasa z trzciny cukrowej, 0,5% płynu z moczenia kukurydzy, 0,25% glukoza, 0,25 NaCl i 0,5% KH2PO4; pH ustawione do 5,8.

5. Agar Difco Mycological (niskie pH).

Wiele z płytek agarowych używanych w rozwoju głównego banku zbioru komórek można selekcjonować pod względem przyszłych wymagań dla głównego zbioru, lecz zwykle wytwarza się tak około 15 do około 30 płytek. Po odpowiednim okresie wzrostu, np. 7 do 10 dni, płytki zdrapuje się w obecności wodnego podłoża, zwykle roztworu soli lub buforu, w celu zebrania prz.etrwalników, i otrzymaną główną zawiesinę zbiorczą dzieli się między małe fiolki, np. jednomililitrowe w każdej z wielu 1.5 ml fiolek. Aby wytworzyć pracującą zawiesinę zbiorczą prz.etrwalników do użytku w badaniach lub operacjach fermentacji produkcyjnej, zawartości jednej lub więcej tych fiolek z głównym zbiorem drugiego pokolenia, można porozdzielać i inkubować na płytkach agarowych w sposób opisanych powyżej dla wytwarzania głównej zawiesiny podstawowej prz.etrwalników. Jeśli rozważa się rutynowa operacje produkcyjne, można stosować aż 100 do 400 płytek do wytworzenia zbioru pracującego drugiego pokolenia. Każdą płytkę zdrapuje się do oddzielnej fiolki ze zbiorem pracującym, przy czym każda fiolka zwykle zawiera jeden ml wytworzonego szczepu. Dla stałej obserwacji, zarówno główną zawiesinę zbiorczą jak i szczep produkcyjny drugiego pokolenia

189 757 korzystnie przechowuje się w parującej strefie naczynia do przechowywania kriogenicznego, zawierającego ciekły N2 lub inny płyn kriogeniczny.

W sposobie ilustrowanym w fig. 1, wytwarza się wodną pożywkę wzrostową, która zawiera źródło azotu, takie jak pepton, pochodną drożdży lub równoważnik, glukozę i źródło fosforu, takie jak sól fosforanowa. Przetrwalniki drobnoustroju hoduje się w tej pożywce w układzie fermentacyjnym do posiewania. Zalecanym drobnoustrojem jest Aspergillus ochraceus NRRL 405 (ATCC 18500). Tak wytworzony szczep podstawowy wprowadza się następnie do bioreaktora produkcyjnego z substratem o wzorze XIII. Bulion fermentacyjny miesza się i napowietrza przez czas wystarczający do postępu reakcji do żądanego stopnia zakończenia.

Pożywka do bioreaktora do posiewania korzystnie obejmuje wodną mieszaninę, która zawiera: między około 0,5% i około 5% wagowo glukozę, między około 0,05% i około 5% wagowo źródło azotu, np. pepton, między około 0,05% i około 0,5% wagowo źródło fosforu, np. fosforan amonowy lub metalu alkalicznego, taki jak monozasadowy fosforan amonowy lub wodorofosforan dipotasowy, między około 0,25% i 2,5% wagowo lizat drożdżowy lub ekstrakt (lub inne źródło aminokwasów, takie jak gorzelniane substancje rozpuszczalne), między około 1% i około 2% wagowo agar lub inny niestrawny polisacharyd. Szczególnie zalecana pożywka wzrostowa do posiewania zawiera około 0,05% i około 5% wagowo źródło azotu, takie jak pepton, między około 0,25% i około 2,5% wagowo autolizowane drożdże lub ekstrakt drożdżowy, między około 0,5% i około 5% wagowo glukozę i między około 0,05% i około 0,5% wagowo źródło fosforu, takie jak monozasadowy fosforan amonowy. Szczególnie ekonomicznymi operacjami w sposobie uzyskuje się przez użycie innej zalecanej hodowli do posiewania, która zawiera między około 0,25% i około 5% wagowych płynu z namaczania kukurydzy, między około 0,25% i około 2,5% autolizowanych drożdży lub ekstraktu drożdżowego, między około 0,5% i około 5% wagowych glukozy i około 0,05% i około 0,5% wagowych monozasadowego fosforanu amonu. Płyn z namaczania kukurydzy jest szczególnie ekonomicznym źródłem białek, peptydów, węglowodanów, kwasów organicznych, witamin, jonów metali, pierwiastków śladowych i fosforanów. Płyny zacierowe z innych zbóż można stosować w miejsce, lub jako dodatek do płynu z namaczania kukurydzy. pH pożywki korzystnie reguluje się w zakresie między około 5,0 i około 7,0, np. przez dodanie wodorotlenku metalu alkalicznego lub kwasu ortofosforowego. Jeśli płyn z namaczania kukurydzy służy jako źródło azotu i węgla, pH reguluje się korzystnie w zakresie około 6,2 do około 6,8. Pożywkę, zawierającą pepton i glukozę reguluje się korzystnie do pH między około 5,4 i około 6,2. Wśród użytecznych pożywek do stosowania w fermentacji do posiewania:

1. Pożywka #1: 2% pepton, 2% drożdże autolizowane (lub ekstrakt drożdżowy) i 2% glukoza; pH ustawione do 5,8 20% NaOH.

2. Pożywka #2: 3% płyn z namaczania kukurydzy, 1,5% ekstrakt drożdżowy, 0,3% monozasadowy fosforan amonu i 3% glukoza; pH ustawione do 6,5 20% NaOH.

Przetrwalniki drobnoustroju wprowadza się do tej pożywki z fiolki zwykle zawierającej około 10⁹ przetrwalników na ml zawiesiny. Optymalną produktywność pokolenia do posiewania realizuje się jeśli rozcieńczenia pożywki wzrostowej na początku hodowli do posiewania nie zmniejsza gęstości populacji przetrwalników poniżej około 10⁷ na ml. Korzystnie, przetrwalniki hoduje się w układzie fermentacyjnym do posiewania dotąd aż objętość upakowanych miceli (PMV) w bioreaktorze wynosi co najmniej około 20%, korzystnie około 35% do około 45%. Ponieważ cykl w naczyniu fermentacyjnym do posiewania (lub każdym naczyniu z wielu, które obejmują ciąg fermentacyjny do posiewania) zależy od początkowego stężenia w tym naczyniu, może być pożądane zapewnienie dwóch lub więcej etapów fermentacji z posiewaniem, w celu przyspieszenia całości procesu. Jednakże, korzystne jest unikanie stosowania znacznie więcej niż trzech bioreaktorów do posiewania w szeregu, ponieważ aktywność może być kompromisowa jeśli fermentację z posiewem przeprowadza się przez nadmierną ilość etapów. Fermentację kultury do posiewu przeprowadza się przy mieszaniu w temperaturze w zakresie około 23° do około 37°C, korzystnie w zakresie między około 24° do około 37°C.

Kulturę z układu fermentacji do posiewu wprowadza się do bioreaktora produkcyjnego razem z produkcyjną pożywką wzrostową. W postaci realizacji według wynalazku, nie wyjałowiony kanrenon lub inny substrat o wzorze XIII służy jako substrat dla reakcji. Korzystnie,

189 757 substrat dodaje się do bioreaktora produkcyjnego w postaci 10% do 30% wagowych zawiesiny w pożywce wzrostowej. W celu zwiększenia powierzchni dostępnego obszaru dla reakcji ddα-hyZroksylacji. wielkość cząstek lubstraru o wzorze XIII zmniejsza się przez przepuszczenie lubstraru przez roeZrabniace mikoocząsteczkow^' wyłączony z linii, przed wprowadzeniem do bioreaktora. Wprowadza się także oddzielnie jałową pożywkę podstawową, zawierającą glukozę, oraz drugi roztwór odżywczy, zawierający pochodną doożdżową taką jak poddane autolizie drożdże (lub równoważny preparat aminokwasowy na podstawie alternatywnych źródeł, takich jak ooepuseceαlae substancje gorzelniane). Pożywka obejmuje wodną mieszaninę, zawierającą: między około 0,5% i około 5% wagowo glukozę, między około 0,05% i około 5% wagowo źródło azotu, np. pepton, między około 0,05% i około 0,5% wagowo źródła fosforu, np. fosforan amonowy lub metalu alkalicznego, takiego jak wod3rofolfooan dipotasowy, między około 0,25% i około 2,5% wagowo lizat drożdżowy lub ekstrakt (lub inne źródło aminokwasów, takie jak rozpuszczalne substancje gorzelniane), między około 1% i około 2% wagowo agar lub inny niestrawny polisacharyd. Szczególnie zaleca się proZukcnjao pożywkę wzrostową, zawierającą około 0,05% i około 5% wagowo źródło azotu, takiego jak pepton, między około 0,25% i około 2,5% wagowo drożdże poddane autolizie lub ekstrakt drożdżowy, między około 0,5% i około 5% wagowo glukozę i między około 0,05% i około 0,5% wagowo źródło fosforu, takie jak monozasadowy fosforan amonu. Inna zalecana produkcyjna pożywka wzrostowa zawiera między około 0,5% i około 5% wagowo płyn z namaczania kukurydzy, między około 0,25% i około 2,5% drożdże poddane autolizie łub ekstrakt drożdżowy, między około 0,5% i około 5% wagowo glukozę i około 0,05% i około 0,5% wagowo monoeαsαdown fosforan amonu. pH produkcyjnej pożywki fermentacyjnej korzystnie reguluje się w sposób opisany powyżej, w takich samych zakresach dla pH pożywki opartej 0 pepton/glukozę i pożywek opartych o płyn z aαmaceaaia kukurydzy, odpowiednio. Użyteczne pożywki wzrostowe do biokonwersji przedłożono poniżej:

1. Pożywka #1: 2% pepton, 2% drożdże po autolizie (lub ekstrakt drożdżowy) i 2% glukoza; pH ustawione do 5,8 20% NaOH.

2. Pożywka #2: 1% pepton, 1% drożdże po autolizie (lub ekstrakt drożdżowy) i 2% glukoza; pH ustawione do 5,8 20% NaOH.

3. Pożywka #3: 0,5% pepton, 0,5% drożdże po autolizie (lub ekstrakt drożdżowy) ί 0,5% glukoza; pH ustawione do 5,8 20% NaOH.

4. Pożywka #4: 3% płyn z n^aczania kukurydzy, 1,275% ekstrakt drożdżowy, 0,3% moa3ealadowy fosforan amonu i 3% glukoza; pH ustawione do 6,5 20% NaOH.

5. Pożywka #5: 2,55% płyn z aamaczaaia kukurydzy, 1,275% ekstrakt drożdżowy, 0,255% m3noeasadown fosforan amonu i 3% glukoza; pH ustawione do 6,5 20% NaOH.

6. Pożywka #6: 2,1% płyn z namaczania kukurydzy, 1,05% ekstrakt drożdżowy, 0,21% monozasadowy fosforan amonu i 3% glukoza; pH ustawione do 6,5 20% NaOH.

Nie wyjałowowiony kaaoenoa i jałowe roztwory odżywcze podaje się łańcuchowo do bioreaktora produkcyjnego w około pięciu do około dwudziestu, korzystnie około dziesięciu do około piętnastu, korzystnie zasadniczo równych porcjach do każdego cyklu produkcji seryjnej. Korzystnie, substrat wprowadza się początkowo w ilości wystarczającej do ustalenia stężenia, wynoszącego między około 0,1% wagowo i około 3% wagowo, korzystnie między około 0,5% i około 2% wagowo, przed zaszczepieniem posiewowym bulionem fermeatαcvjaym. następnie dodaje się okresowo, dogodnie co 8 do 24 godzin, do podstawowego stężenia, wynoszącego między około 1% i około 8% wagowych. Jeśli dodatkowo substrat dodaje się co 8 g3Zzia, całość dodatku może być nieco niższa, np. 0,25% do 2,5% wagowych, niż w wynadku sZv substrat dodaie sie tylko na aoZltαwie dziennch. W drun im nrzvnadku łączne dodaχ ν' «r u ν' x w>* x x *nie kanoenonu może wynosić w zakresie 2% do około 8% wagowych. Uzupełniającą mieszaninę odżywczą dodawaną podczas reakcji fermentacji jest koncentrat, np. mieszanina, zawierająca między około 40% i około 60% wagowo jałową glukozę i między około 16% i około 32% wagowo jałowy ekstrakt drożdżowy lub inne jałowe źródło pochodnej drożdżowej (lub inne źródło aminokwasów). Ponieważ ^^ιΟι, dodawany do bioreaktora produkcyjnego z fig. 1 nie jest jałowy, okresowo do bulionu fermentacyjnego dodaje się antybiotyki, w celu kontroli niepożądanych organizmów. Antybiotyki, takie jak kaeamncnea. tetracyklina i cefaleksnaα można dodawać bez niekorzystnego wpływu na wzrost i biokonweosję. Koozyst189 757 nie, wprowadza się je do bulionu fermentacyjnego w stężeniu, wynoszącym np. między około 0,0004% i około 0,002% na podstawie całej ilości bulionu, zawierającego np. między około 0,0002% i około 0,0006% siarczanu kanamycyny, między około 0,0002% i około 0,006% tetracykliny HCl i/lub między około 0,001% i około 0,003% cefaleksyny, ponownie na podstawie całej ilości bulionu.

Zazwyczaj, cykl produkcji seryjnej wynosi około 80-160 godzin. Tak więc, części każdego z substratów o wzorze XIII i roztwory odżywcze, dodaje się zwykle co około 2 do 10 godzin, korzystnie co około 4 do 6 godzin. Korzystnie, do układu fermentacyjnego z posiewem oraz do bioreaktora produkcyjnego wprowadza się także środek zapobiegający tworzeniu się piany.

Korzystnie, w sposobie według fig. 1 ładunek szczepu do bioreaktora produkcyjnego wynosi około 0,5% do około 7%, korzystniej około 1% do około 2% objętościowo na podstawie całości mieszaniny w bioreaktorze, a stężenie glukozy utrzymuje się między około 0,01% i około 1,0%, korzystnie między około 0,025% i około 0,01%, korzystniej między około 0,05% i około 0,25% wagowych z okresowymi dodawaniami, które korzystnie są porcjami 0 około 0,05% do około 0,25% wagowych, w oparciu o całość ładunku. Temperaturę fermentacji kontroluje się dogodnie w zakresie, wynoszącym około 20° do około 37°C, korzystnie około 24°C do około 28°C, lecz może być potrzebne obniżenie temperatury podczas reakcji, np. w 2°C przyrostach, w celu zachowania objętości upakowanych miceli (PMV) poniżej około 60%, korzystnie poniżej około 50%, i przez to zapobiec zakłócaniu odpowiedniego mieszania dzięki lepkości bulionu fermentacyjnego. Jeśli rosnąca biomasa wychodzi ponad powierzchnię płynu, substrat pozostający wewnątrz biomasy może zostać przeniesiony poza strefę reakcji i stać się niedostępnym dla reakcji hydroksylacji. W celu produktywności, pożądane jest aby osiągnąć PMV w zakresie 30 do 50%, korzystnie 35% do 45% w ciągu pierwszych 24 godzin reakcji fermentacji, lecz potem warunki korzystnie są w stanie kontrolować dalszy wzrost w granicach ustalonych powyżej. Podczas reakcji, pH pożywki fermentacyjnej kontroluje się w zakresie między około 5,0 i około 6,5, korzystnie między około 5,2 i około 5,8, a bioreaktor poddaje się mieszaniu w tempie, wynoszącym między około 400 i około 800 obrotów na minutę. Poziom rozpuszczonego tlenu, wynoszący co najmniej około 10% nasycenia, uzyskuje się przez napowietrzanie ładunku przy między około 0,2 i około 1,0 wzm 1 utrzymywanie ciśnienia w głównej przestrzeni bioreaktora między około ciśnieniem atmosferycznym i około 100 kPa nadciśnienia, najkorzystniej około 70 kPa nadciśnienia. Tempo mieszania można także zwiększać według potrzeby, aby utrzymać minimum poziomu rozpuszczonego tlenu. Korzystnie, rozpuszczony tlen utrzymuje się dobrze ponad około 10%, w rzeczywistości aż około 50% w celu pobudzenia konwersji substratu. Utrzymywanie pH w zakresie 5,5±0,2 jest także optymalne dla biokonwersji. Pienienie kontroluje się według potrzeby przez dodanie zwykłego środka zapobiegającego pienieniu. Po dodaniu całego substratu reakcję korzystnie kontynuuje się aż do uzyskania stosunku molowego produktu o wzorze VIII do pozostałego nie przereagowanego substratu o wzorze XIII, wynoszącego co najmniej około 9 do 1. Taką konwersję można uzyskać w ciągu 80-160 godzin cyklu fermentacyjnego zaznaczonego powyżej.

Stwierdzono, że wysokie przemiany wiążą się z wyczerpaniem początkowego poziomu odżywki poniżej początkowego poziomu załadunku, i przez kontrolę tempa napowietrzania oraz tempa mieszania w celu uniknięcia wylania się substratu poza płynny bulion. W sposobie według fig. 1 poziom odżywki wyczerpał się a potem utrzymywał na poziomie nie większym od około 60%, korzystnie około 50% początkowego poziomu załadunku; podczas gdy w sposobach wedłue fis. 2 i 3 Doziom odżvwki z.mnieiszvł sie i ntrzvmvwał na noziomie nje wiekszym od około 80%, korzystnie około 70% początkowego poziomu załadunku. Tempo napowietrzania wynosi korzystnie nie więcej niż jeden wzm, korzystniej w zakresie około 0,5 wm; podczas gdy tempo mieszania wynosi korzystnie nie więcej niż 600 obrotów na minutę.

Szczególnie zalecany sposób wytwarzania związku o wzorze VIII zilustrowano w fig. 2. Zalecanym drobnoustrojem dla 11(i-hydroksydacji związku o wzorze XIII (np. kanrenonu) jest Aspergillus ochraceus NRRL 405 (ATCC 18500). W tym sposobie, pożywka wzrostowa korzystnie obejmuje między około 0,5% i około 5% wagowo płyn z namaczania kukurydzy, między około 0,5% i około 5% wagowo glukozę, między około 0,1% i około 3% wagowo

189 757 ekstrakt drożdżowy i między około 0,05% i około 0,5% wagowo fosforan amonu. Jednakże, można także stosować inne produkcyjne pożywki wzrostowe, jakie opisano w niniejszym. Kulturę posiewową wytwarza się zasadniczo w sposób opisany w sposobie według fig. 1, przy użyciu każdej z posiewowych pożywek fermentacyjnych opisanych w niniejszym. Zawiesinę kanrenonu nie przepuszczonego przez rozdrabniacz makrocz.ąsteczkowy lub innego substratu 0 wzorze XIII w pożywce wzrostowej, wytwarza się aseptycznie w blenderze, korzystnie przy stosunkowo wysokim stężeniu, wynoszącym między około 10% i około 30% wagowych substratu. Korzystnie, aseptyczne wytwarzanie może obejmować wyjaławianie lub pasteryzację zawiesiny po mieszaniu. Całą ilość jałowej zawiesiny substratu wymaganą dla wsadu produkcyjnego wprowadza się do bioreaktora produkcyjnego na początku wsadu lub przez okresowe karmienie łańcuchowe. Wielkość cząstek substratu zmniejsza się przez mielenie na mokro w pompie ścinającej włączonej w linię, która przenosi zawiesinę do bioreaktora produkcyjnego, wyjaśniając potrzebę użycia roz.drabniacz.a mikrocząsteczkowego wyłączonego z linii. Jeśli warunki aseptyczne uzyskuje się raczej przez pasteryzację niż wyjaławianie, rozmiar aglomeracji może być nie znaczący, lecz stosowanie pompy ścinającej może być pożądane w celu zapewnienia dodatniej kontroli wielkości cząstek. Jałoswą pożywkę wzrostową i roztwór glukozy wprowadza się do bioreaktora produkcyjnego zasadniczo w taki sam sposób, jak opisano powyżej. Wszystkie składniki pożywki do bioreaktora produkcyjnego wyjaławia się przed wprowadzeniem tak, że antybiotyki nie są potrzebne.

Korzystnie, w operacji sposobu według fig. 2, szczep wprowadza się do bioreaktora produkcyjnego w proporcji, wynoszącej między około 0,5% i około 7%, temperatura fermentacji wynosi między około 20° i około 37°C, korzystnie między około 24°C i około 28°C, a pH kontroluje się w zakresie między około 5,3 i około 5,5 np. przez wprowadzenie gazowego amoniaku, wodnego roztworu wodorotlenku amonu, wodnego roztworu wodorotlenku metalu alkalicznego lub kwasu ortofosforowego. Tak jak w sposobie według fig. 1, temperaturę obniża się korzystnie w celu kontrolowania PMV, tak aby nie przekraczała 55-60%.

Początkowy załadunek glukozy wynosi korzystnie między około 1% i około 4% wagowo, najkorzystniej 2,5% do 3,5% wagowych, lecz korzystnie pozwala się na opadnięcie poniżej około 1,0% wagowych podczas fermentacji. Dodatkową glukozę dodaje się okresowo w porcjach, wynoszących między około 0,2% i 1,0% wagowych na podstawie całego ładunku tak, aby utrzymać stężenie glukozy w strefie fermentacji w zakresie między około 0,1% i około 1,5% wagowych, korzystnie między około 0,25% i około 0,5% wagowych. Ewentualnie, można uzupełniać źródła azotu i fosforu razem z glukozą. Jednakże, ponieważ cały załadunek kanrenonu wykonuje się na początku cyklu fermentacyjnego, w tym czasie można wprowadzić także pozostałe uzupełnienie odżywkami, niosącymi azot i fosfor, co pozwala na stosowanie dokarmiania roztworem glukozy tylko podczas reakcji. Tempo i charakter mieszania jest w znacznej mierze zmienny. Średnio energiczne mieszanie pobudza przenoszenie masy między stałym substratem i fazą wodną. Jednakże, powinno się stosować wirnik niskoobrotowy, w celu zapobieżenia rozkładowi mieliny drobnoustrojów. Optymalna prędkość mieszania zmienia się w zakresie, wynoszącym 200 do 800 obrotów na minutę, w zależności od lepkości bulionu hodowlanego, stężenia tlenu i warunków mieszania jak wpływ naczynia, przegroda 1 konfiguracja wirnika. Zwykle, zalecane tempo mieszania wchodzi w zakres 350-600 obrotów na minutę. Korzystnie wirnik mieszający zapewnia funkcję pompowania osiowo w dół tak, aby sprzyjać dobremu mieszaniu fermentowanej biomasy. Masę korzystnie napowietrza się w tempie, wynoszącym między około 0,3 około 1,0 vvm, korzystnie 0,4 do 0,8 wm, a ciśnienie w głównej przestrzeni bioreaktora wynosi korzystnie między około 50 kPa i około 100 kPa, nadciśnienia, Temperaturę, mieszanie, napowietrzanie i ciśnienie wsteczne kontroluje się korzystnie w celu utrzymania rozpuszczonego tlenu na poziomie co najmniej około 10% objętościowych podczas biokonwersji. Cykl całej masy trwa zwykle między około 100 i około 140 godzin.

Mimo, że zasada operacji dla sposobu według fig. 2 opiera się o wczesne wprowadzenie zasadniczo całości załadunku kannenonu, zrozumiałym będzie, że wzrost bulionu fermentacyjnego można przeprowadzać przed załadunkiem masy kanrenonu. Ewentualnie, część porcji kanTenonu można także dodać do masy później. Jednak generalnie, co najmniej około 75% jałowego kanrenonu powinno się wprowadzić do bioreaktora transformacyjnego w ciągu

189 757 godzin po zapoczątkowaniu fermentacji. Ponadto, pożądane jest wprowadzenie co najmniej około 25% wagowych kanrenonu na początku fermentacji, albo co najmniej w ciągu pierwszych 24 godzin, w celu pobudzenia tworzenia się enzymu(ów) biokonwersji.

W dalszym zalecanym sposobie jaki zilustrowano w fig. 3, całość ładunku fermentacyjnego i roztworu odżywczego wyjaławia się w naczyniu do fermentacji produkcyjnej przed wprowadzeniem szczepu. Roztwory odżywcze, które można stosować, jak również, preferencje wśród nich, są zasadniczo takie same jak w sposobie według fig. 2. W tej postaci realizacji wynalazku działanie ścinające wirnika mieszającego rozbija aglomeraty substratu, które z drugiej strony, mają tendencję do tworzenia się w czasie wyjaławiania. Odkryto, że reakcja zachodzi z powodzeniem jeśli średnia wielkość cząstek kanrenonu wynosi mniej niż 300 (i, i co najmniej 75% wagowych cząstek jest mniejszych niż 240 (i. Stosowanie odpowiedniego wirnika, np. wirnika z turbiną talerzową, przy odpowiedniej prędkości w zakresie 200 do 800 obrotów na minutę, przy prędkości szczytowej, wynoszącej co najmniej 400 cm/sekundę, jak stwierdzono, zapewnia wspólezynnik ścinania wystarczający do utrzymania takiej charakterystyki wielkości cząstek mimo tendencji do aglomeracji, występującej w czasie wyjaławiania wewnątrz bioreaktora produkcyjnego. Pozostałe operacje sposobu według fig. 3 są zasadniczo takie same jak w sposobie według fig. 2. Sposoby według fig. 2 i 4 oferują kilka różnych korzyści w stosunku do sposobu według fig. 1. Szczególną korzyścią jest odpowiedzialność wobec stosowania bazy odżywczej o niskich kosztach, takiej jak płyn z namaczania kukurydzy. Ale dalsze korzyści realizuje się poprzez eliminację potrzeby antybiotyków, uproszczenie procedur dokarmiania i pozwalanie na masowe wyjaławianie kanrenonu lub innego substratu o wzorze XIII. Inną szczególną korzyścią jest możliwość stosowania raczej prostego roztworu glukozy niż kompleksowego roztworu odżywczego do uzupełniania w czasie cyklu reakcyjnego.

W sposobach opisanych w fig. 1 do 3, produkt o wzorze VIII jest krystalicznym ciałem stałym, które razem z biomasą, można oddzielić od bulionu reakcyjnego przez filtrację lub wirowanie z niską prędkością. Alternatywnie, produkt można ekstrahować z całości bulionu reakcyjnego rozpuszczalnikami organicznymi. Produkt o wzorze VIII odzyskuje się przez, ekstrakcję rozpuszczalnikami. W celu maksymalnego odzysku, zarówno przesącz fazy ciekłej jak i filtr biomasy lub placek z wirówki traktuje się rozpuszczalnikiem do ekstrakcji, lecz zwykle >95% produktu wiąże się z biomasą. Zazwyczaj do ekstrakcji można stosować rozpuszczalniki estru węglowodoru, chlorowanego węglowodoru, i ketonowe. Zalecanym rozpuszczalnikiem jest octan etylu. Inne, zwykle odpowiednie rozpuszczalniki obejmują toluen i keton metyloizoeutylowy. Do ekstrakcji z fazy ciekłej, dogodne będzie użycie objętości rozpuszczalnika w przybliżeniu równej objętości roztworu reakcyjnego, z którą się styka. Aby odzyskać produkt z biomasy, te ostatnią zawiesza się w rozpuszczalniku, korzystnie w wielkim nadmiarze w stosunku do początkowego ładunku substratu, np. 50 do 100 ml rozpuszczalnika na gram początkowego ładunku kanrenonu, i uzyskaną zawiesinę korzystnie ogrzewa się w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin przez okres około 20 minut do kilku godzin, w celu zapewnienia przeniesienia produktu do fazy rozpuszczalnika z zagłębień i porów biomasy. Następnie, biomasę usuwa się przez filtrację lub wirowanie i placek filtracyjny korzystnie przemywa się zarówno świeżym rozpuszczalnikiem jak wodą dejonizowaną. Produkt przemycia wodą i rozpuszczalnikiem łączy się potem i fazy pozostawia do rodzielenia. Produkt o wzorze VIII odzyskuje się przez krystalizacje z roztworu. Aby zmaksymalizować wydajność, grzybnię styka się dwukrotnie ze świeżym rozpuszczalnikiem. Po osadzeniu w celu zakończenia rodzielania fazy wodnej, produkt odzyskuje się z fazy rozpuszczalnika. Najkorzystniej. rozpuszczalnik usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem do rozpoczęcia krystalizacji, następnie zatężony ekstrakt chłodzi do temperatury około 0° do około 20°C, korzystnie około 10° do około 15°C przez okres czasu wystarczający do wytrącenia kryształów i wzrost, zwykle około 8 do około 12 godzin.

Sposoby według fig. 2, a zwłaszcza według fig. 3 zaleca się szczególnie. Sposoby te działają przy niskiej lepkości i są odpowiedzialne za ścisłą kontrolę parametrów procesu, takich jak pH, temperatura i rozpuszczony tlen. Ponadto, jałowe warunki łatwo jest zabezpieczyć bez uciekania się do antybiotyków.

189 757

Proces biokonwersji jest egzotermiczny tak, że ciepło powinno się usuwać przy użyciu bioreaktora z płaszczem lub osłoną chłodzącą wewnątrz bioreaktora produkcyjnego. Alternatywnie, bulion reakcyjny może krążyć przez zewnętrzny wymiennik ciepła. Rozpuszczony tlen utrzymuje się korzystnie na poziomie co najmniej około 5%, korzystnie co najmniej około 10% objętościowych, wystarczających do zapewnienia energii dla reakcji i zapewnienia przemiany glukozy w CO2 i H2O, przez regulację tempa wprowadzania powietrza do reaktora w odpowiedzi na pomiar potencjalnego tlenu w bulionie. pH kontroluje się korzystnie w zakresie między około 4,5 i około 6,5.

W każdym z alternatywnych sposobów dla 11-hydroksylacji substratu o wzorze XIII, produktywność ograniczana jest przez transfer masy ze stałego substratu na fazę wodną lub powierzchnię stykania się faz, gdzie, jak wiadomo, zachodzi reakcja. Jak zaznaczono powyżej, produktywność nie jest zasadniczo ograniczona przez tempo przeniesienia masy, tak długo jak średnią wielkość cząstek substratu zmniejsza się do mniej niż około 300 μ i co najmniej 75% wagowych cząstek jest mniejszych niż 240 μ. Jednakże produktywność tych procesów można dodatkowo wzmocnić w pewnych alternatywnych postaciach realizacji, które zapewniają zasadniczy załadunek kanrenonu lub innego substratu o wzorze XIII do bioreaktora produkcyjnego w rozpuszczalniku organicznym. Zgodnie z jedną opcją, substrat rozpuszcza się w rozpuszczalniku nie mieszającym się z wodą i miesza ze szczepem w wodnej pożywce wzrostowej oraz środkiem powierzchniowo czynnym. Użyteczne rozpuszczalniki nie mieszające się z wodą obejmują np. DMF, DMSO, kwasy tłuszczowe C6-Cl2, n-alkany C6-Cl2, oleje roślinne, sorbitany i wodne roztwory środków powierzchniowo czynnych. Mieszanie tego ładunku tworzy układ reakcyjny emulsji, mający poszerzony obszar styku faz dla transferu masy substratu z ciekłej fazy organicznej do miejsc reakcji.

Druga opcja dotyczy początkowego rozpuszczenia substratu w rozpuszczalniku, mieszającym się z wodą, takim jak aceton, keton metyloetylowy, metanol, etanol lub glicerol w stężeniu zasadniczo większym niż rozpuszczalność w wodzie. Przez wytworzenie początkowego roztworu substratu przy podwyższonej temperaturze rozpuszczalność zwiększa się zwiększając przez to dalej ilość substratu w postaci roztworu wprowadzanego do reaktora i niezwykle wzmagając ciężar ładunku reaktora. Ciepły roztwór substratu ładuje się do produkcyjnego reaktora fermentacyjnego razem z stosunkowo chłodnym ładunkiem wodnym, zawierającym pożywkę wzrostową i szczepionkę. Gdy roztwór substratu miesza się z wodną pożywką, występuje wytrącanie się substratu. Jednakże w warunkach zasadniczego nadnasycenia i średnio energicznego mieszania, sprzyja to raczej tworzeniu się zarodków kryształów' niż ich wzrostowi i tworzą się bardzo drobne cząstki na dużym obszarze powierzchni. Duży obszar powierzchni pobudza przenoszenie masy między fazą ciekłą a stałym substratem. Ponadto, stężenie równowagi substratu w ciekłej fazie wodnej wzmacnia się także w obecności rozpuszczalnika mieszającego się z wodą. W związku z tym podnosi się produktywność.

Mimo, że drobnoustroje nie koniecznie tolerują wysokie stężenie etanolu, np. w zakresie, wynoszącym około 3% do około 5% wagowych, można go stosować według potrzeby.

Trzecia opcja dotyczy rozpuszczenia substratu w wodnym roztworze cyklodekstryny. Przykładowe cyklodekstryny obejmują hydroksypropylo-p-cyklodekstrynę i metylo-P-cyklodekstrynę. Stosunek molowy substrat:cyklodekstryna może wynosić około 1:0,5 do około 1:1,5, korzystniej około 1:0,8 do około 1:1. Mieszaninę substrat:cyklodekstryna można dodawać aseptycznie do reaktora biokonwersji.

la-Hydroksdkanrenon i irme produkty procy sp 1 l(x-hy1h^c^l^!^ydacji (wzory VIII i VIII A) są nowymi związkami, które można wyodrębniać przez filtrację środowiska reakcyjnego i ekstrahowanie produktu z biomasy zebranej na środowisku filtracji. Koewencjoerlnę rozkurzczaleiki organiczne, np. octan etylu, aceton, toluen, chlorowane węglowodory i keton metyloizobutylowy można stosować do ekstrakcji. Produkt o wzorze VIII można potem rekrysta^ować z rozpuszczalnika organicznego tego samego typu. Związki o wzorze VIII mają zasadniczą wartość jako pośrednie do wytwarzania związków o wzorze I, a zwłaszcza o wzorze LA.

189 757

Korzystnie związki o wzorze VIII odpowiadają wzorowi VIIIA, w którym -A-A- i -B-Boznaczają grupę -CH2-CH2-, R³ oznacza atom wodoru, niższa grupę alkilową lub niższą alkoksy, a R 1 R⁹ razem stanowią pierścień 20-spiroksanowy:

'utuf

X»CIII

Dalej, zgodnie ze sposobem według schematu 1, związek o wzorze VIII poddaje się reakcji w warunkach alkalicznych ze źródłem jonu cyjankowego, w celu wytworzenia związku enaminowego o wzorze VII

VII

8 9 gdzie -A-A-, -B-B-, R , R i R są takie jak określono powyżej. Jeśli substrat odpowiada związkowi VIIIA, produkt ma wzór VIIA

Υ»

VIIA

Τ 1 9 - □ gdzie -A-A-, -B-B-, R , Y , Y i X są takie jak określono we wzorze XIIIA. Korzystnie R oznacza atom wodoru.

Cyjanowanie substratu 11a-hydroksylowego o wzorze VIII można przeprowadzać przez jego reakcję ze źródłem jonu cyjankowego, takim jak ketono-cyjanohydryna, najkorzystniej acetono-cyjanohydryna, w obecności zasady i soli metalu alkalicznego, najkorzystniej LiCl. Alternatywnie, cyjanowanie można uzyskać bez cyjanohydryny przez użycie cyjanku metalu alkalicznego w obecności kwasu.

W procesie ketono-cyjanohydr^-ny. reakcję prowadzi się w roztworze, korzystnie przy użyciu aprotycznego rozpuszczalnika polarnego. takiego iak dimetyloformamid lub sulfotle- _A . χ — _A___.-----------— J---- ------'J ~ ~ ' nek dimetylu. Tworzenie się enaminy wymaga co najmniej dwóch moli źródła jonu cyjankowego na mol substratu, a korzystnie stosuje się lekki nadmiar źródła jonu cyjankowego. Zasadą jest korzystnie zasada azotowa, taka jak dialkiloamina, t^^ailkiloamina, alkanoloamina, pirydyna lub inne, jednakże, zasady nieorganiczne, takie jak węglany metali alkalicznych lub wodorotlenki metali alkalicznych także można stosować. Korzystnie, substrat o wzorze VIII jest początkowo obecny w proporcji, wynoszącej około 20 i około 50% wagowych, a zasada jest obecna w proporcji, wynoszącej około 0,5 do dwóch równoważników na równoważnik substratu. Temperatura reakcji nie jest krytyczna, lecz produktywność wzmaga się przez

189 757 operację przy temperaturze podwyższonej. Tak więc, np. jeśli stosuje się trietyloaminę jako zasadę, reakcję korzystnie prowadzi się w temperaturze w zakresie około 80°C do około 90°C. Przy takiej temperaturze reakcja postępuje do zakończenia w ciągu około 5 do około 20 godzin. Jeśli stosuje się diizopropyloaminę jako zasadę i reakcję prowadzi w temperaturze 105°C, reakcja kończy się w ciągu 8 godzin. Przy końcu okresu reakcji, rozpuszczalnik usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostały olej rozpuszcza w wodzie i zobojętnia do pH 7 rozcieńczonym kwasem, korzystnie chlorowodorowym. Produkt wytrąca się z tego roztworu i następnie przemywa się go wodą destylowaną i suszy na powietrzu. Uwolniony HCN można odpędzać obojętnym gazem i gasić w zasadowym roztworze. Wysuszony osad odbiera się w chloroformie lub innym odpowiednim rozpuszczalniku, następnie ekstrahuje stężonym kwasem, np. 6N HCl. Ekstrakt zobojętnia się do pH 7 przez dodanie zasady nieorganicznej, korzystnie wodorotlenku metalu alkalicznego i chłodzi do temperatury w zakresie 0°C. Otrzymany osad przemywa się i suszy, potem oekrystalizuje z odpowiedniego rozpuszczalnika, np. acetonu, w celu wytworzenia produktu o wzorze VII odpowiedniego do użytku w następnym etapie procesu.

Alternatywnie, reakcję można prowadzić w układzie rozpuszczalników wodnych, obejmującym rozpuszczalnik mieszający się z wodą, taki jak metanol lub w dwufazowym układzie, zawierającym wodę i rozpuszczalnik organiczny, taki jak octan etylu. W tej alternatywie, produkt można odzyskiwać przez rozcieńczenie roztworu reakcyjnego wodą i potem ekstrakcję produktu przy użyciu rozpuszczalnika organicznego, takiego jak chlorek metylenu lub chloroform, a potem ponownie ekstrakcję z ekstraktu organicznego) przy użyciu stężonego kwasu mineralnego, np. 2N HCl. Patrz, opis patentowy nr 3 200 113.

Zgodnie z jeszcze inną alternatywą, reakcję można prowadzić w rozpuszczalniku mieszającym się z wodą, takim jak dimetyloformamid, dimetyloacetamid, N-metylo-pirolidon lub sulfotlenek dimetylu, po której roztwór produktu reakcji rozcieńcza się wodą. i czyni zasadowym, np. przez dodanie węglanu metalu alkalicznego, potem chłodzi do temperatury 0°C do 10°C, powodując przez to wytrącenie się produktu. Korzystnie, układ gasi się podhalogeninem metalu alkalicznego lub innym odczynnikiem skutecznym do zapobiegania tworzenia się cyjanku. Po przesączeniu i przemyciu wodą, wytrącony osad jest odpowiedni do użycia w następnym etapie procesu.

Zgodnie z jeszcze dalszą alternatywą, produkt enaminowy o wzorze VII można wytworzyć przez reakcję substratu o wzorze VIII w obecności źródła protonów, z nadmiarem cyjanku metalu alkalicznego, korzystnie NaCN, w rozpuszczalniku wodnym, zawierającym apootyczny polarny rozpuszczalnik mieszający się z wodą, taki jak dimetyloformamid lub dimetyloacetamid. Źródło protonów jest korzystnie kwasem mineralnym lub C1 do C5 kwasem karboksylowym, pozy czym szczególnie zaleca się kwas siarkowy. Wyjątkowo, nie potrzeba dodawać oddzielnego źródła protonów, jeśli odczynnikiem cyjanowania jest handlowy LiCN w DMF.

Źródło jonu cyjankowego, takiego jak sól metalu alkalicznego, ładuje się korzystnie do reaktora w proporcji, wynoszącej około 2,05 do około 5 równoważników molowych na równoważnik substratu. Uważa się, że kwas mineralny lub inne źródło protonów pobudza dodanie HCN poprzez 4,5 i 6,7 wiązania podwójne, i jest korzystnie obecny w proporcji, wynoszącej co najmniej jeden równoważnik molowy na mol równoważnika substratu; lecz układ reakcyjny powinien pozostawać zasadowy pozez utrzymanie nadmiaru cyjanku metalu alkalicznego wobec obecnego kwasu. Reakcję przeprowadza się korzystnie w temperaturze co najmniej około 75°C, zwykle 60°C do 100°C, przez okres od 1 do około 8 godzin, korzystnie około 1,5 do około 3 godzin. Przy końcu okresu reakcyjnego, mieszaninę reakcyjną chłodzi się, korzystnie do temperatury pokojowej; i produkt, będący enaminą wytrąca się pozez zakwaszenie mieszaniny reakcyjnej i mieszanie z zimną wodą, korzystnie o temperaturze bliskiej temperatury łaźni lodowej. Uważa się, że zakwaszenie zamyka U-lakton, który ma tendencje do otwierania w warunkach zasadowych, przeważających pozy cyjanowaniu. Mieszaninę reakcyjną zakwasza się dogodnie przy użyciu tego samego kwasu, jaki jest obecny podczas reakcji, korzystnie kwasu siarkowego. Korzystnie dodaje się wodę w proporcji, wynoszącej między około 10 i około 50 równoważników molowych na mol produktu.

189 757

Związki o wzorze VII są związkami nowymi i mają zasadniczą wartość jako pośrednie w wytwarzaniu związków o wzorze I, a zwłaszcza o wzorze IA. Korzystnie związki o wzorze VIII odpowiadają wzorowi VIIIA, w którym -A-A- i -B-B- oznaczają grupę -CH2-CH2-, r3 oznacza atom wodoru, niższa grupę alkilową lub niższą alkoksy, a R i r9 razem stanowią pierścień 20-spiroksanowy:

A /

Wił II

Najkorzystniej, związek o wzorze VII oznacza e'R(e'a),7'β-20'-ammoheksadekahydro1 Γβ-hydrokky-10’α,13'α-dimejylot3’,5-diokkotpπΌtfurrn-2233ϊ),17'α(5Ή))[7,44mejtnot4H]-cyklopenta [a] fenantreno] - 5 '-karbonitryl.

W przemianie związku o wzorze VIII w enaminę o wzorze VII, pochodną 7-cyjanową związku o wzorze VIII obserwowano przez chromatografię w surowym produkcie. Założono, że związek 7-cyjanowy jest pośrednim w procesie przemiany. Zakłada się dalej, że związek pośredni 7-cyjanowy sam reaguje tworząc drugi związek pośredni, pochodną e,7-cyjanową związku o wzorze VIII, który odwrotnie reaguje tworząc enester. Patrz np. R. Christiansen i in., The Reaction of Steroidal 4,6-Dijn-3-Onj's With Cyanide, Steroids, tom 1, czerwiec 1963, który załącza się w niniejszym jako odniesienie. Te nowe związki mają także zastosowanie jako markery chromatograficzne, jak również są syntetycznymi związkami pośrednimi. W zalecanej postaci realizacji tego etapu całości schematu 1 procesu syntezy, te związki pośrednie to kwas 7cx-cyjano-11a,17-dihydroksy-3-okso-17a-prcgn-4-eno-21-dikarboksylowy γ-lakton i kwas eβ,7α-dicyjano-11a,17-dihydroksy-3-okso-17α-pregnano-21 dikarboksylowy, γ-lakton.

W następnym etapie schematu 1 syntezy, enamina o wzorze VII ulega hydrolizie w celu wytworzenia związku diketonowego o wzorze VI

VI

8 9 gdzie -A-A-, -B-B-, R^J, R° i R9 są takie jak określono we wzorze XIU. Do hydrolizy można stosować każdy wodny kwas organiczny lub mineralny. Zaleca się kwas chlorowodorowy. Aby wzmóc produktywność, korzystnie stosuje się rozpuszczalnik mieszający się z wodą, taki jak dimetyloacetamid lub niższy alkanol, jako równoczesny rozpuszczalnik. Korzystniej, rozpuszczalnikiem jest dimetyloacetamid. Kwas powinien być obecny w proporcji co najmniej jednego równoważnika na równoważnik substratu o wzorze VII. W układzie wodnym enaminowy substrat o wzorze VII można zasadniczo przekształcić w diketon o wzorze VI, w okresie około 5 godzin, w temperaturze około 80°C. Operacja przy podwyższonej temperaturze zwiększa produktywność, lecz temperatura nie jest krytyczna. Odpowiednie temperatury wybiera się na podstawie lotności układu rozpuszczalnika i kwasu.

189 757

Korzystnie, enaminowy substrat o wzorze VII odpowiada wzorowi VLA

VIIA a produkt diketonowy odpowiada wzorowi VIA

VIA których każdy -A-A-, -B-B-, R\ Y\ Y² i X są takie jak określono we wzorze XIIIA. Korzystnie R3 oznacza atom wodoru.

Przy końcu okresu reakcyjnego, roztwór chłodzi się do temperatury między około 0°C do około 25°C w celu krystalizacji produktu. Kryształy produktu można rekrystalizować z odpowiedniego rozpuszczalnika, takiego jak izopropanol lub metanol w celu wytworzenia produktu o wzorze VI odpowiedniego do użytku w następnym etapie procesu; lecz rekrystalizacja nie jest zwykle konieczna. Produkty o wzorze VI są związkami nowymi, które mają zasadniczą wartość w wytwarzaniu związków o wzorze I, a zwłaszcza o wzorze LA. Korzystnie związki o wzorze VIII odpowiadają wzorowi VIIIA, w którym -A-A- i -B-B- oznaczają grupę -^2-0^2-, r3 oznacza atom wodoru, niższą grupę alkilową lub niższą alkoksy, a R i r7 razem stamow^^ą pierścień 20-spiroksanowy:

\ /

XXXIII

Najkorzystniej, związek o wzorze VI jest 4'S(4'a),7’ a-heksadeksahydro-! ra-hydroksy10'β,3'β-dinleIylo-3',5,20^,-trioksosβiko[furan-2(3H),17'βe[4,7]metano[17H]eybłopezta[a]e -fenanetreno]-5'β(2.H)kαrbonitrylem.

W szczególnie zalecanej postaci realizacji wynalazku, enaminowy produkt o wzorze VII wytwarza się ze zwuazku o wzorze VIII w sposób opisany powyżej i przelkt ztałca m situ w dl i keton o wzorze VI. W tej postzei realizeejl wynalazku, substrat o wzopze VIII pcddaje się rc akcji o naZmiarem cyjanku metalu alkaliczne go w rozβuszcealnike wodnym, Iαeeizrąjącym źródło βtotz>ϋów lub) ewkutualme nadmiarem ketonozyjano^dydfyny w obecności zasady i LiCh jpk oprano w nin^łejszym powyZei. .Ιι-Ζο^^ι, zomiasn chłodzenia miISzαn^tn^e reakcyjnej, zakwdazenⁱI i dodanie łvo^on w proporcjach obliczonych dla sβowo⁰owania ^wytrącenia maminy, zasaZniezz, korzystnie om ija chłoda-nii oπeazanizn reakcyjn-Z. Zamiast tego, Zo mieszaniny reakcyjnej dodaje się wodę i kwas, korzystnie kwas mineralny, taki jak siarkowy,

189 757 przy końcu reakcji cyjanowania. Proporcja dodanego kwasu jest wystarczająca do zobojętnienia nadmiaru cyjanku metalu alkalicznego, który zwykle wymaga wprowadzenia co najmniej jednego równoważnika molowego na mol substratu o wzorze VIII, k3ozyltaie między około 2 i około 5 moli równoważników na równoważnik substratu. Jednakże, utrzymuje się wystarczająco wysoką temperaturę i wystarczająco wysokie rozcieńczenie aby unikać zasadniczego wytrącania, a hydrolizę eaamian do diketonu pozostawia się do postępowania w fazie ciekłej. Tak więc, proces preebiega z minimum przerwań i z wysoką produktywnością. Hydrolizę prowadzi się korzystnie w temperaturze co najmniej 80°C, k3rznltaie w zakresie, wynoszącym około 90°C do około 100°€, przez okres zwykle wynoszący około 2 do około 5 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną chłodzi się, korzystnie do temperatury, wynoszącej między około 0°C i około 15°C, kooznltaie w łaźni lodowej do około 5°C do około 10°C, w celu wytrącenia diketonowego produktu o wzorze VI. Stały produkt można odzyskiwać, np. przez filtrację, a zanielzczylzczeniα zmniejsza się przez przemycie wodą.

W następnym etapie schematu 1 lyatczy. ewioeek diketonowy o wzorze VI poddaje się reakcji z alkoholanem metalu w celu otworzenia mostka ketonowego między pozycjami 4 i 7 poprzez rozszczepienie wiązania między grupą karbonylową i atomem węgla w pozycji 4, utworzenia a-zorientowanej grupy αlk3klykaob3aylowej w pozycji 7 i usunięcia cyjanku przy atomie węgla w pozycji 5. Produkt tej reakcji jest związkiem hydooksycstoowyin, odpowiadającym wzorowi V

V gdzie -A-A-A, -B-B-, R³, R⁸ i R⁹ są takie jak określono we wzorze XIII i R¹ ozaaceα niższą grupę alk3klnkarbonylową lub hydooklnkarboaylowo. Alkoholan metalu stosowany w reakcji odpowiada wzorowi R^WOM gdzie M jest metalem alkalicznym i R^WO- odpowiada grupie alkoksy R1 Wydajności tej reakcji są w większości zadowalające jeśli alkoholanem metalu jest metanolan potasu lub metanolan sodu, lecz można stosować inne niższe alkoholany. Alkoholan potasu zaleca się szczególnie. Fenolmy, inne ar^l^^alkoholany można także stosować, jak również arylosiarczki. Reakcję dogodnie przeprowadza się w obecności alkoholu, odpowiadającego wzorowi r1°OH gdzie Ri0 jest takie jak określono powyżej. Można stosować inne konwencjonalne rozpuszczalniki. Koreystaie. substrat o wzorze VI jest obecny w proporcji, wynoszącej między około 2% i około 12% wagowych, co najmniej około 6% wagowych. Korzystnie, R^!(!OM jest obecny w proporcji, wynoszącej między około 0,5 i około 4 moli na mol suTsli-atUi k^toe'^^nzse'iCjj między około 1 i około 2ł molami na mol substratu, a jeszcze korzystniej około 1,6 mola na mol lubltratu. Temperatura nie jest krytyczna, lecz podwyższenie temperatury wzmaga produktywność. Czas reakcji wynosi zwykle około 4 i około 24 godzin, koinystnie około 4 do około 16 godzin. Dogodnie, reakcję prowadzi się w aΐmolfcl'njzaej temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin w zależności od użytego rozpuszczalnika.

Czas wymagany dla reakcji w celu osiągnięcia równowagi, zależy od ilości alkoholanu dodanego do mieszaniny reakcyjnej i sposobu w jaki dodaje się alkoholan. Alkoholan można dodawać w pojedynczej porcji lub w wielu porcjach, albo można go dodawać w sposób ciągły. Jeśli alkoholan dodaje się w wielu porcjach, k3renltne jest dodanie około 1,6 równoważnika metanolami sodu w dwóch etapach. W tym dwuetapowym dodaniu, do miclzanian reakcyjnej dodaje się początkowo 1 równoważnik metanolami potasu, po czym 0,6 równoważnika metanolami potasu około 90 minut później. Ten dwuetapowy sposób dodawania skraca czas osiągnięcia równowagi w stosunku do dodania w pojednnjecj porcji 1,6 równoważnika metanolami potasu.

189 757

Ponieważ równowaga jest noIzysteiejrzα dla wytwarzania hydrokryertIU o niskim stężeniu Piketonu, reakcja przebiega korzystnie raczej przy wysokim rozcieńczeniu, np. 40:1 dla reakcji z metanolanem sodu. Odkryto, że znacznie wyższą produktywność można zrealizować przez użycie metanolami potasu niż metanolami sodu, ponieważ rozcieńczenie w zakresie 20:1 jest generalnie wystarczające dla minimalizacji rozmiaru odwrotnego cyjαeowreia, jeśli odczynnikiem jest metanolan potasu.

Zgodnie z wynalazkiem, stwierdzono dalej, że reakcję odwrotnego cyjaeowaeia można zahamować przez wzięcie odpowiedniego odczynnika chemicznego lub miar fizycznych w celu usunięcia pobocznego produktu jonu cyjankowego ze strefy reakcyjnej. Tak więc, w dalszej postaci realizacji wynalazku reakcję d^etmu z alkoholanem metalu alkalicznego, można prowadzić w obecności czynnika strącającego dla jonu cyjankowego, takiego jak np. soli, zawierającej kation, który tworzy nierozpuszczalny związek cyjankowy. Takimi solami mogą być np. jodek cynku, siarczan żelazowy lub zasadniczo każdy halogenek, siarczan lub inna sól ziem alkalicznych lub metal przejściowy, który jest bardziej rozpuszczalny niż odpowiadający cyjanek. Jeśli jodek cynku jest obecny w proporcjach w zakresie około jednego równoważnika na równoważnik substratu diketonowego, zaobserwowano, że produktywność reakcji zwiększa się znacznie w porównaniu z procesem prowadzonym przy nieobecności halogenku metalu alkalicznego.

Nawet jeśli czynnik strącający stosuje się do usunięcia jonu cyjankowego, pozostaje korzystnym przebieg przy dość wysokim rozcieńczeniu, lecz przez stosowanie czynnika strącającego, stosunek molowy rozpuszczalnika do substratu diketonowego można zmniejszyć znacznie w porównaniu z reakcjami przy nieobecności takiego czynnika. Odzyskanie hydroksyertru o wzorze V można przeprowadzić albo zgodnie z procedurami ekstrakcji lub bez ekstrakcji, opisanymi poniżej.

Równowagę reakcji można także kontrolować pod względem wytwarzania hydroksyestru o wzorze V przez usuwanie tego hydrokryestIu z mieszaniny reakcyjnej, po jego syntezie. Usuwanie hydrokryertru może postępować albo etapami albo w sposób ciągły, środkami takimi jak filtracja. Usuwanie hydroksyertIu można stosować do kontroli równowagi albo pojedynczo albo w połączeniu z chemicznym lub fizycznym usuwaniem cyjanku z mieszaniny reakcyjnej. Ogrzewanie otrzymanego przesączu kieruje potem równowagą reakcji pod względem przemiany pozostającego diketonu o wzorze VI w hyproksyester o wzorze V.

W przemianie diketonu o wzorze VI w hydroksyester o wzorze V, 5-csjanohydroksserteI obserwowano w surowym produkcie w małych ilościach, zwykle mniejszych niż około 5% wagowych. Zakłada się, że ten 5-cyjanohydronsyerter jest pośrednim związkiem równowagi między diketonem o wzorze VI i hydroksyestrem o wzorze V. Zakłada się dalej, że ten pośredni związek równowagi tworzy się z d^etmu przez atak metanolami na grupę 5,7-okso i krotoeowanie enolanu, oraz z hydroksy^ru przez addycję Michaela produktu ubocznego jonu cyjankowego wobec grupy funkcyjnej 3-keto-A⁴,⁵ hydroksyesti·u.

Oprócz 5-cyjrno-7-kwasu i 17-alkoholanu hydroksyeslru o wzorze V, zaobserwowano, że pośredni 5-cyjaeo hydroksy^er reaguje z ubocznym produktem jonu cyjankowego (obecnym jako wynik odcyjrnowania. które wprowadza podwójne wiązanie δ4’5) w celu wytworzenia ó-cyjano^-kwasu. Zakłada się, że działanie jonu cyjankowego dealkiluje grupę

7-estrową 5-eyjaeohypIonsyestIu, do uzyskania ć-cyjano^-kwasu i odpowiadającego alkilonitrylu.

Zakłada się dalej, że przejściowy związek pośredni H-alkoholan tworzy się przez atak metanolami na 17-rkirolanton (albo poprzedni związek pośredni, który następnie przekształca sie w hvpronrvesΐerϊ ró-alkoholan łatwo erz.eksz.talca sie w ΗυΡιο^υ(^(ι — - a--y - y / jl «. * * przez traktowanie kwasem. Zatem, nie generalnie obserwuje się go w macierzy produktu.

5-Cyjrnohydrokryester, 5-cyjrno-7-kwar i 17-alkoholan są nowymi związkami, użytecznymi jako markery chromatografii i jako pośrednie w wytwarzaniu hsdIonsycrtIu. Można je wyodrębniać z surowego produktu tego etapu schematu 1 syntezy. Alternatywnie, można je syntetyzować bezpośrednio do użytku jako markery lub związki pośrednie. 5-Cyjαeohydrokrscrter można syntetyzować przez reakcję roztworu wyizolowanego diketonu o wzorze VI z zasadą, taką jak alkoholan lub amina, i wyodrębnienie otrzymanego osadu. Wytworzony

189 757 ewio5em kooeys3eie jest wodooo-almetylo-CZ-chjano-11α.la-di9hdooksy-3-okso-laα-poegl eaeolaa,21 lZimaoboksylanem, h-laktonem.

Kwas C-ehjano-aomaoboksylnwh można syntetyzować bedpośoeZnio pozee reakcję diketonu o weoo5e VI ee słabym wodnym ooetwooem easaZy, takiej jak octan sodu lub wodorowęglan sodu i wyodrębnienie otrzymanego osadu. Wytworzony ewioeek jest kooeystnie kwasem 5 β-cyjane--1α,l k-dih9dzoneyi3-o0eu- - ka-pkopremo-07a21 -dikar0o0euil'nrkyo, γ-lakeonem.

n-Alkoholan można syntetyzować Ιρζ^ορΙι^ pozee reakcję ooetwoou hhdoomshestou o weoree V z αle.o9olancm. uehsmujoe mies5aeinę la-alko9olanu i odkogiadrjącego hydromuhpsto^ι. Wytworemy ewioeem mooehs3eie jest Zimśtylo-jjα,ja-di9hdroksy-3-okso-j7α-koerean-i4-eeOlaa,21 odimaobokshlanem, hllae39nem.

Kooehuteie, substrat Zίmptoeowh o weoree VI odpowiada weorowi VIA

o

VIA a pooZsmt 9hZookshestou ozpowiada weooowi VA

VA w których każdy e -A-A-, -BoB-, R , γ , γ i X so takie jak określono we weoree XIIIA i R¹ jess ttkijak olrnoślono we wzϋ305 V. Ko3odit3ie R³ oznaac.a atom wodoioi.

PooZskth o weooep V so ewioemami nowymi, które majo enaceoco wartość jako pośrednie w wytwareaniu ewiąemów o weoreś I, a 5włas5eea o weooee IA. Kooehs3niś, ewioeki o weooee V oZpowiaZajo weooowi VA, w którym -A-A-i -B-B- oenaceajo goupę R- oeeacea atom wodoru, niżuea goupę alkilowo lub eiżuea klmomuh, a R8 i r9 oaeem stanowig pierścień 20lspiooksaeowy:

'muf

XXXIII

Najmoo5hutniej, ewioepm o weooee V oenacea wodooometylo-jjk,jaαodihhdookuh-3o -oeuopoern-4lśno-a a,21 odimaobokshlan, γllαktoe.

Zwioepk o wenoee V można WhoZoęóeić pozpe filtoację lub eakwaueenie onetwoou opakcyjnego np. kwasem mineralnym, takim jak woZny ooetwór HCl lub kwasu siarkowego, ochłoZeenie Zo temperatury ntoceenia i ekstrakcję kooZumtu ooepuseeealmkiem noganicenhm, takim jak chlorek metylenu lub octan etylu. Ekstrakt kozemhwa się woZnym ooetwooem easaZy, susey i filtruje, po eehm usuwa oo5.ksseeealeie. Alternatywnie, ooetwór reakcyjny, eawieo

189 757 rający produkt o wzorze V można zgasić stężonym kwasem. Roztwór produktu zatęża się, chłodzi do temperatury między około 0°C do 25°C i stały produkt izoluje przez filtrację.

W zalecanej postaci realizacji, metanol i HCN usuwa się przez destylację po zakończeniu okresu reakcyjnego, za pomocą kwasu mineralnego (takiego jak kwas chlorowodorowy lub kwas siarkowy) dodawanego przed destylacją, oraz wody dodawanej po destylacji. Kwas mineralny można dodawać w pojedynczym etapie, w wielu etapach i w sposób ciągły. W zalecanej postaci realizacji, kwas mineralny dodaje się w sposób ciągły przez okres, wynoszący około 10 do około 40 minut, korzystniej około 15 do około 30 minut. Podobnie, wodę można dodawać na spód aparatu destylacyjnego w pojedynczym etapie, w wielu etapach lub ciągle. W zalecanej postaci realizacji, zatężoną mieszaninę reakcyjną chłodzi się od temperatury wrzenia wobec powrotu skroplin przed dodaniem wody. Korzystnie, mieszaninę chłodzi się do temperatury, wynoszącej między około 50°C do około 70°C, korzystnie między około 60°C do około 70°C i korzystniej około 65°C przed dodaniem wody. Następnie dodaje się wodę, korzystnie w sposób ciągły przez okres około 15 minut do około 3 godzin, a korzystniej przez około 60 minut do około 90 minut, utrzymując temperaturę w przybliżeniu stałą. Produkt o wzorze V zaczyna krystalizować od spodu aparatu do destylacji, w trakcie dodawania wody. Po dodaniu wody do mieszaniny, rozcieńczoną mieszaninę utrzymuje się w mniej więcej tej samej temperaturze przez około 1 godzinę, a potem chłodzi do temperatury około 15°C przez dodatkowy okres, wynoszący około 4 do około 5 godzin. Mieszaninę utrzymuje się w temperaturze około 15°C przez okres około 1 do 2 godzin. Dłuższy okres utrzymywania w temperaturze 15°C zwiększa wydajność cyjanoestru w mieszaninie. Ten sposób odzyskiwania zapewnia wysokiej jakości krystaliczny produkt bez operacji ekstrakcji.

Zgodnie z innym zalecanym sposobem odzyskiwania produktu o wzorze V, metanol i HCN usuwa się przez destylację po zakończeniu okresu reakcyjnego, za pomocą wody dodawanej przed lub w czasie destylacji. Dodawanie wody przed destylacją upraszcza operację, lecz postępowe dodawanie w czasie destylacji pozwala na utrzymanie zasadniczo stałej objętości w aparacie destylacyjnym. Produkt o wzorze V krystalizuje od spodu aparatu w trakcie przebiegu destylacji. Ten sposób odzyskiwania zapewnia wysokiej jakości krystaliczny produkt bez operacji ekstrakcji.

Zgodnie z jeszcze dalszą alternatywą, roztwór reakcyjny, zawierający produkt o wzorze V można zgasić kwasem mineralnym, np. 4N HCl, po czym rozpuszczalnik usuwa się przez destylację. Usuwanie rozpuszczalnika jest także skuteczne do usuwania pozostałości HCN z produktu reakcji. Stwierdzono, że wielokrotne ekstrakcje rozpuszczalnika w celu oczyszczenia związku o wzorze V nie są konieczne jeśli związek o wzorze V służy jako pośredni w procesie wytwarzania epoksymekrenonu, jaki opisano w niniejszym. W rzeczywistości takie ekstrakcje można często całkiem wyeliminować. Jeśli ekstrakcję rozpuszczalnika stosuje się do oczyszczania produktu, pożądane jest uzupełnienie przemywania rozpuszczalnika solanką i przemywania wodorotlenkiem sodu. Ale jeśli ekstrakcję rozpuszczalnika eliminuje się, przemywania solanką i sodą kaustyczną eliminuje się także. Eliminacja ekstrakcji i przemywania znacznie wzmaga produktywność procesu bez zmniejszania wydajności lub jakości produktu, a także eliminuje potrzebę suszenia przemywanego roztworu środkiem odwadniającym, takim jak siarczan sodu.

Surowy produkt lla-hydroksy-7a-alkoksykarbonylowy odbiera się ponownie w rozpuszczalniku, do następnego etapu reakcji, który jest przemianą grupy 11-hydroksylowej w grupę pozostającą w pozycji 11, wytwarzając przez to związek o wzorze IV:

IV

189 757

Λ η q 1 gdzie -A-A-, R , -Β-Β-, R i R są takie jak określono we wzorze XIII, R jest taki jak określono we wzorze V i R² oznacza niższą grupę arylosulfonyloksy, alkilosulfonyloksy, acyloksy lub halogenek. Korzystnie grupę 11a-hydroksy estryfikuje się przez reakcję niższego halogenku alkilosulfonylu, halogenku acylu lub bezwodnika kwasowego, który dodaje się do roztworu, zawierającego produkt pośredni o wzorze V. Niższy bezwodnik kwasowy, taki jak bezwodnik octowy i trichlorowcowane bezwodniki kwasowe, takie jak bezwodnik trifluorooctowy, można stosować do wytwarzania odpowiednich pozostających grup acyloksy. Jednakże zaleca się niższe halogenki alkilosulfonylowe, a zwłaszcza chlorek metanosulfonylu. Alternatywnie, grupę 1-a-hydroksy można przekształcić w halogenek przez reakcję odpowiedniego odczynnika, takiego jak bromek tionylu, chlorek tionylu, chlorek sulfurylu lub chlorek oksalilu. Inne' odczynniki do tworzenia estrów kwasu 11a-sulfonowego obejmują chlorek tosylu, chlorek benzenosulfonylu i bezwodnik trifluorom etanosulfonowy. Reakcję prowadzi się w rozpuszczalniku, zawierającym wymiatacz chlorowcowodorowy, taki jak trietyloamina lub pirydyna. Można także stosować zasady nieorganiczne, takie jak węglan potasu lub węglan sodu. Początkowe stężenie hydroksyestru o wzorze V wynosi korzystnie między około 5% i okofo 50% wagowych. Odcz.ynmk estrrffkacyjjny 2^est korzystnie obecny w lekkim midrniarze. Chlorek metylenu jest szczególnie odpowiednim rozpuszczalnikiem dla reakcji, lecz można także wykorzystać inne rozpuszczalniki, takie jak dichloroetan, pirydynę, chloroform, keton metylowo-etylowy, dimetoksystαn, keton metylowo-izobutylowy, aceton, inne ketony, etery, αeetoairryi, toluen i rerrahydrofuraa. Temperaturę reakcji ustala się przede wszystkim ze względu na lotność rozpuszczalnika. W chlorku metylenu temperatura reakcji zawiera się korzystnie w zakresie między około -10°C i około 10°C.

Korzystnie, substrat hydroksysstroąy o wzorze V odpowiada wzorowi VA

VA a produkt odpowiada wzorowi IVA

z których każdy z -A-A-, -B-B-, R³, γ1 γ¹ i X są takie jak określono we wzorze XIIIA, R1 jest niższą grupą alkoksykarbonylową lub hydroksykarbonylową, a r2 jest taki jak określono we wzorze IV. Korzystnie r3 oznacza atom wodom.

Produkty o wzorze IV są nowymi związkami, które mają zasadniczą wartość jako pośrednie w wytwarzaniu związków o wzorze I, a zwłaszcza o wzorze IA. Korzystnie, związki o wzorze V odpowiadają wzorowi VA, w którym -A-A- i -B-B- oznaczają grupę -CH2-CH2-,

189 757

R3 oznacza atom wodoru, niższa grupę alkilową lub niższa alkoksy, a R⁸ i R⁹ oazem stanowią pierścień 20-SβiroZsanowy:

A / mm

Najkorzystniej związek o wzorze IV jest wodooometylo-17a-hydroksy-l la-(mety-losulfonylo)oksy-3-oZsopregn-4-eno-7α,21-dikarboksylanem, γ-laktonem. Jeśli pożądana jest pozostająca goupa acyloksy, związek o wzorze IV jest korzystnie 7-wodooometylo-17-hydroksy-3-okso-l la-(2,2,2-trifluoro-l-oksoetoksy)-17a-poegn-4-eno-7a,21-dikaoboksyla-nem, y-laktonem; lub 7-metylo-llα((acetyloksy)-17-hγdroksy-3-okso-17α-βregn-4-eno-7α,21 -dikaoboksylanem, y-laktonem.

Jeśli trzeba, związek o wzorze IV można wyodrębniać przez usunięcie rozpuszczalnika. Korzystnie, roztwór reakcyjny najpierw przemywa się wodnym roztworem zasady, np. 0,5-2N NaOH, po czym przemywa kwasem, np. 0,5-2n HCl. Po usunięciu rozpuszczalnika reakcyjnego produkt oekrystalizuje się, np. pozez odebranie produktu w chlorku metylenu, a potem dodanie drugiego rozpuszczalnika, takiego jak eter etylowy, który obniża rozpuszczalność produktu o wzorze IV, powodując wytrącanie się go w formie krystalicznej.

Przy odzyskiwaniu produktu o wzorze IV lub przy wytwarzaniu roztworu reakcyjnego do przemiany związku pośredniego o wzorze IV w związek pośredni o wzorze II, jak dalej opisano poniżej, wszystkie etapy ekstrakcji i/lub przemywania można pominąć jeśli roztwór zamiast tego traktuje się żywicą jonowymienną, następnie żywicą kationo-wymienną. Alternatywnie, roztwór reakcyjny można najpierw traktować adsorbentami nieorganicznymi, takimi jak zasadowy tlenek glinu lub zasadowa Zoz,emionZa, po czym przemyć rozcieńczonym kwasem. Krzemionka zasadowa lub zasadowy tlenek glinu można zwykle mieszać z roztworem reakcyjnym w proporcji, w'ynosz.ącej między około 5 i około 50 g na kg produktu, korzystnie między około 15 i około 20 g na kg produktu. Zarówno pozy stosowaniu żywicy jonowymiennej jak i adsorbentów nieorganicznych, traktowanie można przeprowadzać przez proste zawieszenie żywicy lub adsorbenta nieorganicznego z roztworem reakcyjnym przy mieszaniu w temperaturze otoczenia, następnie usunięcie żywicy lub adsorbenta nieorganicznego przez filtrację.

W alternatywnej i zalecanej postaci realizacji wynalazku, produkt, będący związkiem o wzorze IV odzyskuje się w postaci surowej jako zatężony roztwór przez usunięcie części rozpuszczalnika. Ten zatężony roztwór stosuje się bezpośrednio w następującym etapie procesu, którym jest usunięcie grupy pozostającej 11α ze związku o wzorze IV, tworząc w ten sposób enesteo o wzorze II:

II gdzie -A-A-, -B-B-, r3 R⁸ i R⁹ są takie jak określono we wzorze XIII i R¹ jest takie jak określono we wzorze V. Dla celów tej reakcji, goupa R2 związku o wzorze IV może być każdą grupą pozostającą, której usunięcie skutecznie tworzy wiązanie podwójne między atomami węgla w pozycji 9 i 11. Korzystnie, grupą pozostającą jest niższa grupa alkilosulfonyloksy lub acyloksy, którą usuwa się pozez reakcję kwasu i soli metalu alkalicznego. Można stosować kwasy mineralne, lecz zaleca się niższe kwasy alkanowe. Korzystnie, odczynniki do reakcji

189 757 obejmuje dalej sól metalu alkalicznego wykorzystanego kwasu alkanowego. Szczególnie zaleca się, żeby grupa pozostająca obejmowała grupę mesyloksy i odczynnik do reakcji obejmował kwas mrówkowy lub kwas octowy oraz sól metalu alkalicznego jednego z tych kwasów lub innego niższego kwasu alkanowego. Jeśli grupą pozostającą jest mesyloksy i odczynnikiem usuwającym jest albo kwas octowy i octan sodu albo kwas mrówkowy i mrówczan potasu, obserwuje się relatywnie wysoki stosunek 9,11-olefiny do 11,12-olefiny. Jeśli w czasie usuwania grupy pozostającej obecna jest wolna woda, występuje tendencja do tworzenia zanieczyszczeń, szczególnie 7,9-laktonu

8 9 gdzie -A-A-, R , -B-B-, R i R są takie jak określono we wzorze XIII, który jest trudny do usunięcia z końcowego produktu. Skutkiem tego, stosuje się bezwodnik octowy lub inny czynnik odwadniający do usunięcia wody obecnej w kwasie mrówkowym. Zawartość wolnej wody w mieszaninie reakcyjnej przed reakcją powinna być utrzymana na poziomie poniżej około 0,5%, korzystnie poniżej około 0,1% wagowych, zmierzonego przez analizę Karla Fischera pod względem wody, na podstawie całkowitego roztworu reakcyjnego. Mimo to, zaleca się, aby mieszaninę reakcyjną utrzymywać tak suchą jak tylko możliwe do wypraktykowania, przy czym zadowalające wyniki uzyskano przy 0,3% wagowych wody. Korzystnie, mieszanina ładunku reakcyjnego zawiera między około 4% i około 50% wagowych substratu o wzorze IV w kwasie alkanowym. Korzystnie obejmuje ona między około 4% i około 20% wagowych soli metalu alkalicznego kwasu. Jeśli stosuje się bezwodnik octowy jako czynnik odwadniający, korzystnie jest on obecny w proporcji, wynoszącej między około 0,05 mola i około 0,2 mola na mol kwasu alkanowego.

Stwierdzono, że proporcje produktu ubocznego 7,9-laktonu i 11,12-olefiny w mieszaninie reakcyjnej jest stosunkowo niska jeśli odczynnik eliminujący zawiera połączenie kwasu trifłuorooctowego, bezwodnika trifluorooctowego i octanu potasu jako odczynnika do eliminacji pozostającej grupy i tworzenia enestru (9,n-olefiny). Bezwodnik trifluorooctowy służy jako odczynnik odwadniający i powinien być obecny w proporcji co najmniej około 3% wagowych, korzystniej co najmniej około 15% wagowych, najkorzystniej około 20% wagowych, na podstawie kwasu trifluorooctowego jako czynnika eliminującego.

Oprócz 7,9-laktonu, inne zanieczyszczenia i produkty uboczne, które są użyteczne jako pośrednie w syntezie oraz jako markery chromatograficzne, obserwowano w tym etapie schematu 1 syntezy. Nowy 4,9,13-trien enestru o wzorze II (np. 7-metylo-17-metylo-3-okso-18-nonpregna-4,9(11),13-trieno-13a,21-dikarboksylan) wyodrębniono chromatograficznie z roztworu produktu. Ilość tego wytworzonego związku wydaje się zwiększać ze wzrostem czasu reakcji dla tego etapu syntezy. Zakłada się, że związek tworzy się w czasie protonow^ania laktonu i powstały jon karboniowy C17 ułatwia migrację kątowej grupy metylowej z pozycji C13. Odprotonowanie tego związku pośredniego daje 4,9,13-trien.

Nnvvw σηιηρ 5-rvinnn-A' j pnpUni n smue* TT fnn wnHnrn-7-mptv1n-5R-c.virnn-17- ' C* ''Γ' X “ 'JJ'-' ““ ZddZ^ Zd ZZ ~ , d^z^dd^z dd \zd£. . · . Z ZZZ,d z . -J z _r - JJ· d .

-hydroksy-3-okso-17a-pregn-11-eno-17a,21-dikarboksylan, γ-lakton) także wyodrębniono chromatograficznie z surowego produktu. Zakłada się, że te związki tworzą się poprzez odwodnienie pozostałego odpowiednio 5-cyjano-7-kwasu i 5-cyjanohydroksye.stru, które są obecne w surowym roztworze produktu jako wynik trzeciego etapu syntezy według schematu 1.

Nowy epimer C17 enestru o wzorze II (np. wodoro-7-metylo-17-hydroksy-3-okso-17a-pregna-4,9(11)-dieno-7,21-dikarboksylan, γ-lakton) także wyodrębniono chromatograficznie z surowego produktu. Zakłada się, że warunki kwasowe reakcji eliminacji mogą powodować racemizację centrum chiralnego C17, dając 17-epimer enestru. 17-Epimer można syntetyzo40

189 757 wać bezpośrednio przez reakcję związku o wzorze IV z roztworim mrówczanu potasu, kwasu mrówkowego i bezwodnika octowego oraz izolację 17-ipimere.

Mimo, że nii aeserwawαza go jako zanieczyszczenia w roztworze surowego βtaduktu. 11-ketaz hndtoksyIstku o wzorze V można wytworzyć przez utlenienie grupy 11edyZroksn odpowiadającego hydroksyis^u odpowiednim czynnikiem utleniającym, takim jak odczynnik Jonisi. Wytworzony H-keton korzystnie jest dΌZoto-7emetnlo-17-hndtoksy--3,11-Ziatbso17αe{πegrta-4-ezo-7α.21 -Zikarbaksylazem. y-lakOnim.

Alternatywnie, grupy pozostające 11 α ze związku o wzorze IV można eliminować w celu wytworzenia inestru o wzorze II przez ogrzanie taztwote o wzorze IV w rozpuszczalniku organicznym, takim jak DMSO, DMF lub DMA.

Dalej zgodnie z wynalazkiem, związek o wzorze IV poZdaje się reakcji początkowo z alkatuanim alkInnlu, tatom jak octzn izopkaβ enylu w oeezności kwasu, tkkiego jak kwas toluezatulfonawn lub bezwodnik kwasu mineralnego, takiego jak kwas siarkowy, w celu ubu-nzenia at^ttd 3 -^ι^οΙοι

IV(Z) związku o wzorze IV. Alternatywnie 3-Izoloestek można utworzyć prziz ti'akto\edziI związku o wzorze IV bezwodnikiem kwasowym lub zasadą, takim jak kwas octowy i octan sodu. Dalszą alternatywą jest traktowanie związku o wzorze IV ketenem w obecności kwasu w celu wytworzenia związku o wzorze IV(Z). Pośredni związek o wzorze IV(Z) reaguje potem z mrówczanem metalu alkalicznego leb octanem w obecności kwasu mrówkowego lub octowego w celu utworzenia octanu Δ⁹*¹¹-molu o wzorze IV(Y)

IV (Y) który można potem przekształcić w enister o wzorze II w rozpuszczalniku akgαniczznm. korzystnie alkoholu, tdkim jak metanol, albo przez rozkład termiczny octanu enolu albo jego reakcję z alkoholanem metalu alkalicznego. Reakcja eliminacji jest wysoce selektywna wobec istre o wzorze II z pierwszeństwem wobec 11,12ealefizy i 7,9-lαktonu. i ta selektywność jest zabezpieczona przez przemianę octanu enolu w izoz.

189 757

K9oehs3eiś, suós3ort o wzoozś IV 9Zk9wiαdα wdorowi IVA

a produkt eeeutoowh odpowiada weooowi IIA

- IIA • 2 1.9 1 gdeie każdy -A-A-, -3^-, R γ i γ ooae X so takie jak określono we wdooee XIIIA i R1 jest takie jak określono we weooep V. Kooehstniś Rt oeeaeea atom wodom.

Jeśli treśba, ewioeśk o weoreś II można ienlować pozee usunięcie onekusecealeima. odebranie stałego produktu w zimnej wodzie i ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak octan etylu. Po odpowiednim przemyciu i etapach suszenia, produkt odzyskuje się pozee usunięcie rozpuszczalnika do ekstrakcji. Następnie śnesteo izoluje się pozee dodanie wody do zatężonego roztworu produktu i filtoację stałego koodumtu, usuw^ajoc pozee 3o korzystnie 7,dllaktoe. Poeemiana substratu o weoreś II w kooZSmt o weooee IA można poowadeić w sposób opisany w opisie patentowym 4 559 332, który specjalnie eałoceono w niniejuehm jako oZnieuiśeie, lub mooehstniśj przez nowo oeakcję pozy użyciu promotora ehlooowcoace3amiZs jaki opisano poniżej.

W innej postaci realizacji wynalazku, 9hdoneshśstś0 o weooee V można przekształcić w enesteo o weooep II bez izolacji ewioems pośredniego o weooee IV. W tej metodzie, hyZookshśutśo odbiera się w rozpuszczalniku organicznym, takim jak chlorek metylenu; i Zo ooetwoou dodaje się albo czynnik achlujoch, np. e9loośe metanosulfonylu albo cehenik e9l9oowcująch, np. chlorek sulfurylu. Mieszaninę miesza się i jeśli whmooehs3ann chlorowcowanie, dodaje się środek whmia3ajoeh HCl, taki jak imidadol. Reakcja 3a jest bardzo pgeo3eomieena i Zlatśgo powinno się jo prowadzić w kontrolowanym tempie poey pełnym chłodzeniu. Po dodaniu zasady uzyskano mieszaninę ogrzewa się Zo średniej temperatury, np. około 0°C do temperatury pokojowej albo nieco powyżej, i poddaje reakcji pozee okoes ewhmlp około 1 Zo około 4 godzin. Po zakończeniu reakcji, roeksseeeαleik odpędza się, mnoehutnie pod bardzo niskim ciśnieniem (np. około 600 Zo około 700 mm Hg) w temperaturze około -10°C Zo około +15°C, korzystniej około 0° do około 5°C, w celu eatężenia roztworu i usunięcia nadmiaru dasaZy. Substrat rozpuszcza się potem konoweiś w oozkuszcealeimu organicznym, koo^st^e w chlorowcowanym roepsueeealnimu, takim jak ehloośe metylenu w celu przemiany w ynesteo.

Odczynnik elimieujoch goupy poeou3ająeś wytwarza się moodhu3nie pozee mieszanie kwasu organicznego soli kwasu organicznego i czynnika 9Zwadniajocegn, korzystnie kwasu mrówkowego, mrówczanu metalu almalieeneg9 i óe5W9dnimk oe3nwegn, odpowiednio, w suchym reaktorze. Dodanie bezwodnika octowego jest śre93śomiceee i Zajp uwalnianie CO, tak, że tempo dodawania musi być w ewioeku e tym, kontrolowane. Aby pobudzić usuwanie wody, temperaturę tej reakcji utrzymuje się eooehu3eie w zakresie około 60°C Zo około 90°C, najmnoehu3nipj nmnło 65°C do około 75°C. Następnie dodaje się ten odczynnik do roztworu

189 757 produktu związku o wzorze IV, aby wykonać reakcję eliminacji. Po około 4 do około 8 godzinach, mieszaaiaę reakcyjną ogrzewa się korzystnie do temperatury, wynoszącej co najmniej około 85°C, lecz korzystnie nie powyżej około 95°C aż do usunięcia całego lotnego destylatu, a potem przez dodatkowy okres do zakończenia reakcji, zwykle około 1 do około 4 g3Zzie. Mieszaninę reakcyjną chłodzi się i po odzyskaniu przez standardową technikę ekstrakcji, ernester można odzyskać według potrzeby przez odparowanie rozpuszczalnika.

Stwierdzono dalej, że enester o wzorze II można odzyskiwać z roztworu reakcyjnego przez alternatywną procedurę, która unika potrzeby etapu ekstrakcji po reakcji eliminacji, zapewniając przez to oszczędzanie k3setów. p3lcpseeaie wydajności i/lub poprawę produktywności. W tym procesie, produkt eacstrown wytrąca się przez rozcieńczenie mieszaniny reakcyjnej wodą po usunięciu kwasu mrówkowego. Produkt następnie izoluje się przez filtrację. Nie potrzeba żadnej ekstrakcji.

Zgodnie z dalszą alternatywą dla przemiany hydroksy^t™ o wzorze V w enester o wzorze II bez izolacji związku o wzorze IV, grupę lla-hydrokln hydroklyestru o wz3oee V zamienia się na chlorowiec, a caeltcr o wzorze V tworzy się in situ przez odchlorowcowoodorowanie tconiczae. Zamianę grupy hydroksy przez chlorowiec wykonuje się przez reakcję halogenku sulfurnlu. korzystnie chlorku sulfSonlu. w zimnie w obecności środka wymiatającego w3Z3oohal3genck, takiego jak imidazol. HyZooksyeltco rozpuszcza się w rozpuszczalniku takim jak tetrahydrofuran i chłodzi do temperatury około 0°C do około -70°C. Do mieseaaian reakcyjnej dodaje się halogenek sulfurylu i ogrzewa się przez czas wystarczający do zakończenia reakcji eliminacji, zwykle około 1 do około 4 godziny. Sposób według tej postaci realizacji nie tylko łączy dwa etapy w jednym, lecz eliminuje użycie: chlorowcowanego odczynnika odwadniającego (takiego jak bezwodnik octowy lub siarczan sodu). Ponadto, reakcja nie wymaga warunków reSuRsu i unika tw3ozcaia produktu ubocznego CO, który powstaje przy stosowaniu kwasu octowego jako odczynnika odwadniającego.

Zgodnie ze leczególaie zalecaną postacią realizacji wynalazku, związek diketonowy o wzorze VI można przekształcać w epoksymeksrenon lub inny związek o wzorze I bez izolacji żadnego związku pośredniego w postaci ocznlzcz3nej. Zgodnie z tym zalecanym sposobem, roztwór reakcyjny, zawierający hnZroksyester gasi się silnym roztworem kwasu, chłodzi do temperatury otoczenia, a potem ekstrahuje odpowiednim r3zpulzczalaikiem ekstrakcyjnym. K3oenstaie, wodny roztwór soli nieorganicznej, np. około 10% wagowo roztwór solanki, dodaje się do miclzαainn reakcyjnej przed ekstrakcją. Ekstrakt przemywa się i suszy przez destylację azeotropową w celu usunięcia rozpuszczalnika metanolowego, pozostałego z reakcji rozszjecpicaia ketonu.

Otrzymany zatężony roztwór, zawierający między około 5% i około 50% wagowych związku o wzorze V, styka się następnie w zimnie z odczynnikiem acyl^ącym lub alkilsulfoaującym w celu utworzenia estru sulfonowego lub estru kwasu dikarboksylowego. Po zakończeniu reakcji alkilolulfoaylαcji lub karboksylacji, roztwór reakcyjny przepuszcza się przez kolumnę z żywicą wymienną kwasową, a potem zasadową w celu usunięcia zanieczyszczeń zasadowych i kwasowych. Po każdym przejściu, kolumnę przemywa się odpowiednim rozpuszczalnikiem, np. chlorkiem metylenu w celu odzyskania z niej pozostałego estru sulfonowego lub Zikaι'boksyloweg3). Połączone eluaty i frakcje przemywania łączy się i redukuje, korzystnie pod zmniejszonym ciśnieniem, w celu wytworzenia zatężonego roztworu, zawierającego ester sulfonowy lub ester ^karboksylowy o weooee IV. Ten zatężony roztwór styka się następnie z odczynnikiem odwadniających, zawierającym czynnik usuwający grupę pozostającą 1 dα-cstou i usuwający wodór, tworząc podwójne wiązanie 9,11. Koozyltnic, odczynnik do usuwania soup oo3os1aiacvch zawiera roztwór oZcznaaików dowαZaiai acvch kwas mrówkoe/ XX UCP · J t P wy/mrówczan metalu alkalijzaeg3/bez\vodnik octowy, opisanych powyżej. Po ukończeniu reakcji, mieszaninę reakcyjną chłodzi się i usuwa kwas mrówkowy/inne lotne składniki, pod emaicjse3anm ciśnieniem. Pozostałość chłodzi się do temperatury otoczenia, poddaje odpowiednim etapom przemywania, a potem lusen uzyskując zatężony roztwór, zawierający enester o we3ree II. Ten ene^er można następnie przekształcać w ep3ksymeklren3n lub inny związek o wzorze I przy użyciu sposobu opisanego w niniejszym lub w opisie patentowym 4 559 332.

189 757

W szczególnie zalecanej postaci realizacji wynalazku, rozpuszczalnik usuwa się z roztworu reakcyjnego pod zmniejszonym ciśnieniem i produkt o wzorze IV dzieli się między wodę i odpowiedni rozpuszczalnik organiczny, np. octan etylu. Warstwę wodną ekstrahuje się następnie z powrotem z użyciem rozpuszczalnika organicznego i powrotny ekstrakt przemywa roztworem zasadowym, korzystnie roztworem wodorotlenku metalu alkalicznego, zawierającym halogenek metalu alkalicznego. Fazę organiczną zatęża się, korzystnie pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując enestrowy produkt o wzorze II. Produkt o wzorze II można potem odbierać w rozpuszczalniku organicznym np. chlorku metylenu i dalej poddawać reakcji w sposób opisany w opisie '332 w celu wytworzenia produktu o wzorze I.

leśli w reakcji epoksydacji stosuje się trichlorowcoacetonitryl, stwierdzono, że wybór rozpuszczalnika jest istotny, przy czym najbardziej zaleca się rozpuszczalniki chlorowcowane, a szczególnie zaleca się chlorek metylenu. Rozpuszczalniki, takie jak dichloroetan i chlorobenzen dają rozsądnie zadowalające wydajności, lecz wydajności są generalnie lepsze w środowisku reakcji chlorku metylenu. Rozpuszczalniki takie jak acetonitryl i octan etylu dają słabe wydajności, podczas gdy reakcja w rozpuszczalnikach takich jak metanol lub mieszanina woda/tetrahydrokfuran daje niewiele żądanego produktu.

Dalej zgodnie z niniejszym wynalazkiem, stwierdzono że liczne ulepszenia w syntezie epoksymeksrenonu można zrealizować raczej przez użycie trichlorowcoacetamidu niż trichlorowcoacetonitrylu jako aktywatora nadtlenkowego przy reakcji epoksydacji. Zgodnie ze szczególnie zalecanym sposobem, epoksydację przeprowadza się przez reakcję substratu o wzorze IIA z nadtlenkiem wodoru w obecności trichloroacetamidu i odpowiedniego buforu. Korzystnie, reakcję prowadzi się przy pH w zakresie około 3 do około 7, najkorzystniej między około 5 i około 7. lednakże mimo tych warunków, zadowalającą reakcję realizowano poza zalecanymi zakresami pH.

Szczególnie korzystne warunki otrzymuje się przy buforze, zawierającym wodorofosforan dipotasowy i/lub buforze, zawierającym połączenie wodorofosforanu dipotasowego i diwodorofosforanu potasu w stosunku między około 1:4 i około 2:1, najkorzystniej w zakresie około 2:3. Można także stosować bufory boranowe, lecz generalnie dają one niższe przemiany niż fosforan dipotasowy lub mieszaniny K2HPO4/KH2PO4. laki by nie był zestaw buforu, powinien on zapewnić pH w zakresie wskazanym powyżej. Oddzielnie od całości kompozycji buforu lub dokładnego pH, które może zapewniać, zaobserwowano, że reakcja postępuje znacznie efektywniej jeśli co najmniej część buforu zawiera dizasadowy jon wodorofosforanowy. Uważa się, że ten jon może uczestniczyć zasadniczo jako katalizator homogeniczny w tworzeniu adduktu lub kompleksu, obejmującego promotor i jon nadtlenku wodoru, którego tworzenie może być, odwrotnie, zasadnicze dla całości mechanizmu reakcji epoksydacji. Tak więc, wymaganiem ilościowym dla dizasadowego wodorofosforanu (korzystnie z K2HPO4) może być tylko małe stężenie katalityczne. Generalnie, zaleca się, aby K2HPO4 byl obecny w proporcji co najmniej około 0,1 równoważnika, np. między około 0,1 i około 0,3 równoważnika na równoważnik substratu.

Reakcję przeprowadza się w odpowiednim rozpuszczalniku, korzystnie chlorku metylenu, lecz alternatywnie można stosować inne chlorowcowane rozpuszczalniki, takie jak chlorobenzen lub dichloroetan. Toluen i mieszaniny toluenu i acetonitrylu także okazały się zadowalające. Bez wiązania się z konkretną teorią, sądzi się, że reakcja przebiega najefektywniej w układzie dwufazowym, w którym tworzy się pośredni nadtlenek wodoru i rozkłada w stosunku do fazy organicznej o niskiej zawartości wody, a reaguje z substratem w fazie organicznej. Tak więc zalecanymi rozpuszczalnikami są te, w których rozpuszczalność w wodzie jest niska. Efektywny odzysk 7 toluenu pobudzany jest przez inkluzję innego rozpuszczalnika, takiego jak acetonitryl.

W przemianie substratów o wzorze II w produkty o wzorze I, toluen zapewnia korzyść sposobu, ponieważ substraty swobodnie rozpuszczają się w wodzie, a produkty nie. Tak więc, produkt osadza się podczas reakcji jeśli przemiany sięgają zakresu 40-50%, tworząc trójfazową mieszaninę, z której produkt można dogodnie wydzielić przez filtrację. Metanol, octan etylu, sam acetonitryl, THF i THF/woda nic okazały się tak efektywne jak rozpuszczalniki chlorowocowane lub toluen, w przeprowadzaniu przemiany tego etapu sposobu.

189 757

Mimo, że trichloroacetamid jest szczególnie zalecanym odczynnikiem, można także stosować ieee tIicholoIOwcoαcctαmiPy, takie jak tπΠullroacctamiP i chloIoPifluoIoacetrmid. Można także stosować trichloroweometylobeezamid i inne związki, mające cząstkę arylenową, alkilenową lub alkiiy^dową (lub inną grupę, która pozwala na przeniesienie efektu wycofania elektronu grupy wycofującej elektron do grupy karbonylowej amidu) między grupą trichloIOwcomctylową wycofującą elektron i grupą karbonylową amidu. Można także stosować hcptafluoIobutyrormiPs, lecz z mniej korzystnymi wynikami. Generalnie, aktywator nadtlenkowy może odpowiadać wzorowi:

R°C(O)NH2 gdzie R° oznacza grupę, mającą siłę wycofywania elektronu (jak zmierzono przez stałą sigma) co najmniej tak dużą jak grupa moeochlorometylowa. Grupa, wycofująca elektron korzystnie łączy się bezpośrednio z karboeylem amidu dla maksymalnej efektywności. Konkretniej, aktywator nadtlenkowy może odpowiadać wzorowa:

X¹ O χ² —Ć—R^p-C—NH₂ gdzie rp oznacza grupę, która pozwala na przeniesienie efektu wycofania elektronu grupy wycofującej elektron do grupy karbonylowej amidu, a korzystnie wybiera się ją spośród grupy rrylenowcj, alkeeylowej, alkinylowej i -(CX⁴χ5)r-; X\ x2, X³, X⁴ i X⁵ wybiera się niezależnie spośród chlorowca, atomu wodoru, grupy alkilowej, chlorowcoalkilowej i cyjanowej oraz cyjanoαlnilowej; oraz e wynosi 0, 1 lub 2; po warunkiem, że gdy e wynosi 0 wtedy co najmniej jeden z X\ X² i X³ oznacza chlorowiec; i gdy Rk oznacza -(C^a),,- oraz gdy e wynosi 1 lub 2, wtedy co najmniej jedee z X⁴ i X⁵ oznacza chlorowiec. Jeśli każdy z X\ χ2, χ3, X⁴i X⁵ nie jest chlorowcem, korzystnie jest grupą ehlorowcoalkilową, najkorzystniej eadchlorowcoalkilową. Szczególnie zaleca się aktywatory, w których e wyrosi 0 i co najmniej dwa χ1, X² i χ3 są chlorowcem lub te, w których Rkjest -(CX⁴X5)r-, e wynosi 1 lub 2, co eajmeiej jeden z X⁴ i X⁵ oznacza chlorowiec, ieee z X⁴ i X⁵ oznaczają chlorowiec lub naPchlorowcoalkil i X¹, X i χ3 oznaczają chlorowiec lub nαPchloIowcoalkil. Każdy z X , X', X , X i X oznacza korzystnie Cl lub F, najkorzystniej Cl, choć mieszane halogenki są także odpowiednie, jak eaPchloIoalnil lub eadbromoalkil i ich połączenia, pod warunkiem, że atom węgla bezpośrednio dołączony do grupy karbonylowej amidu podstawiony jest co najmniej jedną grupą chlorowcową.

Korzystnie aktywator nadtlenkowy jest obecny w proporcji, wynoszącej co eajmeiej jeden równoważnik, korzystniej między około 1,5 i około 2 równoważniki substratu obecnego początkowo. Nadtlenek wodoru powinien być załadowany do reakcji w co eajmeiej średnim nadmiarze, lub dodawany progresywnie w trak^-ie trwania reakcji epoksydacji. Choć reakcja zużywa tylko jedee lub dwa równoważniki nadtlenku wodoru ea mol substratu, nadtlenek wodoru ładuje się korzystnie w znacznym nadmiarze w stosunku do aktywatora obecnego początkowo. Bez ograniczania wynalazku do poszczególnej teorii, uważa się, że mechanizm reakcji wiąże się z tworzeniem adduktu aktywatora i anionu nadtlenku, że tworzenie się tej reakcji jest odwracalne- przy równowadze z przewagą reakcji odwrotnej, oraz że znaczny początkowy nadmiar nadtlenku wodoru jest zatem konieczny w celu napędzania reakcji naprzód. Temperatura tej reakcji nie jest ściśle krytyczna, i można ją efektywnie prowadzić w zakresie, wynoszącym około 0°C do około 100°. Generalnie, zalecana temperatura wynosi między około 20°C i około 30°C lecz przy pewnych rozpuszczalnikach, np. toluenie, reakcję możea korzystnie prowadzić w zakresie około 60°C do około 70°C. Przy około 25°C reakcja zwykle wymaga mniej niż 10 godzin, zwykle około 3 do około 6 godzin. Jeśli trzeba, w celu uzyskania pełnej krzemiany substratu, można dodać dodatkowy aktywator i eadtleeek wodoru, przy końcu cyklu reakcyjnego.

189 757

Pozy końcu cyklu reakcyjnego usuwa się fazę wodną, roztwór organiczny korzystnie przemywa się w celu usunięcia zanieczyszczeń rozpuszczalnych w wodzie, po którym produkt można odzyskiwać przez usunięcie rozpuszczalnika. Przed usunięciem rozpuszczalnika, roztwór reakcyjny powinno się przemyć środkiem do przemywania co najmniej łagodnym do średnio zasadowego, np. węglanem sodu. Korzystnie, mieszaninę reakcyjną przemywa się sukcesywnie z użyciem: łagodnego roztworu redukującego, takiego jak słaby (np. około 3% wagowo) roztworem siarczynu sodu; roztworem zasadowym, np. NaOH lub KoH (korzystnie około 0,5N); roztworem kwasu, takiego jak HCl (korzystnie około IN); i na koniec przemycie środkiem obojętnym, zawierającym wodę lub solankę, korzystnie nasyconą solanką, w celu zminimalizowania strat produktu. Przed usunięciem rozpuszczalnika reakcyjnego, można koozystnie dodać drugi rozpuszczalnik, taki jak rozpuszczalnik organiczny, korzystnie etanol tak, że produkt można odzyskiwać przez krystalizację po destylacji w celu usunięcia bardziej lotnego rozpuszczalnika.

Powinno się zrozumieć, że nowy sposób epoksydacji, wykorzystujący toichloroacetamid lub inny nowy aktywator nadtlenku, ma zastosowanie poza różnymi schematami wytwarzania epoZsγmeZoen3nu i w rzeczywistości można go stosować do tworzenia epoksydów poprzez podwójne wiązania olefmowe w wielu różnych substoatach poddanych reakcji w fazie ciekłej. Reakcja jest szczególnie efektywna przy związkach nienasyconych, w których olefiny poddaje się tetrasubstytucji i trisubstytucji, to jest R^aR^bC=R^cRd oraz R^aR^bC=CR^cH gdzie R^a do Rd oznacza podstawniki inne niż atom wodoru. Reakcja postępuje najszybciej i w sposób pełny przy wiązaniu podwójnym poddanym tetoasubstytucji. Przykłady substratów dla reakcji epoksydacji obejmują Δ⁹Ί -kanocnon i następujące substraty:

189 757

Ponieważ reakcja postępuje szybciej i pełniej z wiązaniami podwójnymi poddanymi trisubstytucji i tettasubstntucji, jest to szczególnie efektywne Zla selektywnej epoksydach przez takie wiązanie podwójne w związkach, które mogą obejmować izze wiązania podwójne, gdzie atomy węgla olifiny poddaje się mazasuestntueji lub nawet disuestytueji.

Izzymi nii ograniczającymi przykładami ilustrującymi ogólnej riakcji ^oksydacji są następujące reakcje epoksydach:

Powinno się Zalej zrozumieć, że riakcję można stosować korzystnie w epoksyZacji monopaZstawianned leb nawet ZiβaZstawianyeh wiązań podwójnych, takich jak 11,12-alIainowneh w ^/.10011 suestrαtaed stetoidowneh. Jednakże, ponieważ przeważnie epoksyduje ona więcej wysoko podstawionych wiązań podwójnych, zp. 9,11-olIfinawycd. z wysoką selektywnością, sposób wiZług tigo wynalazku jist szczigólnie efektywny dla uzyskiwania wysokich wydajności i βiΌdektywzaścl w etapach epoksydami różnych schematów reakcji opisanych gZzii indziej w niniejszym.

189 757

Ulepszony sposób okazał się szczególnie koodystnym zastosowaniem w whtga:n·eanis:

przez ep9muhdację:

i wytwarzanie:

pozee epomuhdację·.

Wiele mnozyśei przedstawiono Zla upos9bs wytwarzania ewioeku według wynalazku, w którym stosuje się trie9loonacśtαmid zamiast 3richloooacetonitohls jako odczynnika przenoS5ąceg9 atom tlenu dla opamcji ep9muhsαeji. Układ oicehnnima ma niskie k9wie9wae3wo do olefin ubogich w ρ^,ο^, w subs3oαtaeh. zawierajocych oba typy wiozań podwójnych. Dodatkowo, w ssbutoa3aeh eomplśkuowheh, takich jak steroidy, olefiny dik9dttawi9nś i toipodstawione można różnicować przez reakcję. Tak więc, obserwuje się dobro selektywność w epomuhiacji ieomś0he5ehe9 zwiozków Δ-9,11 i Δ-l 1,12. W tym wypadku, śp9eshZ 9,11 tworzy się z minimalna reakcja izomeru, zawierajocego wiozanip podwójne A-l 1,12. W ewioeku z tym, wydajność reakcji, profil pooZsmtu i końcowa czystość so znacznie wzmocnione w porównaniu z reakcjami, w których stosuje się toic9loooweoacetonitohl. Stwierdzono także dodatkowo, żś znaczny nadmiar tworzenia się tlenu obserwowany pozy

189 757 stosowaniu tr^chlo^^wcoacetonitoylu jest zminimalizowany przy trichloroacetamidzie, powodując poprawę bezpieczeństwa procesu epoksydacji. Dalej, w przeciwieństwie do reakcji pobudzanej przez toichloooacetonitoyl, reakcja z trichloroacetamidem wykazuje minimum efektów egzotermicznych, ułatwiając w ten sposób kontrolę profilu cieplnego reakcji. Efekty mieszania obserwuje się jako minimalne i wydajność reaktora bardziej stałą, co jest dalszą korzyścią nad procesem z trichloroacetonitrylem. Reakcja jest łatwiejsza do zwiększania skali niż reakcja pobudzana toichloooacetonitoylem. Izolacja produktu i oczyszczanie jest proste. Nie obserwuje się utleniania Bayeoa-Villagera Zaobonylowej grupy funkcyjnej (przemiana ketonu w ester pobudzana nadtlenkiem) jak doświadczono przy użyciu kwasu m-chlooopeooksybenzoesowegw lub innych nadkwasów. Odczynnik jest niedrogi, łatwo dostępny i łatwo go obrabiać.

Oprócz tego, następujące związki obserwowano pozez chromatografię w surowym produkcie z etapu schematu 1 syntezy, w którym enester o wzorze II przekształca, się w związek o wzorze I:

(1) nowy 11α,12α epoksyd enestru o wzorze II, np. wodoiO-7-metylo-l la.lda-oą/oksy17-hydowks—-3 -okso-17 a-poegn-d-enoda© 1 -dikaobokoγlan, y-laktwn;

(2) nowy 4_l5:9,1S-dizβwko—d enestou o wzorze II np. wodoro-7-metylo-4α_l5α;9α_l11αdiepok2y-ⁿ 7-hydroZoy-3-okso317a-pr-gnano-7a_l21 -dikaobwks—lan, y-lakton;

(3) nowy 12-keton enestru o wzorze II np. wodoro-7lmeaylo-17lh³droksy-3l12-diokso17α-pr3gna-^g-diano-7α.,2 1 -dikarbokeylanl γ-luZto n^g (4) nowy 9J 1-dihy'diOZ.s— enesnou o wzorze II np. wodoro-7Ime3ylo-9α_l11β,17dihydrokzyU-okso-17a-βrγgn3l4-eno-7a_l21 -dikarboZoylan_l y-^-aktg3;

(5) nowy analog U-h-droZsy enes^-™ o wzorze II, np. w3doroI7Ime3γlo-12α_l17t dihydroksy-3-okso-S7a-βregna-4,9(11)-dien3-7a_l2SIdikaobokoylan_l y-laZton; oraz (6) nowy 7-kwas związku o wzorze I, np. kwas 9,11 αteβwZsγ-S7-hydIΌksy-3-okso-17αβregn-4tzn3-7a_l2S- diZaOboksylowe—^- γ-lak ton.

Związki te mają wykorzystanie jako syntetyczne związki pośrednie i/lub markery chow—atografiązne w e^oajwarzaniu zw^zku o ws-ze I, ozcza^gólniz zβ3ksγmeksrsnoou.

Zakłada się, że 11α,12 α-epoksyd enestru o wzorze II tworzy się przez zanieczyszczenia wytworzone podczas poprzedniego etapu, w którym związek o wzorze IV przekształca się w enesteo o wzorze II. To zίldi^zczwozczenie ——izo^—owz—o chor3metogoaficznie i -izst to A^11,1 —ester Tworzy zte on zwykte z eneztrem Δ^3,11 w stoo—iku okoto 90 TO twitesteu ii it —i π ^ν — ιγιΔ , renzstou Δ ’ ), chociaż ten stosunek może się zmieniać. Utlenianie enestou Δ ’ podczas przemiany znestru o wzwoze II w związek o wzoozz I daje 1 Sα.,S2u-epoko—d.

4,5:9, H-epoksyd znestou o wzwoze I wyizolowano chromatograficznie. Zakłada się, że pochodzi on z nadepoksydacji wnzstru. Ob-eoe-uje się go zw—zlz w oszΌrv—— pr3dsaZcie na poziomie okwłw 5%o wagowych lub mniej, chocia^s il ość ta moee się zmieniać.

U-Kiton znes-ru o wzorze II w—izw loeocno cł3Όmatogoafioznie. Zak⁽ada się, że powstaje wn z allilicznego utleniania enestru. Obserwuje się zwykle w surowym produkcie na poziom iw okwłw 5%o —agowyuh mniej, chociaż ilość ta mwże się zmienioć. Pozizoi U-ketonu ——m-ylzgw w surowym βroduZoie_l po użyciu trichloroacetonito—lu jakw aktp-^oto-a nadfienZu wwdwou, był wyższy niż poziwm wykryty prz— otooowanis trizhlwooaze3a—idu joko aktywatora.

9,1 l-dih—drok syenzwteo w wzorze II wyi ztkwono cł3Όmo3ogoz^zicznie. Obsz raztye si³ gw zwykle w surowym produkcie no poziomie okwło ⁰%o wagowych lub mniej, chwdoż ilość ta mwże się zmieniać. Zakłoda się, że powstaje on z hydrolizy eβwksγds o wzorze I.

12tHydroksγzneoter o wzorze II —yizwlo—ano chromatograficznie. Obserwuje się go 7wvkle w snrowvm nrodukcie na noziomie około 5% wagowvch lub mniei. chociaż ilość ta mwże się z—ieniać. Zakłada się, żz po—staje on z hydroliz— 11,12-eβokoγdu z późniejszą eliminacją ^{1 z}

Poza ty—, związki o —zorze I ——tworzone zgodnie z t—— wpisz—, —wżna dwdatkowo —wdγk_iZ_W—a^y w celu uzys kania —etobolitu, βoehodnz-l prwleku lub innego o ulepszony—³—łaśziwwśz^lach (tokich jak s^lzpazono oowβsszczalność ^- obβoopc,a)l które ndatweioją poduovanie i/lub skuteczność epz^hzym ekzoenwnu. Grupa ^z-hydroko— zw^,pzku o tYzwrze I (np). wwdorot7-—et-buń-, 17-dihy^p3ok—y-^-, 11 unepok sy-3-oksOh 17α-βoegn-4-znos7αl^g 1 -dikarboko—ⁱanl γ-laZtwn) jeo- nowym zwiawdem, który zidentyfikowano Iβkw —wżiiw— — ztobolit u szoγura. Mzta189 757 bolit 6-hydroksy można wytwarzać z odpowiadającego eteru etyloezole (np. wodoro^-metylo-9,11d-epaksn- 17ehydroksy-17αepregn-4-enoe7α,21-dikαrbobsnldn, γ-lakton). Eter etyloenolown związku o wzorze I można wytworzyć zgodnie z procedurą przedłożoną w peblikacji R.M.Weiir i L.M.Hofmaz (J.MeZ.Chim. 1977, 1304), którą załącza się w niniejszym jako odniesienie, etir etnloenolown poddaje się potem reakcji z kwasem m-chloronadbeznoesowym, uzyskując odpowiadającą pochodzą 6-dndroksy związku o wzorze I.

Zakłada się Zalej, że sole monokarboksylawe Iβaksymeksrenonu, szczigólnii sole potasowe i saZowe, są odpowiednią alternatywą wobic ułatwienia podawania związku o wzorze I osobom, dla których wskazane jest podawanie pochodnych alZosteronu. W warunkach łagodził zasadowych możliwe jest selektywne otwarcie tβirolaktonownch związków o wzorze I, biz hydrolizy grupy estrowej C7, dając odpowiadający analog kwasu 17βedydroksy-17ae -(--propionowIgo). Te analogi o otwartym łańcuchu są bardziej polarne niż ich odpowiedniki laktonowe i mają krótszy czas retencji przy analizie przez HPLC z odwrotną fazą. Warunki kwasowi generalnie powoZują regenerację pierścienia laktonowego.

W warunkach bardziej wymuszonych, splrolabtan otwiera się i ester C7 hnZrolizujI. Zając odpowiadające produkty uboczne, analogi kwasu 17β-hydroksy-17α-(3-βtoβionowego) związków o wzorze I. Ti kwasy karboksylowe mają krótszy czas retencji niż kwasy mozoka^ boksylowi przy analizie przez HPLC z odwrotną fazą. Warunki kwasowi (np. traktowanie rozcieńczonym kwasem, takim jak 0,1-4 M kwasem edlorowodotownm) generalnie powodują powodują rIgInItaeję pierścienia laktozowego kwasu Zikarboksylowigo.

Nowy sposób epaksndaeji jest wysoce użyteczny jako kończący etap syntezy według schematu 1. W szczególnii zalecanej postaci realizacji, całość procesu według schematu 1 postępuje następująco:

NH,

HCI, CK,OH, H,O, 80 *C,Sh

O

My4roksy«ster O

189 757

t. Zabtzplaczanla I. Redukcja

Ze schematu zilustrowanego powyżej, będzie zrozumiałe, że wybrane etapy reakcji zapewniają zasadniczą elastyczność w produkcji epoksymeksrenonu i związków pokrewnych. Kluczowe cechy obejmują między innymi: (a) biokonwersję substratu, takiego jak kanrenon, androstendion lub β-sitosterol w pochodną lla- lub 9a-hydroksylową (z równoczesną przemianą β-sitosterolu w strukturę 17-ketonową; (b) wprowadzenie podwójnego wiązania 9,11 przez odwodnienie związku zawierającego albo grupę lla- albo 9a-hydroksylową, po czym wprowadzenie grupy epoksy przez utlenienie podwójnego wiązania 9,11; (c) dołączenie 7a-alkoksykarbonylu przez utworzenie enaminy, hydrolizę enaminy do diketonu i reakcję diketonu z alkoholanem metalu alkalicznego; (d) tworzenie pierścienia 20-spiroksanowego w pozycji 17; (e) tworzenie 5,7-laktonu i estryfikację laktonu do 7-alkoksykarbonylu; (f) zabezpieczenie 3-ketonu przez przemianę w 3-enoloeter lub 3-ketal podczas różnych przemian przy innych pozycjach (łącznie z tworzeniem się pierścienia 20-spiroksanowego w pozycji 17). Z kilkoma ograniczeniami, te cztery elementy składowe sposobu (b) do (d) można prowadzić w prawie każdej kolejności. Elementy sposobu (e) i (f) oferują porównywalną elastyczność. Zapewniają one drogę do epoksymeksrenonu i innych związków o wzorze I, które są znacznie prostsze w porównaniu z procesem z opisu patentowego U.S. nr 4 559 332. Ponadto, zapewniają ważne korzyści w produktywności i wydajności.

W opisach schematów reakcji jakie przedłożono powyżej, odzyskiwanie, izolację i oczyszczanie produktów reakcji, można generalnie przeprowadzić metodami dobrze znanymi dla specjalistów. Z wyjątkiem oznaczeń przeciwnych, warunki, rozpuszczalniki i odczynniki są albo konwencjonalne, nie specjalnie krytyczne, albo oba. Jednakże, pewne konkretne procedury jakie szczególnie opisano powyżej, zapewniają korzyści, które nadają przeważającą wydajność całości i/lub produktywność różnych etapów sposobu i schematów sposobu, i/lub wysoką jakość związków pośrednich oraz ostatecznych produktów 9,11-epoksysterodiowych.

189 757

Wykorzystanie związków 20-spiroksanowych wytworzonych według wynalazku opisuje się w opisie patentowym Groba U.S. nr 4 559 332, który specjalnie załącza się w niniejszym jako odniesienie.

Związki 20-spiroksanowe wytworzone zgodnie z podanym sposobem, odróżnia się przez przeważające biologiczne właściwości i są zatem wartościowymi aktywnymi składnikami farmaceutycznymi. Przykładowo, mają silne działanie antagonistyczne wobec aldosteronu, redukując i normalizując nadmiernie wysoką retencję sodu i wydzielanie potasu powodowane przez aldosteron. Mają zatem, jako diuretyki chroniące potas, ważne zastosowania terapeutyczne, np. w leczeniu nadciśnienia, niewydolności serca lub marskości wątroby.

Pochodne 20-spiroksanowe, mające działanie antagonistyczne wobec aldosteronu, są znane, patrz np. Fieser i Fiissz: Steroids; strona 708 (Renhold Publ.Corp., Nowy Jork, 1959) oraz brytyjska publikacja patentowa nr 1 041 534; znane są także analogicznie aktycwne kwasy 17P-hydroksy-21-karboksylowe i ich sole, patrz np. opis patentowy nr U.S 3 849 404. Związki z tego rodzaju, które dotychczas stosowano w terapii, mają jednak poważne wady, ponieważ posiadają pewną aktywność specyficzną wobec seksualności, która prędzej czy później, daje kłopotliwe konsekwencje w zwyczajowej terapii długoterminowej. Zwłaszcza niepożądane są kłopotliwe skutki, które można przypisywać aktywności anty-aadrogenicznsj znanych preparatów anty-aldosteronowych.

Związki według wynalazku oraz sposoby ich wytwarzania, opisuje się dalej w następujących przykładach.

Przykład 1

Schemat 1: Etap 3D: Metoda A: Wytwarzanie y-laktonu 9,11α-sρoksy-17α-hydroksy-3-oksoprt^]^i^-‘^;^-^t^ii^(^-7(^,;21-dikarboksylanu wodoro-metylowego

Czteroszyjny reaktor z płaszczem o pojemności 500 ml zaopatrzono w mechaniczne mieszadło, chłodnicę/bełkotkę, termometr i wkraplacz z rurką doprowadzającą azot. Do reaktora wprowadzono 8,32 g surowego enestru w 83 ml chlorku metylenu przy mieszaniu w atmosferze azotu. Dodano do tego 4,02 g dwuzasadowego fosforanu potasowego, potem 12 ml trichloroacetonitrylu. Dopuszczono z zewnątrz zimną wodę do płaszcza reaktora i mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury 8°C. Przez wkraplacz dodano 36 ml 30% nadtlenku wodoru w ciągu 10 minut. Mieszanina reakcyjna początkowo zabarwiona na jasnożółto zmieniła się na prawie bezbarwną po zakończeniu dodawania. Mieszanina reakcyjna pozostawała w temperaturze 9±1°C w ciągu dodawania i kontynuowano mieszanie przez noc (ogółem 23 godziny). Do mieszaniny reakcyjnej dodano chlorek metylenu (150 ml) i całą zawartość wlano do -250 ml wody z lodem. Ekstrahowano trzy razy równymi porcjami 150 ml chlorku metylenu. Połączone ekstrakty chlorku metylenu przemyto 400 ml zimnego 3% roztworu siarczynu sodu, aby rozłożyć pozostały nadtlenek. Następnie myto 330 ml zimnego IN wodorotlenku sodu, 400 ml zimnego IN kwasu chlorowodorowego i na koniec 400 ml solanki. Fazę organiczną wysuszono nad siarczanem magnezu, przesączono i placek filtracyjny przemyto 80 ml chlorku metylenu. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 9,10 g surowego produktu jako jasnożółte ciało stałe. Rekrystalizowano je z ~25 ml 2-butanonu, uzyskując 5,52 g prawie białych kryształów. Końcowa rekrystalizacja z acetonu (—50 ml) dało 3,16g dłK^gicł,, igaastych kiy^sztalów o jempzcaturze o^p^ni^nm = 24l2243°C.

NMR Ή (CDCb): 5,92 (1H, s), 3,67 (3H, s), 3,13 (1H, d, J=5), 2,89 (1H, m), 2,81-2,69 (15H, m), 1,72 (1H, dd, J=5,15), 1,52-1,22 (5H, m), 1,04 (3H, s).

Przykład 2

Schemat 1: Etap 3A: Metoda D: WySwczzanis y-laktonu 11α,17αldihydroksyl3lokso_-ρseia^_l4_-sno_-7a,21-dikarboksylanu wodoro_-msSyloweao

4^lS(4'(a),7'c-hsksadekahydro-11 'a-hvdrkksy1l 0'β,3 3'β^ΐιηβΙγ1ο-3',5,20'-Ε^5θ8ρ0Γθl[furano-2(3H),17'0l[4,7]metαno[17Hicyktopenta[a]fsnantreao]l5'β(5Ή)-kaρboaitρyl (1 równoważnik) poddano reakcji z meSylansm sodu (4,8 równoważnika) w rozpuszczalniku metanolu w obecności jodku cynku (1 równoważnik). Obróbka produktu reakcji była albo zgodna ze sposobem ekstrakcyjnym opisanym tutaj, albo przy użyciu sposobu nisekkS-ckcyjnsgo, w którym wyeliminowano etapy ekstrakcji chlorkiem metylenu, mycia solanką i wodorotlenkiem sodu oraz suszenia kiarczaasm sodu. Również w tym nieekstrakcyjnym sposobie toluen

189 757 eastąkioe9 5% (wagowo) roztworem kwaśnego węglanu sodu. Jako produkt Wh9doęóni9e9 γ-lamton ł lk,j7αodl9hdroksy---oksokoegn-4-en9-7α,2j-dikaodnkuhlanu wndnroomet^lnwpgo.

Przykład Schemat 1: Etap 3C: Metoia E: Wytwarećmie h-lam3nnu 17α-hhdrokuho-l9ks9poegnαl -4,9(1 l)liien9-7a,2j-iimaodomuhlanu woioro-metylowśg9

Do tnójszyjnej omoą^łndeenej kolby o pojemności 2 litrów, ea9pa3oeonej w mieszadło mechaniczne, weoaplaee i teomoparę wprowadzono 9hiromshśsteo (100 g; 0,22 mola), wytworzony jak w przykładzie 2. Używano obiegowej łaźni e9l9ieąeej z automatyceno kontrolo temperatury. Pozei reakcjo kolbę Whsuueon9 ee względu na wrażliwość chlorku me3aeouulf9nhlu na woię.

Do kolby wpoowadeono chlorek metylenu (1 lito) i 9hirokuhestśo rozpuścił się w nim pozy mieszaniu. Roztwór neh1odeon9 do temperatury 0°C i pozee wkoaplace doiano do kolby chlorek mś3ae9sslf9ehlu (25 ml; 0,32 mola). Do reaktora doiano pozee weoaklaee toiety^aminę (50 ml; 0,59 mola) i weoaplaee przemyto dodatkowo chlorkiem metylenu (34 ml). Dodanie toiśtyl9αminh było bardzo ege93eomieene. Czas ioiawania wyniósł około 10 minut poey mieszaniu i ehl9ieenls. Mieszaninę och1oid9eo do temperatury 0°C i utrzymywano w tej temperaturze pozy mieszaniu pozee dodatkowe 45 minut, podczas gdy górno przestrzeń kolby reakcyjnej przedmuchano aeotem. Próbkę mieszaniny reakcyjnej analizowano potem poey użyciu chromatografii eienko\r'aou3\enwej i \ryuoeoupoaweej chromatografii cieczowej ila sprawdzenia zakończenia reakcji. .Mie'ueaeieę następnie mieszano w temperaturze 0°C poeee dodatkowe 30 minut i ponownie ukoawde9n9 eαm9ńceeniś reakcji. Analiza wykazała, że reakcja istotnie zakończyła się w tym punkcie; roepusecealeik chlorek metylenu odpędzono w temperaturze 0°C pozy 660 mm Hg. Analiza pozee chromatografię gazowo destylatu wykazała obecność zarówno ehloomu metanouulfonhls jak Metyloaminy. Potem doiano do reaktora ehl9oek metylenu (800 ml) i powstało mieszaninę mieszano pozee 5 minut w temperaturze w zakresie 0-15 °C. R9epuueeealnlk znów odpędzono w temperaturze 0-5 °C poey 660 mm Hg, sehsesjąe mesylan o wzorze IV, w którym Rt oznacza H, i lB-B- oeeaceajo -CH2-CH2l, a R1 oznacza me3okuhkaobnnhl. Czystość produktu wyniosła 90-95 w % powierzchni.

Aby wytworzyć reagent eliminujocy zmieszano mrówczan potasu (23,5 g; 0,28 mola), kwas mrówkowy (80 ml) i dpewodnim octowy (40 ml) w nddeiplehm suchym reaktorze. Kwas mrówkowy i bezwodnik octowy przepompowano do reaktora i poiceas dodawania bezwodnika octowego utrzymywano temperaturę nie wyższo niż 40°C. Mieszaninę stanowioco reagent elimiesjąeh ogrzewano do temperatury 70°C, aby pozbyć się wody z układu oekeehjnśgo. Tę reakcję e9etyeu9wae9, aż zawartość wody była niżsea niż 0,3% wagowo, jak mierzono pozy pomocy analizy Kaola Fishera. Roetwóo reagenta elimieujocego przeniesiono następnie io reaktora, 5awieoajocego stężony roetwóo .suoowśg9 mysilmu, wytworeony jak opisano wyżej. Otrzymano mieszaninę ogoepwano do temperatury najwyżej 95°C i odbierano lotny destylat, aż destylat już się nie tworzył. Destylację przerwano w temperaturze około 90°C. Po 5ak9ńczeniu destylacji mieszaninę reakcyjno mieszano w temperaturze 95°C pozee dodatkowe 2 godziny i zakończenie reakcji ukoawie9no przez chromatografie eieee-\rααos3\rΌwą. Gdy reakcja zakończyła się, ne9łndenno reaktor do temperatury 50°C i usunięto e mieszaniny reakcyjnej kwas mrówkowy ooae ooepssecealeik poey 660 mm Hg w tśmkeoαtsoee 50°C. Koncentra, 9e9łnie9no do temperatury k9moj9wej, iodano potem octan etylu (688 ml) i mieszaninę octanu etylu i knneśntoatu mieszano pozee 15 minut. Wtedy wkoowaieon9 12% roetwóo solanki (688 ml), żeby pomóc w usunięciu 5keieezhueceeń ooepusecealnych w woizie z fazy organicznej. Następnie knenutawi9eo fazy do odstania na 20 minut. Warstwę woino przeniesiono do innego naczynia, do którego wprowaieono dodatkowo ilość octanu etylu (-50 ml). Powtórno ekstrakcję warstwy woinej Whk9ean9 przez 30 minut, po czym p95ostawi9e9 fazy io odstania i p9loceono warstwy octanu etylu. Do połoceonhe9 warstw octanu etylu i9dan9 nasycmy roztwór chl9oeu sodu (600 ml) i prowadzono mieszanie pozee -0 minut. Potem fazy koeou3awi9e9 do odstania. Warstwę woino usunięto. Wykonano dodatkowe mycie c9l9oeiśm soZu (600 ml). Fazę organiczno oddzielono oi drogich końcowych pozemywek. Następnie faeę organiczno przemyto IN woi9rotleneiśm soiu (600 ml) pozy mieszaniu przez -0 minut. Fazy 9it3αwα1h się pozee 30 minut, żeby usunoć woino warstwę. Spoa-wieono pH wodnej warstwy i 5ealśei9n9, że wynosi >7. Prowadzono dalsze mycie nasyconym roztworem chlor189 757 ku sodu (600 ml) przez 15 minut. Ostatecznie zatężono fazę organiczną przy 660 mm Hg w temperaturze 50°C i produkt odzyskano przez filtrację. Końcowy produkt był piankowatym brązowym ciałem stałym, które suszono. Dalsze suszenie w temperaturze 45°C pod zmniejszonym ciśnieniem przez 24 godziny dało 95,4 g produktu, eneltou, n-lαktoau 17α-hnZroksy3-3ks3pregna-4,9(11)-dieao-7α,21-dikaob3ksnlanu wodoro-metylowego, w którym oznaczono 68,8%. Molowa wydajność wyniosła 74,4% skorygowana dla wyjściowego hydroksy^-tou i końcowego ern^e^t^ir^.

Przykład 4

Schemat 1: Etap 3D: Metoda C: Synteza y-laktonu 9,11a-cpoksy-17α-hndooOly-3-3kl3pregn-4-eao-7α.2d -dikarboksylanu wodoro-metylowego

Do reaktora o pojemności 100 ml wprowadzono enester o wzorze IIA (5,4 g, o zawartości 74,4% cacstou). Do enestou dodano trijhl3ooacctamid (4,9 g) i wodorofosforan dipotasowy (3,5 g) oba w stałej postaci, potem chlorek metylenu (50 ml). Mieszaninę ochłodzono do temperatury 15°C i dodano 30% nadtlenek wodoru (25 g) w ciągu 10 minut. Pozwolono dojść mieszaninie reakcyjnej do temperatury 20°C i mieszano w tej temperaturze przez 6 godzin, po tym czasie sprawdzono konwersję na drodze HPLC. Oznaczono pozostały eaelter jako mniej niż 1% wagowo.

Mieszaninę reakcyjną dodano do wody (100 ml), pozostawiono fazy do rozdzielenia i u^s^i^^^io warstwę ehlooOu metylenu. Dodano do war^^tip^^ chlorku metylenu wodorotlenek sodu (0,5N; 50 ml). Po 20 minutach fazy pozostawiono do rozdzielenia i dodano HCl (0,5N; 50 ml) do warstwy chlorku metylenu, po czym fazy pozostawiono do rozdzielenia i fazę organijeaą przemyto nasyconą solanką (50 ml). Warstwę chlorku metylenu wysuszono nad μοmagnezu i usunięto rozρuszcealnik. Otrzymano białe ciało stałe (5,7 g). Wodną warstwę wodorotlenku sodu zakwaszono i ekstrahowano, a ekstrakt poddano obróbce, oto^ymując dodatkowe 0,2 g produktu. Wydajność cpoksymeklrenoau wyniosła 90,2%.

Przykład 5

Wytwarzanie n-laktoau 1 la, 12a-ep3ksy-17-hydroksy-3-okso-17α-pregn-4-en3-7α,21-woZ3rodikarboklylanu 7-metylowego

19

Olefina Δ ’ “ z enestou jest produktem ubocznym eliminacji 11^^^^ Wydzielono jzyltą próbkę z mieleaninn reakcyjnej wytworzonej jak w przykładzie 3 pozez powtarzaną poeparatywaą chromatografię cieczową. Tak więc 73 g pozostałości (wytworzonej jak opisano w przykładzie 3) oho3matografowaa3 na 2,41 kg żelu krzemionkowego Mercka (40-63 μ) z gradientem układu elucyjnego octan etylu, toluen (20:80, 30:70, 40:60, 60:40, objętościowo). Połączono wzbogacone porcje olefiny Δ^η’¹² z wybranych frakcji 30:70. TLC na płytkach EMF, stosując octan etylu/toluen 60:40 (objętościowo) z wizualizacją pozy użyciu kwasu siarkowego i SWUV służyła jako wskazówka do wyboou odpowiednich frakcji. 7,9 g surowej olefiny Δ^ΗΊ² (80% powierzchni według HPLC) otrzymanej po usunięciu rozpulzozalaika.

ρ \ χ ✓ P »> χ v x ' chromatografio wano na 513 g żelu krzemionkowego MeocOa (40-63 (μ) z gradientem układu elucyjnego octan etylu/chloreO metylenu (10:90, 20:80, 35:65, objętościowo). Czysty y-laOton 17-hydroksy-3-okso-17α-pregna-4,11-Zieao-7α.21-woZooodikαrboksylanu-7-metylowego (3,72 g) otrzymano z wybranych frakcji 20:80.

Selekcja frakcji opierała się na ocenie przez TLC jak w sytuacji popozcdaiej.

MIR cm’1: 1767 (lakton), 1727 (ester), 1668 i 1616 (3-keto^45).

NMR *H (CDC1₃) ppm: 1,05 (s, 3H), 1,15 (s, 3H), 3,66 (s, 3H), 5,58 (dd, 1H), 5,80 (s, 1H), 5,88 1dd, 1DC

189 757

NMR 13C (CDCl3) ppm: 17,41, 18,58, 21,73, 28,61, 32,28, 33,63, 34,91, 35,64, 35,90, 38,79, 42,07, 44,12, 48,99, 49,18, 51,52, 93,81, 126,43, 126,69, 133,76, 166,24, 172,91, 176,64, 198,56.

Roztwór 1,6 g (3,9 mmola) y-laktonu 17-lr^y^^i^ro^ssy-^-c4^i^co^17a-pnegn;a^^zl,11-dieno7a,21-wodorodikarboksylanu 7-metylowego w 16 ml chlorku metylenu zmieszano z 2,2 ml trichloroacetonitrylu (22,4 mmola) i 0,75 g fosforanu dipotasowego (4,3 mmola). Całość mieszano i połączono z 6,7 ml 30% nadtlenku wodoru (66 mmoli). Mieszanie kontynuowano w temperaturze 25°C przez 45 godzin. Po tym czasie dodano 28 ml chlorku metylenu i 39 ml wody. Część organiczną oddzielono i przemyto kolejno a) 74 ml 3% siarczynu sodu, b) 62 ml IN wodorotlenku sodu, c) 74 ml IN kwasu chlorowodorowego i d) 31 ml 10% solanki. Znów oddzielono część organiczną, wysuszono nad siarczanem magnezu i odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. 1,25 g pozostałości chromatografowano na 138,2 g żelu krzemionkowego Mercka (40-63 μ), stosując gradientowy układ eter metylowo-tert-butylowy, toluen (40:60, 60:40, 75:25, objętościowo). Odpowiednie części frakcji 60:40 i 75:25 połączono po ocenie przez TLC, otrzymując 0,66 g czystego y-laktonu 11a,12a-epoksy-17d^ydroksy-3-okso-17a-nregn-4-eno-7a,21-wΌdorodikarboksylanu 7-metylowego. Stosowano TLC na płytkach EMF z układem elucyjnym eter metydowo-tert-butylowy, toluen 75:25 (objętościowo) i wizualizacją kwasem siarkowym i SWUV.

NMR ₁H (CDCb) _ppm: 1,09 (_s, 3H), 1,30 (_s, 3H), 3,05 (ABⁿ’^u2H), 3,67 (S, 3H), 5,80 (s, 1H) .

NMR ¹³C (CDCb) _ppm: 14,2, 18,0, 21,2, 28,8, 31,9, 33,5, 34,6, 34,7, 35,1, 35,5, 37,4, 38,3, 41,8,.46,0, 47,2, 50,4, 51,7, 56,7, 94,0, 126,'7,165,2,172,5, 176,7, 198,1.

Teoria C 69,54 i H 7,30_; Zraleziono: C 69,29 i H 7,17.

P rzykł6d ⁴

Wyodrębnianie y-laktonu ny,5y:9α,11y-diepoksγ-17-hydroksy-3-oksϋ-17α-nregnano-7a,21 -wodorodikarboksylanu 7-metylowego

Surowy epoksymeksrenon (157 g) wytworzony z 200 g enestru, jak w przykładzie 1, poddano chromatografowaniu na 4,4 kg żelu krzemionkowego Mercka (40-63 |i). Porcję 88,1 g uzyskano, stosując układ elucyjny acetonitryl, toluen 10:90 (objętościowo). Wydzielone ciało stałe rozpuszczono w 880 ml gorącego ketonu metylowo-etylowego i przesączono przez wkład solka floc. Drugie 88 ml ketonu metylowo-etylowego użyto jako przemycie. Przesącz zatężono przez usunięcie 643 ml rozpuszczalnika i mieszaninę ochłodzono do temperatury pokojowej. Ciało stałe odsączono i przemyto ketonem metylowo-etylowym. Po suszeniu otrzymano 60,2 g epoksymeksrenonu oznaczonego jako 96,8% przez HPLC. Przesącz zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. 9,3 g pozostałości rekrystallzowano z 99 ml ketonu metylowo-etylowego, otrzymując 2,4 g suchego ciała stałego. Porcję 400 mg ciała stałego podda_no nrep-zytvwne!j HPLC 7 odwrotna faza na kolumnie YMC ODS Czysty γ-lakton 4 α,5 α: 9a,11 a-diepoksy-17-hydroksy-3 -okso-17 α-pzegnyno-7a,21 - wodorodikarboksylanu 7-metylowego (103 mg) wydzielono, stosując układ elucyjny acetonitryl (24%), metanol (4%) i woda (72%).

NMR )H (CDC1₃) _ppm_: 0,98 (s, 3H), 1,32 (s, 3H), 2,89 (m, 1H), 3,07 (_s, d, 2H), 3,73 (s, 3H).

MS, M+430, obliczone dla C24H30O7 (430,50).

189 757

Przykład 7

Wyodrębnianie y-laktonu 17-hydroknry3,l 2--Pokno-17(r-pregna-4,9(11)-dieno-7a,21-woporodikrrbokrylanu 7-mety'lowego

Ług macierzysty ketonu metylowo-etylowego otrzymany, jak w przykładzie 1, odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Porcję 4,4 g pozostałości poddano chromatografii na 58,4 g BTR Zorbax LP (40 μ). Elucja gradientem ketonu metylowo-etylowego i chlorku metylenu (25:75 do 50:50 objętościowo) dała 1,38 g substancji. Porcję 1,3 g tej substancji oczyszczano dalej przy użyciu pIcprratyweej HPLC z odwrotną fazą na kolumnie YMC ODS AQ (10 μ), stosując jako fazę ruchomą, acetonitryl (30%), metanol (5%) i wodę (65%). Produkt otrzymano ze wzbogaconej frakcji przez ekstrakcję chlorkiem metylenu. Chlorek metylenu odparowano do sucha i 175 mg pozostałości oczyszczano ponownie przy użyciu krekaratywnej HPLC z odwrotną fazą na kolumnie YMC ODS AQ, stosując jako fazę ruchomą acetonitryl (24%), metanol (4%) i wodę (72%). Ekstrakcja chlorkiem metylenu wzbogaconej frakcji dała 30,6 mg czystego y-laktoeu 17-hydroksy-3,12-diokso-17a-pregea-4,9(11)-Pieno-7α.2l-wodoroPikarboksylanu 7-metylowego

NMR ^lH (CDCb) ppm: 1,17 (s, 3H), 1,49 (s, 3H), 3,13 (m, 1H), 3,62 (8, 3H), 5,77 (s, 1H), 5,96 fs, 1H).

NMR 13C (CDCI3) ppm: 13,1, 21,0, 28,0, 29,4, 33,1, 33,4, 33,9, 35,5, 36,7, 40,3, 41,5, 43,0, 43,4, 52,0, 55,0, 91,0, 123,7, 126,7,167,9,171,8, 176,8, 197,4, 201,0.

Przykład 8

Wytwarzanie PiwoPziαeu soli dipotasowej kwasu 9,11α-ekonsy-17-hyPronsy-3-okro17a-eregn-4-eeo-7a,21 -dikarboksylowego

Sporządzono zawiesinę zawierającą 2,0 g (4,8 mmola) epoksymckrrenonu wytworzonego jak w przykładzie 4, 10 ml wody, 3 ml dioksanu i 9,3 ml 1,04 N wodnego wodorotlenku potasu (9,7 mmola). Całość mieszano w temperaturze 25°C przez 3 godziny. Podczas początkowych dwóch godzin utworzył się żółty jednorodny roztwór. Podniesiono temperaturę do 70°C i kontynuowano mieszanie w ciągu dodatkowych 3 godzin. Rozpuszczalnik usunięto przez destylację pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość oczyszczono przy użyciu chromatografii z odwrotną fazą na 90 g żelu krzemioekowego C18, stosując wodę jako eluent. Żądane frakcje połączono po przeglądzie przez TLC ea płytkach EMF, stosując chlorek metylenu, metanol jako elueet i SWUY Po wizualizacji. Połączone frakcje zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość podPaeo oczyszczeniu z odwrotną fazą powtarzanemu, jak poprzednio opisano. Żądane frakcje zatężono Po sucha pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozpuszczono w etanolu. Dodano octae etylu do punktu zmętnienia, potem dodano hepta, do całkowitego wytrącenia. Wydzielono 0,55 g produktu, diwodzianu soli dipota56

189 757 sowej kwasu 9,11α-eβaksy-17ehyZroksy-3-okso-17α-βregn-4-enOe7α,21edikarboksylowega jako żółte ciało stałe. Analiza węgla odpowiadała strukturze uwodnionej C23H₂8K2, 1,75 H₂O: Teoria C 52,50 wobec 55,85 dla bezwodnej postaci; znaleziono C 52,49. Po tLc na płytkach EMF z chlorkiem metylenu, metanolem, wodą (6:3:0,5, objętościowo) jako iluentem i wizualizacją przez SWUV, obserwowano Rf 0,29.

Przykład 9

Wytwarzanie soli disoZowej kwasu 9,11 d-eβoksy-17-hndroksy-3-oksoe na-pregz^-ezae7a,21 -Zikarboksylowego

COONa

Około 5 mg (0,01 mmola) IβabsnmIkstIzonu wntworzonIgo. jak w przykładzie 4, zawieszaza w około 100 pm mazano Iw w fiolce O ml r rozeieńazona około 0000 μ 2 2,5N NaOH. Powstała mieszanina była żółta i jednorodna. Następnie mieszaninę ogrzewano na łaźni olejowej w temperaturze 70°C. Po 10 minutach próbka 1 o^m z mieszaniny analizowana przez HPLC (ZorbaK 3B-C8 150 x 4,6 mm, 2 ml/minetę, gradient = 35 : 65 (objętościowo) A:B, A = aeetanitkyl/metazol (1:1), B = woda/0,1%) kwas trifluorooctown, detekcja w 210 nm) wykazała Zwie substancji o czasie retencji 4,86 i 2,93 minuty, składające się odpowiednio z hydtabsnkwasu (otwarty laktoz) i otwartego laktonu kwasu 7-kdrboksylawego. Po 30 minutach pobrano drugą próbkę (0,05 ml) i zakwaszono 0,05 ml 3N HCl, po czym zobojętniono około 0,5 ml kwaśnego węglanu sodu. Analiza HPLC jak wyżej pokazała oczekiwane steroidy o zamkniętych pierścieniach z czasem retencji 6,59 i 10,71 minuty. Stosuzik y-laktozu 9,11a-^oksy-17 -hnZtoksn-3 -okso-17 d-pregn-4-ena-7a,01 eWodaiΌZikareoksnlanu 7 - mety lowego (10,71 minut) do odpowiedniego kwasu 7ekdrboksylowego wyniósł 7:89.

Selektywna hydroliza laktonu była możliwa w łagodnych warunkach. SβotząZzaao drugą fiolkę 4 ml jak wyżej, ale zie ogrzewano. Mieszaninę poddano działaniu dźwięków przez 5 mamut . Próbkę 0,05 oi ł rozcieńczono 0,5 oi ł miezaanmy l1ł O0jjętośctowoł meiazal/acItazittnl i analizowano przez HPLC bez uprzedniego zakwaszenia. Otrznmdan otwattn laktoz 7-esttu kwasu karboksylowego miał czas retencji 4,85 mizuty, jak zaobserwowano wyżej i zie był zanieczyszczony kwasem 7-batboksylawnm.

Przykład 10

WnaZręeziaaie y-laktoze 9α.11β.17etrihydroksy-3-okso-17α-pregn-4-ena-7α)21-wadakadikdtboksnlanu 7emetylawego o

189 757 oraz y-laktonu 12a, 17ldihydroksy-3-okso-17α-pρsgna-4,9( 11 )-disaOl7α,51 lwodorodikarboksylanu

7-metylowego

yd ..akton 9a, 11 β,17--rihydroksy33tokrOllaa-ρsegn44jano-ac22 - 9WodorodiCarbkksylanu 7-metylowego i Y-lakton 12c,17-dihydroksy-3-okso-17αlpregna-4,9(Π)-disno-7α,51lWodorodikarboksylanu 7-mstylowego wydzielono po preparatywnej chromatografii cieczowej ługu macierzystego z 2-butaaonu odzyskanego po epoksydowaniu ernestru, jak opisano w przykładzie 1 (protokół z trichloroacetonitrylem). Tak więc pierwszą krystalizację przeprowadzono, stosując 5-butaaon, jak podano. W rekrystalizacji jednak użyto 5lbutanon (10 objętości na gram) zamiast acetonu. Otrzymano tak pozostałość 2,8 g i oczyszczano ją przez preparatywną HPLC z odwrotną fazą. Jako fazę stacjonarną użyto Cromasil C8 (10 (i), z fazą ruchomą złożoną z wody milliQ i acetonitrylu w stosunku 70:30 (objętościowo). Zaobserwowano krystalizację w jednej ze wzbogaconych frakcji. Wydzielono ciało stałe (46,7 mg) i zidentyfikowano jako γ-lakton 9α,113,17-trihydroksy-3-okso-17αlpregn-4-eno-7α,51lWodorodikarboksylαnu 7lmetylowsgo. Ług macierzysty odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość (123 mg) zidentyfikowano jako γ-lakton 15c,l7ldihydrokky-3-okko-17a-pregna-4,9( 11 )ldieno-7α,51 -wodorodika-bokkylaau 7-metylowego.

y-Lakton 9a,11 3,17ltrihydroksy-3-okso-17α-p-egn-4-eao-7α,51 -wodr^rodika-boksylaau 7-metylowego:

MS M+432, obliczone dla C54H35Oe (432,51).

NMR *H (CDCb) ppm: 1,23 (s, 3H), 1,54 (s, 3H), 3,00 (m, 1H), 3,14 (m, 1H), 3,74 (s, 3H), 5,14 (s, 1H, wolno wymienialny), 5,79 (s, 1H).

NMR 13C (CDCb) ppm: 16,8, 22,7, 24,8, 29,0, 29,3, 32,1, 34,1, 34,7, 35,2, 35,7, 36,8,

40.7, 43,0, 45,0 45,9, 52,9, 72,8, 77,4, 95,9, 12Ί,4,163,7,176,7, 177,3, 199,4.

y-Lakton 12a, 17ldihydroksy-3-okso-17α-prsgna-4,9(11 )-disao-7α,51 -wodorodikarboksylanu 7-mstylowego

MS M+441, obliczone dla C54H3rO6 (414,50).

NMR Ή (CDCb) ppm: 0,87 (s, 1H), 1,40 (S, 1H), 3,05 (m, 1H), 3,63 (s, 3H), 3,99 (m, 1H), 5,72 (s, 1H), 5,96 (m, 1H).

NMR 13C (CDCb) ppm: 14,8, 24,0, 26,1, 29,7, 33,6, 34,0, 36,3, 37,0, 37,4, 40,7, 40,9,

43.8, 48,1, 69,1, 95,5, 122,7, 126,3, 145,9, 164,5, 173,2, 177,6, 198,2.

Przy kład 11

Wytwarzanie y-Laktonu 9,11αlepoksy-3lStoksy-17-hydroksy-17α-pregn-4-eao-7α,51-wodo-odikarboksylanu 7-metylowego o

189 757 oraz y-laktoeu 6β, 17-PihyProksy-9,11 a-epoksy-3-okso-17a-pregn-4-eeo-7a,21-wodorodinarbokrylaeu 7-metylowego y-Laktoe 9,11 (r-ekoksy-3-etokry-17-hydIoksy-17a-pregn-4-eeo-7a,21 -woPoIoPinaIboksylanu 7-metylowego wytworzono zgodeie z metodą R.M.Weiera i L.M.Hoffmanna (J.MeP.Chem., 1977,1304), którą włączono jako odnośnik. 148 g (357 mmoli) y-laktonu 9,11 a-epoksy- 17-hy p rok sy-3-okso-17a-pregn-4-eeo-7a,21 -wodoIoPikarbokrylaeu 7-metylowego wytworzonego, jak w przykładzie 4, połączono z 311 ml absolutnego etanolu i 155 ml (932 mmole) trietyłoortomrówczanu. Zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej i jako katalizator dodano 10,4 g (54,7 mmola) kwasu toluceorulfoeowego (monohydratu). Mieszanie kontynuowano przez 30 minut i reakcję zgaszono PoPaeiem, 41,4 g (505 mmoli) sproszkowanego octanu sodu i 20,7 ml (256 mmoli) pirydyny. Ciało stałe (70,2 g) usunięto przez filtrację i przesącz zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość trawiono 300 ml octanu etylu i 9,8 g ciała stałego usunięto przez filtrację.

Przesącz zatężono Po sucha i pozostałość trawiono 100 ml metanolu zawierającego 2 ml pirydyny. 29,7 g ciała stałego usunięto przez filtrację. Dodatkowe wytrącanie zauważono w przesączu. Toteż przesącz znów przesączono, usuwając podatkowe 21,9 g ciała stałego. Przesącz zatężono Po sucha i pozostałość trawiono 50 ml metanolu zawierającego 1 ml pirydyny. Wydzielono przez filtrację 33,8 g ciała stałego. Jakościowa HPLC wykazała, że ostatnia porcja ciała stałego była dostatecznie czysta (90% powierzchni y-lantoeu 9,11a-ekokry-3-ctokry-17-hs'Proksy-17(x-pIege-4-eeo-7a,21-wΊIpoIoPikarbonsylaeu 7-metylowego) do użycia w eastępeym etapie reakcji.

y-Laktoe 9,11 a-ekoksy-3-etoksy-17-hydIoksy-17α-kIegn-4-eeo-7α,21 -wodoIodikaIboksylaeu 7-metylowego:

NMR ’H (CDCls) ppm: 1,02 (s, 3H), 1,27 (s, 3H), 1,30 (t, 3H), 3,12 (m, 1H), 3,28 (m, 1H), 3,66 (s, 3H), 3,78 (m, 2H), 5,20 (s, 1H), 5,29 (d, 1H).

Porcję 8 g enoloeteru (y-lantonu 9,l r4-epoksy-3-etoksy--7-hydroksy-17a-pregn-4-cno7a,21-woPorodikaIboksylanu 7-metylowego) (18 mmoli) wytworzonego w poprzednim etapie rozpuszczono w 120 ml M-dioksanu. Roztwór połączono z mieszaniną 6,8 g 53% kwasu m-chłoroeaipbi^i^i^i^i^i^^ego (20,9 mmola), 18,5 ml 1,0 N wodorotlenku sodu (18,5 mmola) i 46 ml mieszaniny dioksan/wOpa (9:1). Utrzymywano temperaturę -3°C i całość mieszano przez 2 godziny. Temperaturę podniesiono po 25°C i kontynuowano mieszanie przez dalsze 20 godzin. Mieszaninę połączono z 400 ml zimnej wody (10°C) i 23,5 ml 1,0N wodorotlenku sodu (23,5 mmola). Mieszaninę ekstrahowano cztery razy porcjami po 100 ml chlorku metylenu. Połączone porcje chlorku metylenu suszono nap siarczanem magnezu i Supematant rozpuszczalnika usunięto przez destylację pod zmniejszonym ciśnieniem. 13,9 g pozostałości roztarto z 50 ml eteru etylowego, uzyskując 2,9 g białego ciała stałego. Porcję 2,4 g ciała stałego chromatografowano na 100 g żelu krzemionkowego Mercka (60 μ). Po początkowym przemyciu 1 litrem 1: 1 octanu etylu/hektαnu. produkt eluowano mieszaniną octan etylu/heptae w stosunku 7:3. Wzbogacone frakcje połączono na podstawie oceny TLC (płytki EMF; eluent octan etylu/heptan 7:3 (objętościowo); wizualizacja SWUV). Tak więc otrzymano 0,85 g wzbogaconego materiału i rekrystalizowmo go z 10 ml izopropylu, uzyskując 0,7 g y-laktonu 6β,17-dihydroknys4,11α-epoknyse-okno--7α-ppecn-4-eno-7α,21-wodorodikarboksylanu 7-metylowego. Bardziej zanieczyszczone frakcje połączono i otrzymano 0,87 g surowego y-laktonu 6p,17-dihyP^^l^^;^^i9,1la-epoksy-3-okso-17a-prieg:^-^ⁱ4-eno-7a,21-wodoroPikrIbokrylanu 7-metylowego. Ten materiał chromatografowano na 67,8 g żelu krzemionkowego Mercka (40-63 μ). Dodatkowe 0,69 g produktu odzyskano przy użyciu toluenu, zawierającego 0,5-2,5% metanolu.

y-Lakton 6β, 17-dihydroknys9,11 α-epoknys33okno- - 7a-ppeggn4-eno-7a,21 -wodorodii karbo^ylmu 7emetylowego:

Teoria: C 66,96 i H 7,02; Znaleziono: C 66,68 i H 7,16.

NMR Ή (CDCI3) ppm: 1,06 (s, 3H), 1,36 (Pm, 1H), 1,63 (s, 3H), 2,92 (m, 1H), 3,02 (Pd, 1H), 3,12 (P, 1H), 3,64 (s, 3H), 4,61 (P, 1H), 5,96 (s, 1H).

NMR ^BC (CDCI3) ppm: 16,17, 21,32, 21,79, 24l36l 27,99, 28,94, 30,86, 31,09, 32,75, 33,19, 34,92, 36,77, 39,16, 43,98, 47l74l 51,56, 51,66, 65,36, 72,23, 94,79, 165,10, -7-,36l 176,41, 199,59.

189 757

Przykład 12

Wytwarzanie y-laktonu d,j1α-ek9ksy-17-9ydrokeyi3-okso-17αopoegn-4-śnnl7Z.21-w9Z90oiikaoboksylanu 7-m etylowego

Do 2 g (4,8 mmola) holak3nnu 9,j1αoepnkuy-j7o9ydroksy-3-okso-jaαopoegn-4-enn-7a.2j-w9Z9oodikaobomuhlanu 7omethlowśgo wytworzonego, jak w przykładzie 4, iodano -,3 ml (14,4 mmola) 25% me3okuhlanu sodu w metanolu. Otrzymano żółto zawiesinę ogrzewano w temperaturze 50°C. Ciało stałe nie rozpuściło się. Do mieszaniny dodano 3,3 ml metanolu (bezwodnego Aldoich). Mieszaninę ogrzewano w warunkach temperatury wrzenia wobec k9W093s skroplin (65°C) i stała się jśZe90oina. Po 30 minutach wytoocony ciało stałe wstrzymało mieszanie.

Doiano około 25 ml bezwodnego mś3an9ls i mieszaninę przeniesiono do kolby o 100 ml. Mieszaninę ogrzewano w warunkach temperatury wrzenia wobec powrotu skroplin pozee 16 goizin, w tym czasie mieueanina stała się ciemna i jednorodna. Mieszaninę oc91ode9n9 do temperatury 25°C i dodano 70 ml 3N HCl (wydzielanie ciepła). Kilka gramów lodu doiano dla ochłodzenia mieszaniny i roztwór ekstrahowano dwiema kolejnymi porcjami po 25 ml ehlooes metylenu. Ciemny roztwór wysuszono nai siarczanem soZu i poiśuoceono poeee warstwę 2,5 cm żelu kozeminnmoweg9 (E.Mpock, 70-2-0 mese 60 A rozmiar porów). Krzemionkę śls9wan9 100 ml chlorku metylenu. Wymyty ehl90śk metylenu zatężono następnie pod emeiśjse9ehm ciśnieniem, sehuksjoc 1 g brozowyj pianki, która krystallzowała po doianiu 9etαes etylu. Warstwę elsowae9 iougi oaz 100 ml 10% mieszaniny octan etyls/e9l90śk metylenu i wymyty roztwór zatężono, sehtksjoc 650 mg brozowej pianki.

Chromatografia cipnmowaostw9wα (E.Mpock 60 F-254 żel krzemionkowy 0,25 mm, tolsee/9ctrn etylu (1:1, objętościowo) wykazała obecność h-laktonu 9,11α-epoksyoja-łlydo9ksh--okso-j7α-pregn-4-eno-aα,21-wodorodikaoÓ9ksylans 7-metyloweg9. holaktonu d,jlα-epoeshl17-9y'iroksyi3-okso-j7a-poegn-4-ee9-7Z.21-w3iiooodieaoóoksy'laeu almp3ylowego w obu próbkach, chociaż baodeo mało 7α-kαobokshśkioeos znajdowało się w klpowueej próbce. Pierwszo próbkę roztarto e gorocym octanem etylu (77°C) i poe9u3awiono do ochłodzenia do temperatury 25°C. Mieszaninę potem kozśtąeeono, sdhskujoc 400 mg białawego ciała stałego o temperaturze topnienia 254-258°C. H,1-C 1 j³CoΔPT były zgodne e określono strukturo. Mała ilość octanu etylu knenu3a1a w próbce, ale nie wykazano materiału wyjściowego ea pomoco HPLC (eorbaK SB-C8 150 x 4,6 mm, 2 ml/minutę, i5oeoatycenh 40:60 (objętościowo) A:B, A = acśt9mtoh/mśtannl (1:1), B = —1^0,1% kwas toifluorooctowy, detekcja w 210 nm) (HPLC wykazała 98,6% powierzchni), i TLC (39luen/9etan etylu 1:1, objętościowo).

FAB-MS potwierdziła ciężar ceottec5kowh 414 z M+H w 415,2.

NMR ^JH (400 MHz, deu3eonc9loo9f9om) 8: 0,95 (s, 3H), 1,50 (s, -H), 1,45 (m, -H), 1,55-2,7 (m, 15H), 2,85 (t, J=13, 1H), 3,25 (d, J=6, 1H), 3,65 (S, 3H), 5,78 (s, 1H).

189 757

Przykład 13

Wytwarzanie y-laktonu kwasu 9,11a-epoksy-17-hydroksy-3-^k^s^c^^i^7a-pregn-4-eno7a,21 -dikarboksylowego

Do 774 mg (1,82 mmola) y-laktonu 9,11a-epoksy-17-hydroksy-3-okso-17a-pregn-4-eno-7a,21-wodorodikazboksγlanu 7-metylowego wytworzonego, jak w przykładzie 4 i zawieszonego w 3 mł acetonitrylu, dodano 3 ml (7,5 mmola, 2,0 równoważniki) 2,5M wodorotlenku sodu. Mieszanina stała się żółta i po 10 minutach była jednorodna.

Dla monitorowania postępu reakcji jednakowe próbki (0,1 ml) mieszaniny gaszono w 0,01 ml 3M kwasu siarkowego i ekstrahowano w szklanych 4 ml fiolkach octanem etylu (0,2 ml). Fazy rozdzielono przez usunięcie pipetą niższej wodnej warstwy. Odpędzono fazę organiczną i pozostałość analizowano przez HPLC·, stosując metodę opisaną w przykładzie 47H. Po 50 minutach w temperaturze 25°C zaszła mała zmiana w składzie mieszaniny.

Mieszaninę ogrzewano w warunkach temperatury wrzenia wobec powrotu skroplin (około 90°C) przez 50 minut. Analiza mieszaniny przez HPLC pokazała 6% powierzchni pozostałego wyjściowego materiału. Mieszaninę mieszano w temperaturze 25°C przez 65 godzin. Zakwaszenie, ekstrakcja i analiza HPLC próbki, jak opisano wyżej, potwierdziły brak pozostałego wyjściowego materiału.

Mieszaninę mocno zakwaszono dodatkiem około 4 ml 3M kwasu siarkowego i ekstrahowano dwiema porcjami (około 10 ml) chlorku metylenu. Fazy organiczne połączono i wysuszono nad siarczanem sodu. Zatężenie na wyparce obrotowej dało 780 mg ciała stałego. Ciało stałe rekrystalizowano z dimetyloformamidu/metanolu, uzyskując 503 mg (67%) krystalicznego ciała stałego barwy żółto-brązowej. Próbka topiła się z wydzieleniem gazu w temperaturze około 260°C, kiedy ogrzewano szybko. Próbka powoli ciemniała, ale pozostała ciałem stałym, kiedy wolno ogrzewano ją do temperatury 285°C.

NmR ’H (dimetyłosulfotlenek d-6, 400 MHz) 8: 0,85 (s, 3H), 1,4 (s, 3H), 1,3-2,9 (m, 19H), 3,15 (m, 1H), 5,55 (s, 1H), 11,8 (br, 1H).

Przykład 14

Schemat 1: Etap 3D: Metoda I: Synteza y-laktonu 9,11a-epoksy-17a-hydroksy-3-oksopregn-4-eno-7a,21 -dikarboksylanu

0,2M roztwór enestru o wzorze ILA. w chlorku metylenu połączono z 2 równoważnikami fosforanu dipotasowego rozpuszczonego w równym ciężarze wody (50% (wagowo) wodny roztwór), 3 równoważnikami chlorodifluoroacetymidu i 22 równoważnikami nadtlenku wodoru (dodanego, jako 30% wodny roztwór). Całość mieszano w temperaturze 25°C przez 23 godziny. Środowisko reakcji rozcieńczono ilością wody równą załadunkowi nadtlenku wodoru i oddzielono chlorek metylenu. Porcję chlorku metylenu przemyto raz 3% roztworem siarczynu sodu (objętość równa 1,75 załadunku nadtlenku wodoru). Oddzielono porcję chlorku metylenu i wysuszono nad siarczanem sodu. Roztwór 7ytężono przez destylację pod ciśnieniem atmosferycznym, aż temperatura głowicy osiągnęła 70°C. Pozostałość oceniono przez HPLC, '.H i ³³C NMR (CDCI3). Wydajność epoksymeksrenonu oznaczono jako 54,2% powierzchni przez HPLC.

189 757

Przykład 15 Wytwarzanie:

(Związek C-134)

Roztwór ketonu C-133 (2 g) w acetonie (15 ml) traktuje się IN kwasem chlorowodorowym (4 ml) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Środowisko reakcyjne zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozcieńcza się wodą i ekstrahuje octanem etylu. Połączone warstwy organiczne przemywa się 5% roztworem wodorowęglanu sodu i wodą i suszy nad siarczanem sodu. Czynnik odwadniający filtruje się i przesącz zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując surowy keton C-134. Surowy produkt ojzylzczα się przez chromatografię na żelu krzemionkowym przy użyciu miclzαninOjtaau etylu i toluenu jako eluentów, uzyskując czysty keton C-134, który dodatkowo ojznlzcza się pozez rekrystalizację z octanu etylu i heksanu lub alkoholu.

Claims

Zastrzeżenia patentowe którym:

R¹ oznacza alfa-zorientowany niższy alkoksykarbonyl lub hydroksykarbonyl;

-A-A- oznacza grupę -CHR⁴-CHR⁵- lub -CR⁴=CR⁵-;

R³, r4 i r5 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej w'odór, fluorowiec, hydroksyl, niższy alkil, niższy alkoksyl, hydroksyalkil, alkoksyalkil, hydroksykarbonyl, cyjano, i aryloksyl;

-B-B- oznacza grupę -CHR⁶-CHR⁷- lub alfa- albo beta-zorientowaną grupę:

^Rj—r^R? —ch-ch₂-ch— _iit gdzie R⁶ i R7 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, fluorowiec, niższy alkoksyl, acyl, hydroksyalkil, alkoksyalkil, hydroksykarbonyl, alkil, alkoksykarbonyl, acyloksyalkil, cyjano, i aryloksy; i

R⁸ i R⁹ są niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, hydroksyl, fluorowiec, niższy alkoksyl, acyl, hydroksyalkil, alkoksyalkil· hydroksykarbonyloalkil, alkoksykarbonyloalkil, acyloksyalkil, cyjano, i aiyloksyl, lub R i R⁹ razem obejmuje karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, lub R8 albo R⁹ razem z R6 lub R7 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową skondensowaną z pentacyklicznym pierścieniem D.
2. Związek o wzorze 301 według zastrz. 1, w którym związek odpowiada wzorowi 301A:

w którym:

Ri oznacza alfa-zorientowany niższy alkoksykaobonyl; -A-A- oznacza grupę -CH2-CH2- lub -CH=CH-;

189 757

-B-B- oznacza grupę -CH2-CH2- lub alfa- albo beta- zorientowaną grupę:

—ch-ch₂-ch—

IIIA

X oznacza dwa atomy wodoru lub grupę okso;

Y¹ i Y² razem oznaczają mostek tlenowy -O-, lub

Y¹ oznacza hydroksyl, i γ2 oznacza hydroksyl, niższy alkoksyl lub, jeśli X oznacza H2, także niższy alkanoiloksyl; lub sole związków w których X oznacza okso i γ2 oznacza hydroksyl.
3. Związek o wzorze 301A według zastrz. 2, w którym związek odpowiada wzorowi
4. Związek o wzorze 302:

302 w którym:

Ri oznacza alfa-zorientowany niższy alkoksykarbonyl lub hydroksykarbonyl;

-A-A- oznacza grupę -CHR⁴-CHR⁵- lub -CR⁴=CR⁵-;

R³, r4 i R⁵ są niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, fluorowiec, hydroksyl, niższy alkil, niższy alkoksyl, hydroksyalkil, alkoksyalkil, hydroksykarbonyl, cyjano, i aryloksy;

-B-B- oznacza grupę -CHR⁶-CHR⁷- lub alfa- albo beta-zorientowaną grupę:

R^b R⁷ j—r —ch-ch₂-ch—

III gdzie R⁶ i R7 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, fluorowiec, niższy alkoksyl, acyl, hydroksyalkil, alkoksyalkil, hydroksykarbonyl, alkil, alkoksykarbonyl, acyloksyalkil, cyjano, i aryloksyl; i

R⁸ i R⁹ są niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, hydroksy, fluorowiec, niższy alkoksy, acyl, hydroksyalkil, alkoksyalkil, hydroksykarbonyiualkil, alkoksykarbonyloalkil, acyloksyalkil, cyjano, i aryloksy, lub R⁸ i R9 razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, lub r8 albo r9 razem z R⁶ lub R7 obejmuje karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową skondensowaną z pentacyklicz.nym pierścieniem D.

189 757
5. Związek o wzorze 30Z! według zasttz. 4, w którym związek odpowiada wzorowi 302A:

w którym:

R¹ oenacea alfa-eooientowany niżsey aimoksymaobonyl;

-A-A- oenacea grupę -CH2-CH2- lub -CH=CH-;

-B-B- oenacea goupę -CH2-CH2- lub alfa- albo beta-eorientowaną grupę:

—CH—CH₂-CH—

IIIA

X oenacea dwa atomy wodoru lub goupę okso;

Y¹ i Y² raeem oenaceajo mostek tlenowy -O-, lub

Y¹ oenacea hydroksy, i γ2 oenacea hydroksy, niżsey alkoksyl lub, jeśli X oenacea H2, także niżsey alkanoiloksyl; lub sole ewioeków w których X oenacea okso i γ2 oenacea hydroksy.
6. ewioeek o weoree 302A według eastre. 5, w którym ewioeek odpowiada weorowi w którym:

R¹ oenacea alfa-eorientowany niżsey alkoksykarbonyl lub hydroksykarbonyl;

-A-A- oenacea grupę -CHR4-CHR⁵- lub -CR4=CR⁵-;

R⁴ i R5 są nieeależnie wybrane e grupy obejmującej wodór, fluorowiec, hydroksy, niżsey alkil, niżsey alkoksy, hydroksyalkil, alkoksyalkil, hydoomsykaobonyl, cyjano, i aryloksy;

189 757 ζ «π

-B-B- oznacza grupę -CHR -CHR - lub alfa- albo beta-zonentowaną grupę:

-CH-CH₂CHIII gdzie R⁶ i R7 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, fluorowiec, niższy alkoksy, acyl, hydroksyalkil, alkoksyalkil, hydroksykarbonyl, alkil, alkoksykarbonyl, acyloksyalkil, cyjano, i aryloksy; i

R⁸ i R9 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, hydroksy, fluorowiec, niższy alkoksy, acyl, hydroksyalkil, alkoksyalkil, hydroksykarbonyloalkil, alkoksykarbonyloalkil, acyloksyalkil, cyjano, i aryloksy, lub R8 i R9 razem obejmuje karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, lub r8 albo R9 razem z R⁶ albo R7 obejmuje karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową skondensowaną z pentacyklicznym pierścieniem D.
8. Związek o wzorze 303 według zastrz. 7, w którym związek odpowiada wzorowi

303A:

w którym:

R¹ oznacza alfa-zorientowany niższy alkoksykarbonyl;

-A-A- oznacza grupę -CH2-CH2- lub -CH=CH-;

-B-B- oznacza grupę -CH2-CH2- lub alfa- albo beta-zorientowaną grupę:

—ch-ch₂-ch—

IIIA

X oznacza dwa atomy wodoru lub okso;

Y i Y razem oznaczają mostek tlenowy -O-, lub γΐ oznacza hydroksyl, i odpowiada wzorowi oznacza hydroksyl, niższy alkoksyl lub, jeśli X oznacza H2, także niższy alkanoiloksy;

lub sole związków w których X oznacza okso i Y² oznacza hydroksyl.
9. Związek o wzorze 3O3a według zastrz. 7, w którym związek odpowiada wzorowi

189 757
10. Związek o wzorze 304:

w którym:

Ri oznacza alfa-zorientowany niższy alkoksykarbonyl lub hydroksykarbonyl;

-A-A- oznacza grupę -CHR4-CHR⁵- lub -CR4=CR⁵-;

R³, R4 i R5 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, fluorowiec, hydroksyl, niższy alkil, niższy alkoksy, hydroksyalkil, alkoksyalkil, hydroksykarbonyl, cyjano, i aryloksyl;

-B-B- oznacza grupę -CHR6-CHR⁷- lub alfa- albo beta-zorientowaną grupę:

—ch-ch₂-ch— gdzie R i R są niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, fluorowiec, niższy alkoksyl, acyl, hydroksyalkil, alkoksyalkil, hydroksykarbonyl, alkil, alkoksykarbonyl, acyloksyalkil, cyjano, i aryloksyl; i

R⁸ i R⁹ są niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, hydroksyl, fluorowiec, niższy alkoksyl, acyl, hydroksyalkil, alkoksyalkil, twdroksykarbonyioalkib alkoksykarbonyloalkil, acyloksyalkil, cyjano, i aryloksyl, lub R8 i R. razem obejmuje karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, lub r8 albo r9 razem z R⁶ albo R7 obejmuje karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową skondensowaną z pentacyklicznym pierścieniem D.
11. Związek o wzorze 304 wedlug zastrz. 10, w którym związek odpowiada wzorowi 304A:

304A w którym:

R¹ oznacza alfa-zorientowany niższy alkoksykarbonyl;

-A-A- oznacza grupę -CH2-CH2- lub -CH=CH-;

-B-B- oznacza grupę -CH2-CH2- lub alfa- albo beta-zorientowaną grupę:

—ch-ch₂-ch—

IIIA

X oznacza dwa atomy wodory lub grupę okso; γΐ i γ2 razem oznaczają mostek tlenowy -0-, lub γΐ oznacza hydroksyl, i γ2 oznacza hydroksyl, niższy alkoksyl lub, jeśli X oznacza H2, także niższy alkanoiloksyl; lub sole związków w których X oznacza okso i γ2 oznacza hydroksyl.

189 757
12. ewioeek o weoree 304A według eastre. 11, w którym ewioeek odpowiada wzooowi w którym:

Ri oenacea alfa-eorientowany niżsey alkoksykaobonyl lub hydroksykarbonyl;

-A-A- oenacea grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-;

R4 i R3 so nieeależnie wybrane e grupy obejmującej wodór, fluorowiec, hydroksy, niżsey alkil, niżsey alkoksyl, hyZroksyalkil alkoksyalkil, hydroksykarbonyl, cyjano, i aryloksyl;

-B-B- oenacea grupę -CHR⁶-CHRZ- lub alfa- albo beta-zorientowano grupę:

—ch-ch₂-ch—

III gdeie r6 i R⁷ so nieeależnie wybrane e grupy obejmujocej wodór, fluorowiec, niżsey alkoksyl, acyl, hyZroksyalkil, alkoksyalkil, hyZooksykaobonyl, alkil, alkoksykarbonyl, acyloksyalkil, cyjano, i atyloksyl; i

R⁸ i R9 so nieeależnie wybrane e grupy obejmujocej wodór, hydroksy, fluorowiec, niżsey alkoksy, acyl, hydo3ksyalkil, alkoksyalkil, hyZo(^)k^;yka^lbC3tvyloalkil, alkoksykarbonyloalkil, acyloksyalkil, cyjano, i aryloksy, lub R⁸ i R⁹ razem obejm^o karbocykliceno lub heterocykliceno strukturę pierścieniowo, lub R⁸ albo R9 razem e κ albo R7 obejmujo karbocykliceno lub heterocykliceno strukturę pierścieniowo skondensowano e pentacyklicenym pierścieniem D.
14. ZwiązeW o wzorzw 305 wed5uk zautrZe 13,w którym ówiązek odpk wżada wzorowi 305A:

O

305A

189 757 w którym:

Ri oznacza alfa-zorientowany niższy alkoksykarbonyl;

-A-A- oznacza grupę -CH2-CH2- lub -CH=CH-;

-B-B- oznacza grupę -CH2-CH2- lub alfa- albo beta-zorientowaną grupę:

—CH—CH₂-CH— _IIIA

X oznacza dwa atomy wodoru lub grupę okso;

γΐ i Y² razem oznaczają mostek tlenowy -O-, lub γΐ oznacza hydroksyl, i γ2 oznacza hydnoksyl, niższy alkoksyl lub, jeśli X oznacza H2, także niższy alkanoiloksyl; lub sole związków w których X oznacza okso i γ2 oznacza hydrok^.
15. Związek o wzorze 305A według zaste. 14, w którym związek odpowiada wzorowi
16. Związek o wzorze 306:

306 w którym:

-A-A- oznacza grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-;

r3, r4 i R⁵ są niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, fluorowiec, hydroksyl, niższy alkil, niższy alkoksyl, hydroklyalmil, alkoksyalkil, hydroklymaobonyl, cyjano, i aryloksyl;

-B-B- oznacza grupę -CHR6-CHR7- lub alfa- albo beta-zorientowaną grupę:

—ch-ch₂-ch—

III gdzie R6 i R⁷ są niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, fluorowiec, niższy alkoksyl, acyl, hyZooksyalkil, alkoklwalkil, hydooksykarbonyl, alkil, alkomlwkarbonyl, acyloklyalkil, cviano i arv1nVęv i

R z i Rł są niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, hydroksyl, fluorowiec, niższy alkoksy, acyl, hydromlyalkil, alkoksyalkil, hydri^iksykarl^c^op^dl^oalkil, alkoksykaobonyloalkil, acyloksyalkil, cyjano, i aryloksy, lub R⁸ i R9 razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, lub R⁸ albo R9 razem z R^ albo R⁷ obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową skondensowaną z pentacyklicznym pierścieniem D; i jego sole.

189 757
17. Związek o wzorze 306 według zastrz. 16, w którym związek odpowiada wzorowi

306A:

306A w którym:

-A-A- oznacza grupę -CH2-CH2- lub -CH=CH-;

-B-B- oznacza grupę -CH2-CH2- lub alfa- albo beta-zorientowaną grupę:

—CH-CH₂-CH—

IIIA

X oznacza dwa atomy wodoru lub grupę okso;

γΐ i γ2 razem oznaczają mostek tlenowy -0-, lub γΐ oznacza hydroksyl, i γ2 oznacza hydroksyl, niższy alkoksyl lub, jeśli X oznacza H2, także niższy alkanoiloksyl; lub sole związków w których X oznacza okso i γ² oznacza hydroksyl.
18. Związek o wzorze 306 według zastrz. 16, w którym związek odpowiada wzorowi
19. Związek o wzorze 306 według zastrz. 16, w którym związek odpowiada wzorowi
20. Związek o wzorze 306 według zastrz. 16, w którym związek odpowiada wzorowi

189 757 w którym:

R1 oenacea alfa-eorientowany niżsey alkoksykaobonyl lub hydooksykarbonyl;

-A-A- oenacea grupę -CHR⁴-CHR5- lub -CR⁴=CR5-;

Rt, r4 i r5 so nieeależnie wybrane e grupy obejmujocej wodór, fluorowiec, hydroksyl, niżsey alkil, niżsey alkoksyl, hydroksyalkil, alkoksyalkil, hyZooksykrob3nyl, cyjano, i aryloksyl;

-B-B- oenacea grupę -CHR6-CHR⁷- lub alfa- albo beta-eorientowano grupę:

—CH—CH₂'CH— _IZI gdeie R i R so nieeależnie wybrane e grupy obejmujocej wodór, fluorowiec, niżsey alkoksyl, acyl, hydri^^^yalkil, al^ksy^h, hydroksykarbonyl, alkil, alkoksykarbonyl, acyloksyalkil, cyjano, i ayloksyl; i

R⁸ i R⁹ so nipealpżnie wybrane e grupy obejmujocej wodór, hydroksyl, fluorowiec, niżsey alkoksyl, acyl, hyZo3ksyalkil, alkoksyalkilt hyZroksykarbonyloalkil, alkoksykaobonyloalkil, acyloksyalkil, cyjano, i aoyloksyl, lub Rt i R⁹ raeem obejmujo karbocykliceno lub heterocykliceno strukturę pierścieniowo, lub R8 albo r9 razem e R^ń albo r7 obejmujo karbocykliceną lub hetcoocykliceno strukturę pierścieniowo skondensowano e pentacyklicenym pierścieniem D.
22. ZwiązeW o wzorzw 3O5 rved7tw zzu^z^,, w któtym związ5k ądpowizdo wzorowi 307A:

w którym:

R1 oenacea alfa-eorientowany niżsey alkoksykarbonyl;

-A-A- oenacea goupę -CH₂-CH₂- lub -CH=CH-;

-B-B- oenacea goupę -CH2-CH₂- lub alfa- albo beta-eorientowano goupę:

—ćh-ch₂-ch— _iiia

X oenacea dwa atomy wodoru lub goupę okso;

γ1 i γ2 oazem oenaceajo mostek tlenowy -O-, lub γ1 oenacea hydroksyl, i γ2 oenacea hydroksyl, niżsey alkoksyl lub, jeśli X oenacea H₂, także niżsey alkanoiloksyl; lub sole ewioeków w których X oenacea okso i γ2 oenacea hydroksyl.

189 757
23. Związek o wzorze 307A według zastrz. 21, w którym związek odpowiada wzorowi
24. Związek o wzorze 308:

w którym:

R1 oznacza alfa-zorientowany niższy alkoksykarbonyl lub hydroksykarbonyl;

-A-A- oznacza grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i r5 są niezależnie wybrane z grapy obejmującej wodór, fluorowiec, hydroksyl, niższy alkil, niższy alkoksyl, hydroksyalkil, alkoksyalkil, hydroksykarbonyl, cyjano, i aryloksy;

-B-B- oznacza grupę -CHR6-CHR7 lub alfa- albo beta-zorientowaną grupę:

R.—ch-ch₂-chIII gdzie R6 i r7 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, fluorowiec, niższy alkoksyl, acyl, hydroksyalkil, alkoksyalkil, hydroksykarbonyl, alkil, alkoksykarbonyl, acyloksyalkil, cyjano, i aryloksy; i

R8 i R9 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, hydroksy, fluorowiec, niższy alkoksyl, acyl, hydroksyalkil, alkoksyalkil, hydroksykarbonyloalkil, alkoksykarbonyloalkil, acyloksyalkil, cyjano, i aryloksyl, lub r8 i R^razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, lub r8 albo r9 razem z r6 albo R7 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową skondensowaną z pentacyklicznym pierścieniem D.
25. Związek o wzorze 30z według zastrz. 123, w którym zwmzck odpowiada wzorowi 308A:

w którym:

R1 oznacza alfa-zorientowany niższy al03Zsykaobonyl; -A-A- oznacza grupę -CH2-CH2- lub -CH=CH-;

189 757

-B-B- oznacza grupę -CH₂-CH₂- lub alfa- albo beta-zorientowaną grupę:

-ch-ch₂-ch- _iiia

X oznacza dwa atomy wodoru lub grupę okso;

Y¹ i Y² razem oznaczają mostek tlenowy -O-, lub

Y¹ oznacza hydroksy, i

Y² oznacza hydroksy, niższy alkoksyl lub, jeśli X oznacza H2, także niższy alkanoiloksyl; lub sole związków w których X oznacza okso i Y2 oznacza hydroksyl.
26. Związek o wzorze 308A według zastrz. 23, w którym związek odpowiada wzorowi
27. Związek o wzorze 309:

w którym:

R¹ oznacza beta-zorientowany niższy alkoksykarbonyl hydroksykarbonyl;

-A-A- oznacza grupę -CHR⁴-CHR⁵- lub -CR⁴=CR⁵-;

R³, R4 i r5 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, fluorowiec, hydroksyl, niższy alkil, niższy alkoksy, hydroksyalkil, alkoksyalkil, hydroksykarbonyl, cyjano, i aryloksyl;

-B-B- oznacza grupę -CHR6-CHR⁷- lub alfa- albo beta-zorientowaną grupę:

—CH-CH₂-CH—

III gdzie R⁶ i R7 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, fluorowiec, niższy alkoksyl, acyl, hydroksyalkil, alkoksyalkil, hydroksykarbonyl, alkil, alkoksykarbonyl, acyloksyalkil, cyjano, i aryloksyl; i

R⁸ i R⁹ są niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, hydroksy, fluorowiec, niższy alkoksy, acyl, hydroksyalkil, alkoksyalkil, hydroksykarbonyloalkil, alkoksykarbonyloalkil, 9eyloksyaikii, cyjano, i aryioksyj, lub R i R razem obejmują karąocykliezną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, lub R⁸ albo R⁹ razem z r6 albo R7 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową skondensowaną z pentacyklicznym pierścieniem D.

189 757
28. Związek o wzorze 309 według zastrz. 27, w którym związek odpowiada wzorowi 309A:

w którym:

R1 oznacza beta-zorientowany niższy alkoksykarbonyl;

-A-A- oznacza grupę -CH2-CH2- lub -CH=CH-;

-B-B- oznacza grupę -CH2-CH2- lub alfa- albo beta-zorientowaną grupę:

—ch-ch₂-ch—

IIIA

X oznacza dwa atomy wodoru lub grupę okso;

γ1 i γ2 razem oznaczają mostek tlenowy -O-, lub γ1 oznacza hydroksyl, i γ2 oznacza hydroksyl, niższy alkoksyl lub, jeśli X oznacza H2, także niższy alkanoiloksyl; lub sole związków w których X oznacza okso i γ2 oznacza hydroksyl.
29. Związek o wzorze 309a według zastrz. 27, w którym związek odpowiada wzorowi

Wynalazek ten dotyczy nowych związków pośrednich użytecznych w wytwarzaniu związków steroidowych. Najbardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy nowych związków pośrednich do wytwarzania wodorometylo-9,11a-epoksy-17a-hydroksy-3-oksopregn-4-en-7 a,21-dikarboksylanu, y-laktonu (przytaczanego także jako eplerenon lub epoksymeksrenon).

Metody wytwarzania związków z szeregu 20-spiroksanu opisuje się w opisie patentowym U.S. nr 4 559 332. Związ^ąi wytwarzane zgodnie z procesem z tego opisu, mają otwarty pierścień E, zawierający atom tlenw, o ogólnym wzonze o

IA

189 757 w którym -A-A- reprezentuje grupę -CH2-CH2 lub -CH=CH-; R1 reprezentuje niższą grupę alkoksykarbonylową o orientacji a, albo grupę hydroksykarbonylową, -B-B- reprezentuje grupę -CH2-CH2- lub α- albo β-zorientowaną grupę r! r⁷

CH-CH

I I

-CH—CH₂ — CH —

III przy czym r6 i r7 oznaczają atom wodoru; X reprezentuje dwa atomy wodoru lub grupę okso,- γ1 i γ² jednocześnie reprezentują mostek tlenowy -O- albo γ1 reprezentuje grupę hydroksy i γ2 reprezentuje grupę hydroksy, niższą alkoksy lub, jeśli X reprezentuje H2, także niższą alkanoiloksy; oraz sole takich związków, w których X reprezentuje grupę okso i γ²reprezentuje grupę hydroksy, czyli odpowiadających kwasom 17e-hydroksy-21-karboksylowych.

Opis patentowy U.S. nr 4 559 332 opisuje liczne metody wytwarzania epoksymeksrenonu i związków pokrewnych o wzorze IA. Ukazanie się nowych i rozszerzenie klinicznych zastosowań dla epoksymeksrenonu stwarzają potrzebę ulepszenia procesów produkcji tego i innych pokrewnych steroidów.

W związku z tym, niniejszy wynalazek odnosi się do szeregów schematów syntez epoksymeksrenonu; związków pośrednich użytecznych w wytwarzaniu epoksymeksrenonu; oraz syntezy takich nowych związków pośrednich.

Nowe schematy syntezy opisuje się szczegółowo w opisie zalecanych postaci realizacji. Wśród nowych związków pośrednich wedlug tego wynalazku znajdują się opisane bezpośrednio poniżej.

Związek o wzorze IV odpowiada strukturze:

IV gdzie: -A-A- reprezentuje grupę -CHR⁴-CHR5- lub -CR⁴=CR5-;

r3, r4 i r5 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, chlorowca, grupy hydroksy, niższej alkilowej, niższej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy; R¹ reprezentuje a-zorientowaną grupę niższą alkoksykarbonylową lub grupę hydroksykarbonylową; r2 oznacza grupę pozostającą 11α, której usunięcie powoduje skuteczne utworzenie podwójnego wiązania między atomami węgla w pozycji Q i 1 1 · _R_R_ πηιηρ .GT-TT? KCT-TR InK ri.altuA rn-imp37 1 11« * - · X W prx v Χ.Χ vxx> ₄ ‘ X XX x ' χ. XX X x V»U ΙΑ ν«.χ xz χ_ιχζχ x wxx vxz * » χχχχχχ t«^x ν» L/ ·

CH ✓

CH

-CH— CH₂ — CH7

III

189 757 gdzie R i R wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, chlorowca, niższej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydIΌZsyZarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy; oraz R⁸ i r9 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydroksy, chlorowca, niższej grupy alkoksy, acylowej, hydooksyalkil3wej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, albo R* i r9 razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, albo R⁸ i R9 razem z R⁶ i R⁷ obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D.

¹ Q Q

Związek o wzorze IVA odpowiada wzorowi IV, gdzie R i R razem z atomem węgla pierścienia, do którego so dołączone, tw^rorzą strukturę:

Y^,7) iini( CHg) _s

XXXIV gdzie X, γ1, γ2 i C(17) so takie jak określono powyżej.

Związek o wzorze IVB odpowiada wzorowi IV, gdzie R8 i r9 razem tworzą strukturę o wzorze XxXIII:

XXXIII.

Związki o wzorach odpowiednio IVC, IVD i IVE, odpowiadają każdemu wzorowi IV. IVA lub lVB, gdzie każdy z -A-A- i -B-B- oznacza -CH2-CH2-, R3 oznacza atom wodoru i R ¹oznacza grupę alkoksyZaobonylową, korzystnie metoksykarbionylow^ą. Związki, wchodzące w zakres wzoru IV można wytwarzać przez reakcję niższego odczynnika alkilosulfonylującego lub acylującego, albo czynnika tworzącego halogenek, z odpowiadającym związkiem wchodzącym w zakres wzoru V.