EA009176B1 - Способ получения 7-альфа-карбоксил-9,11-эпоксистероидов и промежуточных продуктов, используемых для их получения, и общий способ эпоксидирования по олефиновым двойным связям - Google Patents

Abstract

В изобретении описаны новые схемы реакций, новые стадии способов и новые промежуточные продукты для синтеза эпоксимексренона и других соединений формулыв которой -А-А- обозначает группу -CHR-CHR- или -CR=CR-, R, Rи Rнезависимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, C-Cалкил, C-Cалкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу, Rобозначает альфа-ориентированный C-Cалкоксикарбонильный или гидроксикарбонильный радикал, -В-В- обозначает группу -CHR-CHR- или альфа- или бета-ориентированную группугде Rи Rнезависимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, C-Cалкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу и Rи Rнезависимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, гидрокси, галоген, C-Cалкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонилалкил, алкоксикарбонилалкил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, или Rи Rвместе образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, либо Rи Rвместе с Rили Rобразуют карбоциклическое или гетероциклическое кольцо, конденсированное с пятичленным кольцом D, при том, что там, где специально не указано, алкил или алкильная часть заместителя может содержать число углеродных атомов от 1 до 6.

Description

Предпосылки создания изобретения

Настоящее изобретение относится к новым способам получения 9,11-эпоксистероидных соединений, прежде всего соединений 20-спироксанового ряда и их аналогов, новых промежуточных продуктов, которые могут быть использованы для получения стероидных соединений, и к способам получения таких новых промежуточных продуктов. В частности, объектом изобретения являются новые и усовершенствованные способы получения γ-лактона неполного метилового эфира 9,11а-эпокси-17а-гидрокси-3оксопрегн-4-е-н-7а,21-дикарбоновой кислоты (эплеренон; эпоксимексренон).

Способы получения соединений 20-спироксанового ряда описаны в патенте США 4559332 (далее патент '332). Соединения, полученные в соответствии со способом по патенту '332, характеризуются наличием разомкнутого кислородсодержащего кольца Е общей формулы

ТА в которой -А-А- обозначает группу -СН₂-СН₂- или -СН=СН-,

В¹ обозначает α-ориентированный низший алкоксикарбонильный, соответственно (низш.)алкоксикарбонильный, или гидроксикарбонильный радикал,

-В-В- обозначает группу -СН₂-СН₂- либо α- или β-ориентированную группу

где В⁶ и В⁷, каждый, обозначает водород,

X обозначает два водородных атома или оксогруппу,

Υ¹ и Υ² совместно обозначают кислородный мостик -О- или

Υ¹ обозначает гидроксил и

Υ² обозначает гидроксил, (низш.)алкоксигруппу или, если X представляет собой Н₂, (низш.)алканоилоксигруппу, и включают также соли таких соединений, в которых X обозначает оксогруппу, а Υ² обозначает гидроксил, т.е. соответствующих 17в-гидрокси-21-карбоновых кислот.

В патенте США 4559332 описан ряд способов получения эпоксимексренона и родственных соединений формулы 1А. Возникновение новой и более широкой области клинического применения эпоксимексренона создает необходимость в разработке усовершенствованных способов получения этого и других родственных стероидов.

Краткое изложение сущности изобретения

Основной задачей настоящего изобретения является разработка усовершенствованных способов получения эпоксимексренона, других 20-спироксанов и других стероидов, обладающих общими структурными особенностями. Другими задачами изобретения являются, в частности, разработка усовершенствованного способа, осуществление которого позволяет получать с высоким выходом продукты формулы 1А и другие родственные соединения, разработка такого способа, который включает минимальное число стадий выделения, и разработка такого способа, который можно осуществлять с приемлемыми капитальными затратами и приемлемыми затратами на стадиях превращения.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является разработка ряда схем синтеза эпоксимексренона, промежуточных продуктов, которые могут быть использованы при получении эплеренона, и способа синтеза этих новых промежуточных продуктов.

Эти новые схемы синтеза подробно представлены в описании предпочтительных вариантов осуществления. Новые промежуточные продукты по настоящему изобретению включают те, которые описаны непосредственно ниже.

Соединение формулы IV соответствуют структуре

IV в которой -А-А- обозначает группу -СНВ⁴-СНВ⁵- или -СВ⁴=СВ⁵-,

В³, В⁴ и В⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, (низш.)алкил, (низш.)алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу,

- 1 009176

К¹ обозначает α-ориентированный (низш.)алкоксикарбонильный или гидроксикарбонильный радикал,

К² обозначает уходящую 11а-группу, отщепление которой обеспечивает образование двойной связи между 9- и 11-м углеродными атомами,

-В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу

где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, (низш.)алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и

К⁸ и К⁹ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, (низш.)алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, или

К⁸ и К⁹ совместно образуют карбоциклическую или гетероциклическую кольцевую структуру, или К⁸ К⁹ совместно с К⁶ или с К⁷ образуют карбоциклическую или гетероциклическую кольцевую структуру, конденсированную с пентациклическим Ό-кольцом.

Соединение формулы 1УА соответствует формуле 1У, в которой К⁸ и К⁹ совместно с атомом углерода кольца, к которому они присоединены, образуют структуру

где значения X, Υ¹, Υ² и С(17) указаны выше.

Соединение формулы 1УВ соответствует формуле 1УА, в которой К⁸ и К⁹ совместно образуют структуру

Соединения формулы 1УС, 1УЭ и 1УЕ являются аналогами соединений любой из формул 1У, 1УА и 1УВ соответственно, в которых -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-, К³ обозначает водород, а К¹ обозначает алкоксикарбонил, предпочтительно метоксикарбонил. Соединения формулы 1У могут быть получены взаимодействием (низш.)алкилсульфонилирующего или ацилирующего агента или образующего галогенид агента с соответствующим соединением, описываемым формулой У

Соединение формулы У имеют структуру

где значения -А-А-, -В-В-, К¹, К³, К⁸ и К⁹ аналогичны указанным для формулы 1У.

Соединение формулы УА соответствует формуле У, в которой К⁸ и К⁹ совместно с углеродным атомом кольца, к которому они присоединены, образуют структуру

где значения X, Υ¹, Υ² и С(17) указаны выше.

Соединение формулы УВ соответствуют формуле УА, в которой К⁸ и К⁹ совместно образуют струк^туру

Соединения формул УС, УЭ и УЕ являются аналогами соединений любой из формул V, УЛ и УБ соответственно, в которых -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-, К³ обозначает водород, а К¹ обозначает алкоксикарбонил, предпочтительно метоксикарбонил. Соединения формулы У могут быть получены взаимодействием алкоксида щелочного металла с соответствующим соединением фор

- 2 009176 мулы νΐ.

Соединение формулы νΐ соответствует структуре

VI где значения -А-А-, -В-В-, В³, В⁸ и В⁹ аналогичны указанным для формулы ΐν.

Соединение формулы VΐΑ соответствует формуле νΐ, в которой В⁸ и В⁹ совместно с углеродным атомом кольца, с которым они связаны, образуют структуру

Υ² γ¹ ΐ ^ХС( 1 7) пш( СН₂) ₂ · с - X / \ где значения X, Υ¹, Υ² и С(17) указаны выше.

Соединение формулы VΐΒ соответствуют формуле У1А, в которой В⁸ и В⁹ совместно образуют структуру

XXXIV о

А \ип/ XXXIII

Соединения формул ν^ νΐϋ и νΐΕ являются аналогами соединений любой из формул νΐ, VΐΑ и VΐΒ соответственно, в которых -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-, а В³ обозначает водород. Соединения формул νΐ, ν^, νΐΐ! и У1С получают гидролизом соединений формул νΐΐ, УНА, νΐΙΙ! и У11С соответственно.

Соединение формулы νΐΐ соответствует структуре

где значения -А-А-, -В-В-, В³, В⁸ и В⁹ аналогичны указанным для формулы IV.

Соединение формулы νΐΙΑ соответствует формуле VII, в которой В⁸ и В⁹ совместно с углеродным атомом кольца, к которому они присоединены, образуют структуру

Υ²

Υ ’ I

С( 1 7) 1Н11( СН.) - - С - X / \ где значения X, Υ¹, Υ² и С(17) указаны выше.

Соединение формулы νΐΙΒ соответствует формуле νΐΙΑ, в которой В⁸ и В⁹ совместно образуют структуру

XXXIV о

А V./ XXXIII

Соединения формул νΐΙΑ νΐΙΙ) и νΐΙΕ являются аналогами соединений любой из формул VII, νΐΙΑ и νΐΙΒ соответственно, в которых -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-, а В³ обозначает водород. Соединения формулы νΙΙ могут быть получены цианированием соединений формулы νΙΙΙ.

Соединение формулы νΐΐΐ соответствует структуре

- 3 009176 где значения -А-А-, -В-В-, К³, К⁸ и К⁹ аналогичны указанным для формулы IV.

Соединение формулы VША соответствует формуле VIII, в которой К⁸ и К⁹ совместно с атомом углерода кольца, к которому они присоединены, образуют структуру

Υ² γ\ I

С( 1 7) П111( СН,) ₂ - с - X ......_ / \ где значения X, Υ¹, Υ² и С(17) указаны выше.

Соединение формулы соответствует формуле ^ПА, в которой К⁸ и К⁹ совместно образуют структуру

XXXIV о

А А|шг/ XXXIII

Соединения формул УШС, УПГО и УШЕ являются аналогами соединений любой из формул VIII, УША и У111В соответственно, в которых -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-, а К³ обозначает водород. Соединения формулы VIII получают окислением субстрата, содержащего соединение формулы XIII, аналогично тому, как это изложено ниже, ферментацией, эффективной для введения 11-гидроксильной группы в субстрат в α-ориентации.

Соединение формулы XIV соответствует структуре

XXXIV где значения -А-А-, -В-В-, К³, К⁸ и К⁹ аналогичны указанным для формулы IV.

Соединение формулы XIVА соответствует формуле XIV, в которой К⁸ и К⁹ совместно с углеродным атомом кольца, к которому они присоединены, образуют структуру

Υ² у’ I

С( 1 7) 1П11( СН₂) 2 - С - X ______ / \ где значения X, Υ¹, Υ² и С(17) указаны выше.

Соединение формулы XIV соответствует формуле XIVА, в которой К⁸ и К⁹ совместно с углеродным атомом кольца, к которому они присоединены, образуют структуру о

А \ши/ XXXIII

Соединения формул XIVС, XIV^ и XIVЕ являются аналогами соединений любой из формул XIV, XIVА и XIVВ соответственно, в которых -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-, а К³ обозначает водород. Соединения формулы XIV могут быть получены гидролизом соответствующего соединения формулы XV.

Соединение формулы XV соответствует структуре

где значения -А-А-, -В-В-, К³, К⁸ и К⁹ аналогичны указанным для формулы IV.

Соединение формулы XVА соответствует формуле XV, в которой К⁸ и К⁹ совместно с углеродным атомом кольца, к которому они присоединены, образуют структуру

Υ² γ’_χ I

7) 11111( СН₂) 2 - С - X

XXXIV

- 4 009176 где значения X, Υ¹, Υ² и С(17) указаны выше.

Соединение формулы ХУВ соответствует формуле ХУЛ, в которой К⁸ и К⁹ совместно с углеродным атомом кольца, к которому они присоединены, образуют структуру

Соединения формул ХУС, ХУВ и ХУЕ являются аналогами соединений любой из формул XV, ХУА и ХУВ соответственно, в которых -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-, а К³ обозначает водород. Соединения общей формулы ХУ могут быть получены цианированием соответствующего соединения общей формулы ХУТ.

Соединение формулы XXI соответствует структуре где значения -А-А-, -В-В-, К³, К⁸ и К⁹

аналогичны указанным для формулы ГУ.

Соединение формулы ХХ1А соответствует формуле XXI, в которой К⁸ и К⁹ совместно с углеродным атомом кольца, к которому они присоединены, образуют структуру

где значения X, Υ¹, Υ² и С(17) указаны выше.

Соединение формулы ХХ1В соответствует формуле ХХ1А, в которой К⁸ и К⁹ совместно образуют структуру

Соединения формул ХХ1С, ХХГО и ХХ1Е являются аналогами соединений любой из формул ХХ1, ХХ1А и ХХ1В соответственно, в которых -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-, а К³ обозначает водород. Соединения общей формулы XXI могут быть получены гидролизом соответствующего соединения общей формулы XXII.

Соединение формулы XXII соответствует структуре

где значения -А-А-, -В-В-, К³, К⁸ и К⁹ аналогичны указанным для формулы IV.

Соединение формулы ХХПА соответствует формуле XXII, в которой К⁸ и К⁹ совместно с углеродным атомом кольца, к которому они присоединены, образуют структуру

где значения X, Υ¹, Υ² и С(17) указаны выше.

- 5 009176

Соединение формулы ΧΧΙΙΒ соответствует формуле ΧΧΙΙΑ, в которой К⁸ и К⁹ совместно образуют структуру

Соединения формул ΧΧΙΙίζ ΧΧΙΙΌ и ΧΧΙΙΕ являются аналогами соединений любой из формул ΧΧΙΙ, ΧΧΙΙΑ и ΧΧΙΙΒ соответственно, в которых -Α-Α- и -Β-Β-, каждый, обозначает группу -СН2-СН2-, а К³ обозначает водород. Соединения общей формулы ΧΧΙΙ могут быть получены цианированием соединения общей формулы ΧΧΙΙΙ.

Соединение формулы ΧΧΙΙΙ соответствует структуре

где значения -Α-Α-, -Β-Β-, К³, К⁸ и К⁹ аналогичны указанным для формулы Ιν.

Соединение формулы ΧΧΙΙΙΑ соответствует формуле ΧΧΙΙΙ, в которой К⁸ и К⁹ совместно с атомом углерода кольца, с которым они связаны, образуют структуру

где значения Χ, Υ¹, Υ² и С(17) указаны выше.

Соединение формулы ΧΧΙΙΙΒ соответствует формуле ΧΧΙΙΙΑ, в которой К⁸ и К⁹ совместно образуют структуру

Соединения формул ХХ111С, ΧΧΙΙΙΌ и ΧΧΙΙΙΕ являются аналогами соединений любой из формул ΧΧΙΙΙ, ΧΧΙΙΙΑ и ΧΧΙΙΙΒ соответственно, в которых -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН2-СН2-, а К³ обозначает водород. Соединения общей формулы ΧΧΙΙΙ могут быть получены окислением соединения формулы ΧΧΙν аналогично тому, как это изложено ниже.

Соединение формулы 104 соответствует структуре

где значения -А-А-, -В-В- и К³ такие же, как указанные для формулы Ιν, а К¹¹ обозначает С₁-С₄алкил. Соединение формулы 104А соответствует формуле 104, в которой -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-, а К³ обозначает водород. Соединения общей формулы 104 могут быть получены термическим разложением соединения формулы 103.

Соединение формулы 103 соответствует структуре

имеют значения, указанные для формулы 104, а К¹² обозначает где -А-А-, -В-В-, К³ и К¹¹ С₁-С₄(низш.)алкил.

- 6 009176

Соединение формулы 103 А соответствуют формуле 103, в которой -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-, а К³ обозначает водород. Соединения формулы 103 могут быть получены взаимодействием соответствующего соединения формулы 102 с диалкилмалонатом в присутствии основания, такого, как алкоксид щелочного металла.

Соединение формулы 102 соответствует структуре

где значения -А-А-, -В-В-, К³ и К¹¹ такие же, как указанные для формулы 104.

Соединение формулы 102А соответствует формуле 102, в которой -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-, а К³ обозначает водород. Соединения формулы 102 могут быть получены взаимодействием соответствующего соединения формулы 101 с триалкилсульфониевым соединением в присутствии основания.

Соединение формулы 101 соответствует структуре

где -А-А-, -В-В-, К³ и К¹¹ имеют значения, указанные для формулы 104.

Соединение формулы 101 А соответствует формуле 101, в которой -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-, а К³ обозначает водород. Соединения формулы 101 могут быть получены взаимодействием 11а-гидроксиандростен-3,17-диона или другого соединения формулы XXXIV с триалкилортоформиатом в присутствии кислоты.

Если принять во внимание описание конкретных реакционных схем, которые приведены ниже, то очевидно, какое из этих соединений оказывается наиболее приемлемым для конкретной реакционной схемы. Соединения по настоящему изобретению можно эффективно использовать в качестве промежуточных продуктов для получения эпоксимексренона и других стероидов.

Другие объекты и отличительные особенности изобретения отчасти очевидны и отчасти представлены ниже.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 изображена технологическая схема осуществления способа биоконверсии канренона или канренонового производного в соответствующее 11а-гидроксисоединение.

На фиг. 2 изображена технологическая схема осуществления предпочтительного варианта способа биоконверсии для 11а-гидроксилирования канренона или канреноновых производных.

На фиг. 3 изображена технологическая схема осуществления особенно предпочтительного варианта способа биоконверсии продуктов с 11а-гидроксилированием канренона или канреноновых производных.

На фиг. 4 показано распределение по размерам частиц канренона после их получения в соответствии со способом, представленным на фиг. 2.

На фиг. 5 показано распределение по размерам частиц канренона после их стерилизации в биореакторе в соответствии со способом, представленным на фиг. 3.

На всех чертежах одинаковые элементы обозначены одинаковыми позициями.

Описание предпочтительных вариантов выполнения

В соответствии с настоящим изобретением были разработаны различные новые технологические схемы для получения эпоксимексренона и других соединений формулы I

где -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-, _К ³ _{, К} ⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, (низш.)алкил, (низш.)алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруп

- 7 009176 пу, арилоксигруппу,

К¹ обозначает α-ориентированный (низш.)алкоксикарбонильный или гидроксикарбонильный радикал,

-В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу ^В\ ζ”⁷

СН-------СН

I I

--СН —сн_г--СН— где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, (низш.)алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу и

К⁸ и К⁹ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, (низш.)алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, или

К⁸ и К⁹ совместно образуют карбоциклическую или гетероциклическую кольцевую структуру, или

К⁸ либо К⁹ совместно с К⁶ или с К⁷ образуют карбоциклическую или гетероциклическую кольцевую структуру, сконденсированную с пентациклическим И-кольцом.

В настоящем описании во всех случаях, если не указано иное, органические радикалы, которые обозначены как низшие, соответственно (низш.), содержат не более 7, предпочтительно 1-4 атома углерода.

Предпочтительный (низш.)алкоксикарбонильный радикал представляет собой радикал, полученный из алкилового радикала, содержащего 1-4 углеродных атома, такого, как метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, втор-бутил и третбутил; особенно предпочтительными являются метоксикарбонил, этоксикарбонил и изопропоксикарбонил. Предпочтительный (низш.)алкоксирадикал представляет собой радикал, дериватизированный из вышеупомянутых С₁-С₄алкильных радикалов, прежде всего из первичных С₁-С₄алкильных радикалов; особенно предпочтителен метоксирадикал. Предпочтительный (низш.)алканоильный радикал представляет собой радикал, дериватизированный из прямоцепочечного алкила, содержащего 1-7 углеродных атомов; особенно предпочтительны формил и ацетил.

В предпочтительном варианте метиленовый мостик в положении 15, 16 является β-ориентированным.

Предпочтительный класс соединений, которые могут быть получены в соответствии со способами по изобретению, составляют 20-спироксановые соединения, описанные в патенте США 4559332, т.е. соединения формулы ΙΑ

где -Α-Α- обозначает группу -СН₂-СН₂- или -СН=СН-,

-В-В- обозначает группу -СН₂-СН₂- либо α- или β-ориентированную группу формулы ΙΙΙΑ

I---------------------------------------1 — сн-сн₂— СН- _111А

К¹ обозначает α-ориентированный (низш.)алкоксикарбонильный или гидроксикарбонильный радикал,

X обозначает два водородных атома, оксогруппу или =8,

Υ¹ и Υ² совместно обозначают кислородный мостик -О- или

Υ¹ обозначает гидроксил,

Υ² обозначает гидроксил, (низш.)алкоксигруппу или, если X представляет собой Н₂, обозначает (низш.)алканоилоксигруппу.

Предпочтительные 20-спироксановые соединения, получаемые согласно новым способам по изобретению, представляют собой соединения формулы Ι, у которых Υ¹ и Υ² совместно обозначают кислородный мостик -О-.

Особенно предпочтительными соединениями формулы I являются такие, у которых X обозначает оксогруппу.

Из представителей 20-спироксановых соединений формулы ΙΑ, у которых X обозначает оксогруппу, наиболее предпочтительны такие, у которых Υ¹ и Υ² совместно обозначают кислородный мостик -О-.

Как уже указано выше, 17в-гидрокси-21-карбоновая кислота приемлема также в форме ее солей. При этом особого внимания заслуживают соли металлов и аммония, такие, как соли щелочных металлов и щелочно-земельных металлов, например соли натрия, кальция, магния и, что предпочтительно, калия и

- 8 009176 соли аммония, полученные с использованием аммиака или приемлемых, предпочтительно физиологически допустимых, органических азотсодержащих оснований. В качестве оснований особого внимания заслуживают не только амины, например (низш.)алкиламины (такие, как триэтиламин), гидрокси(низш.)алкиламины [такие, как 2-гидроксиэтиламин, ди(2-гидроксиэтил)амин и три(2-гидроксиэтил)амин], циклоалкиламины (такие, как дициклогексиламин) и бензиламины (такие, как бензиламин и Ν,Ν'дибензилэтилендиамин), но также и азотсодержащие гетероциклические соединения, например соединения ароматического характера (такие, как пиридин и хинолин), и соединения, включающие, по меньшей мере частично, замещенное гетероциклическое кольцо (такие, как Ν-этилпиперидин, морфолин, пиперазин и Ν,Ν'-диметилпиперазин).

Кроме того, предпочтительные соединения включают соли щелочных металлов, прежде всего соли калия, соединений формулы ΙΑ, в которых К¹ обозначает алкоксикарбонил, X обозначает оксогруппу, а Υ¹ и Υ², каждый, обозначает гидроксил.

Особенно предпочтительными соединениями формул I и ΙΑ являются, например, следующие:

9а,11 а-эпокси-7 а-метоксикарбонил-20-спирокс-4-ен-3,21 -дион, 9а,11а-эпокси-7а-этоксикарбонил-20-спирокс-4-ен-3,21-дион, 9а,11 а-эпокси-7 а-изопропоксикарбонил-20-спирокс-4-ен-3,21-дион и 1,2-дегидроаналог каждого из этих соединений, 9а,11а-эпокси-6а,7а-метилен-20-спирокс-4-ен-3,21-дион, 9а,11а-эпокси-6в,7в-метилен-20-спирокс-4-ен-3,21-дион, 9а,11а-эпокси-6в,7в;15в,16в-бис-метилен-20-спирокс-4-ен-3,21-дион и 1,2-дегидроаналог каждого из этих соединений,

9а,11 а-эпокси-7 а-метоксикарбонил-17 в-гидрокси-3 -оксопрегн-4-ен-21-карбоновая кислота, 9а,11 а-эпокси-7 а-этоксикарбонил-17 в-гидрокси-3 -оксопрегн-4-ен-21-карбоновая кислота, 9а,11а-эпокси-7а-изопропоксикарбонил-17в-гидрокси-3-оксопрегн-4-ен-21-карбоновая кислота, 9а,11 а-эпокси-17 в-гидрокси-6а,7 а-метилен-3-оксопрегн-4-ен-21 -карбоновая кислота, 9а,11 а-эпокси-17в-гидрокси-6в,7 в-метилен-3 -оксопрегн-4-ен-21-карбоновая кислота, 9а,11а-эпокси-17в-гидрокси-6в,7в;15в,16в-бис-метилен-3-оксопрегн-4-ен-21-карбоновая кислота и соли щелочных металлов, прежде всего калиевая соль или аммониевая соль каждой из этих кислот, а также соответствующий 1,2-дегидроаналог каждой из упомянутых карбоновых кислот и их солей, метиловый эфир, этиловый эфир и изопропиловый эфир 9а,11а-эпокси-15в,16в-метилен-3,21диоксо-20-спирокс-4-ен-7а-карбоновой кислоты, метиловый эфир, этиловый эфир и изопропиловый эфир 9а,11а-эпокси-15в,16в-метилен-3,21диоксо-20-спирокса-1,4-диен-7а-карбоновой кислоты, метиловый эфир, этиловый эфир и изопропиловый эфир 9а,11а-эпокси-3-оксо-20-спирокс-4-ен-7акарбоновой кислоты,

9а,11 а-эпокси-6в,7 в-метилен-20-спирокс-4-ен-3-он, 9а,11а-эпокси-6в,7в;15в,16в-бис-метилен-20-спирокс-4-ен-3-он, а также метиловый эфир, этиловый эфир и изопропиловый эфир 9а,11а-эпокси-17в-гидрокси-17а(3-гидроксипропил)-3-оксоандрост-4-ен-7а-карбоновой кислоты,

9а,11а-эпокси-17в-гидрокси-17а-(3-гидроксипропил)-6а,7а-метиленандрост-4-ен-3-он, 9а,11а-эпокси-17в-гидрокси-17а-(3-гидроксипропил)-6в,7в-метиленандрост-4-ен-3-он, 9а,11а-эпокси-17в-гидрокси-17а-(3-гидроксипропил)-6в,7в;15в,16в-бис-метиленандрост-4-ен-3он, включая 17а-3-ацетоксипропиловые и 17а-3-формилоксипропиловые аналоги упомянутых андростановых соединений, а также 1,2-дегидроаналоги всех упомянутых соединений андрост-4-ен-3-онового и 20-спирокс-4-ен-3-онового рядов.

Химические названия соединений формул I и ΙΑ и аналогичных соединений, обладающих аналогичными характерными структурными отличиями, образуют в соответствии с современной номенклатурой следующим образом:

в случае соединений, у которых Υ¹ совместно с Υ² обозначает -0-, образуют от названия 20-спироксана (так, например, соединение формулы ΙΑ, у которого X обозначает оксогруппу, а Υ¹ совместно с Υ² обозначает -0-, дериватизируют из 20-спироксан-21-она);

в случае соединений, у которых Υ¹ и Υ², каждый, обозначает гидроксил, а X обозначает оксогруппу, образуют от названия 17в-гидрокси-17а-прегнен-21-карбоновой кислоты;

в случае соединений, у которых Υ¹ и Υ², каждый, обозначает гидроксил, а X обозначает два водородных атома, образуют от названия 17в-гидрокси-17а-(3-гидроксипропил)андростана.

Поскольку циклические формы и формы с разомкнутыми циклами, т.е. соответственно лактоны и 17в-гидрокси-21-карбоновые кислоты, а также их соли, настолько родственны между собой, что эти последние можно рассматривать просто как гидратированные формы этих первых, все упомянутые формы, идет ли речь о конечных продуктах формулы Ι или об исходных материалах и промежуточных продуктах

- 9 009176 аналогичного строения, в каждом случае, если конкретно не указано иное, как в предыдущей части настоящего описания, так и в дальнейшем необходимо воспринимать в совокупности.

В соответствии с изобретением для получения соединений формулы Ι с высоким выходом продукта при приемлемой себестоимости было разработано несколько самостоятельных технологических схем. Осуществление каждой из этих схем синтеза включает получение ряда промежуточных продуктов. Некоторые из этих промежуточных продуктов являются новыми соединениями, а способы получения этих полупродуктов являются новыми способами.

Схема 1 (с использованием в качестве сырья канренона или родственного вещества)

Согласно одной из предпочтительных технологических схем получения соединений формулы Ι процесс целесообразно начинать с канренона или родственного исходного вещества формулы ΧΙΙΙ

XIII в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, (низш.)алкил, (низш.)алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу,

-В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу

/ сн-------сн

I I —сн — сн_г—сн—

III где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, (низш.)алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу и

К⁸ и К⁹ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, (низш.)алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, или

К⁸ и К⁹ совместно образуют карбоциклическую или гетероциклическую кольцевую структуру, или

К⁸ либо К⁹ совместно с К⁶ или с К⁷ образуют карбоциклическую или гетероциклическую кольцевую структуру, конденсированную с пентациклическим О-кольцом.

С помощью способа биоконверсии такого типа, как проиллюстрированный на фиг. 1 и 2, в соединение формулы ΧΙΙΙ вводят 11-гидроксигруппу с α-ориентацией, получая таким образом соединение формулы νΙΙΙ

VIII где значения -А-А-, -В-В-, К³, К⁸ и К⁹ указаны выше.

В предпочтительном варианте соединение формулы ΧΙΙΙ соответствует структуре

ΧΙΙΙΑ

- 10 009176

в каждой из которых -А-А- обозначает группу -СН₂-СН₂- или -СН=СН-,

-В-В- обозначает группу -СН₂-СН₂- либо α- или β-ориентированную группу 1

ΠΙΑ ί .

— сн — сн_г—сн—

X обозначает два водородных атома, оксогруппу или =8,

Υ¹ и Υ² совместно обозначают кислородный мостик -О- или

Υ¹ обозначает гидроксил и

Υ² обозначает гидроксил, (низш.)алкоксигруппу или, если X обозначает Н₂, (низш.) алканоилоксигруппу, соли таких соединений, у которых X обозначает оксогруппу, а Υ² обозначает гидроксил, а соединение формулы У111, полученное в результате такой реакции, соответствует формуле У111А

где -А-А-, -В-В-, Υ¹, Υ² и X имеют значения, указанные для формулы Х111А.

В более предпочтительном варианте К⁸ и К⁹ совместно образуют 20-спироксановую структуру

где -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-, а К³ обозначает водород.

Предпочтительные микроорганизмы, которые можно использовать на этой стадии гидроксилирования, включают

АзрегдШиз осЬтасеиз \1К1К1, 405,

АзрегдШиз осЬтасеиз АТСС 18500,

АзрегдШиз шдег АТСС 16888 и АТСС 26693,

АзрегдШиз 1ш1и1апз АТСС 11267,

1К1пхориз огухае АТСС 11145,

1К1пхориз з!о1ош£ег АТСС 6227Ъ,

81гер1отусез ГгасЬае АТСС 10745,

Вас11из те§а1епит АТСС 14945,

Рзеийотопаз сгисМае АТСС 13262 и

ТпсЬо1Ьесшт гозеит АТСС 12543.

Другие предпочтительные организмы включают Еизагшт охузрогит ί. зр. серае АТСС 11171 и 1К1пхориз а1т1пхиз АТСС 11145.

Помимо перечисленных, группа организмов, которые проявляют действие в отношении этой реакции, включает

АЬзкЬа соеги1а АТСС 6647,

АЬзкЬа Эанса АТСС 22752,

Асйпотисог е1едапз АТСС 6476,

АзрегдШиз Пасарез АТСС 1030,

АзрегдШиз 1нт1§а1из АТСС 26934,

Веаиуепа Ъазз1апа АТСС 7159 и АТСС 13144,

ВойуозрЬаепа оЫиза ΙΜΙ 038560,

Са1опес1ла йесога АТСС 14767,

СЬае1отшт сосЫюйез АТСС 10195,

Согупезрога саззнсо1а АТСС 16718,

Сиппт§Ьате11а Ыакез1ееапа АТСС 8688а,

Сиппт§Ьате11а есВ1ыи1а1а АТСС 3655,

Сиппт§Ьате11а е1едапз АТСС 9245,

- 11 009176

Сигуи1апа οΐαναΐα АТСС 22921,

Сшлтбапа 1ииа1а АТСС 12071,

Субибгосатрои габ1С1со1а АТСС 11011,

Ерюосеит йиш1со1а АТСС 12722,

СопдгопсПа Ьи11ег1 АТСС 22822,

Нурошусек сйтукокретшик,

Мотбете11а 1каЬе11та АТСС 42613,

Мисог шисебо АТСС 4605,

Мисог дпкео-суапик АТСС 1207А,

МугоЖесшш уеггисапа АТСС 9095,

Ыосагб1а согаШпа,

Раесбошусек сагпеик АТСС 46579,

РешсШиш ра!и1иш АТСС 24550,

Рййошусек айо-оШасеик ЖО 6651,

Рййошусек супобопйк АТСС 26150,

Руспокротшш кр. АТСС 12231,

8ассйаторо1укрога егуШгае АТСС 11635, 8еребошиш сйтукокретшиш АТСС 13378, 81асйу11бшш Ысо1ог АТСС 12672, 81гер1ошусек йудгоксоркик АТСС 27438, 81гер1ошусек ригригаксепк АТСС 25489, 8упсер11а1ак1гшп гасешокиш АТСС 18192, ТйашпокЩиш ртГотше АТСС 8992, Т1ие1а\та 1егпсо1а АТСС 13807 и УетйсШшш ЖеоЬтошае АТСС 12474.

Кроме того, проявление действия в отношении 11а-гидроксилирования можно ожидать от микроорганизмов, к которым относятся

Серйа1окротшш арЫб1со1а [Рйуΐосйет^кΐ^у (1996), 42 (2), 411-415],

Сосй1юЬо1ик 1ипа1ак [I. Вю1ес1'то1. (1995), 42 (2), 145-150],

Т1ед1еше11а отсЫб1к [КЫш.-Еатш. Ζ1. (1986), 20 (7), 871-876],

Т1ед1еше11а 1уа1окрога [КЫш.Еатш. Ζ1. (1986), 20 (7), 871-876],

Мопокротшш оЩасеиш |Ас1а МютоЬю1. Ро1., 8ет. В. (1973), (5) 2, 103-110],

АкретдШик ик!ик |Ас1а МютоЬю1. Ро1., 8ет. В. (1973), (5) 2, 103-110],

Еикапиш дташтеатиш (Ас!а М1стоЬю1. Ро1., 8ет. В. (1973), (5)2, 103-110], УетйсШшш д1аисиш [Ас1аМ1сгоЬю1. Ро1., 8ет. В. (1973), (5)2, 103-110] и ВЫхорик пщпсапк [I. 81егснб Вюсйеш. (1987), 28 (2), 197-201].

Перед началом ферментации в производственном масштабе с целью гидроксилирования канренона или других субстратов формулы ХШ в ферментационной системе для выращивания посевного материала, включающей ферментер для выращивания посевного материала или ряд из двух или большего числа таких ферментеров, готовят инокулят. В первый ферментер для выращивания посевного материала совместно с питательным раствором для выращивания клеток вводят суспензию спор рабочего экземпляра культуры. Если необходимый для процесса объем инокулята превышает тот, который получают в первом ферментере для выращивания посевного материала, этот объем можно постепенно и в геометрической прогрессии увеличить последовательным проведением процесса в остальных ферментерах линии наработки посевного материала. В предпочтительном варианте инокулят, получаемый в ферментационной системе для выращивания посевного материала, представляет собой массу жизнеспособных клеток, достаточную для достижения быстрого инициирования реакции в рабочем ферментере, относительно коротких циклов периодического процесса и высокой рабочей эффективности ферментера.

Независимо от числа сосудов в цепи ферментеров для выращивания посевного материала в предпочтительном варианте размеры второго и последующих ферментеров должны быть такими, чтобы степень разбавления на каждом этапе этой линии была практически одинаковой. Начальная степень разбавления инокулята в каждом ферментере для выращивания посевного материала может быть приблизительно такой же, как и степень разбавления в рабочем ферментере. В рабочий ферментер совместно с инокулятом и питательным раствором загружают канренон или другой субстрат формулы ХШ и проводят в нем реакцию гидроксилирования.

Суспензию спор, загружаемую в ферментационную систему для выращивания посевного материала, извлекают из содержащей суспензию спор рабочего экземпляра культуры пробирки, взятой из множества пробирок, которые образуют банк клеток рабочих экземпляров культур и которые до применения хранят в криогенных условиях. В свою очередь банк клеток рабочих экземпляров культур получают из банка клеток штамма хозяина, который готовят следующим образом. Образец спор, полученный из соответствующего источника, например из Американской коллекции типовых культур, вначале суспендируют в водной среде, например, такой, как солевой раствор, питательный раствор или раствор поверхност

- 12 009176 но-активного вещества (в частности, неионогенного поверхностно-активного вещества, такого, как продукт Твин 20, в концентрации приблизительно 0,001 мас.%), и эту суспензию распределяют по культуральным чашкам, в каждой из которых содержится твердая питательная смесь, как правило, на основе неусвояемого полисахарида, такого, как агар, на которой споры размножаются. Предпочтительная твердая питательная смесь включает примерно от 0,5 до примерно 5 мас.% глюкозы, примерно от 0,05 до примерно 5 мас.% источника азота, например пептона, примерно от 0,05 до примерно 0,5 мас.% источника фосфора, например фосфата аммония или щелочного металла, такого, как вторичный кислый фосфат калия, примерно от 0,25 до примерно 2,5 мас.% лизата дрожжевых клеток или дрожжевого экстракта (или другого источника аминокислот, такого, как мясной экстракт или вытяжка из вещества срединного головного мозга), примерно от 1 до примерно 2 мас.% агара или другого неусвояемого полисахарида. Твердая питательная смесь может, но необязательно, далее включать и/или содержать примерно от 0,1 до примерно 5 мас.% солодового экстракта. Предпочтительные значения рН твердой питательной смеси, которые доводят до необходимого уровня добавлением гидроксида щелочного металла или ортофосфорной кислоты, находятся примерно от 5 до примерно 7. Для выращивания могут быть использованы, помимо прочих, следующие твердые среды.

1. Твердая среда № 1: 1% глюкозы, 0,25% дрожжевого экстракта, 0,3% К₂НРО₄ и 2% агара (фирмы Вас1о); рН доводят до 6,5 добавлением 20% ЫаОН.

2. Твердая среда № 2: 2% пептона (фирмы Вас1о), 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы и 2% агара (фирмы Вас1о); рН доводят до 5 добавлением 10% Н₃РО₄.

3. Твердая среда № 2: 0,1% пептона (фирмы Вас1о), 2% солодового экстракта (фирмы Вас1о), 2% глюкозы и 2% агара (фирмы Вас1о); значение рН составляет 5,3.

4. Жидкая среда: 5% тростниковой мелассы, 0,5% кукурузного экстракта, 0,25% глюкозы, 0,25% ЫаС1 и 0,5% КН₂РО₄; рН доводят до 5,8.

5. Микологический агар ЭНсо (с низким значением рН).

Число агаровых чашек, используемых для создания банка клеток штамма хозяина, можно выбирать с учетом будущих потребностей в клетках штамма хозяина, но, как правило, таким путем готовят примерно от 15 до примерно 30 чашек. По прошествии приемлемого периода роста, например 7-10 дней, чашки освобождают выскабливанием в присутствии водного носителя, как правило, солевого или буферного раствора, собирая выращенные споры, и получаемую суспензию клеток штамма хозяина разделяют по маленьким пробиркам, например по 1 мл в каждой из множества 1,5-миллилитровых пробирок. С целью приготовить суспензию спор рабочего экземпляра культуры для использования в исследованиях или технологических процессах ферментации содержимое одной или нескольких из этих пробирок со спорами штамма хозяина второго поколения можно распределить между агаровыми чашками и инкубировать согласно тому, как это описано для приготовления суспензии клеток штамма хозяина. Когда планируют проведение обычных технологических процессов, для получения рабочего экземпляра культуры второго поколения может быть использовано 100-400 чашек. Содержимое каждой чашки выскабливают в отдельную пробирку с рабочим экземпляром культуры, причем каждая пробирка, как правило, содержит 1 мл полученного инокулята. При постоянной консервации как суспензию клеток штамма хозяина, так и рабочий инокулят второго поколения целесообразно хранить в паровом пространстве криогенного сосуда, содержащего жидкий Ν₂ или другую криогенную жидкость.

При осуществлении способа, проиллюстрированного на фиг. 1, готовят водную среду для выращивания, которая включает источник азота, такой, как пептон, дрожжевой продукт или эквивалент, глюкозу и источник фосфора, такой, как фосфатная соль. В такой среде в системе для выращивания посевного материала культивируют споры микроорганизма. Предпочтительным микроорганизмом является АкретдШик осйтасеик ЫККЬ 405 (АТСС 18500). Далее полученный таким образом расходный посевной материал совместно с субстратом формулы XIII вводят в рабочий ферментер. Культуральную жидкость перемешивают и аэрируют в течение времени, достаточного для достижения необходимой степени завершения реакции.

Предпочтительная среда, вводимая в ферментер для выращивания посевного материала, представляет собой водную смесь, которая включает примерно от 0,5 до примерно 5 мас.% глюкозы, примерно от 0,05 до примерно 5 мас.% источника азота, например пептона, примерно от 0,05 до примерно 0,5 мас.% источника фосфора, например фосфата аммония или щелочного металла, такого, как первичный кислый фосфат аммония или вторичный кислый фосфат калия, примерно от 0,25 до примерно 2,5 мас.% лизата дрожжевых клеток или дрожжевого экстракта (или другого источника аминокислот, такого, как барда), примерно от 1 до примерно 2 мас.% агара или другого неусвояемого полисахарида.

Особенно предпочтительная среда для выращивания посевного материала включает примерно от 0,05 до примерно 5 мас.% источника азота, такого, как пептон, примерно от 0,25 до примерно 2,5 мас.% дрожжевого автолизата или дрожжевого экстракта, примерно от 0,5 до примерно 5 мас.% глюкозы и примерно от 0,05 до примерно 0,5 мас.% источника фосфора, такого, как первичный кислый фосфат аммония. Особенно экономически выгодные технологические процессы проводят с использованием другой предпочтительной посевной культуры, которая включает от 0,5 до примерно 5 мас.% кукурузного экстракта, примерно от 0,25 до примерно 2,5 мас.% дрожжевого автолизата или дрожжевого экстракта, при

- 13 009176 мерно от 0,5 до примерно 5 мас.% глюкозы и примерно от 0,05 до примерно 0,5 мас.% первичного кислого фосфата аммония.

Кукурузный экстракт является особенно экономичным источником белков, пептидов, углеводородов, органических кислот, витаминов, ионов металлов, микроэлементов и фосфатов. Вместо кукурузного экстракта или в дополнение к нему могут быть использованы сусла из других злаковых культур. В предпочтительном варианте значение рН среды поддерживают примерно от 5 до примерно 7, например, добавлением гидроксида щелочного металла или ортофосфорной кислоты. Когда источником азота и углерода служит кукурузный экстракт, рН предпочтительно доводить до интервала примерно от 6,2 до примерно 6,8. Значения рН среды, содержащей пептон и глюкозу, предпочтительно поддерживать примерно от 5,4 до примерно 6,2. Для наработки посевного материала могут быть использованы, помимо прочих, следующие среды.

1. Среда № 1: 2% пептона, 2% дрожжевого автолизата (или дрожжевого экстракта) и 2% глюкозы; рН доводят до 5,8 добавлением 20% ЫаОН.

2. Среда № 2: 3% кукурузного экстракта, 1,5% дрожжевого экстракта, 0,3% первичного кислого фосфата аммония и 3% глюкозы; рН доводят до 6,5 добавлением 20% ЫаОН.

Споры микроорганизма вводят в эту среду из пробирки, содержащей, как правило, примерно 10⁹ спор на 1 мл суспензии. Оптимальной продуктивности поколения семенного материала достигают тогда, когда начальное разбавление посевной культуры средой для выращивания не уменьшает плотности популяции спор до уровня ниже приблизительно 10⁷/мл. В предпочтительном варианте споры культивируют в системе для наработки посевного материала до тех пор, пока объем уплотненных мицелиев (ОУМ) в ферментере для выращивания посевного материала не достигнет по меньшей мере 20%, предпочтительно 35-45%. Поскольку цикл в сосуде ферментера для наработки посевного материала (или любом сосуде из множества, которое включает линия ферментеров для наработки посевного материала) зависит от начальной концентрации в этом сосуде, для ускорения процесса в целом может возникнуть необходимость в осуществлении двух или трех стадий наработки посевного материала. Однако предпочитают избегать применения значительно больше трех последовательно установленных ферментеров для наработки посевного материала, поскольку в случае, если наработку посевного материала осуществляют чрезмерным числом стадий, это может негативно сказаться на активности. Наработку посевной культуры проводят с перемешиванием при температуре примерно от 23 до примерно 37°С, предпочтительно примерно от 24 до примерно 28°С.

Культуру из системы для наработки посевного материала вводят в рабочий ферментер вместе с рабочей средой для выращивания. В одном из вариантов выполнения изобретения в качестве субстрата для реакции служит канренон или другой субстрат формулы XIII. В предпочтительном варианте субстрат вводят в рабочий ферментер в форме суспензии концентрацией 10-30 мас.% в среде для выращивания. Для увеличения площади поверхности, доступной для реакции 11а-гидроксилирования, перед вводом в ферментер уменьшают размеры частиц субстрата формулы XIII пропусканием через микронную коллоидную мельницу, установленную вне технологической линии. Также раздельно вводят стерильную исходную питательную среду, содержащую глюкозу, и второй стерильный питательный раствор, содержащий дрожжевой продукт, такой, как дрожжевой автолизат (или эквивалентную аминокислотную композицию на основе других источников, таких, как барда).

Эта среда представляет собой водную смесь, включающую примерно от 0,5 до примерно 5 мас.% глюкозы, примерно от 0,05 до примерно 5 мас.% источника азота, например пептона, примерно от 0,05 до примерно 0,5 мас.% источника фосфора, например фосфата аммония или щелочного металла, такого, как вторичный кислый фосфат калия, примерно от 0,25 до примерно 2,5 мас.% лизата дрожжевых клеток или дрожжевого экстракта (или другого источника аминокислот, такого, как барда), примерно от 1 до примерно 2 мас.% агара или другого неусвояемого полисахарида. Особенно предпочтительная рабочая среда для выращивания включает примерно от 0,05 до примерно 5 мас.% источника азота, такого, как пептон, примерно от 0,25 до примерно 2,5 мас.% дрожжевого автолизата или дрожжевого экстракта, примерно от 0,5 до примерно 5 мас.% глюкозы и примерно от 0,05 до примерно 0,5 мас.% источника фосфора, такого, как первичный кислый фосфат аммония.

Другая предпочтительная рабочая среда включает примерно от 0,5 до примерно 5 мас.% кукурузного экстракта, примерно от 0,25 до примерно 2,5 мас.% дрожжевого автолизата или дрожжевого экстракта, примерно от 0,5 до примерно 5 мас.% глюкозы и примерно от 0,05 до примерно 0,5 мас.% первичного кислого фосфата аммония. В предпочтительном варианте рН рабочей ферментационной среды регулируют таким образом, как это описано выше в отношении среды для наработки посевного материала с теми же предпочтительными интервалами значений рН в случае соответственно среды на основе пептона/глюкозы и среды на основе кукурузного экстракта. Ниже представлены среды для выращивания, которые могут быть использованы при биоконверсии.

1. Среда № 1: 2% пептона, 2% дрожжевого автолизата (или дрожжевого экстракта) и 2% глюкозы; рН доводят до 5,8 добавлением 20% ЫаОН.

2. Среда № 2: 1% пептона, 1% дрожжевого автолизата (или дрожжевого экстракта) и 2% глюкозы;

- 14 009176 рН доводят до 5,8 добавлением 20% ΝαΟΗ.

3. Среда № 3: 0,5% пептона, 0,5% дрожжевого автолизата (или дрожжевого экстракта) и 0,5% глюкозы; рН доводят до 5,8 добавлением 20% ΝαΟΗ.

4. Среда № 4: 3% кукурузного экстракта, 1,5% дрожжевого экстракта, 0,3% первичного кислого фосфата аммония и 3% глюкозы; рН доводят до 6,5 добавлением 20% ΝαΟΗ.

5. Среда № 5: 2,55% кукурузного экстракта, 1,275% дрожжевого экстракта, 0,255% первичного кислого фосфата аммония и 3% глюкозы; рН доводят до 6,5 добавлением 20% ЫаОН.

6. Среда № 6: 2,1% кукурузного экстракта, 1,05% дрожжевого экстракта, 0,21% первичного кислого фосфата аммония и 3% глюкозы; рН доводят до 6,5 добавлением 20% ЫаОН.

На протяжении всего цикла периодического процесса получения нестерильный канренон и стерильные питательные растворы поэтапно вводят в рабочий ферментер в соотношении 5:20, предпочтительно 10:15, более предпочтительно в практически равных количествах. Перед инокуляцией среды для наработки посевного материала субстрат целесообразно вначале вводить в количестве, достаточном для достижения концентрации примерно от 0,1 до примерно 3 мас.%, предпочтительно примерно от 0,5 до примерно 2 мас.%, а затем добавлять периодически, удобно каждые 8-24 ч, до достижения совокупного количества примерно от 1 до примерно 8 мас.%.

Когда дополнительные количества субстрата вводят по прошествии каждых 8 ч, общее добавляемое количество может быть несколько меньше, например 0,25-2,5 мас.%, чем в случае, когда субстрат вводят в режиме ежедневной одноразовой добавки. В этом последнем случае может оказаться необходимой совокупная добавка канренона в интервале от 2 до примерно 8 мас.%. В предпочтительном варианте в качестве добавляемой питательной смеси, вводимой во время ферментационной реакции, используют концентрат, например смесь, включающую примерно от 40 до примерно 60 мас.%, стерильной глюкозы и примерно от 16 до примерно 32 мас.% стерильного дрожжевого экстракта или другого стерильного источника дрожжевого продукта (или другого источника аминокислот). Поскольку субстрат, вводимый в показанный на фиг. 1 рабочий ферментер, оказывается нестерильным, для предотвращения роста нежелательных микроорганизмов в ферментационный бульон периодически добавляют антибиотики. Без нежелательного влияния на рост культуры и биоконверсию можно добавлять такие антибиотики, как канамицин, тетрациклин и цефалексин. В предпочтительном варианте их вводят в ферментационный бульон в концентрации, находящейся, например, примерно от 0,0004 до примерно 0,002% в пересчете на общее количество бульона, включая, в частности, в примерно от 0,0002 до примерно 0,0006% канамицинсульфата, примерно от 0,0002 до примерно 0,006% тетрациклингидрохлорида и/или примерно от 0,001 до примерно 0,003% цефалексина также в пересчете на общее количество бульона.

Длительность рабочего цикла периодического процесса ферментации, как правило, составляет приблизительно 80-160 ч. Таким образом, порции как субстрата формулы XIII, так и питательных растворов, как правило, добавляют каждые 2-10 ч, предпочтительно каждые 4-6 ч. В систему наработки посевного материала и в рабочий ферментер целесообразно также вводить пеногаситель.

В предпочтительном варианте осуществления способа, представленного на фиг. 1, количество инокулята, вводимого в рабочий ферментер, составляет примерно от 0,5 до примерно 7 об.%, более предпочтительно примерно от 1 до примерно 2 об.%, в пересчете на общий объем смеси в ферментере, а концентрацию глюкозы поддерживают примерно от 0,01 до примерно 1,0 мас.%, предпочтительнее примерно от 0,025 до примерно 0,5 мас.%, более предпочтительно примерно от 0,05 до примерно 0,25 мас.%, при периодическом введении добавок, которые предпочтительно составляют примерно от 0,05 до примерно 0,25 мас.% в пересчете на общее количество загружаемого для рабочего цикла материала.

Температуру во время ферментации целесообразно регулировать в интервале примерно от 20 до примерно 37°С, предпочтительно примерно от 24 до примерно 28°С, но во время реакции с целью поддержать объем уплотненных мицелиев (ОУМ) на уровне менее приблизительно 60%, более предпочтительно менее примерно 50%, и таким путем избежать ситуации, когда вязкость ферментационного бульона препятствует удовлетворительному перемешиванию, может возникнуть необходимость снижать температуру, например, ступенчато по 2°С.

Если растущая биомасса выступает над поверхностью жидкости, остающийся в этой биомассе субстрат может выйти из реакционной зоны и становится недоступным для реакции гидроксилирования. В первые 24 ч ферментационной реакции для оптимальной производительности необходимо добиться ОУМ в интервале 30-50%, предпочтительно 35-45%, но в дальнейшем условия предпочтительно регулируют таким образом, чтобы удержать дальнейший рост в вышеуказанных пределах. Во время реакции рН ферментационной среды поддерживают примерно от 5,0 до примерно 6,5, предпочтительно примерно от 5,2 до примерно 5,8 и перемешивание в ферментере осуществляют при скорости вращения примерно от 400 до примерно 800 об/мин. Содержания растворенного кислорода по меньшей мере приблизительно 10% от концентрации насыщения достигают аэрацией загруженной массы примерно от 0,2 до примерно 1,0 об./об.-мин, поддерживая избыточное давление в пространстве ферментера над жидкостью от приблизительно атмосферного до примерно 1,0 бар, наиболее предпочтительно примерно 0,7 бар. При необходимости поддержать минимальное количество растворенного кислорода можно также увеличить ско

- 15 009176 рость перемешивания. Для ускорения конверсии субстрата содержание растворенного кислорода целесообразно поддерживать на уровне существенно выше 10%, а фактически оно достигает 50%. Для биоконверсии оптимальным является также поддержание рН на уровне 5,5±0,2. Пенообразование регулируют по мере необходимости добавлением обычного пеногасителя. После введения всего субстрата в предпочтительном варианте реакцию продолжают до тех пор, пока молярное соотношение между продуктом формулы VIII и оставшимся, непрореагировавшим субстратом формулы XIII не достигнет по меньшей мере приблизительно 9:1. Такой конверсии можно достичь в течение указанного выше 80-160-часового цикла периодического процесса.

Было установлено, что высокая степень конверсии связана со снижением начального содержания питательных веществ до уровня, который ниже содержания в первоначально загруженной массе, а также с регулированием степени аэрации и скорости перемешивания таким образом, чтобы избежать выплескивания субстрата из жидкой питательной среды. При осуществлении способа, представленного на фиг. 1, после снижения содержания питательных веществ его поддерживают на уровне, который не превышает приблизительно 60%, предпочтительно примерно 50% от содержания в первоначально загруженной массе, тогда как в способах, представленных на фиг. 2 и 3, после снижения содержания питательных веществ его поддерживают на уровне, который не превышает приблизительно 80%, предпочтительно примерно 70% от содержания в первоначально загруженной массе. Предпочтительная степень аэрации не превышает одного объема на объем в минуту, более предпочтительно находится на уровне приблизительно 0,5 об./об.-мин, тогда как предпочтительная скорость вращения при перемешивании не превышает 600 об/мин.

Особенно предпочтительный способ получения соединения формулы VIII проиллюстрирован на фиг. 2. Предпочтительным микроорганизмом также является ЛкрегдШик осйгасеик ΝΚΚΒ 405 (АТСС 18500). При осуществлении этого способа предпочтительная среда для выращивания включает примерно от 0,5 до примерно 5 мас.% кукурузного экстракта, примерно от 0,5 до примерно 5 мас.% глюкозы, примерно от 0,1 до примерно 3 мас.% дрожжевого экстракта и примерно от 0,05 до примерно 0,5 мас.% фосфата аммония. Однако можно также использовать и другие рабочие среды для выращивания, которые представлены в настоящем описании. Посевную культуру готовят, по существу, так, как это изложено в описании способа, показанного на фиг. 1, используя любую среду для наработки посевного материала, представленную в настоящем описании. Суспензию канренона, не обработанного в микронной коллоидной мельнице, или другого субстрата формулы XIII в среде для выращивания готовят в асептических условиях в смесителе, предпочтительно при относительно высокой концентрации субстрата, находящейся примерно от 10 до примерно 30 мас.%. В предпочтительном варианте процесс приготовления в асептических условиях может включать стерилизацию или пастеризацию суспензии после смешения. Все количество стерильной суспензии субстрата, необходимое для периодического процесса получения, вводят в рабочий ферментер в начале процесса или периодическим поэтапным добавлением. Размер частиц субстрата уменьшают мокрым помолом в установленном на технологической линии насосе, который работает с высоким усилием сдвига и служит для подачи суспензии в рабочий ферментер, что позволяет, тем самым, исключить необходимость в применении установленной вне технологической линии микронной коллоидной мельницы. В тех случаях, когда асептические условия обеспечиваются не стерилизацией, а пастеризацией, степень агломерации может быть незначительной, но для позитивного контроля размеров частиц может оказаться необходимой помощь насоса, работающего с высоким сдвигом. Стерильную среду для выращивания и раствор глюкозы вводят в рабочий ферментер практически аналогично тому, как это изложено выше. Перед вводом все компоненты, подаваемые в рабочий ферментер, стерилизуют, исключая таким образом необходимость в использовании антибиотиков.

В предпочтительном варианте при осуществлении способа, представленного на фиг. 2, инокулят вводят в рабочий ферментер в количестве, находящемся примерно от 0,5 до примерно 7%, ферментационная температура находится примерно от 20 до примерно 37°С, предпочтительно примерно от 24 до примерно 28°С, а рН регулируют примерно от 4,4 до примерно 6,5, предпочтительно примерно от 5,3 до примерно 5,5, например, введением газообразного аммиака, водного гидроксида аммония, водного гидроксида щелочного металла или ортофосфорной кислоты.

Касательно способа, представленного на фиг. 1, следует отметить, что в предпочтительном варианте для регулирования роста биомассы таким образом, чтобы ОУМ не превышал 55-60%, контролируют температуру. Предпочтительное начальное содержание вводимой глюкозы находится примерно от 1 до примерно 4 мас.%, наиболее предпочтительно 2,5-3,5 мас.%, но в предпочтительном варианте во время ферментации содержанию позволяют медленно опускаться до уровня ниже примерно 1,0 мас.%. Дополнительное количество глюкозы вводят периодически в виде порций примерно от 0,2 до примерно 1,0 мас.% в пересчете на общее количество загружаемой массы с тем, чтобы поддержать концентрацию глюкозы в зоне ферментации в интервале примерно от 0,1 до примерно 1,5 мас.%, предпочтительно примерно от 0,25 до примерно 0,5 мас.%.

Совместно с глюкозой можно, но необязательно, вводить источники азота и фосфора. Однако, поскольку все количество канренона загружают в начале периодического процесса, в то же самое время

- 16 009176 можно также вводить требуемое количество питательных веществ, содержащих азот и фосфор, что по мере протекания реакции позволяет использовать для добавок только раствор глюкозы. Скорость и тип перемешивания могут существенно варьироваться. Массоперенос между твердым субстратом и водной фазой при умеренно интенсивном перемешивании ускоряется. Однако с целью предотвратить разрушение миелина микроорганизмов следует применять мешалку с низкой степенью сдвига. В зависимости от вязкости культуральной жидкости, содержания кислорода и условий перемешивания, которые определяются типом сосуда, конфигурацией лопаток и вращающейся мешалки, оптимальную скорость вращения мешалки варьируют в интервале 200-800 об/мин. Обычно предпочтительная скорость вращения мешалки находится в интервале 350-600 об/мин. В предпочтительном варианте вращающаяся мешалка обеспечивает перекачивание массы в осевом направлении сверху вниз, что способствует хорошему перемешиванию ферментированной биомассы. В предпочтительном варианте массу аэрируют со степенью аэрации примерно от 0,3 до примерно 1,0 об./об.-мин, предпочтительно 0,4-0,8 об./об.-мин, а избыточное давление в пространстве над жидкостью в ферментере находится примерно от 0,5 до примерно 1,0 бар. В предпочтительном варианте температуру, режим перемешивания и аэрации и обратное давление регулируют таким образом, чтобы поддержать во время биоконверсии концентрацию растворенного кислорода на уровне по меньшей мере приблизительно 10 об.%, продолжительность периодического процесса, как правило, находится примерно от 100 до примерно 140 ч.

Хотя принцип осуществления способа, представленного на фиг. 2, основан на раннем введении практически всего количества канренона, очевидно, что процесс роста в культуральной жидкости можно проводить до загрузки основной массы канренона. Определенную порцию канренона можно также, но необязательно, добавлять в рабочую массу позднее. Однако в рабочий ферментер в течение 48 ч после инициирования ферментации обычно следует вводить по меньшей мере приблизительно 75% стерильного канренона. Более того, для ускорения продуцирования фермента (ферментов) для биоконверсии по крайней мере примерно 25 мас.% канренона необходимо вводить в начале ферментации или по меньшей мере в течение первых 24 ч.

В другом предпочтительном способе, который проиллюстрирован на фиг. 3, всю загружаемую массу и питательный раствор стерилизуют в рабочем ферментационном сосуде до введения инокулята. Питательные растворы, которые можно использовать, а также предпочтительные среди них, по существу, соответствуют таковым, которые описаны для способа, представленного на фиг. 2. В данном варианте выполнения изобретения сдвиговое действие вращающейся мешалки разрушает агломераты частиц субстрата, которые в противном случае могут образоваться во время стерилизации. Было установлено, что реакция протекает удовлетворительно, если средний размер частиц канренона составляет менее приблизительно 200 мкм и размер по крайней мере 75 мас.% частиц меньше 240 мкм. Установлено также, что применение приемлемой мешалки, например дисковой турбинной мешалки, при адекватной скорости перемешивания, находящейся в интервале 200-800 об/мин, при линейной скорости вращения наконечника по крайней мере приблизительно 400 см/с обеспечивает достижение такой степени сдвига, которой достаточно для поддержания таких размерных характеристик частиц, несмотря на агломерацию, тенденция к которой наблюдается при стерилизации в рабочем ферментере. Остальную часть способа, представленного на фиг. 3, осуществляют практически так же, как в и способе по фиг. 2. Способы, проиллюстрированные на фиг. 2 и 3, обладают некоторыми явными преимуществами перед способом, представленным на фиг. 1. Особое преимущество состоит в возможности использовать дешевую питательную основу, такую, как кукурузный экстракт. Другие преимущества состоят в том, что устраняется необходимость в использовании антибиотиков, в упрощении операций ввода сырья и в возможности стерилизации в массе канренона или другого субстрата формулы XIII. Еще одним особым преимуществом является возможность по ходу реакционного цикла использовать в качестве добавок простой глюкозный раствор вместо сложного питательного раствора.

При осуществлении способов, проиллюстрированных на фиг. 1-3, продукт формулы VIII представляет собой твердое кристаллическое вещество, которое совместно с биомассой можно отделить от реакционной питательной среды фильтрованием или низкоскоростным центрифугированием. По другому варианту продукт можно экстрагировать из всей реакционной питательной среды органическими растворителями. Продукт формулы VIII выделяют экстракцией растворителями.

Для выделения максимального количества продукта как жидкофазный фильтрат, так и биомассовый фильтровальный пирог или прессованную биомассу из центрифуги экстрагируют растворителем, так как с биомассой обычно связано >95% продукта. Для экстракции, как правило, можно использовать углеводородные, сложноэфирные, хлорированные углеводородные и кетоновые растворители. Предпочтительным растворителем является этилацетат. Другие, как правило, приемлемые растворители включают толуол и метилизобутилкетон. Для экстракции из жидкой фазы может оказаться целесообразным использовать растворитель в объеме, приблизительно равном объему реакционного раствора, с которым его вводят в контакт. Для извлечения продукта из биомассы последнюю суспендируют в растворителе, предпочтительно в большом избытке относительно первоначально загруженного количества субстрата, например 50-100 мл растворителя на 1 г первоначально загруженного количества канренона, и с целью

- 17 009176 обеспечить переход продукта из полостей и пор биомассы в фазу растворителя. Образовавшуюся суспензию в предпочтительном варианте кипятят с обратным холодильником в течение определенного интервала времени, продолжительность которого составляет от 20 мин до нескольких часов. После этого биомассу удаляют фильтрованием или центрифугированием и в предпочтительном варианте фильтровальный пирог промывают как свежим растворителем, так и деионизированной водой. Далее промывные воду и растворитель объединяют и фазам дают разделиться. Продукт формулы VIII из раствора выделяют кристаллизацией. Для достижения максимального выхода мицелий дважды вводят в контакт со свежим растворителем. После отстаивания с целью обеспечить полноту отделения водной фазы продукт выделяют из фазы растворителя. В наиболее предпочтительном варианте растворитель удаляют в вакууме до тех пор, пока не начинается кристаллизация, а затем концентрированный экстракт охлаждают и выдерживают при температуре 0-20°С, предпочтительно примерно от 10 до примерно 15°С в течение времени, достаточного для осаждения и роста кристаллов, как правило в течение 8-12 ч.

Способы, представленные на фиг. 2 и 3, главным образом последний, являются особенно предпочтительными. Эти способы осуществляют при низкой вязкости, а их осуществление дает возможность четко регулировать технологические параметры, такие, как рН, температура и содержание растворенного кислорода. Более того, при этом без помощи антибиотиков упрощается поддержание стерильных условий.

Процесс биоконверсии является экзотермическим, вследствие чего тепло необходимо отводить с помощью рубашки вокруг ферментера или змеевикового холодильника внутри рабочего ферментера. По другому варианту можно предусмотреть циркуляцию реакционной среды через внешний теплообменник. В предпочтительном варианте регулированием расхода вводимого в реактор воздуха в зависимости от данных измерений кислородного потенциала в питательной среде содержание растворенного кислорода поддерживают на уровне по меньшей мере приблизительно 5 об.%, предпочтительнее по крайней мере примерно 10 об.%, что является достаточным для того, чтобы обеспечить энергией реакцию и гарантировать конверсию глюкозы в СО₂ и Н₂О. В предпочтительном варианте рН регулируют примерно от 4,5 до примерно 6,5.

В каждом из альтернативных способов 11-гидроксилирования субстрата формулы XIII производительность ограничивается массопереносом из твердого субстрата в водную фазу или к границе между фазами, где, как полагают, протекает реакция. Как указано выше, производительность существенно не ограничивается скоростью массопереноса в том случае, если средний размер частиц субстрата уменьшают до уровня менее приблизительно 300 мкм, а размер по меньшей мере 75 мас.% частиц составляет менее 240 мкм. Однако при осуществлении этих способов производительность можно еще больше повысить в некоторых альтернативных вариантах, в которых обеспечивается загрузка существенной части канренона или другого субстрата формулы XIII в рабочий ферментер в органическом растворителе. В соответствии с одним из вариантов субстрат растворяют в несмешивающемся с водой растворителе и смешивают с водной фазой, содержащей инокулят и среду для выращивания, и поверхностно-активным веществом. К эффективным не смешивающимся с водой растворителям относятся, например, ДМФ, ДМСО, С₆-С1₂жирные кислоты, С₆-С_!2-н-алканы, растительные масла, сорбитаны и водные растворы поверхностно-активных веществ. При перемешивании этой массы образуется эмульсионная реакционная система, характеризующаяся увеличенной площадью межфазной поверхности для массопереноса субстрата из органической жидкой фазы к реакционным участкам.

Второй вариант состоит в изначальном растворении субстрата в смешивающемся с водой растворителе, таком, как ацетон, метилэтилкетон, метанол, этанол и глицерин, в концентрации, которая существенно превышает его растворимость в воде. При повышенной температуре приготовления исходного раствора субстрата повышается растворимость, благодаря чему еще больше увеличивается вводимое в реактор в форме раствора количество субстрата, и в результате возрастает полезная нагрузка реактора. Этот теплый раствор субстрата загружают в рабочий ферментер вместе с относительно холодной водной массой, содержащей среду для выращивания и инокулят. Когда раствор субстрата смешивают с водной средой, происходит осаждение субстрата. Однако в условиях существенного перенасыщения и умеренно интенсивного перемешивания наблюдается превышение скорости образования зародышей кристаллизации над скоростью роста кристаллов, в результате чего возникают очень тонкодисперсные частицы с высокой удельной площадью поверхности. Высокая удельная площадь поверхности способствует массопереносу между жидкой фазой и твердым субстратом. Более того, в присутствии смешивающегося с водой растворителя увеличивается также равновесная концентрация субстрата в водной жидкой фазе. Следовательно, увеличивается производительность.

Хотя микроорганизм может не обладать необходимой толерантностью к высокой концентрации органического растворителя в водной фазе, этанол можно эффективно использовать, в частности, в концентрации примерно от 3 до примерно 5 мас.%.

Третий вариант состоит в солюбилизации субстрата в водном циклодекстриновом растворе. Примеры циклодекстринов включают включают гидроксипропил-в-циклодекстрин и метил-β-циклодекстрин. Молярное соотношение субстрат/циклодекстрин может составлять примерно от 1:1 до примерно 1:1,5.

- 18 009176

Далее в асептических условиях смесь субстрат/циклодекстрин можно вводить в реактор для биоконверсии.

α-гидроксиканренон и другие продукты, полученные при осуществлении способа 11αгидроксилирования (формул VIII и VША), являются новыми соединениями, которые можно выделять фильтрованием реакционной среды и экстракцией продукта из биомассы, собранной на фильтрующей среде. Для экстракции могут быть использованы обычные органические растворители, например этилацетат, ацетон, толуол, хлорированные углеводороды и метилизобутилкетон. Далее продукт формулы

VIII можно перекристаллизовать из органического растворителя того же типа.

Соединения формулы VIII обладают существенной ценностью как промежуточные продукты для получения соединений формулы I и особенно формулы ТА.

В предпочтительном варианте соединения формулы VIII соответствуют формуле VША, в которой -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-, К³ обозначает водород, (низш.)алкил или (низш.)алкоксигруппу, а К⁸ и К⁹ совместно образуют 20-спироксановое кольцо

XXXIII

Далее в соответствии со способом, который представлен на схеме 1, в щелочных условиях проводят источником цианидного иона с получением енаминового взаимодействие соединения формулы VIII с соединения формулы VII

где -А-А-, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные выше.

В случае, когда субстрат соответствует формуле VША, продукт соответствует формуле VIIА

где -А-А-, -В-В-, К³, Υ¹, Υ² и X имеют значения, указанные для формулы XIII.

Цианирование 11 α-гидроксильного субстрата формулы VIII можно проводить путем взаимодействия с источником цианидного иона, такого, как кетонциангидрин, а наиболее предпочтительно ацетонциангидрина, в присутствии основания и соли щелочного металла, наиболее предпочтительно Ь1С1. По другому варианту цианирование можно осуществлять без циангидрина путем использования цианида щелочного металла в присутствии кислоты.

В варианте способа с кетонциангидрином эту реакцию проводят в растворе предпочтительно с использованием апротонного полярного растворителя, такого, как диметилформамид или диметилсульфоксид. Образование енамина требует по меньшей мере 2 моль источника цианидного иона на 1 моль субстрата, а в предпочтительном варианте источник цианида используют в небольшом избытке. Предпочти тельным основанием является азотное основание, такое, как диалкиламин, триалкиламин, алканоламин, пиридин и т. п. Однако можно также использовать неорганические основания, такие, как карбонаты щелочных металлов и гидроксиды щелочных металлов. В предпочтительном варианте первоначально субстрат формулы VIII содержится в количестве примерно от 20 до примерно 50 мас.%, а основание содержится в количестве примерно от 0,5 до 2 экв. на 1 экв. субстрата. Температура реакции решающего значения не имеет, но проведение процесса при повышенной температуре повышает производительность. Так, например, в случае, когда в качестве основания используют триэтиламин, реакцию целесообразно проводить в интервале примерно от 80 до примерно 90°С. При таких температурах реакция проходит до завершения в течение примерно от 5 до примерно 20 ч. Когда в качестве основания используют диизо

- 19 009176 пропилэтиламин и реакцию проводят при 105°С, эта реакция завершается по истечении 8 ч. К концу реакционного периода растворитель удаляют в вакууме и оставшийся продукт в виде масла растворяют в воде и нейтрализуют до рН 7 разбавленной кислотой, предпочтительно соляной. Продукт из этого раствора выпадает в осадок, после чего его промывают дистиллированной водой и сушат на воздухе. Выделяющийся НСN можно удалить инертным газом и нейтрализовать щелочным раствором. Высушенный осадок растворяют в хлороформе или другом приемлемом растворителе, затем экстрагируют концентрированной кислотой, например 6н. НС1. Добавлением неорганического основания, предпочтительно гидроксида щелочного металла, экстракт нейтрализуют до рН 7 и охлаждают до температуры на уровне 0°С. Полученный осадок промывают и сушат, затем перекристаллизовывают из приемлемого растворителя, например ацетона, с получением продукта формулы VII, приемлемого для использования на следующей стадии данного способа.

В другом варианте эту реакцию можно проводить в водном растворителе, включающем смешивающийся с водой органический растворитель, такой, как метанол, или в двухфазной системе, включающей воду и органический растворитель, такой, как этилацетат. В этом варианте продукт можно выделять разбавлением реакционного раствора водой и последующей экстракцией продукта с использованием органического растворителя, такого, как метиленхлорид или хлороформ, после чего проводят обратную экстракцию из такого органического экстракта с использованием концентрированной минеральной кислоты, например 2н. НС1 (см. патент США 3200113).

В соответствии с еще одним вариантом реакцию можно проводить в смешивающемся с водой растворителе, таком, как диметилформамид, диметилацетамид, Ν-метилпирролидон или диметилсульфоксид, после чего полученный реакционный раствор разбавляют водой и сообщают ему щелочную реакцию, например, добавлением карбоната щелочного металла, затем охлаждают до 0-10°С, вызывая тем самым осаждение продукта. В предпочтительном варианте эту систему гасят гипогалитом щелочного металла или другим реагентом, который эффективно предотвращает выделение цианида. После фильтрования и промывки водой выпавший в осадок продукт приемлем для использования на следующей стадии способа.

В соответствии с дополнительным вариантом енаминовый продукт формулы VII может быть получен взаимодействием субстрата формулы VIII в присутствии источника протонов с избытком цианида щелочного металла, предпочтительно №С^ в водном растворителе, включающем апротонный смешивающийся с водой полярный растворитель, такой, как диметилформамид или диметилацетамид. Предпочтительным источником протонов является минеральная кислота или С₁-С₅карбоновая кислота, причем особенно предпочтительна серная кислота. В необычном случае, когда цианирующим реагентом служит Ι,ίΓΝ в ДМФ, какая-либо необходимость в дискретном добавлении источника протонов отсутствует.

В предпочтительном варианте цианидный ион вводят в реактор в количестве, находящемся примерно от 2,05 до 5 мол. экв. на 1 экв. субстрата. Полагают, что присоединению НСN по 4,5- и 6,7двойным связям содействует минеральная кислота или другой источник протонов, поэтому в предпочтительном варианте его вводят в количестве по меньшей мере 1 мол. экв. на 1 мол. экв. субстрата, но реакционная система должна сохранять основность, что достигается поддержанием избытка цианида щелочного металла в сравнении с количеством содержащейся кислоты. Реакцию предпочтительнее проводить при температуре по меньшей мере приблизительно 75°С, как правило 60-100°С, в течение периода примерно от 1 до примерно 8 ч, более предпочтительно примерно от 1,5 до примерно 3 ч. К концу реакционного периода реакционную смесь охлаждают предпочтительно до почти комнатной температуры и полученный енамин осаждают подкислением реакционной смеси и смешением с холодной водой предпочтительно при температуре, близкой к температуре ледяной бани. Полагают, что подкисление вызывает замыкание 17-лактона, который проявляет тенденцию к размыканию цикла при превалировании основных условий во время цианирования. Реакционную смесь целесообразно подкислять с использованием той же самой кислоты, которая использовалась во время реакции, предпочтительно серной кислоты. В предпочтительном варианте воду добавляют в пропорции примерно от 10 до примерно 50 мол. экв. на 1 моль продукта.

Соединения формулы VII являются новыми соединениями и обладают существенной ценностью как промежуточные продукты для получения соединений формулы I, прежде всего формулы ГА.. Предпочтительные соединения формулы VII соответствуют формуле VIIА, в которой -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂СН₂-, К³ обозначает водород, (низш.)алкил или (низш.)алкоксигруппу, а К⁸ и К⁹ совместно образуют 20-спироксановое кольцо о

XXXIII

Наиболее предпочтительным соединением формулы VII является 5'К(5'а),7'в,20'аминогексадекагадро-11 в'-гидрокси-10'а,13'а-диметил-3',5-диоксоспиро{фуран-2-(3Н),17'а-(5'Н)[7,4]метено[4Н] циклопента[а]фенантрен}-5'-карбонитрил.

- 20 009176

На следующей стадии схемы 1 синтеза енамин формулы νΙΙ гидролизуют с получением дикетонового соединения формулы νΙ

где -А-А-, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные для формулы νΙΙΙ.

Для гидролиза можно использовать любую водную органическую или минеральную кислоту. Предпочтительна соляная кислота. С целью повысить производительность в предпочтительном варианте в качестве сорастворителя используют смешивающийся с водой органический растворитель, такой, как низший спирт. Кислота должна содержаться в пропорции по меньшей мере 1 экв. на 1 экв. субстрата формулы νΙΙ. В водной системе енаминовый субстрат формулы νΙΙ при примерно 80°С в течение приблизительно 5 ч можно практически полностью превратить в дикетон формулы νΙΙ. Проведение процесса при повышенной температуре повышает производительность, но температура решающего значения не имеет. Приемлемую температуру выбирают, основываясь на летучести системы растворителя и кислоты. В предпочтительном варианте енаминовый субстрат формулы νΙΙ соответствует формуле

а дикетоновый продукт соответствует формуле

в каждой из которых -А-А-, -В-В-, Υ¹, Υ² и Χ имеют значения, указанные для формулы νΚΙΛ..

По истечении реакционного периода раствор охлаждают до 0-25°С с целью кристаллизации продукта. Полученные кристаллы можно перекристаллизовать из приемлемого растворителя, такого, как изопропанол или метанол, с получением продукта формулы νΙ, который можно использовать на следующей стадии способа, но перекристаллизация обычно не обязательна. Продукты формулы νΙ являются новыми соединениями, которые обладают существенной ценностью как промежуточные продукты для получения соединений формулы Ι, а особенно формулы ГА. Предпочтительные соединения формулы νΙ соответствуют формуле νΙΛ., в которой -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-, К³ обозначает водород, (низш.)алкил или (низш.)алкоксигруппу, а К⁸ и К⁹ совместно образуют 20-спироксановое кольцо о

А

5,,,,,/ XXXIII

Наиболее предпочтительным соединением формулы νΙ является 4'8(4'а),7'а-гексадекагидро-11'агидрокси-10'в,13'в-диметил-3',5,20'-триоксоспиро{фуран-2(3Н),17'в(4,7)метано[17Н]циклопента[а]фенантрен}-5 в(2'Н)карбонитрил.

В особенно предпочтительном варианте выполнения изобретения являющийся продуктом енамин формулы νΙΙ получают из соединения формулы νΙΙΙ таким путем, который описан выше, и ΐη пре

- 21 009176 вращают в дикетон формулы νΐ. В этом варианте выполнения изобретения проводят взаимодействие субстрата формулы νΐΐΐ с избытком цианида щелочного металла в водном растворителе, содержащем источник протонов, или, что необязательно, с избытком кетонциангидрина в присутствии основания и Б1С1, как это описано выше. Однако в предпочтительном варианте вместо охлаждения реакционной смеси, подкисления и добавления воды в пропорциях, рассчитанных с тем, чтобы вызвать осаждение енамина, избегают существенного охлаждения реакционной смеси. В смесь в конце реакции цианирования добавляют воду и кислоту, предпочтительно минеральную кислоту, такую, как серная, в количестве, достаточном для нейтрализации избытка цианида щелочного металла, для чего обычно требуется введение по меньшей мере 1 мол. экв. кислоты на 1 моль субстрата формулы νΐΐΐ, предпочтительно примерно от 2 до примерно 5 мол. экв. на 1 экв. субстрата. При этом температуру поддерживают на достаточно высоком уровне, а степень разбавления увеличивают достаточно для того, чтобы избежать существенного осаждения и обеспечить возможность гидролиза енамина до дикетона в жидкой фазе. Таким образом, процесс проходит с минимальными препятствиями и высокой производительностью. В предпочтительном варианте гидролиз проводят при температуре по меньшей мере 80°С, более предпочтительно в интервале примерно от 90 до примерно 100°С в течение периода времени, продолжительность которого, как правило, составляет примерно от 1 до примерно 10 ч, более предпочтительно примерно от 2 до примерно 5 ч. Затем реакционную смесь охлаждают предпочтительно до температуры примерно от 0 до примерно 15°С, целесообразно в ледяной бане до температуры примерно от 5 до примерно 10°С с целью осаждения получаемого дикетона формулы νΐ. Твердый продукт можно выделить, в частности, фильтрованием, а примеси удалить промывкой водой.

На следующей стадии схемы 1 синтеза проводят взаимодействие дикетонового соединения формулы νΐ с алкоксидом металла с целью размыкания кетонового мостика между 4- и 7-м положениями, разрыва связи между карбонильной группой и 4-м углеродным атомом, образования α-ориентированного алканоилоксикарбонильного заместителя в 7-м положении и удаления цианида в 5-м положении. Продуктом этой реакции является гидроксиэфирное соединение, соответствующее формуле ν

где -А-А-, В³, -В-В-, В⁸ и В⁹ имеют значения, указанные для формулы νΐΐΐ, а В¹ обозначает (низш.)алкоксикарбонил или гидроксикарбонил.

Используемый для этой реакции алкоксид металла соответствует формуле В¹⁰ОМ, где М обозначает щелочной металл, а В¹⁰О - соответствует алкоксизаместителю при В¹. Выход продукта в результате этой реакции оказывается наиболее удовлетворительным, когда алкоксид металла представляет собой метоксид калия или натрия, но могут быть использованы и другие (низш.)алкоксиды. Алкоксид калия особенно предпочтителен. Могут быть также использованы феноксиды, другие арилоксиды, равно как и арилсульфиды. Реакцию целесообразно проводить в среде спирта, соответствующего формуле В¹⁰ОМ, где значение В¹⁰ указано выше. Можно использовать другие обычные растворители. В предпочтительном варианте соединение формулы νΐ содержится в пропорции, находящейся примерно от 2 до примерно 12 мас.%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 6 мас.%, а В¹⁰ОМ содержится в количестве, находящемся примерно от 0,5 до примерно 4 моль на 1 моль соединения. Температура решающего значения не имеет, но при повышенной температуре производительность возрастает. Продолжительность реакции, как правило, составляет примерно от 4 до примерно 24 ч, предпочтительно примерно от 4 до 16 ч. В зависимости от конкретно используемого растворителя эту реакцию целесообразно проводить при температуре кипения под атмосферным давлением с обратным холодильником.

В процессе конверсии дикетона формулы νΐ в гидроксиэфир формулы νΐ, получаемый в качестве побочного продукта, цианидный ион способен взаимодействовать с продуктом с образованием 5-цианоэфира. Поскольку равновесие более устойчиво при низких концентрациях, в предпочтительном варианте эту реакцию проводят при довольно высокой степени разбавления, например, достигающей 40:1 в случае взаимодействия с метоксидом ЭДа. Было установлено, что заметно более высокой производительности можно добиться с использованием не метоксида натрия, а метоксида калия, поскольку, когда в качестве реагента используют метоксид калия, разбавление на уровне приблизительно 20:1 обычно оказывается достаточным для сведения к минимуму степени обратного цианирования.

При создании изобретения было, кроме того, установлено, что реакцию обратного цианирования можно ингибировать с помощью соответствующих химических или физических методов удаления из реакционной зоны образующегося в качестве побочного продукта цианидного иона. Таким образом, в еще одном варианте выполнения изобретения взаимодействие дикетона с алкоксидом щелочного металла можно проводить в присутствии осадителя для цианидного иона, например, такого, как соль, включающая катион, который образует нерастворимое цианидное соединение. Такие соли могут, например,

- 22 009176 включать йодид цинка, сульфат трехвалентного железа и, по существу, любую галогенидную, сульфатную и другие соли щелочно-земельных и переходных металлов, которые более растворимы, чем соответствующий цианид. Если йодид цинка содержится в количестве, приблизительно равном 1 экв. на 1 экв. дикетонового соединения, то согласно наблюдениям производительность реакции существенно возрастает в сравнении с производительностью процесса, проводимого в отсутствии галогенида щелочного металла.

Даже когда для удаления цианидного иона используют осадитель, преимущество проведения процесса при довольно высокой степени разбавления сохраняется, но при применении осадителя молярное соотношение между растворителем и дикетоновым соединением можно существенно снизить в сравнении с соотношением во время реакций, проводимых в отсутствии такого агента. Выделение гидроксиэфира формулы V можно осуществлять в соответствии с любым из описанных ниже экстракционных и неэкстракционных методов.

В предпочтительном варианте дикетоновое соединение формулы VI соответствует формуле

а гидроксиэфирный продукт соответствует формуле

в каждой из которых -Α-Α-, -В-В-, Υ¹, Υ² и X имеют значения, указанные для формулы XШΑ, а значения К¹ аналогичны указанным для формулы V.

Продукты формулы V являются новыми соединениями, которые обладают существенной ценностью как промежуточные продукты для получения соединений формулы Ι, прежде всего формулы ΙΑ. Предпочтительные соединения формулы V соответствуют формуле νΑ, в которой -Α-Α- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-, К³ обозначает водород, (низш.)алкил или (низш.)алкоксигруппу, а К⁸ и К⁹ совместно образуют 20-спироксановое кольцо

Наиболее предпочтительным соединением формулы V является γ-лактон неполного метилового эфира 11а,17а-дигидрокси-3-оксопрегн-4-ен-7а,21-дикарбоновой кислоты.

Соединение формулы V может быть выделено подкислением реакционного раствора, например концентрированной НС1, охлаждением до комнатной температуры и экстракцией продукта органическим растворителем, таким, как метиленхлорид или этилацетат. Экстракт промывают водным промывным щелочным раствором, сушат и фильтруют, после чего растворитель удаляют. По другому варианту реакционный раствор, содержащий продукт формулы V, можно нейтрализовать концентрированной кислотой. Получаемый раствор концентрируют, охлаждают до 0-25°С и получаемое твердое вещество выделяют фильтрованием.

В соответствии с предпочтительным вариантом выделения продукта формулы V метанол и 11С\ удаляют перегонкой после истечения реакционного периода, причем перед перегонкой или во время нее добавляют воду и кислоту. Добавление воды перед перегонкой упрощает проведение операций, но постепенное добавление во время перегонки позволяет сохранять практически постоянный объем. По мере протекания перегонки из кубовых остатков кристаллизуется продукт формулы V. Осуществление такого способа выделения обеспечивает возможность получения высококачественного кристаллического продукта без операций экстракции.

В соответствии с еще одним вариантом реакционный раствор, содержащий продукт формулы V, можно нейтрализовать минеральной кислотой, например 4н. НС1, после чего перегонкой удаляют растворитель. При удалении растворителя обеспечивается также удаление из реакционного продукта оста- 23 009176 точного количества ΗΟΝ. Было установлено, что, когда, как это отмечено в настоящем описании, в качестве промежуточного продукта в процессе получения эпоксимексренона используют соединение формулы V, многочисленные экстракции растворителями для очистки соединения формулы V становятся необязательными. Действительно, такие экстракции часто можно полностью исключить. Когда для очистки продукта проводят экстракцию растворителями, промывки растворителями необходимо дополнять промывкой рассолом и щелочными промывками. Но, когда экстракции растворителями исключают, исключают также промывки рассолом и щелочами. Исключение экстракций и промывок заметно улучшает производительность процесса без ущерба для выхода или качества продукта, а также устраняет потребность в сушке промытого раствора осушителем, таким, как сульфат натрия. Сырой 11а-гидрокси-7аалкоксикарбонильный продукт вновь растворяют растворителем на последующей стадии способа, которой является конверсия 11-гидроксильной группы в легко отщепляемую группу в 11-м положении, в результате чего образуется соединение формулы IV

в которой значения -А-А-, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ аналогичны указанным для формулы VIII, значения К¹ аналогичны указанным для формулы V, а К² обозначает арилсульфонилоксигруппу, (низш.)алкилсульфонилоксигруппу, ацилоксигруппу или галогенид.

В предпочтительном варианте 11а-гидроксил этерифицируют взаимодействием с низшим алкилсульфонилгалогенидом, ацилгалогенидом или ангидридом карбоновой кислоты, который добавляют в раствор, содержащий промежуточный продукт формулы V. Предпочтительны (низш.)алкилсульфонилгалогениды и особенно метансульфонилхлорид. По другому варианту 11а-гидроксильную группу можно превратить в галоидную взаимодействием с приемлемым реагентом, таким, как тионилбромид, тионилхлорид, сульфурилхлорид и оксалилхлорид. Другие реагенты для получения эфиров 11а-сульфокислоты включают тозилхлорид, бензолсульфонилхлорид и ангидрид трифторметансульфокислоты. Это взаимодействие проводят в растворителе, содержащем поглотитель галогенида водорода, такой, как триэтиламин и пиридин. Можно также использовать неорганические основания, такие, как карбонат Να или К. Предпочтительная начальная концентрация гидроксиэфира формулы V находится примерно от 5 до примерно 50 мас.%. В предпочтительном варианте этерифицирующий реагент содержится в небольшом избытке. Для проведения этой реакции особенно приемлемым растворителем является метиленхлорид, но можно также использовать другие растворители, такие, как дихлорэтан, пиридин, хлороформ, метилэтилкетон, диметоксиэтан, метилизобутилкетон, ацетон, прочие кетоны, простые эфиры, ацетонитрил, толуол и тетрагидрофуран. Реакционную температуру регулируют главным образом в зависимости от летучести растворителя. В метиленхлориде предпочтительная реакционная температура находится в интервале примерно от -10 до примерно 10°С.

Предпочтительный гидроксиэфирный субстрат формулы V соответствует формуле

а продукт соответствует формуле

в каждой из которых значения -А-А-, -В-В-, Υ¹, Υ² и X аналогичны указанным для формулы XIII, К¹ обозначает алканоилоксикарбонил или гидроксикарбонил, а значения К² аналогичны указанным для формулы IV.

Продукты формулы IV являются новыми соединениями, которые обладают существенной ценностью как промежуточные продукты при получении соединений формулы I, прежде всего формулы РА. Предпочтительные соединения формулы IV соответствуют формуле ^А, в которой -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-, К³ обозначает водород, (низш.)алкил или (низш.) алкоксигруппу, а К⁸

- 24 009176 и К⁹ совместно образуют 20-спироксановое кольцо о

XXXIII

Наиболее предпочтительным соединением формулы Ιν является γ-лактон неполного метилового эфира 17а-гидрокси-11а-(метилсульфонил)окси-3-оксопрегн-4-ен-7а,21-дикарбоновой кислоты.

При необходимости соединение формулы Ιν можно выделять удалением растворителя. В предпочтительном варианте реакционный раствор вначале промывают водным щелочным раствором, например 0,5-2н. ЫаОН, с последующей промывкой кислотой, например 0,5-2н. НС1. После удаления растворителя продукт перекристаллизовывают, например, растворением продукта в метиленхлориде и затем добавлением другого растворителя, такого, как этиловый эфир, который снижает растворимость продукта формулы Ιν, вызывая его осаждение в кристаллической форме.

При выделении продукта формулы Ιν или при приготовлении реакционного раствора для превращения промежуточного продукта формулы Ιν в промежуточный продукт формулы ΙΙ, как это описано ниже, можно не использовать экстракцию и/или промывку, если вместо этого реакционный раствор обработать ионообменной смолой для удаления кислых и основных примесей. Раствор вначале обрабатывают анионообменной смолой, а затем катионообменной смолой. В другом варианте реакционный раствор можно вначале обработать неорганическими адсорбентами, такими, как основный оксид алюминия или основный диоксид кремния, с последующей промывкой разбавленной кислотой. Основный диоксид кремния или основный оксид алюминия, как правило, можно смешивать с реакционным раствором в пропорции примерно от 5 до примерно 50 г на 1 кг продукта, предпочтительно примерно от 15 до примерно 20 г на 1 кг продукта. Обработку ионообменными смолами или неорганическими адсорбентами можно проводить простым суспендированием смолы или неорганического адсорбента в реакционном растворе с перемешиванием при комнатной температуре и с последующим удалением смолы или неорганического адсорбента фильтрованием.

В альтернативном предпочтительном варианте выполнения изобретения получаемое соединение формулы Ιν выделяют в сыром виде как концентрированный раствор путем удаления части растворителя. Этот концентрированный раствор используют непосредственно на следующей стадии способа, которой является удаление 11а-уходящей группы соединения формулы Ιν, в результате чего образуется енэфир формулы

где -А-А-, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные для формулы νΙΙΙ, а значения К¹ аналогичны указанным для формулы ν.

Принимая во внимание цели проведения этой реакции, заместителем К² в соединении формулы Ιν может быть любая уходящая группа, отщепление которой обеспечивает образование двойной связи между 9- и 11-м атомами углерода.

Предпочтительной уходящей группой является (низш.)алкилсульфонилокси- или ацилоксизаместитель, который удаляют взаимодействием с кислотой и солью щелочного металла. Можно использовать минеральные кислоты, но предпочтительны низшие алифатические кислоты. Предпочтительный реагент для этой реакции далее включает соль щелочного металла используемой алифатической кислоты. В особенно предпочтительном варианте уходящая группа представляет собой мезилоксигруппу, а реагент для этой реакции включает муравьиную или уксусную кислоту и соли щелочного металла одной из этих кислот или другой низшей алифатической кислоты. Когда уходящая группа представляет собой мезилоксигруппу, а удаляющим реагентом являются муравьиная кислота и формиат калия, достигается относительно высокое соотношение между 9,11- и 11,12-олефинами. Если во время удаления уходящей группы в реакционной смеси содержится свободная вода, наблюдается тенденция к образованию примесей, в частности 7,9-лактона

который трудно удалить из конечного продукта.

- 25 009176

Таким образом, для удаления воды, содержащейся в муравьиной кислоте, используют уксусный ангидрид или другой осушитель. Содержание свободной воды в реакционной смеси до реакции следует поддерживать на уровне ниже приблизительно 0,5 мас.%, предпочтительно ниже примерно 0,1 мас.%, как это определяют анализом Карла Фишера на воду, в пересчете на общее количество реакционного раствора. Хотя в предпочтительном варианте реакционную смесь содержат настолько сухой, насколько это оказывается практичным, удовлетворительных результатов достигают при 0,3 мас.% воды. Предпочтительная загружаемая реакционная смесь содержит примерно от 4 до примерно 50 мас.% соединения формулы IV в алифатической кислоте. В предпочтительном варианте соль щелочного металла этой кислоты содержится примерно от 4 до примерно 20 мас.%. В том случае, если в качестве осушителя используют уксусный ангидрид, в предпочтительном варианте он содержится примерно от 0,05 до примерно 0,2 моль на 1 моль алифатической кислоты.

Было установлено, что, когда в качестве реагента для удаления уходящей группы и образования енэфира (9,11-олефина) используют удаляющий агент, представляющий собой сочетание трифторуксусной кислоты, трифторуксусного ангидрида и ацетата калия, содержание в реакционной смеси в качестве побочного продукта 7,9-лактона и 11,12-олефина является относительно низким. Трифторуксусный ангидрид служит осушителем и он должен содержаться в количестве по меньшей мере примерно 3 мас.%, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 15 мас.%, наиболее предпочтительно около 20 мас.%, в пересчете на количество трифторуксусно-кислотного удаляющего реагента.

По другому варианту 11а-уходящие группы соединения формулы IV могут быть удалены с получением енэфира формулы II выдержкой при повышенной температуре раствора соединения формулы IV в органическом растворителе, таком, как ДМСО, ДМФ и диметилацетамид.

Далее в соответствии с изобретением соединение формулы IV вначале вводят во взаимодействие с алкенилалканоатом, таким, как изопропенилацетат, в присутствии кислоты, такой, как толуолсульфокислота, или безводной минеральной кислоты, такой, как серная кислота, с получением 3-енольного эфира соединения формулы

По другому варианту 3-енольный эфир может быть получен обработкой ангидридами карбоновых кислот и основанием, такими, как уксусная кислота и ацетат натрия. Дальнейшие альтернативные варианты включают обработку кетеном в присутствии кислоты с получением соединения формулы ^(Ζ). После этого осуществляют взаимодействие промежуточного продукта формулы ^(Ζ) с формиатом или ацетатом щелочного металла в присутствии муравьиной или уксусной кислоты с получением Δ-9,11енолацетата формулы

который затем можно превращать в енэфир формулы II в органическом растворителе, предпочтительно в спирте, таком, как метанол, путем термической деструкции енолацетата либо путем его введения во взаимодействие с алкоксидом щелочного металла.

Реакция отщепления является высоко селективной в отношении енэфира формулы II с предпочтением к 11,12-олефину и 7,9-лактону, и эта селективность сохраняется во время превращения енолацетата в енон.

Предпочтительное соединение формулы IV соответствует формуле

- 26 009176 а енэфирный продукт соответствует формуле

в каждой из которых -А-А-, -В-В-, Υ¹, Υ² и X имеют значения, указанные для формулы XIII, а значения В¹ аналогичны указанным для формулы V.

При необходимости соединение формулы II можно выделить удалением растворителя, растворением твердого продукта в холодной воде и экстракцией органическим растворителем, таким, как этилацетат. После соответствующих стадий промывки и сушки продукт выделяют удалением экстракционного растворителя. Далее енэфир растворяют в растворителе, приемлемом для конверсии в продукт формулы I. По другому варианту этот енэфир можно выделять добавлением в получаемый концентрированный раствор воды и отфильтровыванием твердого продукта, в результате чего удаляется преимущественно 7,9-лактон. Конверсию субстрата формулы II в продукт формулы РА можно осуществлять аналогично тому, как это изложено в патенте США 4559332, который специально включен в настоящее описание в качестве ссылки, или, что более предпочтительно, проводить новую реакцию с использованием галоидацетамидного промотора, как это изложено ниже.

В другом варианте выполнения изобретения гидроксиэфир формулы V можно превратить в енэфир формулы II без выделения промежуточного соединения формулы IV. В этом способе гидроксиэфир растворяют в органическом растворителе, таком, как метиленхлорид, и в раствор добавляют либо ацилирующий агент, например метансульфонилхлорид, либо галоидирующий агент, например сульфурилхлорид. Смесь перемешивают и в тех случаях, когда проводят галоидирование, добавляют акцептор НС1, такой, как имидазол. Смешение основания с раствором является высоко экзотермическим процессом, поэтому его следует осуществлять с регулируемой скоростью добавления и полным охлаждением. После добавления основания образовавшуюся смесь нагревают до умеренной температуры, например от 0°С до комнатной или несколько повышенной температуры, и проводят реакцию, как правило, в течение 1-4 ч. После завершения реакции растворитель удаляют, предпочтительно в условиях высокого вакуума (например, 24-28 дюймов рт.ст.) при температуре от -10 до +15°С, более предпочтительно примерно от 0 до примерно 5°С, с целью концентрирования раствора и удаления избытка основания. Далее продукт вновь растворяют в органическом растворителе, предпочтительно в галоидированном растворителе, таком, как метиленхлорид, для превращения в енэфир.

Реагент, отщепляющий уходящую группу, в предпочтительном варианте получают смешением органической кислоты, соли органической кислоты и осушителя, предпочтительно соответственно муравьиной кислоты, формиата щелочного металла и уксусного ангидрида, в сухом реакторе. Добавление уксусного ангидрида вызывает экзотермический процесс и приводит к выделению СО, вследствие чего необходимо соответствующим образом регулировать скорость добавления. Для ускорения удаления воды в предпочтительном варианте температуру во время этой реакции поддерживают в интервале 60-90°С, наиболее предпочтительно примерно от 65 до примерно 75°С. Далее этот реагент добавляют в получаемый раствор соединения формулы IV с целью вызвать реакцию отщепления. В предпочтительном варианте по истечении 4-8 ч реакционную смесь выдерживают при температуре по меньшей мере приблизительно 85°С, но не выше примерно 95°С, до тех пор, пока не удалится весь летучий дистиллят, а затем в течение еще некоторого периода времени для завершения реакции, как правило, примерно от

I до 4 ч. Реакционную смесь охлаждают и после рекуперации с использованием стандартных экстракционных методов енэфир выделяют в требуемом виде выпариванием растворителя.

Далее было установлено, что енэфир формулы II можно выделять из реакционного раствора другим способом, в котором устраняется потребность в экстракционных стадиях, следующих за реакцией удаления, обеспечивая тем самым экономию затрат, повышение выхода продукта и/или увеличение производительности. При осуществлении такого способа получаемый енэфир осаждают разбавлением реакционной смеси водой после удаления муравьиной кислоты. Затем фильтрованием выделяют продукт. Проведение стадий экстракции при этом не требуется.

В соответствии с еще одним вариантом превращения гидроксиэфира формулы V в енэфир формулы

II без выделения соединения формулы IV 11а-гидроксильную группу гидроксиэфира формулы V замещают атомом галогена, после чего ΐη 8йи термическим дегидрогалоидированием получают енэфир формулы II. Замещение гидроксильной группы атомом галогена осуществляют взаимодействием с сульфурилгалогенидом, предпочтительно с сульфурилхлоридом, на холоде в присутствии связывающего хлорид водорода агента, такого, как имидазол. Гидроксиэфир растворяют в растворителе, таком, как тетрагидрофуран, и охлаждают до температуры от 0 до -70°С. Добавляют сульфурилгалогенид и реакционную смесь подогревают до умеренной температуры, например до комнатной температуры, и выдерживают в

- 27 009176 течение времени, достаточного для завершения реакции удаления, как правило в течение 1-4 ч. Такой вариант способа не только объединяет две стадии в одну, но позволяет исключить применение галоидированного реакционного растворителя, кислоты (такой, как уксусная) и осушителя (уксусного ангидрида или сульфата натрия). Более того, условия проведения реакции не требуют кипячения с обратным холодильником и исключают выделение в качестве побочного продукта СО, которое сопровождает применение уксусной кислоты в качестве осушителя.

В соответствии с особенно предпочтительным вариантом выполнения изобретения дикетоновое соединение формулы VI можно превратить в эпоксимексренон или другое соединение формулы I без выделения в очищенном виде какого-либо промежуточного продукта. В соответствии с этим предпочтительным способом реакционный раствор, включающий гидроксиэфир, гасят раствором сильной кислоты, охлаждают до комнатной температуры, а затем экстрагируют приемлемым экстракционным растворителем. Перед экстракцией в реакционную смесь целесообразно добавлять водный раствор неорганической соли, например, концентрацией 10 мас.%. Экстракт промывают и сушат азеотропной перегонкой, удаляя метанольный растворитель, оставшийся после реакции отщепления кетона.

Далее полученный концентрированный раствор, содержащий примерно от 5 до примерно 50 мас.% соединения формулы V, на холоде вводят в контакт с ацилирующим или алкилсульфонилирующим реагентом с получением эфира сульфо- или дикарбоновой кислоты. По завершении реакции алкилсульфонилирования или карбоксилирования реакционный раствор пропускают через колонку с кислой, а затем основной ионообменной смолой для удаления основных и кислых примесей. После каждого цикла колонку промывают соответствующим растворителем, например метиленхлоридом, для удаления из нее остаточного эфира сульфо- или дикарбоновой кислоты. Объединенные элюатные и промывные фракции совмещают и их объем уменьшают, предпочтительно в вакууме, с получением концентрированного раствора, содержащего эфир сульфо- или дикарбоновой кислоты формулы IV. Далее этот концентрированный раствор вводят в контакт с осушителем, включающим агент, обеспечивающий удаление уходящей 11а-эфирной группы и отщепление водородного атома с образованием 9,11-двойной связи. В предпочтительном варианте этот реагент для удаления уходящей группы представляет собой описанный выше раствор муравьиной кислоты/формиата щелочного металла/уксусного ангидрида в качестве осушителя. После завершения реакции реакционную смесь охлаждают и в вакууме удаляют муравьиную кислоту и/или другие летучие компоненты. Остаток охлаждают до комнатной температуры, осуществляют соответствующие стадии промывки и затем сушат с получением концентрированного раствора, включающего енэфир формулы II. Затем этот енэфир можно превращать в эпоксимексренон или другое соединение формулы I в соответствии со способом, представленным в настоящем описании или в патенте США 4559332.

В особенно предпочтительном варианте выполнения изобретения из реакционного раствора в вакууме удаляют растворитель и продукт формулы IV распределяют между водой и соответствующим органическим растворителем, например этилацетатом. Далее водный слой подвергают обратной экстракции органическим растворителем и продукт обратной экстракции промывают щелочным раствором, предпочтительно раствором гидроксида щелочного металла, содержащим галогенид щелочного металла. Органическую фазу концентрируют, предпочтительно в вакууме, с получением енэфира формулы II. Этот продукт формулы II далее можно растворять в органическом растворителе, например в метиленхлориде, и вводить в дальнейшую реакцию, как это изложено в патенте '332, с получением продукта формулы I.

Было установлено, что когда в реакции эпоксидирования используют тригалоидацетонитрил, выбор растворителя имеет важное значение, причем большое предпочтение отдают галоидированным растворителям, а особенно предпочтителен метиленхлорид. Достижение удовлетворительного выхода продукта обеспечивают такие растворители, как дихлорэтан и хлорбензол, но в метиленхлоридной реакционной среде выход продукта обычно выше. В таких растворителях, как ацетонитрил и этилацетат, обычно выход продукта недостаточно высок, в то время как в результате реакции в таких растворителях, как метанол или смесь вода/тетрагидрофуран, целевой продукт получают с низким выходом.

Далее в соответствии с настоящим изобретением было установлено, что использование в качестве перекисного активатора тригалоидацетамида вместо тригалоидацетонитрила дает возможность внести в синтез эпоксимексренона множество усовершенствований. В соответствии с особенно предпочтительным способом эпоксидирование проводят при взаимодействии вещества формулы ПА с перекисью водорода в среде трихлорацетамида в присутствии приемлемого буфера. В предпочтительном варианте эту реакцию проводят при рН в интервале примерно от 3 до примерно 7, наиболее предпочтительно примерно от 5 до примерно 7. Однако реакция может быть успешно осуществлена и вне этих предпочтительных интервалов значений рН.

Особенно хорошие результаты получают при использовании буфера, включающего вторичный кислый фосфат калия и/или буфера, представляющего собой сочетание вторичного кислого фосфата калия и первичного кислого фосфата калия в соотношении, находящемся примерно от 1:4 до примерно 2:1, наиболее предпочтительно приблизительно при 2:3. Можно также использовать боратные буферы, но обычно при этом конверсия протекает медленнее, чем в случае вторичного кислого фосфата калия или

- 28 009176

К₂НРО₄ или смесей К₂НРО₄/КН₂РО₄. Независимо от состава буфера, он должен обеспечивать поддержание рН в вышеуказанном интервале. Было установлено, что независимо от состава буфера в целом или точного значения рН, которое может быть установлено с его помощью, реакция протекает значительно более эффективно, если по меньшей мере часть буфера составляет ион вторичного кислого фосфата. Полагают, что этот ион может принимать существенное участие в качестве гомогенного катализатора при образовании аддукта или комплекса, включающего ион промотора и гидропероксид ион, образование которого, в свою очередь, может оказать существенное влияние на механизм реакции эпоксидирования в целом. Таким образом, необходимое количество вторичного кислого фосфата (предпочтительно К₂НРО₄) должно быть достаточно лишь для создания небольшой каталитической концентрации. Обычно в предпочтительном варианте содержание иона НРО₄ ^-2 должно составлять по меньшей мере приблизительно 0,1 экв., в частности примерно от 0,1 до примерно 0,3 экв. на 1 экв. вещества.

Эту реакцию проводят в приемлемом растворителе, предпочтительно в метиленхлориде, но по другому варианту можно использовать и другие галоидированные растворители, такие, как хлорбензол или дихлорэтан. Было установлено, что приемлемыми являются также толуол и смеси толуола с ацетонитрилом. Не основываясь на какой-либо конкретной теории, полагают, что реакция наиболее эффективно протекает в двухфазной системе, в которой гидроперекисный промежуточный продукт образуется и распределяется в органической фазе с низким содержанием воды и взаимодействует в этой органической фазе с субстратом. Таким образом, предпочтительными растворителями являются те, в которых растворимость воды низка. Эффективному выделению продукта из толуола способствует введение другого растворителя, такого, как ацетонитрил.

Использование толуола для конверсии веществ формулы ΙΙ в продукты формулы Ι сообщает способу преимущество, поскольку вещества формулы ΙΙ легко растворимы в толуоле, а продукты формулы Ι нет. Так, когда конверсия достигает уровня 40-50%, продукт выпадает в осадок, в результате чего образуется трехфазная смесь, из которой продукт можно эффективно выделить фильтрованием. Было установлено, что метанол, этилацетат, ацетонитрил самостоятельно, ТГФ и ТГФ/вода оказываются не столь эффективными для проведения конверсии на этой стадии способа как галоидированные растворители или толуол.

Хотя трихлорацетамид является наиболее предпочтительным реагентом, могут быть также использованы и другие тригалоидацетамиды, такие, как трифторацетамид. Можно также применять тригалоидметилбензамид и другие соединения, содержащие между электроноакцепторной тригалоидметильной группой и карбонилом амида ариленовый остаток. Кроме того, приемлемы для использования 3,3,3-тригалоидпропионамиды, но в этом случае результат менее предпочтителен. Перекисный активатор может отвечать формуле

К°С(О)ХН₂, где К⁰ обозначает группу, обладающую по меньшей мере такой же электронно-акцепторной способностью (как ее определяют по сигма-постоянной), что и монохлорметильная группа. Более конкретно перекисный активатор может соответствовать формуле

где значения X¹, X² и X³ независимо друг от друга выбирают из галогена, водорода, алкила, галоидалкила, цианогруппы и цианоалкила, а значения К^Р выбирают из арилена и группы (СX⁴X⁵)_η-, где п обозначает 0 или 1 и по меньшей мере один из X¹, X², X³, X⁴ и X⁵ обозначает галоген или перфторалкил.

Когда любой из X¹, X², X³, X⁴ и X⁵ не обозначает галоген, он предпочтительно обозначает галоидалкил, наиболее предпочтительно пергалоидалкил. Особенно предпочтительными активаторами являются те, у которых п обозначает 0, и по меньшей мере два из X¹, X² и X³ обозначают атомы галогена, и те, у которых все X¹, X², X³, X⁴ и X⁵ обозначают атомы галогена или пергалоидалкилы. В предпочтительном варианте каждый из X¹, X², X³, X⁴ и X⁵ обозначает С1 или Г, наиболее предпочтительно О, хотя могут оказаться приемлемыми также соединения со смешанными галогенами, равно как и перхлоралкил и пербромалкил, а также их сочетания.

В предпочтительном варианте перекисный активатор содержится в количестве по меньшей мере приблизительно 1 экв., более предпочтительно примерно от 1,5 до примерно 2 экв. на 1 экв. первоначально содержащегося вещества. Перекись водорода необходимо вводить в реакцию, по меньшей мере, в умеренном избытке или ее вводят постепенно, по мере протекания реакции эпоксидирования. Хотя во время этой реакции расходуется всего от 1 до 2 экв. перекиси водорода на 1 моль вещества, в предпочтительном варианте перекись водорода загружают в значительном избытке в сравнении с количеством первоначально загружаемых исходного вещества и активатора. Не основываясь на какой-либо конкретной теории, полагают, что механизм реакции включает образование аддукта активатора и ООН, что эта реакция получения обратима и продукт способствует смещению равновесия реакции в обратном направлении и что, таким образом, для смещения равновесия во время этой реакции в сторону образования продукта эпоксидирования необходим существенный начальный избыток перекиси водорода. Поддержание тем

- 29 009176 пературы реакции в узком диапазоне решающего значения не имеет, поэтому процесс можно эффективно проводить в температурном интервале 0-100°С. Оптимальная температура зависит от выбора растворителя. Обычно предпочтительная температура находится примерно от 20 до 30°С, но в случае некоторых растворителей, например толуола, реакцию можно с успехом проводить в температурном интервале 60-70°С. При 25°С на реакцию, как правило, требуется менее 10 ч, обычно 3-6 ч. При необходимости в конце реакционного цикла с целью добиться полноты конверсии субстрата можно вводить дополнительные количества активатора и перекиси водорода.

По завершении реакционного цикла водную фазу удаляют, органический реакционный раствор в предпочтительном варианте промывают для удаления водорастворимых примесей, после чего удалением растворителя можно выделить продукт. Перед удалением растворителя реакционный раствор следует обработать промывной жидкостью со щелочной реакцией, по меньшей мере, от слабой до умеренной, например раствором карбоната натрия. В предпочтительном варианте реакционную смесь промывают последовательно слабовосстановительным раствором, таким, как слабый (например, 3 мас.%) раствор сульфита натрия в воде; щелочным раствором, например раствором \аО11 или КОН (предпочтительно приблизительно 0,5н.); раствором кислоты, такой, как НС1 (предпочтительно 1н.), и в завершение нейтральной промывной жидкостью, представляющей собой воду или рассол, предпочтительно насыщенный рассол, с целью свести к минимуму потери продукта. Перед удалением реакционного растворителя можно с успехом добавлять другой растворитель, такой, как органический растворитель, предпочтительно этанол, благодаря чему продукт можно выделять кристаллизацией после перегонки для удаления более летучего реакционного растворителя.

Необходимо отметить, что предлагаемый новый способ эпоксидирования с использованием трихлорацетамидного или другого нового перекисного активатора находит применение далеко за пределами различных схем получения эпоксимексренона и фактически может быть эффективным при получении эпоксидов через олефиновые двойные связи в самых различных субстратах, вступающих во взаимодействие в жидкой фазе. Такая реакция особенно эффективна при использовании ненасыщенных соединений, у которых имеются тетразамещенные и тризамещенные олефиновые углеродные атомы, т.е. соединений формул К^аК^ьС=СК^сК^а и К^аК^ьС=СК^сН, где К^а-К^а обозначают заместители, отличные от водородных атомов. Эта реакция протекает наиболее быстро и полно в случае, когда исходным служит циклическое соединение с тризамещенной двойной связью или циклическое либо ациклическое соединение с тетразамещенными двойными связями. Примеры исходных веществ для этой реакции включают Л-9,11канренон и соединения формул

Поскольку эта реакция протекает более быстро и полно при наличии тризамещенных и тетразамещенных двойных связей, она особенно эффективна для селективного эпоксидирования через такие двой- 30 009176 ные связи в соединениях, у которых могут быть другие двойные связи, где олефиновые углеродные атомы являются монозамещенными или даже дизамещенными.

Необходимо также иметь в виду, что эту реакцию можно эффективно проводить при эпоксидировании монозамещенных или даже дизамещенных двойных связей, таких, как 11,12-олефиновые, в различных стероидных субстратах. Однако, поскольку при этом с высокой степенью селективности эпоксидируются преимущественно более высокозамещенные двойные связи, например 9,11-олефиновые, способ по настоящему изобретению особенно эффективен для достижения высоких выхода продукта и производительности на стадиях эпоксидирования в различных реакционных схемах, представленных в какихлибо других частях настоящего описания.

Этот усовершенствованный способ находит, как проиллюстрировано, особенно эффективное применение при получении соединений формул

эпоксидированием соединений формул

Множество преимуществ было продемонстрировано для вариантов осуществления способа по изобретению, в которых вместо трихлорацетонитрила в качестве реагента для перехода кислорода для реакции эпоксидирования используют трихлорацетамид. Система с трихлорацетамидным реагентом обеспечивает точное регулирование процесса эпоксидирования через тризамещенные двойные связи при наличии в той же самой молекулярной структуре дизамещенных и α,β-кетоолефиновых связей. Таким образом существенно улучшаются выход реакционного продукта, график его образования и конечная степень частоты. Далее было установлено, что выделение существенного избыточного количества кислорода, которое происходит при использовании трихлорацетонитрила в случае трихлорацетамида, не наблюдается, что сообщает процессу эпоксидирования повышенную безопасность. Более того, в противоположность ускорению реакции трихлорацетонитрилом, в случае трихлорацетамида экзотермические эффекты во время реакции минимальны, что упрощает регулирование теплового режима реакции. Дополнительным преимуществом перед способом с использованием трихлорацетонитрила при этом являются наблюдаемые минимальные эффекты перемешивания и более адекватные рабочие характеристики реактора. Реакция оказывается более приемлемой для ее проведения в условиях равномерно увеличенного масштаба, чем реакция, ускоряемая трихлорацетонитрилом. Выделение и очистка продукта оказываются простыми, какого-либо окисления карбонильной функциональной группы по Байеру-Вилладжеру (ускоряемой перекисью конверсии кетона в эфир), которое происходит, например, в случае использования м-хлорпероксибензойной кислоты или других надкислот, не отмечают, а реагент является недорогим, легко доступным и простым в обращении.

Новый способ эпоксидирования по изобретению высоко эффективен на заключительной стадии синтеза по схеме 1. В особенно предпочтительном варианте способ в целом по схеме 1 осуществляют следующим образом:

- 31 009176

Схема 2

Осуществление второй из новых схем реакций (схема 2) по настоящему изобретению начинается с канренона или другого исходного вещества, соответствующего формуле

где -А-А-, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные для формулы VIII.

На первой стадии такого способа соединение формулы XIII превращают в продукт формулы

с использованием схемы реакции цианирования, практически такой же, как описанная выше для конверсии соединения формулы VIII в промежуточный продукт формулы VII.

- 32 009176

в каждой из которых -А-А-, -В-В-, Υ¹, Υ² и Χ имеют значения, указанные для формулы ΧΙΙΙ.

На второй стадии схемы 2 енамин формулы ΧΙΙ гидролизуют до промежуточного дикетонового продукта формулы

где -А-А-, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные для формулы νΙΙΙ, с использованием реакционной схемы практически такой же, как описанная выше для конверсии субстрата формулы νΙΙΙ в промежуточный продукт формулы νΙΙ.

Предпочтительный субстрат формулы ΧΙΙ соответствует формуле

а дикетоновый продукт соответствует формуле

в каждой из которых -А-А-, -В-В-, Υ¹, Υ² и Χ имеют значения, указанные для формулы МША.

Далее в соответствии со схемой реакций 2 проводят взаимодействие дикетона формулы ΧΙ с алкоксидом щелочного металла, получая мексренон или другой продукт формулы

- 33 009176

в каждой из которых -А-А-, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные для формулы VIII, значения К¹ аналогичны указанным для формулы V.

Этот способ осуществляют с использованием практически такой же реакционной схемы, как описанная выше для конверсии соединений формулы VI в соединения формулы V.

Предпочтительное соединение формулы XI соответствует формуле

а промежуточный продукт соответствует формуле

в каждой из которых -А-А-, -В-В-, Υ¹, Υ² ] К¹ аналогичны указанным для формулы V.

Далее соединения формулы X 9а-гидроксилируют по новому способу биоконверсии с получением продуктов формулы и X имеют значения, указанные для формулы ХША, значения

где -А-А-, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные для формулы VIII, а значения К¹ аналогичны указанным для формулы V.

Примерами микроорганизмов, которые могут быть использованы на этой стадии гидроксилирования, являются ХосагсНа сотсгийа АТСС 31548, ХосагсНа аигепйа АТСС 12674, Согупезрога саззйсо1а АТСС 16718, 81гер1отусез кудгозсоркиз АТСС 27438, МогйегеИа 1заЪе11та АТСС 42613, Веаиуепа Ъазз1апа АТСС 7159, РетсШит ригригодепит АТСС 46581, Нуротусез скгузозрегтиз IМI 109981, ТЬатпозК1ит ртЕогте АТСС 8992, Сиппт§йате11а Ыакез1ееапа АТСС 8688а, Сиппт§йате11а есЫпи1а1а АТСС 3655, СипптдкатеПа е1едапз АТСС 9245, ТпсЬокесшт гозеит АТСС 12543, Еркоссит 1шписо1а АТСС 12722, 8асскагоро1узрога егуктае АТСС 11635, Веаиуепа Ъазз1апа АТСС 13144, АйктоЪаскг з1тр1ех, Васкпит сус1оох1дапз АТСС 12673, Суйпдгосагроп гадкко1а АТСС 11011, ХосагсНа аигепйа АТСС 12674, ХосагсНа сатсгипа, ХосагсНа гезккШз 14887, Рзеидотопаз 1ез1оз1егоп1 АТСС 11996, Ккодососсиз едш АТСС 21329, МусоЪаскпит ЕогШкит АТСС 6842 и Кйодососсиз гкодосйтоиз АТСС 19150. Эту реакцию проводят, по существу, так же, как это изложено выше при описании фиг. 1 и 2. Особенно предпочтителен способ, представленный на фиг. 1.

Предпочтительная среда для выращивания, которая может быть использована в процессах биоконверсии, содержит примерно от 0,05 до примерно 5 мас.% доступного азота, примерно от 0,5 до примерно 5 мас.% глюкозы, примерно от 0,25 до примерно 2,5 мас.% дрожжевого продукта и примерно от 0,05 до примерно 0,5 мас.% доступного фосфора. Особенно предпочтительные среды для выращивания включа ют следующие компоненты:

с соевой мукой: примерно от 0,5 до примерно 3 мас.% глюкозы, примерно от 0,1 до примерно 1 мас.% соевой муки, примерно от 0,05 до примерно 0,5 мас.% галогенида щелочного металла, примерно

- 34 009176 от 0,05 до примерно 0,5 мас.% дрожжевого продукта, такого, как дрожжевой автолизат или дрожжевой экстракт, примерно от 0,05 до примерно 0,5 мас.% фосфатной соли, такой, как К₂НРО₄ (при значении рН 7);

на основе пептона-дрожжевого экстракта-глюкозы: примерно от 0,2 до примерно 2 мас.% пептона, примерно от 0,05 до примерно 0,5 мас.% дрожжевого экстракта и примерно от 2 до примерно 5 мас.% глюкозы;

среда Мюллера-Хинтона: примерно от 10 до примерно 40 мас.% говяжьего экстракта, примерно от 0,35 до примерно 8,75 мас.% казаминовых кислот, примерно от 0,15 до примерно 0,7 мас.% крахмала.

Грибы можно выращивать на питательных веществах соевой муки или пептонов, тогда как актиномицеты и эубактерии можно выращивать на соевой муке (плюс 0,5-1 мас.% соли карбоновой кислоты, такой, как формиат натрия, для биотрансформаций) или в питательной среде Мюллера-Хинтона.

Получение 11 β-гидроксимексренона из мексренона ферментацией описано в примере 19.

Продукты формулы IX являются новыми соединениями, которые можно отделять фильтрованием, промывать приемлемым органическим растворителем, например этилацетатом, и перекристаллизовывать из него же или из аналогичного растворителя. Они являются ценными промежуточными продуктами при получении соединений формулы I и прежде всего формулы 1А.

Предпочтительные соединения формулы IX соответствуют формуле IXА, в которой -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-, К³ обозначает водород, (низш.)алкил или (низш.)алкоксигруппу, а К⁸ и К⁹ совместно образуют 20-спироксановое кольцо о

А \||||/ XXXIII

На следующей стадии схемы 2 синтеза проводят взаимодействие продукта формулы IX с дегидратирующим реагентом с получением соединения формулы

где -А-А-, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные для формулы УШ, а значения К¹ аналогичны указанным для формулы У.

В случае, когда исходное вещество соответствует формуле IXА, продукт отвечает формуле ПА

в каждой из которых -А-А-, -В-В-, Υ¹, Υ² и X имеют значения, указанные для формулы XША, а значения К¹ аналогичны указанным для формулы У.

На конечной стадии этой схемы синтеза продукт формулы II превращают в продукт формулы I эпоксидированием в соответствии со способом, описанным в патенте США 4559332, или же предпочтительно согласно новому способу эпоксидирования по изобретению, который описан выше.

В особенно предпочтительном варианте способ в целом по схеме 2 осуществляют следующим образом:

- 35 009176

Схема 3

В этом случае синтез начинают с соединения формулы

XX где -А-А- и К³ имеют значения, указанные для формулы VIII, -В-В- имеет значения, указанные для формулы VIII, за исключением того, что ни К⁶, ни К⁷ не составляют части кольца, сконденсированного с Ό-кольцом в положениях 16,17, а К²⁶ обозначает (низш.)алкил, предпочтительно метил.

В результате взаимодействия соединения формулы XX с сульфонийилидом образуется эпоксидный промежуточный продукт формулы

где -А-А-, К³, -В-В- и К²⁶ имеют значения, указанные для формулы XX.

На следующей стадии схемы 3 синтеза промежуточный продукт формулы XIX превращают в другой промежуточный продукт формулы

где -А-А-, К³ и -В-В- имеют значения, указанные для формулы XX.

На этой стадии вещество формулы XIX превращают в промежуточный продукт формулы XVIII

- 36 009176 взаимодействием с ХаС11(СООЕ1)₂ в присутствии основания в растворителе. В результате обработки соединения формулы ΧνΙΙΙ горячей водой и галогенидом щелочного металла получают декарбоксилированное промежуточное соединение формулы

где -А-А-, К³ и -В-В- имеют значения, указанные для формулы ΧΧ.

Способ конверсии соединения формулы ΧΧ в соединение формулы ΧνΙΙ практически соответствует тому, который описан в патентах США 3897417, 3413288 и 3300489, включенных в настоящее описание в качестве ссылок. Хотя исходные соединения отличаются, реагенты, механизмы процессов и условия введения 17-спиролактонового остатка являются практически идентичными.

В результате взаимодействия промежуточного продукта формулы ΧνΙΙ с дегидрогенизирующим реагентом получают следующий промежуточный продукт формулы:

где -А-А-, К³ и -В-В- имеют значения, указанные выше.

Типичные эффективные дегидрогенизирующие реагенты включают дихлордицианобензохинон (ДДХ) и хлоранил (2,3,5,6-тетрахлор-п-бензохинон). В другом варианте дегидрогенизацию можно было бы провести последовательным осуществлением галоидирования по месту 6-го углеродного атома, а затем реакции дегидрогалоидирования.

Далее промежуточный продукт формулы ΧνΙ превращают в енамин формулы

где -А-А-, К³ и -В-В- имеют значения, указанные для формулы ΧΧ.

Конверсию проводят цианированием, по существу, таким путем, как это описано выше для случая конверсии 11а-гидроксисоединения формулы νΙΙΙ в енамин формулы νΙΙ. Как правило, источником цианидного иона может служить цианид щелочного металла. Предпочтительным основанием является пирролидин и/или тетраметилгуанидин. Можно использовать метанольный растворитель.

Продукты формулы Χν являются новыми соединениями, которые можно выделять хроматографическим путем. Эти и другие новые соединения формулы ΑΧV обладают существенной ценностью как промежуточные продукты для получения соединений формулы Ι и особенно формулы ЬА. Соединения

- 37 009176 где -А-А-, -В-В-, К³, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные выше.

В наиболее предпочтительных соединениях формулы АXV и XV -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-.

В соответствии с методом гидролиза, описанным выше для получения дикетоновых соединений формулы VI, енамины формулы XV могут быть превращены в дикетоны формулы

где -А-А-, К³ и -В-В- имеют значения, указанные для формулы XX.

Особенно предпочтительны для синтеза эпоксимексренона те соединения формулы XIV, которые также описываются формулой VIА.

Продукты формулы XIV являются новыми соединениями, которые могут быть выделены осаждением. Эти и другие новые соединения формулы АXIV обладают существенной ценностью как промежуточные продукты для получения соединений формулы I и особенно формулы М.. Соединения формулы АXIV соответствуют следующей структуре:

ΑΧίν где -А-А-, -В-В-, К³, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные выше.

В наиболее предпочтительных соединениях формул АXIV и XIV -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН2-СН2-.

Далее соединения формулы XIV превращают в соединения формулы XXXI, по существу, в соответствии со способом, описанным выше для превращения дикетона формулы VI в гидроксиэфир формулы V. В этом случае промежуточный продукт формулы

где -А-А-, -В-В- и К³ имеют значения, указанные для формулы XX.

Предпочтительны те соединения формулы XXXI, которые соответствуют формуле ПА. Соединения формулы XXXI превращают в соединения формулы XXXII по способу, описанному выше или в патенте США 4559332. В особенно предпочтительном варианте способ в целом по схеме 3 осуществляют следующим образом:

- 38 009176

Схема 4

выдержка при повышенной — температуре

на С ΐ

ДМСО

НС1. СН₃ОН. н_г0 · С. 5 Ч

Первые три стадии схемы 4 аналогичны тем же стадиям схемы 3, т.е. получению промежуточного продукта формулы XVII с использованием в качестве сырья соединения, соответствующего формуле XX.

После этого промежуточный продукт формулы XVII эпоксидируют, например, по способу, описанному в патенте США 4559332, с получением соединения формулы

где -А-А-, К³ и -В-В- имеют значения, указанные для формулы XX.

Однако в особенно предпочтительном варианте выполнения изобретения соединение формулы XVII эпоксидируют по 9,11 - двойной связи с использованием окислителя, включающего перекисный активатор амидного типа, наиболее предпочтительно трихлорацетамид, в соответствии со способом, который описан выше в отношении схемы 1, для превращения енэфира формулы II в продукт формулы I. Условия проведения и относительные количества реагентов в такой реакции практически такие же, как указанные для превращения енэфира формулы II в эпоксимексренон.

Было установлено, что эпоксидирование вещества формулы XVII можно также осуществлять с очень хорошим выходом с использованием надкислоты, такой, как, например, м-хлорпероксибензойная кислота. Однако применение трихлорацетамидного реагента обеспечивает возможность достижения превосходных результатов при сведении к минимуму образования побочного продукта окисления по Байеру-Вилладжеру. Этот последний побочный продукт можно удалить, но для этого требуется растирание в порошок в растворителе, таком, как этилацетат, с последущей кристаллизацией из другого растворителя, такого, как метиленхлорид. Эпоксисоединение формулы XXIV дегидрируют с получением между 6- и 7м углеродными атомами двойной связи взаимодействием с дегидрирующим (окислительным) агентом, таким, как ДДХ или хлоранил, или с использованием последовательности бромирование/дегидробромирование (или другого галоидирования/дегидрогалоидирования), в результате чего по- 39 009176

где -А-А-, -В-В- и К³ имеют значения, указанные для формулы XX.

Особенно предпочтительны те соединения формулы XXIII, в которых -А-А- и -В-В- имеют значения, указанные для формулы XIII.

Хотя прямое окисление для получения продукта формулы XXIII эффективно, выход продукта обычно низок. По этой причине в предпочтительном варианте окисление ведут в две стадии: вначале соединение формулы XXIV галоидируют по углеродному атому в 6-м положении, а затем дегидрогалоидируют с получением 6,7-олефина. В предпочтительном варианте галоидирование проводят с использованием Ν-галоидного органического реагента, такого, как, например, Ν-бромсукцинимид. Бромирование проводят в приемлемом растворителе, таком, как, например, ацетонитрил, в присутствии ускорителя галоидирования, такого, как перекись бензоила. Реакция протекает эффективно при температуре в интервале примерно от 50 до примерно 100°С, возможно, при температуре кипения с обратным холодильником при атмосферном давлении в таком растворителе, как четыреххлористый углерод, ацетонитрил или их смесь. Однако для завершения этой реакции, как правило, требуется 4-10 ч. Растворитель отпаривают и остаток растворяют в несмешивающемся с водой растворителе, например в этилацетате. Образовавшийся раствор последовательно промывают слабым щелочным раствором (таким, как бикарбонат щелочного металла) и водой или предпочтительно насыщенным рассолом с целью свести к минимуму потери продута, после чего растворитель отпаривают, а остаток растворяют в другом растворителе (таком, как диметилформамид), который приемлем для реакции дегидрогалоидирования.

В раствор совместно с галогенидом щелочного металла, таким, как Б1Вг, добавляют подходящий реагент дегидрогалоидирования, например 1,4-диазадицикло [2,2,2] октан (ДАДЦО), этот раствор нагревают до приемлемой реакционной температуры, например 60-80°С, и реакцию продолжают в течение нескольких часов, как правило 4-15 ч, до завершения дегидробромирования. По ходу реакционного цикла для завершения реакции по мере необходимости можно добавлять дополнительные количества дегидробромирующего реагента. Затем продукт формулы XXIII можно выделить, например, добавлением воды для осаждения продукта, который после этого отделяют фильтрованием и в предпочтительном варианте промывают дополнительным количеством воды. В предпочтительном варианте продукт перекристаллизовывают, например, из диметилформамида.

Продукты формулы XXIII, такие, как 9,11-эпоксиканренон, являются новыми соединениями, которые могут быть выделены экстракцией/кристаллизацией. Они обладают особой ценностью как промежуточные продукты для получения соединений формулы I и прежде всего формулы £А. Так, например, их можно использовать в качестве исходных для получения соединений формулы XXII. ВУ наиболее предпочтительных соединениях формулы XXIII -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-.

Используя, по существу, способ, описанный выше для получения соединений формулы VII, проводят взаимодействие соединений формулы XXIII с цианидным ионом, получая новые эпоксиенаминовые соединения, отвечающие формуле

где -А-А-, К³ и -В-В- имеют значения, указанные для формулы XX.

Особенно предпочтительны те соединения формулы XXII, у которых значения -А-А- и -В-В- аналогичны указанным для формулы XIII.

Продукты формулы XXII являются новыми соединениями, которые можно выделять осаждением и фильтрованием. Они обладают значительной ценностью как промежуточные продукты для получения соединений формулы I и особенно формулы £А. В наиболее предпочтительных соединениях формулы XXII -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-.

Используя, по существу, способ, описанный выше для получения соединений формулы VI, эпок- 40 009176 сиенаминовые соединения формулы XXII превращают в новые эпоксидикетоновые соединения формулы XXI.

Продукты формулы XXI являются новыми соединениями, которые можно выделять осаждением и фильтрованием. Они обладают значительной ценностью как промежуточные продукты для получения соединений формулы I и особенно формулы 1А. В особенно предпочтительных соединениях формулы XXI значения -А-А и -В-В- аналогичны указанным для формулы XIII и каждый обозначает группу -СН2-СН2-.

Соединения формулы XXI превращают в соединения формулы XXXII в соответствии со способом эпоксидирования, представленным в настоящем описании, или способом, описанным в патенте США 4559332. В особенно предпочтительном варианте способ в целом по схеме 4 осуществляют следующим образом:

Схема 5

Способ по схеме 5 начинают осуществлять с использования исходного вещества, соответствующего формуле

в которой -А-А-, -В-В- и В³ имеют значения, указанные для формулы XX. Это вещество превращают в продукт формулы

	Я3	0 II
		в
А		/
		-в
	он
МеО			XXVIII

взаимодействием с триметилортоформиатом, где -А-А-, В³ и -В-В- имеют значения, указанные для формулы XX.

После получения соединения формулы XXVШ его превращают в соединение формулы XXVΐΐ в соответствии со способом, описанным выше для конверсии вещества формулы XX в соединение формулы

- 41 009176

XVII. Соединение формулы XXVII имеет следующую структуру:

где -Α-Α-, -В-В- и К³ имеют значения, указанные для формулы XX, а К_х обозначает любую из обычных гидроксилзащищающих групп.

В соответствии со способом, описанным выше для получения соединения формулы XVI, соединение формулы XXVII окисляют с получением новых соединений формулы

в которой -Α-Α-, -В-В- и К³ имеют значения, указанные для формулы XX.

Особенно предпочтительными соединениями формул XXIX, XXVIII, XXVII и XXVI являются те, в которых -Α-Α- и -В-В- имеют значения, указанные для формулы XIII.

Продукты формулы XXVI являются новыми соединениями, которые можно выделять осаждением/фильтрованием. Они обладают значительной ценностью как промежуточные продукты для получения соединений формулы I и особенно формулы ГД.. В особенно предпочтительных соединениях формулы XXVI -Α-Α- и -В-В- имеют значения, указанные для формулы XIII, и каждый обозначает группу -СН2-СН2-.

В соответствии со способом, описанным выше для цианирования соединений формулы VIII, новые промежуточные продукты формулы XXVI превращают в новые 9-гидроксиенаминовые промежуточные продукты формулы

где -Α-Α-, К³ и -В-В- имеют значения, указанные для формулы XX.

Продукты формулы XXV являются новыми соединениями, которые можно выделять осаждением/фильтрованием. Они обладают значительной ценностью как промежуточные продукты для получения соединений формулы I и особенно формулы ЬД.. В особенно предпочтительных соединениях формулы XXV -Α-Α- и -В-В- имеют значения, указанные для формулы XIII, и каждый обозначает группу -СН2-СН2-.

С использованием, по существу, тех условий, которые описаны выше для получения дикетоновых соединений формулы VI, 9-гидроксиенаминовые промежуточные продукты формулы XXV превращают в дикетоновые соединения формулы XIV. Следует отметить, что в этом случае реакция эффективна одновременно для гидролиза енаминовой структуры и дегидратации по 9,11-положениям с образованием двойной 9,11-связи. Далее соединения формулы XIV превращают в соединения формулы XXXI, а затем в соединения формулы XIII осуществлением тех же самых стадий, которые представлены выше при описании схемы 3.

- 42 009176

В особенно предпочтительном варианте способ в целом по схеме 5 осуществляют следующим образом:

На схеме 6 предлагается предпочтительный способ получения эпоксимексренона и других соединений формулы I, начиная с 11а-гидроксилирования андростендиона или другого соединения формулы

где -А-А-, К³ и -В-В- имеют значения, указанные для формулы XIII, с получением промежуточного продукта, соответствующего формуле

где -А-А-, К³ и -В-В- имеют значения, указанные для формулы XIII.

За исключением выбора исходного вещества, способ проведения 11а-гидроксилирования, по существу, аналогичен описанному выше для схемы 1. Для проведения процесса 11а-гидроксилирования андростендиона или другого соединения формулы XXXV могут быть использованы следующие микроорганизмы: АзрегдШиз осЬгасеиз Х1К1К1, 405 (АТСС 18500), АзрегдШиз шдег АТСС 11394, АзрегдШиз шйи1апз АТСС 11267, КЫ/ориз огухае АТСС 11145, КЫхориз з1о1от£ег АТСС 6227Ъ, ТпсйоШесшт гозеит АТСС 12519 и АТСС 8685.

Далее 11а-гидроксиандрост-4-ен-3,17-дион или другое соединение формулы XXXVI превращают в 11а-гидрокси-3,4-енольный простой эфир формулы

- 43 009176

где -А-А-, В³ и -В-В- имеют значения, указанные для формулы XIII, а В¹¹ обозначает метил или другой (низш.)алкил (С₁-С₄), проведением взаимодействия с этерифицирующим реагентом, таким, как триалкилортоформиат, в присутствии кислотного катализатора.

Для осуществления такого превращения 11а-гидроксисоединение подкисляют смешением с кислотой, такой, как, например, гидрат бензолсульфокислоты или гидрат толуолсульфокислоты, и растворяют в низшем спирте, предпочтительно в этаноле. Выдерживая смесь на холоде, предпочтительно при температуре примерно от 0 до примерно 15°С, одновременно постепенно, в течение периода 5-40 мин в нее вводят триалкилортоформиат, предпочтительно триэтилортоформиат. Далее смесь нагревают и реакцию проводят при температуре от 20 до примерно 60°С. В предпочтительном варианте реакцию проводят при 30-50°С в течение 1-3 ч, а затем для завершения реакции кипятят с обратным холодильником в течение дополнительного периода, как правило, 2-6 ч. Реакционную смесь охлаждают предпочтительно до 0-15°С, предпочтительнее до примерно 5°С и в вакууме удаляют растворитель.

В соответствии с реакционной схемой, аналогичной представленной выше схеме 3 для превращения соединения формулы XX в соединение формулы XVII, 17-спиролактоновый остаток формулы XXXIII вводят в соединение формулы 101. Так, например, можно провести взаимодействие соединения формулы 101 с сульфонийилидом в присутствии основания, такого, как гидроксид щелочного металла, в приемлемом растворителе, таком, как ДМСО, с получением промежуточного продукта, соответствующего формуле

где -А-А-, В³, В¹¹ и -В-В- имеют значения, указанные для формулы 101.

Далее проводят взаимодействие промежуточного продукта формулы 102 с эфиром малоновой кислоты в присутствии алкоксида щелочного металла с образованием пятичленного спиролактонового кольца и получением промежуточного продукта формулы

где -А-А-, В³, В¹¹ и -В-В- имеют значения, указанные для формулы 101, а В¹² обозначает С1-С4(низш.)алкил.

В завершение соединение формулы 103 в приемлемом растворителе, таком, как диметилформамид, выдерживают при повышенной температуре в присутствии галогенида щелочного металла, в результате чего отщепляется алкоксикарбонильный остаток и образуется промежуточный продукт формулы

где -А-А-, В³, В¹¹ и -В-В- имеют значения, указанные для формулы XIII.

Далее 3,4-енолэфирное соединение 104 превращают в соединение формулы XXIII, т.е. такое соединение формулы VIII, у которого В⁸ и В⁹ совместно образуют остаток формулы XXXIII. Эту стадию окисления осуществляют практически таким же образом, как и стадию окисления при конверсии соединения формулы XXIV в промежуточный продукт формулы XXIII во время синтеза по схеме 4. Прямое окисле

- 44 009176 ние можно проводить с использованием такого реагента, как 2,3-дихлор-5,6-дициано-1,4-бензохинон (ДДХ) или тетрахлорбензохинон (хлоранил), или предпочтительно осуществляют двухстадийное окисление: вначале бромирование, например, Ν-галоидбромирующим агентом, таким, как Ν-бромсукцинамид (НБС) или 1,3-дибром-5,5-диметилгидантоин (ДБДМГ), а затем дегидробромирование основанием, например ДАДЦО, в присутствии Б1Вг при нагревании. В том случае, когда для бромирования используют НБС, для конверсии 3-енольного эфира в енон необходимо также использовать кислоту. ДБДМГ, представляющий собой реагент, скорее, для ионного, чем для свободно-радикального бромирования, сам по себе эффективен для бромирования и конверсии енольного эфира в енон.

Далее соединение формулы νΙΙΙ превращают в эпоксимексренон или другое соединение формулы Ι осуществлением стадий, которые представлены выше при описании схемы 1.

Каждый из промежуточных продуктов формул 101-104 является новым соединением, обладающим значительной ценностью в качестве промежуточного продукта при получении эпоксимексренона или других соединений формул ΙΔ. и Ι. В предпочтительном варианте у каждого из соединений формул 101104 -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-, а К³ обозначает водород, (низш.)алкил или (низш.)алкоксигруппу. В наиболее предпочтительном варианте соединение формулы 101 представляет собой 3-этокси-11а-гидроксиандрост-3,5-диен-17-он, соединение формулы 102 представляет собой 3-этоксиспиро[андрост-3,5-диен-17в,2'-оксиран]-11а-ол, соединение формулы 103 представляет собой γ-лактон неполного этилового эфира 3-этокси-11а,17а-дигидроксипрегна-3,5-диен-21,21-дикарбоновой кислоты, а соединение формулы 104 представляет собой γ-лактон 3-этокси-11а,17а-дигидроксипрегна3,5-диен-21-карбоновой кислоты.

В особенно предпочтительном варианте способ в целом по схеме 6 осуществляют следующим образом:

Схема 7

Схема 7 предусмотрена для синтеза эпоксимексренона и других соединений формулы Ι с использованием в качестве исходного материала соединения, представляющего собой β-ситостерин, холестерин, стигмастерин или другое соединение формулы

где -А-А-, К³ и -В-В- имеют значения, указанные для формулы ΧΙΙΙ, Ώ-Ώ обозначает группу -СН₂-СН₂

- 45 009176 или -СН=СН-, а значения каждого из К¹³, К¹⁴, К¹⁵ и К¹⁶ независимо друг от друга выбирают из водорода и С₁-С₄алкила.

На первой стадии этого синтеза биоконверсией соединения формулы XXXУII получают 11а-гидроксиандростендион или другое соединение формулы XXXУI. Процесс биоконверсии проводят, по существу, в соответствии со способом, описанным выше для 11а-гидроксилирования канренона (или другого соединения формулы XIII).

В процессе синтеза 11а-гидроксиандростендиона вначале биоконверсией соединения формулы XXXУII получают 4-андростен-3,17-дион. Эту начальную биоконверсию можно проводить по способу, представленному в патенте США 3759791, который включен в настоящее описание в качестве ссылки. После этого 4-андростен-3,17-дион превращают в 11 α-гидроксиандростендион, по существу, в соответствии со способом, описанным выше для 11а-гидроксилирования канренона (или другого соединения формулы XII).

Остальная часть синтеза по схеме 7 аналогична представленной на схеме 6. В особенно предпочтительном варианте способ в целом по схеме 7 осуществляют следующим образом:

Способы, варианты их осуществления и композиции, предлагаемые по изобретению, а также условия и реагенты, используемые при осуществлении этих способов, описаны ниже в примерах.

Пример 1.

Косячки агара готовили с использованием среды для выращивания, представленной в табл. 1.

Таблица 1

ДПГА (среда для косячков агара и чашек)

дрожжевой экстракт	20 г
пептон	20 г
глюкоза	20 г
агар	20 г
дистиллированная вода в количестве до - рН в исходном состоянии составляло 6,7 - рН с использованием Н3РО4 (10%-ная, масса/объем) доводили до 5	1000 мл
распределяли - для косячков агара: по 7,5 мл в пробирки 180 х 18 мм - для чашек (10 см в диаметре) по 25 мл в пробирки 200 х 20 мм - стерилизовали при 120° С в течение 20 мин - рН после стерилизации: 5

- 46 009176

Для получения первого поколения культур колонию ЛзрегдШиз осГгасеиз в пробирке суспендировали в 2 мл дистиллированной воды и для каждого косячка агара, который готовили по описанной выше методике, использовали 0,15-миллилитровые аликвоты этой суспензии. Косячки агара инкубировали в течение 7 дней при 25°С, после чего поверхностная культура приобрела такой же внешний вид, как у белого ватного мицелия. Обратная сторона была пигментирована в оранжевый цвет в нижней части и в желто-оранжевый цвет в верхней части.

Культуры первого поколения на косячках агара суспендировали в 4 мл стерильного раствора, содержавшего 3 мас.% продукта Твин 80 в качестве неионогенного поверхностно-активного вещества и аликвоты этой суспензии по 0,15 мл использовали для инокуляции косячков агара второго поколения, которые готовили с использованием среды для выращивания, представленной в табл. 2.

Таблица 2

Для второго поколения и обычных косячков агара

солодовый экстракт	20 г
пептон	1 г
глюкоза	20 г
агар	20 г
дистиллированная вода в количестве до - рН в исходном состоянии составляло 5,3 - распределяли по 7,5 мл в пробирки (180 х 18 мм) - стерилизовали при 120° С в течение 20 мин	1000 мл

Косячки агара второго поколения инкубировали в течение 10 дней при 25°С, получая густую массу окрашенных в золотой цвет спор, которые подвергались обратной пигментации в коричнево-оранжевый цвет.

Готовили защитную среду, состав которой представлен в табл. 3.

Таблица 3

Защитная среда

снятое молоко	10 г
дистиллированная вода	100 мл
В 250-миллилитровую колбу, содержавшую 100 мл дистиллированной воды, при 50° С добавляли снятое молоко. Стерилизовали при 120° С в течение 15 мин. Охлаждали до 33° С и использовали до окончания текущего дня

Культуры из пяти косячков агара второго поколения в 100-миллилитровой колбе суспендировали в 15 мл этого защитного раствора. Такую суспензию распределяли в виде аликвот (по 0,5 мл каждая) по пробиркам 100x10 мм для лиофилизации. Предварительно их замораживали при температуре от -70 до -80°С в бане из ацетона с сухим льдом в течение 20 мин, затем сразу же переносили в сушильную камеру, предварительно охлажденную до температуры от -40 до -50°С. Предварительно замороженные аликвоты лиофилизировали под остаточным давлением 50 мкм рт.ст. и при температуре <-30°С. По завершении лиофилизации в каждую пробирку добавляли по 2-3 гранулы стерильного силикагеля с индикатором влажности и запаивали над пламенем.

Для приготовления косячков агара с маточной культурой, приемлемых для ферментации в промышленном масштабе, в 1 мл дистиллированной воды суспендировали по одной аликвоте лиофилизованной культуры, которую готовили по описанной выше методике, и аликвоты по 0,15 мл такой суспензии использовали для инокуляции косячков агара, снабженных средой для выращивания, состав которых представлен в табл. 2. Маточные косячки агара инкубировали в течение 7 дней при 25°С. По завершении инкубационного периода культуру, выращенную на косячках агара, хранили при 4°С.

Для приготовления обычной культуры на косячке агара культуру из маточного косячка агара суспендировали в 4 мл стерильного раствора, содержавшего 3 мас.% продукта Твин 80, и образовавшуюся суспензию распределяли в виде аликвот объемом по 0,15 мл по косячкам агара, которые были покрыты средой для выращивания, представленной в табл. 2. Такие обычные культуры на косячке агара могут быть использованы при инокуляции колб с первичным посевным материалом для лабораторных или промышленных процессов ферментации.

Для приготовления культуры в узкогорлой колбе для первичного посевного материала культуру из обычного косячка агара, который готовили по описанной выше методике, удаляли и суспендировали в 10 мл раствора, содержавшего 3 мас.% продукта Твин 80. Аликвоты по 0,1 мл образовавшейся суспензии вводили в 500-миллилитровую колбу с отражательными перегородками, содержавшую среду для выращивания, состав которой представлен в табл. 4.

- 47 009176

Таблица 4

Для первичной и конверсионной культуры в узкогорлой колбе и круглодонной колбе)

глюкоза	20 г
пептон	1 г
дрожжевой автолизат	20 г
дистиллированная вода в количестве до - рН в исходном состоянии составляло 5,2 - рН с использованием ΝεΟΗ (20%-ный) доводили до 5,8 - распределяли 100 мл в 500-миллилитровой колбе с отражательными перегородками - распределяли 500 мл в 2000-миллилитровой круглодонной колбе (с 3 отражательными перегородками) - стерилизовали при 120° С в течение 20 мин - рН после стерилизации: приблизительно 5,7	1000 мл

Колбу для посевного материала инкубировали в роторной качалке (200 об/мин, 5-сантиметровое смещение) в течение 24 ч при 28°С, в результате чего культуру готовили в форме грануловидных мицелиев диаметром 3-4 мм. Наблюдениями под микроскопом было установлено, что эта посевная культура представляла собой чистую культуру с синнематическим ростом, с большими и сильно скрученными гифами. Значение рН суспензии составляло 5,4-5,6. Значение ОУМ было равным 5-8%, как это определяли центрифугированием (3000 об/мин, 5 мин).

Конверсионную культуру в узкогорлой колбе готовили инокуляцией 100 мл среды для выращивания, состав которой представлен в табл. 4, во второй 500-миллилитровой качалочной колбе с использованием 1 мл биомассы из колбы для посевного материала. Образовавшуюся смесь инкубировали в роторной качалке (200 циклов/мин, 5-сантиметровое смещение) в течение 18 ч при 28°С. Исследования этой культуры показали, что она включала грануловидные мицелии диаметром 3-4 мм. При исследовании под микроскопом этой культуры установили, что она представляла собой чистую культуру с синнематическим и нитевидным ростом, при котором верхушечные клетки были заполнены цитоплазмой, а старые клетки были вакуолизированными. Значение рН суспензии культуры составляло 5-5,2, а значение ОУМ, как его определяли центрифугированием, - 10-15%. Таким образом, эта культура оказывалась приемлемой для превращения канренона в 11а-гидроксиканренон.

г канренона пропускали через микронную коллоидную мельницу с доведением размеров частиц до примерно 5 мкм и суспендировали в 20 мл стерильной воды. В эту суспензию добавляли 40% (мас./об.) стерильный раствор глюкозы; 16% (мас./об.) стерильный раствор дрожжевого автолизата и стерильный раствор антибиотиков, причем содержание всех компонентов в табл. 5 соответствует 0 ч времени реакции. Раствор антибиотиков готовили растворением 40 мг канамицинсульфата, 40 мг тетрациклингидрохлорида и 200 мг цефалексина в 100 мл воды. Стероидную суспензию, глюкозный раствор и раствор дрожжевого автолизата ступенчато добавляли в культуру, которая содержалась в качалочной колбе.

Таблица 5

Показательное добавление стероида и растворов (добавок и антибиотиков) в ходе биоконверсии канренона в качалочной колбе)

Время реакции, часов	Стероидная суспензия мл приблизит., мг	Раствор глюкозы, мл	Раствор дрожжевого автолизата, мл	Раствор антибиотиков, мл
0	1	50	1	0,5	1
8	2	100	2	1
24	2	100	1	0,5	1
32	5	250	2	1
48	2	100	1	0,5	1
56	5	250	2	1
72	3	150	1	0,5	1
90

По мере протекания реакции реакционную смесь периодически анализировали для определения содержания глюкозы и тонкослойной хроматографией определяли степень конверсии в 11а-гидроксиканренон. В ходе проведения такой реакции дополнительные количества канренонового

- 48 009176 субстрата и питательных веществ вводили в ферментационную реакционную смесь с расходом, который регулировали таким образом, чтобы поддержать концентрацию глюкозы на уровне приблизительно 0,1 мас.%. Режим добавления стероидной суспензии, глюкозного раствора, раствора дрожжевого автолизата и раствора антибиотиков представлен в табл. 5. Реакцию превращения в роторной качалке продолжали в течение 96 ч при 25°С (200 циклов/мин, 5-сантиметровое смещение). Значение рН в ходе проведения ферментации находилось в пределах 4,5-6,0. Всякий раз, когда значение ОУМ достигало или превышало 60%, отбирали 10-миллилитровую порцию бульонной культуры и ее заменяли 10 мл дистиллированной воды. Об исчезновении канренона и появлении 11а-гидроксиканренона во время такой реакции судили путем отбора проб питательной среды через интервалы 4, 7, 23, 31, 47, 55, 71, 80 и 96 ч после начала ферментационного цикла и анализом этих проб тонкослойной хроматографией. Ход реакции, как это определяли анализом проб, представлен в табл. 6.

Таблица 6

Время биоконверсии канренона в качающейся колбе

Время, часов	Степень превращения Канренон КГ 11а-гидроксиканренон КР = 0,81 КР = 0,29
0	100	0,0
4	50	50
7	20	80
23	20	80
31	30	70
47	20	80
55	30	70
71	25	75
80	15	85
96	-10	-90

Пример 2.

Первичную посевную культуру в узкогорлой колбе готовили аналогично примеру 1. Готовили питательную смесь, состав которой представлен в табл. 7.

Таблица 7 Для конверсионной культуры в 10-литровом стеклянном ферментере

	количество	г/л
глюкоза	§0 г	20
пептон	80 г	20
дрожжевой автолизат	0,5 г
пеногаститель 8АС 471	4 л
дистиллированная вода в количестве до - пустой ферментер стерилизовали в течение 30 мин при 130° С - загружали 3 л деионизированной воды, выдерживали при 40°С - при одновременном перемешивании добавляли компоненты питательной среды - перемешивали в течение 15 мин, объем доводили до 3,9 л - значение рН без регулирования состав ляло 5,1 - добавлением 20%-ного (масса/объем) МаОН доводили до 5,8 - стерилизовали при 120° С в течение 20 мин - значение рН после стерилизации: 5,5-5,7	1000 мл

Начальную 4-литровую порцию этой питательной смеси вводили в конверсионный ферментер, имеющий объем 10 л. Этот ферментер имел цилиндрическую конфигурацию при соотношении между высотой и диаметром 2,58. Его оборудовали турбинной мешалкой со скоростью вращения 400 об/мин, которая была снабжена двумя дисковыми колесами № 2 с 6 лопатками на каждом. Внешний диаметр рабочих колес составлял 80 мм, радиальный размер каждой из лопаток был равным 25 мл, а высота 30 мм, причем верхнее колесо находилось на 280 мм ниже верха сосуда, а нижнее колесо находилось на 365 мм

- 49 009176 ниже этого верха сосуда, высота отражательных перегородок в сосуде составляла 210 мм и они выступали в радиальном направлении от внутренней стороны вертикальной стенки сосуда к центру на расстояние 25 мм.

мл посевной культуры смешивали в ферментере с загружаемой питательной средой и конверсионную культуру инкубировали в течение 22 ч при 28°С, степени аэрации 0,5 л/л-мин и под давлением 0,5 кг/см². По истечении 22 ч значение ОУМ культуры составляло 20-25%, а значение рН было равным 5,0-5,2.

Готовили суспензию, которая включала 80 г канренона в 400 мл стерильной воды, и 10-миллилитровую порцию добавляли в смесь, находившуюся в конверсионном ферментере. Одновременно с этим в количествах, указанных в табл. 8, на момент, который соответствовал 0 ч времени реакции, добавляли 40% (мас./об.) стерильный раствор глюкозы, 16% (мас./об.) стерильный раствор дрожжевого автолизата и стерильный раствор антибиотиков. Раствор антибиотиков готовили так, как изложено в примере 1.

Таблица 8

Показательное добавление стероида и растворов (добавок и антибиотиков) в ходе биоконверсии канренона в 10-литровом стеклянном ферментере)

Время реакции	Стероидная суспензия	Раствор глюкозы, мл	Раствор дрожжевого автолизата, мл	Раствор антибиотиков, мл
мл	приблизит.,мг
0	10	4	25	12,5	40
4			25	12,5
8	10	4	25	12,5
12			25	12,5
16	10	4	25	12,5
20			25	12,5
24	10	4	25	12,5	40
28	10	4	25	12,5
32	12,5	5	25	12,5
36	12,5	5	25	12,5
40	12,5	5	25	12,5
44	12,5	5	25	12,5
48	12,5	5	25	12,5	40
52	12,5	5	25	12,5
56	12,5	5	25	12,5
60	12,5	5	25	12,5
64	12,5	5	25	12,5
68	12,5	5	25	12,5
72	12,5	5	25	12,5	40
76	12,5	5	25	12,5
80
84
88

По мере протекания реакции реакционную смесь периодически анализировали для определения содержания глюкозы и тонкослойной хроматографией определяли степень конверсии в 11а-гидроксиканренон. Основываясь на результатах тонкослойного хроматографического анализа образцов реакционной питательной среды, как это изложено ниже, по мере расхода канренонового субстрата в реакционную смесь вводили дополнительные количества канренона. Следили также за содержанием глюкозы и всякий раз, когда содержание глюкозы падало до уровня приблизительно 0,05 мас.% или ниже, дополнительное количество глюкозного раствора добавляли таким образом, чтобы повысить концентрацию приблизительно до 0,25 мас.%. Через определенные промежутки времени по ходу реакционного цикла добавляли также питательные вещества и антибиотики. Режим добавления стероидной суспензии, глюкозного раствора, раствора дрожжевого автолизата и раствора антибиотиков представлен в табл. 8. Реакцию превращения продолжали в течение 90 ч при степени аэрации 0,5 об. воздуха/об. жидкости в минуту (об./об.-мин) при положительном давлении в пространстве над жидкостью 0,3 кг/см².

- 50 009176

Температуру поддерживали на уровне 28°С до тех пор, пока значение ОУМ не достигало 45%, а затем температуру снижали до 26°С и поддерживали на этом уровне, пока значение ОУМ возрастало с 45 до 60%, после чего поддерживали на уровне 24°С. Начальная скорость вращения мешалки при перемешивании была равной 400 об/мин, а по прошествии 40 ч ее повышали до 700 об/мин. Значение рН поддерживали в пределах 4,7-5,3 добавлением в зависимости от потребности 2 М ортофосфорной кислоты или 2 М ЫаОН. По мере образования пены вспенивание подавляли добавлением нескольких капель продукта Απίίίοαιη 8ΑΟ 471. Об исчезновении канренона и появлении 11а-гидроксиканренона во время такой реакции судили по результатам тонкослойного хроматографического анализа проб каждые 4 ч. Когда большая часть канренона из питательной среды исчезала, вводили дополнительные порции.

После введения всех дополнительных количеств канренона реакцию завершали, когда тонкослойный хроматографический анализ показывал, что концентрация канренонового субстрата относительно 11а-гидроксиканренонового продукта падала приблизительно до 5%.

По завершении реакционного цикла культуральную жидкость фильтровали через сырную салфетку, отделяя мицелий от жидкой питательной среды. Мицелиевую фракцию вновь суспендировали в этилацетате с использованием приблизительно 65 об. жидкости (5,2 л) на 1 г загруженного в ходе проведения реакции канренона. Эту суспензию мицелиев в этилацетате кипятили с обратным холодильником в течение 1 ч с перемешиванием, охлаждали примерно до 20°С и фильтровали на воронке Бюхнера. Мицелиевый фильтровальный пирог промывали последовательно этилацетатом (5 об. на 1 г загруженного канренона, 0,4 л) и деионизированной водой (500 мл) с целью вытеснить из фильтровального пирога этилацетатный экстракт. Этот фильтровальный пирог выбрасывали в отход. Обогащенный экстракт, промывной растворитель и промывную воду собирали в сепараторе и затем для разделения на фазы оставляли стоять в течение 2 ч.

Далее водную фазу выбрасывали в отход, а органическую фазу концентрировали в вакууме до остаточного объема 350 мл. Эти кубовые остатки охлаждали до 15°С и в течение приблизительно 1 ч выдерживали в условиях перемешивания. Образовавшуюся суспензию фильтровали для удаления кристаллического продукта и фильтровальный пирог промывали 40 мл этилацетата. После сушки выход 11а-гидроксиканренона, по данным определения, составлял 60 г.

Пример 3.

Суспензию спор готовили с использованием обычного косячка агара по методу, который описан в примере 1. В 500 мл питательного раствора, состав которого представлен в табл. 4, находившегося в 2000-миллилитровой круглодонной колбе с отражательными перегородками (3 отражательные перегородки каждая размерами 50x30 мм), в виде 0,5-миллилитровой аликвоты вносили суспензию спор. Образовавшуюся смесь инкубировали в этой колбе в течение 24 ч при 25°С в возвратно-поступательной качалке (120 об/мин, 5-сантиметровое смещение), в результате чего получали культуру, которая по данным микроскопного исследования являлась чистой культурой с сильно скрученными гифами. Значение рН этой культуры находилось примерно от 5,3 до 5,5, а значение ОУМ (как его определяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин) составляло 8-10%.

С использованием приготовленной таким образом культуры посевную культуру готовили в ферментере из нержавеющей стали с конфигурацией вертикального цилиндра, фактический объем которого составлял 160 л, а соотношение между высотой и диаметром было равным 2,31 (высота 985 мм, диаметр 425 мм). Этот ферментер оборудовали дисковой мешалкой турбинного типа, которая была снабжена двумя колесами, причем на каждом колесе имелось по шесть лопаток внешним диаметром 240 мм, радиальный размер каждой из лопаток был равным 80 мл, а высота 50 мм. Верхнее колесо находилось на глубине 780 мм относительно верхушки ферментера, а второе колесо находилось на глубине 995 мм. Высота вертикальных отражательных перегородок составляла 890 мм, они выступали в радиальном направлении от внутренней стороны вертикальной стенки ферментера к центру на расстоянии 40 мм. Мешалка вращалась со скоростью 170 об/мин. В этот ферментер вводили 100 л питательной смеси, состав которой приведен в табл. 9, а затем 1-литровую порцию приготовленного по описанной выше методике предварительного инокулята, значение рН которого составляло 5,7.

- 51 009176

Таблица 9

Для активной растущей культуры в 160-литровом ферментере при засевании рабочего ферментера необходимо примерно 8 л материала

	количество	г/л
глюкоза	2 кг	20
пептон	2 кг	20
дрожжевой автолизат	2 кг	20
пеногаститель 8АО 471	0,010 л	следы
дистиллированная вода в количестве до - пустой ферментер стерилизовали в течение 30 мин при 130° С - загружали 6 л деионизированной воды, выдерживали при 40° С - при одновременном перемешивании добавляли компоненты питательной среды - перемешивали в течение 15 мин, объем доводили до 95 л - стерилизовали при 121 °С в течение 30 мин - значение рН после стерилизации составляло 5,7 - стерильной деионизированной воды добавляли до объема 100 л	1000 мл

Инокулированную смесь инкубировали в течение 22 ч при степени аэрации 0,5 л/л· мин при положительном давлении в пространстве над жидкостью 0,5 кг/см². Температуру поддерживали на уровне 28°С до тех пор, пока значение ОУМ не достигало 25%, а затем ее снижали до 25°С. Значение рН регулировали в пределах 5,1-5,3. Рост объема мицелия совместно с профилями значений рН и содержания кислорода, растворенного в реакционной среде для посевной культуры, показан в табл. 10.

Таблица 10

Процесс роста мицелия по времени при наработке посевного материала

Ферментационный период, ч	Значение рН	Объем уплотненного мицелия (ОУМ), % (3000 об/мин, 5 мин)	Содержание растворенного кислорода, %
0	5,7±0,1		100
4	5,7±0,1
8	5,7±0,1	12±3	85±5
12	5,7±0,1	15±3	72±5
16	5,5±0,1	25±3	40 ±5
20	5,4±0,1	30±3	35±5
22	5,3±0,1	33±3	30±5
24	5,2±0,1	35±3	25 ±5

С использованием приготовленного таким образом посевного материала процесс конверсионной ферментации проводили в вертикальном цилиндрическом ферментере из нержавеющей стали, который характеризовался диаметром 1,02 м, высотой 1,5 и фактическим объемом 1,4 м³. Этот ферментер оборудовали турбинной мешалкой, которая была снабжена двумя рабочими колесами, одно из которых находилось на 867 мм ниже верхушки реактора, а другое отстояло от верхушки на 1435 мм. На каждом колесе имелось по шесть лопаток, радиальный размер каждой из которых был равным 95 см, а высота 75 см. Вертикальные отражательные перегородки высотой 1440 мм выступали в радиальном направлении от внутренней стороны вертикальной стенки ферментера к центру на расстоянии 100 мм. Готовили питательную смесь, состав которой приведен в табл. 11.

- 52 009176

Таблица 11

Для биоконверсионной культуры в 1000-литровом ферментере

	количество	г/л
глюкоза	16 кг	23
пептон	16 кг	23
дрожжевой автолизат	16 кг	23
пеногаститель 8АО 471	0,080 л	следы
дистиллированная вода в количестве до - пустой ферментер стерилизовали в течение 1 ч при 130° С - загружали 600 л деионизированной воды, выдерживали при 40° С - при одновременном перемешивании добавляли компоненты питательной среды - перемешивали в течение 15 мин, объем доводили до 650 л - стерилизовали при 121 °С в течение 30 мин - значение рН после стерилизации составляло 5,7 - стерильной деионизированной воды добавляли до объема 700 л	1000 мл

В ферментер вводили в виде начальной порции 700 л этой питательной смеси (при рН 5,7), а затем 7 л посевного материала из данного примера, приготовленного по описанной выше методике.

Питательную смесь, содержавшую инокулят, инкубировали в течение 24 ч при степени аэрации 0,5 л/л-мин и под давлением в пространстве над жидкостью 0,5 кг/см². Температуру поддерживали на уровне 28°С, а скорость вращения мешалки при перемешивании составляла 110 об/мин. Рост объема мицелия показан в табл. 12 вместе с профилями значений рН и содержания кислорода, растворенного в реакционной среде для посевной культуры.

Таблица 12

Процесс роста мицелия по времени в ферментере с конверсионной культурой

Ферментационный период, ч	Значение рН	Объем уплотненного мицелия (ОУМ), % (3000 об/мин, 5 мин)	Содержание растворенного кислорода, %
0	5,6±0,2		100
4	5,5±0,2		100
8	5,5±0,2	12±3	95±5
12		15±3	90 ±5
16	5,4±0,1	20 ±5	75 ±5
20	5,3±0,1	25 ±5	60 ±5
22	5,2±0,1	30±5	40±5

По завершении инкубации отмечали гранулирование мицелия, но гранулы, в общем, были малого размера и образовывали относительно рыхлую массу. Диффузный мицелий суспендировали в питательной среде. Конечные значения рН составляли 5,1-5,3.

В приготовленную таким образом трансформированную культуру вводили 1,250 кг суспензии канренона (обработанной в микронной коллоидной мельнице до размеров частиц 5 мкм) в 5 л стерильной воды. В пропорциях, указанных в табл. 14, на момент времени реакции 0 ч добавляли стерильный раствор добавок и раствор антибиотиков. Состав раствора добавок приведен в табл. 13.

- 53 009176

Таблица 13

Для конверсионной культуры

	количество
декстроза	40 кг
дрожжевой автолизат	8 кг
пеногаститель 8АО 471	0,010 л
дистиллированная вода в количестве до - пустой 150-литровый ферментер стерилизовали в течение 1 ч при 130° С - загружали 70 л деионизированной воды, выдерживали при 40° С - при одновременном перемешивании добавляли компоненты раствора добавок” - перемешивали в течение 15 мин, объем доводили до 95 л - значение рН до регулирования составляло 4,9 - стерилизовали при 120 °С в течение 20 мин - значение рН после стерилизации составляло 5

Биоконверсию проводили в течение примерно 96 ч при степени аэрации 0,5 л/л-мин и под давлением в пространстве над жидкостью 0,5 кг/см², а значение рН, которое находилось в пределах 4,7-5,3, регулировали по мере необходимости добавлением 7,5 М №ОН или 4 М Н₃РО₄. Скорость вращения мешалки при перемешивании, которая вначале составляла 100 об/мин, по истечении 40 ч повышали до 165 об/мин и до 250 об/мин по истечении 64 ч. Начальная температура была равной 28°С, но когда ОУМ достигал 45%, ее снижали до 26°С, а когда ОУМ возрастал до 60%, ее снижали до 24°С. По мере необходимости для подавления пенообразования в виде мелких капель добавляли продукт ЗАО 471. Содержание глюкозы во время ферментации проверяли через 4-часовые интервалы и каждый раз, как концентрация глюкозы опускалась ниже 1 г/л, в рабочую массу вводили 10-литровые добавки стерильного раствора глюкозы. За исчезновением канренона и появлением 11а-гидроксиканренона во время такой реакции также следили по результатам высокоэффективного жидкостного хроматографического анализа. Когда по меньшей мере 90% исходной порции канренона превращалось в 11а-гидроксиканренон, вводили дополнительные порции канренона по 1,250 кг. Когда по результатам анализа конверсия этой дополнительной порции канренона достигала 90%, вводили следующую порцию 1,250 кг канренона. Придерживаясь в дальнейшем такого же принципа добавок (по 1,250 кг каждая), в общей сложности в реактор загружали 20 кг канренона. После ввода в реактор всей массы канренона, когда концентрация непрореагировавшего канренона относительно количества образовавшегося 11а-гидроксиканренона достигала 5%, процесс завершали. График добавления канренона, стерильного раствора добавок и раствора антибиотиков представлены в табл. 14.

- 54 009176

Таблица 14

Дополнительные порции стероида и растворов (добавки и антибиотики) в ходе проведения биоконверсии канренона в ферментере

Время реакции	КАНРЕНОН в суспензии кг дополни- тельно, кг	Стерильный раствор добавок, литров	Раствор антибиотиков, литров	Приблизительный объем, литров
0	1,250	1,25	10	8	700
4			10
8	1,250	2,5	10
12			10
16	1,250		10
20			10
24	1,250	5	10	8	800
28	1,250		10
32	1,250		10
36	1,250		10
40	1,250		10
44	1,250		10
48	1,250	12,5	10	8	800
52	1,250		10
56	1,250		10
60	1,250		10
64	1,250		10
68	1,250		10
72	1,250	20	10	8	1050
76				0
80
84
88
92
Всего

По завершении биоконверсии центрифугированием в корзиночной центрифуге отделяли мицелии от питательной среды. Фильтрат, как определяли высокоэффективной жидкостной хроматографией, включал всего 2% от общего количества 11а-гидроксиканренона, содержавшегося в питательной среде после сбора клеток, поэтому его выбрасывали. Мицелии суспендировали в 1000 л этилацетата в экстракторе емкостью 2 м³. Образовавшуюся суспензию выдерживали с перемешиванием в течение 1 ч при повышенной температуре, в условиях кипячения этилацетата с обратным холодильником, а затем охлаждали и центрифугировали в корзиночной центрифуге. Прессованную мицелиевую биомассу промывали 200 л этилацетата, после чего выбрасывали в отход. Для отделения водной фазы обогащенному стероидом экстракту в растворителе давали постоять в течение 1 ч. Водную фазу экстрагировали дополнительным количеством (200 л) этилацетатного растворителя, а затем направляли в отход. Объединенные растворительные фазы осветляли центрифугированием и помещали в концентратор (фактический объем 500 л), в котором концентрировали в вакууме до остаточного объема 100 л. В процессе выпаривания начальное количество загружаемых в концентратор объединенных экстракта и промывных растворов составляло 100 л; этот объем по мере улетучивания растворителя поддерживали на постоянном уровне непрерывным или периодическим добавлением объединенного раствора. После завершения стадии выпаривания кубовые остатки охлаждали до 20°С и перемешивали в течение 2 ч, а затем фильтровали на воронке Бюхнера. Рабочую емкость концентратора промывали 20 л этилацетата и этот промывной раствор в дальнейшем использовали для промывки фильтровального пирога на фильтре. Продукт сушили в ва

- 55 009176 кууме при 50°С в течение 16 ч. Выход 11а-гидроксиканренона составлял 14 кг.

Пример 4.

Лиофилизированные споры микроорганизма АзрегдШш осЬгаееиз ΝΚΚΕ 405 суспендировали в 2 мл среды для выращивания на основе кукурузного экстракта, состав которой приведен в табл. 15.

Таблица 15

Среда для выращивания на основе кукурузного экстракта (Среда для выращивания при культивировании первичного посевного материала)

кукурузный экстракт	30 г
дрожжевой экстракт	15 г
первичный кислый фосфат аммония	3 г
глюкоза (загружали после стерилизации) дистиллированная вода в количестве До объема 1000 мл, рН изначально 4,6, добавлением 20%-ного МаОН рН доводили до 6,5, 50-миллилитровыми порцияи вводили в 250миллилитровую колбу Эрленмейера, стерилизовали при 121°С в течение 20 мин	30 г

Готовую суспензию использовали в составе инокулята для размножения спор на агаровых чашках. Готовили десять агаровых чашек, в каждой из которых содержалась твердая среда для выращивания на основе глюкозы/дрожжевого экстракта/фосфата/агара, состав которой представлен в табл. 16.

Таблица 16 ГДФА (глюкоза/дрожжевой экстракт/фосфат/агар для чашек)

глюкоза (загружали после стерилизации)	10 г
дрожжевой экстракт	2,5 г
К2НРО4	3 г
агар дистиллированная вода в количестве до объема 1000 мл рН доводили до 6,5 стерилизовали при 121°С в течение 30 мин	20 г

По одной 0,2-миллилитровой аликвоте этой суспензии переносили на поверхность каждой чашки.

Чашки инкубировали при 25°С в течение десяти дней, после чего споры из всех чашек собирали в стерильную криогенную защитную среду, состав которой представлен в табл. 17.

Таблица 17

ГДФ/глицерин (глюкоза/дрожжевой экстракт/фосфат/глицерин в качестве среды для выращивания в пробирках с маточной культурой)

глюкоза (загружали после стерилизации)	10 г
дрожжевой экстракт	2,5 г
К2НРО4	3 г
глицерин дистиллированная вода в количестве до объема 1000 мл стерилизовали при 121° С в течение 30 мин	20 г

Готовую суспензию распределяли в 20 пробирок, перенося в каждую пробирку по 1 мл материала. Эти пробирки составляют банк клеток штамма хозяина, который можно увеличить с получением банка рабочих клеток, используемого при приготовлении инокулята для биоконверсии канренона в 11а-гидроксиканренон. Пробирки, которые составляли банк клеток штамма хозяина, хранили в паровой фазе морозильника с жидким азотом при -130°С.

В начале создания банка рабочих клеток споры из единственной пробирки банка клеток штамма хозяина повторно суспендировали в 1 мл стерильной среды для выращивания, состав которой представлен в табл. 15. Приготовленную суспензию делили на десять 0,2-миллилитровых аликвот и каждую аликвоту использовали для инокуляции одной агаровой чашки, содержавшей твердую среду для выращивания, состав которой представлен в табл. 16. Эти чашки инкубировали при 25°С в течение 10 дней. К третьему дню инкубирования нижняя сторона среды для выращивания имела коричнево-оранжевую окраску. По завершении инкубирования получали большое количество спор, окрашенных в золотистый цвет. Споры

- 56 009176 из каждой чашки собирали по методу создания банка клеток штамма хозяина, который описан выше. В общей сложности готовили 100 пробирок, каждая из которых содержала 1 мл суспензии. Эти пробирки составляли банк рабочих клеток. Пробирки банка рабочих клеток также сохраняли выдержкой в паровой фазе морозильника с жидким азотом при -130°С.

мл среды для выращивания, состав которой представлен в табл. 15, загружали в

250-миллилитровую колбу Эрленмейера. В эту колбу вводили 0,5-миллилитровую аликвоту рабочей суспензии клеток и смешивали со средой для выращивания. Инокулированную смесь инкубировали при 25°С в течение 24 ч с получением первичной посевной культуры, процентный объем уплотненных мицелиев которой составлял приблизительно 45%. Визуальным исследованием этой культуры устанавливали, что она включала грануловидные мицелии диаметром 1-2 мм, а по данным исследования с помощью микроскопа она представляла собой чистую культуру.

Культивирование вторичной посевной культуры инициировали введением среды для выращивания, состав которой представлен в табл. 15, в колбу Фернбаха емкостью 2,8 л и инокуляцией среды 10-миллилитровой порцией первичной посевной культуры данного примера, приготовление которой описано выше. Инокулированную смесь инкубировали при 25°С в течение 24 ч в роторной качалке (200 об/мин, 5-сантиметровое смещение). По завершении инкубации культура проявляла те же самые свойства, которые описаны выше для первичной посевной культуры, и была приемлема для применения при ферментационном превращении, в ходе проведения которого канренон подвергали конверсии в 11а-гидроксиканренон.

Процесс превращения проводили в ферментере Вгаип Е Вю81а1 следующей конфигурации:

емкость: 15 л, круглодонная;

круглодонная высота: 53 см;

диаметр: 20 см;

соотношение высота/диаметр: 2,65;

мешалки: диаметром 7,46 см, шесть лопаток размерами 2,2х1,4 см каждая;

расстояние между мешалками: 65,5, 14,5 и 25,5 см от днища сосуда;

отражательные перегородки: четыре размерами 1,9х48 см;

барботер: диаметром 10,1 см, 21 отверстие диаметром по 1 мм;

регулирование температуры: обеспечивалось с помощью внешней рубашки вокруг сосуда.

Канренон суспендировали в концентрации 20 г/л в 4 л деионизированной воды и добавляли 2-литровую порцию среды для выращивания, состав которой представлен в табл. 18, одновременно перемешивая смесь в ферментере при скорости вращения мешалки 300 об/мин.

Таблица 18

Среда для выращивания биоконверсионной культуры в 10-литровом ферментере

	общее количество	количество/г
глюкоза (загружали после стерилизации)	160 г	20 г
пептон	160 г	20 г
дрожжевой экстракт	160 г	20 г
пеногаститель 8АО 471	4,0 мл	0,5 мл
канренон деионизированная вода в количестве до 7,5 л стерилизовали при 121°С в течение 30 мин	160 г	20 г

Образовавшуюся суспензию перемешивали в течение 15 мин, после чего добавлением дополнительного количества деионизированной воды объем доводили до 7,5 л. На этом этапе добавлением 20 мас.% раствора №ОН значение рН суспензии доводили до интервала 5,2-6,5 и затем суспензию стерилизовали выдержкой при 121 °С в течение 30 мин в ферментере фирмы Вгаип Е. После стерилизации значение рН было равным 6,3+0,2, а конечный объем составлял 7 л. Стерилизованную суспензию инокулировали 0,5-литровой порцией вторичной посевной культуры этого примера, которую готовили по описанноый выше методике, и добавлением 50% стерильного раствора глюкозы объем доводили до 8 л. Ферментацию проводили при температуре 28°С до тех пор, пока ОУМ не достигал 50%, после чего температуру снижали до 26°С, а когда ОУМ превышал 50%, ее снижали до 24°С, что позволяло постоянно поддерживать значением ОУМ ниже приблизительно 60%. Воздух вводили через барботер с расходом потока 0,5 об./об.-мин в пересчете на начальный объем жидкости, а манометрическое давление в ферментере поддерживали на уровне 700 мбар. Перемешивание начинали при скорости вращения мешалки 600 об/мин, а затем ее по мере необходимости ступенчато повышали до 1000 об/мин, поддерживая со

- 57 009176 держание растворенного кислорода выше 30 об.%. Следили за концентрацией глюкозы. После того как вследствие расхода на реакцию ферментации первоначально высокая концентрация глюкозы падала до уровня ниже 1%, с использованием стерильного раствора глюкозы концентрацией 50 мас.% вводили дополнительное количество глюкозы, поддерживая ее концентрацию в течение оставшейся части периодического процесса в интервале 0,05-1%. Перед инокуляцией значение рН составляло 6,3±0,2. После падения значения рН приблизительно до 5,3 в начальный период ферментации в течение оставшейся части технологического цикла добавлением гидроксида аммония его поддерживали в интервале 5,5±0,2. Вспенивание подавляли добавлением полиэтиленгликолевого пеногасителя, поставляемого на рынок под товарным знаком 8АО 471 фирмой О81 8рее1а111е8, 1пс.

Рост культуры происходил главным образом в течение первых 24 ч технологического цикла, причем к этому моменту времени ОУМ достигал примерно 40%, значение рН было равным приблизительно 5,6, а содержание растворенного кислорода составляло около 50 об.%. Конверсия канренона начиналась еще во время роста культуры. Во время биоконверсии посредством ежедневного анализа проб следили за концентрацией канренона и 11а-гидроксиканренона. Пробы экстрагировали горячим этилацетатом и получаемые растворы проб анализировали тонкослойной хроматографией и высокоэффективной жидкостной хроматографией. Полагали, что биоконверсия завершалась, когда концентрация остаточного канренона составляла примерно 10% от начальной концентрации. Приблизительная продолжительность конверсии была равной 110-130 ч.

Когда биоконверсия завершалась, мицелиевую биомассу отделяли от питательной среды центрифугированием. Образовавшийся сверху слой экстрагировали равным объемом этилацетата и водный слой выбрасывали в отход. Мицелиевую фракцию вновь суспендировали в этилацетате с использованием приблизительно 65 об. на 1 г канренона, загруженного в ферментационный реактор. Эту мицелиевую суспензию при перемешивании кипятили с обратным холодильником в течение 1 ч, охлаждали примерно до 20° С и фильтровали на воронке Бюхнера. Мицелиевый фильтровальный пирог дважды промывали 5 объемами этилацетата на 1 г канренона, загруженного в ферментер, и затем промывали 1 л деионизированной воды с целью вытеснить остаточный этилацетат. Водный экстракт, обогащенный продуктом растворитель, растворительные промывные и водные промывные жидкости объединяли. В зависимости от результатов анализа на остаточные стероиды в оставшемся истощенном мицелиевом фильтровальном пироге его либо выбрасывали в отход, либо вновь экстрагировали. Объединенным жидким фазам давали отстояться в течение 2 ч. После этого водную фазу отделяли и выбрасывали в отход, а органическую фазу концентрировали в вакууме до достижения остаточного объема приблизительно 500 мл. Затем перегонную колбу охлаждали примерно до 15°С и медленно перемешивали при этой температуре в течение приблизительно 1 ч. Кристаллический продукт выделяли фильтрованием и промывали 100 мл очень холодного этилацетата. Выпариванием из кристаллов удаляли растворитель и кристаллический продукт сушили в вакууме при 50°С.

Пример 5.

Лиофилизированные споры микроорганизма АзрегдШиз осЬгасеиз АТСС 18500 суспендировали в 2 мл среды для выращивания на основе кукурузного экстракта, как это изложено в примере 4. Также аналогично примеру 4 готовили десять агаровых чашек. Эти чашки инкубировали и продукт собирали согласно примеру 4, создавая банк клеток штамма хозяина. Пробирки, которые составляли банк клеток штамма хозяина, хранили в паровой фазе морозильника с жидким азотом при -130°С.

Из пробирки банка клеток штамма хозяина согласно изложенному в примере 4 создавали банк рабочих клеток, который хранили в азотном морозильнике при -130°С.

300 мл среды для выращивания, состав которой представлен в табл. 19, загружали в 2-литровую колбу с отражательными перегородками. В эту колбу вводили 3-миллилитровую аликвоту рабочей суспензии клеток. Инокулированную смесь инкубировали при 28°С в течение 20-24 ч в роторной качалке (200 об/мин, 5-сантиметровое смещение) с получением первичной посевной культуры, процентный объем уплотненных мицелиев которой составлял приблизительно 45%. Визуальным исследованием этой культуры устанавливали, что она включала гранулоподобные мицелии диаметром 1-2 мм, а по данным исследования с помощью микроскопа, она представляла собой чистую культуру.

Таблица 19 Среда для выращивания первичной и вторичной посевной культуры

	количество/л
глюкоза (загружали после стерилизации)	20 г
пептон	20 г
дрожжевой экстракт	20 г
дистиллированная вода в количестве до 1000 мл стерилизовали при 121° С в течение 30 мин

- 58 009176

Культивирование вторичной посевной культуры инициировали введением 8 л среды для выращивания, состав которой представлен в табл. 19, в 14-литровый стеклянный ферментер. Этот ферментер инокулировали 160-200 мл первичной посевной культуры данного примера, приготовление которого описано выше.

Инокулированную смесь инкубировали при 28°С в течение 18-20 ч при скорости вращения мешалки 200 об/мин, степень аэрации составляла 0,5 об./об. мин. По завершении размножения культура проявляла те же самые свойства, что описаны выше для первичной посевной культуры.

Процесс превращения проводили в 60-литровом ферментере практически аналогично тому, как это описано в примере 4, за исключением того, что среда для выращивания имела состав, который указан в табл. 20, а первоначально загружаемая порция вторичной посевной культуры составляла 350-700 мл. Скорость вращения мешалки при перемешивании вначале была равной 200 об/мин, а затем ее по мере необходимости поддерживать концентрацию растворенного кислорода выше 10 об.% повышали до 500 об/мин. Примерная продолжительность биоконверсии для 20 г/л канренона составляла 80-160 ч.

Таблица 20 Среда для выращивания биоконверсионной культуры в 60-литровом ферментере

	общее количество	количесгво/г
глюкоза (загружали после стерилизации)	17,5 г	0,5 г
пептон	17,5 г	0,5 г
дрожжевой экстракт	17,5 г	0,5 г
канренон (загружали в виде 20%-ной суспензии в стерильной воде)	700 г	20 г
деионизированная вода в количестве до 35 л стерилизовали при 121° С в течение 30 мин

Пример 6.

С использованием суспензии спор из банка рабочих клеток, созданного в соответствии со способом, описанным в примере 4, также, по существу, по методу, который описан в примере 4, готовили первичную и вторичную посевные культуры. С использованием вторичной посевной культуры, полученной по этому методу, в соответствии с модифицированным способом такого типа, как проиллюстрированный на фиг. 1, проводили два эксперимента с биоконверсией и два эксперимента с биоконверсией проводили согласно способу, проиллюстрированному на фиг. 2. Состав среды для выращивания микроорганизма для биоконверсии, графики добавления канренона, время получения продукта и степень конверсии в этих экспериментах представлены в табл. 21. В ходе проведения эксперимента К2А использовали схему добавления канренона, основанную на том же принципе, что и представленная в примере 3, в то время как в ходе проведения эксперименте К2В использовали схему примера 3, модифицированную применением только двухразового добавления канренона: один раз в начале периодического процесса и один раз по прошествии 24 ч. В экспериментах К2Б и К2Г все количество канренона вводили в начале периодического процесса и процесс проводили в целом аналогично примеру 4, за исключением того, что порцию загружаемого канренона перед введением в ферментер стерилизовали в отдельном сосуде, а глюкозу добавляли по мере протекания этого периодического процесса. Для уменьшения размеров комков, которые образовывались во время стерилизации, применяли измельчитель Уоринга. В экспериментах К2А и К2Б канренон вводили в массу в виде метанольного раствора и по этой причине такие эксперименты в дальнейшем отличались от экспериментов примеров соответственно 3 и 4.

- 59 009176

Таблица 21

Параметры начальных процессов биоконверсии канренона

Номер эксперимента	К2А	К2Б	К2В	К2Г
Среда (г/л) кукурузный экстр, дрожжевой экстр. νη4η2ρο4 глюкоза О8А рН	30 15 3 15 0,5 мл 2,5н. МаОН доводили до 6,0	тот же состав, что и в эксперименте К2А	30 15 3 30 0,5 мл 2,5н. МаОН доводили до 6,5	тот же состав, что и в эксперименте К2В
Канренон	по 10 г/80 мл МеОН добавляли по истечении 0, 18, 24, 30, 36, 42, 50, 56, 62 и 68 ч	80 г/640 мл МеОН добавляли по истечении 0 ч весь сразу	Стерилизованный и измельченный; добавляли по истечении 0 ч: 25 г; 24 ч: 200 г	Стерилизованный и измельченный; добавляли по истечении 0 ч: 200 г
Время получения продукта	143 ч	166 ч	125 ч	104 ч
Биоконверсия	45,9%	95,6%	98,1%	95,1%

В экспериментах К2А и К2Б концентрация аккумулированного в исчерпанной питательной среде метанола составляла приблизительно 6%, т.е. являлась, как было установлено, концентрацией, ингибировавшей рост культуры и процесс биоконверсии. Однако, основываясь на результатах этих экспериментов, приходили к заключению, что метанол или другой смешивающийся с водой растворитель мог бы быть эффективным при более низких концентрациях, позволяя увеличить количество загружаемого канренона и вводить канренон в виде тонкодисперсных осажденных частиц, создавая тем самым большую удельную площадь поверхности между фазами и предоставляя канренон для реакции.

Было установлено, что канренон стоек при температуре стерилизации 121 °С, но его частицы соединяются в комки. Для разрушения крупных кусочков до тонкодисперсных частиц, которые подвергались эффективной конверсии в продукт, применяли измельчитель Уоринга.

Пример 7.

С использованием суспензии спор из банка рабочих клеток, созданного в соответствии со способом, описанным в примере 4, также, по существу, по способу, который описан в примере 4, готовили первичную и вторичную посевные культуры. Параметры и результаты экспериментов примера 7 представлены в табл. 22. С помощью вторичной посевной культуры, полученной таким путем, один процесс биоконверсии (К3В) проводили, по существу, так, как это изложено в примере 3, и три процесса биоконверсии проводили в соответствии со способом, который в общем описан в примере 5. В ходе проведения этих трех последних экспериментов (К3А, К3Б и К3Г) канренон стерилизовали в портативном резервуаре совместно со средой для выращивания, исключая глюкозу. Глюкозу в асептических условиях подавали из другого резервуара. Стерилизованную суспензию канренона вводили в ферментер либо перед инокуляцией, либо на ранней стадии биоконверсии. В ходе проведения эксперимента К3Б дополнительные количества стерильного канренона и среды для выращивания вводили по истечении 46,5 ч. Крупные кусочки канренона, которые образовывались во время стерилизации, разрушали с помощью измельчителя Уоринга, получая таким образом суспензию тонкодисперсных частиц, поступающую в ферментер. Состав среды для выращивания биоконверсионного микроорганизма, график добавления канренона, графики добавления питательных веществ, время получения продукта (время конверсии) и степень конверсии для этих экспериментов представлены в табл. 22 и 23.

Таблица 22

Параметры процесса биоконверсии канренона

Номер эксперимента	КЗА	КЗБ	КЗВ	кзг
Среда (г/л) кукурузный экстр, дрожжевой экстр. νη4η2ρο4 глюкоза О8А рн	30 15 3 15 0,5 мл 2,5н. МаОН доводили ДО 6,5	тот же состав, что и в эксперименте КЗА	пептон: 20 дрожжевой экс.: 20 глюкоза: 20 О8А: 3 мл 2,5н. МаОН доводили до 6,5	тот же состав, что и в эксперименте КЗА
Загрузка канренона	Канренон стерилизовали и измельчали. НБ: 50 г 16,5 ч: 110 г	то же самое, что и в эксперименте КЗА НБ: 50 г 16.5 ч: 110 г 46.5 ч: 80 г	Нестерильный канренон: загружали по графику, указанному в таблице 23	То же самое, что и в эксперименте КЗА НБ: 50 г 16,5 ч: 110 г
Введение сырья	см. таблицу 23	см. таблицу 23	см. таблицу 23	см. таблицу 23
Время биоконверсии	118,5 ч	118,5 ч	118,5 ч	73,5 ч
Биоконверсия	93,7%	94,7%	60,0%	68,0%

- 60 009176

Таблица 23 График введения канренона, глюкозы и среды для выращивания в в экспериментах с ростом

Время добавления,	КЗВ	ИЗА	КЗБ	кзг
канренон 200	50%-ный	пептон и	антибиотики: 20 мг	канре-	канре-	канре-
	г/2 л	раствор	дрожжевой	канамицина, 20 мг	нон/среда для	нон/среда для	нон/среда для
	стерильной	глюкозы	экстракт по	тетрациклина, 100	выращива-	выращива-	выращивания,
	ди		20 г каждого в	мг цефалексина в	ния, см. таблицу 22	ния, см. таблицу 22	см. таблицу 22
			1 л воды	50 мл
	г	г	г		г/л	г/л	г/л
0	-	-	-	-	50 г/0,4л	50 г/0,4л	50 г/0,4л
14,5	16	100	25	50 мл	-	-	-
16,5	-	—	-	-	ПО г/1,2л	ПО г/1,2л	ПО г/1,2л
20,5	16	140	25	-	-
28,5	16	140	25	-	—
34,5	16	150	25	-	-
40,5	16	150	25	50 мл	-
46,5	880	130	25	-	80 г/0,8л
52,5	160	120	25	-	-
58,5	160	150	25	-	-
64,5	160	180	25	50 мл	-
70,5	160	140	25	-	-	-

Благодаря росту волокон во всех четырех экспериментах этого примера наблюдали высокую вязкость культуральной жидкости. Для преодоления препятствий, которые высокая вязкость создавала для аэрации, перемешивания, регулирования рН и регулирования температуры, в ходе проведения этих экспериментов увеличивали степень аэрации и скорость перемешивания. В этих более жестких условиях конверсия протекала удовлетворительно, но над поверхностью жидкой питательной среды образовывался плотный слой биомассы. Вместе с этим слоем биомассы из питательной среды выносилось некоторое количество непрореагировавшего канренона.

Пример 8.

Параметры и результаты экспериментов примера 8 представлены в табл. 24. Проводили четыре эксперимента с ферментацией, в ходе которых биоконверсией канренона получали 11а-гидроксиканренон. В двух из этих экспериментов (К4А и К4Г) биоконверсию проводили практически так же, как и в экспериментах К3А и К3Г примера 6. В ходе проведения эксперимента К4В канренон превращали в 11а-гидроксиканренон в основном аналогично изложенному в примере 3. В эксперименте К4Б процесс проводили в общем так, как изложено в примере 4, т.е. со стерилизацией канренона и среды для выращивания в ферментере непосредственно перед инокуляцией все количество азотсодержащих и фосфорсодержащих питательных веществ вводили в питательную среду вначале, а для поддержания концентрации глюкозы по мере протекания периодического процесса в ферментер вводили дополнительное количество раствора, содержавшего только глюкозу. В последнем процессе (в эксперименте К4Б) концентрацию глюкозы проверяли каждые 6 ч и для регулирования содержания глюкозы в интервале 0,5-1% добавляли раствор глюкозы. Графики введения канреноновых добавок в ходе проведения этих экспериментов представлен в табл. 25.

Таблица 24 Параметры экспериментов с процессом роста при биоконверсии канренона

Номер эксперимента	К4А	К4Б	К4В	К4Г
Среда (г/л) кукурузный экстр, дрожжевой экстр. νη4η2ρο4 глюкоза ОБА рН	30 15 3 15 0,5 мл 2,5н. ИаОН доводили до 6,5	тот же состав, что и в эксперименте К.4А	пептон: 20 дрожжевой экс.: 20 глюкоза: 20 О8А: 3 мл 2,5н. ИаОН доводили до 6,5	тот же состав, что и в эксперименте К.4А
Загрузка канренона	канренон стерилизовали и измельчали. НБ: 40 г 23,5 ч: 120 г	160 г канренона стерилизовали в ферментере	нестерильный канренон: загружали по графику, указанному в таблице 25	канренон стерилизовали и измельчали. НБ: 40 г 23,5 ч: 120 г
Введение питательной среды	см. таблицу 25	см. таблицу 25	см. таблицу 25	см. таблицу 25
Время биоконверсии	122 ч	122 ч	122 ч	122 ч
Биоконверсия *-	95,6%	97,6%	95,4%	96,7%

- 61 009176

Таблица 25

График введения канренона, глюкозы и среды для выращивания в в экспериментах с процессом роста

Время добавления, ч	К4В	К4А	К4Б	К4Г
канренон 200 г/2 л стерильной воды	50%-ный раствор глюкозы	пептон и дрожжевой экстракт по 20 г каждого в 1 л воды	антибиотики: 20 мг канамицина, 20 мг тетрациклина, 100 мг цефалексина в 50 мл (добавляли в суспензию канренона)	среда для выращивания, см. таблицу 24	среда для выращивания, см. таблицу 24	среда для выращивания, см. таблицу 24
	г	г	г
14	600	135	25	50 мл	-	-	-
20	-	100	-	-	—	-	-
23	-	-	-	-	120г/1,2 л	-	120г/1,2 л
26	-	100	25	-	—	-
32	-	135	25	—	—
38	500 ,	120	25	50 мл
44	-	100	25	-
50	__	100	25	-
56	-	150	25	-		-
62	500	150	25	50	-
68	-	200	25	-	—
74		300	25	—	-	-
80	-	100	25	—	-	-
86	-	125	25	—	-	-
92		175	25			-
98		150	-			-
104		175	-
110		175	-
116	-	200	-	—	-	-

Поскольку в течение дня или двух дней после инокуляции культуральная жидкость становилась высоковязкой, все ферментеры работали в усиленном режиме перемешивания и аэрации в ходе проведения большей части ферментационного цикла.

Пример 9.

Состав среды для выращивания во время конверсии, графики введения канренона, время конверсии и степень конверсии в экспериментах данного примера представлены в табл. 26.

Четыре эксперимента с биоконверсией проводили практически по тому же методу, который описан для эксперимента К4Б в примере 8, за исключением того, что указано ниже. В эксперименте К5Б верхнюю турбинную дисковую мешалку, которую применяли для перемешивания в других экспериментах, заменяли создающей нисходящий поток мешалкой шаппе 1шре11ег. Эффект такого нисходящего потока состоял в аксиальном нагнетании питательной среды в центральную часть ферментера и уменьшении количеств образующейся плотной биомассы. В эксперименте К5Г непосредственно после инокуляции вводили 200 мл метанола. Поскольку канренон стерилизовали в ферментере, все питательные вещества, за исключением глюкозы, загружали в начале периодического процесса, устраняя потребность в поэтапном добавлении источников азота, источников фосфора и антибиотиков.

- 62 009176

Таблица 26

Параметры экспериментов с процессом роста при биоконверсии в 10-литровом масштабе

Номер эксперимента	К5А	К5Б	К5В	К.5Г
Среда (г/л) кукурузный экстр, дрожжевой экстр. νη4η2ρο4 глюкоза О8А рН	30 15 3 15 0,5 мл 2,5н. ИаОН доводили до 6,5	тот же состав, что и в эксперименте К.5А	пептон: 20 дрожжевой экс.: 20 глюкоза: 20 О8А: 3 мл 2,5н. ИаОН доводили до 6,5	тот же состав, что и в эксперименте К5А
Загрузка канренона	160 г канренона стерилизовали в ферментере	160 г канренона стерилизовали в ферментере	160 г канренона стерилизовали в ферментере	160 г канренона стерилизовали в ферментере
Введение питательной среды	введение глюкозы	введение глюкозы	введение глюкозы	введение глюкозы
Время биоконверсии	119,5 ч	119,5 ч	106 ч	119,5 ч
Биоконверсия *-	96%	94,1%	88,5%	92,4%

Для удержания в погруженном состоянии твердой фазы, растущей над поверхностью жидкости, в каждый ферментер через 96 ч после начала периодического процесса добавляли 2 л среды для выращивания. Добавлением среды для выращивания либо применением мешалки, создающей нисходящий поток (в эксперименте К5Б) возникающие при перемешивании проблемы полностью разрешать не удавалось, но результаты экспериментов демонстрировали осуществимость и преимущества предлагаемого способа и показывали возможность обеспечить удовлетворительное перемешивание в соответствии с обычными техническими приемами.

Пример 10.

Практически таким же путем, как это описано в примере 9, проводили три эксперимента с биоконверсией. Состав среды для выращивания во время конверсии, графики введения канренона, время биоконверсии и степень конверсии в экспериментах данного примера представлены в табл. 27.

Таблица 27 Параметры экспериментов с процессом роста при биоконверсии в 10-литровом масштабе

Номер эксперимента	К6А	К6Б	Я6В
Среда (г/л) кукурузный экстр, дрожжевой экстр. νη4η2ρο4 глюкоза О8А рН	30 15 3 15 0,5 мл 2,5н. ИаОН доводили до 6,5	тот же состав, что и в эксперименте К.6А	пептон: 20 дрожжевой экс.: 20 глюкоза: 20 О8А: 0,5 мл 2,5н. №ОН доводили до 6,5
Загрузка канренона	160 г канренона стерилизовали в ферментере	160 г канренона стерилизовали в ферментере	160 г канренона стерилизовали в ферментере
Введение питательной среды	введение глюкозы; по истечении 71 ч 1,3 л питательной среды и 0,8 л стерильной воды	введение глюкозы; по истечении 95 ч 0,5 л питательной среды и 0,5 л стерильной воды	введение глюкозы; ничего другого не добавляли
Время биоконверсии	120 ч	120 ч	120 ч
Биоконверсия *-	95%	96%	90%
Материально-массовый баланс	59%	54%	80%

В эксперименте 1К6Л по прошествии 71 ч для погружения в жидкость плотной массы мицелия, рост которого происходил над поверхностью жидкой питательной среды, добавляли 1,3 л среды для выращивания и 0,8 л стерильной воды. С той же целью по истечении 95 ч в эксперименте К6Б добавляли 0,5 л среды для выращивания и 0,5 л стерильной воды. Данные материально-массового баланса показывали, что улучшенного материально-массового баланса достигали в случае, когда накопление плотной биомассы над поверхностью жидкости сводили к минимуму.

Пример 11.

Для сравнения эффектов предварительной стерилизации канренона и стерилизации канренона и среды для выращивания в биоконверсионном ферментере проводили эксперименты с ферментацией. В эксперименте Ш способ осуществляли аналогично тому, как это проиллюстрировано на фиг. 2, в условиях, сопоставимых с условиями во время экспериментов К2В, К2Г, (Ш, К3В, К3Г, Η4Α и К4Г. Эксперимент К7Б проводили аналогично тому, как это проиллюстрировано на фиг. 3, в условиях, сопостави

- 63 009176 мых с условиями проведения экспериментов примеров 4, 9 и 10 и К4Б. Состав среды для выращивания во время конверсии, графики введения канренона, время биоконверсии и степень конверсии в экспериментах данного примера представлены в табл. 28.

Таблица 28

Параметры экспериментов с процессом биоконверсии в

10-литровом масштабе

Номер эксперимента	К7А	К7Б
Среда (г/л) кукурузный экстр, дрожжевой экстр. νη4η2ρο4 глюкоза О8А рН	30 15 3 15 0,5 мл 2,5н. №ОН доводили до 6,5	тот же состав, что и в эксперименте К7А
Загрузка канренона	160 г канренона стерилизовали и измельчали вне вне ферментера	160 г канренона стерилизовали в ферментере
Введение питательной среды	введение глюкозы; канренон добавляли вместе с 1,6 л среды для выращивания	введение глюкозы; без других добавок
Время биоконверсии	118,5 ч	118,5 ч
Биоконверсия	93%	89%

В эксперименте К7Б материально-массовый баланс, основанный на данных анализа последней пробы, составлял 89,5%, что указывало на отсутствие существенных потерь субстрата или деструкции в процессе биоконверсии. Перемешивание в ходе проведения обоих экспериментов определяли как адекватное.

В течение первых 80 ч остаточная концентрация глюкозы превышала целевую, находившуюся в регулируемом интервале 510 г/л. Принимая во внимание плотную массу, которая накапливалась в пространстве над жидкостью в обоих ферментерах, рабочие параметры экспериментов были очевидно неэффективными.

Пример 12.

Эффективность экстракции определяли проведением ряда экспериментов с экстракцией в объеме 1 л, результаты которых представлены в табл. 29. В каждом из этих экспериментов стероиды экстрагировали из мицелия с использованием этилацетата (1 л/л объема ферментационной зоны). В каждом эксперименте проводили две последовательные экстракции. Основываясь на данных высокоэффективной жидкостной хроматографии с высокой разрешающей способностью, во время первой экстракции рекуперировали приблизительно 80% всего количества стероида, а вторая экстракция повышала степень его рекуперации до 95%. В результате третьей экстракции выделяли, по-видимому, еще 3% стероида. Оставшиеся 2% составляют потери в верхней водной фазе. С помощью вакуума экстракт концентрировали досуха, но его не промывали каким-либо дополнительным растворителем. Вытеснение растворителем позволило бы повысить рекуперацию во время начальной экстракции, если бы была подтверждена экономическая целесообразность такой стадии.

Таблица 29

Выделение 11а-гидроксиканренона экстракцией в объеме 1 л (в % от общего количества)

Номер эксперимента	1-ая экстракция	2-ая экстракция	3-я экстракция	Верхний слой
К5Л	79%	16%	2%	2%
К5А	84%	12%	2%	2%
В4А	72%	20%	4%	4%
К4А	79%	14%	2%	5%
К4Б	76%	19%	4%	1%
В.4Б	79%	16%	3%	2%
К4Б	82%	15%	2%	1%
В среднем	79%	16%	3%	2%

В качестве растворителей для экстракции/кристаллизации 11а-гидроксиканренона в масштабе 1-литрового количества питательной среды оценивали метилизобутилкетон (МИБК) и толуол. В соответ- 64 009176 ствии с протоколом экстракции, как это указано выше, как МИБК, так и толуол сопоставляли с этилацетатом как по экстракционной эффективности, так и по показателям кристаллизации.

Пример 13.

Как часть критериев оценки способов, представленных на фиг. 2 и 3, при осуществлении каждого из этих способов проводили исследования размеров частиц канренонового субстрата, вводимого в начале ферментационного цикла в каждом из таких способов. Как сказано выше, канренон, используемый в способе, представленном на фиг. 1, перед загрузкой в ферментер подвергали измельчению в микронной коллоидной мельнице. В этом способе канренон не стерилизуют, а рост нежелательных микроорганизмов подавляют добавлением антибиотиков. В способах, представленных на фиг. 2 и 3, перед вводом в реакцию канренон стерилизуют. В способе, проиллюстрированном на фиг. 2, этого достигают в измельчителе перед введением канренона в ферментер. В способе, представленном на фиг. 3, суспензию канренона в среде для выращивания стерилизуют в ферментере в начале периодического процесса. Как это обсуждалось выше, стерилизации свойственна тенденция вызывать агломерацию канреноновых частиц. Вследствие ограниченной растворимости канренона в водной среде для выращивания производительность в этом способе зависит от массопереноса из твердой фазы и, таким образом, как можно было бы ожидать, зависит от площади межфазной поверхности, свойственной твердому порошкообразному субстрату, которая, в свою очередь, определяется распределением частиц по размерам. Эти факторы в начальной стадии служат препятствиями при осуществлении способов, проиллюстрированных на фиг. 2 и 3.

Однако было установлено, что перемешивание в измельчителе, показанном на фиг. 2, и в ферментационном сосуде, показанном на фиг. 3, в сочетании с воздействием насоса, работающего с высоким сдвигом и применяемого для транспортировки массы согласно фиг. 2, разрушают агломераты до частиц с размерами в интервале, который довольно близок к интервалу размеров частиц нестерилизованного канренона после измельчения в микронной коллоидной мельнице, служащего сырьем в способе, представленном на фиг. 1. Это проиллюстрировано распределением частиц по размерам для канренона, который имеется в начале реакционного цикла в каждом из трех способов (см. табл. 30 и фиг. 4 и 5).

Таблица 30 Распределение частиц по размерам в трех различных образцах канренона

Образец	45-125 мкм	<180 мкм	средний размер, мкм	Эксперимент №: биоконверсия в %
Партия канренона	75%	95%	--	КЗВ: 93,1% (120 ч) К4В: 96,3% (120 ч)
Смешанный образец	31,2%	77,2%	139,5	КЗ А: 94,6% (120 ч) КЗБ: 95,2% (120 ч)
Стерильный образец	24,7%	65,1%	157,4%	КЗВ: 97,6% (120 ч) К5Б: 93,8% (120 ч)

Оценивая данные табл. 30, можно отметить, что мешалки и насос, работающий с высоким сдвигом, оказывались эффективными для уменьшения среднего размера частиц стерилизованного канренона до значений такого же порядка, что и в случае нестерилизованного субстрата, но заметная разница в размерах с преимуществом частиц нестерилизованного субстрата сохранялась. Несмотря на наличие этой разницы, данные эффективности реакции показывали, что процессы с предварительной стерилизацией по производительности были, по меньшей мере, такими же, как процессы по способу, показанному на фиг. 1. Дополнительные преимущества могут быть достигнуты в способе по фиг. 2 осуществлением некоторых стадий дальнейших уменьшения и регулирования размеров частиц, например мокрым помолом стерилизованного канренона и/или скорее пастеризацией, чем стерилизацией.

Пример 14.

Посевную культуру готовили аналогично примеру 5. По прошествии 20 ч мицелии в ферментере для выращивания инокулята представляли собой кашицу с ОУМ 40%. Значение ее рН составляло 5,4, а содержание неизрасходованной глюкозы было равным 14,8 г/л.

Готовили 35 л биоконверсионной среды для выращивания, состав которой представлен в табл. 20. При приготовлении исходной питательной среды глюкозу и дрожжевой экстракт раздельно стерилизовали и смешивали в виде единственного сырья с начальной концентрацией 30 мас.% глюкозы и 10 мас.% дрожжевого экстракта. Значение рН этого сырья доводили до 5,7.

С использованием этой питательной среды (табл. 20) проводили два эксперимента с биоконверсией для превращения канренона в 11а-гидроксиканренон. Каждый из таких экспериментов проводили в 60-литровом ферментере, который был оснащен перемешивающим устройством, включающим одну турбинную мешалку Раштона и две мешалки ЫдЫшп' А315.

Начальная порция среды для выращивания, загружаемая в ферментер, составляла 35 л. Обработан

- 65 009176 ный в микронной коллоидной мельнице и нестерилизованный канренон вводили в начальной концентрации 0,5%. Питательную среду в ферментере инокулировали посевной культурой, приготовленной по методу, который изложен в примере 5, при начальном коэффициенте инокуляции 2,5%. Ферментацию проводили при температуре 28°С, скорости вращения мешалки 200-500 об/мин, степени аэрации 0,5 об./об.-мин и обратном давлении, достаточном для поддержания количества растворенного кислорода по меньшей мере 20 об.%. Конверсионная культура, которую выращивали в ходе проведения эксперимента с получением, находилась в форме очень мелких овальных гранул (приблизительно 1-2 мм). Канренон и дополнительные количества питательных веществ добавляли в ферментер поэтапно в основном аналогично вышеизложенному в примере 1. Добавки питательных веществ вводили каждые 4 ч в количествах 3,4 г для глюкозы и 0,6 г для дрожжевого экстракта на 1 л питательной среды в ферментере.

В табл. 31 представлены степень аэрации, скорость вращения мешалки, содержание растворенного кислорода, ОУМ и значения рН, превалирующие в заданных интервалах во время каждого из экспериментов данного примера, а также добавки глюкозы, которые осуществляли во время периодического цикла. В табл. 32 представлен также профиль конверсии канренона. Эксперимент К11А завершали по истечении 46 ч; эксперимент К11Б продолжался в течение 96 ч. В этом последнем случае за 81 ч достигали 93% конверсии; еще одну добавку сырья вводили по истечении 84 ч и после этого сырье вводить прекращали. Следует отметить, что в период между прекращением ввода сырья и концом эксперимента происходило заметное изменение вязкости.

Таблица 31

Ферментация К11А
Время	Аэрация (л/мин)	об/мин	КРК, %	Обратное давление	ОУМ (%)	рН	Конц.глюк. (г/л)
0,1	20	200	93	0	2	6,17	5,8
7	20	200	85,1	0	5	6,03	5,5
12,4	20	300	50,2	0		5,43
21,8	20	400	25,5	0	38	6,98	0
29	20	500	17	0	35	5,22
30,2	20	500	18,8	10		5,01
31	20	500	79	10		4,81	1
35,7	20	500	100	10	45	5,57	0
46,2	20	500	23	6	45	5,8	1
			Общее количество глюкозы	27,5 г/л
		Общее количество дрожжевого экстракта: 8,75 г/л
Ферментация К11Б
Время	Аэрация (л/мин)	об/мин	КРК, %	Обратное давление	ОУМ (%)	РН	Конц.глюк. (г/л)
0,1	20	20	92,9	0	2	5,98	5,4
7	20	200	82,2	0	5	5,9	5
12,4	20	300	49,5	0		5,48
21,8	20	400	18	0	40	7,12	0
29	20	500	36,8	0	35	5,1	3
35,7	20	500	94,5	10		4,74	0
46,2	20	500	14,5	6	45	5,32	2
55	20	500	16,7	10		5,31	0,5
58,6	20	500	19,4	15		5,32	1
61,9	20	500	13	15	40	5,36	2
71,7	20	500	13	15	42	5,37	0
81,1	20	500	22,9			5,42	2,5
85,6	20	500	22	15	45	5,48	1
97,5	20	500	108	15	45	6,47	0
117,7	20	500		15		7,38	0
			Общее количество глюкозы: 63 г/л
		Общее количество дрожжевого экстракта: 14,5 г/л

- 66 009176

Таблица 32

Ферментация К11А: конверсия канренона
Концентрация (г/л)	Конверсия	Расчет, колич. ОНкан.	Степень конверс. (г/л»ч)
Образец	Время	ОН-канренон	Канрен.	Всего	(%)	(г/л)	Расчетная	По определению
К11А-0	0,10	0,00	5,41	5,41
К11А-7	7,00	0,18	4,89	5,07	3,58	0,18
К11А-22	21,80	2,02	2,12	4,14	48,75	2,44
К11А-29	29,00	3,67	4,14	7,81	47,03	4,48
К11А-36	35,70	6,68	1,44	8,12	82,27	7,74	0,49	0,45
К11А-46	46,20	7,09	0,41	7,51	94,48	8,59	0,08	0,04
Ферментация К.11 Б: конверсия канренона
Концентрация (г/л)	Конверсия	Расчет, колич. ОНкан.	Степень конвер (г/л»ч)
Образец	Время	ОН-кан.	Канрен.	Всего	(%)	(г/л)	Расчетная	По определению
К11Б-0	0,1	0,00	5,60	5,60
К11Б-7	7,0	0,20	4,98	5,18	3,78	0,19	0,03	0,03
К11Б-22	21,8	2,51	2,46	4,97	50,49	2,52	0,16	0,16
К11Б-29	29,0	4,48	16,99	21,47	20,87	4,69	0,30	0,27
К11Б-36	35,7	8,18	10,35	18,53	44,16	9,70	0,75	0,55
К11Б-55	55,0	17,03	13,20	30,23	56,33	19,50	0,32	0,36
К11Б-59	58,6	20,80	11,73	32,53	63,95	21,97	0,69	1,05
К11Б-62	61,9	22,19	8,62	30,81	72,02	24,50	0,77	0,42
К11Б-72	71,7	26,62	3,61	30,23	88,06	29,46	0,51	0,45
К11Б-81	81,1	27,13	2,05	29,18	92,97	30,32	0,09	0,05
К11Б-86	85,6	26,87	2,020	28,88	93,02	30,11	-0,04	-0,06
К11Б-97	97,5	23,95	1,71	25,66	93,34	30,22	0,01	-0,25
К11Б-118	117,17	24,10	1,68	25,79	93,47	30,26	0,00	0,01

Пример 15.

Для оценки эффективности в отношении биоконверсии канренона в 11а-гидроксиканренон в соответствии со способами, в целом описанными выше, испытывали различные культуры.

Банк рабочих клеток каждого из микроорганизмов АзрегдШиз шдег АТСС 11394, ВЫ/ориз агг1и/из АТСС 11145 и ВЫ/ориз з!о1ош£ег АТСС 6227Ь создавали аналогично примеру 5. 50 мл среды для выращивания, состав которой представлен в табл. 18, инокулировали 1 мл суспензии спор, взятой из банка рабочих клеток, и помещали в инкубатор. Посевную культуру готовили в инкубаторе ферментацией при 26°С в течение приблизительно 20 ч. Перемешивание в инкубаторе осуществляли при скорости вращения мешалки 200 об/мин.

2-миллилитровые аликвоты посевной культуры каждого микроорганизма использовали для инокуляции колб для биоконверсии, содержавших по 30 мл среды для выращивания, представленной в табл. 18. Каждую культуру использовали для инокуляции двух колб, т.е. в общей сложности шести. 200 мг канренона при 36°С растворяли в 4 мл метанола и 0,5-миллилитровую аликвоту этого раствора вводили в каждую из колб. Биоконверсию проводили в общем в условиях, которые описаны в примере 5, с добавками по 1 мл раствора глюкозы концентрацией 50 мас.% один раз в день. По прошествии первых 72 ч делали следующие наблюдения за ростом мицелиев в соответствующих колбах для биоконверсионной ферментации:

АТСС 11394 - хороший равномерный рост;

АТСС 11145 - хороший рост в первые 48 ч, но мицелии агломерировали с образованием шара; в последние 24 ч никакого очевидного роста не происходило;

АТСС 6227Ь - хороший рост, причем мицелиевая масса образовывала шарообразную колонию.

Для анализа на степень биоконверсии отбирали пробы питательной среды. По прошествии трех дней ферментации с использованием микроорганизма АТСС 11394 конверсия в 11а-гидроксиканренон достигала 80-90%; в случае микроорганизма АТСС 11145 обеспечивалась конверсия 50%, а в случае микроорганизма АТСС 6227Ь - 80-90%.

- 67 009176

Пример 16.

По существу, аналогично способу, который описан в примере 15, на эффективность в отношении конверсии канренона в 11а-гидроксиканренон испытывали дополнительные микроорганизмы. Испытываемые организмы и результаты испытаний представлены в табл. 33.

Таблица 33

Культуры, испытываемые на эффективность биоконверсии канренона в 11 α-гидроксиканренон

Культура	АТСС №	среда1	результаты	приблизи - тельная конверсия
Шйгориз огугае	11145	КЭ	+	50%	-
КЫгориз 51о1опйет	6227Ь	КЭ	+	80-90%	-
Азрег^Шиз пШШапз	11267	КЭ	+	50%	80%
АзрегкШиз пщег	11394	КЭ	+	80-90%	90%
Азрег^Шиз осйгасеиз	ΝΚΚΕ 405	КЭ	+		90%
Азрег^Шиз осйгасеиз	18500	КЭ	+		90%
ВасШиз зиЬЕПз	31028	п+кэ	-	0%	0%
ВасШиз зиЬИПз	31028	КЭ	-	0%	0%
ВасШиз зр.	31029	п+кэ	-	0%	0%
ВасШиз зр.	31029	КЭ	-	0%	*
ВасШиз те&а1епит	14945	П + КЭ	+	5%	80% *
ВасШиз те§а1епит	14945	КЭ	+	5%	10% *
ТпскоШесшт гозеит	12519	КЭ	+	80% *	90% *
ТпсКоШесшт гозеит	8685	КЭ	+	80% *	90% *
81гер1отусез ГгаШае	10745	КЭ	+	<5%	<10%
81гер1отусез ГгаФае	10745	ТСПБ	-	*	♦
81гер1отусез 1ауепёи1ае	13664	КЭ	-	0%	♦
АИгерЮтусез 1ауепс1и1ае	13664	ТСПБ	-	0%	0%
ИосагШоёез 81тр1ех	6946	МП	-	0%	0%
МосагШоёез 81тр1ех	13260	МП	-	*	♦
Рзеиёотопаз зр.	14696	МП	-	*	♦
Рзеиёотопаз зр.	14696	КЭ	+	<5%	<10%
Рзеидотопаз зр.	14696	исс,	-	0%	♦
Рзеийотодаз зр.	13261	УС	+	*	< 10%
Рзеиёотопаз сгисМае	13262	МП		#	<10%
Рзеидотопаз рибйа	15175	МП	-	0%	0%
* образование других, неидентифицированных продуктов

Среда¹: КЭ обозначает кукурузный экстракт; ТСПБ обозначает триптический соевый питательный бульон; П + КЭ обозначает пептон и кукурузный экстракт; МП обозначает мясной экстракт и пептон.

Пример 17.

Различные микроорганизмы испытывали на эффективность в отношении конверсии канренона в 9а-гидроксиканренон. Ферментационный бульон для экспериментов этого примера готовили согласно тому, как это указано в табл. 34.

- 68 009176

Таблица 34 На основе соевой муки
Декстроза	20 г
Соевая мука	5г
№С1	5г
Дрожжевой экстракт	5 г
КН2РО4	5г
Вода	До объема 1 л
рН 7

На основе пептона/дрожжевого экстракта/глюкозы

Глюкоза	40 г
Бактопептон	10 г
Дрожжевой экстракт	5г
Вода	До объема 1 л
На основе среды Мюлле	за-Хинтона
Говяжий экстракт	300 г
Казаминовые кислоты	17,5 г
Крахмал	1,5 г
Вода до объема	До объема 1 л

Грибы выращивали в среде на основе соевой муки и пептона/дрожжевого экстракта/глюкозы; актиномицеты и эубактерии выращивали на соевой муке (плюс 0,9 мас.% Να-формиата для биоконверсий) или в питательной среде Мюллера-Хинтона.

Закваски инокулировали исходными замороженными спорами (20 мл соевой муки в 250-миллилитровой колбе Эрленмейера). Колбы накрывали фильтром для очистки молока и биологическим экраном. Эти закваски (24- или 48-часового возраста) использовали для инокуляции метаболических культур (также 20 мл в 250-миллилитровой колбе Эрленмейера) - с 10-15% сго551ид уо1ите - и эти последние инкубировали в течение 24-48 ч до введения стероидного субстрата с целью проведения реакции конверсии.

Канренон растворяли/суспендировали в метаноле (20 мг/мл), стерилизовали фильтрованием и вводили в культуры с достижением конечной концентрации 0,1 мг/мл. Все колбы для биоконверсионной ферментации встряхивали в качалках при 250 циклах/мин (с дугой качания 2 дюйма) в камере с температурой, поддерживаемой на уровне 26°С, и 60% влажностью.

Выделение продукта производили по прошествии 5 и 48 ч биоконверсии или через 24 ч после введения субстрата. Выделение продукта начинали с добавления в каждую колбу для ферментации 23 мл этилацетата или метиленхлорида. Далее колбы подвергали встряхиванию в течение 2 мин и содержимое каждой колбы выливали в 50-миллилитровую коническую пробирку. Для разделения фаз пробирки центрифугировали в течение 20 мин при комнатной температуре со скоростью 4000 об/мин. Органический слой каждой пробирки переносили в 20-миллилитровую пробирку из боросиликатного стекла и выпаривали в креей уас. Пробирки закрывали крышками и хранили при -20°С.

С целью получить материал для структурного определения масштаб биоконверсий изменяли до 500 мл увеличением числа операций ферментации в качалочных колбах до 25. Во время выделения продукта (по прошествии 24 или 48 ч после введения субстрата) в каждую колбу индивидуально добавляли этилацетат, колбы закрывали крышками и на 20 мин возвращали в качалку. Далее содержимое колб выливали в полипропиленовые флаконы и центрифугировали для разделения фаз или в делительную воронку, в которой фазам давали разделиться под влиянием гравитационного эффекта. Органические фазы сушили, получая сырой экстракт стероидов, содержавшихся в реакционной смеси.

Реакционный продукт анализировали вначале тонкослойной хроматографией на силикагелевых (250 мкм) пластинках с флуоресцентным покрытием (254 нм). В каждую пробирку, содержавшую высушенный этилацетатный экстракт реакционной смеси, добавляли по 500 мкл этилацетата. Последующие анализы проводили жидкостной хроматографией высокого разрешения и масс-спектрометрией. Пластинки проявляли в среде хлороформ/метанол в объемном соотношении 95:5.

Дальнейший анализ проводили жидкостной хроматографией высокого разрешения (ЖХВР) и массспектрометрией (МС). При этом жидкостную хроматографию высокого разрешения осуществляли с разбавлением водой и с использованием программного обеспечения МШешит, детектора на фотодиодной матрице (ФДМ-детектор) и автоматического пробоотборника. Для жидкостной хроматографии высокого разрешения использовали прибор с водяным разбавлением ΝοναΡαΙ: С-18 (с размером частиц 4 мкм) и 4-миллиметровым картриджем ΡαάίαΙΡαΡ. 25-минутный линейный градиент растворителей начинался в колонке при соотношении вода/ацетонитрил 75:25, а завершался при соотношении вода/ацетонитрил 25:75. За этим следовали 3-минутный градиент с доведением содержания ацетонитрила до 100% и

- 69 009176

4-минутная изократная промывка перед восстановлением в колонке исходных условий.

Во время жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии как в ацетонитрильную, так и в водную фазы вводили ацетат аммония в концентрации 2 нМ. Хроматографию осуществляли без заметного воздействия. Отводимый из колонки элюент разделяли в соотношении 22:1, причем большую часть материала направляли в ФДМ-детектор. Оставшиеся 4,5% материала направляли в электрораспылительную ионизационную камеру масс-спектрометра 8с1ех АРГ III. Масс-спектрометрию осуществляли в положительном режиме (рокфуе шобе). Линия аналоговых данных обеспечивала передачу хроматограммы на единственной длине волны от ФДМ-детектора жидкостной хроматографии с высоким разрешением к масс-спектрометру для совместного анализа УФ- и масс-спектрометрических данных.

Было установлено, что модели масс-спектрометрических фрагментации могут быть использованы для классификации гидроксилированных соединений. Оба целевых гидроксилированных канренона, 11а-гидрокси- и 9а-гидрокси-, отщепляют воду при различных частотах, что соответствующим образом может быть использовано для диагностики. Кроме того, 9а-гидроксиканренон образует аммониевый аддукт легче, чем 11а-гидроксиканренон. В табл. 35 представлены сводные данные ТСХ, ЖХВР/УФ и ЖХ/МС для ферментации канренона, показывая, какие из испытываемых микроорганизмов оказывались эффективными для биоконверсии канренона в 9а-гидроксиканренон. Предпочтительным из них являлся микроорганизм Согупекрога саккнсо1а АТСС 16718.

Таблица 35

Сводные данные ТСХ, ЖХВР/УФ и ЖХ/МС для

- 70 009176

Сиппт^ИашеПа есЫпи1а!а АТСС 3655	У	У	У
Сиппт^йатеПа е1е§апз АТСС 9245	У	У	У
Сигуи1апа с1ауаТа АТСС 22921	η	У	у/п
Сигуи1апа 1ипа1а АТСС 12071	У	η	η
СуИпйгосагроп га<Пс1со1а (8еаг1е) АТСС 11011	ίΓ	η	η
Ер1соссит Ьшшсо1а АТСС 12722	У	У	У
Ерюоссит огугае АТСС 12724	1Г	ίΓ	ΪΓ
Ризагшт охузрогит АТСС 7601	ίΓ
Ризагшт охузрогит Г.зр. АТСС 11171	η
СИЬЬеге11а ГиДкипЯ АТСС 14842	1г	У	У
О1юс1аШит ёеИциезсепз АТСС 10097	У	ΪΓ	ΪΓ
Соп^гопеПа ЬиНеп АТСС 22822	У	у УФ?	У
Нуротусез сйгузозрегтиз Ти1. ΙΜΙ 109891	У	У	У
Ыротусез НроСег АТСС 10792	η
Ме1апозрога огпата АТСС 26180	ίΓ	η	η
МогйегеПа 1заЬеШпау АТСС 42613	У	У	η
Мисог &п8со-суапиз АТСС 1207а	η
Мисог тиседо АТСС 4605	1г	У	У
МусоЬас!епит ГогШйитп АТСС 6842
МугоШесшт уеггисапа АТСС 9095	ίΓ	ίΓ	У
МосагШа аигепНа (8еаг1е) АТСС 12674	η	1г	η
ЫосагсИа сашсгипа (8еаг1е)	У	У	η
МосагШа согаШпа АТСС 19070	η
РаесПотусез сагпеиз АТСС 46579	η	У	η
РешсШит сйгузоеепит АТСС 9480	η
РешсШит ра1и1ит АТСС 24550	У	У	у/η
РешсШит ригриго^епит АТСС 46581	ίΓ	У	У
РШютусез а!го-оПуасеиз АТСС 6651	ΪΓ	У	ίΓ
РШютусез супоёогШз АТСС 26150	η	ίΓ	ίΓ

- 71 009176

Ркусошусез Ыакез1ееапиз	У	У	у/η
Руспозропиш зр. АТСС 12231	У	У	у/η
Κΐιΐζοροβοη 8р.
КЫгориз аггкпгиз АТСС 11145	ίΓ	У	η
ЯЫгориз 8ίο1οηΐίβΓ АТСС 6227Ь	η
Ккоёососсиз ецш АТСС 14887	η	ίΓ	η
Ккоёососсиз если АТСС 21329 *	ίΓ	ίΓ	η
Шюкососсиз 8р.	η	η	η
Ккоёососсиз гкоёоскгоиз АТСС 19150	η	ίτ	η
8асс11агоро1у8рога егуШгае АТСС 11635	У	У	У
Зереёошиш атриПозрогит ΙΜΙ 203033	η	η	η
8ере(1отит скгузозрегтит АТСС 13378	η
8ер1отуха аГНтз АТСС 6737	η	у УФ?	у/п
81аскуПё1ит Ысо1ог АТСС 12672	У	У	у/п
81гер1отусез саШогтсиз АТСС 15436	η
8Пер1отусез стегеосгосаШз АТСС 3443	η
81гер1отусез соеНсо1ог АТСС 10147	η
81гер1отусез Посси1из АТСС 25453
81гер1отусез ГгасПае АТСС 10745	η
81гер1отусез ^пзеиз зиЬзр. ^пзеиз АТСС 13968	η
81гер1отусез §пзеиз АТСС 11984	η
81герЮтусез кудгоеепапз АТСС 19631	η
81гер1отусез ку^гозсоркиз АТСС 27438	У	У	У
8йер1отусез 1ауепди1ае Рап1аЬ 105	η
81гер1отусез раислзрогоёепез АТСС 25489	η
81гер1отусез ригригазсепз АТСС 25489	η	1г	ίΓ
81гер1отусез гозеосйгото^епез АТСС 13400
81гер1отусез зресГаЬШз АТСС 27465	π
81узапиз ппсгозрогиз АТСС 2833
8упсер11а1а81гит гасетозит АТСС 18192	π

- 72 009176

Культура	пятно ТСХ при 9аΩΗ-АД	пик ЖХВР при УФ для 9а-ОНканренона	МС: 357 (М + Н), 339 (-Н2О) и 375 ( + ΝΗ4)
ТИатшсПит е1е£ап5 АТСС 18191
Ткатпо51у1ит ртГогте АТСС 8992	У	1г	У
ТЫе1ау1а 1егпсо1ап АТСС 13807			и
ТпсЬоёегта νπϊάε АТСС 26802	η
ТпсЬоШесшт гозеит АТСС 12543	1г	У	у/п
УеШсИИит ШеоЬготае АТСС 12474	У	1г	1Г

Пример 18.

Различные культуры испытывали на эффективность в отношении биоконверсии андростендиона в 11а-гидроксиандростендион в соответствии со способами, которые в целом описаны выше.

Банк рабочих клеток каждого из микроорганизмов АзрегдШиз осйгасеиз КВВЬ 405 (АТСС 18500), АзрегдШиз шдег АТСС 11394, АзрегдШиз пк1и1апз АТСС 11267, ВЫхориз огухае АТСС 11145, ВЫхориз з!о1ош1ег АТСС 6227Ь, ТпсЬоФесшт гозеит АТСС 12519 и АТСС 8685 готовили, по существу, по способу, который описан в примере 4. 1 мл суспензии спор из этого банка рабочих клеток инокулировали 50 мл среды для выращивания, состав которой представлен в табл. 18, и помещали в инкубатор. Посевную культуру готовили в инкубаторе ферментацией при 26°С в течение примерно 20 ч. Перемешивание в инкубаторе производили при скорости вращения мешалки 200 об/мин.

2-миллилитровые аликвоты посевной культуры каждого микроорганизма использовали для инокуляции биоконверсионных колб, содержавших по 30 мл среды для выращивания, представленной в табл. 15. Каждую культуру использовали для инокуляции двух колб, т.е. в общей сложности 16. 300 мг андростендиона при 36°С растворяли в 6 мл метанола и в каждую из колб вводили 0,5-миллилитровую аликвоту этого раствора. Биоконверсию в общем проводили в течение 48 ч в условиях, описанных в примере 6. По прошествии 48 ч образцы питательной среды объединяли и экстрагировали этилацетатом так, как описано в примере 17. Этилацетатный экстракт концентрировали выпариванием и образцы анализировали тонкослойной хроматографией на наличие продукта, обладавшего хроматографической подвижностью, подобной подвижности 11 а-гидроксиандростендионового стандарта (фирма 8щта СЬет1са1 Со., Сент-Луис). Результаты представлены в табл. 36. Положительные результаты обозначены знаком

Таблица 36 Биоконверсия андростендиона в 11 а-гидроксиандростендион

Культура	АТСС №	среда	результаты ТСХ
ΒΒίζορυδ огугае	11145	КЭ	+
ВЫгориз 81о1ош1ег	6227Ь	кэ	+
Азрег^Шиз шс1и1ап8	11267	КЭ	+
Азрег^Шиз т^ег	11394	кэ	+
Азрег^Шиз осйгасеиз	ΝΒΒΙ, 405	кэ	+
Азрег^Шиз осйгасеиз	18500	кэ	+
ТпсйоТйесшт гозеит	12519	кэ	+
ТпскоФесшт гозеит	8685	кэ	+

Данные табл. 36 показывают, что каждая из перечисленных культур способна продуцировать из андростендиона соединение, обладающее таким же значением ВГ, как и Па-гидроксиандростендионовый стандарт.

Микроорганизм АзрегдШиз осйгасеиз ХВВ1. 405 (АТСС 18500) повторно испытывали по такому же методу, как описанный выше, и продуцируемые этой культурой продукты выделяли и очищали хроматографией на колонке с силикагелем с использованием метанола в качестве растворителя. Фракции анализировали тонкослойной хроматографией. Для ТСХ применяли пластинки ^Ьа1таи К6Е с силикагелем 60А размерами 10x20 и толщиной 250 мкм. Системой растворителей служили метанол/хлороформ в объ

- 73 009176 емном соотношении 5:95. Как кристаллизованный продукт, так и 11а-гидроксиандростендионовый эталон анализировали ЖХ/МС и ЯМР-спектроскопией. Оба соединения характеризовались идентичными профилями и молекулярными массами.

Пример 19.

На эффективность в отношении конверсии мексренона в 11 β-гидроксимексренон испытывали различные микроорганизмы. Ферментационную среду в этом примере готовили так, как представлено в табл. 34.

Условия ферментации и методы анализов были аналогичны условиям и методам, указанным в примере 17. Для ТСХ применяли пластинки и систему растворителей, которые описаны в примере 18. Хроматографический анализ основан на следующем предположении: поскольку 11а-гидроксимексренон и 11а-гидроксиканренон характеризуются одинаковой хроматографической подвижностью, 11а-гидроксиканренон и 9а-гидроксиканренон проявляют ту же самую подвижность, что и 11а-гидроксиандростендион и Πβ-гидроксиандростендион. Следовательно, 11 β-гидроксимексренон должен обладать такой же подвижностью, как и 9а-гидроксиканренон. Таким образом, подвижность соединений, экстрагируемых из среды для выращивания, сравнивали с подвижностью 9а-гидроксиканренона как с эталоном. Результаты приведены в табл. 36.

Таблица 37

Сводные данные ТСХ для процесса образования 11а-гидроксимексренона из мексренона

Микроорганизм	Среда1 1	Характер пятна2
АЬз1сПа соеги1а АТСС 6647	М, С	резко выражен.
Азрег^Шиз пщег АТСС 16888	С, П	бледное (С) ? (П)
Веаиуепа Ьазз1апа АТСС 7159	П	резко выражен.
Веаиуепа Ьазз^апа АТСС 13144	С, П	?, ?
ВоН-уозрЬаепа оЫиза ΙΜΙ 038560		бледное
Сипшп^катеПа Ыакез1ееапа АТСС 8688а	С, п	резко выражен.
есЫпи1а1а АТСС 3655	с, п	резко выражен.
е1едапз АТСС 9245	с, п	резко выражен.
Сигуи1аг1а 1ипа1а АТСС 12071	с	резко выражен.
Сопдгопе11а Ьи11еп АТСС 22822	с, п	резко выражен.
РешсШит ра!и1ит АТСС 24550	с, п	резко выражен.
РешсШит ригриго^епит АТСС 46581	с, п	резко выражен.
РШютусез а!го-оИуасеиз ΙΡΟ 6651	с, п	бледное
КЪоёососсиз ецш АТСС 14887	м	бледное
8ассЬагоро1узрога егуШгае АТСС 11635	М, СФ	бледное
81гер1отусез Ьу£гозсор1сиз АТСС 27438	М, СФ	резко выражен.
81гер1отусез ригригазсепз АТСС 25489	М, СФ	бледное
ТЬаттсНит е1е£апз АТСС 18191	с, п	бледное
ТНатпоз1у1ит рпгГогте АТСС 8992	с, п	бледное
ТпсЬоШесшт гозеит АТСС 12543	п, с	бледное (П) ? (С)

¹М обозначает среду Мюллера-Хинтона.

П обозначает ПДГ (пептон/дрожжевой экстракт/глюкоза).

С обозначает соевую муку.

СФ обозначает соевую муку плюс формиат.

²? означает сомнительное отличие от случая с отсутствием контроля над субстратом.

Эти данные позволяют предположить, что большинство микроорганизмов, перечисленных в этой таблице, продуцируют из мексренона продукт, аналогичный или идентичный Πβ-гидроксимексренону.

- 74 009176

Пример 20.

Схема 1, стадия 1: получение 5'К(5'а),7'в,20'-аминогексадекагидро-11'в-гидрокси-10'а,13'адиметил-3',5-диоксоспиро{фуран-2(3Н),17'а(5'Н)[7,4]метено[4Н]циклопента[а]фенантрен}-5'карбонитрила.

В 50-галлонный реактор, плакированный стеклом, с перемешиванием загружали 61,2 л (57,8 кг) ДМФ, а затем 23,5 кг 11-гидроксиканренона 1. В эту смесь добавляли 7,1 кг хлорида лития. Смесь перемешивали в течение 20 мин и загружали 16,9 кг ацетонциангидрина, после чего 5,1 кг триэтиламина. Смесь нагревали до 85°С и выдерживали при этой температуре в течение 13-18 ч. По завершении реакции добавляли 353 л воды, а затем 5,6 кг бикарбоната натрия. Смесь охлаждали до 0°С, переносили в 200-галлонный реактор, плакированный стеклом, и гасили медленным добавлением 130 кг 6,7% раствора гипохлорита натрия. Продукт отфильтровывали и промывали 3 порциями по 40 л воды, получая 21,4 кг енамина.

Пример 21.

Схема 1, стадия 2: получение 4'8(4'а),7'а-гексадекагидро-11'а-гидрокси-10'3,13'в-диметил-3',5,20'триоксоспиро{фуран-2(3Н),17'в-[4,7]метано[17Н]циклопента[а]фенантрен}-5'в(2'Н)-карбонитрила.

В 200-галлонный реактор, плакированный стеклом, загружали 50 кг енамина 2, приблизительно 445 л разбавленной 0,8н. соляной кислоты и 75 л метанола. Смесь выдерживали при 80°С в течение 5 ч и при пониженной температуре 0°С в течение 2 ч. Твердый продукт отфильтровывали с получением 36,5 кг сухого дикетона.

Пример 22

Схема 1, стадия 3А: получение γ-лактона неполного метилового эфира 11а,17а-дигидрокси-3оксопрегн-4-ен-7а,21-дикарбоновой кислоты.

4-горлую 5-литровую круглодонную колбу снабжали механической мешалкой, уравновешивающей давление капельной воронкой с трубкой для ввода тока азота, термометром и холодильником с барботером. Этот барботер патрубком из коррозионно-стойкой пластмассы тайгон соединяли с двумя 2-литровыми ловушками, первая из которых была пустой, ее устанавливали внутри реакционного сосуда с целью предотвратить обратное всасывание материала из второй ловушки (с 1 л концентрированного раствора гипохлорита натрия) в реакционную колбу. В колбу в 3 л метанола вводили 79,50 г дикетона 3 (в значение массы не вносили поправку на степень чистоты, которая составляла 85%). К нему с помощью капельной воронки добавляли по каплям с перемешиванием в токе азота в течение 10-минутного периода 64,83 г 25% метанольного раствора метоксида натрия. После того как добавление завершали, оранжевато-желтую реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 20 ч. По завершении этого периода времени по каплям через капельную воронку добавляли 167 мл 4н. НС1 (осторожно: на этом этапе выделяется НС№), продолжая кипячение реакционной смеси с обратным холодильником. Окраска реакционной смеси осветлялась до бледной золотисто-оранжевой. После этого холодильник заменяли насадкой для отбора легких фракций и отгонкой удаляли 1,5 л метанола, одновременно с этим в соответствии со скоростью отгонки добавляя в колбу через делительную воронку 1,5 л воды. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и дважды экстрагировали 2,25-литровыми порциями метиленхлорида. Объединенные экстракты последовательно промывали 750-миллилитровыми порциями холодного насыщенного раствора №С1, 1н. раствора ΝαΟΗ и вновь насыщенного раствора №С1. Органический слой в течение ночи сушили над сульфатом натрия, фильтровали и с помощью вакуума объем упаривали до ~250 мл. Добавляли 300 мл толуола и под пониженным давлением отпаривали

- 75 009176 оставшийся метиленхлорид, причем за этот период времени на стенках колбы в виде белого твердого вещества начинал образовываться продукт. Содержимое колбы в течение ночи выдерживали при пониженной температуре и твердый продукт отделяли фильтрованием. Его промывали 250 мл толуола и дважды 250-миллилитровыми порциями диэтилового эфира и сушили на вакуумной воронке, получая 58,49 г белого твердого вещества степени чистоты 97,3%, как устанавливали ЖХВР. При концентрировании маточного раствора получали дополнительно 6,76 г продукта степени чистоты 77,1%. Общий выход с учетом степени чистоты составлял 78%.

Пример 23.

Схема 1, стадия 3Б: конверсия γ-лактона неполного метилового эфира 11а,17а-дигидрокси-3оксопрегн-4-ен-7а,21-дикарбоновой кислоты в γ-лактон неполного метилового эфира 17а-гидрокси-11а(метилсульфонил)окси-3-оксопрегн-4-ен-7а,21-дикарбоновой кислоты.

5-литровую четырехгорлую колбу оборудовали аналогично вышеприведенному примеру, за исключением того, что после барботера систему ловушек не устанавливали. В колбу с перемешиванием и в токе азота в количестве 138,70 г добавляли гидроксиэфир и 1425 мл метиленхлорида. С помощью бани из соли со льдом реакционную смесь охлаждали до -5°С. Быстро вводили 51,15 г (0,447 моль) метансульфонилхлорида с последующим медленным, по каплям добавлением 54,37 г триэтиламина в 225 мл метиленхлорида. Скорость добавления, длившегося ~30 мин, регулировали таким образом, чтобы температура реакционной смеси ни в коем случае не повышалась приблизительно до 5°С. Перемешивание продолжали еще в течение 1 ч и реакционную смесь переносили в 12-литровую делительную воронку, в которую добавляли 2100 мл метиленхлорида. Раствор последовательно промывали 1н. НС1, 1н. №1ОН и насыщенным водным раствором №1С1 с расходом в каждом случае по 700 мл каждого. Промывные жидкости объединяли и подвергали обратной экстракции 3500 мл метиленхлорида. Все органические промывные жидкости объединяли в 9-литровой емкости, в которую добавляли 500 г нейтрального оксида алюминия со степенью активности ΙΙ и 500 г безводного сульфата натрия. Содержимое этой емкости интенсивно перемешивали в течение 30 мин и фильтровали. Фильтрат в вакууме выпаривали досуха, получая продукт в виде липкой желтой пены. Этот продукт растворяли в 350 мл метиленхлорида и по каплям с перемешиванием добавляли 1800 мл диэтилового эфира. Скорость добавления регулировали таким образом, чтобы в течение 30 мин ввести примерно половину диэтилового эфира. После введения примерно 750 мл в виде кристаллического твердого вещества начинал выделяться продукт. Оставшийся диэтиловый эфир добавляли в течение 10 мин. Твердое вещество удаляли фильтрованием, фильтровальный пирог промывали 2 л диэтилового эфира и в течение ночи сушили в вакуумном сушильном шкафу при 50°С, получая 144,61 г (88%) почти белого твердого вещества с 1_пл=149-150°С. Материал, полученный таким путем, как правило, харатеризуется степенью чистоты 98-99% (по данным ЖХВР, по площади в процентах). В одном эксперименте получали материал с температурой плавления 153-153,5°С, степень чистоты которого, как это определяли по площади ЖХВР, составляла 99,5%.

Пример 24.

Схема 1, стадия 3В способа А: получение γ-лактона неполного метилового эфира 17а-гидрокси-3оксопрегна-4,9(11)-диен-7а,21-дикарбоновой кислоты.

1-литровую четырехгорлую колбу оборудовали как во втором примере. С перемешиванием в токе азота в колбу добавляли 250 мл муравьиной кислоты и 62 мл уксусного ангидрида. Добавляли 6,17 г формиата калия и реакционную смесь выдерживали на масляной бане при температуре внутри 40°С (эту операцию с улучшенными результатами повторяли позднее при 70°С) в течение 16 ч. По прошествии 16 ч вводили мезилат 5 и температуру внутри повышали до 100°С. Выдержку при повышенной температуре и перемешивание продолжали в течение 2 ч, после чего в роторном испарителе в вакууме удаляли растворитель. Остаток перемешивали вместе с 500 мл смеси воды со льдом в течение 15 мин, затем дважды экстрагировали 500-миллилитровыми порциями этилацетата. Органические фазы объединяли и последовательно промывали 250-миллилитровыми порциями холодных насыщенного раствора хлорида натрия (дважды), 1н. раствора гидроксида натрия и вновь насыщенного раствора хлорида натрия. Далее органическую фазу сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали досуха в вакууме с получением в виде пены желтовато-белого продукта, который, когда его касались шпателем, рассыпался как стеклянный порошок. По данным анализа (ЖХВР, по площади в процентах), порошок, который образовывался (14,65 г), представлял собой смесь 82,1% соединения 6, 7,4% соединения 8 и 5,7% соединения 9.

Пример 25.

Схема 1, стадия 3В способа Б: получение γ-лактона неполного метилового эфира 17а-гидрокси-3оксопрегна-4,9(11)-диен-7а,21-дикарбоновой кислоты.

5-литровую четырехгорлую колбу оборудовали как в вышеприведенном примере и с перемешиванием в токе азота добавляли 228,26 г уксусной кислоты и 41,37 г ацетата натрия. С помощью масляной бани смесь нагревали до внутренней температуры 100°С. Добавляли 123,65 г мезилата и выдерживали при повышенной температуре в течение 30 мин. По завершении этого периода выдержку при повышенной температуре прекращали и добавляли 200 мл смеси воды со льдом. Температура опускалась до 40°С и перемешивание продолжали в течение 1 ч, после чего реакционную смесь медленно выливали в 1,5 л

- 76 009176 холодной воды в 5-литровой колбе с работающей мешалкой. Продукт выделялся в виде липкого масла. Это масло растворяли в 1 л этилацетата и промывали холодными насыщенным раствором хлорида натрия, 1н. гидроксидом натрия и в завершение вновь насыщенным раствором хлорида натрия с расходом по 1 л каждого раствора. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат выпаривали досуха в вакууме с получением продукта в виде пены, которая разрушалась с образованием липкого масла. Это последнее растирали в диэтиловом эфире в течение некоторого промежутка времени и в конечном счете оно затвердевало. Твердый продукт отфильтровывали и промывали дополнительным количеством диэтилового эфира, получая 79,59 г желто-белого твердого вещества. Это последнее соответствовало содержанию 70,4% целевого Д^9,11-енэфира 6, 12,3% Д^11,12-енэфира 8, 10,8% 7а,9а-лактона 9 и 5,7% непрореагировавшего соединения 5.

Пример 26.

Схема 1, стадия 3Г: синтез γ-лактона неполного метилового эфира 9,11а-эпокси-17а-гидрокси-3оксопрегн-4-ен-7а,21-дикарбоновой кислоты.

Снабженный рубашкой 4-горлый 500-миллилитровый реактор оборудовали механической мешалкой, холодильником/барботером, термометром и капельной воронкой с патрубком для подачи тока азота. В этот реактор с перемешиванием и в токе азота загружали 8,32 г сырого енэфира в 83 мл метиленхлорида. В дополнение добавляли 4,02 г вторичного кислого фосфата калия, а затем 12 мл трихлорацетонитрила. По рубашке реактора пропускали подаваемую извне охлаждающую воду и реакционную смесь охлаждали до 8°С. Через капельную воронку в течение 10-минутного периода вводили 36 мл 30% перекиси водорода. После завершения этой операции добавления окрашенная вначале в бледно-желтый цвет реакционная смесь становилась почти бесцветной. Температура реакционной смеси оставалась равной 9±1°С в течение всего периода добавления и при продолжении перемешивания в течение ночи (в общей сложности 23 ч). В реакционную смесь добавляли 150 мл метиленхлорида и все содержимое вводили в ~250 мл смеси воды со льдом. Эту массу трижды экстрагировали 150-миллилитровыми порциями метиленхлорида. Объединенные метиленхлоридные экстракты промывали 400 мл холодного 3% раствора сульфита натрия для разложения всей остаточной перекиси. За этим следовали промывка 330 мл холодного 1н. раствора гидроксида натрия, промывка 400 мл холодного 1н. раствора соляной кислоты и в завершение промывка 400 мл рассола. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, фильтровали и фильтровальный пирог промывали 80 мл метиленхлорида. Растворитель удаляли в вакууме с получением в виде бледно-желтого твердого вещества 9,10 г сырого продукта. Этот последний перекристаллизовывали из ~25 мл 2-бутанона, получая 5,52 г почти белых кристаллов. В результате конечной перекристаллизации из ~50 мл ацетона получали 3,16 г длинных игольчатых кристаллов с 1_||;|=241-243°С.

Пример 27.

Схема 1, стадия 3, вариант 1: получение γ-лактона неполного метилового эфира 9,11а-эпокси-17агидрокси-3-оксопрегн-4-ен-7а,21-дикарбоновой кислоты из 4'8(4'а),7'а-гексадекагидро-11'а-гидрокси10'в,13'в-диметил-3',5,20'-триоксоспиро{фуран-2(3Н),17'в-[4,7]метано[17Н]циклопента[а]фенантрен}5'в(2'Н)карбонитрила.

г дикетона загружали в чистый и высушенный реактор с последующим введением 820 мл МеОН и 17,6 мл 25% раствора ЫаОМе в МеОН. Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником (при ~67°С) в течение 16-20 ч. Продукт гасили 40 мл 4н. НС1. Перегонкой под атмосферным давлением удаляли растворитель. Добавляли 100 мл толуола и остаточное количество метанола удаляли азеотропной перегонкой с толуолом. После концентрирования сырой гидроксиэфир 4 растворяли в 206 мл метиленхлорида и охлаждали до 0°С. Добавляли 5 мл метансульфонилхлорида, а затем медленно добавляли 10,8 мл триэтиламина. Продукт перемешивали в течение 45 мин. Вакуумной перегонкой удаляли растворитель, получая сырой мезилат 5.

В отдельный высушенный реактор вводили 5,93 г формиата калия, 240 мл муравьиной кислоты, а затем 118 мл уксусного ангидрида. Смесь выдерживали при 70°С в течение 4 ч.

В концентрированный раствор мезилата 5 добавляли смесь, содержавшую муравьиную кислоту. Конечную смесь выдерживали при 95-105°С в течение 2 ч. Образовавшуюся смесь охлаждали до 50°С и вакуумной перегонкой при 50°С удаляли летучие компоненты. Продукт распределяли между 275 мл этилацетата и 275 мл воды. Водный слой подвергали обратной экстракции 137 мл этилацетата, промывали 240 мл холодного 1н. раствора гидроксида натрия, а затем 120 мл насыщенного ЫаС1. После разделения фаз органический слой концентрировали в условиях вакуумной перегонки с получением сырого енэфира.

Продукт растворяли в 180 мл метиленхлорида и охлаждали до 0-15°С. Добавляли 8,68 г вторичного кислого фосфата калия, а затем 2,9 мл трихлорацетонитрила. В смесь в течение 3 мин вводили 78 мл 30% раствора перекиси водорода. Реакционную смесь перемешивали при 0-15°С в течение 6-24 ч. После завершения реакции смесь разделялась на две фазы. Органический слой промывали 126 мл 3% раствора сульфита натрия, 126 мл 0,5н. раствора гидроксида натрия, 126 мл 1н. раствора соляной кислоты и 126 мл 10% рассола. Продукт сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали через броунмиллерит, а метиленхлоридный растворитель удаляли перегонкой под атмосферным давлением. Продукт

- 77 009176 дважды кристаллизовали из метилэтилкетона с получением 7,2 г эплеренона.

Пример 28.

Схема 1, стадия 3, вариант 2: конверсия 1'8(4'а),7'а-гексадекагидро-11'а-гидрокси-10'в,13'вдиметил-3',5,20'-триоксоспиро{фуран-2(3Н),17'в-[4,7]метано[17Н]циклопента[а]фенантрен}-5'в(2'Н)карбонитрила в γ-лактон неполного метилового эфира 9,11а-эпокси-17а-гидрокси-3-оксопрегн-4-ен7а,21-дикарбоновой кислоты без промежуточного продукта.

4-горлую 5-литровую круглодонную колбу снабжали механической мешалкой, капельной воронкой с патрубком для впуска тока азота, термометром и холодильником с барботером, сообщающимся с натрийгипохлоритной газовой ловушкой. В колбу вводили 83,20 г дикетона в 3,05 л метанола. В капельную воронку загружали 67,85 г 25 мас.% раствора метоксида натрия в метаноле. При перемешивании в токе азота в колбу по каплям в течение 15 мин добавляли метоксид. Образовывалась темная оранжево-желтая суспензия. Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 20 ч и по каплям, одновременно продолжая кипячение с обратным холодильником, добавляли 175 мл 4н. соляной кислоты (осторожно: во время этой операции выделяется 11СЖ). Холодильник заменяли насадкой для отбора легких фракций и отгонкой головного погона и перегонкой удаляли 1,6 л метанола, одновременно с этим со скоростью, компенсирующей скорость отгонки, добавляли в колбу по каплям через делительную воронку 1,6 л 10% водного раствора хлорида натрия. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и дважды экстрагировали 2,25-литровыми порциями метиленхлорида. Объединенные экстракты промывали 750-миллилитровыми порциями холодных 1н. раствора гидроксида натрия и насыщенного раствора хлорида натрия. Органический слой сушили азеотропной перегонкой метанола под давлением в 1 атм. до конечного объема 1 л (0,5% общего количества отбирали для анализа).

Концентрированный органический раствор (гидроксиэфира) возвращали в исходную реакционную колбу, оборудованную как указано выше, но без ловушки для НС№ Колбу охлаждали до 0°С и при перемешивании в токе азота добавляли 30,7 г метансульфонилхлорида. В капельную воронку загружали 32,65 г триэтиламина, который добавляли по каплям в течение 15 мин, поддерживая температуру на уровне 5°С. Перемешивание продолжали в течение 2 ч, одновременно подогревая реакционную смесь до комнатной температуры. Готовили колонку, содержавшую 250 г кислотной ионообменной смолы 1)о\уе\ 50 ^х8-100, которую перед применением промывали 250 мл воды, 250 мл метанола и 500 мл метиленхлорида. Реакционную смесь пропускали через эту колонку и собирали. Готовили свежую колонку и вышеописанный процесс повторяли. Готовили третью 250-граммовую колонку с основной ионообменной смолой 1)о\уе\х8-100, которую предварительно обрабатывали по изложенному выше методу обработки кислотной смолой. Реакционную смесь пропускали сверху вниз через эту колонку и собирали. Готовили четвертую колонку с основной смолой и реакционную смесь вновь пропускали сверху вниз через колонку и собирали. За каждым проходом через колонку следовали две промывки колонки 250-миллилитровыми порциями метиленхлорида, причем для каждого прохода требовалось ~10 мин. Промывные жидкости на основе растворителей объединяли с реакционной смесью, в вакууме объем уменьшали до ~500 мл и 2% жидкости отбирали для контроля качества. Объем остатка далее уменьшали до 150 мл (раствор сырого мезилата).

В 5-литровый первоначально укомплектованный реактор вводили 960 мл муравьиной кислоты, 472 мл уксусного ангидрида и 23,70 г формиата калия. Эту смесь выдерживали с перемешиванием в токе азота при 70°С в течение 16 ч. Далее температуру повышали до 100°С и в течение 30 мин через капельную воронку добавляли раствор сырого мезилата. По мере отгонки из реакционной смеси метиленхлорида температура опускалась до 85 °С. После полного его удаления температура медленно возвращалась к 100°С и ее поддерживали на этом уровне в течение 2,5 ч. Реакционную смесь охлаждали до 40°С и при пониженном давлении муравьиную кислоту удаляли до тех пор, пока не достигали минимального перемешиваемого объема (~150 мл). Остаток охлаждали до комнатной температуры и добавляли 375 мл метиленхлорида. Разбавленный остаток промывали холодными 1-литровыми порциями насыщенного раствора хлорида натрия, 1 н. карбоната натрия и вновь раствора хлорида натрия. Органическую фазу сушили над 150 г сульфата магния и фильтровали с получением темного красновато-коричневого раствора (раствора сырого енэфира).

- 78 009176

Снабженный рубашкой 4-горлый 1-литровый реактор оборудовали механической мешалкой, холодильником/барботером, термометром и капельной воронкой с патрубком для подачи тока азота. В этот реактор с перемешиванием и в токе азота загружали раствор сырого енэфира (по расчетам, 60 г) в 600 мл метиленхлорида. В дополнение добавляли 24 г вторичного кислого фосфата калия, а затем 87 мл трихлорацетонитрила. По рубашке реактора пропускали подаваемую извне охлаждающую воду и реакционную смесь охлаждали до 10°С. Через капельную воронку в течение 30-минутного периода в смесь вводили 147 мл 30% перекиси водорода. После завершения этой операции окрашенная вначале в темную красновато-коричневого окраску реакционная смесь становилась бледно-желтой. Температура реакционной смеси оставалась равной 10±1°С в течение всего периода добавления и при продолжении перемешивания в течение ночи (в общей сложности 23 ч). Фазы разделялись и водную часть дважды экстрагировали 120-миллилитровыми порциями метиленхлорида. Далее добавляли объединенные органические фазы, промытые 210 мл 3% раствора сульфита натрия. Эту операцию повторяли второй раз, после чего как органическая, так и водная части характеризовались отрицательным тестом на перекись с помощью индикаторной иодокрахмальной бумажки. Органическую фазу последовательно промывали 210миллилитровыми порциями холодных 1н. гидроксида натрия, 1н. соляной кислоты и, наконец, дважды промывали рассолом. Органическую фазу сушили азеотропной перегонкой до объема ~100 мл, добавляли свежего растворителя (250 мл), азеотропно перегоняли до того же объема 100 мл и остаточный растворитель удаляли в вакууме с получением в виде клейкой желтой пены 57,05 г сырого продукта. Часть (51,01 г) далее сушили до постоянной массы 44,3 г и подвергали количественному ЖХВР анализу. По данным оценки, содержание эпоксисоединения составляло приблизительно 27,1%.

Пример 29.

В реакционную колбу в токе азота загружали 429,5 г 11а-гидроксиандростендиона и 7,1 г гидрата толуолсульфокислоты. В реактор добавляли 2,58 л этанола и образовывавшийся раствор охлаждали до 5°С. В течение 15-минутного периода при 0-15°С в этот раствор добавляли 334,5 г триэтилортоформиата. После завершения операции добавления триэтилортоформиата реакционную смесь подогревали до 40°С и при этой температуре в течение 2 ч проводили реакцию, после которой температуру повышали до точки кипения с обратным холодильником и реакцию продолжали при кипячении с обратным холодильником в течение еще 3 ч. Реакционную смесь охлаждали в вакууме и в вакууме удаляли растворитель с получением 3-этоксиандроста-3,5-диен-17-она.

Пример 30. Образование енамина из 11а-гидроксиканренона.

1,72 г цианида натрия вводили в 25-миллилитровую 3-голую колбу, снабженную механической мешалкой. Добавляли 2,1 мл воды и смесь перемешивали при повышенной температуре до растворения твердых частиц. Добавляли 15 мл диметилформамида, а затем 5 г 11а-гидроксиканренона. В эту смесь вводили смесь 0,4 мл воды с 1,49 г серной кислоты. Смесь выдерживали при 85°С в течение 2,5 ч, после чего ЖХВР анализ показывал завершение конверсии в продукт. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры. Добавляли 0,83 г серной кислоты и смесь перемешивали в течение 0,5 ч. Эту реакционную смесь вводили в 60 мл воды, охлажденной на ледяной бане. Колбу промывали 3 мл ДМФ и 5 мл воды. Суспензию перемешивали в течение 40 мин и фильтровали. Фильтровальный пирог дважды промывали 40 мл воды и сушили в вакуумном сушильном шкафу при 60°С в течение ночи с получением 4,9 г 11а-гидроксиенамина, т.е. 5'К(5'а),7'в,20'-аминогексадекагидро-11'в-гидрокси-10'а,13'а-диметил3',5-диоксоспиро{фуран-2(3Н),17'а(5'Н)-[7,4]метено[4Н]циклопента[а]фенантрен}-5'-карбонитрила.

- 79 009176

Пример 31. Конверсия 11а-гидроксиканренона в дикетон.

1,03 г цианида натрия вводили в 50-миллилитровую 3-горлую колбу, снабженную механической мешалкой. Добавляли 1,26 мл воды и содержимое колбы слегка подогревали для растворения твердого материала. Добавляли 9 мл диметилацетамида (или диметилформамида), а затем 3,0 г 11αгидроксиканренона. В реакционную колбу с перемешиванием вводили смесь 0,47 мл серной кислоты с 0,25 мл воды. Смесь выдерживали при 95°С в течение 2 ч. ЖХВР анализ указывал на завершение реакции. Добавляли 0,27 мл серной кислоты и смесь перемешивали в течение 30 мин. Вводили дополнительно 25 мл воды и 0,90 мл серной кислоты и реакционную смесь перемешивали в течение 16 ч. Затем эту смесь охлаждали на ледяной бане до 5-10°С. Твердый материал выделяли фильтрованием через фильтр со стеклянной фриттой с последующей двукратной промывкой 20 мл воды. Твердый дикетон, т.е. 4'8(4'α),7'α-гексадекагидро-11'α-гидрокси-10'β,13'β-диметил-3',5,20'-триоксоспиро{фуран2(3Н),17'в[4,7]метано[17Н]циклопента[а]фенантрен}-5'в(2'Н)карбонитрил сушили в вакуумном сушильном шкафу с получением 3,0 г твердого вещества.

Пример 32.

Суспензию 5 г дикетона, полученного согласно примеру 31, в 100 мл метанола кипятили с обратным холодильником и в течение 1 мин добавляли 5,8 мл 25% раствора метоксида калия в метаноле. Смесь становилась гомогенной. По прошествии 15 мин образовывался осадок. Смесь кипятили с обратным холодильником и по прошествии приблизительно 4 ч она вновь становилась гомогенной. Кипячение с обратным холодильником продолжали в общей сложности в течение 23,5 ч и добавляли 10 мл 4,0н. НС1. Перегонкой в целом удаляли 60 мл раствора цианида водорода в метаноле. К остатку после перегонки в течение 15 мин добавляли 57 мл воды. Во время добавления воды температуру раствора повышали до 81,5°С и перегонкой дополнительно удаляли 4 мл раствора цианида водорода в метаноле. После завершения добавления воды смесь становилась мутной и источник тепла удаляли. Смесь перемешивали в течение 3,5 ч и продукт медленно кристаллизовался. Суспензию отфильтровывали и собранный твердый материал промывали водой, сушили в токе воздуха на воронке и в течение 16 ч сушили при 92°С (под остаточным давлением 26 дюймов рт.ст.) с получением 2,98 г не совсем белого твердого вещества. Это твердое вещество на 91,4 мас.% состояло из гидроксиэфира, т.е. γ-лактона неполного метилового эфира 11β,17α-дигидрокси-3-оксопрегн-4-ен-7α,21-дикарбоновой кислоты. Выход составлял 56,1%.

Пример 33.

Дикетон, полученный согласно примеру 31, загружали в очищенную и высушенную 3-горлую реакционную колбу, снабженную термометром, ловушкой Дина Старка и механической мешалкой. В реактор при комнатной температуре (22°С) загружали 24 мл метанола и образовывавшуюся суспензию перемешивали в течение 5 мин. В реактор загружали 52,8 мл 25 мас.% раствора метоксида натрия в метаноле и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, причем за это время реакционная смесь превращалась в светло-коричневый прозрачный раствор и происходило, как отмечали, слабое выделение тепла (2-3 °С). Скорость добавления регулировали таким образом, чтобы температура в сосуде не превышала 30°С.

После этого смесь нагревали до кипения с обратным холодильником (приблизительно 67°С) и кипячение с обратным холодильником продолжали в течение 16 ч. Далее отбирали пробу и анализировали ЖХВР на степень конверсии. Реакцию продолжали при кипячении с обратным холодильником до тех пор, пока остаточное содержание дикетона превышало 3% от количества загруженного дикетона. Во время кипячения с обратным холодильником в реакционный сосуд вводили 120 мл 4н. НС1, в результате чего выделялся НСЫ, который гасили в газовой ловушке.

По завершении этой реакции из реакционной смеси под атмосферным давлением отгоняли 90-95% метанольного растворителя. Температуру верха во время отгонки варьировали в пределах 67-75°С, и дистиллят, который содержал НСЫ, перед сбрасыванием в отход обрабатывали каустиком и химическим отбеливателем. После удаления метанола реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, причем, когда смесь остывала до 40-45°С, начинал выпадать в осадок твердый продукт. В охлажденную суспензию при 25°С вводили 1200 мл водного раствора, необязательно содержавшего 5 мас.% бикарбоната натрия, и затем образовывавшуюся смесь в течение приблизительно 1 ч выдерживали при пониженной температуре (0°С). Обработка бикарбонатом натрия оказывалась эффективным средством удаления

- 80 009176 из реакционной смеси остаточного непрореагировавшего дикетона. Суспензию перемешивали при 0°С в течение 2 ч для завершения осаждения и кристаллизации, после которых твердый продукт выделяли фильтрованием и фильтровальный пирог промывали 100 мл воды. Продукт сушили при 80-90°С под остаточным давлением 26 дюймов рт.ст. до постоянной массы. Содержание влаги после сушки составляло менее 0,25 мас.%. Молярный выход с учетом поправок составлял примерно 77-80 мас.%.

Пример 34.

В метанольном растворителе в присутствии 1 экв. йодида цинка проводили взаимодействие 1 экв. дикетона, полученного в соответствии с примером 31, с 4,8 экв. метоксида натрия. Обработку реакционного продукта можно проводить либо в соответствии с экстракционным методом, представленным в настоящем описании, либо по неэкстракционному методу, в котором отсутствуют стадии экстракции метиленхлоридом, промывок рассолом и каустиком и сушки над сульфатом натрия. Кроме того, в этом неэкстракционном методе толуол заменяют 5 мас.% раствором бикарбоната натрия.

Пример 35.

1,97 г гидроксиэфира, полученного согласно примеру 34, добавляли к 20 мл тетрагидрофурана и образовывавшуюся смесь охлаждали до -70°С. Добавляли 0,8 мл сульфурилхлорида и смесь перемешивали в течение 30 мин, после чего добавляли 1,3 г имидазола. Реакционную смесь подогревали до комнатной температуры и перемешивали в течение еще 2 ч. Далее эту смесь разбавляли метиленхлоридом и экстрагировали водой. Органический слой концентрировали с получением 1,97 г сырого енэфира. Небольшую пробу сырого продукта анализировали ЖХВР. Анализ показывал, что соотношение 9,11олефин/11,12-олефин/7,9-лактон составляло 75,5/7,2/17,3. Когда процесс проводили при 0°С, но иначе, чем указано выше, в результате реакции получали продукт, в котором распределение 9,11-олефин/11,12олефин/7,9-лактон составляло 77,6/6,7/15,7. Этот технический прием объединяет в одну стадию введение уходящей группы и ее удаление с введением 9,11-олефиновой структуры енэфира, т.е. в результате реакции сульфурилхлорид вызывал замещение 11а-гидроксигруппы гидроксиэфира формулы V галогенидом, за которым следовало дегидрогалоидирование с образованием Д-9,11-структуры. Таким образом, образование енэфира обеспечивалось без использования сильной кислоты (такой, как муравьиная) или осушителя, такого, как уксусный ангидрид. Устранялась также стадия кипячения с обратным холодильником, предусмотренная в другом способе, на которой выделялся монооксид углерода.

Пример 36.

г гидроксиэфира, полученного согласно примеру 34, и 400 мл метиленхлорида вводили в очищенную сухую 3-горлую круглодонную колбу, снабженную механической мешалкой, капельной воронкой и термопарой. Образовывавшуюся смесь перемешивали при комнатной температуре до завершения образования раствора. С помощью ледяной бани этот раствор охлаждали до 5°С. В раствор СН2С12, содержавший гидроксиэфир, вводили 5 мл метансульфонилхлорида, вскоре после чего следовало медленное, по каплям добавление 10,8 мл триэтиламина. Скорость добавления регулировали таким образом, чтобы температура реакционной смеси не превышала 5°С. Реакция оказывалась очень экзотермической, вследствие чего было необходимо охлаждение. Реакционную смесь перемешивали приблизительно при 5°С в течение 1 ч. После завершения реакции (по данным ЖХВР и ТСХ анализов) смесь концентрировали примерно при 0°С под остаточным давлением 26 дюймов рт.ст. до образования густого шлама. Образовывавшийся шлам разбавляли 160 мл СН₂С1₂ и смесь концентрировали приблизительно при 0°С под остаточным давлением 26 дюймов рт.ст. до образования концентрата. Степень чистоты этого концентрата (по площади ЖХВР в процентах), мезилатного продукта формулы IV, в которой К³ обозначает Н, а как -Α-Α-, так и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-, т.е. продукта превращения γ-лактона неполного метилового эфира 11а,17а-дигидрокси-3-оксопрегн-4-ен-7а,21-дикарбоновой кислоты в γ-лактон неполного метилового эфира 17а-гидрокси-11а-(метилсульфонил)окси-3-оксопрегн-4-ен-7а,21дикарбоновой кислоты, составляла 82%. Этот материал без выделения использовали для последующей реакции.

4,7 г формиата калия, 16 мл муравьиной кислоты и 8 мл (0,084 моль) уксусного ангидрида вводили в чистый сухой реактор, снабженный механической мешалкой, холодильником, термопарой и греющей рубашкой. Образовывавшийся раствор нагревали до 70°С и перемешивали при этой температуре в течение примерно 4-8 ч. Добавление уксусного ангидрида вызывает экзотермическую реакцию и выделение газа (С0), вследствие чего скорость добавления необходимо изменять таким образом, чтобы регулировать как температуру, так и выделение газа (давление). Продолжительность реакции с получением активного удаляющего реагента зависела от количества воды, находившейся в реакционной среде (муравьиная кислота и формиат калия включали примерно по 3-5% влаги, каждый). Реакция удаления чувствительна к количеству содержащейся воды; если содержание воды, по данным анализа Карла Фишера (КФ), составляет >0,1%, концентрация 7,9-лактоновой примеси может возрасти. Удаление этого побочного продукта из конечного продукта сопряжено с затруднениями технологического порядка. Когда результаты анализа КФ показывали <0,1% воды, активный удаляющий агент переносили в концентрат мезилата (0,07 моль), полученного на предыдущей стадии. Образовывавшийся раствор нагревали до 95°С, летучий материал отгоняли и собирали в ловушке Дина Старка. Когда выделение летучего материала

- 81 009176 прекращалось, ловушку Дина Старка заменяли холодильником и реакционную смесь выдерживали при 95°С в течение еще 1 ч. По завершении процесса (по данным ТСХ и ЖХВР анализов; <0,1% исходного материала) содержимое реактора охлаждали до 50°С и начинали вакуумную перегонку (26 дюймов рт.ст./50°С). Смесь концентрировали до густого шлама и затем охлаждали до комнатной температуры. Конечный шлам разбавляли 137 мл этилацетата, раствор перемешивали в течение 15 мин и разбавляли 137 мл воды. Слои разделялись и находившийся внизу водный слой повторно экстрагировали 70 мл этилацетата. Объединенный этилацетатный раствор промывали один раз 120 мл солевого раствора и дважды 120-миллилитровыми порциями охлажденного льдом 1н. раствора №1ОН. Определяли значение рН водосодержащей среды и, если значение рН обедненной промывной жидкости составляло <8, органический слой повторно промывали. Когда значение рН обедненной промывной жидкости было равным >8, этилацетатный слой один раз промывали 120 мл солевого раствора и концентрировали досуха в роторном испарителе с помощью водяной бани при 50°С. Масса полученного в виде твердого продукта енэфира, т.е. γ-лактона неполного метилового эфира 17а-гидрокси-3-оксопрегна-4,9(11)-диен-7а,21дикарбоновой кислоты составляла 92 г (77% молярный выход).

Пример 37.

100 г (0,22 моль) гидроксиэфира, полученного согласно примеру 34, загружали в 2-литровую 3-горлую круглодонную колбу, снабженную механической мешалкой, капельной воронкой и термопарой. Применяли циркуляционную охлаждающую баню с автоматическим регулированием температуры. Перед реакцией колбу сушили вследствие чувствительности метансульфонилхлорида к воде.

В колбу загружали 1 л метиленхлорида и с перемешиванием растворяли в нем гидроксиэфир. Раствор охлаждали до 0°С и в эту колбу с помощью капельной воронки вводили 25 мл (0,32 моля) метансульфонилхлорида. Через капельную воронку в реактор вводили 50 мл (0,59 моля) триэтиламина и воронку промывали 34 мл дополнительного метиленхлорида. Введение триэтиламина сопровождалось высокоэкзотермической реакцией. Время введения при перемешивании и охлаждении составляло примерно 10 мин.

Загружаемую смесь охлаждали до 0°С и выдерживали при этой температуре с перемешиванием в течение дополнительных 45 мин, причем в этот период пространство над жидкостью в реакционной колбе очищали током азота. Далее пробу реакционной смеси тонкослойной хроматографией и жидкостной хроматографией высокого разрешения анализировали на завершение реакции.

После этого смесь перемешивали при 0°С в течение еще 30 мин и вновь анализировали на завершение реакции. На этом этапе анализ показывал, что реакция была практически полностью завершена; при 0°С под остаточным давлением 26 дюймов рт.ст. в качестве растворителя отпаривали метиленхлорид.

Газохроматографический анализ дистиллята указывал на наличие как метансульфонилхлорида, так и триэтиламина. После этого в реактор загружали 800 мл метиленхлорида и образовывавшуюся смесь перемешивали в течение 5 мин при температуре 0-15°С. Растворитель вновь отпаривали при 0-5°С под остаточным давлением 26 дюймов рт.ст., получая мезилат формулы IV, в которой К³ обозначает Н, -А-Аи -В-В-, каждый, обозначает группу -СН2-СН2-, а К¹ обозначает метоксикарбонил. Степень чистоты продукта составляла приблизительно 90-95% (по площади).

Для получения удаляющего реагента 23,5 г (0,28 моль) формиата калия, 80 мл муравьионой кислоты и 40 мл уксусного ангидрида смешивали в отдельном высушенном реакторе. В этот реактор закачивали муравьиную кислоту и уксусный ангидрид, причем температуру во время добавления уксусного ангидрида поддерживали на уровне не выше 40°С. Содержащую удаляющий реагент смесь выдерживали при 70°С для удаления из реакционной системы воды. Эту реакцию вели до тех пор, пока содержание воды не достигало уровня ниже 0,3 мас.%, как это определяли анализом Карла Фишера. Далее раствор удаляющего реагента переносили в реактор, содержавший концентрированный раствор сырого мезилата, приготовленный по изложенному выше.

Образовавшуюся смесь нагревали до максимальной температуры 95°С и дистиллят летучих компонентов собирали до тех пор, пока дистиллят не прекращал образовываться. Отгонку останавливали приблизительно при 90°С.

После завершения отгонки реакционную смесь перемешивали при 95°С в течение еще 2 ч и тонкослойной хроматографией проверяли полноту реакции.

Когда реакция завершалась, реактор охлаждали до 50°С и при 50°С под остаточным давлением 26 дюймов рт. ст. из реакционной смеси удаляли растворитель. Концентрат охлаждали до комнатной температуры, после чего вводили 688 мл этилацетата и смесь этилацетата с концентратом перемешивали в течение 15 мин. На этом этапе с целью содействовать удалению из органической фазы водорастворимых примесей вводили 688 мл 12% солевого раствора. Далее фазам давали разделяться в течение 20 мин. Водный слой переносили в другой сосуд, в который вводили дополнительное количество (350 мл) этилацетата. Эту обратную экстракцию водного слоя проводили в течение 30 мин, после чего давали разделяться фазам и объединяли этилацетатные слои. К объединенным этилацетатным слоям добавляли 600 мл насыщенного раствора хлорида натрия и перемешивали в течение 30 мин. Затем давали разделяться фазам. Водный слой удаляли. Проводили дополнительную промывку 600 мл раствора хлорида натрия.

- 82 009176

От второго, обедненного промывного раствора отделяли органическую фазу. Далее эту органическую фазу при перемешивании в течение 30 мин промывали 600 мл 1н. гидроксида натрия. В течение 30 мин фазам давали разделяться для удаления водного слоя. Проверяли значение рН водного слоя, в результате устанавливали, что оно составляло >7. В течение 15 мин осуществляли дальнейшую промывку 600 мл насыщенного раствора хлорида натрия. В завершение органическую фазу концентрировали при 50°С под остаточным давлением 26 дюймов рт.ст. и фильтрованием выдаляли продукт. Высушенный конечный продукт представлял собой коричневое твердое вещество в виде пены. В результате дальнейшей сушки при 45°С под пониженным давлением в течение 24 ч получали 95,4 г енэфирного продукта, степень чистоты которого, по данным количественного анализа, составляла 68,8%. С учетом количества как исходного гидроксиэфира, так и конечного эфира молярный выход продукта был равным 74,4%.

Пример 38.

Работали аналогично примеру 37, за исключением того, что многочисленные стадии промывок исключали за счет обработки реакционного раствора ионообменной смолой, основным оксидом алюминия или основным диоксидом кремния. Условия обработки основным диоксидом кремния представлены в табл. 38. Каждая из этих обработок эффективно, как устанавливали, удаляла примеси без многочисленных промывок примера 44.

Таблица 38

Очиститель	Расход	Цель эксперимента	Основные результаты
Основный оксид алюминия	2 г/125 г продукта	Обработка реакционной смеси основным оксидом алюминия для удаления соли ЕЦ>НС1 и устранения промывок 1н. ХаОН и 1и. НС1	Выход продукта составлял 93%
Основный диоксид кремния	2 г/125 г продукта	Обработка реакционной смеси основным диоксидом кремния, которая дешевле при удалении соли Е(3*НС1 и устранение промывок 1н, ХаОН и 1н, НС1	Выход продукта составлял 95%

Пример 39.

г ацетата калия и 42,5 мл трифторуксусной кислоты смешивали в 100-миллилитровом реакторе. В эту смесь с расходом, который регулировали для поддержания температуры во время добавления на уровне ниже 30°С, добавляли 9,5 мл трифторуксусного ангидрида. Далее раствор выдерживали при 30°С в течение 30 мин, получая реагент для удаления, который может быть использован для превращения мезилата формулы IV в енэфир формулы II.

В предварительно приготовленный раствор мезилата формулы IV добавляли предварительно приготовленный удаляющий реагент ТФА/ТФУ ангидрид. Образовывавшуюся смесь выдерживали при 40°С в течение 4,5 ч, причем ТСХ или ЖХВР периодически проверяли степень конверсии. Когда реакция завершалась, смесь переносили в 1-гордую колбу и под пониженным давлением досуха концентрировали при комнатной температуре (22°С). Для достижения полноты растворения твердофазного материала в смесь добавляли 137 мл этилацетата, после чего добавляли 137 мл смеси вода/рассол и образовавшуюся двухфазную смесь перемешивали в течение 10 мин. После этого в течение 20 мин фазам давали разделяться. Концентрация рассола составляла 24 мас.%. Водную фазу вводили в контакт с дополнительным количеством (68 мл) этилацетата и приготовленную таким образом двухфазную смесь перемешивали в течение 10 мин, после чего ей давали постоять в течение 15 мин для разделения фаз. Этилацетатные слои из двух экстракций объединяли и промывали 120 мл рассола концентрацией 24 мас.%, другой порцией (60 мл) рассола концентрацией 24 мас.%, 150 мл 1н. раствора гидроксида натрия и еще одной 60миллилитровой порцией рассола. После каждого добавления водной фазы смесь перемешивали в течение 10 мин и давали ей постоять в течение 15 мин для расслоения. Образовывавшийся раствор под пониженным давлением, создаваемым водоструйным насосом, при 45°С концентрировали досуха. 8,09 г твердого продукта анализировали ЖХВР, в результате чего устанавливали, что он включал 83,4% (по площади) енэфира, 2,45% (по площади) 11,12-олефина, 1,5% 7,9-лактона и 1,1% непрореагировавшего мезилата.

Пример 40.

В 50-миллилитровую колбу помещали 1,0 г мезилата со структурой, полученной согласно примеру 23, 10 г изопропенилацетата и 5 мг п-толуолсульфокислоты и выдерживали с перемешиванием при 90°С. По прошествии 5 ч смесь охлаждали до 25°С и концентрировали в вакууме под давлением 10 мм рт.ст. Остаток растворяли в 20 мл СН₂С1₂ и промывали 5% водным раствором №НСО₃. Слой СН₂С1₂ концентрировали в вакууме с получением 1,47 г продукта в виде желтовато-коричневого масла. Этот продукт перекристаллизовывали из СН₂С1₂/Е1₂О с получением 0,50 г енолацетата формулы ΐν(Ζ).

-83 009176

Этот материал вводили в смесь 0,12 г ацетата натрия и 2,0 мл уксусной кислоты, которую предварительно нагревали с перемешиванием до 100°С. По прошествии 60 мин смесь охлаждали до 25°С и разбавляли 20 мл СН₂С1₂. Раствор промывали 20 мл воды и сушили над М§8О₄. Фильтрованием удаляли осушитель и фильтрат концентрировали в вакууме с получением 0,4 г целевого 9,11-олефина, Ιν(Υ). Сырой продукт включал менее 2% 7,9-лактона в качестве примеси.

Пример 41. Термическое расщепление мезилата в ДМСО.

Смесь 2 г мезилата с 5 мл ДМСО в колбе выдерживали при 80°С в течение 22,4 ч. Данные ЖХВР анализа этой реакционной смеси указывали на то, что исходный материал обнаружен не был. В реакционную смесь добавляли 10 мл воды и осадок трижды экстрагировали метиленхлоридом. Объединенные метиленхлоридные слои промывали водой, сушили над сульфатом магния и концентрировали с получением енэфира.

Пример 42.

В 50-миллилитровой колбе грушевидной формы с мешалкой 1,07 г енэфира (по данным количественного анализа содержавшего 74,4% енэфира), 0,32 г трихлорацетамида и 0,70 г вторичного кислого фосфата калия в твердом виде смешивали с 15 мл метиленхлорида. Получали прозрачный раствор. С помощью пипетки в течение 1-минутного периода добавляли 5 мл 30 мас.% перекиси водорода. Образовавшуюся смесь перемешивали в течение 6 ч при комнатной температуре, после чего ЖХВР анализ показывал, что соотношение между эпоксимексреноном и енэфиром в реакционной смеси составляло приблизительно 1:1. В эту реакционную смесь дополнительно добавляли 0,32 г трихлорацетамида и реакцию продолжали при перемешивании в течение еще 8 ч, а по истечении этого времени остаточная доля енэфира уменьшалась, как устанавливали, до 10%. Добавляли дополнительно 0,08 г трихлорацетамида и реакционной смеси давали постоять в течение ночи, после чего в смеси относительно количества эпоксимексренона оставалось всего 5% непрореагировавшего енэфира.

Пример 43.

5,4 г енэфира формулы НА (по данным количественного анализа, содержавшего 74,4% енэфира) вводили в 100-миллилитровый реактор. В этот енэфир добавляли 4,9 г трихлорацетамида и 3,5 г вторичного кислого фосфата калия (оба в твердом виде), а затем 50 мл метиленхлорида. Смесь охлаждали до 15°С и в течение 10-минутного периода вводили 25 г 30% перекиси водорода. Реакционной смеси давали нагреваться до 20°С и перемешивали при этой температуре в течение 6 ч, после чего ЖХВР проверяли степень конверсии. Остаточное содержание енэфира, по результатам анализа, было равным менее 1 мас.%.

Реакционную смесь вводили в 100 мл воды, давали фазам разделяться и метиленхлоридный слой удаляли. В метиленхлоридный слой добавляли 50 мл 0,5н. гидроксида натрия. По прошествии 20 мин после того, как фазам давали разделиться, в метиленхлоридный слой добавляли 50 мл 0,5н. НС1, после чего фазы оставляли разделяться и органическую фазу промывали 50 мл насыщенного рассола. Метиленхлоридный слой сушили над безводным сульфатом магния и удаляли растворитель. Таким путем получили 5,7 г белого твердого вещества. Водный слой с гидроксидом натрия подкисляли, экстрагировали и экстракт обрабатывали с получением дополнительно 0,2 г продукта. Выход эпоксимексренона составлял 90,2%.

Пример 44.

Енэфир формулы НА превращали в эпоксимексренон аналогично тому, как это описано в примере 43, за исключением следующих отличий: первоначально загружаемая порция включала 5,4 г енэфира (по данным количественного анализа содержавшего 74,4% енэфира), 3,3 г трихлорацетамида и 3,5 г вторичного кислого фосфата калия. Добавляли 12,5 мл раствора перекиси водорода. Реакцию вели в течение ночи при 20°С, после чего ЖХВР указывал на 90% конверсию енэфира в эпоксимексренон. Дополнительно вводили 3,3 г трихлолрацетамида и 5,0 г 30% перекиси водорода и реакцию вели в течение еще 6 ч, после чего содержание остаточного енэфира составляло всего 2% от загруженного енэфира. После обработки, которую проводили аналогично примеру 43, получили 5,71 г эпоксимексренона.

Пример 45.

Енэфир формулы НА превращали в эпоксимексренон аналогично тому, как это в целом описано в примере 43. В ходе проведения реакции в этом примере загружаемая порция енэфира включала 5,4 г енэфира (по данным количественного анализа содержавшего 74,4% енэфира), загружаемая порция трихлорацетамида составляла 4,9 г, загружаемая порция перекиси водорода составляла 25 г, а загружаемая

- 84 009176 порция вторичного кислого фосфата калия была равной 3,5 г. Реакцию проводили в течение 18 ч при 20°С. Содержание остаточного енэфира составляло менее 2%. После обработки получали 5,71 г эпоксимексренона.

Пример 46.

Енэфир формулы ПЛ превращали в эпоксимексренон аналогично тому, как это описано в примере 43, за исключением того, что реакционная температура в этом примере составляла 28°С. Материалы, загружаемые в реактор, включали 2,7 г енэфира, 2,5 г трихлорацетамида, 1,7 г вторичного кислого фосфата калия, 17,0 г перекиси водорода и 50 мл метиленхлорида. По прошествии 4 ч реакции содержание непрореагировавшего енэфира составляло всего 2% в пересчете на загруженное количество енэфира. После обработки так, как изложено в примере 43, получали 3,0 г эпоксимексренона.

Пример 47.

г енэфира формулы ПЛ (по данным количественного анализа содержавшего 72% енэфира) растворяли в 150 мл метиленхлорида, после чего при медленном перемешивании добавляли 14,9 г трихлорацетамида. Температуру смеси регулировали на уровне 25°С и раствор 10,6 г вторичного кислого фосфата калия в 10,6 мл воды перемешивали в растворе енэфирного субстрата при скорости вращения мешалки 400 об/мин. В раствор субстрата/фосфата/трихлорацетамида в течение 3-5 мин добавляли 69,4 мл 30 мас.% раствора перекиси водорода. Не отмечали ни экзотермической реакции, ни выделения кислорода. Приготовленную таким образом реакционную смесь перемешивали при скорости вращения мешалки 400 об/мин и 25°С в течение 18,5 ч. По ходу всей реакции никакого выделения кислорода не отмечали.

Реакционную смесь разбавляли 69,4 мл воды и смесь перемешивали при скорости вращения мешалки приблизительно 250 об/мин в течение 15 мин. При проведении процесса необходимость в регулировании температуры отсутствовала, его вели, по существу, при комнатной температуре (причем была приемлема любая температура в интервале 5-25°С). Водному и органическому слоям давали разделиться и нижний метиленхлоридный слой удаляли.

Водный слой подвергали обратной экстракции в течение 15 мин при скорости вращения мешалки 250 об/мин в 69,4 мл метиленхлорида. Слоям давали разделиться и нижний метиленхлоридный слой удаляли. Водный слой (177 г со значением рН 7) анализировали с определением перекиси водорода. Результат (12,2%), указывавший на то, что во время реакции было израсходовано всего 0,0434 моль перекиси водорода, составлял 0,0307 моль олефина. Обратной экстракции с использованием небольшого объемного количества метиленхлорида оказывалось достаточно для гарантии того, что никаких потерь эпоксимексренона в водном слое не было. Этот результат подтверждался осуществлением второй экстракции большим количеством метиленхлорида, в которой выделяли только трихлорацетамид.

Совокупные метиленхлоридные растворы после вышеуказанных экстракций объединяли и промывали 122 мл 3 мас.% раствора сульфита натрия в течение по меньшей мере 15 мин при скорости вращения мешалки примерно 250 об/мин. По завершении этого периода перемешивания отмечали отрицательный тест с индикаторной йодкрахмальной бумажкой (КЬбумажка; окрашивания не наблюдали; при положительной реакции пурпурная окраска указывает на присутствие перекиси).

Водному и органическому слоям давали разделиться и нижний метиленхлоридный слой удаляли. Водный слой (со значением рН 6) выбрасывали в отход. Следует отметить, что добавление раствора сульфита натрия способно вызывать слабоэкзотермическую реакцию, вследствие чего такую операцию добавления необходимо проводить с регулированием температуры.

Метиленхлоридную фазу при скорости вращения мешалки приблизительно 250 об/мин и температуре в интервале 15-25°С (при значении рН 12-13) в течение 45 мин промывали 61 мл 0,5н. раствора гидроксида натрия. В ходе проведения такой операции удаляли примеси, дериватизированные из трихлорацетамида. Подкисление щелочной водной фракции с последующей экстракцией метиленхлоридом подтверждало, что за время этой операции терялось очень мало эпоксимексренона.

Метиленхлоридную фазу один раз в течение 15 мин промывали 61 мл 0,1н. соляной кислоты при скорости вращения мешалки 250 об/мин и температуре в интервале 15-25°С. Далее слоям давали разделиться и нижний метиленхлоридный слой удаляли и вновь в течение 15 мин промывали 61 мл 10 мас.% водного раствора хлорида натрия при скорости вращения мешалки 250 об/мин и температуре в интервале 15-25°С. Вновь давали разделиться слоям и органический слой удаляли. Этот органический слой фильтровали через прокладку 8о1каПос, а затем выпаривали досуха под пониженным давлением. Сушку завершали на водяной бане при температуре 65°С. Получали 17,95 г не совсем белого твердого вещества, которое подвергали ЖХВР анализу. Содержание эпоксимексренона составляло 66,05%. Скорректированный молярный выход в результате этой реакции был равным 93,1%.

Продукт растворяли в 189 мл горячего метилэтилкетона, а образовывавшийся раствор перегоняли под атмосферным давлением до тех пор, пока не удаляли 95 мл кетонового растворителя. После начала кристаллизации продукта температуру понижали до 50°С. Перемешивание при 50°С продолжали в течение 1 ч. Затем температуру понижали до 20-25°С и перемешивание продолжали в течение еще 2 ч. Твердый продукт отфильтровывали и промывали 24 мл МЭК, а затем этот твердый продукт сушили до постоянной массы 9,98 г, где, по данным количественного ЖХВР анализа, на долю эпоксимексренона прихо

- 85 009176 дилось 93,63%. Этот продукт повторно растворяли в 106 мл горячего МЭК и горячий раствор фильтровали под давлением через 10-микрометрический типовой фильтр. Для промывки использовали дополнительные 18 мл МЭК и фильтрованный раствор в МЭК перегоняли под атмосферным давлением до удаления 53 мл растворителя. После начала кристаллизации продукта температуру понижали до 50°С и перемешивание при 50°С продолжали в течение 1 ч. Далее температуру понижали до 20-25°С и эту температуру поддерживали при одновременном перемешивании в течение еще 2 ч. Твердый продукт отфильтровывали и промывали 18 мл МЭК. Этот твердый продукт сушили до постоянной массы 8,32 г, где, по данным количественного ЖХВР анализа, на долю эпоксимексренона приходилось 99,6%. Заключительные потери при сушке составляли менее 1,0%. В целом выход эпоксимексренона в ходе проведения такой реакции и обработки в данном примере составлял 65,8%. Этот общий выход отражал выход продукта реакции 93%, рекуперацию при начальной кристаллизации 78,9% и рекуперацию при перекристаллизации 89,5%.

Пример 48. Эпоксидирование продукта формулы ИА с использованием толуола.

Енэфир формулы ИА превращали в эплеренон по способу, который в целом описан в примере 46, за исключением того, что в качестве растворителя использовали толуол. Вещества, загруженные в реактор, включали 2,7 г енэфира, 2,5 г трихлорацетамида, 1,7 г вторичного кислого фосфата калия, 17,0 г перекиси водорода и 50 мл толуола. Реакционной температуре позволяли повышаться вследствие экзотермии до 28°С и процесс завершали в течение 4 ч. Образовавшуюся трехфазную смесь охлаждали до 15°С, фильтровали, промывали водой и сушили в вакууме с получением 2,5 г продукта.

Пример 49. Эпоксидирование 9,11-диенона.

40,67 г соединения формулы КУПА (соединение формулы XVII, в которой -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-) растворяли в 250 мл метиленхлорида в 1-литровой 3-горлой колбе и охлаждали извне смесью соли со льдом. Добавляли 22,5 г вторичного кислого фосфата калия и 83,5 г трихлорацетонитрила и смесь охлаждали до 2°С, после чего медленно, в течение 1 ч вводили 200 г 30% перекиси водорода. Реакционную смесь перемешивали при 12°С в течение 8 ч и в течение 14 ч при комнатной температуре. Отбирали каплю органического слоя и проверяли на содержание исходного енона, количество которого, по данным анализа, составляло <0,5%. Добавляли 400 мл воды, перемешивали в течение 15 мин и разделяли на слои. Органический слой последовательно промывали 200 мл 10% йодида калия, 200 мл 10% тиосульфата натрия и 100 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия, каждый раз разделяя слои. Органический слой сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали с выходом 41 г сырого эпоксида. Продукт кристаллизовали из этилацетата/метиленхлорида с получением 14,9 г чистого материала.

Пример 50. Эпоксидирование соединения XVIIА с использованием м-хлорнадбензойной кислоты.

18,0 г соединения XVIIА растворяли в 250 мл метиленхлорида и охлаждали до 10°С. При перемешивании в течение 15 мин добавляли 21,86 г м-хлорнадбензойной кислоты (50-60% степени чистоты). Никакого роста температуры не отмечали. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч и проверяли на присутствие диенона. Реакционную смесь обрабатывали последовательно 10% раствором сульфита натрия, 0,5н. раствором гидроксида натрия, 5% раствором соляной кислоты и, наконец, 50 мл насыщенного солевого раствора. После сушки над безводным сульфатом магния и выпаривания получали 17,64 г эпоксида, который использовали непосредственно на следующей стадии. Этот продукт, как определяли, включал продукт окисления по Байеру-Вилладжеру, который удаляли растиранием в порошок в этилацетате с последующей перекристаллизацией из метиленхлорида. В масштабе 500 г выпадавшую в осадок м-хлорбензойную кислоту отфильтровывали с последующей обычной обработкой.

Пример 51. Эпоксидирование соединения XVIIА с использованием трихлорацетамида.

г соединения XVIIА растворяли в 25 мл метиленхлорида. Добавляли 2 г трихлорацетамида и 2 г вторичного кислого фосфата калия. С перемешиванием при комнатной температуре добавляли 10 мл 30% перекиси водорода и перемешивание продолжали в течение 18 ч с получением 1,63 г эпоксида. Продукт окисления по Байеру-Вилладжеру не образовывался.

Пример 52.

56,39 г (1005,03 ммоль, 3,00 экв.) загружали в 2000-миллилитровую колбу и при комнатной температуре суспендировали в 750,0 мл диметилсульфоксида. В колбу совместно с 956,0 мл ТГФ загружали 100,00 г (335,01 ммоль, 1,00 экв.) триенона, соответствующего формуле XX (в которой К³ обозначает Н, а -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-). В эту колбу загружали 126,14 г (670,02 ммоль, 2,00 экв.) триметилсульфонийметилсульфата и образовывавшуюся смесь кипятили с обратным холодильником (при 80-85°С) в течение 1 ч. За конверсией 17-спирооксиметилена следили посредством ЖХВР. В вакууме из реакционной смеси отгоняли приблизительно 1 л ТГФ, после чего в течение 30минутного периода вводили 460 мл воды, одновременно поддерживая пониженную температуру реакционной смеси (15°С). Образовывавшуюся смесь фильтровали и твердый оксирановый продукт дважды промывали 200-миллилитровыми порциями воды. Отмечали, что продукт был высоко кристаллическим, поэтому фильтрация проходила легко. После этого продукт сушили в вакууме при 40°С. Выделяли 104,6 г 3-метиленольного простого эфира Д-5,6,9,11,17-оксиранового стероидного продукта.

- 86 009176

Пример 53.

В сухой 500-миллилитровый реактор в токе азота загружали 41,94 г (616,25 ммоля, 1,90 экв.) метоксида натрия. В этот реактор загружали 270,9 мл этанола, в котором суспендировали метоксид натрия. В суспензию вводили 103,90 г (646,68 ммоля, 2,00 экв.) диэтилмалоната, после чего добавляли 104,60 г (324,34 ммоля, 1,00 экв.) оксиранового стероида, полученного согласно примеру 52, и образовывавшуюся смесь кипятили с обратным холодильником, т.е. выдерживали при 80-85°С. Кипячение продолжали в течение 4 ч, после чего посредством ЖХВР проверяли полноту реакции. В течение 30-минутного периода в реакционную смесь вводили 337,86 мл воды, одновременно поддерживая пониженную температуру реакционной смеси (15°С).

Перемешивание продолжали в течение 30 мин, а затем реакционную суспензию фильтровали, получая фильтровальный пирог, представляющий собой тонкодисперсный аморфный порошок. Этот фильтровальный пирог дважды промывали водой (по 200 мл каждый раз), после чего сушили в вакууме при комнатной температуре. Выделяли 133,8 г 3-метиленольного простого эфира Δ-5,6,9,11,17спиролактон-21-метоксикарбонильного промежуточного продукта.

Пример 54.

133,80 г (313,68 ммоль, 1,00 экв.) 3-метиленольного простого эфира Δ-5,6,9,11,17-спиролактон-21метоксикарбонильного промежуточного продукта (формулы XVIII, в которой К³ обозначает Н, а -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН₂-СН₂-), полученного согласно примеру 53, при перемешивании загружали в 2000-миллилитровый реактор совместно с 27,50 г (470,52 ммоль, 1,50 экв.) хлорида натрия, 709 мл диметилформамида и 5 мл воды. Образовывавшуюся смесь кипятили с обратным холодильником (при 138-142°С) в течение 3 ч, после чего реакционную смесь анализировали посредством ЖХВР на полноту реакции. После этого в течение 30 мин в смесь добавляли воду, одновременно поддерживая пониженную температуру смеси (15°С). Перемешивание продолжали в течение 30 мин, после чего реакционную суспензию фильтровали, выделяя аморфный твердый реакционный продукт в виде фильтровального пирога. Этот фильтровальный пирог дважды промывали 200-миллилитровыми порциями воды, после чего сушили. Выделенный 3-метиленолэфир-17-спиролактон сушили с получением 91,6 г (выход 82,3%; степень чистоты по площади 96% по данным количественного анализа).

Пример 55.

В 2000-миллилитровый реактор загружали 91,60 г (258,36 ммоль, 1,00 экв.) енольного простого эфира, полученного в соответствии с примером 54, 250 мл этанола, 250 мл уксусной кислоты и 250 мл воды и образовавшуюся суспензию кипятили с обратным холодильником в течение 2 ч. В течение 30 мин добавляли 600 мл воды, одновременно поддерживая пониженную температуру реакционной смеси (15°С). После этого реакционную суспензию фильтровали и фильтровальный пирог дважды промывали 200-миллилитровыми порциями воды. Далее фильтровальный пирог сушили. В качестве продукта выделяли 84,4 г 3-кето^-4,5,9,11,17-спиролактона (соединения формулы XVII, в которой К³ обозначает Н, а -А-А- и -В-В-, каждый, обозначает группу -СН2-СН2-; выход 95,9%).

Пример 56.

кг (2,81 моля) соединения XУIIА совместно с 3,2 л тетрахлорида углерода загружали в 22литровую 4-горлую колбу. В смесь добавляли 538 г Ν-бромсукцинимида, а затем 3,2 л ацетонитрила. Образовавшуюся смесь кипятили с обратным холодильником, поддерживая температуру кипения (68°С) в течение приблизительно 3 ч, в результате чего получали прозрачный оранжевый раствор. По прошествии 5 ч выдержки при повышенной температуре раствор приобретал темный цвет. По истечении 6 ч источник тепла удаляли и из реакционной смеси отбирали пробу. Растворитель отпаривали в вакууме и к остатку в нижней части сосуда добавляли 6 л этилацетата. Образовавшуюся смесь перемешивали, после чего добавляли 4 л 5% раствора бикарбоната натрия и смесь перемешивали в течение 15 мин, а затем фазам давали разделиться. Водный слой удаляли и 4 л насыщенного солевого раствора вводили в смесь, которую после этого перемешивали в течение 15 мин. Фазы вновь разделяли и органический слой подвергали отпариванию в вакууме с получением густого шлама. Далее добавляли 4 л диметилформамида и отпарку продолжали до температуры в сосуде 55°С. Кубовые остатки оставляли стоять в течение ночи и добавляли 330 г ДАДЦО и 243 г бромида лития. Затем смесь нагревали до 70°С. По прошествии 1,5 ч выдержки при этой повышенной температуре отбирали пробу для жидкостной хроматографии, а по истечении 3,5 ч выдержки при повышенной температуре дополнительно добавляли 40 г ДАДЦО. По прошествии 4,5 ч выдержки при повышенной температуре вводили 4 л воды и образовавшуюся смесь охлаждали до 15°С. Суспензию фильтровали и фильтровальный пирог промывали 3 л воды и сушили на фильтре в течение ночи. 978 г мокрого фильтровального пирога загружали назад в 22-литровую колбу и добавляли 7 л диметилформамида. Полученную таким образом смесь нагревали до 105°С, после чего фильтровальный пирог полностью переходил в раствор. Источник тепла удаляли, а смесь в колбе перемешивали и охлаждали. В рубашку реактора направляли смесь воды со льдом, смесь внутри реактора охлаждали до 14°С и выдерживали при этой температуре в течение 2 ч. Образовывавшуюся суспензию фильтровали и дважды промывали 2,5-литровыми порциями воды. Фильтровальный пирог сушили в вакууме в течение ночи. Таким путем получили 510 г светло-коричневого твердого продукта.

- 87 009176

Пример 57.

В 2-литровую 4-горлую колбу загружали 100,00 г (282,1 ммоль, 1,00 экв.) 9,11-эпоксиканренона, полученного согласно примеру 56, 650,0 мл диметилформамида, 30,00 г (707,7 ммоль, 2,51 экв.) хлорида лития и 72,04 г (77,3 мл, 846,4 ммоль, 3,00 экв.) ацетонциангидрина. Образовавшуюся суспензию механически перемешивали и обрабатывали 45,49 г (49,6 мл, 395,0 ммоль, 1,4 экв.) тетраметилгуанидина. Затем эту систему фильтровали с использованием холодильника с водяным охлаждением и холодильника с охлаждением сухим льдом (заполненного сухим льдом в ацетоне) с целью предотвратить выделение ИСК Вентиляционную трубку, отходящую от холодильника с охлаждением сухим льдом, присоединяли к газоочистителю, заполненному большим избытком хлорного химического отбеливателя. Смесь нагревали до 80°С.

По прошествии 18 ч получали темный красновато-коричневый раствор, который с перемешиванием охлаждали до комнатной температуры. Во время процесса охлаждения для удаления остаточного ΠΕΝ через раствор барботировали ток азота, причем вентиляционная трубка проходила в массу химического отбеливателя в газоочистителе. По прошествии 2 ч раствор обрабатывали 72 г уксусной кислоты и перемешивали в течение 30 мин. Далее сырую смесь с перемешиванием выливали в 2 л смеси воды со льдом. После этого перемешиваемую суспензию обрабатывали 400 мл 10% водного раствора НС1 и перемешивали в течение 1 ч. Затем смесь фильтровали с получением 73 г темного кирпичнокрасного твердого вещества. Фильтрат помещали в 4-литровую делительную воронку и экстрагировали 3 порциями по 800 мл метиленхлорида, органические слои объединяли и подвергали обратной экстракции 2 порциями по 2 л воды. Метиленхлоридный раствор в вакууме концентрировали с получением в виде темно-красного масла 61 г остатка.

После того как водные промывные фракции отавляли стоять в течение ночи, образовывалось значительное количество осадка. Этот осадок собирали фильтрованием; анализ показывал, что было получено 14,8 г чистого енаминового продукта.

После сушки 73 г исходного красного твердого вещества его анализировали ЖХВР, результаты которой показывали, что его большая часть приходилась на долю 9,11-эпоксиенамина. Далее ЖХВР анализ показывал, что енамин являлся основным компонентом красного продукта в виде масла, полученного путем обработки метиленхлоридом. Расчетный молярный выход енамина была равным 46%.

Пример 58.

В 1000-миллилитровую круглодонную колбу вводили 4,600 г (0,011261 моль, 1,00 экв.) 9,11эпоксиенамина, полученного в соответствии с примером 57. В смесь добавляли 300 мл метанола и 192 мл 0,5 мас.% раствора НС1, после чего ее кипятили с обратным холодильником в течение 17 ч. После этого в вакууме удаляли метанол с уменьшением количества материала в перегонном сосуде до 50 мл, что вызывало образование белого осадка. В суспензию вводили 100 мл воды, после чего ее фильтровали с получением белого твердого фильтровального пирога, который трижды промывали водой. Выход твердого 9,11эпоксидикетонового продукта составлял 3,747 (81,3%).

Пример 59.

200 мг (0,49 ммоль) эпоксидикетона, полученного в соответствии с примером 58, суспендировали в 3 мл метанола и в эту смесь добавляли 1,8-диазадицикло[5.4.0]ундец-7-ена (ДДУ). При кипячении с обратным холодильником в течение 24 ч смесь становилась гомогенной. Далее при 30°С ее концентрировали досуха в роторном испарителе и остаток делили между метиленхлоридом и 3н. НС1. В результате концентрирования органической фазы получали 193 мг желтого твердого вещества, которое, как определяли, на 22 мас.% представляло собой эпоксимексренон. Выход продукта составлял 20%.

Пример 60.

К 100 мг дикетона, суспендированного в 1,5 мл метанола, добавляли 10 мкл (0,18 экв.) 25 мас.% раствора метоксида натрия в метаноле. Раствор кипятили с обратным холодильником. По прошествии 30 мин дикетона не оставалось, содержался 5-цианоэфир. В эту смесь добавляли 46 мкл 25 мас.% раствора метоксида натрия в метаноле. Смесь кипятили с обратным холодильником в течение 23 ч, после чего основным продуктом оказывался, как определяли по данным ЖХВР, эплеренон.

- 88 009176

Пример 61.

К 2 г дикетона, суспендированного в 30 мл сухого метанола, добавляли 0,34 мл триэтиламина. Суспензию кипятили с обратным холодильником в течение 4,5 ч. Смесь перемешивали при 25° С в течение 16 ч. Образовывавшуюся суспензию фильтровали с получением в виде белого твердого продукта 1,3 г 5цианоэфира.

К 6,6 г дикетона, суспендированного в 80 мл метанола, добавляли 2,8 мл триэтиламина. Смесь кипятили с обратным холодильником в течение 4 ч и перемешивали при 25°С в течение 88 ч, причем за это время из раствора кристаллизовался продукт. Фильтрованием с последующей промывкой метанолом в виде белого порошка получали 5,8 г цианоэфира. Этот материал перекристаллизовывали из хлороформа/метанола с получением 3,1 г кристаллического продукта, который, по данным ЖХВР, характеризовался однородностью.

Принимая во внимание вышеизложенное, очевидно достижение нескольких целей изобретения и достижение других преимуществ.

Поскольку в описанные выше композиции и способы можно вносить различные изменения, не выходя при этом за объем изобретения, следует отметить, что вышеприведенное описание и прилагаемые чертежи лишь иллюстрируют изобретение, не ограничивая его объем.

Claims (102)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения соединения формулы в которой -Α-Α- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

   К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С7алкил, С1-С7алкоксигрушгу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу,

   К¹ обозначает α-ориентированный С₁-С₇алкоксикарбонильный или гидроксикарбонильный радикал,

   -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С₁-С₇алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и

   К⁸ и К⁹ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, гидрокси, галоген, С₁-С₇алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонилалкил, алкоксикарбонилалкил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, или

   К⁸ и К⁹ вместе образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, или

   К⁸ и К⁹ вместе с К⁶ или К⁷ образуют карбоциклическое или гетероциклическое кольцо, конденсированное с пятичленным кольцом Ό, заключающийся во взаимодействии соединения формулы

   - 89 009176 в которой -А-А-, К¹, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные выше, с пероксидным соединением в присутствии активатора пероксида, причем указанный пероксидный активатор соответствует формуле

   О и ¹¹ κ°-ονή₂ , где К⁰ обозначает заместитель со способностью оттягивать электроны по силе не ниже, чем у монохлорметила, а само соединение формулы II получают удалением уходящей 11а-группы, такой как мезилокси, из соединения формулы где -А-А-, К¹, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют указанные выше значения, а К² обозначает уходящую группу, такую как мезилокси, отщепление которой обеспечивает образование двойной связи между 9- и 11-м углеродными атомами, указанное соединение формулы ГУ получают взаимодействием С₁-С₇алкилсульфонилирующего или ацилирующего реагента или генерирующего галогенид агента, такого как сульфурилхлорид, с соединением формулы где -А-А-, К¹, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют указанные выше значения, которое в свою очередь получают из соединения VI взаимодействием с алкоксидом щелочного металла формулы К¹⁰ОМ, где М обозначает щелочной металл, а К¹⁰ОМ - соответствует алкоксизаместителю при К¹, и это соединение соответствует структурной формуле где -А-А-, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные выше, получение которого осуществляют гидролизом соединения формулы

   - 90 009176 где -А-А-, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные выше, которое в свою очередь получают реакцией соединения формулы

   УШ;

   где -А-А-, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные выше, с источником цианидных ионов в присутствии соли щелочного металла, а само соединение формулы УШ где -А-А-, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные выше, ферментацией в присутствии микроорганизма, например, выбранного из рода АкрегдШик осНгасеик КККЬ 405 (АТСС 18500), Акрег_§111ик шдег АТСС 11394, АкрегдШик тби1апк АТСС 11267, КЫ/орик огу/ае АТСС 11145, КЫ/орик к!о1отГег АТСС 6227Ь, Т^^сΗоΐΗес^ит гокеиш АТСС 12519 и АТСС 8685, обеспечивающего эффективное введение в субстрат 11-гидроксигруппы с α-ориентацией; при этом имеется в виду, что там, где специально не указано, алкильная часть заместителя может содержать число углеродных атомов от 1 до 6.
2. 2. Способ получения соединений формулы II по п.1 в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

   К³, К⁴, К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С7алкил, С1-С7алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, ари локсигруппу,

   К¹ обозначает «-ориентированный С₁-С₇алкоксикарбонильный или гидроксикарбонильный радикал,

   -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу

   I I —сн—сн_г — сн- _11Т где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген,

   С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и

   К⁸ и К⁹ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, гидрокси, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонилалкил, алкоксикарбонилал кил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, или

   К⁸ и К⁹ вместе образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, или

   - 91 009176

   В⁸ и В⁹ вместе с В⁶ или В⁷ образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, конденсированную с пятичленным кольцом Ώ, заключающийся в удалении 11 α-уходящей группы, такой как мезилокси, из соединения формулы в которой -А-А-, В¹, В³, -В-В-, В⁸ и В⁹ имеют вышеуказанные значения, а В² обозначает вышеуказанную уходящую группу, при том, что, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода.
3. 3. Способ по п.2, в котором соединение формулы II соответствует формуле

   Υ²

   1_ ссн₂э—С—X

   НА в которой -А-А- обозначает группу -СН2-СН2- или -СН=СН-,

   -В-В- обозначает группу -СН₂-СН₂- либо α- или β-ориентированную группу

   ША

   В¹ обозначает α-ориентированный С1-С₇алкоксикарбонильный радикал,

   X обозначает два водородных атома или оксогруппу,

   Υ¹ и Υ² совместно обозначают кислородный мостик -О- или

   Υ¹ обозначает гидроксил и

   Υ² обозначает гидроксил, С_гС₇алкоксигруппу или, если X обозначает Н₂, необязательно С1-С₇алканоилоксигруппу, а также солей соединений, в которых X обозначает оксогруппу, а Υ² обозначает гидроксил, включающий контактирование раствора, содержащего С1-С₆алифатическую кислоту и соль С1-С₆алифатической ки- в которой -А-А-, В¹, -В-В-, X, Υ¹ и Υ² имеют значения, указанные для формулы НА, а В² обозначает С1-С₇алкилсульфонилокси- или ацилоксигруппу.
4. 4. Способ по п.2, в котором соединение формулы IV представляет собой γ-лактон неполного метилового эфира 17а-гидрокси-11а-(метилсульфонил)окси-3-оксопрегн-4-ен-7а,21-дикарбоновой кислоты, а соединение формулы II представляет собой γ-лактон неполного метилового эфира 17а-гидрокси-3оксопрегна-4,9(11)диен-7а,21-дикарбоновой кислоты.
5. 5. Способ получения соединения формулы IV по п.1 в которой -А-А- обозначает группу -СНВ⁴-СНВ⁵- или -СВ⁴=СВ⁵-,

   В³, В⁴ и В⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С₇алкил, С_гС₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу,

   В¹ обозначает α-ориентированный С1-С₇алкоксикарбонильный или гидроксикарбонильный радикал,

   -В-В- обозначает группу -СНВ⁶-СНВ⁷- либо α- или β-ориентированную группу

   - 92 009176 ^в\ сн

   I .

   —сн—сн_г—сн— я⁷ сн I

   III где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С₇алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и

   К⁸ и К⁹ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонилалкил, алкоксикарбонилалкил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, или

   К⁸ и К⁹ совместно образуют карбоциклическую или гетероциклическую кольцевую структуру, или К⁸ либо К⁹ совместно с К⁶ или с К⁷ образуют карбоциклическую или гетероциклическую кольцевую структуру, сконденсированную с пентациклическим Ό-кольцом, а

   К² обозначает С1-С₇алкилсульфонилоксигруппу, ацилоксигруппу или галогенид, включающий взаимодействие С1-С₇алкилсульфонилирующего или ацилирующего реагента или образующего галогенид агента, такого, как тионил-галогенид, сульфурилгалогенид или оксалилгалогенид, с соединением формулы где -Α-Α-, К¹, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные выше.
6. 6. Способ по п.5, в котором соединение формулы IV соответствует формуле

   ΙΥΑ в которой -Α-Α- обозначает группу -СН₂-СН₂- или -СН=СН-,

   К¹ обозначает а-ориентированный С1-С7алкоксикарбонильный радикал, К² обозначает С1-С7алкилсульфонилоксигруппу или ацилоксигруппу, -В-В- обозначает группу -СН₂-СН₂- либо а- или β-ориентированную группу

   I I —сн—сн_г—сн

   ΙΙΙΑ

   X обозначает два водородных атома или оксогруппу,

   Υ¹ и Υ² совместно обозначают кислородный мостик -0- или

   Υ¹ обозначает гидроксил и

   Υ² обозначает гидроксил, С1-С₇алкоксигруппу или, если X обозначает Н₂, необязательно С1-С₇алканоилоксигруппу, а также солей соединений, у которых X обозначает оксогруппу, а Υ² обозначает гидроксил, включающий взаимодействие С1-С₆алкилсульфонила или ацилгалогенида в присутствии акцептора галогенида водорода с соединением формулы в которой -Α-Α-, К¹, -В-В-, X, Υ¹ и Υ² имеют значения, указанные для формулы ΤΫΑ.
7. 7. Способ по п.5, в котором соединение формулы IV представляет собой γ-лактон неполного метилового эфира 17а-гидрокси-11а-(метилсульфонил)окси-3-оксопрегн-4-ен-7а,21-дикарбоновой кислоты, а соединение формулы V представляет собой γ-лактон неполного метилового эфира 11а,17адигидрокси-3-оксопрегн-4-ен-7а,21-дикарбоновой кислоты.
8. 8. Способ получения соединения формулы V по п.1

   - 93 009176 в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

   К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С₁-С₇алкил, С₁-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу,

   К¹ обозначает α-ориентированный С₁-С₇алкоксикарбонильный или гидроксикарбонильный ради кал,

   -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу

   I I —сн—сн_г — сн- _ΙΙΖ где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген,

   С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонилалкил, алкоксикарбонилал кил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и

   К⁸ и К⁹ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонилалкил, алкоксикарбонилал кил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, или

   К⁸ и К⁹ совместно образуют карбоциклическую или гетероциклическую кольцевую структуру, или

   К⁸ либо К⁹ совместно с К⁶ или с К⁷ образуют карбоциклическую или гетероциклическую кольцевую структуру, сконденсированную с пятичленным Ό-кольцом, включающий взаимодействие соединения формулы У с алкоксидом щелочного металла формулы К¹⁰ОМ, где М обозначает щелочной металл, а К¹⁰О соответствует алкоксизаместителю при К¹, и это соединение формулы У соответствует структурной формуле где -А-А-, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные выше.

   УА в которой -А-А- обозначает группу -СН2-СН2- или -СН=СН-,

   К¹ обозначает α-ориентированный С₁-С₇алкоксикарбонильный радикал, -В-В- обозначает группу -СН₂-СН₂- либо α- или β-ориентированную группу

   I 1 —СН-СН-,—сн- _111А

   X обозначает два водородных атома или оксогруппу,

   Υ¹ и Υ² совместно обозначают кислородный мостик -О- или

   Υ¹ обозначает гидроксил и

   Υ² обозначает гидроксил, С₁-С₇алкоксигруппу или, если X обозначает Н₂, необязательно С1-С7алканоилоксигруппу, а также солей соединений, у которых X обозначает оксогруппу, а Υ² обозначает гидроксил, включающий взаимодействие соединения формулы У!А с алкоксидом щелочного металла, соответствующего формуле К¹⁰ОМ, в среде спирта формулы К¹⁰ОМ, где М обозначает щелочной металл, а К¹⁰ОМ соответствует алкоксизаместителю при К¹, и это соединение формулы УА соответствует структурной формуле

   - 94 009176 где -А-А-, -В-В-, Υ¹, Υ² и X имеют значения, указанные для формулы УЛ.
9. 10. Способ по п.8, в котором соединение формулы V представляет собой γ-лактон неполного метилового эфира 11 а,17а-дигидрокси-3-оксопрегн-4-ен-7а,21-дикарбоновой кислоты, а соединение формулы VI представляет собой 4'8(4'а),7'а-гексадекагидро-11'а-гидрокси-10'в,13'в-диметил-3',5,20'триоксоспиро{фуран-2(3Н),17'в[4,7]метано[17Н]циклопента[а]фенантрен}-5'в(2'Н)-карбонитрил.
10. 11. Способ по п.8, в котором цианидный ион образуется как побочный продукт реакции и который далее включает удаление цианидного иона из реакционной зоны во время реакции с целью снизить степень любого взаимодействия цианидного иона с продуктом формулы V.
11. 12. Способ по п.11, в котором цианидный ион удаляют из реакционной среды осаждением с помощью осадителя.
12. 13. Способ по п.12, в котором реакцию проводят в среде растворителя, а осадитель представляет собой соль, включающую катион, который образует цианидное соединение более низкой растворимости в такой среде, чем растворимость в ней осадителя.
13. 14. Способ по п.13, в котором катион выбирают из группы, включающей ионы щелочно-земельных металлов и ионы переходных металлов.
14. 15. Способ получения соединения формулы VI по п.1 в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С₇алкил, С_гС₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу

    I I —сн—сн_г—сн- _Т11 где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген,

    С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонилалкил, алкоксикарбонилал кил, ацилоксиалкил цианогруппу, арилоксигруппу, и

    К⁸ и К⁹ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, или

    К⁸ и К⁹ совместно образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, или

    К⁸ либо К⁹ совместно с К⁶ или с К⁷ образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, конденсированную с пентациклическим Э-кольцом, включающий гидролиз соединения формулы VII в которой -А-А-, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные выше.

    - 95 009176
15. 16. Способ по п.15, в котором соединение формулы VI соответствует формуле в которой -А-А- обозначает группу -СН₂-СН₂- или -СН=СН-,

    -В-В- обозначает группу -СН₂-СН₂- либо α- или β-ориентированную группу —сн— сн_г—сн—

    ΙΙΙΑ

    X обозначает два водородных атома или оксогруппу,

    Υ¹ и Υ² совместно обозначают кислородный мостик -О- или

    Υ¹ обозначает гидроксил и

    Υ² обозначает гидроксил, (С1-С₇)алкоксигруппу или, если X обозначает Н₂, необязательно С 1-С₇алканоилоксигруппу, а также солей соединений, у которых X обозначает оксогруппу, а Υ² обозначает гидроксил, включающий гидролиз соединения формулы VIIА в присутствии кислоты и в среде органического растворителя и/или

    УНА в которой -А-А-, -В-В-, Υ¹, Υ² и X имеют значения, указанные для формулы VIА.
16. 17. Способ по п.15, в котором соединение формулы VI представляет собой 4'8(4'α),7'αгексадекагидро-11'а-гидрокси-10'в,13'в-диметил-3',5,20'-триоксоспиро{фуран-2(3Н),17'в-[4,7]метано[17Н]циклопента[а]фенантрен}-5'в(2'Н)-карбонитрил, а соединение формулы VII представляет собой 5'В(5'а),7'в,20'-аминогексадекагидро-11'в-гидрокси-10'а,13'а-диметил-3',5-диоксоспиро{фуран-2(3Н),17'а(5'Н)-[7,4]метено[4Н]циклопента[а]фенантрен}-5'-карбонитрил.
17. 18. Способ получения соединения формулы VII по п.1 в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СВ⁴=СВ⁵-,

    В³, В⁴ и В⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С₇алкил, С1-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу,

    -В-В- обозначает группу -СНВ⁶-СНВ⁷- либо α- или β-ориентированную группу ^к\ У сн-------сн

    --СН —СН_г—СН— где В⁶ и В⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, С1-С7алкоксиалкил, гидроксикарбонил, С1-С6алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и

    В⁸ и В⁹ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген,

    - 96 009176

    С₁-С₇алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонилалкил, алкоксикарбонилалкил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, или

    К⁸ и К⁹ совместно образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, или

    К⁸ либо К⁹ совместно с К⁶ или с К⁷ образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, конденсированную с пентациклическим Ό-кольцом, притом, что, где специально не указано, алкильная часть заместителя может содержать число атомов углерода от 1 до 6, включающий взаимодействие соединения формулы VIII с источником цианидных ионов в присутствии соли щелочного металла, причем это соединение формулы VIII соответствует структурной формуле

    VIII где -А-А-, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные выше.
18. 19. Способ по п.18, в котором соединение формулы VII соответствует формуле

    ΙΙΙΑ в которой -А-А- обозначает группу -СН₂-СН₂- или -СН=СН-, -В-В- обозначает группу -СН₂-СН₂- либо α- или β-ориентированную группу —сн—сн₂—-сн—

    X обозначает два водородных атома или оксогруппу,

    Υ¹ и Υ² совместно обозначают кислородный мостик -О- или Υ¹ обозначает гидроксил и Υ² обозначает гидроксил, С₁-С₇алкоксигруппу или, если X обозначает Н₂, необязательно С₁-С₇алканоилоксигруппу, а также солей соединений, у которых X обозначает оксогруппу, а Υ² обозначает гидроксил, включающий взаимодействие источника цианидных ионов, такого, как кетонциангидрин, в присутствии Ь1С1 и в присутствии основания с 11а-гидроксисоединением формулы где -А-А-, -В-В-, Υ¹, Υ² и X имеют значения, указанные для формулы VIIА.
19. 20. Способ по п.18, в котором соединение формулы VII представляет собой 5'К(5'а),7'в,20'аминогексадекагидро-11'в-гидрокси-10'а,13'а-диметил-3',5-диоксоспиро {фуран-2(3Н),17'а(5'Н)[7,4]метено[4Н]циклопента[а]фенантрен}-5'-карбонитрил, а соединение формулы VIII представляет собой γ-лактон 11а,17а-дигидрокси-3-оксопрегн-4,6-диен-21-карбоновой кислоты.
20. 21. Способ по п.18, в котором источник цианидных ионов представляет собой цианид щелочного металла, а взаимодействие между соединением формулы VIII с цианидным ионом проводят в присутствии кислоты и воды.
21. 22. Способ получения соединения формулы VIII по п.1

    VIII в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидро

    - 97 009176 ксил, С₁-С₇алкил, С₁-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу, -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу ^Β*Ί—г^в'

    --СН —СН₂— СН— где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и

    К⁸ и К⁹ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонилалкил, алкоксикарбонилал кил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, или

    К⁸ и К⁹ совместно образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, или

    К⁸ либо К⁹ совместно с К⁶ или с К⁷ образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, конденсированную с пентациклическим Ό-кольцом, при том, что, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода, включающий окисление субстратного соединения формулы XIII ферментацией в присутствии микроорганизма, например, выбранного из рода АзрегдШиз осйгасеиз ЖКЕ 405 (АТСС 18500), АзрегдШиз шдег АТСС 11394, АзрегдШиз шби1апз АТСС 11267, 1<1п/ориз огу/ае АТСС 11145, 1<1п/ориз з!о1ош1ег АТСС 6227Ь, ТпсйоШесшш гозеит АТСС 12519 и АТСС 8685, обеспечивающего эффективное введение в это субстратное соединение 11-гидроксигруппы, с α-ориентацией, причем это субстратное соединение соответствует формуле в которой -А-А-, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные выше.
22. 23. Способ по п.22, в котором соединение формулы XIII представляет собой γ-лактон 11α,17αдигидрокси-3-оксопрегн-4,6-диен-21-карбоновой кислоты.

    XXXI в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С₁-С₇алкил, С₁-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу,

    К¹ обозначает α-ориентированный С₁-С₇алкоксикарбонильный или гидроксикарбонильный радикал,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу ^в\

    СН-------СН

    I I —сн—сн₂ — сн- _ΙΙΣ где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, включающий взаимодействие соединения формулы XIV с алкоксидом щелочного металла формулы К¹⁰ОМ, где М обозначает щелочной металл, а К¹⁰О соответствует алкоксизаместителю при К¹, причем это соединение соответствует структурной формуле

    - 98 009176 в которой -А-А-, К³ и -В-В- имеют значения, указанные выше, при этом получение самого соединения ΧΙΥ осуществляют путем гидролиза соединения формулы в которой -А-А-, К³ и -В-В- имеют значения, указанные выше, а само соединение ΧΥ получают взаимодействием соединения формулы где -А-А-, К³ и -В-В- имеют вышеуказанные значения, с источником цианидных ионов в присутствии соли щелочного металла, при этом соединение ΧΥΙ получают из триенона формулы где -А-А- и К³ имеют значения, указанные для νΙΙΙ,

    -В-В- имеет значения, указанные для νΙΙΙ, за исключением того, что ни К⁶, ни К⁷ не составляют части кольца, сконденсированного с Ό-кольцом в положениях 16, 17, а К⁶ обозначает С1-С₇алкил, путем последовательных стадий, включающих взаимодействие указанного соединения формулы ΧΧ с сульфонийилидом (с получением эпоксидного промежуточного продукта), взаимодействием указанного промежуточного эпоксида с КаСН(СООЕ1)₂ в присутствии основания в растворителе, с последующей последовательной обработкой полученного в результате продукта нагреванием, водой и галогенидом щелочного металла с получением декарбоксилированного промежуточного соединения дальнейшей дегидрогенизацией указанного декарбоксилированного промежуточного продукта в промежуточный продукт формулы ΧνΙ.
23. 25. Способ по п.24 в котором соединение формулы ΧΙν представляет собой 4'8(4'а),7'а1',2',3',4,4',5,5',6',7',8',10',12',13',14',15',16'-гексадекагидро-10в,13'в-диметил-3',5,20'-триоксоспиро{фуран2(3Н),17'в-[4,7]метано[17Н] циклопента[а]фенантрен}-5'-карбонитрил.
24. 26. Способ получения соединения формулы ΧΙν по п.24

    - 99 009176

    К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С₁-С₇алкил, С₁-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу

    I I СН —СН_г—СН— Щ где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, включающий гидролиз соединения формулы в которой -Α-Α-, К³ и -В-В- имеют значения, указанные выше.
25. 27. Способ по п.26, в котором соединение формулы XIV представляет собой 4'8(4'α),7'α1',2',3',4,4',5,5',6',7',8',10',12',13',14',15',16'-гексадекагидро-10β,13'β-диметил-3',5,20'-триоксоспиро{фуран2(3Н),17'β-[4,7]метано[17Н]циклопента[а]фенантрен}-5'-карбонитрил, а соединение формулы формулы XV представляет собой 5'К(5'α),7'β,20'-амино-1,2',3',4,5,6',7',8',10',12',13',14',15',16'-тетрадекагидро10'α,13'α-диметил-3',5'-диоксоспиро{фуран-2(3Н),17'α(5Ή)-[7,4]метено[4Н]циклопента[а]фенантрен}-5'карбонитрил.
26. 28. Способ получения соединения формулы XV по п.24 в которой -Α-Α- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С₁-С₇алкил, С₁-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу, -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу ^в\ /

    СН-------СН | I

    --СН— сн_г— СН- III где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген,

    - 100 009176

    С₁-С₇алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, включающий взаимодействие соединения формулы XVΐ с источником цианидных ионов в присутствии соли щелочного металла, причем это соединение формулы XVΐ соответствует структурной формуле

    XVI в которой -А-А-, В³ и -В-В- имеют значения, указанные выше.
27. 29. Способ по п.28, в котором соединение формулы XV представляет собой 5'В(5'а),7'в,20'-амино1',2',3',4,5,6',7',8',10',12',13',14',15',16'-тетрадекагидро-10'а,13'а-диметил-3',5-диоксоспиро{фуран2(3Н),17'а(5'Н)-[7,4]метено[4Н]циклопента[а]фенантрен}-5'-карбонитрил.
28. 30. Способ получения соединения, соответствующего формуле

    XXXII в которой -А-А- обозначает группу -СНВ⁴-СНВ⁵- или -СВ⁴=СВ⁵-,

    В³, В⁴ и В⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С₁-С₇алкил, С₁-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу,

    В¹ обозначает а-ориентированный С₁-С₇алкоксикарбонильный или гидроксикарбонильный радикал,

    -В-В- обозначает группу -СНВ⁶-СНВ⁷- либо а- или β-ориентированную группу ^в\ У?

    сн-------сн

    I I

    -СН —СН_г—СН— где В⁶ и В⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и где, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов С, включающий взаимодействие соединения формулы XXI с алкоксидом щелочного металла формулы В¹⁰ОМ, где М обозначает щелочной металл, а В¹⁰О соответствует алкоксизаместителю при В¹, причем это соединение формулы XXI соответствует структурной формуле в которой -А-А-, В³ и -В-В- имеют значения, указанные выше, с получением его из соединения формулы

    - 101 009176 в которой -А-А-, К³ и -В-В- имеют вышеуказанные значения, гидролизом последнего, которое в свою очередь получают взаимодействием соединения формулы н* χχιιι в которой -А-А-, К³, К⁴, К⁵ и -В-В- имеют вышеуказанные значения, а

    К⁸ и К⁹ вместе образуют лактоновое кольцо, идентичное лактоновому кольцу соединения формулы XXII, с источником цианидных ионов в присутствии соли щелочного металла, а само соединение XXIII получают из его 6,7-дигидропредшественника XXIV путем отщепления от последнего двух атомов водорода из положений 6 и 7 где -А-А-, -В-В- имеют вышеуказанные значения, который в свою очередь получен из исходного соединения XX, по способу, описанному в п.24.
29. 31. Способ получения соединения формулы XXXII по п.30

    XXXII в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С7алкил, С1-С7алкоксигруппу, гидроксиалкил, С1-С6алкоксиС1-С6алкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу,

    К¹ обозначает α-ориентированный С₁-С₇алкоксикарбонильный или гидроксикарбонильный радикал,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу ^В\ ζ^Β

    СН-------сн

    I I —сн—сн_г—сн— _11;1 где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, заключающийся во взаимодействии соединения формулы XXI с алкоксидом щелочного металла формулы К¹⁰ОМ, где М обозначает щелочной металл, а К¹⁰О соответствует алкоксизаместителю при К¹, причем это соединение формулы XXI соответствует структурной формуле

    - 102 009176 где -А-А-, К³, К⁴, К⁵ и -В-В- имеют вышеуказанные значения, и где, если специально не указано, алкильная часть заместителя имеет число атомов углерода от 1 до 6.
30. 32. Способ по п.30, в котором соединение формулы XXI представляет собой 4'8(4'α),7'α-9',11'αэпоксигексадекагидро-10в,13'в-диметил-3',5,20'-триоксоспиро{фуран-2(3Н),17'в-[4,7]метано[17Н]циклопента[а] фенантрен }-5'-карбонитрил.
31. 33. Способ получения соединения формулы XXI по п.30

    XXI в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С7алкил, С1-С7алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу ^В\ ζ^Β сн-------сн

    I I

    -СН —СН_г—СН — ЦТ где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и местителя имеет число атомов углерода от 1 до 6, заключающийся в том, что соединение формулы где, если специально не указано, алкильная часть за- в которой -А-А-, К³ и -В-В- имеют значения, указанные выше, подвергают гидролизу.
32. 34. Способ по п.33, в котором соединение формулы XXI представляет собой 4'8(4'α),7'α-9',11'α- эпоксигексадекагидро-10в,13'в-диметил-3',5,20'-триоксоспиро{фуран2(3Н),17'в[4,7]метано[17Н]циклопента[а]фенантрен}-5'-карбонитрил, а соединение формулы XXII представляет собой 5'К(5'а),7'в,20'-амино-9,11в-эпоксигексадекагидро-10',13'-диметил-3',5-диоксоспиро{фуран-2(3Н),17'а(5'Н)-[7,4]метен[4Н]циклопента[а]фенантрен}-5'-карбонитрил.
33. 35. Способ получения соединения формулы XXII по п.30

    - 103 009176 в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С₇алкил, С1-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу ^В\ ζ^Β

    СН-------сн

    I I —сн—сн_г—снIII где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и где, если специально не указано, алкильная часть заместителя имеет число атомов углерода от 1 до 6, включающий взаимодействие соединения формулы XXIII с источником цианидных ионов в присутствии соли щелочного металла, причем это соединение формулы XXIII соответствует структурной формуле

    XXIII в которой -А-А- и -В-В- имеют значения, указанные выше, α

    К³, К⁸, К⁹ имеют значения, указанные в п.30.
34. 36. Способ по п.35, в котором соединение формулы XXII представляет собой 5'К(5'а),7'в,20'-амино9,11в-эпоксигексадекагидро-10',13'-диметил-3',5-диоксоспиро{фуран-2(3Н),17'а(5'Н)-[7,4]метено[4Н]циклопента[а]фенантрен}-5'-карбонитрил, а соединение формулы XXIII представляет собой γ-лактон 9,11 а-эпокси-17а-гидрокси-3-оксопрегна-4,6-диен-21-карбоновой кислоты.
35. 37. Способ получения соединения формулы XXIII по п.30 в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С₇алкил, С1-С₇алкоксигруппу, гидроксиС1-С₆алкил, С1-С₆алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу <и χ✓ снсн

    II •--СН —СН_г--СН— где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С₁-С₇алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу,

    К⁸ и К⁹ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С₇алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонилалкил, алкоксикарбонилалкил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, или

    К⁸ и К⁹ совместно образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, или

    К⁸ либо К⁹ совместно с К⁶ или с К⁷ образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру,

    - 104 009176 конденсированную с пентациклическим ϋ-кольцом, и где алкильная часть заместителя имеет число атомов углерода от 1 до 6, в которой К³, -А-А- и -В-В- имеют значения, указанные выше.
36. 38. Способ получения соединения формулы

    XXIV в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С7алкил, С1-С7алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо а- или β-ориентированную группу и⁷

    X ζ

    СН------сн

    I I •--СН —СН₂--СН— -[-£.£ где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонилалкил, алкоксикарбонилалкил, ацилоксиалкил цианогруппу, арилоксигруппу, полученного по способу, описанному в п.26, и где алкильная часть заместителя имеет значения от 1 до 6, в которой К^х обозначает гидроксизащитную группу, -А-А-, К³, -В-В- имеют значения, указанные выше, при этом соединение формулы ΧΧν получают из соединения формулы в которой -А-А-, -К³ и -В-В- имеют вышеуказанные значения, взаимодействием соединения формулы ΧΧνΙ с источником цианидных ионов в присутствии соли щелочного металла, а само соединение формулы ΧΧνΙ получают путем отщепления атомов водорода из

    - 105 009176

    6,7-положений соединения формулы в которой -А-А-, К³ и -В-В- имеют вышеуказанные значения.
37. 39. Способ получения соединения формулы Х!У по п.38 в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С₇алкил, С1-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу н⁷

    X ζ

    СН-------сн

    I I —сн —сн_г—сн— где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и где алкильная часть заместителя имеет число атомов углерода от 1 до 6, включающий гидролиз соединения формулы в которой К^х обозначает гидроксизащитную группу,

    -А-А-, К³, -В-В- имеют значения, указанные выше.
38. 40. Способ по п.39, в котором соединение формулы ХРУ представляет собой 4'8(4'α),7'α-

    1',2',3',4,4',5,5',6',7',8',10',12',13',14',15',16'-гексадекагидро-10β,13'β-диметил-3',5,20'-триоксоспиро{фуран2(3Н),17'β-[4,7]метано[17Н]циклопента[а]фенантрен}-5'-карбонитрил, а соединение формулы ХХУ представляет собой 5'К(5'α),7'β,20'-аминогексадекагидро-9'β-гидрокси-10'α,13'-диметил-3',5-диоксоспиро{фуран-2(3Н),17'а(5'Н)-[7,4]метено[4Н]циклопента[а]фенантрен}-5'-карбонитрил.
39. 41. Способ получения соединения формулы ХХУ по п.38

    - 106 009176 в которой -А-А- обозначает группу -СНВ⁴-СНВ⁵- или -СВ⁴=СВ⁵-,

    В³, В⁴ и В⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С7алкил, С1-С7алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу,

    -В-В- обозначает группу -СНВ⁶-СНВ⁷- либо α- или β-ориентированную группу ^й\ ζ”⁷

    СН-------сн

    I I —сн —сн_г—сн — где В⁶ и В⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и где, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода, в которой В^х обозначает гидроксизащитную группу, включающий взаимодействие соединения формулы XXVI с источником цианидных ионов в присутствии соли щелочного металла, причем это соединение формулы XXVI соответствует структурной формуле

    XXVI в которой -А-А-, В³ и -В-В- имеют значения, указанные выше.
40. 42. Способ по п.41, в котором соединение формулы XXV представляет собой 5^(5^),7^,20^ аминогексадекагидро-9'β-гидрокси-10'α,13'α-диметил-3',5-диоксоспиро{фуран-2(3Н),17'α(5Ή)-[7,4]метено[4Н]циклопента[а]фенантрен}-5'-карбонитрил, а соединение формулы XXVI представляет собой γ-лактон 9α,17α-дигидрокси-3-оксопрегн-4,6-диен-21-карбоновой кислоты.
41. 43. Способ получения соединения формулы XXVI по п.38

    XXVI в которой -А-А- обозначает группу -СНВ⁴-СНВ⁵- или -СВ⁴=СВ⁵-,

    В³, В⁴ и В⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С7алкил, С1-С7алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу,

    -В-В- обозначает группу -СНВ⁶-СНВ⁷- либо α- или β-ориентированную группу X__/ ι ι

    ---сн---сн₂---сн---где В⁶ и В⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и где, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода, и в которой В^х обозначает гидроксизащитную группу, включающий отщепление атомов водорода из положений 6 и 7 соединения формулы XXVII

    - 107 009176 в которой -А-А-, К³ и -В-В- имеют значения, указанные выше.
42. 44. Способ по п.43, в котором упомянутое соединение формулы XXVI представляет собой γ-лактон 9а,17а-дигидрокси-3-оксопрегн-4,6-диен-21-карбоновой кислоты, а соединение формулы XXVII представляет собой γ-лактон 9а,17а-дигидрокси-3-оксопрегн-4-ен-21-карбоновой кислоты.
43. 45. Способ получения соединения формулы в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-, К³ выбирают из группы, включающей водород,

    С₁-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу, -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу %__А

    ---сн---сн₂---сн---где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С₁-С₇алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, галоген, гидроксил, С1-С7алкил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и где, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода,

    К⁸ и К⁹ совместно образуют лактоновое кольцо, соответствующее таковому в исходном соединении 104, в которой -А-А-, К³ и -В-В- имеют значения, указанные выше,

    К¹¹ обозначает С₁-С₄алкил, в свою очередь соединение 104 получают термическим разложением соединения формулы 103 в присутствии галогенида щелочного металла, причем это соединение формулы 103 соответствует структурной формуле в которой -А-А-, К³, К¹¹ и -В-В- имеют значения, указанные выше,

    К¹² обозначает С₁-С₄алкил, а соединение 103 получают способом, включающим конденсацию соединения формулы 102 с диалкилмалонатом в присутствии основания, причем это соединение формулы 102 соответствует структурной формуле

    - 108 009176 в которой -А-А-, К³, К¹¹ и -В-В- имеют значения, указанные выше, и его получают взаимодействием соединения формулы 101 с сульфонийилидом в присутствии основания, причем это соединение формулы 101 соответствует структурной формуле

    101 в которой -А-А-, К³, К¹¹ и -В-В- имеют значения, указанные выше, а само соединение 101 получают способом, включающим взаимодействие соединения формулы ΧΧΧνΙβ. с этерифицирующим реагентом в присутствии кислотного катализатора, причем это соединение формулы ΧΧΧν^ соответствует структурной формуле в которой -А-А-, К³ и -В-В- имеют значения, указанные выше.
44. 46.Способ получения соединения формулы νΙΙΙ по п.45 в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³ выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С7алкил, С₁-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу, -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо а- или β-ориентированную группу Ч__Ζ

    ι. . ι

    ---сн---сн₂---сн---где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С₁-С₇алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и где, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода,

    К⁸ и К⁹ совместно образуют лактоновое кольцо, соответствующее таковому в исходном соединении 104, включающий окисление соединения формулы, которая соответствует формуле 104

    104 в которой -А-А-, К³ и -В-В- имеют значения, указанные выше,

    К¹¹ обозначает С₁-С₄алкил.
45. 47. Способ по п.45 или 46, в котором осуществляют контактирование соединения формулы 104 с окислителем.

    - 109 009176
46. 48. Способ по п.47, в котором окислителем служит бензохиноновое производное.
47. 49. Способ по п.48, в котором окислитель выбирают из группы, включающей 2,3-дихлор-5,6дициан-1,4-бензохинон и тетрахлорбензохинон.
48. 50. Способ по п.46, в котором осуществляют контактирование соединения формулы VIII с галоидирующим агентом с получением галоидированного промежуточного продукта, после чего осуществляют контактирование этого галоидированного промежуточного продукта с дегидрогалоидирующим агентом для дегидрогалоидирования этого галоидированного промежуточного продукта и получения соединения формулы 104.
49. 51. Способ получения соединения формулы 104 по п.45 в которой -Α-Α- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-, К³ выбирают из группы, включающей водород,

    С1-С7алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу, К¹¹ обозначает С₁-С₄алкил,

    -В-В- обозначает группу -СНК-СНК⁷- либо а- или β-ориентированную группу п⁷ >—( --СН —СН_г-СН— где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, галоген, гидроксил, С1-С7алкил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и где, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода, включающий термическое разложение соединения формулы 103, в присутствии галогенида щелочного в которой -Α-Α-, К³, К¹¹ и -В-В- имеют значения, указанные выше, К¹² обозначает С₁-С₄алкил.
50. 52. Способ получения соединения формулы 103 по п.45 в которой -Α-Α- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴, К⁵ выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С7алкил, С1-С7алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу, К¹¹ обозначает С1-С₄алкил,

    К¹² обозначает С₁-С₄алкил, -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо а- или β-ориентированную группу —сн—сн_г—сн—

    - 110 009176 где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С₁-С₇алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и где, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода, включающий конденсацию соединения формулы 102 с диалкилмалонатом в присутствии основания, причем это соединение формулы 102 соответствует структурной формуле

    102 в которой -Α-Α-, К³, К¹¹ и -В-В- имеют значения, указанные выше.
51. 53. Способ получения соединения формулы 102 по п.45

    102 в которой -Α-Α- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-, К³, К⁴, К⁵ выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С₁-С₇алкил,

    С1-С7алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу, К¹¹ обозначает С₁-С₄алкил,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу

    ---сн-—сн₂·---сн---где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С₁-С₇алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и, где, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода, включающий взаимодействие соединения формулы 101 с сульфонийилидом в присутствии основания, причем это соединение формулы 101 соответствует структурной формуле в которой -Α-Α-, К³, К¹¹ и -В-В- имеют значения, указанные выше.
52. 54. Способ получения соединения формулы 101 по п.45

    101

    101 в которой -Α-Α- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-, К³, К⁴, К⁵ выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С₁-С₇алкил,

    С1-С7алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу, К¹¹ обозначает С₁-С₄алкил,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу

    ---сн---сн₂---сн---где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С₁-С₇алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил,

    - 111 009176 ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и где, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода, включающий взаимодействие соединения формулы XXXVI с этерифицирующим реагентом в присутствии кислотного катализатора, причем это соединение формулы XXXVI соответствует структурной фор муле в которой -А-А-, К³ и -В-В- имеют значения, указанные выше.
53. 55. Способ по п.54, в котором соединение формулы 101 получают взаимодействием соединения формулы XXXVI с триалкилортоформиатом в подкисленном спиртовом растворителе.
54. 56. Способ получения соединения формулы в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴ и К⁵ выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С₁-С₇алкил, С1-С7алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу, -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу

    --сн—сн₂--сн--где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С₁-С₇алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и где, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода, включающий окисление субстратного соединения формулы XXXVII ферментацией в присутствии микроорганизма, например, выбранного из рода АзрегдШиз осйгасеиз ЫККЬ 405 (АТСС 18500), АзрегдШиз пщег АТСС 11394, АзрегдШиз шди1апз АТСС 11267, КЫ/ориз огу/ае АТСС 11145, КЫ/ориз з!о1ош£ег АТСС 6227Ь, ТНсйоФесшт гозеит АТСС 12519 и АТСС 8685, обеспечивающего эффективное превращение этого субстратного соединения в соединение формулы

    XXXVI в которой -А-А-, -В-В- и К³ имеют значения, указанные выше, такое субстратное соединение формулы XXXVII соответствует формуле где -А-А-, К¹, К³ и -В-В- имеют значения, указанные выше,

    Ό-Ό обозначает группу -СН₂-СН₂- или -СН=СН-,

    К¹³, К¹⁴, К¹⁵ и К¹⁶ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей С₁-С₄алкил, в которое и осуществляют введение 11а-гидроксильной группы посредством вышеуказанной биоконвер сии.
55. 57. Способ получения соединения формулы

    - 112 009176 в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С₁-С₇алкил, С₁-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу,

    К¹ обозначает α-ориентированный С₁-С₇алкоксикарбонильный или гидроксикарбонильный радикал, -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу ^к\ у^т сн-------сн

    I I —сн—сн_г—сн— XXI где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген,

    С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и где, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода,

    К⁸ и К⁹ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С₁-С₇алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонилалкил, алкоксикарбонилал кил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, или

    К⁸ и К⁹ совместно образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, или

    К⁸ либо К⁹ совместно с К⁶ или с К⁷ образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, конденсированную с пентациклическим Ό-кольцом, и где, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода, включающий получение соединения формулы п^э

    К⁹ ν в которой -А-А-, К¹, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные выше, взаимодействием соединения формулы У с алкоксидом щелочного металла формулы К¹⁰ОМ, в которой М обозначает щелочной металл, а К¹⁰О соответствует алкоксизаместителю при К¹, причем это соединение формулы У соответствует структурной формуле в которой -А-А-, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные выше, без выделения соединения формулы У в очищенной форме, взаимодействие этого соединения формулы У с низшим алкилсульфонилирующим или ацилирующим реагентом или с галоидгенерирующим агентом с получением соединения формулы в которой -А-А-, К¹, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные выше,

    К² обозначает алкилсульфонилоксигруппу, уходящую ацилоксигруппу или галогенид, без выделения соединения формулы РУ в очищенной форме, удаление из него уходящей Πα-группы за

    - 113 009176 счет взаимодействия с реагентом для ее удаления с получением этого соединения формулы II.
56. 58. Способ по п.1, в котором, минуя выделение соединения формулы II в очищенном виде, проводят взаимодействие этого соединения формулы II с эпоксидирующим реагентом с получением соединения формулы в которой -А-А-, К¹, К³, -В-В-, К⁸ и К⁹ имеют значения, указанные в п.57.
57. 59. Способ по п.58, в котором соединение формулы II получают взаимодействием соединения формулы IV с реагентом, удаляющим уходящую группу, включающим алифатическую кислоту, в присутствии алкоксида щелочного металла, из реакционного раствора упаривают летучие компоненты, водорастворимые компоненты реакционного раствора удаляют промывкой водным промывным раствором, в результате чего получают остаточный раствор соединения формулы II, приемлемый для превращения этого соединения формулы II в соединение формулы I, и с остаточным раствором соединения формулы II совмещают перекисный окислитель с целью обеспечить превращение этого соединения формулы II в соединение формулы I.
58. 60. Способ по п.57, в котором соединение формулы V получают взаимодействием соединения формулы VI с алкоксидом щелочного металла в органическом растворителе с получением реакционного раствора с соединением формулы V; соединение формулы V экстрагируют из раствора, представляющего собой реакционный раствор с соединением формулы V, с использованием органического растворителя, в результате чего получают раствор с экстрактом соединения формулы V и в этот раствор с целью получения соединения формулы VI вводят С₁-С₇алкилсульфонилгалогенид, или ацилгалогенид, или галоидгенерирующий агент.
59. 61. Способ по п.57, в котором соединение формулы IV получают взаимодействием соединения формулы V с реагентом, удаляющим уходящую группу, в органическом растворителе с получением реакционного раствора с соединением формулы IV; раствор, представляющий собой реакционный раствор с соединением формулы IV, пропускают через колонки с кислой, а затем с основными ионообменными смолами с целью удалить из него основные и кислотные примеси, в результате чего получают элюат соединения формулы IV и реагент для удаления уходящей алкилсульфонилокси- или ацилоксигруппы совмещают с раствором, представляющим собой элюат соединения формулы IV, с целью получения соединение формулы II.
60. 62. Способ получения эпоксисоединения, включающий контактирование субстратного соединения, содержащего олефиновую двойную связь, с перекисным соединением в присутствии перекисного активатора, причем этот перекисный активатор соответствует формуле о _в Ч н · с- нн₂ где К⁰ обозначает заместитель, способность которого - оттягивать электроны не ниже, чем у монохлорметила.
61. 63. Способ по п.62, где перекисный активатор соответствует формуле х¹ в которой значения X¹, X² и X³ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей галоген, водород, алкил, галоалкил, цианогруппу и цианоалкил, значения К^р выбирают из группы, включающей арилен и группу (СX⁴X⁵)_η-, п обозначает 0 или 1, причем по меньшей мере один из X¹, X², X³, X⁴ и X⁵ обозначает галоген или перфторалкил.
62. 64. Способ по п.62, в котором п обозначает 0 и по меньшей мере два из X¹, X² и X³ обозначают атомы галогена или пергалоалкил.
63. 65. Способ по п.62, в котором все X¹, X², X³, X⁴ и X⁵ обозначают атомы галогена или пергалоалкил.
64. 66. Способ по п.62, в котором перекисный активатор представляет собой тригалоацетамид.
65. 67. Способ по п.66, в котором перекисный активатор представляет собой трихлорацетамид.
66. 68. Способ по п.62, в котором субстратное соединение соответствует формуле

    - 114 009176

    IV в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴, К⁵ выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С₁-С₇алкил,

    С₁-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу, арилоксигруппу,

    К¹ обозначает α-ориентированный С1-С7алкоксикарбонильный или гидроксикарбонильный радикал, К² означает С1-С₇алкилсульфонилокси, ацилокси или галоидный остаток,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу

    III где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, и

    К⁸ и К⁹ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонилалкил, алкоксикарбонилалкил, ацилоксиалкил, цианогруппу, арилоксигруппу, или

    К⁸ и К⁹ совместно образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, или

    К⁸ либо К⁹ совместно с К⁶ или с К⁷ образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, конденсированную с пентациклическим Ό-кольцом, при том, что, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода.
67. 69. Способ по п.62, в котором субстратное соединение выбирают из группы, включающей соединения формул а продукт реакции эпоксидирования выбирают из группы, включающей соединения формул

    - 115 009176
68. 70. Соединение формулы в которой -А-А- обозначает группу -СНВ⁴-СНВ⁵- или -СВ⁴=СВ⁵-,

    В³, В⁴ и В⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С₇алкил, С1-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу и арилоксигруппу,

    В¹ обозначает а-ориентированный С1-С₇алкоксикарбонильный или гидроксикарбонильный радикал,

    -В-В- обозначает группу -СНВ⁶-СНВ⁷- либо а- или β-ориентированную группу

    А X

    СН-------сн

    I I

    --СН —СН₂-СН— ΤΤΎ где В⁶ и В⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, и

    В⁸ и В⁹ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, гидроксил, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонилалкил, алкоксикарбонилалкил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, или

    В⁸ и В⁹ совместно образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, или

    В⁸ либо В⁹ совместно с В⁶ или с В⁷ образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, конденсированную с пентациклическим Э-кольцом,

    В² обозначает С_гС₇алкилсульфонилокси-, ацилокси или галоостаток, при том, что, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода.
69. 71. Соединение формулы ΐν по п.70, соответствующее формуле

    1УА в которой -А-А- обозначает группу -СН₂-СН₂- или -СН=СН-,

    В¹ обозначает а-ориентированный С1-С7алкоксикарбонилъный радикал, В² обозначает С1-С7алкилсульфонилоксигруппу или ацилоксигруппу,

    - 116 009176

    -В-В- обозначает группу -СН₂-СН₂- либо α- или β-ориентированную группу

    X обозначает два водородных атома или оксогруппу, Υ¹ и Υ² совместно обозначают кислородный мостик -О- или, Υ¹ обозначает гидроксил и Υ² обозначает гидроксил, С₁-С₇алкоксигруппу или, если X обозначает Н₂, необязательно С₁-С₇алканоилоксигруппу, а также соли соединений, у которых X обозначает оксогруппу, а Υ² обозначает гидроксил.
70. 72. Соединение формулы IV по п.70, представляющее собой γ-лактон неполного метилового эфира

    17 а-гидрокси-11 а-(метилсульфонил)окси-3 -оксопрегн-4-ен-7 α,21 -дикарбоновой кислоты.

    в которой -А-А- обозначает группу -СНВ⁴-СНВ⁵- или -СВ⁴=СВ⁵-,

    В³, В⁴ и В⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С₁-С₇алкил, С₁-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу и арилоксигруппу,

    В¹ обозначает α-ориентированный С₁-С₇алкоксикарбонильный или гидроксикарбонильный ради кал,

    -В-В- обозначает группу -СНВ⁶-СНВ⁷- либо α- или β-ориентированную группу \ ζ сн-------сн

    I I

    -сн —сн₂—сн—

    III где В⁶ и В⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, и

    В⁸ и В⁹ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, гидроксил, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонилалкил, алкоксикарбонилалкил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, или

    В⁸ и В⁹ совместно образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, или

    В⁸ либо В⁹ совместно с В⁶ или с В⁷ образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, конденсированную с пентациклическим Ό-кольцом, при том, что, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода.
71. 74. Соединение формулы V по п.73, соответствующее формуле в которой -А-А- обозначает группу -СН2-СН2- или -СН=СН-, В¹ обозначает α-ориентированный С₁-С₇алкоксикарбонильный радикал,

    -В-В- обозначает группу -СН₂-СН₂- либо α- или β-ориентированную группу —с_Н__сн_г—сн— ΙΙΙΆ

    X обозначает два водородных атома или оксогруппу, Υ¹ и Υ² совместно обозначают кислородный мостик -О- или Υ¹ обозначает гидроксил и

    Υ² обозначает гидроксил, С₁-С₇алкоксигруппу или, если X обозначает

    Н₂, необязательно С₁-С₇алканоилоксигруппу, а также соли соединений, у которых X обозначает оксогруппу, а Υ² обозначает гидроксил.
72. 75. Соединение формулы V по п.73, представляющее собой γ-лактон неполного метилового эфира

    - 117 009176

    11а,17а-дигидрокси-3-оксопрегн-4-ен-7а,21-дикарбоновой кислоты.
73. 76. Соединение формулы в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С₇алкил, С1-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу и арилоксигруппу, -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу н*н

    Xζ

    СНСН

    II

    --СН —СН₂-СН—£££ где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, и

    К⁸ и К⁹ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, гидроксил, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонилалкил, алкоксикарбонилалкил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, или К⁸ и К⁹ совместно образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, или К⁸ либо К⁹ совместно с К⁶ или с К⁷ образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, конденсированную с пентациклическим Ό-кольцом, при том, что, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода.

    в которой -А-А- обозначает группу -СН2-СН2- или -СН=СН-, -В-В- обозначает группу -СН2-СН2- либо α- или β-ориентированную группу — С-И — СН£— С-Н —

    X обозначает два водородных атома или оксогруппу,

    Υ¹ и Υ² совместно обозначают кислородный мостик -О- или

    Υ¹ обозначает гидроксил и

    Υ² обозначает гидроксил, С1-С₇алкоксигруппу или, если X обозначает Н₂, необязательно С1-С₇алканоилоксигруппу, а также соли соединений, у которых X обозначает оксогруппу, а Υ² обозначает гидроксил.
74. 78. Соединение формулы VI по п.76, представляющее собой 4'8(4'а),7'а-гексадекагидро-11'агидрокси-10'в,13'в-диметил-3',5,20'-триоксоспиро{фуран-2(3Н),17'в-[4,7]метано[17Н]циклопента[а]фенантрен}-5'в(2'Н)-карбонитрил.

    - 118 009176
75. 79. Соединение формулы в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С₁-С₇алкил, С₁-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу и арилоксигруппу,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо а- или β-ориентированную группу я \н

    XΖ

    СН-он

    II —сн —сн₂—сн— где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген,

    С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, и

    К⁸ и К⁹ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С₁-С₇алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонилалкил, алкоксикарбонилалкил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, или К⁸ и К⁹ совместно образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, или К⁸ либо К⁹ совместно с К⁶ или с К⁷ образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, конденсированную с пентациклическим Ώ-кольцом, при том, что, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода.
76. 80. Соединение формулы ΥΙΙ по п.79, соответствующее формуле в которой -А-А- обозначает группу -СН₂-СН₂- или -СН=СН-, -В-В- обозначает группу -СН₂-СН₂- либо а- или β-ориентированную группу

    I I —сн— сн_г—сн—

    ΙΙΙΑ

    Χ обозначает два водородных атома или оксогруппу,

    Υ¹ и Υ² совместно обозначают кислородный мостик -О- или Υ¹ обозначает гидроксил и

    Υ² обозначает гидроксил, С₁-С₇алкоксигруппу или, если Χ обозначает Н₂, необязательно С₁-С₇алканоилоксигруппу, а также соли соединений, у которых Χ обозначает оксогруппу, а Υ² обознача ет гидроксил.
77. 81. Соединение формулы νΙΙ по п.79, представляющее собой 5'К(5'α),7'β,20'-аминогексадекагидро11'β-гидрокси-10'α,13'α-диметил-3',5-диоксоспиро{фуран-2(3Н),17'α(5Ή)-[7,4]метено[4Н]циклопента[а]фенантрен}-5'-карбонитрил.

    - 119 009176 в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С₁-С₇алкил, С₁-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу и арилоксигруппу,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу

    СН-------сн

    I ί

    --СН —СН₂-СН— ттт где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, и

    К⁸ и К⁹ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонилалкил, алкоксикарбонилал кил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, или

    К⁸ и К⁹ совместно образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, или

    К⁸ либо К⁹ совместно с К⁶ или с К⁷ образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, конденсированную с пентациклическим Ό-кольцом, при том, что, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода.
78. 83. Соединение формулы VIII по п.82, соответствующее формуле в которой -А-А- обозначает группу -СН2-СН2- или -СН=СН-,

    -В-В- обозначает группу -СН2-СН2- либо α- или β-ориентированную группу —сн— сн₂—сн—

    ΙΙΙΑ

    X обозначает два водородных атома или оксогруппу,

    Υ¹ и Υ² совместно обозначают кислородный мостик -О- или

    Υ¹ обозначает гидроксил и

    Υ² обозначает гидроксил, С₁-С₇алкоксигруппу или, если X обозначает Н₂, необязательно С₁-С₇алканоилоксигруппу, а также соли соединений, у которых X обозначает оксогруппу, а Υ² обозначает гидроксил.
79. 84. Соединение формулы VIII по п.82, представляющее собой γ-лактон 11α,17α-дигидрокси-3оксопрегна-4,6-диен-21-карбоновой кислоты.
80. 85. Соединение формулы в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С₁-С₇алкил, С₁-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу и арилоксигруппу, и

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу

    А у

    СН-------сн

    I I

    --СН —СН₂-СН— γγϊ где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил,

    - 120 009176 ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу.
81. 86. Соединение формулы ХШ по п.25, представляющее собой 4'8(4'α),7'α-

    1',2',3',4,4',5,5',6',7',8',10',12',13'14',15',16'-гексадекагидро-10β,13'β-диметил-3',5,20'-триоксоспиро{фуран2(3Н) 17' β-[4,7]метано [17Н] циклопента[а] фенантрен }-5'-карбонитрил.
82. 87. Соединение формулы в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С₇алкил, С1-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу и арилоксигруппу,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу

    А А

    СН-------сн

    I I —сн — сн₂—сн—

    III где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, при том, что, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода.
83. 88. Соединение формулы ХУ по п.87, представляющее собой γ-лактон неполного метилового эфира 9α,17α-дигидрокси-3-оксопрегн-4-ен-7α,21-дикарбоновой кислоты.
84. 89. Соединение формулы в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С₇алкил, С1-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу и арилоксигруппу,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶ -СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу

    А А сн-------сн

    I I —сн — сн₂—сн—

    III где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С₇алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу.
85. 90. Соединение формулы XXI по п.85, представляющее собой 4'8(4'α),7'α-9',11'α- эпоксигексадекагидро-10 β ,13' β-диметил-3',5,20'-триоксоспиро { фуран-2(3Н),17' β[4,7]метано[17Н]циклопента[а]фенантрен}-5'-карбонитрил.
86. 91. Соединение формулы

    - 121 009176 в которой -А-А- обозначает группу -СНВ⁴-СНВ⁵- или -СВ⁴=СВ⁵-,

    В⁴ и В⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С₁-С₇алкил, С₁-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу и ари локсигруппу,

    -В-В- обозначает группу -СНВ⁶-СНВ⁷- либо α- или β-ориентированную группу н⁷ сн-------сн

    I I —-сн—сн₂— сн— где В⁶ и В⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, при том, что, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода.
87. 92. Соединение формулы XXII по п.91, представляющее собой 5'В(5'α),7'β,20'-амино-9,11β эпоксигексадекагидро-10',13'-диметил-3',5-диоксоспиро{фуран-2(3Н),17'α(5Ή)-[7,4]метен[4Н]цикло пента[а]фенантрен}-5'-карбонитрил.

    XXIII в которой -А-А- обозначает группу -СНВ⁴-СНВ⁵- или -СВ⁴=СВ⁵-,

    В⁴ и В⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С₁-С₇алкил, С₁-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу и ари локсигруппу,

    -В-В- обозначает группу -СНВ⁶-СНВ⁷- либо α- или β-ориентированную группу н⁷

    Ί-----( — сн—сн₂— сн — где В⁶ и В⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, при том, что, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода.
88. 94. Соединение формулы XXIII по п.93, где В⁸ и В⁹ совместно с углеродным атомом, с которым они связаны, образуют структуру

    Iγ ^γ\ /I

    С( ί 7) (ши ( СН₂) ₂ · О-Х / XXXXIV в которой X обозначает два водородных атома или оксогруппу,

    Υ¹ и Υ² совместно обозначают кислородный мостик -О- или

    Υ¹ обозначает гидроксил и

    Υ² обозначает гидроксил, С₁-С₇алкоксигруппу или если X обозначает Н₂, необязательно С₁-С₇алканоилоксигруппу, а также соли соединений, в которых X обозначает оксогруппу, а Υ² обозначает гидроксил.
89. 95. Соединение формулы

    - 122 009176 в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С₇алкил, С1-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу и ари локсигруппу,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу

    III где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу,

    К⁸ и К⁹ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, или

    К⁸ и К⁹ совместно образуют карбоциклическую или гетероциклическую кольцевую структуру и

    К^х выбирают из группы, включающей водород и гидроксизащитную группу.
90. 96. Соединение формулы XXV по п.95, которое представляет собой 5^(5^),7^,20^ аминогексадекагидро-9'β-гидрокси-10'α,13'α-диметил-3',5-диоксоспиро{фуран-2(3Н),17'α(5Ή)-[7,4]метено[4Н]циклопента[а]фенантрен}-5'-карбонитрил.
91. 97. Соединение формулы в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С₇алкил, С1-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу и ари локсигруппу,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу в⁷

    Г — сн —сн_г — сн — где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, и

    К^х выбирают из группы, включающей водород и гидроксизащитную группу, при том что, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода.
92. 98. Соединение формулы XXVI по п.97, представляющее собой γ-лактон 9α,17α-дигидрокси-3оксопрегна-4,6-диен-21-дикарбоновой кислоты.
93. 99. Соединение формулы

    - 123 009176 в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С₇алкил, С1-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу и арилоксигруппу,

    К¹¹ обозначает С₁-С₄алкил,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу н⁷ >—( — сн—сн₂— сн — где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, при том, что, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода.
94. 100. Соединение формулы 104 по п.99, представляющее собой γ-лактон 3-этокси-11а,17адигидроксипрегна-3,5-диен-21-карбоновой кислоты.
95. 101. Соединение формулы в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С₇алкил, С1-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу и арилоксигруппу,

    К¹¹ обозначает С₁-С₄алкил,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу н⁷

    Ί—Ύ сн сн₂ сн _ΣΙΙ где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, при том, что, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода.
96. 102. Соединение формулы 103 по п.101, представляющее собой γ-лактон 3-этокси-11а,17адигидроксипрегна-3,5-диен-21,21-дикарбоновой кислоты.
97. 103. Соединение формулы в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С1-С₇алкил, С1-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу и арилоксигруппу,

    К¹¹ обозначает С₁-С₄алкил,

    - 124 009176

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу в’ в⁷ — св —сн₂— сн— где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, при том, что, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода.
98. 104. Соединение формулы 102 по п.103, представляющее собой 3-этоксиспиро[андрост-3,5-диен17 β,2'-оксиран]-11 α-ол.
99. 105. Соединение формулы в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

    К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С₁-С₇алкил, С₁-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу и арилоксигруппу,

    К¹¹ обозначает С₁-С₄алкил,

    -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу в* в⁷ — сн —сн, — сн — — - ν п ·— ν п 2 — ν- п — X X где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С₁-С₇алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, при том, что, если специально не указано, алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода.
100. 106. Соединение формулы 102 по п.105, представляющее собой 3-этокси-11а-гидроксиандрост-3,5диен-17-он.
101. 107. Соединение формулы в которой -А-А- обозначает группу -СНК⁴-СНК⁵- или -СК⁴=СК⁵-,

     К³, К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С₁-С₇алкил, С₁-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу и арилоксигруппу,

     -В-В- обозначает группу -СНК⁶-СНК⁷- либо α- или β-ориентированную группу в’ в⁷ — св —сн₂— сн— где К⁶ и К⁷ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, алкил, алкоксикарбонил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, и

     К⁸ и К⁹ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, С1-С7алкоксигруппу, ацил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонилалкил, алкоксикарбонилал кил, ацилоксиалкил, цианогруппу и арилоксигруппу, или

     К⁸ и К⁹ совместно образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, или

     К⁸ либо К⁹ совместно с К⁶ или с К⁷ образуют карбоциклическую или гетероциклическую структуру, конденсированную с пентациклическим Ό-кольцом, при том, что, если специально не указано,алкильная часть заместителя содержит от 1 до 6 атомов углерода.
102. 108. Соединение формулы IX по п.107, соответствующее формуле

     - 125 009176 в которой -Α-Α- обозначает группу -СН₂-СН₂- или -СН=СН-,

     К⁴ и К⁵ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей водород, галоген, гидроксил, С₁-С₇алкил, С₁-С₇алкоксигруппу, гидроксиалкил, алкоксиалкил, гидроксикарбонил, цианогруппу и арилоксигруппу,

     К¹ обозначает а-ориентированный С₁-С₇алкоксикарбонильный радикал,

     -В-В- обозначает группу -СН₂-СН₂- либо а- или β-ориентированную группу —сн—сн_г—сн— IIIА

     X обозначает два водородных атома или оксогруппу,

     Υ¹ и Υ² совместно обозначают кислородный мостик -0- или

     Υ¹ обозначает гидроксил и

     Υ² обозначает гидроксил, С₁-С₇алкоксигруппу или если X обозначает Н₂, необязательно С₁-С₇алканоилоксигруппу, а также соли соединений, у которых X обозначает оксогруппу, а Υ² обозначает гидроксил.