CN100384866C - 制备7α-羧基9,11-环氧甾族化合物的方法和其中使用的中间体以及烯双键环氧化作用的一般方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于合成epoxymexrenone和其它式I化合物的多种新的反应方法，新的反应步骤：其中-A-A-代表基团-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自独立地选自氢，卤素，羟基，低级烷基，低级烷氧基，羟基烷基，烷氧基烷基，羟基羰基，氰基，芳基氧基，R1代表α-取向的低级烷氧羰基或羟基烷基残基，-B-B-代表基团-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基团：其中R6和R7各自独立地选自氢，卤素，低级烷氧基，酰基，羟基烷基，烷氧基烷基，羟基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自独立地选自氢，卤素，低级烷氧基，酰基，羟基烷基，烷氧基烷基，羟基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起构成一个碳环或杂环结构，或者R8或R9与R6或R7一起构成一个与五元环D环稠合的碳环或杂环结构。
Description
发明背景
本发明涉及制备9，11-环氧甾族化合物，特别是20-螺环氧乙烷类及其类似物那些化合物的新的方法，在该甾族化合物制备中有用的新的中间体，以及这些新的中间体的制备方法。更特别地，本发明涉及制备9，11α-环氧-17α-羟基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氢甲酯，γ-内酯(eplerenone即依普利酮；epoxymexrenone)的新的且有优点的方法。
美国专利4559332公开了20-螺环氧乙烷类化合物的制备方法。根据’332专利的方法制备的化合物具有下面通式的包含一个可打开的氧的E环：
其中
-A-A-代表基团-CH2-CH2-或-CH＝CH-，
R1代表α-取向的低级烷氧羰基或羟基羰基残基。
-B-B-代表基团-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的基团
R6和R7是氢，
X代表两个氢原子或氧代基团，
Y1和Y2一起代表氧桥-O-，或
Y1代表羟基，和
Y2代表羟基，低级烷氧基，或者，如果X代表H2，则也可以代表低级烷酰氧基，
以及其中X代表氧代基团且Y2代表羟基的这些化合物的盐，即相应的17β-羟基-21-羧酸的盐。
美国专利4559332描述了一些制备epoxymexrenone和相关的式IA化合物的方法。epoxymexrenone的新的和扩大的临床应用的出现，产生了制备这些和其它相关的甾族化合物的改进的方法的需要。
发明概述
本发明首要目的是提供制备具有共同结构特征的epoxymexrenone，其它的20-螺环氧乙烷和其它甾族化合物的改进的方法。本发明的具体目的是：以高产率提供生产式IA产品和其它相关化合物的改进的方法；提供包括最少分离步骤的这样的方法；提供实现合理基本投资和在合理转化成本下操作的这样的方法。
因此，本发明涉及一系列epoxymexrenone的合成方法；制备eplerenone中有用的中间体；和这些新的中间体的合成。
在优选的实施方案的描述中详细说明了新的合成方法。本发明新的中间体是下面紧接着描述的那些化合物。
式IV化合物相应于下面的结构式：
其中
-A-A-代表基团-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，
R3，R4和R5各自独立地选自氢，卤素，羟基，低级烷基，低级烷氧基，羟基烷基，烷氧基烷基，羟基羰基，氰基，芳基氧基，
R1代表α-取向的低级烷氧羰基或羟基羰基残基，
R2是11α-离去基团，它的除去可有效地在9-和11-碳原子之间产生双键；
-B-B-代表基团-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基团：
其中
R6和R7各自独立地选自氢，卤素，低级烷氧基，酰基，羟基烷基，烷氧基烷基，羟基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，和
R8和R9各自独立地选自氢，卤素，低级烷氧基，酰基，羟基烷基，烷氧基烷基，羟基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起构成一个碳环或杂环结构，或者R8或R9与R6或R7一起构成一个与五元环D环稠合的碳环或杂环结构。
式IVA化合物相应于这样一种式IV化合物，其中R8和R9与它们所连接的成环碳原子一起形成下面的结构：
其中X，Y1，Y2和C(17)如上定义。
式IVB化合物相应于这样一种式IVA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII结构：
式IVC，IVD和IVE化合物分别相应于式IV，IVA，或IVB，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氢，和R1是烷氧羰基，优选甲氧羰基。式IV范围内的化合物可以通过使一种低级烷基磺酰化试剂或酰化试剂，或一种产生卤素离子的试剂，与式V范围内的一种相应的化合物反应来制备。
式V化合物相应于下面的结构：
其中-A-A-，-B-B-，R1，R3，R8和R9如式IV所定义。
式VA化合物相应于这样一种式V化合物，其中R8和R9与它们所连接的成环碳原子一起形成下面的结构：
其中X，Y1，Y2和C(17)如上定义。
式VB化合物相应于这样一种式VA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII结构：
式VC，VD和VE化合物分别相应于式V，VA，或VB中任一个，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氢，和R1是烷氧羰基，优选甲氧羰基。式V范围内的化合物可以通过使一种碱金属烷氧化物与式VI的一种相应的化合物反应来制备。
式VI化合物相应于下面的结构：
其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定义。
式VIA化合物相应于这样一种式VI化合物，其中R8和R9与它们所连接的成环碳原子一起形成下面的结构：
其中X，Y1，Y2和C(17)如上定义。
式VIB化合物相应于这样一种式VIA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII结构：
式VIC，VID和VIE化合物分别相应于式VI，VIA，或VIB中任一个，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氢。式VI，VIA，VIB和VIC化合物分别通过水解相应于式VII，VIIA，VIIB或VIIC的化合物来制备。
式VII化合物相应于下面的结构：
其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定义。
式VIIA化合物相应于这样一种式VII化合物，其中R8和R9与它们所连接的成环碳原子一起形成下面的结构：
其中X，Y1，Y2和C(17)如上定义。
式VIIB化合物相应于这样一种式VIIA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII结构：
式VIIC，VIID和VIIE化合物分别相应于式VII，VIIA，或VIIB中任一个，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氢。式VII范围内的化合物可以通过将式VIII范围内的一种化合物氰化来制备。
式VIII化合物相应于下面的结构：
其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定义。
式VIIIA化合物相应于这样一种式VIII化合物，其中R8和R9与它们所连接的成环碳原子一起形成下面的结构：
其中X，Y1，Y2和C(17)如上定义。
式VIIIB化合物相应于这样一种式VIIIA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII结构：
式VIIIC，VIIID和VIIIE化合物分别相应于式VIII，VIIIA，或VIIIB中任一个，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氢。式VIII范围内的化合物可以通过发酵而有效地以α-取向向底物引入11-羟基来氧化包括式XIII化合物的一种底物而制备，如下文所述。
式XIV化合物相应于下面的结构：
其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定义。
式XIVA化合物相应于这样一种式XIV化合物，其中R8和R9与它们所连接的成环碳原子一起形成下面的结构：
其中X，Y1，Y2和C(17)如上定义。
式XIV化合物相应于这样一种式XIVA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII结构：
式XIVC，XIVD和XIVE化合物分别相应于式XIV，XIVA，或XIVB中的任何一个，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氢。式XIV范围内的化合物可以通过将式XV范围内的一种相应的化合物水解来制备。
式XV化合物相应于下面的结构：
其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定义。
式XVA化合物相应于这样一种式XV化合物，其中R8和R9与它们所连接的成环碳原子一起形成下面的结构：
其中X，Y1，Y2和C(17)如上定义。
式XVB化合物相应于这样一种式XVA化合物，其中R8和R9与它们所连接的成环碳原子一起形成式XXXIII结构：
式XVC，XVD和XVE化合物分别相应于式XV，XVA，或XVB中任一个，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氢。式XV范围内的化合物可以通过将式XVI范围内的一种相应的化合物氰化来制备。
式XXI化合物相应于下面的结构：
其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定义。
式XXIA化合物相应于这样一种式XXI化合物，其中R8和R9与它们所连接的成环碳原子一起形成下面的结构：
其中X，Y1，Y2和C(17)如上定义。
式XXIB化合物相应于这样一种式XXIA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII结构：
式XXIC，XXID和XXIE化合物分别相应于式XXI，XXIA，或XXIB中任一个，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氢。式XXI范围内的化合物可以通过将式XXII范围内的一种相应的化合物水解来制备。
式XXII化合物相应于下面的结构：
其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定义。
式XXIIA化合物相应于这样一种式XXII化合物，其中R8和R9与它们所连接的成环碳原子一起形成下面的结构：
其中X，Y1，Y2和C(17)如上定义。
式XXIIB化合物相应于这样一种式XXIIA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII结构：
式XXIIC，XXIID和XXIIE化合物分别相应于式XXII，XXIIA，或XXIIB中任一个，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氢。式XXII范围内的化合物可以通过将式XXIII范围内的一种化合物氰化来制备。
式XXIII化合物相应于下面的结构：
其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定义。
式XXIIIA化合物相应于这样一种式XXIII化合物，其中R8和R9与它们所连接的成环碳原子一起形成下面的结构：
其中X，Y1，Y2和C(17)如上定义。
式XXIIIB化合物相应于这样一种式XXIIIA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII结构：
式XXIIIC，XXIIID和XXIIIE化合物分别相应于式XXIII，XXIIIA，或XXIIIB中任一个，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氢。式XXIII范围内的化合物可以通过氧化下文所描述的式XXIV的一种化合物来制备。
式104化合物相应于下面的结构：
其中-A-A-，-B-B-，和R3如式IV所定义，且R11是C1-C4烷基。
式104A化合物相应于式104，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氢。式104范围内的化合物可以通过热分解式103化合物来制备。
式103化合物相应于下面的结构：
其中-A-A-，-B-B-，R3和R11如式104所定义，及R12是C1-C4低级烷基。
式103A化合物相应于式103，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氢。式103范围内的化合物可以通过在一种碱例如碱金属烷氧化物的存在下，使式102的一种相应的化合物与丙二酸二烷基酯反应来制备。
式102化合物相应于下面的结构：
其中-A-A-，-B-B-，和R3和R11如式104所定义。
式102A化合物相应于式102，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氢。式102范围内的化合物可以通过在一种碱的存在下使式101的一种相应的的化合物与三烃基硫鎓化合物反应来制备。
式101化合物相应于下面的结构：
其中-A-A-，-B-B-，R3和R11如式104所定义。
式101A化合物相应于式101，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氢。式101范围内的化合物可以通过在一种酸的存在下，使11α-羟基雄甾烯-3，17-二酮或其它式XXXVI化合物与一种原甲酸三烷基酯反应来制备。
以下面给出的具体反应方法的公开为基础，很明显这些化合物相对于一种特定反应方法来说具有最大的利用度。本发明化合物的用途是用作epoxymexrenone和其它甾族化合物的中间体。
本发明的其它目的和特征部分将在下文中变得显而易见，部分将被指出。
附图的简要说明
图1是6-去氢睾酮-17-α-丙内酯(canrenone)或一种6-去氢睾酮-17-α-丙内酯衍生物向相应的11α-羟基化合物生物转化的方法的流程示意图；
图2是6-去氢睾酮-17-α-丙内酯和6-去氢睾酮-17-α-丙内酯衍生物的11α-羟基化生物转化的优选方法的流程示意图；
图3是6-去氢睾酮-17-α-丙内酯和6-去氢睾酮-17-α-丙内酯衍生物的11α-羟基化生物转化的特别优选方法的流程示意图；
图4是根据图2方法制备的6-去氢睾酮-17-α-丙内酯的颗粒大小分布；和
图5是根据图3的方法在转化发酵罐中灭菌的6-去氢睾酮-17-α-丙内酯的颗粒大小分布。
相应的参考标志指示附图中相应的部分。
优选实施方案的描述
根据本发明，提出了各种新的制备opoxymexrenone和相应于式I的其它化合物的方法：
其中
-A-A-代表基团-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，
R3，R4和R5各自独立地选自氢，卤素，羟基，低级烷基，低级烷氧基，羟基烷基，烷氧基烷基，羟基羰基，氰基，芳基氧基，
R1代表α-取向的低级烷氧羰基或羟基烷基残基，
-B-B-代表基团-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基团：
其中
R6和R7各自独立地选自氢，卤素，低级烷氧基，酰基，羟基烷基，烷氧基烷基，羟基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，和
R8和R9各自独立地选自氢，卤素，低级烷氧基，酰基，羟基烷基，烷氧基烷基，羟基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起构成一个碳环或杂环结构，或者R8或R9与R6或R7一起构成一个与五元环D环稠合的碳环或杂环结构。
除非另有说明，本申请公开说明书中称之为“低级”的有机基团包含最多7，优选1-4个碳原子。
低级烷氧羰基优选是从具有1-4个碳原子的烷基例如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基和叔丁基衍生的烷氧羰基；特别优选的是甲氧基羰基，乙氧基羰基和异丙氧基羰基。低级烷氧基优选是从上述C1-C4烷基，特别是从伯C1-C4烷基衍生的烷氧基；特别优选的是甲氧基。低级烷酰基优选是从具有1-7个碳原子的直链烷基衍生的烷酰基；特别优选的是甲酰基和乙酰基。
15，16-位的亚甲基桥优选是β-取向的。
可以根据本发明方法制备的一类优选的化合物是美国专利4559332中所描述的20-螺环氧乙烷化合物，即相应于式IA的化合物：
其中
-A-A-代表基团-CH2-CH2-或-CH＝CH-，
-B-B-代表基团-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的式IIIA基团
R1代表α-取向的低级烷氧羰基或羟基羰基残基，
X代表两个氢原子或氧代基团或＝S，
Y1和Y2一起代表氧桥-O-，或
Y1代表羟基，和
Y2代表羟基，低级烷氧基，或者，如果X代表H2，则也可以代表低级烷酰氧基，
本发明新的方法制备的20-螺环氧乙烷化合物优选是其中Y1和Y2一起代表氧桥-O-的式I化合物。
特别优选的式I化合物是其中X代表氧代基团的那些化合物。
其中X代表氧代基团的式IA20-螺环氧乙烷化合物中最特别优选的是其中Y1和Y2一起代表氧桥-O-的那些化合物。
如已经提到的，17β-羟基-21-羧酸也可以是其盐的形式。特别考虑金属盐和铵盐，例如碱金属和碱土金属盐，例如钠盐，钙盐，镁盐，和优选的钾盐，及从氨或合适的，优选的生理耐受的，含氮的有机碱衍生的铵盐。作为碱，考虑的不只是胺，例如低级烷基胺(例如三乙胺)，羟基-低级烷基胺[例如2-羟基乙胺，二-(2-羟基乙基)-胺或三-(2-羟基乙基)-胺]，环烷基胺(例如二环己基胺)或苄基胺类(例如苄基胺和N，N’-二苄基乙二胺)，还包括含氮的杂环化合物，例如那些芳香特征的化合物(例如吡啶或喹啉)或那些具有至少部分饱和的杂环(例如N-乙基哌啶，吗啉，哌嗪或N，N’-二甲基哌嗪)。
优选的化合物也包括式IA化合物的碱金属盐，特别是钾盐，其中R1代表烷氧羰基，X代表氧代基团，以及各Y1和Y2代表羟基。
特别优选的式I和IA化合物是例如下面的化合物：
9α，11α-环氧-7α-甲氧羰基-20-螺氧-4-烯(spirox-4-ene)-3，21-二酮，
9α，11α-环氧-7α-乙氧羰基-20-螺氧-4-烯-3，21-二酮，
9α，11α-环氧-7α-异丙氧羰基-20-螺氧-4-烯-3，21-二酮，
和各化合物的1，2-脱氢类似物，
9α，11α-环氧-6α，7α-亚甲基-20-螺氧-4-烯-3，21-二酮，
9α，11α-环氧-6β，7β-亚甲基-20-螺氧-4-烯-3，21-二酮，
9α，11α-环氧-6β，7β；15β，16β-双亚甲基-20-螺氧-4-烯-3，21-二酮，
和各化合物的1，2脱氢类似物，
9α，11α-环氧-7α-甲氧羰基-17β-羟基-3-氧代-孕甾-4-烯-21-羧酸，
9α，11α-环氧-7α-乙氧羰基-17β-羟基-3-氧代-孕甾-4-烯-21-羧酸，
9α，11α-环氧-7α-异丙氧羰基-17β-羟基-3-氧代-孕甾-4-烯-21-羧酸，
9α，11α-环氧-17β-羟基-6α，7α-亚甲基-3-氧代-孕甾-4-烯-21-羧酸，
9α，11α-环氧-17β-羟基-6β，7β-亚甲基-3-氧代-孕甾-4-烯-21-羧酸，
9α，11α-环氧-17β-羟基-6β，7β；15β，16β-双亚甲基-3-氧代-孕甾-4-烯-21-羧酸，和这些酸的碱金属盐，特别是钾盐或铵盐，以及上面提到的羧酸或其盐的1，2-脱氢类似物。
9α，11α-环氧-15β，16β-亚甲基-3，21-二氧代-20-螺氧-4-烯-7α-羧酸甲酯，乙酯和异丙酯，
9α，11α-环氧-15β，16β-亚甲基-3，21-二氧代-20-螺氧-1，4-二烯-7α-羧酸甲酯，
乙酯，和异丙酯，
以及9α，11α-环氧-3-氧代-20-螺氧-4-烯-7α-羧酸甲酯，乙酯，和异丙酯，
9α，11α-环氧-6β，7β-亚甲基-20-螺氧-4-烯-3-酮，
9α，11α-环氧-6β，7β；15β，16β-双亚甲基-20-螺氧-4-烯-3-酮，
以及9α，11α-环氧，17β-羟基-17α(3-羟基-丙基)-3-氧代-雄甾-4-烯-7α-羧酸甲酯，乙酯，和异丙酯，
9α，11α-环氧，17β-羟基-17α-(3-羟基-丙基)-6α，7α-亚甲基-雄甾-4-烯-3-酮，
9α，11α-环氧-17β-羟基-17α-(3-羟基-丙基)-6β，7β-亚甲基-雄甾-4-烯-3-酮，
9α，11α-环氧-17β-羟基-17α-(3-羟基-丙基)-6β，7β；15β，16β-双亚甲基-雄甾-4-烯-3-酮，
包括上面提到的雄甾烷的17α-(3-乙酰氧基丙基)和17α-(3-甲酰氧基丙基)类似物，
也包括所有上面提到的雄甾-4-烯-3-酮和20-螺氧-4-烯-3-酮一系列化合物的1，2-脱氢类似物。
具有相同特征性结构特征的式I和IA以及类似化合物的化学名称是根据现行命名法以下面的方式命名的：对于其中Y1与Y2一起代表-O-的化合物来自20-螺环氧乙烷(例如其中X代表氧代基团且Y1与Y2一起代表-O-的式IA化合物来自20-螺环氧乙烷-21-酮)；对于其中Y1与Y2代表羟基且X代表氧代基团的那些化合物来自17β-羟基-17α-孕甾烯-21-羧酸；对于其中Y1与Y2代表羟基且X代表两个氢原子的那些化合物来自17β-羟基-17α-(3-羟基丙基)-孕甾烷。因为环和开链形式，也就是说各内酯和17β-羟基-21-羧酸及其盐分别相互之间紧密相关，后者可以认为只是前者的水合形式，除非另有说明，在前文和后文中，式I终产物和起始物及类似结构中间体中，应该理解所有情况下，一起指所有提到的形式。
根据本发明，对于高产率和以合理的费用制备式I化合物提出了几种不同的方案。每种合成方法通过制备一系列中间体来进行。一些中间体是新的化合物，并且制备这些中间体的方法是新的方法。
方法1(用烯睾丙内酯或相关的材料起始)
制备式I化合物的一种优选的方法是有益地用相应于式XIII的烯睾丙内酯或相关的起始材料开始
其中
-A-A-代表基团-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，
R3，R4和R5各自独立地选自氢，卤素，羟基，低级烷基，低级烷氧基，羟基烷基，烷氧基烷基，羟基羰基，氰基，芳基氧基，
-B-B-代表基团-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基团：
其中
R6和R7各自独立地选自氢，卤素，低级烷氧基，酰基，羟基烷基，烷氧基烷基，羟基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，和
R8和R9各自独立地选自氢，卤素，低级烷氧基，酰基，羟基烷基，烷氧基烷基，羟基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起构成一个碳环或杂环结构，或者R8和R9与R6或R7一起构成一个与五元环D环稠合的碳环或杂环结构。利用图1和图2说明的生物转化方法类型，在式XIII化合物中引入α-取向的11-羟基，从而生成式VIII化合物
其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如上所定义。
优选式XIII化合物具有下面的结构
11α-羟基产物具有下面的结构
两式中
-A-A-代表基团-CH2-CH2-或-CH＝CH-，
-B-B-代表基团-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的基团
X代表两个氢原子或氧代基团或＝S，
Y1和Y2一起代表氧桥-O-，或
Y1代表羟基，和
Y2代表羟基，低级烷氧基，或者，如果X代表H2，则也可以代表低级烷酰氧基，
以及其中X代表氧代基团且Y2代表羟基的这些化合物的盐，和在反应中产生的式VIII化合物相应于式VIIIA
其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式XIIIA所定义。更优选的是，R8和R9一起形成20-螺环氧乙烷结构：
其中-A-A-，-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氢。
在此羟基化步骤中使用的优选的微生物是赭色曲霉(Aspergillusochraceus)NRRL405，赭色曲霉ATCC18500，黑色曲霉(Aspergillusniger)ATCC16888和ATCC26693，构巢曲霉(Aspergillus nidulan)ATCC11267，米根霉(Rhizopus oryzae)ATCC11145，葡枝根霉(Rhizopusstolonifer)ATCC6227b，弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)ATCC10745，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ATCC14945，克罗斯韦假单孢菌(Pseudomonas cruciviae)ATCC13262，和玫瑰单端孢(Trichothecium roseum)ATCC12543。其它优选的微生物包括Fusarium oxysporum f.sp.cepae ATCC11171和无根根霉(Rhizopusarrhizus)ATCC11145。
对该反应有活性的其它微生物包括蓝色犁头霉(Absidiacoerula)ATCC6647，灰绿犁头霉(Absidia glauca)ATCC22752，雅致放射毛菌(Actinomucor elegans)ATCC6476，黄柄曲霉(Aspergillusflavipes)ATCC1030，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)ATCC26934，蚕白僵菌(Beauveria bassiana)ATCC7159和ATCC13144，Botryosphaeriaobtusa IMI 038560，Calonectria decoraATCC14767，螺卷毛壳霉(Chaetomium cochliodes)ATCC10195，山扁豆生棒孢(Corynesporacassiicola)ATCC16718，短刺小克银汉霉(Cunninghamellablakesleana)ATCC8688a，刺孢小克银汉霉(Cunninghamellaechinulata)ATCC3655，美丽小克银汉霉(Cunninghamella elegans)ATCC9245，Curvularia clavata ATCC22921，新月弯孢(Curvularialunata)ATCC12071，Cylindrocarpon radicicolaATCC1011，Epicoccum humicola ATCC12722，卵形孢球托霉(Gongronella butleri)ATCC22822，Hypomyces chrysospermus，深黄被孢菌(Mortierella isabellina)ATCC42613，大毛霉(Mucormucedo)ATCC4605，灰蓝毛霉(Mucor griseo-cyanus)ATCC1207A，疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)ATCC9095，珊瑚色诺卡氏菌(Nocardia corallina)，Paecilomyces carneus ATCC46579，展开青霉(Penicillum patulum)ATCC24550，Pithomyces atro-olivaceusIFO6651，Pithomyces cynodontis ATCC26150，密孔菌属(Pycnosporium sp.)ATCC12231，Saccharopolyspora erythraeATCC11635，黄球瘤孢(Sepedonium chrysospermum)ATCC13378，Stachylidium bicolor ATCC12672，吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)ATCC27438，Streptomycespurpurascens ATCC25489，总状共头霉(Syncephalastrum racemosum)ATCC18192，Thamnostylum piriforme ATCC8992，Thielavia terricolaATCC13807，和可可轮枝孢(Verticillium theobromae)ATCC12474。
预期对11α-羟基化作用显示活性的另外的微生物包括Cephalosporium aphidicola(植物化学(Phytochemistry)(1996)，42(2)，411-415)，Cochliobolus lunatas(生物技术杂志(J.Biotechnol.)(1995)，42(2)，145-150)，Tieghemella orchidis(Khim.-Farm.Zh.(1986)，20(7)，871-876)，Tieghemella hyalospora(Khim.-Farm.Zh.(1986)，20(7)，871-876)，Monosporium olivaceum(Acta Microbiol.Pol.，Ser.B.(1973)，5(2)，103-110)，焦曲霉(Aspergillus ustus)(Acta Microbiol.Pol.，Ser.B.(1973)，5(2)，103-110)，禾谷镰孢(Fusarium graminearum)(ActaMicrobiol.Pol.，Ser.B.(1973)，5(2)，103-110)，灰绿轮枝孢(Verticillium glaucum)(Acta Microbiol.Pol.，Ser.B.(1973)，5(2)，103-110)，和变黑色根霉(Rhizopus nigricans)(甾族生物化学杂志(J.Steroid Biochem.)(1987)，28(2)，197-201)。
对于烯睾丙内酯或其它式XIII底物的羟基化作用生产规模发酵的制备，在包括一个种菌发酵罐，或一系列两个或几个发酵罐的种菌发酵系统中制备种菌。将工作原种孢子悬浮液与细胞生长营养液一起加入到第一个种菌发酵罐中。如果生产所期望或需要的种菌的体积超过在第一个种菌发酵罐中产生的体积，则可以通过在种菌发酵系列中剩余的发酵罐的接续而将种菌体积逐渐地和等比地增大。优选的是，在种菌发酵系统中制备的种菌对于实现快速引发生产发酵罐中的反应，相对短的生产批量周期和高生产发酵活性来说具有足够的体积和活细胞。不管种菌发罐系列中容器的数目是多少，第二个和下面的种菌发酵罐大小优选是使得系列中各步骤的稀释程度基本上相同。各种菌发酵罐中种菌的最初稀释度可以大约是与生产发酵罐中的稀释度相同。烯睾丙内酯或其它式XIII底物与种菌及营养液一起加入到生产发酵罐中，羟基化反应在那里进行。
加入到种菌发酵系统中的孢子悬浮液来自从众多试管中取出的一只工作原种孢子悬浮液试管，众多试管构成工作原种细胞库，其在使用前在降温条件下贮存。工作原种细胞库来自在下面的方法中制备的主原种细胞库。从合适的来源例如ATCC获得的孢子样品最初悬浮于含水基质中，例如盐水溶液，营养液或表面活性剂溶液，(例如浓度大约是0.001％重量的非离子表面活性剂例如吐温20)，和分布在培养板上的悬浮液，每个平板拥有固体营养混合物，一般是以不可消化的多糖例如琼脂为基础，在那里繁殖孢子。固体营养混合物优选含有大约0.5％-大约5％重量的葡萄糖，大约0.05％-大约5％重量的氮源，例如胨，大约0.05％-大约0.5％重量的磷源，例如磷酸铵盐或碱金属盐，例如磷酸氢二钾，大约0.25％-大约2.5％重量的酵母溶菌产物或抽提物(或其它氨基酸源例如肉膏或脑心浸液)，大约1％-大约2％重量的琼脂或其它不可消化的多糖。任选地，该固体营养混合物可以进一步含有和/或包含大约0.1％-大约5％重量的麦芽汁。固体营养混合物的pH优选在大约5.0-大约7.0之间，根据需要用碱金属氢氧化物或正磷酸调节。其中有用的固体生长培养基如下：
1.固体培养基#1：1％葡萄糖，0.25％酵母抽提物，0.3％K2HPO4和2％琼脂(Bacto)；用20％NaOH调节pH为6.5。
2.固体培养基#2：2％胨(Bacto)，1％酵母抽提物(Bacto)，2％葡萄糖和2％琼脂(Bacto)，用10％H3PO4调节pH为5。
3.固体培养基#3：0.1％胨(Bacto)，2％麦芽汁(Bacto)，2％葡萄糖和2％琼脂(Bacto)；pH为5.3。
4.液体培养基：5％废糖蜜，0.5％玉米浆，0.25％葡萄糖，0.25％NaCl和0.5％KH2PO4，调节pH为5.8。
5.Difco真菌学琼脂(低pH)。
可以根据主原种的未来要求来选择培养主原种细胞库中所使用的琼脂平板数目，但是一般制备大约15-30个平板。适当生长期后，例如7-10天，在含水载体，一般是盐水或缓冲液的存在下，刮平板收集孢子，得到的主原种悬浮液分装在小瓶中，例如在许多1.5ml小瓶中装入1ml。为了制备在研究或生产发酵操作中使用的工作原种孢子悬浮液，可以以上述制备主原种孢子悬浮液的方法将一个或几个这些第二代主原种小瓶中的内含物分布在琼脂平板上并在琼脂平板上培养。期望常规生产操作时，可以使用100-400这样多的平板来产生第二代工作原种。刮每个平板使原种到分开的工作原种小瓶中，每个小瓶一般含有1ml产生的种菌。为了永久保存，主原种悬浮液和第二代生产种菌两者有益地保存在含有液氮或其它降温液的降温储存容器的蒸汽空间中。
在图1所示的方法中，制备含水生长培养基，其含有氮源例如胨，酵母产生物或等价物，葡萄糖，和磷源例如磷酸盐。微生物的孢子在该菌种发酵系统中的该培养基中培养。优选的微生物是赭色曲霉(Aspergillus ochraceus)NRRL405(ATCC18500)。然后将这样制备的菌种原种与式XIII底物一起引入到生产发酵罐中。搅拌发酵肉汤并通气，反应进行足够的时间使进行到期望的完全程度。
用于菌种发酵罐的培养基优选含有含水混合物，该混合物含有：大约0.5％-大约5％重量的葡萄糖，大约0.05％-大约5％重量的氮源，例如胨，大约0.05％-大约0.5％重量的磷源，例如磷酸铵盐或碱金属盐，例如磷酸一铵或磷酸氢二钾，大约0.25％-大约2.5％重量的酵母溶菌产物或抽提物(或其它氨基酸源例如酒糟)，大约1％-大约2％重量的琼脂或其它不可消化的多糖。特别优选的菌种生长培养基含有大约0.05％-大约5％重量的氮源，例如胨，大约0.25％-大约2.5％重量的自溶酵母或酵母抽提物，大约0.5％-大约5％重量的葡萄糖，大约0.05％-大约0.5％重量的磷源，例如磷酸一铵。特别经济的处理操作是通过使用另一种优选的菌种培养基而提供的，该培养基含有大约0.5％-大约5％重量的玉米浆，0.25％-大约2.5％重量的自溶酵母或酵母抽提物，大约0.5％-大约5％重量的葡萄糖，大约0.05％-大约0.5％重量的磷酸一铵。玉米浆是特别经济的蛋白质，肽类，碳水化合物，有机酸，维生素，金属离子，痕量元素和磷酸盐的来源。来自其它谷物的麦芽汁可以代替玉米浆使用或者除玉米浆之外还加入来自其它谷物的麦芽汁。培养基的pH优选通过例如加入碱金属氢氧化物或正磷酸而调节在大约5.0和大约7.0范围之间。当玉米浆作为氮源和碳源时，pH优选调节在大约6.2至大约6.8范围之间。含有胨和葡萄糖的培养基优选调节在pH大约5.4和大约6.2之间。在菌种发酵中使用的有用的生长培养基中有下面两种：
1.培养基#1：2％胨，2％自溶酵母(或酵母抽提物)，和2％葡萄糖；用20％NaOH调节pH为5.8。
2.培养基#2：3％玉米浆，1.5％酵母抽提物，0.3％磷酸一铵和3％葡萄糖；用20％NaOH调节pH为6.5。
将微生物孢子从小瓶引入到培养基中，一般情况下小瓶中每毫升悬浮液含有大约109个孢于。在菌种培养之初用生长培养基稀释不将孢子种群密度降低到每毫升含有大约107个孢子，实现菌种增殖的最佳生产率。优选的是，在菌种发酵系统中培养孢子，直到菌种发酵罐中的叠集菌丝体体积(PMV)至少是大约20％，优选35％-45％。既然菌种发酵容器(或组成菌种发酵系列的许多容器的任何容器)中的周期取决于容器中的初始浓度，因此期望提供两个或三个菌种发酵阶段来促进整个过程。但是，优选避免使用系列中明显多于三个菌种发酵罐，因为如果菌种发酵是通过过多阶段进行的话，则活性遭到损害。菌种培养发酵在搅拌下，在大约23℃-37℃范围内的温度下，优选在大约24℃-28℃范围内的温度下进行。
来自菌种发酵系统的培养物与生产生长培养基一起加入到生产发酵罐中。在本发明的一个实施方案中，没有灭菌的烯睾丙内酯或其它式XIII底物用作反应底物。优选的是将底物以在生长培养基中10％-30％重量浆状物的形式加入到生产发酵罐中。为了增加适于11α-羟基化反应的表面积，在加入到发酵罐之前通过将底物通过离机降低颗粒体积机(off line micronizer)来减小式XIII底物颗粒大小。也分开加入含有葡萄糖的灭菌营养培养的原种，和含有酵母产生物例如自溶酵母(或以其它来源例如酒糟为基础的等价物氨基酸混合物)的第二代灭菌营养溶液。培养基含有含水混合物，混合物含有：大约0.5％-大约5％重量的葡萄糖，大约0.05％-大约5％重量的氮源，例如胨，大约0.05％-大约0.5％重量的磷源，例如磷酸铵盐或碱金属盐，例如磷酸氢二钾，大约0.25％-大约2.5％重量的酵母溶菌产物或抽提物(或其它氨基酸源例如酒糟)，大约1％-大约2％重量的琼脂或其它不可消化的多糖。特别优选的生产生长培养基含有大约0.05％-大约5％重量的氮源，例如胨，大约0.25％-大约2.5％重量的自溶酵母或酵母抽提物，大约0.5％-大约5％重量的葡萄糖，大约0.05％-大约0.5％重量的磷源，例如磷酸一铵。另一种优选的生产培养基含有大约0.5％-大约5％重量的玉米浆，大约0.25％-大约2.5％重量的自溶酵母或酵母抽提物，大约0.5％-大约5％重量的葡萄糖，大约0.05％-大约0.5％重量的磷酸一铵。生产发酵培养基的pH优选以上述对菌种发酵培养基描述的方法，分别调节到对于以胨/葡萄糖为基础的培养基和以玉米浆为基础的培养基的pH相同的优选的范围。有用的生物转化培养基在下面给出：
1.培养基#1：2％胨，2％自溶酵母(或酵母抽提物)，和2％葡萄糖；用20％NaOH调节pH为5.8。
2.培养基#2：1％胨，1％自溶酵母(或酵母抽提物)，和2％葡萄糖；用20％NaOH调节pH为5.8。
3.培养基#3：0.5％胨，0.5％自溶酵母(或酵母抽提物)，和0.5％葡萄糖；用20％NaOH调节pH为5.8。
4.培养基#4：3％玉米浆，1.5％酵母抽提物，0.3％磷酸一铵和3％葡萄糖；用20％NaOH调节pH为6.5。
5.培养基#5：2.55％玉米浆，1.275％酵母抽提物，0.255％磷酸一铵和3％葡萄糖；用20％NaOH调节pH为6.5。
6.培养基#6：2.1％玉米浆，1.05％酵母抽提物，0.21％磷酸一铵和3％葡萄糖；用20％NaOH调节pH为6.5。
在各生产批量周期中，将没有灭菌的烯睾丙内酯和灭菌的营养液以5-20份，优选10-15份，优选以基本上相等的等份，依次加入到生产发酵罐中。有利的是，最初以足够的量加入底物，使在用菌种发酵肉汤接种之前浓度达到大约0.1％重量至大约3％重量之间，优选达到大约0.5％重量至大约2％重量之间，然后周期性加入，一般是每8-24小时加入一次，使累计比例达到大约1％重量至大约8％重量之间。每隔8小时加入附加的底物的情况下，总的加入量比只是每天加入一次底物的情况稍低一些，例如是0.25％-2.5％重量。在后一种情况下累计的烯睾丙内酯的加入量需要是在2％-大约8％重量范围内。在发酵反应期间加入的补充的营养混合物优选是提缩物，例如一种含有大约40％-60％重量灭菌葡萄糖，和大约16％-32％重量灭菌酵母抽提物或其它酵母产生物的灭菌源(或其它氨基酸源)。因为向图1生产发酵罐中加入的底物是没有灭菌的，因此向发酵肉汤中周期性加入抗生素来控制不期望的生物体的生长。可以加入例如卡那霉素，四环素，和头孢氨苄的抗生素而不会对生长和生物转化产生不利的影响。优选的是，以例如以肉汤总量为基础的大约0.0004％至大约0.002％的浓度向发酵肉汤中加入这些抗生素，包括例如以肉汤总量为基础的大约0.0002％至大约0.0006％硫酸卡那霉素，大约0.0002％至大约0.006％的四环素盐酸盐和/或大约0.001％至大约0.003％的头孢氨苄。
一般情况下，生产发酵批量周期是80-160小时左右。因此各式XIII底物和营养液部分一般以每2-10小时，优选每4-6小时加入。有利的是还将消泡剂掺入到菌种发酵系统和生产发酵罐中。
优选的是，在图1的方法中，向生产发酵罐中加入的种菌是发酵罐中总混合物体积的大约0.5-7％，更优选大约1-2％，葡萄糖浓度保持在大约0.01％-1.0％，优选大约0.025％-0.5％，更优选大约0.05％-0.25％重量，周期性加入，优选各部分是总批量填料的大约0.05％-0.25％。发酵温度一般控制在大约20℃-37℃范围内，优选在大约24℃-28℃，但是可能会期望在反应中逐步降低温度，例如以2℃的增量，以保持叠集菌丝体体积(PMV)低于大约60％，更优选低于大约50％，从而防止发酵肉汤粘度干扰令人满意的混合。如果生物质生长超过了液体表面，生物质中保留的底物可以从反应带中去除，使成为对于羟基化反应是不可得的。关于生产率，期望在发酵反应头24小时内达到PMV为30-50％，优选35-45％范围内，但此后，优选控制条件来控制进一步的生长在上述限度内。在反应期间，发酵培养基的pH控制在大约5.0-6.5之间，优选在大约5.2-5.8之间，并且以大约400-800rpm之间的速度搅拌发酵罐。通过向批量中通气大约0.2-1.0vvm，并保持发酵罐上空压力在大约1大气压和1.0巴表压之间，更优选在大约0.7巴表压左右，来实现溶解的氧气水平为至少是大约10％饱和。搅拌速度也可以提高，因为必须保持最小的溶解的氧气的水平。有利的是，溶解的氧气保持在大大高于10％，事实上保持在50％这样高以促进底物的转化。保持pH在5.5±0.2范围内对于生物转化也是最佳的。根据需要通过加入一种普通的消泡剂控制发泡。所有的底物都加完后，优选继续反应直到式VIII产物与剩余的未反应的式XIII底物的摩尔比至少是大约9∶1。这样的转化作用可以在上述指出的80-160小时批量周期内完成。
发现高转化作用与将初始营养水平减少到低于初始加入水平相关，并且通过控制通气速度和搅拌速度来避免底物从液体肉汤中溅出来。在图1的方法中，营养水平减小到不大于大约初始加入量的60％，然后保持在不大于大约60％，优选大约50％；而在图2和图3的方法中，营养水平减小到不大于大约初始加入量的80％，然后保持在不大于大约80％，优选大约70％。通气速度优选不大于1vvm，更优选在大约0.5vvm范围内；而搅拌速度优选不大于600rpm。
在图2中详细说明了制备式VIII化合物的特别优选的方法。优选的微生物还是赭色曲霉(Aspergillus ochraceus)NRRL405(ATCC18500)。在该方法中，生长培养基优选含有大约0.5％-大约5％重量的玉米浆，大约0.5％-大约5％重量的葡萄糖，0.1％-大约3％重量的酵母抽提物，大约0.05％-大约0.5％重量的磷酸铵。但是也可以使用这里所描述的其它生产生长培养基。菌种培养物基本上以对于图1的方法所描述的方法制备，使用这里所描述的任何菌种发酵培养基。没有减低颗粒体积的烯睾丙内酯或其它式XIII底物在生长培养基中的悬浮液在一个混合器中无菌制备，优选以大约10％和大约30％重量底物之间的相对高的浓度。优选的是无菌制备可以包括混合后的悬浮液的灭菌或巴氏灭菌法。在一批生产量初始时向生产发酵罐加入生产一批生产量所需要的灭菌底物悬浮液的全部量，或者周期性连续加入。底物颗粒大小通过在连机剪切泵中湿研磨而减小，连机剪切泵将浆状物转移到生产发酵罐，从而避免了使用离机降低颗粒机的需要。通过巴氏消毒法而不是灭菌法实现无菌条件，团聚作用的程度是不明显的，但是期望使用剪切泵来提供颗粒大小的正对照。基本上以上述方法相同的方法将灭菌生长培养基和葡萄糖溶液引入到生产发酵罐中。在加入之前所有的向生产发酵罐中加入的成分都灭菌，因此不需要抗生素。
优选的是，在图2的操作方法中，以大约0.5％至大约7％的比例向生产发酵罐中加入种菌，发酵温度是大约20℃-大约37℃，优选是大约24℃-大约28℃，例如通过加入气体氨，氢氧化铵水溶液，碱金属氢氧化物水溶液，或正磷酸，将pH控制在大约4.4和大约6.5之间，优选在大约5.3和大约5.5之间。根据图1的方法，优选调节温度来控制生物质的生长，使得PMV不超过55-60％。初始葡萄糖加入量优选在大约1％和大约4％重量之间，更优选2.5％-3.5％重量，但是在发酵过程中优选使其降至低于大约1.0％重量。补充的葡萄糖以总的一批生产量为基础的大约0.2％和大约1.0％重量之间的份数周期性加入，从而保持葡萄糖在发酵带中的浓度在大约0.1％和大约1.5％重量范围内，优选是大约0.25％和大约0.5％重量。可以任选地与葡萄糖一起补加氮源和磷源。不管怎样，因为在一批生产量周期开始时确定了总的烯睾丙内酯的加入量，所以必须供给的含氮和磷的营养物也可以同时加入，使在反应期间补加只使用葡萄糖溶液。搅拌的速度和性质是一个明显的变数。中等剧烈的搅拌促进质在固体底物和水相之间转移。但是，应该使用低剪切高速搅拌机来防止微生物髓鞘质的降解。优选的搅拌速度根据培养基肉汤粘度，氧气浓度，和容器，折流板和叶轮位型影响的混合条件，在200-800rpm范围内变化。一般情况下，优选的搅拌速度在350-600rpm范围内。搅拌叶轮优选提供轴向向下的泵动作用，这样有助于发酵的生物质很好地混合。一批生产量优选以大约0.3和大约1.0vvm之间的速度，优选以0.4-0.8vvm的速度通气。发酵罐上空的压力优选在大约0.5和大约1.0巴量之间。优选控制温度，搅拌，通气和回压，保持溶解的氧气在生物转化期间在至少大约10％体积范围内。总的一批生产量周期一般在大约100和大约140小时之间。
尽管图2方法操作原理以早期基本上加入全部烯睾丙内酯量为基础，但是应该理解，发酵肉汤的生长可能在加入大量烯睾丙内酯之前就进行了。任选地，在一次生产量后期也可以加入一部分烯睾丙内酯。但是，一般情况下，在发酵开始后48小时内应该向转化发酵罐中加入至少大约75％灭菌烯睾丙内酯填料。而且，为了促进生物转化酶的产生，期望在发酵开始或者至少在头24小时内加入至少大约25％重量烯睾丙内酯。
在如图3说明的进一步优选的方法中，在加入种菌之前，在生产发酵容器中将全部一批生产量填料和营养溶液灭菌。可以使用的营养溶液以及其中优选条件与图2的方法基本上相同。在本发明实施方案中，搅拌机叶轮的剪切作用破坏了底物的团聚作用，另一方面是要进行灭菌。已经发现，如果烯睾丙内酯的平均粒度小于大约200μ，并且至少75％重量的颗粒小于240μ，则反应进行得令人满意。发现使用合适的高速搅拌机，例如圆盘涡轮高速搅拌机，以200-800rpm范围内适当的速度，末端速度至少是大约400cm/秒，就提供足以保持减轻在生产发酵罐中灭菌时往往会发生的团聚作用的粒度特征剪切速度。图3方法的其它操作基本上与图2的方法相同。图2和图3的方法提供了几种优于图1方法的显著的优点。一个特殊的优点是可控制使用低耗费营养基质例如玉米浆。以及进一步的优点是不需要抗生素，简化了进料过程，使烯睾丙内酯或其它式XIII底物一次灭菌。另一个特别的优点是在反应周期期间能使用简单的葡萄糖溶液用于补充而不用使用复杂的营养溶液。
在图1-3所示的方法中，式VIII产物是结晶固体，其与生物质一起通过过滤或者低速离心而从反应肉汤中分离出来。或者可以用有机溶剂将产物从全反应肉汤中萃取出来。通过溶剂萃取回收式VIII产物。为了最大限度回收，用萃取溶剂处理液相滤液和生物质过滤器或滤饼，但是通常≥95％的产物与生物质相关。一般情况下，烃，酯，卤代烃，和酮溶剂可以用于萃取。优选的溶剂是乙酸乙酯。其它典型的合适的溶剂包括甲苯和甲基异丁基酮。对于从液相中萃取，适宜使用与其所接触的反应溶液的体积大约相等的溶剂的体积。为了从生物质中回收产物，将后者悬浮于溶剂中，溶剂优选相对于底物初始加入量过量很多，例如每克初始的烯睾丙内酯加入量用50-100ml溶剂，得到的悬浮液优选回流20分钟至几小时，以确保产物从生物质的凹面和孔隙转移到溶剂相中。此后，过滤或离心去除生物质，滤饼优选用新鲜溶剂和去离子水两者洗涤。然后合并水和溶剂洗液并使各相分离。式VIII产物通过结晶从溶液中回收。为了获得最大产率，用新鲜溶剂处理菌丝体两次。沉降使水相完全分离后，从溶剂相中回收产物。最优选的是真空去除溶剂，直到开始结晶，然后，将浓缩的萃取液冷却到0-20℃。优选大约10℃至大约15℃静置一段时间用于结晶沉降和生长，一般是8-12小时。
特别优选图2的方法，尤其是图3的方法。这些方法在低粘度下操作，并且可以变化来控制反应参数，例如pH，温度和溶解的氧气。而且不用借助抗生素可以容易地保持灭菌条件。
生物转化过程是放热的，所以应该使用加套式发酵罐或冷却蛇管在生产发酵罐中去除热。或者反应肉汤可以通过外部热交换器环流。根据肉汤中氧气效能的测定，通过调节空气进入反应器的速度，优选将溶解的氧气保持在至少大约5％体积的水平，优选至少在大约10％体积的水平，就足以提供反应的能量，并且保证葡萄糖转化成二氧化碳和水。pH优选控制在大约4.5和大约6.5之间。
在式XIII底物11-羟基化的各种不同的方法中，产率受从固体底物转移到液相或认为反应所发生的相界的质量的限制。如上述所指出的，产率不明显受质量转移速率限制，只要底物的颗粒平均粒度减小到小于大约300μ，并且至少75％重量的颗粒小于240μ。但是，在一些变化的实施方案中，这些方法的产率可以进一步提高，所述变化的实施方案中向生产发酵罐中提供有机溶剂中的烯睾丙内酯或其它式XIII底物的实际加入量。根据一项选择，将底物溶解于一种水不混溶溶剂中，并与含水的生长培养基接种物和一种表面活性剂混合。有用的水不混溶溶剂包括，例如，DMF，DMSO，C6-C12脂肪酸，C6-C12正链烷烃，植物油，脱水山梨糖醇，和含水的表面活性剂溶液。填料的搅拌作用产生一个乳液反应系统，该系统具有底物从有机液相向反应点质量转移的增大的界面面积。
第二个选择是最初将底物以实质上大于其在水中的溶解度的浓度溶解于水可混溶溶剂中，例如丙酮，甲基乙基酮，甲醇，乙醇，或甘油中。通过在提高的温度下制备初始底物溶液，提高了溶解度，从而进一步提高了加入到反应器中的溶液形式的底物的量，并且最终提高了反应器的有效载量。与相对冷的含有生长培养基和种菌的含水填料一起向生产发酵反应器中进入热的底物溶液。当底物溶液与含水培养基混合时，发生底物沉淀。然而，在基本过饱和中等剧烈搅拌条件下，形成晶核比晶体生长更有利，并且形成高表面积的非常细的颗粒。高表面积促进液相和固相之间的质转移。而且，在水可互溶溶剂的存在下也提高了含水液相中底物的平衡浓度。因此提高了产率。
尽管微生物可能不一定耐受含水相中的高浓度有机溶剂，但是可以使用一定浓度的乙醇，例如大约3％-大约5％重量范围的乙醇以有利于反应。
第三种选择是将底物溶解于含水的环糊精溶液中。详细说明的环糊精包括羟基丙基-β-环糊精和甲基-β-环糊精。底物∶环糊精的摩尔比可以是大约1∶1至大约1∶1.5，底物∶环糊精。然后可以将底物∶环糊精混合物无菌加入生物转化反应器中。
11α-羟基烯睾丙内酯，以及11α-羟基化过程中的其它产物(式VIII和VIIIA)是新的化合物，可以通过过滤反应培养基，并且从过滤培养基收集的生物质中提取产物来分离。常规有机溶剂例如乙酸乙酯，丙酮，甲苯，氯化烃，和甲基异丁基酮可以用于提取。然后式VIII产物可以从相同类型有机溶剂中重结晶。式VIII化合物具有作为制备式I化合物特别是式IA的中间体的实际价值。
优选的是式VIII化合物相应于式VIIIA，其中-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-，R3是氢，低级烷基或低级烷氧基，，并且R8和R9一起构成20-螺噁烷环：
而且，根据反应式1的方法，式VIII化合物在碱性条件下与氰化物离子源反应，产生式VII烯胺化合物：
其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如上定义。其中底物相应于式VIIIA，产物是式VIIA
其中-A-A-，R3，-B-B-，Y1，Y2和X如式XIII所定义。
式VIII的11α-羟基底物的氰化作用可以通过将其与一种氰化物离子源例如酮基氰醇，最优选的是丙酮氰醇，在一种碱和一种碱金属盐的存在下反应来进行，碱金属盐最优选氯化锂。或者，氰化作用可以不用氰醇而通过使用碱金属氰化物在一种酸的存在下进行。
在酮基氰醇的方法中，反应在溶液中进行，优选使用质子惰性极性溶剂例如二甲基甲酰胺或二甲亚砜。生成烯胺时每摩尔底物需要至少2摩尔氰化物离子源，并且优选使用稍过量的氰化物源。碱优选是含有氮原子的碱例如二烷基胺，三烷基胺，链烷醇胺，吡啶或类似物。但是，也可以使用无机碱例如碱金属碳酸盐或碱金属氢氧化物。优选的是，式VIII底物最初存在的比例是大约20-50％重量比例，碱存在的比例是每当量底物0.5-2当量。反应温度的要求不严格，但是高温下操作提高产率。例如，使用三乙胺为碱的情况下，反应在大约80℃-大约90℃范围下进行是有利的。在这样的温度下，反应在大约5-大约20小时内进行完全。在使用二异丙基乙基胺为碱并且反应在105℃进行时，反应8小时进行完全。在反应完全后，真空去除溶剂，残留的油状物溶解于水中，并用稀酸优选盐酸中和到pH7。产物从该溶液中沉淀出来，然后用蒸馏水洗涤并空气风干。释放出来的HCN可以用惰性气体去除并在碱性溶液中使反应停止。将干燥的沉淀溶解于氯仿或其它合适的溶剂中，然后用浓盐酸例如6N HCl萃取。通过加入无机碱，优选碱金属氢氧化物，将萃取液中和到pH7，然后冷却到0℃左右。将得到的沉淀洗涤干燥后从合适的溶剂例如丙酮中重结晶，产生适合于在该方法下一步中使用的式VII产物。
另一方面，反应可以在含有水可互溶有机溶剂例如甲醇的含水溶剂体系中进行，或者在含有水和有机溶剂例如乙酸乙酯的两相体系中进行。在该方法中，可以通过用水稀释反应溶液，然后用有机溶剂例如二氯甲烷或氯仿萃取该产物，然后用浓的矿物酸，例如2N HCl从有机萃取液中反萃取来回收产物。参见美国专利3200113。
根据另一方面，该反应可以在一种水可互溶溶剂例如二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，N-甲基，吡咯烷酮或二甲亚砜中进行，然后用水稀释反应产物溶液，并且例如通过加入一种碱金属碳酸盐使变为碱性，然后冷却到0-10℃，从而使产物沉淀。优选用碱金属次卤酸盐(hypohalite)或其它有效防止氰化物挥发的试剂使系统猝止。过滤并且用水洗涤后，沉淀的产物适用于该方法的下一步反应。
根据另一方面，可以通过使式VIII底物在一种质子源存在下，与过量的碱金属氰化物，优选氰化钠，在含有质子惰性水可互溶的极性溶剂例如二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺的含水溶剂中反应，来制备式VII烯胺产物。质子源优选是矿物酸或C1-C5羧酸，硫酸是特别优选的。相反地，其中氰化作用试剂是商售的氰化锂DMF溶液情况下，不需要加入分离的质子源。
氰化物离子优选以每当量底物大约2.05和大约5摩尔当量的比例加入到反应器中。相信矿物酸或其它质子源促进HCN加成到4，5和6，7双键上，并且优选以每摩尔当量底物至少1摩尔当量的比例存在；但是反应体系应该通过保持碱金属氰化物比酸过量来保持碱性。反应优选在至少大约75℃，一般是60-100℃的温度下，反应大约1-大约8小时，优选大约1.5-大约3小时。反应结束时，将反应混合物冷却，优选冷却到室温左右；优选在大约冰浴温度下通过酸化反应混合物，并且将其与冷水混合，来沉淀产物烯胺。相信酸化作用闭合17-内酯，其在氰化作用中常用的碱性条件下有开环趋势。用反应过程中存在的相同的酸，优选硫酸，方便地酸化反应混合物。优选以每摩尔产物大约10-大约50摩尔当量的比例加入水。
式VII化合物是新的化合物，并且具有作为制备式I特别是式IA的中间体的重要价值。优选的是，式VII化合物相应于式VIIA，其中-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-，R3是氢，低级烷基或低级烷氧基，，并且R8和R9一起构成20-螺噁烷环：
最优选的式VII化合物是5’R(5’α)，7’β-20’-氨基十六氢-11’β-羟基-10’α，13’α-二甲基-3’，5-二氧螺[呋喃-2(3H)，17’α(5’H)-[7，4]亚甲基(metheno)[4H]环戊[a]菲]-5’-腈。
在反应式1合成的下一步中，水解式VII烯胺，产生式VI二酮化合物：
其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定义。水解可以使用任何含水有机或无机酸。优选盐酸。为了提高产率，优选使用一种水可互溶有机溶剂，例如低级链烷醇作为辅助溶剂。酸应该以每当量式VII底物至少1当量的比例存在。在含水体系中，在大约80℃在大约5小时的期间内，烯胺底物VII可以基本上转化成式VII的二酮。在高温下操作提高产率，而温度的要求不严格。根据溶剂体系和酸的挥发性选择合适的温度。
优选的是，式VII烯胺底物相应于式VIIA
而二酮产物相应于式VIA，
其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式VIIIA定义。
在反应完后，将溶液冷却到0-25℃，结晶产物。产物结晶可以从合适的溶剂中重结晶，合适的溶剂例如异丙醇或甲醇，产生适用于该方法下一步反应的式VI产物；但是通常不必重结晶。式VI产物是新的化合物，并且具有作为制备式I化合物特别是式IA化合物的中间体的实际价值。优选的是，式VI化合物相应于式VIA，其中-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-，R3是氢，低级烷基或低级烷氧基，，并且R8和R9一起构成20-螺噁烷环：
最优选的式VI化合物是4’S(4’α)，7’α-十六氢-11’α-羟基-10’β，13’β-二甲基-3’，5，20’-三氧螺[呋喃-2(3H)，17’β-[4，7]亚甲基[17H]环戊[a]菲]-5’β(2’H)-腈。
在本发明一个特别优选的实施方案中，用上述相同的方法由式VIII化合物产生式VII产物烯胺，并就地转化成式VI二酮。在本发明的该实施方案中，式VIII底物与含有质子源的含水溶剂中过量的碱金属氰化物，或者如上所述任选地一种碱和氯化锂存在下与过量酮基氰醇反应。然而，代替冷却反应混合物，酸化，并且以计算引起烯胺沉淀的比例加入水，优选避免大量冷却反应混合物。在氰化作用反应终止时需要向反应混合物中加入水和一种酸，优选一种矿物酸，例如硫酸，加入的酸的比例足以中和过量的碱金属氰化物，对于每摩尔式VIII底物一般需要加入至少1摩尔当量的酸，优选对于每摩尔底物加入大约2摩尔和大约5摩尔当量之间的酸。而且温度需要保持足够高，并且稀释度足够大，使得避免大量沉淀，并且使在液相中进行由烯胺向二酮的水解。因此，该方法可以以最小干扰和高产率进行。水解优选在至少80℃的温度下，更优选在大约90-100℃范围内，一般进行大约1-10小时，更优选大约2-5小时。然后将反应混合物冷却，优选冷却到大约0℃和大约15℃之间的温度，在冰浴中冷到大约5℃至大约10℃对于沉淀式VI产物二酮是有益的。通过过滤可以回收固体产物，并且通过用水洗涤来去除杂质。
在反应式1合成的下一步中，式VI二酮化合物与金属烷氧化物反应，将4和7位的酮桥打开，裂解羰基和4-碳之间的键，在7位形成一个α-取向的链烷酰基氧基羰基取代基并去除5-碳处的氰基。该反应的产物是相应于式V的羟基酯化合物
其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定义，R1是低级烷氧羰基或羟基羰基。反应中使用的金属烷氧化物相应于式R10OM，其中M是碱金属，R10O相应于R1中的烷氧取代基。当金属烷氧化物是钾或钠的甲氧化物时，反应产率是最为令人满意的，但是可以使用其它低级烷氧化物。钾的烷氧化物是特别优选的。也可以使用苯氧化物，其它芳基氧化物，以及芳基硫化物。反应一般在相应于式R10OH其中R10如上定义的醇的存在下进行。可以使用其它常规试剂。优选的是，式VI底物以大约2％和大约12％重量之间的比例存在，更优选至少大约6％重量，R10OM以每摩尔底物大约0.5和大约4摩尔之间的比例存在。温度的要求不严格，但是提高的温度提高产率。反应时间一般是大约4-24小时，优选大约4-16小时。一般情况下，根据使用的溶剂，反应在大气压回流温度下进行。
在式VI二酮向式VI羟基酯的转化中，副产物氰化物离子可以与产物反应生成5-氰基酯。因为平衡在低浓度下更有利，所以反应优选在高稀释度下进行，例如对于用钠甲氧化物的反应高达40∶1。已经发现通过使用钾的甲氧化物而不是钠的甲氧化物可以实现明显高得多的产率，因为大约20∶1范围的稀释度一般足以减小其中钾的甲氧化物作为试剂的反向氰化作用的程度。
根据本发明，进一步发现反向氰化作用反应可以通过采用适当的化学或物理方法从反应带中去除副产物氰化物离子来抑制。因此在本发明的另一个实施方案中，二酮与碱金属烷氧化物的反应可以在氰离子的沉淀剂的存在下进行，氰离子沉淀剂例如含有形成不可溶氰化物的阳离子的盐。这样的盐可以例如包括碘化锌，硫酸铁，或者基本上所有的比相应的氰化物更溶解的碱土金属或过渡金属的卤化物，硫酸盐或其它盐。如果碘化锌以每当量二酮底物大约1当量范围内的比例存在，发现反应产率与没有碱金属卤化物存在下进行的方法相比大大提高。
甚至在使用了除去氰离子的沉淀剂的情况下，仍然优选在高稀释度下，但由于使用了沉淀剂，溶剂与二酮底物的摩尔比，与不用该试剂的反应相比，可以大大减少。式V羟基酯的回收根据下面描述的提取或非提取方法进行。
优选的是，式VI二酮底物相应于式VIA，
而羟基酯产物相应于式VA
其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式VIIIA定义，R1如式V中定义。
式V产物是新的化合物，并且具有作为制备式I化合物特别是式IA化合物的中间体的实际价值。优选的是，式V化合物相应于式VA，其中-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-，R3是氢，低级烷基或低级烷氧基，，并且R8和R9一起构成20-螺噁烷环：
最优选的式V化合物是11α，17α-二羟基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氢甲酯，γ-内酯。
式V化合物可以通过酸化反应溶液，例如用浓盐酸酸化，冷却到室温，并用有机溶剂例如二氯甲烷或乙酸乙酯提取来分离。提取液用含水碱性洗液洗涤，干燥并过滤，然后去除溶剂。或者可以用浓酸中止含有式V产物的反应溶液。浓缩产物溶液，冷却到0-25℃，并且过滤分离固体产物。
根据式V产物回收的一个优选的方法，在反应结束后通过蒸馏去除甲醇和HCN，在蒸馏之前或期间加入水和酸。在蒸馏之前加入水使操作简化，而蒸馏期间行进性加入使体积保持基本上不变。在蒸馏进行时式V产物从底部结晶出来。该回收方法提供了高质量结晶产物而不需要提取操作。
根据另一方面，含有式V产物的反应溶液可以用矿物酸例如4N HCl中止，然后蒸馏去除溶剂。溶剂的去除对于从反应产物中去除残留的HCN也是有效的。已经发现，若其中式V化合物作为制备epoxymexrenone的方法的中间体，纯化式V化合物不一定要多溶剂提取，如本文所述。事实上，这样的提取经常可以完全避免。在溶剂提取用于产物纯化的情况下，期望用盐水和碱洗补充溶剂洗涤。而在免除了溶剂提取的情况下，盐水和碱洗也免除了。免除了提取和洗涤，明显提高了该方法的产率，不损失产量或产品质量，也免去了用干燥剂例如硫酸钠干燥洗涤溶液的需要。粗产物11α-羟基-7α-烷氧基羰基产物又溶解于溶剂中，用于该方法的下一个反应步骤，该反应步骤是11-羟基转化成11-位的好的离去基团，从而产生式IV化合物：
其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定义，R1是式V中的定义，R2是低级芳基磺酰基氧基，烷基磺酰基氧基，酰基氧基或卤素。优选的是，通过与向含有式V中间体产物的溶液中加入的低级烷基磺酰卤，酰卤或酸酐反应来酯化11α-羟基。优选低级烷基磺酰卤，特别是甲磺酰氯。另一方面，可以通过适当的试剂反应例如亚硫酰溴，亚硫酰氯，硫酰氯或草酰氯，将11α-羟基转化成卤化物。形成11α-磺酸酯的其它试剂包括甲苯磺酰氯，苯磺酰氯和三氟甲磺酸酐。反应在含有卤化氢清除剂例如三乙胺或吡啶的溶剂中进行。也可以使用无机碱例如钾或钠的碳酸盐。式V羟基酯的初始浓度优选在大约5％-大约50％重量之间。优选稍微过量存在酯化试剂。对于该反应，二氯甲烷是特别合适的试剂，但是也可以使用其它试剂例如二氯乙烷，吡啶，氯仿，甲乙酮，二甲氧基乙烷，甲基异丁基酮，丙酮，其它酮类，醚类，乙腈，甲苯和四氢呋喃。反应温度主要受溶剂的挥发性限制。在二氯甲烷中，反应温度优选在大约-10℃和大约10℃范围内。
优选的是，式V羟基酯底物相应于式VA，
而产物相应于式IVA
其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式XIII定义，R1是α-取向的低级烷酰氧基羰基或羟基羰基，R2在式IV中定义。
式IV产物是新的化合物，并且具有作为制备式I化合物特别是式IA的中间体的实际价值。优选的是，式IV化合物相应于式IVA，其中-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-，R3是氢，低级烷基或低级烷氧基，，并且R8和R9一起构成20-螺噁烷环：
最优选的式IV化合物是17α-羟基-11α-(甲基磺酰基)氧基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氢甲酯，γ-内酯。
如果需要，可以通过去除溶剂来分离式IV化合物。优选首先用含水的碱性洗液例如0.5-2N氢氧化钠洗涤反应溶液，接着，用酸洗，例如0.5-2N盐酸。去除反应溶剂后，例如通过将产物溶解于二氯甲烷，然后加入降低式IV产物溶解度的另一种溶剂例如乙醚，使其以结晶形式沉淀，使产物重结晶。
根据下文的进一步详细说明，在式IV产物的回收中，或者在制备将式IV中间体转化成式II中间体的反应溶液中，如果代之以用离子交换树脂去除酸性和碱性杂质处理溶液，则可以免却所有的提取和/或洗涤步骤。首先用阴离子交换树脂处理溶液，之后用阳离子交换树脂。另一方面，可以首先用无机吸附剂例如碱性氧化铝或碱性氧化硅处理反应溶液，接着用稀酸洗涤。碱性氧化铝或碱性氧化硅一般可以以每千克产物大约5-50g的比例，优选每千克产物大约15-20g的比例与反应溶液混合。不管使用离子交换树脂还是无机吸附剂，通过简单地在室温搅拌下将树脂或无机吸附剂与反应溶液搅拌成浆状物，然后过滤去除树脂或无机吸附剂来进行处理。
在本发明一种可选择和优选的实施方案中，通过去除部分溶剂，以浓缩溶液粗产物形式回收式IV产物化合物。直接在该方法的下面步骤中使用该浓缩的溶液，从式IV化合物中去除11α-离去基团，从而产生式II烯酯：
其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定义，R1是式V中的定义。为了该反应的目的，式IV化合物的R2取代基可以是任何离去基团，其去除有效生成9-和11-碳之间的双键。优选离去基团是低级烷基磺酰基氧基或酰氧基取代基，其通过与一种酸和一种碱金属盐反应而被去除。可以使用矿物酸，但是优选使用低级链烷酸。有益的是用于该反应的试剂进一步包括使用的链烷酸的碱金属盐。特别优选的是离去基团包括甲磺酰基氧基，用于该反应的试剂包括甲酸或乙酸和一种这些酸或另一种低级链烷酸的碱金属盐。离去基团是甲磺酰基氧基且去除试剂是甲酸和甲酸钾的情况下，发现9，11与11，12-烯烃的比例比较高。如果在去除离去基团的过程中存在游离的水，则有生成杂质特别是7，9-内酯的趋势
其难于从终产物中去除。因此用乙酸酐或其它干燥剂来去除甲酸中存在的水。反应之前反应混合物中存在的游离的水的含量，根据KarlFischer分析对于水的测定，应该保持在低于以总反应溶液为基础的大约0.5％重量的水平，优选低于大约0.1％重量。尽管优选反应混合物尽可能保持干燥，但是0.3％重量的水已可实现令人满意的结果。优选的是，反应加入的混合物含有大约4％和大约50％重量之间的链烷酸中式IV底物。优选含有大约4-20％重量的酸的碱金属盐。乙酸酐用作干燥剂的情况下，其优选以每摩尔链烷酸大约0.05-0.2摩尔之间的比例存在。
发现在消除试剂包括作为消除离去基团并生成烯酯(9，11-烯烃)的试剂的三氟乙酸，三氟乙酸酐和乙酸钾的混合物时，反应混合物中副产物7，9-内酯和11，12-烯烃的比例相对低。三氟乙酸酐作为干燥剂，应该以以三氟乙酸消除剂为基础至少大约3％重量，更优选至少大约15％重量，最优选大约20％的比例存在。
另一方面，可以通过在有机溶剂例如DMSO，DMF，或DMA中加热式IV的溶液，消除式IV化合物的11α-离去基团，产生式II烯酯。
进一步根据本发明，式IV化合物最初在一种酸例如甲苯磺酸或无水矿物酸例如硫酸的存在下，与链烷酸烯酯例如乙酸异丙烯酯反应，生成式IV化合物的3-烯醇酯：
另一方面，通过用一种酸酐和碱例如乙酸和乙酸钠处理，可以生成3烯醇酯。进一步可选择的方法包括在一种酸的存在下用烯酮处理，产生IV(Z)。然后式IV(Z)的中间体在甲酸或乙酸存在下与碱金属甲酸盐或乙酸盐反应，产生式IV(Y)Δ-9，11烯醇乙酸酯：
其然后在有机溶剂中，优选在一种醇例如甲醇中，或者通过乙酸烯醇酯的热分解，或者通过其与碱金属烷氧化物反应，被转化成式II烯酯。消除反应对于式II烯酯是高选择性的，优先11，12-烯烃和7，9-内酯。在乙酸烯醇酯向烯酮的转化过程中保持该选择性。
优选的是，式IV底物相应于式IVA，
而烯酯产物相应于式IIA
其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式XIIIA定义，R1在式V中定义。
如果需要，可以通过去除溶剂，将固体产物溶解于冷水中，并且用有机溶剂例如乙酸乙酯萃取，来分离式II化合物。适当的洗涤和干燥步骤后，通过去除萃取溶剂来回收产物。然后将烯酯溶解于适合于向式I产物转化的溶剂中。另一方面，可以通过向浓缩的产物溶液中加入水并过滤固体产物，从而，优选去除7，9-内酯来分离烯酯。式II底物向式IA产物的转化可以以美国专利4559332中描述的方法进行，该专利在这里引作参考，或者，更优选通过下文描述的使用卤代乙酰胺促进剂的新的反应。
在本发明的另一个实施方案中，不用分离式IV中间体化合物就可以将式V羟基酯转化成式II烯酯。在该方法中，将羟基酯溶解于一种有机溶剂例如二氯甲烷；或者向该溶液中加入酰化剂，例如甲磺酰氯，或卤化剂，例如硫酰氯。搅拌混合物，在涉及卤化作用的情况下，加入盐酸清除剂，例如咪唑。碱与溶液的混合是高度放热的，因此应该用完全冷却以控制速度进行。加入碱之后，得到的混合物升至中等温度，例如0℃至室温，或稍高，一般反应1-4小时。反应完全后，优选在高真空(例如24”至28”Hg)条件下在-10至+15℃，更优选在大约0-大约5℃下，去除溶剂，浓缩溶液，并且去除过量的碱。然后将底物再溶解于有机溶剂优选卤化溶剂例如二氯甲烷中以转化成烯酯。
优选分别在无水反应器中混合有机酸，有机酸盐和干燥剂，优选甲酸，碱金属甲酸盐和乙酸酐来制备离去基团消除剂。乙酸酐的加入是放热的，结果释放CO，因此一定要控制加入速度。为了促进水的去除，反应温度优选保持在60-90℃范围内，更优选大约65-大约75℃。然后，向式IV化合物的产物溶液中加入该试剂以促进消除反应。4-8小时后，优选将反应混合物加热到至少大约85℃的温度，但是不超过约95℃，直到去除所有的挥发蒸馏物质，然后一般再保持大约1-4小时以完成反应。冷却反应混合物，通过标准提取技术回收后，可以根据需要通过蒸发溶剂来回收烯酯。
进一步发现，可以通过另一种方法从反应溶液中回收式II烯酯，该方法避免了消除反应后的提取步骤的需要，从而节省了费用，提高了产量和/或提高了产率。在该方法中，通过在去除甲酸后用水稀释反应混合物来沉淀烯酯产物。然后过滤分离产物。不需要提取。
根据不用分离式IV化合物的由式V羟基酯向式II烯酯转化的进一步选择的方法，式V羟基酯的11α-羟基被卤原子置换，然后通过热脱氢卤化作用就地生成式II烯酯。通过在低温下在一种卤化氢清除剂例如咪唑存在下，与硫酰卤，优选硫酰氯反应，有效进行卤素置换羟基作用。羟基酯溶解于溶剂例如四氢呋喃中并冷却到0至-70℃。加入硫酰卤，将反应混合物加热到中等温度，例如室温，保持足以完成消除反应的一段时间，一般是1-4小时。该实施方案的方法不只是将两步合成为一步，而且也避免了使用：卤化反应试剂；酸(例如乙酸)；和干燥剂(乙酸酐或硫酸钠)。而且，反应不需要回流条件，并且避免产生当使用乙酸为干燥剂时产生的副产物CO。
在本发明一个特别优选的实施方案中，不用分离任何纯化形式的中间体就可以将式VI二酮化合物转化成epoxymexrenone或其它式I化合物。根据该优选方法，用强酸溶液猝灭含有羟基酯的反应溶液，冷却到室温，然后用合适的萃取溶剂萃取。有利的是，在萃取之前向反应混合物中加入无机盐水溶液，例如10％重量盐水溶液。洗涤萃取液，并通过共沸蒸馏从酮裂解反应中去除残留的甲醇溶剂来干燥。
然后在低温下使得到的含有大约5％-50％重量式V化合物的浓溶液与酰化剂或烷基酰化剂接触，生成磺酸酯或二羧酸酯。烷基磺酰化作用或羧化反应完全之后，将反应液通过酸性交换树脂柱后通过碱性交换树脂柱，去除碱性和酸性杂质。每次通过后，用合适的溶剂例如二氯甲烷冲洗柱子，从中回收残留的磺酰酯或二羧酸酯。合并的洗脱液和冲洗液被合并并浓缩，优选真空浓缩，产生含有式IV磺酰酯或二羧酸酯的浓溶液。然后该浓缩液与含有有效去除11α-酯离去基团，并且去除氢生成9，11双键的试剂的干燥剂接触。优选去除离去基团的溶剂含有如上所述的甲酸/碱金属甲酸盐/乙酸酐干燥剂溶液。反应完全后，冷却反应混合物，并真空去除甲酸和/或其它挥发性成分。将残余物冷却到室温，进行适当的洗涤步骤后干燥，得到含有式II烯酯的浓溶液。该烯酯然后可以用这里所描述的或者是在美国专利4559332中描述的方法转化成epoxymexrenone或其它式I化合物。
在本发明一个特别优选的实施方案中，从反应液中真空去除溶剂，式IV产物分配在水和一种合适的有机溶剂例如乙酸乙酯中。然后用有机溶剂反萃含水层，用碱性溶液，优选含有一种碱金属卤化物的碱金属氢氧化物的溶液洗涤反萃液。浓缩有机相，优选真空浓缩，得到式II烯酯产物。式II产物然后可以溶解于有机溶剂例如二氯甲烷中，以’332专利中描述的方法进一步反应，产生式I产物。
在环氧化反应中使用三卤乙腈的情况下，发现溶剂的选择是重要的，最优选卤化溶剂，特别优选二氯甲烷。例如二氯乙烷和氯苯溶剂给出合理的令人满意的产率，但是在二氯甲烷反应介质中一般得到更好的产率。溶剂例如乙腈和乙酸乙酯一般给出不好的产率，而在溶剂例如甲醇或水/四氢呋喃中的反应给出极少期望的产物。
进一步根据本发明，发现通过使用三卤乙酰胺而不是三卤乙腈为环化反应的过氧化物活化剂，可以实现epoxymexrenone合成中的很多改进。根据特别优选的方法，通过在三氯乙酰胺和一种合适的缓冲剂的存在下使式IIA底物与过氧化氢反应进行环氧化作用。反应优选在大约pH3-7范围内，更优选在大约5-7的pH下进行。然而尽管有这些考虑，在优选pH范围外也可以成功实现反应。
用含有磷酸氢二钾的缓冲液和/或用含有相对比例在大约1∶4和大约2∶1之间，更优选在大约2∶3范围内的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾混合物的缓冲液获得特别好的结果。也可以使用硼酸盐缓冲液，但是一般给出比磷酸二钾或K2HPO4或K2HPO4/KH2PO4混合物慢的转化作用。不管缓冲液的组成是什么，其应该提供上面指出范围内的pH值。除了缓冲液全部组成或其精确的pH外，发现如果至少缓冲液的一部分由二元碱性磷酸氢盐离子组成，则反应进行得有效得多。相信该离子基本上作为生成包括促进剂和过氧化氢离子的加成物或配合物中的均相催化剂而参与反应，该加成物或配合物的产生可能接着对于总的环氧化作用反应机理是必需的。因此，对于二元碱性磷酸氢盐(优选来自K2HPO4)的定量需要可能只是少的催化剂浓度。一般情况下，优选以每当量底物至少大约0.1当量，例如大约0.1-大约0.3当量的比例存在HPO4。
反应在合适的溶剂优选二氯甲烷中进行，但是也可以使用其它的卤化的溶剂，例如氯苯或二氯乙烷。发现甲苯和甲苯与乙腈的混合物也是令人满意的。没有依据特定的理论，判断反应在两相系统中进行最有效，其中生成过氧化氢中间体，并分布在低水含量的有机相中，并与有机相中的底物反应。因此优选的溶剂是其中水溶解度低的溶剂。包括有另一种溶剂例如乙腈会促进从甲苯中有效回收。
在式II底物向式I产物的转化中，甲苯提供了方法优点，因为底物大量地溶解于甲苯而产物不溶解。因此，当转化达到40-50％范围时反应中沉淀出产物，产生三相混合物，通过过滤可以方便地从中分离产物。在进行该方法该步骤的转化作用中，甲醇，乙酸乙酯，单独的乙腈，THF和THF/水尚未证明和卤化溶剂或甲苯一样有效。
尽管三氯乙酰胺是最优选的，但是也可以使用其它三卤乙酰胺，例如三氟乙酰胺。三卤代甲基苯甲酰胺，和在拉电子三卤代甲基基团与酰胺的羰基之间有亚芳基部分的其它化合物也是有用的。也可以使用3，3，3-三卤代丙酰胺，但是结果不好。通常，过氧化物活化剂相应于下式：
R℃(O)NH2
其中R0是有拉电子能力(根据σ常数测定)至少与一氯代甲基一样高的基团。更特别地，过氧化物活化剂相应于下式：
其中X1，X2和X3独立地选自卤原子，氢，烷基，卤代烷基和氰基和氰基烷基，RP选自亚芳基和-(CX4X5)n-，其中n是0或1，X1，X2，X3，X4，和X5中至少一个是卤原子或全卤代烷基。其中X1，X2，X3，X4，或X5中任何一个不是卤原子时，其优选是卤代烷基，更优选是全卤代烷基。特别优选的活化剂包括其中n是0且X1，X2和X3中至少两个是卤原子的化合物；或者其中所有X1，X2，X3，X4，和X5是卤原子或是全卤代烷基的化合物。每个X1，X2，X3，X4，和X5优选是氯或氟，虽然混合的卤化物也是合适的，但最优选氯，可以是全氯代烷基或全溴代烷基和其混合物。
优选的是，过氧化物活化剂以最初存在的每当量底物至少大约1当量，更优选大约1.5当量至2当量的比例存在。过氧化氢应该以至少不过分过量的量加入到反应中，或者随着环氧化作用反应的进行跟进性加入。尽管反应对于每摩尔底物只消耗1-2当量的过氧化氢，但是优选以相对于初始存在的底物和活化剂显著过量的量加入过氧化氢。本发明不限制于特别的理论，相信反应机理涉及生成活化剂与OOH-的加成物，该反应的形成是可逆反应，平衡有利于反方向反应，因此为了使反应向正向方向进行必需有大量初始过量的过氧化氢。反应温度不在窄范围内限制，在0-100℃范围内可以有效进行。最佳温度取决于溶剂的选择。一般情况下，优选的温度在大约20-30℃之间，但是在某些溶剂中，例如甲苯，反应可以在60-70℃范围内有利地进行。在25℃时，反应一般需要10小时以下，一般是3-6小时。如果需要，可以在反应周期末加入另外的活化剂和过氧化氢，使底物的转化完全。
在反应周期末，去除水相，优选洗涤有机反应液以去除水溶性杂质，然后可以通过去除溶剂来回收产物。去除溶剂之前，应该用至少弱的至中等的碱性洗液，例如碳酸钠，洗涤反应液。优选的是，反应混合物依次用下面物质洗涤：弱还原溶液例如弱的亚硫酸钠水溶液(例如3％重量)；碱溶液，例如氢氧化钠或氢氧化钾(优选大约0.5N)；酸溶液例如盐酸(优选大约1N)；最终中性洗液含有水或盐水，优选的饱和的盐水，以减小产物损失。去除反应溶剂之前可以有益地加入另一种溶剂例如有机溶剂，优选乙醇，这样蒸馏去除大多数挥发性反应溶剂后，通过结晶来回收产物。
应该明白，除了制备epoxymexrenone的各种方法外，已经很好地应用了使用三氯乙酰胺或其它新的过氧化物活化剂的新的环氧化作用方法，而且事实上可以用于在多种底物液相反应中跨烯烃双键生成环氧化物。该反应在其中烯烃碳原子是四取代和三取代的不饱和的化合物中特别有效，即RaRbC＝CRcRd和RaRbC＝CRcH，其中Ra至Rd代表不是氢的取代基。其中底物是带有三取代双键的环化合物，或者是带有四取代双键的环或无环化合物的反应进行得最快而且完全。举例的该反应的底物包括Δ-9，11-烯睾丙内酯，和
因为三取代和四取代双键反应进行得更快更完全，对于在包括其中烯烃碳原子是一元取代的或者甚至是二元取代的其它双键的化合物中跨这样三取代和四取代双键的选择性环氧化作用是特别有效的。
应该进一步明白，该反应可以用来有利于一元取代的或者甚至是二元取代的双键的环氧化作用，例如各种各样甾类底物中的11，12-烯。但是因为其优选以高选择性环氧化更高级取代的双键，例如9，11-烯，所以本发明方法对于在这里其他地方所描述的各种反应方法的环氧化步骤中实现高产量和高产率是特别有效的。
该改进的方法显示，用于制备下面的化合物特别有益：
其制备方法是将下述化合物环氧化，
已经证明本发明方法中使用三氯乙酰胺代替三氯乙腈作为环氧化作用反应的氧转移剂有多种优点。三氯乙酰胺试剂系统对于在相同分子结构中跨三取代双键与二取代和α，β-酮基烯烃的环氧化作用提供严格的区域控制。因此大大提高了反应产率，产物曲线和终产物纯度。进一步发现使用三卤乙腈所观察到的氧的大大过量的产生在用三氯乙酰胺时没有出现，这对环氧化作用方法赋予更高的安全性。进一步与三氯乙腈促进的反应相反，三氯乙酰胺反应具有最小的放热作用，因此有利于控制反应的放热曲线。发现搅拌作用最小，反应器效能更一致，这是一个好于三氯乙腈方法的进一步的优点。与三氯乙腈促进的反应相比，该反应更适合于大规模生产。产物的分离和纯化是简单的，没有发现例如使用间-氯代过氧苯甲酸或其它过酸所发现的羰基官能团的Bayer-Villager氧化作用(环氧化物促进的酮向酯的转化作用)，并且该试剂不贵，易得，并且容易操作。
本发明新的环氧化方法作为方法1合成的关键步骤非常有用。在一个特别优选的实施方案中，如下进行方法1的全部过程：
方法2
本发明第二种新的反应方法(方法2)用烯睾丙内酯或其它相应于式XIII的底物起始
其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定义。在该方法的第一个步骤中，式XIII底物转化成式XII产物
使用了基本上与上述将式VIII底物转化成式VII中间体的方法相同的氰化反应方法。优选式XIII底物相应于式XIIIA
并且烯胺产物相应于式XIIA
其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式XIII定义。
在该方法2的第二个步骤中，式XII烯胺水解为式XI中间体二酮产物
其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定义，
使用了基本上与上述将式VIII底物转化成式VII中间体的方法相同的反应方法。优选式XII底物相应于式XIIA
并且二酮产物相应于式XIA
其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式VIIIA中定义。
进一步根据反应方法2，式XI二酮与一种碱金属烷氧化物反应生成mexrenone或相应于式X的其它产物，
其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定义，R1如在式V中定义。该方法使用了基本上与上述将式VI化合物转化成式V化合物的方法相同的反应方法来进行。优选式XI底物相应于式XIA
并且中间体产物相应于式XA
其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式XIIIA中定义，R1如在式V中定义。
接着通过新的生物转化方法将式X化合物9α-羟基化，得到式IX产物
其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定义，R1如在式V中定义。可以用于该羟基化步骤的微生物中的微生物是Nocardia conicruria ATCC 31548，Nocardia aurentia ATCC 12674，山扁豆生棒孢(Corynespora cassiicola)ATCC 16718，Streptomyces hydroscopicus ATCC 27438，深黄被孢霉(Mortierella isabellina)ATCC 42613，蚕白僵菌(Beauvria bassiana)ATCC 7519，产紫青霉(Penicillum purpurogenum)ATCC 46581，Hypomyces chrysospermusIMI 109891，Thamnostylum piriforme ATCC 8992，短刺小克银汉霉(Cunnighamella blakesleeana)ATCC 8688a，刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)ATCC 3655，美丽小克银汉霉(Cunninghamella elegans)ATCC 9245，玫瑰单端孢(Trichothecium roseum)ATCC 12543，Epicoccum humicola ATCC 12722，Saccharopolyspora eythrae ATCC 11635，蚕白僵菌(Beauvria bassiana)ATCC 13144，简单节杆菌(Arthrobacter simplex)，Bacterium cyclooxydans ATCC 12673，Cylindrocarpon radicicolaATCC 11011，Nocardia aurentia ATCC 12674，犬股诺卡氏菌(Nocardia canicruria)，限定诺卡氏菌(Norcardia restrictus)ATCC 14887，睾丸酮假单孢菌(Pseudomonas testosteroni)ATCC 11996，Rhodococcus equi ATCC 21329，偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)ATCC-6842，和玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC 19150。
反应基本上以上述与方法1和2相关的方法进行。特别优选方法1的方法。
生物转化中使用的生长培养基优选含有大约0.05％至大约5％重量可利用氮；大约0.5％至大约5％重量的葡萄糖；大约0.25％-大约2.5％重量的酵母产生物；大约0.05％至大约0.5％重量可得的磷。特别优选的生长培养基包括下列物质：
大豆粉：大约0.5％-大约3％重量的葡萄糖；大约0.1％-大约1％重量的大豆粉；大约0.05％-大约0.5％重量的碱金属卤化物；大约0.05％-大约560.5％重量的酵母产生物例如自溶酵母或酵母抽提物；大约0.05％-大约0.5％重量的磷酸盐例如磷酸氢二钾；pH＝7；
胨-酵母抽提物-葡萄糖：大约0.2％-大约2％重量的胨；大约0.05％-大约0.5％重量的酵母抽提物；和大约2％-大约5％重量的葡萄糖；
Mueller-Hinton：大约10％-大约40％重量的牛肉浸液；大约0.35％-大约8.75％重量的酪蛋白水解物；大约0.15％-大约0.7％重量的淀粉。
真菌可以在大豆粉或胨营养物中生长，而放线菌和真杆菌可以在大豆粉(加0.5％-1％重量的羧酸盐例如甲酸钠用于生物转化)或在Mueller-Hinton肉汤中生长。
在实施例19中讨论了通过发酵从mexrenone产生11β-羟基mexrenone。
式IX产物是新的化合物，其通过过滤分离，用合适的有机溶剂例如乙酸乙酯洗涤，并且从相同或相似的溶剂中重结晶。它们具有作为制备式I特别是式IA化合物的中间体的实际价值。优选的是，式IX化合物相应于式IXA，其中-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-，R3是氢，低级烷基或低级烷氧基，，并且R8和R9一起构成20-螺噁烷环：
在合成方法2的下一步反应中，式IX产物与一种脱水剂反应生成式II化合物
其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定义，R1如在式V中定义。其中底物相应于式IXA，产物是式IIA
其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式XIIIA中定义，R1如在式V中定义。
在该合成方法的最后步骤中，通过根据美国专利4559332中描述的方法的环氧化作用，或者优选通过上述本发明新的环氧化作用方法，将式II产物转化成式I。
在一个特别优选的方案中，如下进行方法2的全部过程：
方法3
这种情况下的合成用相应于式XX的底物开始
其中-A-A-和R3如式VIII定义，-B-B-也如式VIII定义，除了R6和R7都不是在16，17位与D环稠合的环的一部分，并且R26是低级烷基，优选甲基。式XX底物与Sulfonium ylide反应产生相应于式XIX的环氧化物中间体
其中-A-A-，R3，-B-B-和R26如式XX中定义。
在合成方法3的下一步反应中，式XIX中间体转化成式XVIII另一种中间体
其中-A-A-，R3，-B-B-如式XX定义。在该步骤中，式XIX底物通过在溶剂中在一种碱的存在下与NaCH(COOEt)2反应而转化成式XVIII中间体。该式XVIII化合物暴露于热水和一种碱性卤化物，产生相应于式XVII的脱羧化中间体
其中-A-A-，R3，-B-B-如式XX定义。这种式XX化合物转化成式XVII化合物的方法基本上相应于美国专利3897417，3413288和3300489中描述的方法，这些专利在此引作参考。尽管底物不同，但是用于引入17-螺内酯部分的试剂，机理和条件基本上相同。
式XVII中间体与脱氢剂的反应得到式XVI进一步的中间体
其中-A-A-，R3，-B-B-如上定义。
一般有用的脱氢剂包括二氯二氰基苯并醌(DDQ)和氯醌(2，3，5，6-四氯-对-苯并醌)。另一方面，脱氢作用可以通过先后的6-碳处的卤化作用，接着脱卤化氢反应来实现。
式XVI中间体接着转化成式XV烯胺
其中-A-A-，R3，-B-B-如式XX定义。基本上以上述对于式VIII的11α-羟基化合物转化成式VII烯胺的方法通过氰化作用转化。一般情况下，氰离子源可以是碱金属氰化物。碱优选是吡咯烷和/或四甲基胍。可以使用甲醇溶剂。
式XV产物是新的化合物，其可以通过色谱分离。这些和其它式AXV新的化合物具有作为制备式I特别是式IA化合物的中间体的实际价值。式AXV化合物相应于下面的结构，
其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如上定义。在最为优选的式XV化合物中，-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-。
根据上述产生式VI二酮化合物的水解作用，式XV烯胺可以转化成式XIV二酮
其中-A-A-，R3，-B-B-如式XX中定义。用于合成epoxymexrenone的特别优选的是那些式XIV化合物，其也落在式VIA范围内。
式XIV产物是新的化合物，其可以通过沉淀来分离。这些和其它式AXIV新的化合物具有作为制备式I特别是式IA化合物的中间体的实际价值。式AXIV化合物相应于下面的结构，
其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如上定义。在更为优选的式AXIV和XIV化合物中，-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-。
基本上使用上述将式VI二酮转化成式V羟基酯的方法将式XIV化合物进一步转化成式XXXI化合物。在该例子中，在进一步转化成式XXXII产物之前必需分离中间体XXXI，
其中-A-A-，-B-B-和R3如式XX中定义，
优选的式XXXI化合物是那些落在式IIA范围内的化合物。用上文或美国专利4559332中描述的方法，将式XXXI化合物转化成式XXXII化合物。在一个特别优选的实施方案中，如下进行方法3的全部过程：
方法4
方法4的头三个步骤与方法3的相同，即用相应于式XX的化合物开始制备式XVII中间体。
此后，例如使用美国专利4559332的方法将式XVII中间体环氧化，产生式XXIV化合物
其中-A-A-，R3和-B-B-如式XX中定义。但是，在本发明特别优选的实施方案中，根据上述方法1中描述的将式II烯酯转化成式I产物的方法，用含有酰胺型过氧化物活化剂，最优选三氯乙酰胺的氧化作用试剂在9，11-双键处将式XVII底物环氧化。用于该反应的条件和试剂的比例基本上与对于式II烯酯转化成epoxymexrenone描述的相同。
已经发现使用一种过酸例如间-氯过氧苯甲酸，也能以非常好的产率有效进行式XVII底物的环氧化作用。但是，三氯乙酰胺试剂提供优异的结果，减少了Bayer-Villager氧化副产物的生成。后者副产物能够去除，但是这需要从溶剂例如乙酸乙酯中研制，接着从另一种溶剂例如二氯甲烷中结晶。通过与脱氢化(氧化)试剂例如DDQ或氯醌反应，或者使用溴化/脱溴化氢(或其它卤化/脱卤化氢)程序，将式XXIV环氧化物脱氢，产生6-和7-碳之间的双键，来产生另一种新的式XXIII中间体
其中-A-A-，R3和-B-B-如式XX中定义。特别优选的式XXIII化合物是其中-A-A-和-B-B-如式XIII中定义的那些化合物。
尽管直接氧化对于形成式XXIII产物是有效的，但是产率一般很低。因此优选氧化作用分两步进行，首先在C-6位将式XXIV底物卤化，然后脱卤化氢，生成6，7-烯烃。优选用一种N-卤代有机试剂例如N-溴代琥珀酰胺进行卤化作用。在一种合适的溶剂中，例如乙腈，在卤化促进剂例如苯甲酰过氧化物存在下进行溴化作用。反应在大约50-大约100℃范围内的温度下有效进行，一般在常压回流温度下在一种溶剂例如四氯化碳，乙腈或其混合物中进行。然而完成反应一般需要4-10小时。去除反应溶剂，残余物溶解于水不互溶溶剂例如乙酸乙酯中。得到的溶液依次用弱碱性溶液(例如碱金属碳酸氢盐)和水，或者优选用饱和盐水洗涤，以减少产物损失，然后去除溶剂，，残余物溶解于适于脱卤化氢反应的另一种溶剂(例如二甲基甲酰胺)中。
合适的脱卤化氢试剂，例如1，4-二氮杂双环[2，2，2]辛烷(DABCO)与碱金属卤化物例如溴化锂一起被加入到溶液中，将溶液加热到适当的反应温度，例如60-80℃，反应持续几小时，一般是4-15小时，以完成脱溴化氢作用。可以根据需要在反应周期期间加入另外的脱溴化氢试剂，以使反应完全。然后，例如通过加入水以沉淀产物，然后过滤分离，并且优选用另外量的水洗涤，来回收式XXIII产物。产物优选例如从二甲基甲酰胺中重结晶。
式XXIII产物，例如9，11-环氧烯睾丙内酯，是新的化合物，其可以通过萃取/结晶来分离。其具有作为制备式I特别是式IA化合物的中间体的实际价值。例如其可以用作制备式XXII的底物。在最优选的式XXIII化合物中，-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-。
基本上使用上述对于制备式VII化合物的方法，使式XXIII化合物与氰化物离子反应，来产生相应于式XXII的新的环氧烯胺化合物
其中-A-A-，R3和-B-B-如式XX中定义。特别优选的式XXII化合物是其中-A-A-和-B-B-如式XIII中定义的那些化合物。
式XXII产物是新的化合物，其可以通过沉淀和过滤来分离。其具有作为制备式I特别是式IA化合物的中间体的实际价值。在最优选的式XXII化合物中，-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-。
基本上使用上述对于制备式VI化合物的方法，使式XXII环氧烯胺化合物转化成新的式XXI环氧二酮化合物。
式XXI产物是新的化合物，其可以通过沉淀和过滤来分离。其具有作为制备式I特别是式IA化合物的中间体的实际价值。特别优选的式XXI化合物是其中-A-A-和-B-B-如式XIII中定义的那些化合物，在最为优选的式XXI化合物中，-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-。
使用上述环氧化方法或者美国专利4559332的方法将式XXI化合物转化成式XXXII化合物。在一个特别优选的实施方案中，如下进行方法4的全部过程：
方法5
方法5的方法用相应于式XXIX的底物开始
其中-A-A-，和-B-B-如式XX中定义。该底物通过与原甲酸三甲酯反应被转化成式XXVIII产物
其中-A-A-，R3和-B-B-如式XX中定义。生成式XXVIII之后，用上述将式XX底物转化成式XVII的方法将式XXIX转化成式XXVII化合物。式XXVII化合物具有下面的结构：
其中-A-A-，-B-B-和R3如式XX中定义，且RX是任何一般的羟基保护基团。
使用上述制备式XVI化合物的方法，氧化式XXVII化合物，得到相应于式XXVI的新的化合物
其中-A-A-，-B-B-和R3如式XX中定义。特别优选的式XXIX，XXVIII，XXVII和XXVI化合物是其中-A-A-和-B-B-如式XIII中定义的那些化合物。
式XXVI产物是新的化合物，其可以通过沉淀/过滤来分离。其具有作为制备式I特别是式IA化合物的中间体的实际价值。特别优选的式XXVI化合物是其中-A-A-和-B-B-如式XIII中定义的那些化合物。在最为优选的式XXVI化合物中，-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-。
使用上面对于式VIII化合物的氰化作用定义的方法，将式XXVI新的中间体转化成式XXV新的9-羟基烯胺中间体
其中-A-A-，R3和-B-B-如式XX中定义。
式XXV产物是新的化合物，其可以通过沉淀/过滤来分离。其具有作为制备式I特别是式IA化合物的中间体的实际价值。特别优选的式XXV化合物是其中-A-A-和-B-B-如式XIII中定义的那些化合物。在最为优选的式XXVI化合物中，-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-。
基本上使用上述对于制备式VI二酮化合物描述的条件，将式XXV9-羟基烯胺中间体转化成式XIV二酮化合物。注意在该例子中，反应有效地同时进行烯胺结构的水解和9，11位的脱水，产生9，11双键。然后使用上述方法3中描述的相同步骤，将式XIV化合物转化成式XXXI化合物，然后生成式XIII化合物。
在一个特别优选的实施方案中，如下进行方法5的全部过程：
方法6
方法6提供了制备epoxymexrenone和其它相应于式I的化合物的好的方法，用11α-羟基化的雄烯二酮或其它式XXXV化合物开始
其中-A-A-，R3和-B-B-如式XIII中定义，产生相应于式XXXVI的中间体
其中-A-A-，R3和-B-B-如式XIII中定义。除了底物的选择，进行11α-羟基化的方法基本上根据上述方法1的说明。下面的微生物适于进行雄烯二酮或其它式XXXV化合物的11α-羟基化作用：
赭色曲霉(Aspergillus ochraceus)NRRL 405(ATCC 18500)；
黑色曲霉(Aspergillus niger)ATCC 11394；
构巢曲霉(Aspergillus nidulans)ATCC 11267；
米根霉(Rhizopus orvzae)ATCC 11145；
葡枝根霉(Rhizoous stolonifer)ATCC 6227b；
玫瑰单端孢(Trichothecium roseum)ATCC 12519和ATCC 8685.
接着11α-羟基雄甾-4-烯-3，17-二酮，或其它式XXXVI化合物通过在一种酸催化剂存在下与一种醚化剂例如原甲酸三烷基酯反应而转化成式(101)11α-羟基-3，4-烯醇醚：
其中-A-A-，R3和-B-B-如式XIII中定义，R11是甲基或其它低级烷基(C1-C4)。为了进行该转化作用，通过与一种酸，例如苯磺酸水合物或甲苯磺酸水合物混合，来酸化11α-羟基底物，并且溶解于低级醇溶剂优选乙醇中。在保持混合物冷却的同时，优选保持在大约0℃-大约15℃，在5-40分钟期间内，逐渐加入原甲酸三烷基酯，优选原甲酸三乙酯。然后将混合物升温，反应在大约20℃-大约60℃之间的温度下进行。优选反应在30℃-50℃进行1-3小时后加热到回流反应一段时间，一般是2-6小时，来完成反应。将反应混合物冷却，优选冷却到0℃-15℃，优选冷却到大约5℃，并且真空去除溶剂。
使用上述方法3中式XX化合物转化成式XVII化合物的相同反应方法，向式101化合物引入式XXXIII17-螺内酯部分。例如，式101底物可以在合适的溶剂例如DMSO中在一种碱例如碱金属氢氧化物存在下与一种Sulfonium ylide反应，产生相应于式102的中间体：
其中-A-A-，R3，R11和-B-B-如式101中定义。然后式102中间体在一种碱金属烷氧化物存在下与一种丙二酸二酯反应，形成5元螺内酯环，并且产生式103中间体：
其中-A-A-，R3，R11和-B-B-如式101中定义，R12是C1-C4低级烷基。最后在一种碱金属卤化物存在下将合适的溶剂例如二甲基甲酰胺中的式103化合物加热，去除烷氧羰基部分，产生式104中间体：
其中-A-A-，R3，R11和-B-B-如式XIII中定义。
接着3，4-烯醇醚化合物104被转化成式XXIII化合物，即其中R8和R9一起形成式XXXIII部分的式VIII化合物。该氧化步骤基本上以方法4合成中式XXIV化合物转化成式XXIII中间体的氧化步骤相同的方法进行。直接氧化可以使用一种试剂例如2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯并醌(DDQ)或四氯苯并醌(氯醌)进行，或者优选进行两个阶段的氧化作用，首先溴化，例如用N-卤代溴化剂例如N-溴代琥珀酰胺(NBS)或1，3-二溴-5，5-二甲基乙内酰脲(DBDMH)，然后用一种碱，例如用DABCO，在溴化锂存在下并且加热，进行脱溴化氢。使用NBS进行溴化的情况下也必须使用酸，以便将3-烯醇醚转化成烯酮。对于溴化和烯醇醚向烯酮的转化，一种离子型的、而不是游离基溴化剂的DBDMH自身是有效的。
然后通过方法1中描述的步骤将式VIII化合物转化成epoxymexrenone或其它式I化合物。
各式101，102，103和104中间体是新的化合物，具有作为epoxymexrenone或其它式IA和I化合物的中间体的实际价值。在各式101，102，103和104化合物中-A-A-和-B-B-优选是-CH2-CH2-，R3是氢，低级烷基或低级烷氧基。更优选的是，式101化合物是3-乙氧基-11α-羟基雄甾-3，5-二烯-17-酮，式102化合物是3-乙氧基螺[雄甾-3，5-二烯-17β，2’-环氧]-11α-醇，式103化合物是3-乙氧基-11α-17α-二羟基孕甾-3，5-二烯-21，21-二羧酸氢乙酯，γ-内酯，式104化合物是3-乙氧基-11α-17α-二羟基孕甾-3，5-二烯-21-羧酸，γ-内酯。
在一个特别优选的实施方案中，如下进行方法6的全部过程：
方法7
方法7提供了制备epoxymexrenone和其它式I化合物的方法，用包括β-谷甾醇，胆甾醇，豆甾醇或其它式XXXVII化合物的起始底物
其中-A-A-，R3和-B-B-如式XIII中定义，D-D是-CH2-CH2-或-CH＝CH-，并且各R13，R14，R15和R16独立地选自氢或C1-C4烷基。
在合成的第一个步骤中，通过式XXXVII化合物的生物转化来制备11α-羟基雄甾烯二酮或其它式XXXVI化合物。生物转化过程基本上根据上述对于烯睾丙内酯(或者其它式XIII底物)的11α-羟基化作用描述的方法进行。
在制备11α-羟基雄甾烯二酮中，最初通过式XXXVII化合物的生物转化来制备4-雄甾烯-3，17-二酮。最初的生物转化可以用美国专利3759791中描述的方法进行，该专利引作参考。然后，基本上根据上文对于烯睾丙内酯(或者其它式XIII底物)的11α-羟基化作用描述的方法将4-雄甾烯-3，17-二酮转化成11α-羟基雄甾烯二酮。
方法7合成的其它部分与方法6相同。在一个特别优选的实施方案中，如下进行方法7的全部过程：
在下面的实施例中进一步详细说明本发明方法，步骤和组分，以及这里所使用的条件和试剂。
实施例1
用表1列出的生长培养基制备斜面培养物(Slants)
为了制备第一代培养基，将赭色曲霉悬浮于试管中的蒸馏水中(2ml)；将这种悬浮液0.15ml等份加到如上述已经制备的斜面上。这些斜面在25℃温育7天，其后表面培养物的外观是白色棉毛状菌丝体。反向下部染成橙色，下部染成橘黄色。
第一代斜面培养物悬浮于含有吐温80非离子表面活性剂(3％重量)的灭菌溶液中(4ml)，该悬浮液的0.15ml等份用来接种第二代斜面，第二代斜面用表2列出的生长培养基制备
第二代斜面培养物在25℃保温10天，产生大量金黄色孢子；反向染成棕橙色。
制备具有表3列出组成的保护培养基。
来自5个第二代斜面培养的培养物悬浮于100ml烧瓶中的保护溶液(15ml)中该悬浮液分布在100×10mm试管中的等份中(每份0.5ml)，用于冻干。这些在-70℃至-80℃在丙酮/干冰浴中预冷冻20分钟，然后立即转移到预先冷却到-40℃至-50℃的干燥的室内。这些预冷冻等份在50μHg余压和≤-30℃时冻干。冻干后向每个带有湿度计的试管加入2-3粒灭菌硅胶，并火焰密封。
为了获得适于工业规模发酵的母代斜面培养物，将已经在上述方法中制备的单一等份的冻干培养物悬浮于蒸馏水(1ml)中，并用0.15ml等份接种提供有表2列出的组成的生长培养基的斜面。母代斜面在25℃保温7天，保温后，在斜面上生长的培养物在4℃下贮存。
为了制备常规培养物，将来自母代斜面的培养物悬浮于含有吐温80(3％重量)的灭菌溶液中，得到的悬浮液的0.15ml等份分布在包被有表2描述的生长培养基的斜面上。常规斜面培养物可以用来接种用于实验室或工业发酵的第一代菌种瓶。
为了制备第一代接种瓶，将根据上述制备的来自常规斜面的培养物移出并悬浮于含有吐温80(3％重量)的溶液(10ml)中。将0.1等份得到的悬浮液加入到含有表4列出组成的生长培养基的500ml带有隔板的烧瓶中。
菌种瓶在旋转振荡器(200rpm，5cm移动度)中在28℃保温24小时，结果得到具有直径3-4mm类小丸状的菌丝体。显微镜观察下，发现菌种培养物是纯的培养物，联丝生长(这个术语用于描述用显微镜观察到的真菌细胞的长的、扭绞的、索状的排列)，有大的菌丝，并且很好地扭曲。悬浮液的pH是5.4-5.6。根据通过离心(3000rpm×5分钟)测定，PMV是5-8％。
通过用来自菌种培养瓶的生物质(1ml)的第二代500ml振荡瓶中接种具有表4列出组成的生长培养基(100ml)来制备转化瓶培养物。得到的混合物在旋转振荡器(200rpm，5cm移动度)中在28℃保温18小时。检查培养物，发现含有直径3-4mm类小丸状的菌丝体。显微镜检查下，测定出培养物是纯的培养物，联丝丝状生长，其中顶端细胞满是细胞质，并且老化的细胞几乎没有液泡化。培养物悬浮液的pH是5-5.2。通过离心测定PMV是10-15％之间。因此认为该培养物适于烯睾丙内酯向11α-羟基烯睾丙内酯的转化。
将烯睾丙内酯(1g)微粒化成大约5μ并悬浮于灭菌水中(20ml)。向该反应液加入：40％(w/v)灭菌葡萄糖溶液；16％(w/v)自溶酵母灭菌溶液；和灭菌抗生素溶液；所有比例在表5中0反应时间一行里给出。将硫酸卡那霉素(40mg)，四环素盐酸盐(40mg)和头孢氨苄(200mg)溶解于水(100ml)来制备抗生素溶液。逐渐向振荡瓶中的培养物加入甾类化合物悬浮液，葡萄糖溶液，和自溶酵母溶液。
随着反应的进行，定期分析反应混合物以测定葡萄糖含量。用薄层色谱测定向11α-羟基烯睾丙内酯的转化作用。以控制保持葡萄糖含量在大约0.1％重量范围内的速度在反应期间向发酵反应混合物中加入另外的烯睾丙内酯底物和培养物。甾类悬浮液，葡萄糖溶液，自溶酵母溶液和抗生素溶液的添加方案在表5中列出。转化反应在旋转振荡器(200rpm，5cm移动度)上在25℃持续96小时。发酵期间pH范围在4.5和6之间。无论什么时候PMV升至或高于60％时，从中取出10ml肉汤培养物并代之以10ml蒸馏水。在发酵周期开始以后在反应期间在4，7，23，31，47，55，71，80，和96小时时间间隔处通过从肉汤中取样并且用TLC分析，来监测烯睾丙内酯的消失和11α-羟基烯睾丙内酯的出现。根据对这些样品测定，该反应进程在表6中列出。
*Rf.和RF.是“相对于溶剂前沿(relative to solvent front)”的缩写，用于薄层色谱中描述化合物相对于溶剂前沿的移动。
实施例2
根据实施例1描述的方法制备第一代菌种瓶培养物。制备具有表7列出的组成的培养混合物。
向10L几何体积的转化发酵罐中最初加入这样的营养化合物(4L)。发酵罐为圆筒型，高度与直径比是2.58。每个发酵罐带有一个400rpm汽轮式搅拌器，其带有两个2号圆轮，6个叶片。叶轮的外径是80mm，每个叶片的半径大小是25mm，高30mm，上轮位于容器顶部以下280mm处，下轮位于顶部以下365mm处，容器的挡板高210mm，并且从容器内垂直壁半径向内延伸25mm。
菌种培养物(40ml)与发酵罐中的营养物混合，并且通过在28℃，通气速度是0.51/分钟，压力是0.5kg/cm2下培养22小时，得到转化培养物。在22小时时，培养物的PMV是20-25％，并且pH是5-5.2。
制备含有烯睾丙内酯(80g)的灭菌水(400ml)悬浮液，向转化发酵罐中的混合物加入10ml。同时以表8中0小时反应时间处给出的比例加入40％(w/v)灭菌葡萄糖溶液；16％(w/v)自溶酵母灭菌溶液；和灭菌抗生素溶液。抗生素溶液用实施例1描述的方法制备。
随着反应的进行，定期对反应混合物进行分析来测定葡萄糖含量，并且通过薄层色谱测定向11α-烯睾丙内酯的转化作用。以根据下文所述的对反应肉汤样品的TLC分析为基础，因为烯睾丙内酯底物被消耗，所以向反应混合物加入另外的烯睾丙内酯。也监测葡萄糖水平，而且不管什么时候葡萄糖浓度降到大约0.05％重量或更低，要加入补充的葡萄糖溶液，将浓度提高到大约0.25％重量。在反应周期期间在不连续的时间也加入营养和抗生素。甾类悬浮液，葡萄糖溶液，自溶酵母溶液和抗生素溶液的添加方案在表8中列出。转化反应以每分钟每体积液体0.5体积，正压头是0.3kg/cm2的通空气速度持续90分钟。温度保持在28℃，直到PVM达到45％，然后降到26℃，并且保持在该温度，PMV从45％升至60％，之后控制在24℃。初始搅拌速度是400rpm，40小时后升至700rpm。根据指出的，通过加入2M正磷酸或2M氢氧化钠，将pH保持在4.7和5.3之间。随着泡沫的产生，通过加入几滴消泡剂SAG471来控制发泡。反应期间以4小时的间隔通过对肉汤样品的TLC分析来监测烯睾丙内酯的消失和11α-羟基烯睾丙内酯的出现。当大部分烯睾丙内酯从肉汤中消失时加入另外的增量数。
加入所有的烯睾丙内酯之后，当TLC分析显示烯睾丙内酯底物相对于11α-羟基烯睾丙内酯产物的浓度降低到大约5％时中止反应。
反应周期结束时，发酵肉汤通过干酪衣过滤，以从液体肉汤中分离菌丝体。将菌丝体级分重新悬浮于乙酸乙酯中，每克反应过程中加入的烯睾丙内酯用大约65体积(5.2升)。菌丝体的乙酸乙酯悬浮液在搅拌下回流1小时，冷却到大约20℃，在Buchner上过滤。依次用乙酸乙酯(每克烯睾丙内酯加量5体积；0.4L)和去离子水(500ml)洗涤菌丝体滤饼，从滤饼上去除乙酸乙酯提取液。弃除滤饼。将富集的提取液，洗涤液和水洗液收集在分离器中，然后静置2小时以相分离。
然后弃除含水相，并且将有机相真空浓缩，使残留体积达350ml。将静止的底部冷却到15℃，并在搅拌下保持大约1小时。过滤得到的悬浮液，取出结晶产物，并用乙酸乙酯(40ml)洗涤过滤滤饼。干燥后测定11α-羟基烯睾丙内酯产量是60g。
实施例3
用实施例1描述的方法由常规斜面制备孢子悬浮液。在2000ml有隔板的圆底烧瓶中(3个隔板，每个隔板50mm×30mm)，向具有表4组成的营养溶液(500ml)中加入1等份(0.5ml)孢子悬浮液。得到的混合物在烧瓶中在交替振荡器上(每分钟振荡120次；5cm移动度)在25℃温育24小时，得到培养物，在显微镜下观察，发现是纯的培养物，菌丝很好地扭曲。培养物的pH在大约5.3和5.5之间，PMV(根据通过在3000rpm离心5分钟测定)是8-10％。
使用这样制备的培养物，在垂直圆筒状不锈钢发酵罐中制备菌种培养物，发酵罐几何体积是160L，纵横尺寸比是2.31(高＝985mm；直径＝425mm)。每个发酵罐带有一个汽轮式搅拌器，其带有两个圆轮，每个圆轮有6个叶片，叶轮的外径是240mm，每个叶片的半径大小是80mm，高50mm，上轮位于发酵罐顶部以下780mm处，第二个轮位于995mm深度处，垂直的挡板高890mm，并且从发酵罐内垂直壁半径向内延伸40mm。搅拌在170rpm下操作。向发酵罐加入表9列出组成的营养混合物(100L)，接着加入一部分如上制备的pH为5.7的原种菌(1L)。
接种的混合物在通气速度是0.5L/L-min，压头是0.5kg/cm2下培养22小时。温度控制在28℃，直到PMV达到25％，然后降到25℃。pH控制在5.1-5.3之间。菌丝体体积的生长见表10，还有pH和菌种培养反应的溶解的氧气的曲线。
使用这样制备的菌种培养物，在圆筒状不锈钢发酵罐中进行转化发酵，发酵罐直径是1.02m，高1.5m，几何体积是1.4m3。每个发酵罐带有一个汽轮式搅拌器，其带有两个叶轮，一个轮位于发酵罐顶部以下867cm处，另一个轮位于顶部以下1435cm处，每个圆轮有6个叶片，叶片半径95cm，高75cm，垂直的挡板高1440cm，并且从发酵罐内垂直壁半径向内延伸100cm。制备具有表11列出组成的营养混合物
向发酵罐中加入初始量(170L)的该营养混合物(pH＝5.7)，接着加入如上制备的该实施例的菌种接种物(7L)。
含有接种物的营养混合物在通气速度是0.5L/L-min，压头0.5kg/cm2下培养24小时，温度保持在28℃，搅拌速度是110rpm。表12中给出了菌丝体体积的生长，还有pH和菌种培养反应的溶解的氧气的曲线。
培养结束后，发现菌丝体呈小丸状，但是这些小丸一般较小并且相对疏松地聚集。分散的菌丝体悬浮于肉汤中。最终pH是5.1-5.3。
向这样制备的转化培养物中加入烯睾丙内酯(1.250kg；颗粒化为5μ)的灭菌水(5L)的悬浮液。以表14中0反应时间指出的比例加入灭菌的添加物溶液和抗生素溶液。附加溶液的组成在表13中列出。
在通气速度是0.5L/L-min，压头0.5kg/cm2下将生物转化进行大约96小时，如果需要，通过加入7.5M氢氧化钠或4M磷酸调节pH范围是4.7-5.3。搅拌速度最初是100rpm，在40小时时提高到165rpm，在64小时时是250rpm。初始温度是28℃，当PMV达到45％时降到26℃，PMV升至60％时降到24℃。根据需要加入细滴中的SAG471来控制发泡。以4小时间隔监测发酵中葡萄糖水平，不管什么时候葡萄糖浓度降至1gpl以下时向体系中加入增量的灭菌添加物溶液(10L)。反应期间用HPLC监测烯睾丙内酯的消失和11α-羟基烯睾丙内酯的出现。当至少最初烯睾丙内酯加入量的90％转化成11α-羟基烯睾丙内酯时，加入1.250kg增量的烯睾丙内酯。当增量中90％烯睾丙内酯已经转化时，加入另一份1.250kg增量。使用相同的标准加入进一步的增量(一份1.250kg)，直到加入反应器的总量(20kg)。向反应器加入全部的烯睾丙内酯量后，当未反应的烯睾丙内酯相对于产生的11α-羟基烯睾丙内酯的量的浓度是5％时中止反应。表14中给出了加入烯睾丙内酯，灭菌附加溶液，和抗生素溶液的方案。
当生物转化完全时，通过在篮状离心机中离心从肉汤中分离菌丝体。对滤液进行HPLC测定，只含有肉汤中11α-羟基烯睾丙内酯总量的2％，因此省去滤液。将菌丝体悬浮于2m3容积提取罐中的乙酸乙酯中(1000L)。搅拌和乙酸乙酯回流条件下将悬浮液加热1小时后冷却，并在篮状离心机中离心。菌丝体滤饼用乙酸乙酯(200L)洗涤后出料。使富集甾类的溶剂提取液静置1小时以分离水相。水相用又一些量的乙酸乙酯(200L)萃取后弃除。离心澄清合并的溶剂相并置于浓缩器中(500L几何体积)，并真空浓缩，得到100L残余体积。在进行蒸发时，加入到浓缩器中的合并的提取液和洗液溶液的初始量是100L，随着溶剂的去除，通过连续或周期性加入合并的溶液来保持该体积不变。蒸发步骤完全后，蒸发器的底部冷却到20℃，并且搅拌2小时，之后在Buchner过滤器上过滤。浓缩器釜用乙酸乙酯(20L)洗涤，然后用该洗涤溶液来洗涤过滤器上的滤饼。产物在50℃真空下干燥16小时，11α-羟基烯睾丙内酯产量14千克。
实施例4
赭色曲霉NRRL405的冻干的孢子悬浮于具有表15给出组成的玉米浆生长培养基(2ml)中：
在用于琼脂平板上孢子繁殖的接种物中使用得到的悬浮液。制备10个琼脂平板，每个平板含有表16给出组成的固体葡萄糖/酵母抽提物/磷酸盐/琼脂生长培养基：
0.2ml等份悬浮液转移到每个平板的表面。平板在25℃温育10天，然后将孢子从所有的平板收集到具有表17给出组成的灭菌冷保护培养基中：
得到的悬浮液分装在20个小瓶中，每个小瓶转移1ml。这些小瓶构成主细胞库，其可以用来产生在用于烯睾丙内酯向11α-羟基烯睾丙内酯生物转化的接种物的传代中使用的工作细胞库。在-130℃在液氮冷冻器的气相中贮存含有主细胞库的小瓶。
为了开始制备工作细胞库，将来自单个主细胞库小瓶的孢子再悬浮于具有表15列出组成的灭菌生长培养基(1ml)中。悬浮液分作10个0.2ml等份，每一等份用来接种具有表16列出组成的固体生长培养基的琼脂平板。这些平板在25℃温育10天。在温育的第3天，生长培养基的下部变为棕-橙色。温育后，大量产生金黄色孢子。通过上述用来制备主细胞库的方法收集各平板的孢子。总共制备了100个小瓶，每个小瓶含有1ml悬浮液。这些小瓶构成工作细胞库。小瓶也在-130℃在液氮冷冻器的气相中贮存。
向250ml Erlenmeyer烧瓶中加入具有表15列出组成的生长培养基(50ml)。向烧瓶中加入一等份(0.5ml)工作细胞悬浮液，并与生长培养基混合。接种的混合物在25℃保温24小时，产生合并的菌丝体体积百分数大约是45％的第一代菌种培养物。目测培养物，发现含有直径1-2mm的类小丸状菌丝体；显微镜观察发现其是纯的培养物。
通过向2.8L Fernbach烧瓶中加入具有表15列出组成的生长培养基，然后用一部分(10ml)该实施例第一代菌种培养物接种该培养基，开始第二代菌种培养物的培养，第一代菌种培养物的繁殖如上所述。接种的混合物在旋转振荡器上(200rpm，5cm移动度)在25℃保温24小时。保温后，该培养物具有如上对于第一代菌种培养物描述的相同的性质，并且适用于其中烯睾丙内酯生物转化成11α-烯睾丙内酯的转化发酵。
在Braun E Biostat发酵罐中进行转化，发酵罐指标如下：
容积： 15L，圆底
高度： 53cm
直径： 20cm
H/D： 2.65
叶轮： 直径7.46cm，6个叶片每个2.2×1.4cm
叶轮间距： 自罐底部65.5，14.5和25.5cm
挡板： 4个，1.9×48cm
分布器： 直径10.1cm，21个孔-1mm直径
温度控制： 通过外部容器套方法提供
将烯睾丙内酯以20g/L的浓度悬浮于去离子水(4L)中，并且在发酵罐中的混合物在300rpm下搅拌时加入一部分(2L)具有表18列出组成的生长培养基。
得到的悬浮液搅拌15分钟，之后用附加的去离子水将体积增加到7.5L。在这时，悬浮液的pH通过加入20％重量氢氧化钠溶液而调至5.2-6.5，然后将悬浮液在Braun E发酵罐中通过在121℃加热30分钟来灭菌。灭菌后的pH是6.3±0.2，终体积是7.0L。用一部分(0.5L)上述制备的该实施例的第二代菌种培养物接种灭菌的悬浮液，通过加入50％灭菌葡萄糖溶液将体积增加到8.0L。使发酵在28℃的温度下进行，直到PMV达到50％，然后降温到26℃，当PMV超过50％时，为了保持恒定的PMV低于大约60％，进一步降温到24℃。空气通过分布器按以初始液体体积为基础0.5vvm的速度通入，发酵罐中的压力保持在700毫巴规量。搅拌开始是600rpm，根据要保持溶解的氧气的浓度高于30％体积的需要，逐步增加到1000rpm。监测葡萄糖浓度。因为发酵反应消耗葡萄糖，在初始的高葡萄糖浓度降至低于1％时，用50％重量灭菌葡萄糖溶液提供补充的葡萄糖，来保持一批生产周期剩余时间内具有0.05％-1％范围内的浓度。接种前pH是6.3±0.2。在最初发酵周期期间pH降至大约5.3后，通过加入氢氧化铵来保持周期的剩余时间内的pH在5.5±0.2范围内。通过加入聚乙二醇消泡剂控制发泡，该消泡剂由OSISpecialties，Inc以商品名SAG 471出售。
培养物的生长主要发生在周期的头24小时，此时PMV是大约40％，pH是大约5.6，并且溶解的氧气的量是大约50％体积。随着培养物的生长开始烯睾丙内酯的转化。在生物转化期间通过每天进行分析监测烯睾丙内酯和11α-羟基烯睾丙内酯的浓度。用热的乙酸乙酯萃取样品，并且用TLC和HPLC分析得到的样品溶液。当残留的烯睾丙内酯浓度大约是初始浓度的10％时，认为生物转化完全。大约的转化时间是110-130小时。
当生物转化完全时，通过离心从肉汤中分离菌丝体生物质。用等体积乙酸乙酯萃取上清液，弃除水相。将菌丝体级分重新悬浮于乙酸乙酯，每克加入到发酵反应器中的烯睾丙内酯大约使用65体积。搅拌下菌丝体悬浮液回流1小时，冷却到大约20℃，在Buchner漏斗中过滤。菌丝体滤饼用5体积的乙酸乙酯洗涤两次然后用去离子水(1L)洗涤，取代残留的乙酸乙酯。合并含水的萃取液，富集的溶剂，溶剂洗液和水洗液。根据对残留的甾类化合物的分析决定残留的没用的菌丝体滤饼是弃除或者再萃取。使合并的液相放置2小时。然后，分离水相并弃除，真空下浓缩有机相，直到残留体积是大约500ml。然后将静止的瓶冷却到大约15℃，缓慢搅拌大约1小时。通过蒸发从结晶中弃除溶剂，结晶产物在50℃真空下干燥。
实施例5
赭色曲霉ATCC18500的冻干的孢子悬浮于实施例4描述的玉米浆生长培养基(2ml)中。制备10个琼脂平板，也是实施例4的方法。根据实施例4的描述培养并收集平板，含有主细胞库的小瓶在-130℃在液氮冷冻器的气相中贮存。
由一个主细胞库的小瓶制备工作细胞库，根据实施例4的描述制备工作细胞库。在-130℃在液氮冷冻器中贮存。
向一个有挡板的2L烧瓶中加入具有表19列出组成的生长培养基(300ml)。向烧瓶中加入一等份(3ml)工作细胞悬浮液。接种的混合物在28℃在旋转振荡器上(200rpm，5cm移动度)保温20-24小时，产生合并的菌丝体体积百分数大约是45％的第一代菌种培养物。目测培养物，发现含有直径1-2mm的类小丸状菌丝体；显微镜观察发现其是纯的培养物。
通过向14L玻璃发酵罐中加入具有表19列出组成的8L生长培养基开始第二代菌种培养物的培养，用160-200ml该实施例的第一代菌种培养物接种发酵罐，第一代菌种培养物的制备如上所述。
接种的混合物在28℃培养18-20小时，200rpm搅拌，通气速度是0.5vvm。繁殖后，该培养物具有如上对于第一代菌种培养物描述的相同的性质。
基本上根据实施例4说明的方法在一个60L发酵罐中进行转化，除了生长培养基具有表20列出组成，并且第二代菌种培养物的初始量是350ml至700ml。搅拌速度开始是200rpm，根据要保持溶解的氧气高于10％体积的需要增加到500rpm。对于20g/L烯睾丙内酯，大约的生物转化时间是80-160小时。
实施例6
使用根据实施例4描述的方法产生的工作细胞库的孢子悬浮液，还是基本上用实施例4描述的方法制备第一代和第二代菌种培养物。使用该方法产生的第二代菌种培养物，根据图1详述的改进的方法类型进行两个生物转化，并且根据图2详述的改进的方法类型进行两个生物转化。表21给出了进行这些转化的转化生长培养基，烯睾丙内酯加入方案，收集时间，和转化程度。进行R2A使用了以实施例3的相同原理为基础的烯睾丙内酯加入方案，同时，进行R2C通过只加入两次烯睾丙内酯，一次在一个批量开始时，一次在24小时之后，来改变实施例3的方案。进行R2B和R2D时，在一次生产批量开始时加入全部的烯睾丙内酯的量，该过程一般以实施例4描述的方法进行，除了在加入到发酵罐之前，烯睾丙内酯进料在分开的容器中灭菌，并且随着一次生产批量的进行加入葡萄糖。使用韦林氏掺合器来减少灭菌中产生的块。进行R2A和R2B时，向批量的甲醇溶液中加入烯睾丙内酯，其中预期这些操作分别进一步不同于实施例3和实施例4的操作。
在进行R2A和R2B时，发酵液中甲醇浓度积累到大约6.0％，发现其抑制培养物的生长和生物转化。但是，以这些操作的结果为基础，认为甲醇或其它水互溶性溶剂可以在低浓度下有效作用，来提高烯睾丙内酯量，并且以细颗粒沉淀物提供烯睾丙内酯，提供大的界面面积，向反应提供烯睾丙内酯。
证明烯睾丙内酯在灭菌条件下(121℃)稳定，但是凝集成块。使用韦林氏掺合器将这些块破碎成细小颗粒，其成功地转化成产物。
实施例7
使用根据实施例4描述的方法产生的工作细胞库的孢子悬浮液，还是基本上用实施例4描述的方法制备第一代和第二代菌种培养物。实施例7的说明和结果在表22中给出。使用该方法产生的第二代菌种培养物，基本上根据实施例3的描述进行一次生物转化(R3C)，并根据实施例5概述的方法进行3次生物转化。在后三次中(R3A，R3B和R3D)，烯睾丙内酯与除了葡萄糖以外的生长培养基一起在轻便型容器中灭菌。葡萄糖由另一个容器无菌加入。在接种之前或在生物转化早期阶段向发酵罐加入灭菌的烯睾丙内酯悬浮液。在R3B操作中，在46.5处加入补充的灭菌烯睾丙内酯和生长培养基。灭菌时形成的烯睾丙内酯块通过韦林氏掺合器破碎，这样生产出进入到发酵罐的细小颗粒悬浮液。表22和23列出了转化生长培养基，烯睾丙内酯加入方案，营养物加入方案，收集时间，和这些操作的转化程度。
因为是丝状生长，所以在该实施例所有4种操作中可见高粘度发酵肉汤。为了克服高粘度产生的有关通气，混合，pH控制和温度控制的障碍，在这些操作中提高了通气速度和搅拌速度。转化在更严格的条件下令人满意地进行，但是在液态肉汤表面上形成致密的块状物。一些未反应的肉汤通过这种块状物带出肉汤。
实施例8
实施例8的说明和结果总结于表24。进行4种发酵操作，其中通过烯睾丙内酯的生物转化产生11α-羟基烯睾丙内酯。在两次发酵中(R4A和R4D)，基本上以实施例6的R3A和R3D操作相同的方法进行生物转化。在R4C操作中，烯睾丙内酯一般以实施例3描述的方法转化成11α-羟基烯睾丙内酯。在R4B操作中，一般以实施例4描述的方法进行转化，即在接种前在发酵罐中将烯睾丙内酯和生长培养基灭菌，在一批生产量开始时加入所有的氮和磷营养物，并且向发酵罐加入只含有葡萄糖的补充溶液来保持随着生产进行期间的葡萄糖的水平。在后一过程中(R4B操作)，每6小时监测葡萄糖浓度，根据控制葡萄糖水平在0.5-1％范围内的指示加入葡萄糖溶液。表25给出了进行这些操作的烯睾丙内酯加入的方案。
在大多数发酵周期中所有的发酵物在高搅拌和通气下进行工作，因为发酵液在接种后一天内或左右变得高度粘稠。
实施例9
表26列出了该实施例这些操作的转化生长培养基，烯睾丙内酯加入方案，收集时间，和转化程度。
除了下面说明外，基本上根据对于实施例8R4B操作说明的方法进行4次生物转化。在R5B操作中，用向下抽吸船用叶轮[叶轮(impeller)是一种机械装置，由与发酵罐的搅拌轴同心相连的毂(hub)相连的叶片构成。叶轮能使发酵罐中的流体移动并混合而且还能分散空气。船用叶轮(marine impeller)具有船螺浆形状的叶片，能使液体以特定的方向、主要是向上或向下流动]代替在其它操作中用于搅拌的顶部涡轮圆轮。向下抽吸轴向作用将肉汤倒向发酵物中心，并减少了块的形成。在R5D操作中接种后立即加入甲醇(200ml)。因为烯睾丙内酯是在发酵罐中灭菌的，除了葡萄糖外的所有营养物在一批生产量开始时加入，避免了一连串加入氮源，磷源或抗生素。
为了保持液体表面生长的固相的浸入，在一批生产量开始96小时后向每个发酵罐加入生长培养基(2L)。通过加入生长培养基或者使用向下抽吸叶轮(R5B操作)者不能完全克服混合问题，但是操作结果证明该方法的可行性和优点，并且指明根据常规操作可以提供令人满意的混合。
实施例10
基本上以实施例9中说明的方法进行三次生物转化。表27列出了转化生长培养基，烯睾丙内酯加入方案，收集时间，和该实施例这些的转化程度：
在R6A操作71小时后加入生长培养基(1.3L)和灭菌水(0.8L)，以浸没液体肉汤表面生长的菌丝体块。为了相同的目的，在R6B操作95小时后加入生长培养基(0.5L)和灭菌水(0.5L)。物料平衡数据表明，液体表面形成块最少情况下，测得更好的质量平衡。
实施例11
进行几轮发酵操作来比较烯睾丙内酯的预灭菌作用和转化发酵罐中烯睾丙内酯和生长基的灭菌作用。在R7A中，根据图2的说明，在类似于R2C，R2D，R3A，R3B，R3D，R4A和R4D的条件下进行该方法。R7B操作根据图3的详细说明在类似于实施例4，9和10，及R4B操作的条件下进行。表28列出了该实施例各操作的转化生长培养基，烯睾丙内酯加入方案，收集时间，和转化程度：
以从R7B操作取出的最终样品为基础的质量平衡是89.5％，表明生物转化中没有明显的底物损失或降解。认为混合对于两种操作是适当的。
最初80小时期间残留的葡萄糖的浓度高于期望的5-10gpl控制范围。处理效率明显不受两个发酵罐上方空间中蓄积的轻饼的影响。
实施例12
在表29中总结的一系列1L提取操作中测定提取效率。在这些操作的每一种操作中，用乙酸乙酯(1L/L发酵体积)从菌丝体中提取甾类化合物。在每一种操作中进行两次连续提取。以RP-HPLC为基础，第一次提取中回收了总的甾类化合物的大约80％；第二次提取回收率提高到95％。第三次提取又回收了3％甾类化合物。损失上清液含水相中残留的2％。使用真空使提取液至干，而不使用任何其他溶剂洗涤。如果通过工艺经济学证明是正确的，则用溶剂处理会提高自初始提取物的回收率。
作为在1L肉汤规模时11α-羟基烯睾丙内酯的提取/结晶溶剂，评定甲基异丁基酮(MIBK)和甲苯。使用如上所述的提取方案，MIBK和甲苯在提取效率和结晶效率方面与乙酸乙酯类似。
实施例13
作为图2和3方法的评价的一部分，对这些方法的每一个中的发酵循环开始时提供的烯睾丙内酯底物进行了颗粒大小研究。如上所述，在加入发酵罐中之前，将向图1方法加入的烯睾丙内酯微粒化。在该方法中，烯睾丙内酯没有被灭菌，而通过加入抗生素来控制不期望的微生物的生长。在图2和3的方法中，在反应前将烯睾丙内酯灭菌。在图2方法中，在将烯睾丙内酯加入到发酵罐之前，在一个掺合器中灭菌。在图3方法中在一批生产量开始时，将烯睾丙内酯在生长基中的悬浮液灭菌。如上所讨论的，灭菌作用有引起烯睾丙内酯颗粒团聚的趋势。因为烯睾丙内酯在含水培养基有限的溶解度，该方法的产率取决于从固相转移的质量，因此预期取决于固体颗粒底物存在的界面面积，接着取决于颗粒大小分布。这些考虑最初作为图2和3的方法的阻碍。
但是发现图2的掺合器和图3的发酵罐中的搅拌作用以及图2中一批生产量的转移所使用的剪切泵的作用，共同将结块降解成颗粒大小范围合理，类似于向图1方法中加入的未灭菌和微粒化的烯睾丙内酯的大小。这可通过三种方法的每一种中反应周期开始时得到的烯睾丙内酯的颗粒大小的分布来进行详细说明。参见表30和图4和5。
由表30数据注意到，搅拌器和剪切泵有效地将灭菌烯睾丙内酯平均颗粒大小减小到和未灭菌底物相同级别，但是未灭菌底物保持明显的大小差异。尽管存在该差别，但是反应效率数据表明预先灭菌方法至少与图1方法一样有效果。通过进一步减小和控制颗粒大小的一些步骤，例如灭菌的烯睾丙内酯的湿磨，和/或通过巴斯德氏消毒而不是灭菌，可以显示出来图2方法的进一步的优点。
实施例14
根据实施例5描述的方法制备菌种培养物。20小时时，种菌发酵罐中的菌丝体是浆状，PMV是40％。其pH是5.4，并且14.8gpl葡萄糖保留没有使用。
制备具有表20所示组成的转化生长基(35L)。在制备进料培养基中，葡萄糖和酵母抽提物分开灭菌，并混合成单一进料，初始浓度为30％重量葡萄糖和10％重量酵母抽提物。进料的pH调至5.7。
使用该培养基，(表20)，进行两轮烯睾丙内酯向11α-羟基烯睾丙内酯的生物转化。每一轮在安装有带有一个Rushton涡轮叶轮和两个Lightnin’A315叶片的搅拌器的60L发酵罐中进行。
最初加入到发酵罐中的生长基是35L。加入微粒化和未灭菌的烯睾丙内酯，使初始浓度是0.5％。以初始接种比例是2.5％的比例，用在实施例5描述的方法中制备的菌种培养物接种发酵罐中的培养基。发酵在28℃的温度下进行，搅拌速度是200-500rpm，通气速度是0.5vvm，背压足以保持溶解的氧气的水平至少是20％体积。在生产操作中，转化作用培养物生长成非常小的椭圆形小丸(大约1-2mm)。基本上以实施例1描述的方法向发酵罐中连续加入烯睾丙内酯和补充营养。每4小时加入营养物，比例是每升发酵罐中肉汤有3.4g葡萄糖和0.6g酵母抽提物。
表31列出的是该实施例各轮中的通气速度，搅拌速度，溶解的氧气，PMV，和所述时间间隔时实现的pH，以及每批生产量期间的葡萄糖的加入。表32给出烯睾丙内酯转化曲线。46小时后终止R11A操作；R11B操作持续96小时。在后一操作中，81小时时达到93％转化率；84小时时又加入进料；然后终止进料。注意进料终止时间和该操作终止时间之间发生的粘度的明显变化。
实施例15
根据上面概述的方法，对各种培养物测定烯睾丙内酯向11α-羟基烯睾丙内酯生物转化中的效率。
根据实施例5的方法制备各黑色曲霉ATCC11394，无根根霉ATCC11145和葡枝根霉ATCC6227b的工作细胞库。用来自工作细胞库的孢子悬浮液(1ml)接种表18所示组成的生长基(50ml)并且放置在恒温箱中。通过在26℃发酵大约20小时在恒温箱中制备菌种培养物。对恒温箱的振荡速度是200rpm。
用各微生物菌种培养物等份(2ml)接种含有表18生长基(30ml)的转化瓶。每个培养物用来接种两个瓶，共六个瓶。在36℃将烯睾丙内酯(200mg)溶解于甲醇(4ml)，向各瓶中加入0.5ml等份该溶液。一般情况下，在实施例5描述的条件下，每天加入50％重量葡萄糖溶液(1ml)进行生物转化。头72小时后，在各转化发酵瓶中生长的菌丝体上发现：
ATCC11394-很好均匀生长
ATCC11145-头48小时中很好生长，但是菌丝体聚成球；最后24小时中没用明显生长；
ATCC6227b-很好生长，菌丝体质聚成球。
取肉汤样品分析生物转化程度。三天后，使用ATCC11394的发酵向11α-羟基烯睾丙内酯的转化达80-90％；ATCC11145提供50％的转化；以及ATCC6227b提供80-90％的转化。
实施例16
基本上使用实施例15说明的方法，对附加的微生物测定烯睾丙内酯向11α-烯睾丙内酯生物转化中的效能。试验的微生物和试验结果在表33中列出：
实施例17
对各种微生物测定烯睾丙内酯向9α-烯睾丙内酯生物转化中的效能。进行该实施例的发酵培养基根据表34所示制备：
表34
大豆粉：
葡萄糖 20g
大豆粉 5g
NaCl 5g
酵母抽提物 5g
KH2PO4 5g
水 to 1L
pH 7.0
胨/酵母抽提物/葡萄糖：
葡萄糖 40g
细菌培养用胨 10g
酵母抽提物 5g
水 to 1L
Mueller-Hinton：
牛肉浸液 300g
酪蛋白水解物 17.5g
淀粉 1.5g
水 to 1L
真菌在大豆粉培养基和胨-酵母抽提物葡萄糖中生长；atinomycetes和真杆菌在大豆粉(加0.9％重量甲酸钠用于生物转化)和Mueller-Hinton肉汤中生长。
用冻干的孢子原种(在250mlErlenmayer瓶中的20ml大豆粉)接种起始培养物。瓶上盖上乳滤器和生物屏蔽。用起始培养物(24或48小时生长)接种代谢培养物(也是在在250mlErlenmayer瓶中的20ml)-10％-15％杂交体积(指相对于接种的培养基体积的接种物体积)-后者在加入用于转化反应的甾类化合物之前温育24-48小时。
烯睾丙内酯溶解于/悬浮于甲醇(20mg/ml)，过滤灭菌，加入到培养物中使终浓度为0.1mg/ml。所有的转化发酵瓶在温度控制在26℃和60％湿度的室内在250rpm(2”摆度)振荡。
加入底物后5和48小时，或24小时，收集生物转化产物。向发酵瓶中加入乙酸乙酯(23ml)或二氯甲烷开始进行收集。然后发酵瓶振荡2分钟，将每个瓶中的物质倒入50ml锥形瓶。为了分离各相，在室温下以4000rpm将试管离心20分钟。将有机层从各试管中转移到20ml硼硅酸盐玻璃管形瓶中，在真空速(speed vac)(这是一个用于从少量样品中除去溶剂的装置用术语。该装置通常对样品施加真空，同时进行离心以加快溶剂蒸发)下蒸发。将管形瓶盖盖并且在-20℃储存。
为了获得用于结构测定的物质，通过将发酵振荡瓶的数目增加到25个使生物转化规模达到500ml。收集时(加入底物后24小时或48小时)，分别向每个瓶中加入乙酸乙酯，将瓶子盖盖，放回到振荡器振荡20分钟。然后将瓶子中的物质倒入聚丙烯瓶，并离心分离固相，或者倒入分液漏斗中通过重力使各相分离。干燥有机相，得到包含在反应混合物中的甾类化合物的粗提取物。
首先在以荧光为背景的硅胶(250μm)板上(254nm)用薄层色谱分析反应产物。。向含有从反应混合物中提取出来的干燥的乙酸乙酯提取物的各管形瓶中加入乙酸乙酯(500μl)。用高效液相色谱和质谱作进一步的分析。平板在95∶5v/v氯仿/甲醇介质中展开。
用高效液相色谱和质谱作进一步的分析。使用Millennium软件，光电二极管阵列检测器和自动取样器的Waters HPLC。反相HPLC使用Waters NovaPakC-18(4μm颗粒度)RadialPak 4mm柱体。用水∶乙腈(75∶25)开始，水∶乙腈(25∶75)结束，开始25分钟的线性溶剂梯度洗脱。接着是3分钟梯度达到100％乙腈的洗脱，并且在初始条件下再生柱子之前进行4分钟等度洗脱。
对于LC/MS，以2nM浓度向乙腈和水相加入乙酸铵。色谱不被明显影响。将来自柱子的洗脱液分为22∶1，大部分材料送入PDA检测器。剩余的4.5％材料送入Sciex API III质谱仪的电子喷射离子化室。以阳极方式(positive mode)(它是一种以化学离子化阳离子模式更完全地描绘的质谱)进行质谱。来自HPLC上PDA检测器的同系数据线将单波长色谱转移给质谱用于UV和MS的共同分析。
质谱裂解方式图用来将羟基化的底物分类。预期的两种羟基化烯睾丙内酯，11α-羟基和9α-羟基，以一致方式在不同的频率失水，其可以用作一种诊断剂。而且9α-羟基烯睾丙内酯比11α-羟基烯睾丙内酯更容易生成铵加成物。表35给出的是烯睾丙内酯发酵的TLC，HPLC/UV和LC/MS数据的总结，表明哪一种试验的微生物在烯睾丙内酯向9α-羟基烯睾丙内酯的生物转化中是有效的。其中优选的微生物是山扁豆生棒孢(Corynespora cassiicola)ATCC16718。
实施例18
根据上文概述的方法对各种培养物测试雄甾烯二酮向11α-羟基雄甾烯二酮生物转化的效率。
基本上根据实施例4描述的方法制备各赭色曲霉NRRL405(ATCC18500)；黑色曲霉ATCC11394和构巢曲霉ATCC11267；米根霉ATCC11145；葡枝根霉ATCC6227b；玫瑰单端孢ATCC12519和ATCC8685的工作细胞库。用来自工作细胞库的孢子悬浮液接种表18所示组成的生长基(50ml)，并且放置在恒温箱中。通过在26℃发酵大约20小时在恒温箱中制备菌种培养物。恒温箱的振荡速度是200rpm。
用各微生物菌种培养物等份(2ml)接种含有表15生长基(30ml)的转化瓶。每个培养物用来接种两个瓶，共十六个瓶。在36℃将雄甾烯二酮(300mg)溶解于甲醇(6ml)，向各瓶中加入0.5ml等份该溶液。一般情况下，在实施例6描述的条件下，生物转化进行48小时。48小时后将肉汤样品收集并根据实施例17用乙酸乙酯提取。蒸发浓缩乙酸乙酯，用薄层色谱分析样品，确定是否存在具有类似于11α-羟基雄甾烯二酮标准(Sigma Chemical Co.，St.Louis)色谱迁移率的产物。结果见表36，正结果标记为“+”。
表36的数据证明所列的每一种培养物都能从雄甾烯二酮产生具有与11α-羟基雄甾烯二酮标准相同的Rf值的化合物。
用上述相同的方法对赭色曲霉NRRL405(ATCC18500)再次测定，通过常规相硅胶柱色谱用甲醇作为溶剂将培养物产物分离并纯化。用薄层色谱分析级分。TLC板是Whatman K6F硅胶60埃，10×20大小，250μ厚的板。溶剂体系是甲醇∶氯仿，5∶95，v/v。用LC-MS和NMR光谱分析结晶产物和11α-羟基雄甾烯二酮标准物。两种化合物得到相似的曲线和分子量。
实施例19
对各种微生物测试mexrenone向11β-羟基mexrenone生物转化的效率。根据表34制备用于该实施例的发酵培养基。
发酵条件与分析方法与实施例17相同。TLC板和溶剂体系与实施例18描述的相同。色谱分析原理如下：11α-羟基mexrenone和11α-羟基烯睾丙内酯具有相同的色谱迁移率。11α-羟基烯睾丙内酯和9α-羟基烯睾丙内酯具有与11α-羟基雄甾烯二酮和11β-羟基雄甾烯二酮相同的迁移方式。因此，11β-羟基mexrenone应该具有与9α-羟基烯睾丙内酯相同的迁移率。因此从生长基中提取的化合物应该以9α-羟基烯睾丙内酯为标准进行操作。结果见表36。
1M＝Mueller-Hinton
P＝PYG(胨/酵母抽提物/葡萄糖)
S＝大豆粉
SF＝大豆粉加甲酸盐
2？＝与没用底物对照的有疑问的区别。
这些数据表明该表中大部分微生物产生与从mexrenone得到的11β-羟基mexrenone相似或相同的产物。
实施例20
方法1：步骤1：制备5’R(5’α)，7’β-20’-氨基十六氢-11’β-羟基-10’a，13’α-二甲基-3’，5-二氧螺[呋喃-2(3H)，17’α(5’H)-[7，4]亚甲基(metheno)[4H]环戊[a]菲]-5’-腈。
搅拌下向50加仑搪玻璃反应器中加入61.2L(57.8kg)DMF，接着加入23.5Kg11-羟基烯睾丙内酯1。向反应物中加入7.1kg氯化锂。将反应混合物搅拌20分钟，加入16.9kg丙酮氰醇，接着加入5.1kg三乙胺。将混合物加热到85℃并在此温度下保持13-18小时。反应后加入353L水，接着加入5.6kg碳酸氢钠。混合物冷却到0℃，转移到200加仑搪玻璃反应器中用130kg 6.7％次氯酸钠溶液缓慢地中止。过滤产物并用3×40L水洗涤，得到21.4kg产物烯胺。
实施例21
方法1：步骤2：制备4’S(4’α)，7’α-十六氢-11’α-羟基-10’β，13’β-二甲基-3’，5，20’-三氧螺[呋喃-2(3H)，17’β-[4，7]亚甲基[17H]环戊[a]菲]-5’β(2’H)-腈。
向200加仑搪玻璃反应器中加入50kg烯胺2，大约445L 0.8N稀盐酸和75L甲醇。混合物加热到80℃反应5小时，冷却到0℃反应2小时。过滤固体产物得到36.5kg干燥产物二酮。
实施例22
方法1：步骤3A：制备11α，17α-二羟基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氢甲酯，γ-内酯。
在4口5L圆底烧瓶上安装机械搅拌子，带有氮气导管的等压添加漏斗，温度计和带有扩散器的冷凝管。扩散器通过聚乙烯管与两个2L阱连接，第一个阱是空的，其是为了防止第二个阱中的物质(1L浓次氯酸钠溶液)倒吸到反应器中。向装有3L甲醇的烧瓶中加入二酮3(79.50g；[重量没用对纯度校正，其是85％])。将25％甲醇钠的甲醇溶液(64.83g)装载到漏斗里并滴加，在氮气下搅拌，历时10分钟。加完后，将亮橙黄色反应混合物加热到回流，反应20小时。然后通过添加漏斗向仍然回流的反应混合物中滴加167ml，4N HCl(注意，HCN在此刻蒸发)。反应混合物颜色变浅为浅金黄色。然后用接取柱头代替冷凝器，并且在通过漏斗向烧瓶同时加入1.5L水的同时通过蒸馏去除1.5L甲醇，加入水的速度与蒸馏速度一致。反应混合物冷却到室温并且用2.25L等份的二氯甲烷萃取两次。合并的萃取物依次用750ml等份的冷的饱和的氯化钠溶液，1N氢氧化钠和饱和的氯化钠洗涤。有机层用硫酸钠干燥过夜，过滤，真空下使体积减少到约250ml。加入甲苯(300ml)，减压去除残留的二氯甲烷，期间，产物开始在烧瓶壁上以白色固体形成。将烧瓶中的物质冷却过夜，并过滤去除固体。用250ml甲苯洗涤一次，用250ml等份乙醚洗涤两次，在真空漏斗上干燥，得到58.49g白色固体，HPLC测定纯度是97.3％。浓缩母液时，得到了另外的6.76g 77.1％纯度的产物。校正纯度后总产率是78％。
实施例23
方法1：步骤3B：由11α，17α-二羟基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氢甲酯，γ-内酯转化成17α-羟基-11α-(甲基磺酰基)氧-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氢甲酯，γ-内酯。
象上面的实施例一样安装5-L四口烧瓶，除了没有捕集系统安装在扩散器外面。通氮气，搅拌下向烧瓶中加入定量138.7g羟基酯，接着加入1425ml二氯甲烷。用盐/冰浴将反应混合物冷却到-5℃。快速加入甲磺酰氯(51.15g，0.447摩尔)，接着缓慢滴加在225ml二氯甲烷中的三乙胺(54.37g)。需要大约30分钟的进料期间，控制加入速度使反应温度不升高到5℃。加入后持续搅拌1小时，将反应物转移到12-L分液漏斗中，并加入2100ml二氯甲烷。连续用700ml等份的冷1N盐酸，1N氢氧化钠，和饱和的氯化钠的氯化钠水溶液洗涤溶液。合并水相并用3500ml二氯甲烷反萃。所有的有机相合并到9-L罐中，加入500g中性氧化铝，II级活性，和500g无水硫酸钠。将罐中物质充分混合30分钟，过滤。真空使滤液至干，得到粘性黄色泡沫。将其溶解于350ml二氯甲烷，并且搅拌下滴加1800ml乙醚。调节加入速度使大约一半乙醚在30分钟内加入。加入大约750ml后，产物开始分离出结晶固体。剩余的醚在10分钟内加入。过滤取出固体，滤饼用2L乙醚洗涤，在50℃真空烘箱中干燥，得到144.61g(88％)几乎白的固体，m.p.149-150℃。用该方法制备的物质一般HPLC(面积％)纯度是98-99％。在一次操作中，得到熔点153-153.5℃的物质，根据HPLC测定，纯度是99.5％。
实施例24
方法1：步骤3C：方法A：制备17α-羟基-3-氧代孕甾-4，9(11)-二烯-7α，21-二羧酸氢甲酯，γ-内酯。
象第二个实施例一样安装1-L四口烧瓶。通氮气，搅拌下向烧瓶中加入甲酸(250ml)和乙酸酐(62ml)。加入甲酸钾(6.17g)，用油浴将反应混合物内部温度加热到40℃(稍后在70℃重复这样做会得到更好的结果)反应16小时。16小时后，加入甲磺酸盐5，内部温度升至100℃。持续加入搅拌2小时，然后在rotavap上真空去除溶剂。残余物与500ml冰水一起搅拌15分钟，然后用500ml等份的乙酸乙酯萃取两次。合并有机相，依次用冷的250ml等份饱和的氯化钠溶液(两次)，1N氢氧化钠溶液，和饱和的氯化钠洗涤。有机相用硫酸钠干燥，过滤，真空至干，得到亮黄白色泡沫，当用刮勺刮时，其呈粉末玻璃状。形成粉末14.65g，分析为82.1％6，7.4％8和5.7％9(HPLC面积百分比)。
实施例25
方法1：步骤3C：方法B：制备17α-羟基-3-氧代孕甾-4，9(11)-二烯-7α，21-二羧酸氢甲酯，γ-内酯。
象上述实施例一样安装5-L 4口烧瓶。通氮气，搅拌下向烧瓶中加入228.26g乙酸和41.37g乙酸钠。用油浴将反应混合物内部温度加热到100℃。加入甲磺酸盐(123.65g)，继续加热30分钟。该阶段完成后，停止加热，并加入200ml冰水。温度降至40℃，并继续搅拌1小时，然后将反应混合物缓慢倒入5-L搅拌的烧瓶中的1.5L冷水中。分离成胶质油状产物。将油溶解于1L乙酸乙酯。用1L等份冷的饱和的氯化钠溶液，1N氢氧化钠溶液，和饱和的氯化钠洗涤。有机相用硫酸钠干燥，过滤，滤液真空至干，得到泡沫，瘪成胶质油。用乙醚研制并最终固化。过滤固体并用乙醚洗涤，得到79.59g黄白色固体。由70.4％期望的Δ9，11烯酯6，12.3％Δ11，12烯酯8，10.8％7-α，9-α内酯9和5.7％未反应5组成。
实施例26
方法1：步骤3D：制备9，11α-环氧-17α-羟基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氢甲酯，γ-内酯。
4口加套的500ml反应器安装机械搅拌子，冷凝管/扩散器，温度计，带有氮气导管的添加漏斗。通氮气，搅拌下向反应器中加入83ml二氯甲烷中8.32g粗产物烯酯。向其中加入4.02g二碱价磷酸钾，接着加入12ml三氯乙腈。外部冷却水通过反应器加套，反应混合物冷却到8℃。在10分钟内通过添加漏斗加入36ml 30％过氧化氢。完全加入后最初浅黄色的反应混合物几乎变得没有颜色。自始至终添加的反应混合物保持在9±1℃，并且连续搅拌过夜(共23小时)。向反应混合物中加入二氯甲烷(150ml)。将全部内含物加入到大约250ml冰水中。用150ml等份二氯甲烷萃取三次。合并的二氯甲烷萃取液用400ml冷的3％亚硫酸钠溶液洗涤以分解残留的过氧化物。接着用330ml冷的1N氢氧化钠洗涤，400ml冷的1N盐酸洗涤，最终用400ml盐水洗涤。有机相用硫酸镁干燥，过滤，滤饼用80ml二氯甲烷洗涤。真空去除溶剂得到9.10g浅黄色固体粗产物。从大约25ml 2-丁酮重结晶，得到5.52g几乎白的结晶。最终从丙酮(大约50ml)中重结晶，得到3.16g长针状结晶，mp.241-243℃。
实施例27
方法1：步骤3：选择1：由4’S(4’α)，7’α-十六氢-11’α-羟基-10’β，13’β-二甲基-3’，5，20’-三氧螺[呋喃-2(3H)，17’β-[4，7]亚甲基[17H]环戊[a]菲]-5’β(2’H)-腈制备9，11α-环氧-17α-羟基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氢甲酯，γ-内酯。
向干净干燥的反应器中加入二酮(20g)，接着加入820ml甲醇和17.6ml 25％甲醇钠/甲醇溶液。反应混合物加热到回流条件(大约67℃)反应16-20小时。用40ml 4N盐酸中止反应。常压蒸馏去除溶剂。加入100ml甲苯，与甲苯共沸蒸馏去除残留的甲醇。浓缩后，将粗产物羟基酯4溶解于206ml二氯甲烷并冷却到0℃。加入甲磺酰氯(5ml)后缓慢加入10.8ml三乙胺。产物搅拌45分钟。真空蒸馏去除溶剂得到粗产物甲磺酸盐5。
在分离的干燥的反应器中加入5.93g甲酸钾，240ml甲酸，接着加入118ml乙酸酐。混合物加热到70℃反应4小时。
向上述制备的浓甲磺酸盐溶液5中加入甲酸混合物。将混合物加热到95-105℃反应2小时。产物混合物冷却到50℃，在50℃真空蒸馏去除挥发成分。产物分配在275ml乙酸乙酯和275ml水中。用137ml乙酸乙酯反萃水层，用240ml冷的1N氢氧化钠溶液然后用120ml饱和的氯化钠洗涤。相分离后，真空蒸馏浓缩有机相，得到粗产物烯酯。
将产物溶解于180ml二氯甲烷并冷却到0-15℃。加入8.68g磷酸氢二钾后加入2.9ml三氯乙腈。3分钟内向混合物中加入78ml 30％过氧化氢溶液。反应混合物在0-15℃搅拌6-24小时。反应后，分离两相混合物。有机层用126ml 3％亚硫酸钠溶液，126ml 0.5N氢氧化钠溶液，126ml 1N盐酸和126ml 10％盐水洗涤。产物用无水硫酸镁干燥，并通过Celite过滤，常压蒸馏去除溶剂二氯甲烷。产物从甲基乙基酮中结晶两次，得到7.2g eplerenone。
实施例28
方法1：步骤3：方法2：由1’S(4’α)，7’α-十六氢-11’α-羟基-10’β，13’β-二甲基-3’，5，20’-三氧螺[呋喃-2(3H)，17’β-[4，7]亚甲基[17H]环戊[a]菲]-5’β(2’H)-腈转化成9，11α-环氧-17α-羟基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氢甲酯，γ-内酯，没有中间体。
在4口5L圆底烧瓶上安装机械搅拌子，带有氮气导管的添加漏斗，温度计和带有扩散器的冷凝管，其与次氯酸钠洗涤器连接。将3.05L甲醇中的二酮(83.20g)加入到烧瓶中。添加漏斗中装入67.85g 25％(w/w)甲醇钠的甲醇溶液。氮气搅拌下经15分钟向烧瓶中滴加甲醇化物。产生暗橘/黄色浆液。将反应混合物加热至回流反应20小时，持续回流的同时滴加175ml 4N盐酸(注意，HCN在该操作中蒸发)。用接取柱头代替回流冷凝器，并且在通过漏斗滴加1.6L 10％氯化钠水溶液的同时通过蒸馏去除1.6L甲醇，加入速度与蒸馏速度一致。反应混合物冷却到室温并且用2.25L等份的二氯甲烷萃取两次。合并的萃取物用750ml等份的冷的1N氢氧化钠和饱和的氯化钠溶液洗涤。有机层在1大气压下与甲醇共沸蒸馏干燥，使终体积为1L(取出总量的0.5％用于分析)。
将浓缩的有机溶液(羟基酯)加回到没有HCN阱的如前所配制的原反应瓶中。烧瓶冷却到0℃，氮气搅拌下加入30.7g甲磺酰氯。添加漏斗装有32.65g三乙胺，保持5℃温度，经15分钟滴加。持续搅拌2小时，同时反应混合物升至室温。制备由250gDowex 50W×8-100酸离子交换树脂组成的柱子，并在使用前用250ml水，250ml甲醇和500ml二氯甲烷洗涤。反应混合物经柱子流下并收集。制备新柱子并重复上面的过程。制备第三个250g柱子，由Dowex 1×8-200碱性离子交换树脂组成，象上述酸树脂处理一样预处理。反应混合物经柱子流下并收集。制备第四个碱性树脂柱，反应混合物又经柱子流下并收集。每次通过柱子后两次用250ml二氯甲烷洗涤柱子，每次流经柱子的时间是大约10分钟。溶剂洗液与反应混合物合并，真空将体积减小到大约500ml，取出2％用于qc.。剩余的进一步减小到150ml终体积(粗产物甲磺酸盐溶液)。
向原5-L反应装置加入960ml甲酸，472ml乙酸酐和23.70g甲酸钾。氮气搅拌下将该混合物加热到70℃反应16小时。然后将温度升至100℃，通过添加漏斗经30分钟加入粗产物甲磺酸盐溶液。随着二氯甲烷蒸馏出反应混合物，温度降至85℃。所有二氯甲烷去除后，温度升至100℃，在100℃反应2.5小时。反应混合物冷却到40℃减压去除甲酸直到达到最小搅拌体积(大约150ml)。残余物冷却到室温，加入375ml二氯甲烷。稀释的残余物用冷的1L等份的饱和的氯化钠溶液，1N碳酸钠，及又一次氯化钠溶液洗涤。有机相用硫酸镁(150g)干燥，过滤得到暗红棕色溶液(粗产物烯酯溶液)。
在4口加套的1L反应器上安装机械搅拌子，冷凝管/扩散器，温度计和带有氮气导管的添加漏斗。氮气搅拌下向反应器中加入600ml二氯甲烷中粗产物烯酯溶液(大约60g)。向其中加入24.0g二碱价磷酸钾，接着加入87ml三氯乙腈。外部冷却水通过反应器加套，反应混合物冷却到10℃。在30分钟内通过添加漏斗加入147ml 30％过氧化氢。完全加入后，最初暗红棕色的反应混合物变成浅黄色。添加的反应混合物自始至终保持在10±1℃，并且连续搅拌过夜(共23小时)。相分离，含水部分用120ml等份二氯甲烷萃取两次。接着合并的有机相加入210ml 3％亚硫酸钠溶液洗涤，重复第二次，此后，通过淀粉/碘化物试纸检测，有机相和水相都对过氧化物呈阴性。有机相依次用210ml等份冷的1N氢氧化钠，1N盐酸洗涤，最终用盐水洗涤两次。有机相共沸干燥至大约100ml体积，加入新鲜溶剂(250ml)并且共沸蒸馏至相同100ml体积，。真空去除残留的溶剂得到57.05g粘性黄色泡沫粗产物。一部分(51.01g)进一步干燥至恒重44.3g，并用HPLC定量分析。在27.1％EPX测定。
实施例29
氮气下向反应器中加入11α-羟基雄甾烯二酮(429.5g)和甲苯磺酸水合物(7.1g)。向反应器中加入乙醇(2.58L)，得到的溶液冷却到5℃。在0-15℃经15分钟向溶液中加入原甲酸三乙酯(334.5g)。加完原甲酸三乙酯后，反应混合物升至40℃，并在该温度下反应2小时，然后温度升至回流，反应在回流下继续3小时。真空下冷却反应混合物，真空去除溶剂得到3-乙氧基雄甾-3，5-二烯-17-酮。
实施例30--由11α-羟基烯睾丙内酯形成烯胺
向装有机械搅拌器的25ml 3-口烧瓶中加入氰化钠(1.72g)。加入水(2.1ml)，加热下搅拌混合物直到固体溶解。加入二甲基甲酰胺(15ml)后加入11α-羟基烯睾丙内酯(5.0g)。向混合物中加入水(0.4ml)和硫酸(1.49g)的混合物。混合物加热到85℃反应2.5小时，此时HPLC分析说明产物的转化完全。反应混合物冷却到室温。加入硫酸(0.83g)，搅拌混合物0.5小时。将反应混合物加入到冰浴中冷却的60ml水中。烧瓶用3mlDMF和5ml水洗涤。将浆液搅拌40分钟并过滤。滤饼用40ml水洗涤两次，在60℃真空烘箱中干燥过夜，得到11α-羟基烯胺，即5’R(5’α)，7’β-20’-氨基十六氢-11’β-羟基-10’α，13’α-二甲基-3’，5-二氧螺[呋喃-2(3H)，17’α(5’H)-[7，4]亚甲基(metheno)[4H]环戊[a]菲]-5’-腈(4.9g)。
实施例31--11α-羟基烯睾丙内酯向二酮的转化
向装有机械搅拌器的50ml 3-口烧瓶中加入氰化钠(1.03g)。加入水(1.26ml)，稍微加热烧瓶以使固体溶解。加入二甲基乙酰胺(或二甲基甲酰胺)(9ml)后加入11α-羟基烯睾丙内酯(3.0g)。搅拌下向反应烧瓶中加入水(0.25ml)和硫酸(0.47ml)的混合物。混合物加热到95℃反应2小时，HPLC分析表明反应完全。加入硫酸(0.27ml)，搅拌混合物30分钟。加入另外的水(25ml)和硫酸(0.90ml)，反应混合物搅拌16小时。然后混合物在冰浴中冷却到5-10℃。通过多孔玻璃过滤器过滤后用水(20ml)洗涤两次来分离固体。固体二酮即4’S(4’α)，7’α-十六氢-11’α-羟基-10’β，13’β-二甲基-3’，5，20’-三氧螺[呋喃-2(3H)，17’β-[4，7]亚甲基[17H]环戊[a]菲]-5’β(2’H)-腈在真空烘箱中干燥得到3.0g固体。
实施例32
实施例31描述的方法制备的5.0g二酮的甲醇(100ml)的悬浮液加热至回流，经1分钟加入25％甲醇钾的甲醇溶液(5.8ml)。混合物变得均匀。15分钟后，出现沉淀。回流下加热混合物，大约4小时后又变得均匀。回流下加热一共持续了23.5小时，加入4.0N盐酸(10ml)。蒸馏去除一共60ml氰化氢的甲醇溶液。经15分钟向蒸馏残余物中加入水(57ml)。在加入水期间溶液温度升至81.5℃，通过蒸馏去除了另外的4ml氰化氢/甲醇溶液。加完水后，混合物变混浊，去除热源。将混合物搅拌3.5小时，产物缓慢结晶。过滤悬浮液，用水洗涤收集的固体。在漏斗上经空气风干，92℃下(26英寸汞柱)干燥16小时，得到2.98g灰白色固体。该固体是91.4％重量羟基酯，即11α，17α-二羟基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氢甲酯，γ-内酯。产率是56.1％。
实施例33
向装有温度计，Dean Stark阱和机械搅拌器的干净干燥的3-口反应烧瓶中加入实施例31描述的方法制备的二酮。室温下(22℃)向反应器加入甲醇(24ml)，将得到的浆液搅拌5分钟。向反应器加入25％重量甲醇钠的甲醇溶液(52.8ml)。室温下将混合物搅拌10分钟，期间反应混合物变成浅棕色澄清溶液，发现反应微放热(2-3℃)。控制加入速度，防止反应器温度超过30℃。然后将反应混合物加热到回流条件(大约67℃)，继续在回流条件下反应16小时。然后取样品，用HPLC分析转化作用。反应在回流下继续，直到残留的二酮不超过二酮加入量的3％。回流期间向反应器加入4N盐酸(120ml)，产生HCN，其被洗涤器吸收。
反应完全后，常压下从反应混合物中蒸馏出90-95％甲醇溶剂。蒸馏期间上方温度从67℃变化为75℃，碱处理含有HCN的蒸馏液，并且在处理前漂白。去除甲醇后将反应混合物冷却到室温，当混合物在40-45℃范围冷却时，开始沉淀固体产物。向冷却的浆液中加入任选地含有5％重量碳酸氢钠(1200ml)(25℃)的水溶液，然后将得到的反应混合物大约1小时冷却到0℃。碳酸氢钠处理有效地从反应混合物中消除了残留的未反应的二酮。浆液在0℃搅拌2小时，以完成沉淀和结晶，然后，过滤回收固体产物，滤饼用水(100ml)洗涤。产物在26”汞柱真空80-90℃干燥至恒重。干燥后的水含量小于0.25％重量。得到的摩尔产率大约77-80％重量。
实施例34
在碘化锌(1当量)存在下，根据实施例31制备的二酮(1当量)与甲醇钠(4.8当量)在甲醇溶剂中反应。或者根据这里所描述的提取方法或者根据其中没有二氯甲烷萃取，盐水和碱洗涤，和硫酸钠干燥步骤的非提取方法处理反应产物。在非提取方法中用5％重量碳酸氢钠溶液代替甲苯。
实施例35
根据实施例34制备的羟基酯(1.97g)与四氢呋喃(20ml)合并，得到的混合物冷却到-70℃。加入磺酰氯(0.8ml)，混合物搅拌30分钟，之后加入咪唑(1.3g)。反应混合物升至室温并再搅拌2小时。然后用二氯甲烷稀释混合物并用水萃取。浓缩有机相，得到粗产物烯酯(1.97g)。一小部分粗产物样品用HPLC分析。分析表明9，11-烯烃∶11，12-烯烃∶7，9-内酯比例是75.5∶7.2∶17.3。根据上述但是在0℃下进行时，反应得到一种产物，其中9，11-烯烃∶11，12-烯烃∶7，9-内酯分布是77.6∶6.7∶15.7。该方法合并成一步，引入离去基团，并消除该离去基团，产生烯酯9，11-烯烃结构，即反应是由磺酰氯引起式V羟基酯的11α-羟基基团被卤化物置换，接着脱卤化氢产生Δ-9，11结构。进行这样的烯酯生成反应不使用强酸(例如甲酸)或干燥剂例如乙酸酐。也消除了另外的产生一氧化碳的方法的回流步骤。
实施例36
向装有机械搅拌器，添加漏斗和热电偶的干净干燥的3-口圆底烧瓶中加入根据实施例34制备的羟基酯(20g)和二氯甲烷(400ml)。得到的混合物在室温下搅拌直到获得完全的溶液。用冰浴将溶液冷却到5℃。向含有羟基酯的二氯甲烷溶液中加入甲磺酰氯(5ml)，很快接着缓慢滴加三乙胺(10.8ml)。调节加入速度使反应温度不超过5℃。反应极端放热；因此必需冷却。反应混合物在大约5℃搅拌1小时。当反应完全时(HPLC和TLC分析)，混合物在大约0℃在26英寸汞柱真空下浓缩，直到变成稠的浆液。得到的浆液用二氯甲烷(160ml)稀释。混合物在大约0℃在26英寸汞柱真空下浓缩得到浓缩物。发现浓缩物(式IV甲磺酸盐产物，其中R3＝H，-A-A-和-B-B-都是-CH2-CH2-，即11α，17α-二羟基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氢甲酯，γ-内酯转化成17α-羟基-11α-(甲基磺酰基)氧-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氢甲酯，γ-内酯)纯度是82％(HPLC面积百分比)。该物质不用分离即可用于下一步反应。
向装有机械搅拌器，添加漏斗和热电偶和加热罩的干净干燥的反应器中加入甲酸钾(4.7g)，甲酸(16ml)和乙酸酐(8ml，0.084mol)。所得溶液加热到70℃并搅拌大约4-8小时。乙酸酐的加入是放热的并产生气体(CO)，因此要调节加入速度，控制温度和气体的产生(压力)。制备活性消除剂的反应时间取决于反应中存在的水的量(甲酸和甲酸钾分别含有大约3-5％的水)。消除反应对水存在量敏感；如果大于0.1％水(KF)，可能提高7，9内酯杂质量。这种副产物难于从终产物中去除。当KF表明小于0.1％水时，活性消除剂被转移到先前步骤中制备的甲磺酸盐浓缩物(0.070mol)。得到的溶液加热到95℃，蒸馏挥发性物质并收集在DeanStark阱中。当停止放出挥发性物质时，用冷凝管代替Dean Stark阱，反应混合物在95℃又加热1小时。完成时(TLC和HPLC分析：少于0.1％起始物)，将内含物冷却到50℃，并开始真空蒸馏(26英寸汞柱/50℃)。混合物浓缩成粘稠的浆液后冷却到室温。得到的浆液用乙酸乙酯(137ml)稀释，搅拌溶液15分钟。用水(137ml)稀释。分离各相，用乙酸乙酯(70ml)再次萃取下面的水相。合并的乙酸乙酯溶液用盐水(120ml)洗涤一次，用冰冷却的1N氢氧化钠溶液洗涤两次(每次120ml)。测定水相pH，如果用过的洗液pH小于8，则再次洗涤有机层。当发现用过的洗液pH大于8时，用盐水溶液(120ml)洗涤乙酸乙酯层一次，使用50℃水浴通过旋转蒸发浓缩至干。得到的固体产物烯酯，即17α-羟基-3-氧代孕甾-4，9(11)-二烯-7α，21-二羧酸氢甲酯，γ-内酯重92g(77％摩尔产率)。
实施例37
向装有机械搅拌器，添加漏斗和热电偶的2-L 3-口圆底烧瓶中加入根据实施例34制备的羟基酯(100g；0.22mol)。使用自动控制温度的循环冷却浴。反应前干燥烧瓶，因为甲磺酰氯对水敏感。
向烧瓶中加入二氯甲烷(1L)，搅拌下羟基酯溶解于其中。该溶液冷却到0℃，通过添加漏斗向烧瓶加入甲磺酰氯(25ml，0.32mol)。通过添加漏斗向烧瓶加入三乙胺(50ml，0.59mol)，用另外的二氯甲烷(34ml)淋洗漏斗。三乙胺的加入是高度放热的。搅拌和冷却下加入时间是10分钟左右。混合物冷却到0℃，在该温度下搅拌下进行附加的45分钟，期间，反应瓶上方通入氮气。然后用薄层色谱和高效液相色谱分析反应混合物样品来检查反应是否完全。然后混合物在0℃又搅拌30分钟，并再次检查反应是否完全。分析表明反应在此刻基本上完全；在0℃在26”汞柱真空去除溶剂二氯甲烷。蒸馏液的气相色谱分析表明存在甲磺酰氯和三乙胺两者。然后向反应器中加入二氯甲烷(800ml)，在0-15℃温度下搅拌得到的混合物5分钟。又在0-5℃在26”汞柱真空去除溶剂，得到式IV甲磺酸盐，其中R3＝H，-A-A-和-B-B-都是-CH2-CH2-及R1是甲氧羰基。产物的纯度是大约90-95面积％。
为了制备消除剂，在分开的干燥的反应器中混合甲酸钾(23.5g，0.28mol)，甲酸(80ml)和乙酸酐(40ml)。甲酸和乙酸酐被泵入到反应器中，在加入乙酸酐期间保持温度不超过40℃。加热消除剂混合物到70℃，从反应体系中弃除水。继续该反应，直到根据Karl Fisher分析水含量少于0.3％重量。然后将消除剂溶液转移到含有根据上述制备的浓缩的粗产物甲磺酸盐溶液的反应器中。得到的混合物被加热到95℃最大温度，收集挥发的蒸馏物直到不再产生蒸馏物。在大约90℃停止蒸馏。蒸馏完成后，反应混合物在95℃又搅拌2小时，用薄层色谱检查反应是否完全。当反应完全后，反应器冷却到50℃在50℃26”汞柱真空下从反应混合物中去除甲酸和溶剂。浓缩物冷却到室温，然后加入乙酸乙酯(688ml)，乙酸乙酯和浓缩物的混合物搅拌15分钟。此时，加入12％盐水溶液(688ml)，有助于从有机相去除水可溶性杂质。然后用20分钟使各相分离。水相转移到另一个容器中，向其中加入附加量的乙酸乙酯(350ml)。将水相反萃30分钟，然后使各相分离，合并乙酸乙酯层。向合并的乙酸乙酯层加入饱和的氯化钠溶液(600ml)，搅拌30分钟。使各相分离。去除水相。进行又一次氯化钠(600ml)洗涤。从第二次余下的洗液中分离有机相。然后在搅拌下用1N氢氧化钠(600ml)洗涤有机相30分钟。各相静置30分钟，去除水相。测定水相pH，发现大于7。用饱和的氯化钠(600ml)又一次洗涤15分钟。最后在50℃26”汞柱真空下浓缩有机相，过滤回收产物。干燥时终产物是泡沫状棕色固体。在45℃减压下进一步干燥24小时，得到95.4g烯酯产物，产率68.8％。校正起始羟基酯和终产物烯酯得摩尔产率是74.4％。
实施例38
重复实施例37的方法，除了通过用离子交换树脂处理反应溶液而避免了多次洗涤步骤。碱性氧化铝或碱性二氧化硅。用碱性二氧化硅处理的条件在表38中给出。发现每一种处理，没有实施例44的多次洗涤，对于去除杂质是有效的。
实施例39
在100ml反应器中混合乙酸钾(4g)和三氟乙酸(42.5ml)。以保持温度在加入期间低于30℃的控制速度下向混合物中加入三氟乙酸酐(9.5ml)。然后将溶液加热到30℃反应30分钟，得到用于将式IV甲磺酸盐转化成式II的烯酯的消除剂。
向预先制备的式IV甲磺酸盐溶液中加入预先形成的TFA/TFA酸酐消除剂。得到的混合物在40℃加热4个半小时，用TLC或HPLC周期性检查转化程度。反应完全后，混合物转移到1-口烧瓶中并室温(22℃)减压下浓缩至干。向混合物中加入乙酸乙酯(137ml)使固相物质完全溶解，然后加入水/盐水混合物(137ml)，搅拌得到的两相混合物10分钟。使各相分离20分钟。盐水浓度是24％重量。水相中加入附加量的乙酸乙酯(68ml)，将这样制备的两相混合物搅拌10分钟，此后使静置15分钟使相分离。合并两次萃取的乙酸乙酯层并用24％重量盐水(120ml)，另一等份24％重量盐水(60ml)，1N氢氧化钠溶液(150ml)和另一份盐水(60ml)洗涤。加入各水相后，混合物搅拌10分钟并静置15分钟使分离。用水吸气器在45℃减压下浓缩得到的溶液至干。HPLC分析固体产物(8.09g)，发现含有83.4面积％的烯酯，2.45面积％11，12-烯烃，1.5％7，9-内酯，和1.1％未反应的甲磺酸盐。
实施例40
具有实施例23制备的结构的甲磺酸盐(1.0g)，乙酸异丙烯酯(10g)和对甲苯磺酸(5mg)置于50ml烧瓶中，搅拌下加热到90℃。5小时后，混合物冷却到25℃，在10mmHg真空下浓缩。残余物溶解于二氯甲烷(20ml)，用5％碳酸氢钠水溶液洗涤。真空浓缩二氯甲烷层，得到1.47g褐色油。该物质从二氯甲烷/乙醚中重结晶，得到0.50g式IV(Z)烯醇的乙酸酯。
搅拌下向预先加热到100℃的乙酸钠(0.12g)和乙酸(2.0ml)的混合物中加入该物质。60分钟后混合物冷却到25℃，并用二氯甲烷(20ml)稀释。溶液用水(20ml)洗涤，硫酸镁干燥。过滤去除干燥剂，真空浓缩滤液，得到0.4g期望的9，11-烯烃，IV(Y)。粗产物含有少于2％的7，9-内酯杂质。
实施例41--甲磺酸盐在DMSO中的热消除。
烧瓶中2g甲磺酸盐和5mlDMSO的混合物在80℃加热22.4小时。对反应混合物的HPLC分析表明没有检测到起始物。向反应中加入水(10ml)，用二氯甲烷萃取沉淀三次。合并的二氯甲烷层用水洗涤，硫酸镁干燥，浓缩得到烯酯。
实施例42
在50ml梨形烧瓶中搅拌下将式IIA(1.07g，74.4％烯酯)，三氯乙酰胺(0.32g)，作为固体的磷酸氢二钾与二氯甲烷(15.0ml)混合。得到澄清的溶液。用移液管经1分钟加入过氧化氢(30％重量；5.0ml)。得到的混合物在室温下搅拌6小时，此刻，HPLC分析表明反应混合物中epoxymexrenone与烯酯的比是大约1∶1。向反应混合物中加入附加的三氯乙酰胺(0.32g)，反应在搅拌下再持续8小时，之后显示残留的烯酯部分减少到10％。加入附加的三氯乙酰胺(0.08g)，反应混合物静置过夜，此刻混合物中相对于epoxymexrenone，只保留5％未反应烯酯。
实施例43
向100ml反应器中加入式IIA烯酯(5.4g，74.4％烯酯)。向烯酯中加入固体形式的三氯乙酰胺(4.9g)，和磷酸氢二钾(3.5g)后加入二氯甲烷(50ml)。混合物冷却到15℃，经10分钟加入30％过氧化氢(25g)。使反应混合物达20℃，并在该温度下搅拌6小时，此刻用HPLC检测转化作用。测定出剩余的烯酯少于1％重量。
反应混合物加入到水中(100ml)，使各相分离，取出二氯甲烷层。向二氯甲烷层中加入氢氧化钠(0.5N；50ml)。20分钟后各相分离，向二氯甲烷层中加入盐酸(0.5N；50ml)。然后各相分离，有机相用饱和的盐水洗涤(50ml)。二氯甲烷层用无水硫酸镁干燥并去除溶剂。得到白色固体(5.7g)。氢氧化钠水层被酸化和萃取处理得到另外的0.2g产物。epoxymexrenone产率是90.2％。
实施例44
根据实施例43的方法将式IIA烯酯转化成epoxymexrenone，有下面的不同；初始加料由烯酯(5.4g，74.4％烯酯)，三氯乙酰胺(3.3g)和磷酸氢二钾(3.5g)组成。加入过氧化氢溶液(12.5ml)。反应在20℃进行过夜，HPLC表明90％烯酯转化成epoxymexrenone。加入另外的三氯乙酰胺(3.3g)和30％过氧化氢(5.0ml)，反应又进行6小时，此时残留的烯酯只是烯酯加入量的2％。根据实施例43后处理后得到5.71gepoxymexrenone。
实施例45
根据实施例43的概述的方法将式IIA烯酯转化成epoxymexrenone。在该实施例的反应中，烯酯加入量是5.4g(74.4％烯酯)，三氯乙酰胺加入量是4.9g，过氧化氢加入量是25g，和磷酸氢二钾加入量是3.5g。反应在20℃进行18小时，残留的烯酯少于2％。后处理后得到5.71g epoxymexrenone。
实施例46
根据实施例43的描述的方法将式IIA烯酯转化成epoxymexrenone，只是该实施例中的反应温度是28℃。反应器中加入的材料包括烯酯(2.7g)，三氯乙酰胺(2.5g)，磷酸氢二钾(1.7g)，过氧化氢(17.0g)和二氯甲烷(50ml)。反应4小时后，未反应的烯酯只是烯酯加入量的2％。根据实施例43后处理后得到3.0g epoxymexrenone。
实施例47
式IIA烯酯(17g，72％烯酯)溶解于二氯甲烷(150ml)，然后缓慢搅拌下加入三氯乙酰胺(14.9g)。混合物温度调至25℃，400rpm搅拌下将磷酸氢二钾(10.6g)的水(10.6ml)溶液搅拌着加入到烯酯底物溶液中。经3-5分钟向底物/磷酸盐/三氯乙酰胺中加入过氧化氢(30％重量溶液；69.4ml)。发现没有放热或放出氧气。这样制备的反应混合物以400rpm搅拌，在25℃反应18.5小时。反应期间没有氧气逸出。用水(69.4ml)稀释反应混合物，混合物在大约250rpm搅拌15分钟。该操作不需要控制温度，基本上在室温下进行(5-25℃范围内的任何温度可以接受)。分离水层和有机层，取出下面的二氯甲烷层。
在250rpm搅拌下用二氯甲烷(69.4ml)反萃水层15分钟。分离水层和有机层，取出下面的二氯甲烷层。水层(177g；pH＝7)进行过氧化氢测定。结果(12.2％)表明反应中消耗仅仅0.0434mol过氧化氢是0.0307烯烃。用小体积二氯甲烷反萃足以保证水相中不损失epoxymexrenone。应用第二次大量二氯甲烷萃取，其中只回收三氯乙酰胺，证明了该结果。
合并来自上述萃取的合并的二氯甲烷溶液，并以250rpm用3％重量亚硫酸钠溶液(122ml)洗涤至少15分钟。在搅拌期终了时发现阴性淀粉碘化物试验(KI试纸；没有发现颜色；阳性试验中紫色表明存在过氧化物)。
分离水层和有机层，取出下面的二氯甲烷层。弃除水层(pH＝6)。注意亚硫酸钠溶液的加入引起稍微放热，因此应该在控制温度下加入。
二氯甲烷层用0.5N氢氧化钠(61ml)以大约250rpm在15-25℃范围内洗涤45分钟(pH＝12-13)。在该过程中去除三氯乙酰胺衍生的杂质。酸化碱性水部分，接着用二氯甲烷萃取保证在该操作中几乎没有epoxymexrenone损失。
二氯甲烷层用0.1N盐酸(61ml)以250rpm搅拌在15-25℃范围内洗涤一次15分钟。分离水层和有机层，取出下面的二氯甲烷层。再次用10％重量氯化钠水溶液(61ml)以大约250rpm在15-25℃范围内洗涤15分钟。分离水层和有机层，取出下面的有机层。有机层通过Solkafloc板过滤后减压蒸发至干。用65℃水浴使干燥完全。得到米色固体(17.95g)，进行HPLC分析。测得epoxymexrenone是93.1％。
产物溶解于热的甲基乙基酮(189ml)，常压蒸馏得到的溶液直到去除95ml酮溶剂。使温度降至50℃，产物结晶，在50℃继续搅拌1小时。然后使温度降至20-25℃，又继续搅拌2小时。过滤固体并用MEK洗涤(24ml)，固体干燥到恒重9.98g，HPLC分析含有93.63％epoxymexrenone。该产物再次溶解于热的MEK(106ml)，压力下热溶液通过10微米在线过滤器过滤。加入又18mlMEK淋洗，常压蒸馏过滤的MEK溶液，直到去除53ml溶剂。使温度降至50℃，产物结晶，在50℃继续搅拌1小时。然后使温度降至20-25℃，在该温度下反应，同时继续搅拌2小时。过滤固体产物并用MEK淋洗(18ml)。固体产物干燥至恒重8.32g，定量HPLC分析其含有99.6％epoxymexrenone。干燥时的最终损失少于1.0％。根据该实施例的反应和后处理，epoxymexrenone总的产率是65.8％。该总产率反映出93％反应产率，78.9％初始结晶收率和89.5％重结晶收率。
实施例48--使用甲苯的式IIA的环氧化作用
根据实施例46概述的方法将式IIA烯酯转化成eplerenone，除了使用甲苯为溶剂。反应器中加入的材料包括烯酯(2.7g)，三氯乙酰胺(2.5g)，磷酸氢二钾(1.7g)，过氧化氢(17.0g)和甲苯(50ml)。反应放热到28℃，反应4小时完成，得到的三相混合物冷却到15℃，过滤，用水洗涤，真空干燥，得到2.5g产物。
实施例49--9，11-二烯酮的环氧化作用
在1L 3-口烧瓶中，称之为XVIIA的化合物(化合物XVII，其中-A-A-和-B-B-两者是-CH2-CH2-)(40.67g)溶解于二氯甲烷(250ml)，冰盐混合物外部冷却。加入磷酸二钾(22.5g)和三氯乙腈(83.5g)，混合物冷却到2℃，然后经1小时缓慢加入30％过氧化氢(200g)。反应混合物在12℃搅拌8小时，在室温下搅拌14小时。取出一滴有机物，测定是否含有起始烯酮，发现少于0.5％。加入水(400ml)，搅拌15分钟，分离各相。有机相连续用200ml碘化钾(10％)，200ml硫代硫酸钠(10％)，和100ml饱和的碳酸氢钠溶液洗涤，每次分离各相。有机层用无水硫酸镁干燥并浓缩，得到粗环氧化物(41g)。产物从乙酸乙酯∶二氯甲烷中结晶，得到14.9g纯产物。
实施例50--使用间-氯代过苯甲酸的化合物XVIIA的环氧化作用
化合物XVIIA(18.0g)溶解于250ml二氯甲烷并冷却到10℃。搅拌下在15分钟内加入固体间-氯代过苯甲酸(50-60％纯度，21.86g)。发现没有温度提高。反应混合物搅拌3小时，检测是否存在二烯酮。反应混合物依次用亚硫酸钠(10％)，氢氧化钠溶液(0.5N)，盐酸溶液(5％)和最后用50ml饱和的盐水溶液处理。用无水硫酸镁干燥后蒸发，得到17.64g环氧化物，直接用于下面的步骤。发现产物包含Baeyer-Villiger氧化产物，通过从乙酸乙酯研制后从二氯甲烷中重结晶将其去除。在500g规模下，将沉淀的间-氯代苯甲酸过滤后常规后处理。
实施例51--使用三氯乙酰胺的化合物XVIIA的环氧化作用
化合物XVIIA(2g)溶解于25ml二氯甲烷。加入三氯乙酰胺(2g)，磷酸二钾(2g)。室温搅拌下加入30％过氧化氢(10ml)，继续搅拌18小时，得到环氧化物(1.63g)。没有生成Baeyer-Villiger产物。
实施例52
室温下向2000ml烧瓶中加入氢氧化钾(56.39g，1005.03mmol；3.00当量)，与二甲亚砜(750.0ml)混合成浆液。向烧瓶中与THF(956.0ml)一起加入相应于式XX的三烯酮(其中R3是氢，A-A-和-B-B-两者是-CH2-CH2-)(100.00g；335.01mmol；1.00当量)。向烧瓶中加入甲基硫酸三甲基硫鎓盐(126.14g；670.02mmol；2.00当量)。得到的混合物在80-85℃加热回流1小时。用HPLC检查向17-螺氧亚甲基的转化作用。真空下从反应混合物中去除大约1LTHF，然后在30分钟内加入水(460ml)，同时反应混合物冷却到15℃。过滤得到的混合物。固体环氧乙烷产物用200ml等份水洗涤两次。发现产物高度结晶，容易进行过滤。然后产物在40℃真空下干燥，分离得到104.6g3-甲基烯醇醚Δ-5，6，9，11，-17-环氧甾类化合物产物。
实施例53
氮气层下向干燥的500ml反应器中加入乙醇钠(41.94g；616.25mmol；1.90当量)。向反应器中加入乙醇(270.9ml)，将甲醇钠在乙醇中制成浆液。向浆液中加入丙二酸二乙酯(103.90g；648.68mmol；2.00当量)，之后加入用实施例52描述的方法制备的环氧甾类化合物(104.60g；324.34mmol；1.00当量)，得到的混合物加热回流，即80-85℃。加热继续4小时，然后用HPLC检查反应的完全程度。经30分钟向反应混合物加入水(337.86ml)，同时将混合物冷却到15℃。继续搅拌30分钟，然后将反应浆液过滤，得到含有细孔粉末的滤饼。滤饼用水(每次200ml)洗涤两次，然后室温真空下干燥。分离得到133.8g 3-甲基-烯醇醚-Δ-5，6，9，11，-17-螺内酯-21-甲氧羰基中间体。
实施例54
与氯化钠(27.50g；470.52mmol；1.5当量)二甲基甲酰胺(709ml)一起向反应器中加入实施例53制备的3-甲基-烯醇醚-Δ-5，6，9，11，-17-螺内酯-21-甲氧羰基中间体(式XVIII，其中R3是氢，A-A-和-B-B-两者是-CH2-CH2-，133.80g，313.68mmol；1.00当量)，并且搅拌下向2000ml反应器中加入水(5ml)。得到的混合物在138-142℃加热回流3小时。然后用HPLC检查反应混合物的完全程度。然后在30分钟内向混合物中加入水，同时反应混合物冷却到15℃。搅拌继续30分钟，反应浆液过滤后回收无定形固体反应产物，为滤饼。滤饼用200ml等份水洗涤两次后干燥。得到91.6g(82.3％产率；96面积％)产物3-甲基烯醇醚-17-螺内酯。
实施例55
向2000ml反应器中加入根据实施例54制备的烯醇醚(91.60g，258.36mmol；1.00当量)，乙醇(250ml)，乙酸(250ml)，和水(250ml)，得到的浆液加入到回流2小时。在30分钟内向混合物中加入水(600ml)，同时反应混合物冷却到15℃。过滤反应浆液，滤饼用水洗涤两次(每次200ml等份)。然后干燥滤饼；分离得到84.4g产物3-酮Δ4，5，9，11，-17-螺内酯(化合物XVII，其中R3是氢，A-A-和-B-B-两者是-CH2-CH2-；产率95.9％)。
实施例56
向22L 4-口烧瓶中与四氯化碳(3.2L)一起加入化合物XVIIA(1kg，2.81摩尔)。向混合物中加入N-溴代琥珀酰胺(538g)后加入乙腈(3.2L)。得到的混合物加热至回流并保持在68℃回流温度下反应大约3小时，产生澄清的橙色溶液。加热5小时后，溶液变暗。加热6小时后移去热源，对反应混合物取样。真空去除溶剂，向底部残余物中加入乙酸乙酯(6L)。搅拌得到的混合物，然后加入5％碳酸氢钠溶液(4L)，将混合物搅拌15分钟，后使相分离。取出水层，向混合物中加入饱和的盐水溶液(4L)，然后搅拌15分钟。再使相分离，真空去除有机层，得到粘稠的浆液。然后加入二甲基甲酰胺(4L)，继续去除至55℃。使静止的底部静置过夜，并加入DABCO(330g)和溴化锂(243g)。然后将混合物加热到70℃。加热1.5小时后，取出液相色谱样品，加热3.50小时后，加入另外的DABCO(40g)。加热4.5小时后，加入水(4L)，得到的混合物冷却到15℃。过滤浆液，滤饼用水(3L)洗涤，并学过滤器上干燥过夜。将湿的滤饼(978g)放回到22L烧瓶中并加入二甲基甲酰胺(7L)。将这样制备的混合物加热到105℃，在此点，滤饼完全溶解于溶液。停止加热，搅拌烧瓶中的混合物并冷却。向反应器加套中加入冰水，反应器中的混合物冷却到14℃并保持2小时。得到的浆液过滤并用2.5L等份的水洗涤两次。滤饼在真空下干燥过夜。得到510g浅棕色固体产物。
实施例57
向2L四口烧瓶中加入：实施例56的产物9，11-环氧烯睾丙内酯(100.00g；282.1mmol；1.00当量)，二甲基甲酰胺(650.0ml)，氯化锂(30.00g；707.7mmol；2.51当量)，和丙酮氰醇(72.04g；77.3ml；846.4mmol；3.00当量)。机械搅拌得到的悬浮液，并用四甲基胍(45.49g；49.6ml；395.0mmol；1.40当量)处理。过滤该体系，使用水冷凝器和干冰冷凝器(装入干冰丙酮溶液)防止HCN逸出。干冰冷凝器的通风线通过装有大大过量氯气漂白剂的洗气器。混合物加热到80℃。
18小时后，得到暗红棕色溶液，其在搅拌下冷却到室温。冷却期间向溶液中通入氮气，以去除残留的HCN，通风线通过阱中的漂白剂。2小时后，用乙酸(72g)处理溶液并搅拌30分钟。然后搅拌下将粗混合物倒入冰水(2L)。搅拌的悬浮液进一步用10％盐酸水溶液(400ml)处理并搅拌1小时。然后过滤混合物，得到暗砖红色固体(73g)。滤液置于4L分液漏斗中，并用二氯甲烷(3×800ml)萃取；合并有机层，并用水反萃(2×2L)。真空浓缩二氯甲烷溶液，得到61g暗红色油状物。
水洗级分放置过夜后，出现大量沉淀。过滤收集沉淀，测定为纯产物烯胺(14.8g)。
干燥原红色固体(73g)后进行HPLC分析，测得主要成分是9，11-环氧烯胺。进一步HPLC分析表明烯胺是二氯甲烷后处理得到的红色油状物的主要成分。烯胺摩尔产率计算值是46％。
实施例58
向1000ml圆底烧瓶中加入根据实施例57制备的9，11-环氧烯胺(4.600g；0.011261mol；1.00当量)。向混合物中加入甲醇(300ml)和0.5％重量盐酸水溶液(192ml)，然后回流17小时。然后真空去除甲醇，将物质的量在蒸馏瓶中减少到50ml，形成白色沉淀。向浆液中加入水(100ml)后过滤，得到白色滤饼，用水洗涤三次。固体9，11-环氧二酮产物产率是3.747g(81.3％)。
实施例59
将根据实施例58制备的环氧二酮(200mg；0.49mmol)悬浮于甲醇(3ml)中，向混合物加入1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(DBU)。回流加热24小时，混合物变均匀。然后在30℃在旋转蒸发器上浓缩至干，残余物分配在二氯甲烷和3.0N盐酸中。浓缩有机相得到黄色固体(193mg)，测得其是22％重量epoxymexrenone。产率20％。
实施例60
向悬浮于1.5ml甲醇中的100mg二酮中加入10毫升(0.18当量)25％(w/w)甲醇钠的甲醇溶液。将溶液加热回流。30分钟后，没有剩下二酮，存在5-氰基酯。向混合物中加入46毫升25％(w/w)甲醇钠的甲醇溶液。混合物在回流下加热23小时，根据HPLC分析，此时主要产物是eplerenone。
实施例61
向悬浮于30ml无水甲醇的2g二酮中加入0.34ml三乙胺。悬浮液在回流下加热4.5小时。混合物在25℃搅拌16小时。过滤得到的悬浮液，得到1.3g 5-氰基酯，为白色固体。
向悬浮于80ml甲醇的6.6g二酮中加入2.8ml三乙胺。混合物在回流下加热4小时，并在25x搅拌88小时，此间产物从溶液中结晶出来。过滤后用甲醇洗涤得到5.8g氰基酯，为白色固体。从氯仿/甲醇中重结晶，得到3.1g结晶产物，HPLC测定其是均匀的。
由此可见，实现了本发明的目的，也获得了其它有益结果。
只要不脱离本发明范围对上述组合物和方法可以进行各种各样的改变，上述描述中涉及的所有内容和附图所示内容只是为了详细说明而不是为了限制本发明。
Claims (23)
1.一种制备式II化合物的方法：
其中
-A-A-代表基团-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，
R3，R4和R5各自独立地选自氢，卤素，羟基，低级烷基，低级烷氧基，羟基烷基，烷氧基烷基，羟基羰基，氰基，芳基氧基，
R1代表α-取向的低级烷氧羰基或羟基羰基残基，
-B-B-代表基团-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基团：
其中
R6和R7各自独立地选自氢，卤素，低级烷氧基，酰基，羟基烷基，烷氧基烷基，羟基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，和
R8和R9各自独立地选自氢，卤素，低级烷氧基，酰基，羟基烷基，烷氧基烷基，羟基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起构成一个碳环或杂环结构，或者R8和R9与R6或R7一起构成一个与五元环D环稠合的碳环或杂环结构，
该方法包括：
从式IV化合物去除11α-离去基团：
其中-A-A-，R1，R3，-B-B-，R8和R9如式II所定义，和R2是11α-离去基团，它的除去有效地在9-和11-碳原子之间产生双键。
2.权利要求1的方法，其中所述式II化合物相应于式IIA：
其中
-A-A-代表基团-CH2-CH2-或-CH＝CH-，
-B-B-代表基团-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的式IIIA基团
R1代表α-取向的低级烷氧羰基，
X代表两个氢原子或氧代基团，
Y1和Y2一起代表氧桥-O-，或
Y1代表羟基，和
Y2代表羟基，低级烷氧基，或者，如果X代表H2，则也可以代表低级烷酰氧基，
和其中X代表氧代基团及Y2代表羟基的化合物的盐，该方法包括：
使含有一种低级链烷酸和一种低级链烷酸的盐的溶液与相应于式IVA的化合物接触：
其中-A-A-，R1，-B-B-，X，Y1和Y2如式IIA所定义，和R2是低级烷基磺酰基氧基或酰基氧基。
3.权利要求1的方法，其中所述式IV化合物是17α-羟基-11α-(甲基磺酰基)氧基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氢甲酯，γ-内酯，所述式II化合物是17α-羟基-3-氧代孕甾-4，9(11)-二烯-7α，21-二羧酸氢甲酯，γ-内酯。
4.权利要求1的方法，其中式IV化合物通过使低级烷基磺酰化试剂或酰化试剂或产生卤素的试剂与式V化合物反应来制备：
其中-A-A-，R1，R3，-B-B-，R8和R9如权利要求1所定义。
5.权利要求4的方法，其中所述产生卤素的试剂是亚硫酰卤、磺酰卤或草酰卤。
6.权利要求4或5的方法，其中所述式IV化合物相应于式IVA：
其中
-A-A-代表基团-CH2-CH2-或-CH＝CH-，
R1代表α-取向的低级烷氧羰基，
R2代表低级烷基磺酰基氧基或酰基氧基，
-B-B-代表基团-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的式IIIA基团
X代表两个氢原子或氧代基团，
Y1和Y2一起代表氧桥-O-，或
Y1代表羟基，和
Y2代表羟基，低级烷氧基，或者，如果X代表H2，则也可以代表低级烷酰氧基，
和其中X代表氧代基团及Y2代表羟基的化合物的盐，该方法包括：
在一种卤化氢清除剂存在下使一种低级烷基磺酰卤或酰卤与相应于式VA的化合物反应：
其中-A-A-，R1，-B-B-，X，Y1和Y2如式IVA所定义。
7.权利要求4或5的方法，其中所述式IV化合物是17α-羟基-11α-(甲基磺酰基)氧基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氢甲酯，γ-内酯，所述式V化合物是11α，17α-二羟基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氢甲酯，γ-内酯。
8.权利要求4或5的方法，其中式V化合物通过使式VI化合物与相应于式R10OM的碱金属烷氧化物反应来制备，其中M是碱金属，R10O-相应于R1的烷氧基取代基，所述式VI化合物具有下面的结构：
其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如权利要求1所定义。
9.权利要求8的方法，其中所述式V化合物相应于式VA：
其中
-A-A-代表基团-CH2-CH2-或-CH＝CH-，
R1代表α-取向的低级烷氧羰基，
-B-B-代表基团-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的式IIIA基团
X代表两个氢原子或氧代基团，
Y1和Y2一起代表氧桥-O-，或
Y1代表羟基，和
Y2代表羟基，低级烷氧基，或者，如果X代表H2，则也可以代表低级烷酰氧基，
和其中X代表氧代基团及Y2代表羟基的化合物的盐，该方法包括：
在一种具有式R10OH的醇存在下使式VIA化合物与相应于式R10OM的碱金属烷氧化物反应，其中M是碱金属，R10O-相应于R1的烷氧基取代基，所述式VIA化合物具有下面的结构：
其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式VA所定义。
10.权利要求8的方法，其中所述式V化合物是11α，17α-二羟基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氢甲酯，γ-内酯，式VI化合物是4’S(4’α)，7’α-十六氢-11’α-羟基-10’β，13’β-二甲基-3’，5，20’-三氧代螺[呋喃-2(3H)，17’β-[4，7]亚甲基[17H]环戊[a]菲]-5’β(2’H)-腈。
11.权利要求8的方法，其中氰化物离子是作为反应的副产物生成的，该方法进一步包括在反应过程中从反应区去除氰化物离子，以减少氰化物离子与式V产物反应的程度。
12.权利要求11的方法，其中通过用沉淀剂沉淀来从反应中去除氰化物离子。
13.权利要求12的方法，其中所述反应在一种溶剂基质中进行，所述沉淀剂包括一种盐，该盐包括生成在所述基质中的溶解度比其中沉淀剂的溶解度低的氰化物的阳离子。
14.权利要求13的方法，其中所述阳离子选自碱土金属离子和过渡金属离子。
15.权利要求8的方法，其中式VI化合物通过水解相应于式VII的化合物来制备：
其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如权利要求1定义。
16.权利要求15的方法，其中所述式VI化合物相应于式VIA：
其中
-A-A-代表基团-CH2-CH2-或-CH＝CH-，
-B-B-代表基团-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的式IIIA基团
X代表两个氢原子或氧代基团，
Y1和Y2一起代表氧桥-O-，或
Y1代表羟基，和
Y2代表羟基，低级烷氧基，或者，如果X代表H2，则也可以代表低级烷酰氧基，
和其中X代表氧代基团及Y2代表羟基的化合物的盐，该方法包括：
在一种酸和一种有机溶剂和/或水的存在下，水解式VIIA化合物，所述式VIIA化合物具有下面的结构：
其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式VIA所定义。
17.权利要求15的方法，其中所述式VI化合物是4’S(4’α)，7’α-十六氢-11’α-羟基-10’β，13’β-二甲基-3’，5，20’-三氧代螺[呋喃-2(3H)，17’β-[4，7]亚甲基[17H]环戊[a]菲]-5’β(2’H)-腈，所述式VII化合物是5’R(5’α)，7’β-20’-氨基十六氢-11’β-羟基-10’α，13’α-二甲基-3’，5-二氧代螺[呋喃-2(3H)，17’α(5’H)-[7，4]亚甲基[4H]环戊[a]菲]-5’-腈。
18.权利要求15的方法，其中式VII化合物通过在一种碱金属盐的存在下，使式VIII化合物与氰化物离子源反应来制备，所述式VIII化合物具有下面的结构：
其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如权利要求1所定义。
19.权利要求18的方法，其中所述式VII化合物相应于式VIIA：
其中
-A-A-代表基团-CH2-CH2-或-CH＝CH-，
-B-B-代表基团-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的式IIIA基团
X代表两个氢原子或氧代基团，
Y1和Y2一起代表氧桥-O-，或
Y1代表羟基，和
Y2代表羟基，低级烷氧基，或者，如果X代表H2，则也可以代表低级烷酰氧基，
和其中X代表氧代基团及Y2代表羟基的化合物的盐，该方法包括：
在一种碱的存在下，在氯化锂的存在下，使氰化物源例如酮基氰醇与一种相应于下式的11α-羟基化合物反应：
其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式VIIA所定义。
20.权利要求18的方法，其中所述式VII化合物是5’R(5’α)，7’β-20’-氨基十六氢-11’β-羟基-10’α，13’α-二甲基-3’，5-二氧代螺[呋喃-2(3H)，17’α(5’H)-[7，4]亚甲基[4H]环戊[a]菲]-5’-腈，和所述式VIII化合物是11α，17α-二羟基-3-氧代孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，γ-内酯。
21.权利要求18的方法，其中所述氰化物离子源包括碱金属氰化物，所述式VIII化合物与氰化物离子之间的反应在一种酸和水的存在下进行。
22.权利要求18的方法，其中式VIII化合物通过在一种对于向所述底物以α-取向引入11-羟基有效的微生物的存在下，通过发酵氧化相应于式XIII的底物化合物来制备，所述底物具有下面的结构：
其中-A-A-，R1，R3，-B-B-，R8和R9如权利要求1定义。
23.权利要求22的方法，其中所述式VIII化合物是11α，17α-二羟基-3-氧代孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，γ-内酯。
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