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Verfahren zur Herstellung von D(-) 3-EIydroxybutansäure
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durch oxidative Fermentation mit Mikroorganismen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D(-)-3-Hydroxybutansäure
durch oxidative Fermentation mit Mikroorganismen, bei welchem Mutanten von Poly-3-hydroxybutansäure
bildenden Mikroorganismen-Gattungen in einem wäßrigen Medium als Substrat, das Ammonium-,
Magnesium-, Calcium-, Eisen-, Phosphat-, Sulfat- und übliche Spurenelement-Ionen
enthält, sowie entweder eine oder mehrere organische, O-enthaltende Verbindungen
mit C-C-Einfachbindungen und einer Anzahl von C-Atomen zwischen 3 und 6 sowie mit
mindestens 2 bis höchstens 6 funktionellen O-haltigen Gruppen oder von einem Kohlendioxid-Wasserstoff-Sauerstoff-Gasgemisch
durchströmt wird, bei Temperaturen bis 45 0C und bei pH-Werten vom schwach sauren
bis schwach alkalischen Bereich gezüchtet werden und die hierbei gebildete D(-)-3-Hydroxybutansäure
aus der Kulturflüssigkeit isoliert wird. D(-)-3-Hydroxybutansäure ist für biochemische,
präparativ organisch-chemische, physiologische, pharmazeutische und medizinische
Zwecke verwendbar.
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Es ist bekannt, daß D(-) -3-Hydroxybutansäure aus dem Harn von Diabetikern
isoliert werden kann /-P.A. Shaffer und W.M. Marriott, J. biol. Chem. 16(1913/1.4),
Seiten 265-2807. Daneben wurde versucht, D(-)-3-Hydroxybutansäure nach Depolymerisierung
(Hydrolyse) von Poly-3-hydroxybutansäure aus dem entstehenden Racemat mit Hilfe
von Chinin / P.A. Levene und H.L. Haller, J. biol. Chem. 65 (1922), Seiten 49-53
/ oder Hydrazin / J.H. Ottaway, Biochem. J. 84 (1962), Seiten 11-12 / zu gewinnen.
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Zur Herstellung von D(-)-3-Hydroxybutansäure in signifikanten Mengen
aus dem Harn von Diabetikern sind große Mengen an Harn erforderlich. Solcher Harn
ist jedoch nicht ständig verfügbar. Die Herstellung über die Chinin- oder Hydrazinderivate
führt zu nur sehr geringen Ausbeuten und ist wegen des hohen Verbrauchs an Reagenzien
zudem noch unrentabel.
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Vor kurzem wurde ein Verfahren zur Herstellung von D(-)-3-Hydroxybuttersäure
(3-HBS) bekannt / DE-OS 27 33 202'7, bei welchem Mikroorganismen in einem wäßrigen
Medium, das als Kohlenstoffquelle C02, ein assimilierbares Kohlehydrat aus der Gruppe
Glucose, Fructose, Saccharose, Lactose, Melasse und Molke, einen assimilierbaren
Alkohol aus der Gruppe Methanol, Äthanol und Glycerin oder die Ablauge der Caprolactamsynthese
nebst einer assimilierbaren Stickstoffquelle und Spurenelementen enthält, bei einer
Temperatur von ca.
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25 0C bis 400C und einem pg-ert von ca. 4 bis 8 gezüchtet werden.
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Als Mikroorganismen wurden geringe Mengen 3-HBS ausscheidende Mutanten,
die nicht in der Lage sind, diese geringen Mengen 3-HBS abzubauen, von z.B. folgenden
Species verwendet: Alcaligenes eutrophus ATCC 23440, Azotobacter chroococcum DSM
281, Bacillus megatherium ATCC 32.
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In der Beschreibung dieses Verfahrens wurde empfohlen, um bei der
Herstellung der 3-HBS in großtechnischem Maßstabe hohe Ausbeuten sicherzustellen,
solche Mutanten zu verwenden, die während einer Züchtungsdauer von 30 Stunden mindestens
100 mg der 3-HBS pro Liter bis mindestens 1 g/l Nährlösung zu erzeugen vermögen,
einzusetzen.
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Da der Verwendung von D(-)-3-Hydroxybuttersäure in der Medizin große
Bedeutung zukommt, sind Herstellungsverfahren mit Ausbeuten im Milligrammbereich
für eine gewerbliche Verwertung unbefriedigend.
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Das Bedürfnis nach Verfahren mit größeren Ausbeuten bleibt daher trotz
des Verfahrens nach der DE-OS 27 33 202 nach wie vor bestehen.
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Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur
Herstellung von D(-)-3-Hydroxybutansäure zu schaffen, das die Nachteile der bekannten
Verfahren vermeidet, mit welchem um eine Zehnerpotenz oder mehr höhere Ausbeuten
an D(-)-3-Hydroxybutansäure gegenüber den zum Stand der Technik gehörigen Verfahren
erzielt werden können, und das in einfachster Weise ohne größeren Aufwand an Fachpersonal,
an Vorrichtungen und an Reagenzien durchgeführt werden kann, ohne von der mangelhaften
Verfügbarkeit einer Ausgangssubstanz abhängig zu sein.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß Mutanten, die
die Fähigkeit Poly-3-hydroxybutansäure zu produzieren verloren haben, die D(-)-3-Hydroxybutansäure
(3-HBS) in den Zellen anhäufen und ausscheiden, jedoch unfähig sind, die ausgeschiedene
3-HBS nachträglich zu verwerten, in einer Submerskultur bei wachstumsbegrenzender
Verringerung der Ammonium-, Magnesium-, Sulfat-, Phosphat, und Eisen-Konzentrationen
und niedrigem, wachstumsbegrenzenaem Sauerstoffpartialdruck in Gegenwart eines Überschusses
an Kohlenstoffquellen kultiviert werden.
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Von Mikroorganismen, die befähigt sind Poly-3-hydroxybutansäure zu
bilden, werden in bekannter Weise Mutanten gezüchtet, die die Fähigkeit, das Polymere
zu bilden, verloren haben. Solche Mutanten, beispielsweise Alcaligenes eutrophus,
Stamm 21646 (DSM) oder Stamm 24408 (DSM), sind für das erfindungsgemäße Verfahren
verwendbar und werden unter für das Wachstum suboptimalen Konzentrationen an Sauerstoff,
Stickstoffverbindungen, Phosphat, Eisen, Mangan, Calcium, Kupfer, Kobalt, Nickel,
Magnesium, Molybdän, Schwefelverbindungen kultiviert. Bevorzugt werden Zellen von
Alcaligenes eutrophus Stamm 21646 (DSM) und/oder Stamm 24408 (DSM) in einer Submerskultur
mit Gluconsäure, Brenztraubensäure oder deren Salze und/oder Milchsäure als Kohlenstoffquellen
verwendet. Es können jedoch auch Zellen der genannten Stämme in einer Submerskultur
mit Glucose, Fructose, Glycerin oder Melasse als Kohlenstoffquellen verwendet werden.
Aber auch andere verwertbare, definierte Kohlenstoffquellen, wie z.B. Acetoin oder
2,3-Butandiol oder Abfallprodukte , die einzelne oder mehrere der genannten Substanzen
enthalten, können verwendet werden, um in Submersfermentationen und gleichzeitigem
Überschuß von Kohlenstoffquellen D(-)-3-Hydroxybutansäure zu produzieren. Zur Steigerung
der Ausbeute an D(-)-3-Hydroxybutansäure können der Kulturflüssigkeit Precursoren
(Alkaliacetat, Alkali-lact t) zugesetzt werden. Zur Steigerung der Ausbeute ist
es ferner möglich, Substanzen zuzusetzen, die das Wachstum partiell oder vollständig
hemmen, wie Methanol oder Schwermetallionen, sowie oberflächenaktive Agentien, beispielsweise
blsäure-Derivate (Salze oder Ester) zuzusetzen.
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Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielten Vorteile bestehen
insbesondere darin, daß D(-)-3-Hydroxybutansäure in bisher unerreicht hoher Ausbeute
hergestellt werden kann und daß keine kostspielige Trennung des Racemates erforderlich
ist.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden anhand einiger Beispiele
näher beschrieben.
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Beispiel 1 Zellen von Alcaligenes eutrophus, Stamm 21646, der durch
Mutation die Fähigkeit zur Speicherung von Poly-3-hydroxybutansäure verloren hat,
wurden in Submerskultur mit einem Medium der folgenden Zusammensetzung kultiviert
Na-Gluconat 30 g, (NH4)2HP°4 2.0 g, KH2PO4 2.1 g, MgS04 x 7 H20 0.2 g, FeCl3 x 6
H20 6 mg, CaC12 x 2 H20 10 mg, H3B03 300 Mg CoCl3 x 6 H20 200 pg, ZnSO4 x 7 H20
100 pg, MnC12 x 4 H20 30 jag, Nie12 x 2 H2 0 30 pg, CuCl2 x 2 H20 10 pg, Na2MoO4
x 2 H20 30 pg, H20 ad 1000 ml, pH 6.8 - 6.9.
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0 Die Zellkultur wurde bei 30 C unter für das Wachstum optimalen
Bedingungen belüftet (125 ml Luft minze 1) und gerührt (600 Upm; KLa = 150 h 1),
bis die Vorräte an Ammonium, Magnesium, Sulfat, Phosphat sowie Eisen begrnzend.wirkten.
Nachdem auch Sauerstoff das Wachstum begrenzte, fand die Produktion von D(-)-3-Hydroxybutansäure
statt. Das Verfahren dauerte 50 Stunden. Die Kulturbrühe wurde anschließend auf
einen pH-Wert von 2 - 3 eingestellt und bis
zum Erreichen einer
breiigen Konsistenz eingeengt. Danach wurde die D(-)-3-Hydroxybutansäure mit Diäthyläther
(es kann auch Isoamylalkohol oder ein anderes geeignetes Lösungsmittel verwendet
werden) extrahiert, das Lösungsmittel entfernt und aus dem sirupösen Rückstand säulenchromatographisch
mit dem Anionenaustauscher Dowex 1 (es kann auch Kieselgel verwendet werden) die
D(-)-3-Hydroxybutansäure abgetrennt. Die Kontrolle des Reinigungsverfahrens und
der Reinheit der D(-)-3-Hydroxybutansäure erfolgte durch Gaschromatographie der
in Methyl- bzw. Butylester umgewandelten Komponenten, IR-Spektrophotometrie sowie
durch Bestimmung der Drehung polarisierten Lichtes durch verdünnte Lösungen. Die
Ausbeute an D(-)-3-Hydroxybutansäure betrug 10 Gew.-%, bezogen auf den Einsatz an
Gluconat.
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Beispiel 2 Zellen von Alcaligenes eutrophus, Stamm 24408, wurden unter
den gleichen Bedingungen mit dem gleichen Medium wie in Beispiel 1 beschrieben kultiviert
und die D(-)-3-Hydroxybutansäure nach dem dort beschriebenen Verfahren gewonnen.
Die Ausbeute betrug 12,3 Gew.-%, bezogen auf den Einsatz an Gluconat.
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Beispiel 3 Zellen von Alcaligenes eutrophus, Stämme 21646 oder 24408,
wurden unter den gleichen Bedingungen mit dem gleichen Medium wie in Beispiel 1
beschrieben kultiviert, mit der Ausnahme, daß das Medium anstelle von Na-Gluconat
Na-Lactat (30 g) als C-Verbindung enthielt. Fermentation und Aufarbeitung von D(-)-3-Hydroxybutansäure
fanden, wie in Beispiel 1 beschrieben, statt. Die Ausbeute an D(-)-3-Hydroxybutansäure
betrug 22,6 Gew.-%, bezogen auf den Einsatz an Lactat.
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Beispiel 4 : Zellen von Alcaligenes eutrophus, Stämme 21646. und 24408
wurden unter den gleichen Bedingungen mit dem gleichen Medium wie in Beispiel 1
beschrieben kultiviert, mit der Ausnahme, daß das Medium anstelle von Na-Gluconat
Fructose (30 g) als C-Verbindung enthielt. Fermentation und Aufarbeitung von D(-)-3-Hydroxybutansäure
fanden, wie in Beispiel 1 beschrieben, statt Die Ausbeute an D(-)-3-Hydroxybutansäure
betrug 8 - 10 Gew.-90 bezogen auf den Einsatz an Fructose.
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Beispiel 5 Zellen von Alcaligenes eutrophus, Stämme 21646 oder 24408,
wurden unter den gleichen Bedingungen mit dem gleichen Medium wie in Beispiel 1
beschrieben kultiviert, mit der Ausnahme, daß das Medium anstelle von Na-Gluconat
Na-Pyruvat (30 g) als C-Verbindung enthielt. Fermentation und Aufarbeitung von D(-)-3-Hydroxybutansäure
fanden, wie in Beispiel 1 beschrieben, statt. Die Ausbeute an D(-)-3-Hydroxybutansäure
betrug 6 bis 8 Gew.-%, bezogen auf den Einsatz an Pyruvat.