BE1024282A1 - Compositions immunogènes - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne des polysaccharides capsulaires chimères et des conjuguès les comprenant. L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques comprenant des polysaccharides capsulaires chimères et des conjugués de ceux-ci. D'autres aspects comprennent des procédés d'immunisation d'un patient contre une infection comprenant l'étape d'administration au patient d'un conjugué de l'invention.

Description

COMPOSITIONS IMMUNOGÈNES DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention concerne des saccharides capsulaires chimères de Streptococcus agalactiae y compris des conjugués comprenant lesdits polysaccharides capsulaires chimères et des protéines porteuses.
CONTEXTE DE L'INVENTION
Streptococcus agalactiae (également connu comme « Streptococcus du groupe B » ou « SGB ») est un microorganisme Gram-positif encapsulé, β-hémolytique qui colonise le tractus anogénital de 25 à 30 % des femmes saines. Il constitue une cause majeure de sepsis néonatal et de méningite, notamment chez les enfants nés de mères porteuses de la bactérie. Le pathogène peut également infecter les adultes avec une maladie sous-jacente, notamment les personnes âgées, et provoquer la mastite bovine. Streptococcus pneumoniae (également connu comme « S. pneumo » ou « pneumocoque ») est un microorganisme Gram-positif encapsulé alpha-hémolytique qui réside dans le nasopharynx des porteurs sains sans entraîner de symptômes. Chez les individus susceptibles, par exemple les personnes âgées, les enfants et les individus immunodéprimés, la bactérie peut devenir pathogène et provoguer une maladie telle que la pneumonie, la méningite ou la septicémie.
La capsule du SGB est un facteur de virulence majeur permettant à la bactérie d'échapper aux défenses immunitaires innées de l'être humain. Elle est constituée de polymères de masse moléculaire élevée constitués de multiples unités répétées (UR) identiques de quatre à sept monosaccharides. Le SGB peut être classifié en dix sérotypes (la, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, et IX) dont la composition chimique et le profil des liaisons glycosidiques de leurs unités répétées de polysaccharides capsulaires diffèrent. De manière similaire, la capsule de S. pneumoniae est un facteur de virulence majeur constitué de polymères de masse moléculaire élevée constitués de multiples unités répétées identiques. Cependant, contrairement au SGB, plus de 90 sérotypes différents de S. pneumoniae ont été identifiés jusqu'à présent.
Les saccharides capsulaires du SGB et S. pneumoniae font l'objet d'études pour leur utilisation dans des vaccins. Cependant, les saccharides sont des antigènes T-indépendants et sont généralement faiblement immunogènes. Par conséquent, la conjugaison à un support peut convertir les antigènes T-indépendants en antigènes T-dépendants, améliorant ainsi les réponses mémoires et permettant le développement d'une immunité protectrice. Les vaccins saccharidiques les plus efficaces sont par conséquent basés sur des glycoconjugués. La plupart du travail sur les vaccins à polysaccharides capsulaires du SGB a été réalisé par Dennis Kasper et ses collègues, et est décrit dans des documents tels que les références 1 à 9. Les vaccins conjugués pour chacun des sérotypes de SGB la, Ib, II, III, et V se sont avérés sûrs et immunogènes chez les humains [10]. Plusieurs vaccins destinés à être utilisés dans la protection contre une infection à S. pneumoniae sont connus et sont généralement constitués de polysaccharides purifiés sélectionnés parmi vingt-trois sérotypes différents (1, 2, 3, 4, 5, 6b, 7F, 8,9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F, et 33F) et comprennent, par exemple, Prevnar 7®, Synflorix® et Prevnar 13®.
Cependant, alors que les polysaccharides capsulaires peuvent induire une réponse humorale protectrice, la protection est hautement spécifique du sérogroupe spécifique (en d'autres termes, la, Ib, III, etc.) et ne confère pas de protection croisée contre les autres sérogroupes. Par conséquent, il reste un besoin pour d'autres vaccins conjugués améliorés contre le SGB.
BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION
Dans un premier aspect, l'invention concerne des polysaccharides capsulaires chimères comprenant au moins une unité répétée de polysaccharide capsulaire d'un premier sérotype et au moins une unité répétée de polysaccharide capsulaire d'un deuxième sérotype différent, dans lesquels les unités répétées sont liées par une liaison glycosidique. Les polysaccharides capsulaires chimères sont des polysaccharides capsulaires bactériens. En particulier, le polysaccharide capsulaire chimère est un polymère de masse moléculaire élevée, ayant toutefois plus particulièrement une masse moléculaire (MW) > 30 kDa, par exemple, une MW pouvant atteindre environ 50 kDa ou plus, ou environ 100 kDa ou plus, environ 140 kDa ou plus, environ 200 kDa ou plus, environ 230 kDa ou plus, environ 260 kDa ou plus, ou toute plage entre celles-ci, par exemple, ayant une MW dans la plage de 50 à 200 kDa, de 80 à 150 kDa, de 150 à 300 kDa, de 175 à 275 kDa ou de 175 à 250 kDa.
Dans certains modes de réalisation, l'invention concerne des polysaccharides capsulaires chimères comprenant au moins une unité répétée de polysaccharide capsulaire d'un premier sérotype du SGB et au moins une unité répétée de polysaccharide capsulaire d'un deuxième sérotype du SGB différent, dans lesquels les unités répétées sont liées par une liaison glycosidique. En particulier dans lequel les unités répétées sont présentes en un rapport d'épitopes équilibré, plus particulièrement dans lequel les unités répétées sont présentes en un rapport de 1/1.
Dans des modes de réalisation particuliers, l'invention concerne un polysaccharide capsulaire chimère comprenant au moins une unité répétée d'un premier sérotype de polysaccharide capsulaire du SGB, au moins une unité répétée d'un deuxième sérotype de polysaccharide capsulaire du SGB et au moins une unité répétée d'un troisième sérotype de polysaccharide capsulaire du SGB, dans lequel les première, deuxième et troisième unités répétées proviennent de différents sérotypes de polysaccharides capsulaires du SGB et dans lequel les unités répétées sont jointes par des liaisons glycosidiques.
Les polysaccharides capsulaires du SGB de type sauvage sont des homopolymères formés à partir d'unités répétées identiques jointes par des liaisons glycosidiques. En revanche, les polysaccharides capsulaires chimères de la présente invention sont des hétéropolymères formés à partir d'unités répétées d'au moins deux sérotypes différents du SGB. Plus spécifiquement, et étant donné que les polysaccharides chimères sont générés in vivo par des cellules bactériennes individuelles, les polysaccharides capsulaires de l'invention sont des hétéropolymères formés à partir d'unités répétées ayant la structure d'unités répétées d'au moins deux sérotypes différents du SGB.
Les polysaccharides chimères particuliers comprennent des unités répétées ayant la structure d'unités répétées de sérotypes capsulaires du SGB la + III, la + Ib + III, Ib + III, VII + IX, V + VII + IX, IV + V, V + VII et IV + V + VII.
Dans certains modes de réalisation, l'invention concerne des polysaccharides capsulaires chimères comprenant des unités répétées jointes par au moins deux, au moins trois, au moins quatre ou au moins cinq types différents de liaisons glycosidiques. En particulier, les liaisons glycosidiques sont sélectionnées dans le groupe constitué de β-d-Glcp- (1-4)-β-d-Galp, β-d-Glcp-(1-6)-β-d-GlcpNAc, β-d-Glcp-(1-6)-β-d-Glcp, β-d-Glcp-(1-2)β-d-Galp et β-d-Glcp-(1—4)-α-d-Glcp.
Dans certains modes de réalisation, l'invention concerne des polysaccharides capsulaires chimères comprenant au moins une unité répétée de polysaccharide capsulaire d'un premier sérotype de Streptococcus pneumoniae et au moins une unité répétée de polysaccharide capsulaire d'un deuxième sérotype différent de Streptococcus pneumoniae, dans lesquels les unités répétées sont liées par une liaison glycosidique.
Dans un second aspect, l'invention concerne un conjugué comprenant (i) un polysaccharide capsulaire chimère du premier aspect et (ii) une protéine porteuse. De préférence, la protéine porteuse est liée de manière covalente au polysaccharide capsulaire. Dans certains modes de réalisation, la protéine porteuse est liée de manière covalente au polysaccharide capsulaire via un lieur, par exemple, le dihydrazide d'acide adipique. De préférence, le conjugué est un conjugué immunogène capable d'induire une réponse immunitaire contre au moins deux sérotypes différents du SGB, au moins trois sérotypes différents ou plus. De préférence, la réponse immunitaire est une réponse immunitaire protectrice, par exemple, une réponse immunitaire à protection croisée.
Dans certains modes de réalisation, la protéine porteuse est sélectionnée dans le groupe constitué de l'anatoxine tétanique, de l'anatoxine diphtérique, de CRM197, de GBS80, de GBS59 et de GBS59(6xD3)-1523.
Dans un troisième aspect, l'invention concerne des compositions pharmaceutiques comprenant le polysaccharide chimère selon le premier aspect et/ou le conjugué selon le second aspect. Particulièrement, le polysaccharide chimère et/ou le conjugué sont présents en une quantité efficace pour prévenir les infections systémiques chez un animal, dans lequel lesdites infections systémiques sont provoquées par le streptocoque de groupe B. Particulièrement, les compositions pharmaceutiques de l'invention comprennent un diluant, un support ou un excipient pharmaceutiquement acceptables. Plus particulièrement, les compositions pharmaceutiques de l'invention sont des compositions vaccinales capables d'éliciter une réponse immunitaire contre le streptocoque du groupe B.
Dans un quatrième aspect, l'invention concerne un procédé d'immunisation d'un patient contre une infection par le streptocoque du groupe B comprenant l'étape d'administration au patient d'un conjugué de 1'invention.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
Figure 1 : propose une structure généralisée de l'opéron cps, les gènes d'assemblage des CPS se trouvent dans un long opéron polycistronique qui est largement conservé dans un grand nombre d'autres bactéries encapsulées telles que Streptococcus pneumoniae.
Figure 2 : propose une comparaison des structures généralisées de l'opéron cps d'un sérotype de
Streptococcus agalactiae de type III et d'un sérotype de Streptococcus pneumoniae de type 14.
Figure 3 : présente la structure des unités répétées des polysaccharides capsulaires du SGB la, Ib, III.
Figure 4 : présente la structure des unités répétées des polysaccharides capsulaires du SGB IV, V et VI.
Figure 5 : présente la structure des unités répétées des polysaccharides capsulaires du SGB VII et VIII .
Figure 5 : présente la structure des unités répétées des polysaccharides capsulaires du SGB IX et II .
Figure 7 : propose un exemple d'un polysaccharide chimère de type Ia/III comprenant des unités répétées de type la et des unités répétées de type III jointes par des liaisons glycosidiques β-d-Glcp-(1^4)-β-d-Galp et β-d-Glcp-(1^6)-β-d-GlcpNAc.
Figure 8 : propose un exemple d'un polysaccharide chimère de type Ia/Ib/III qui comprend des unités répétées de type la, de type III et de type Ib jointes par des liaisons glycosidiques β-d-Glcp-(1^4)-β-d-Galp et β-d-Glcp-(1^6)-β-d-GlcpNAc.
Figure 9 : propose un exemple d'une unité répétée chimère obtenue de bactéries de sérotypes IX exprimant cps50. La chaîne latérale supplémentaire est présentée en gras.
Figure 10 : propose un schéma de l'opéron de CPS de différents sérotypes de Streptococcus agalactiae avec les gènes cps respectifs présentés sous la forme de flèches.
Figure lia : structures de pAM-V et pAM-IX utilisés pour transformer les souches de SGB de sérotype V et IX de type sauvage, respectivement. cps5M, cps50 et cps5I ont été clonés dans pAM401-p80/t80 pour obtenir pAM-V. Le clonage de cps9M et cps91 dans pAM401-p80/t80 a été réalisé pour obtenir pAM-IX.
Figure 11b : structure schématique de pAM-IX-V.
Figure 12 : PS V-IX donne un signal positif indiquant que la souche de type V (pAM-IX) produit des chaînes de polysaccharides capsulaires chimères qui contiennent des unités répétées spécifiquement reconnues par les AcM spécifiques du type V et les AcM spécifiques du type IX. L'expression en trans hétérologue de cps9M et de cps9I permet l'assemblage par le SGB 2603 (V) de polysaccharides capsulaires réagissant avec les antisérums spécifiques des CPS de type V et de type IX.
Figure 13 : l'expression en trans hétérologue de cps5M, cps50 and cps5l permet l'assemblage par le SGB IT-NI-016 (IX) de polysaccharides capsulaires réagissant avec les antisérums spécifiques de CPS de type IX et de type V.
Figure 14 : comparaison des spectres de RMN 1H de PS V-IX et PS V-IXb. Les spectres sont hautement similaires à ceux de PS V et PS IX et contiennent des éléments qui sont caractéristiques des deux polysaccharides capsulaires. Le spectre de PS V IXb est davantage similaire à celui de PS V qu'à celui de PS V-IX.
Figure 15 : la composition moyenne des unités répétées de PS V-IX et PS V-IXb a été estimée par RMN DEPT. Environ 75 % des unités répétées du polysaccharide de type V-IX chimère sont de type IX alors que les 25 % restants sont de type V. Environ 50 % des unités répétées du polysaccharide de type V-IXb chimère sont de type IX alors que les 50 % restants sont de type V.
Figure 16 : vecteurs pour la production de PS-Ia-Ib-III ou PS-Ia-III dans un contexte de sérotype la.
Figure 17 : PS V-IXb donne un signal positif indiquant que la souche de type V (pAM-IX-V) produit 15 chaînes de polysaccharides capsulaires chimères qui contiennent des unités répétées spécifiquement reconnues par les AcM spécifiques du type V et les AcM spécifiques du type IX. L'expression en trans hétérologue combinée de cps9M, cps9I, cps5M, cps50 et cps5I permet l'assemblage par le SGB 2603 (V) de polysaccharides capsulaires réagissant avec les antisérums spécifiques des CPS de type V et de type IX.
Figure 18 : analyse par dot-blot en sandwich de PS V-IX et PS V-IXb
Figure 19 : l'ELISA compétitif a confirmé que PSV-IXb se lie aux AcM spécifiques d'un type avec la moitié de l'efficacité des polysaccharides natifs à la même concentration. PSV-IXb semble être composé de manière homogène d'unités répétées PS V et PS IX.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION L'invention est basée sur les saccharides capsulaires de Streptococcus agalactiae.
Le saccaride capsulaire du SGB est lié de façon covalente au squelette peptidoglycane, et est distinct de l'antigène de groupe B, qui est un autre saccharide qui est lié au squelette peptidoglycane. Tous les gènes responsables de la synthèse et de la fixation à la paroi cellulaire des polysaccharides capsulaires (CPS) du SGB sont regroupés dans l'opéron cps. Cet opéron se compose de 16 à 18 gènes, dont les séquences diffèrent selon les sérotypes (figure 1). La voie d'assemblage du polysaccharide capsulaire de certains sérotypes de Streptococcus pneumoniae est très similaire à celle du SGB, étant donné qu'elles sont toutes les deux polymérase-dépendantes. Spécifiquement, à l'intérieur des sérotypes qui ont une machinerie de synthèse du CPS dépendante de la polymérase, les opérons cps ont la même organisation (figure 2) . Dans certains sérotypes de S. pneumoniae, même la structure chimique des CPS est similaire à celle de certains sérotypes du SGB. Par exemple, la structure chimique des CPS de S. pneumoniae sérotype 14 et du SGB sérotype III est très similaire et le taux d'identité de séquences d'acides aminés entre les protéines homologues codées par leurs opérons cps est de 39,5 %. Ainsi, alors que l'invention est décrite ci-dessous avec un accent particulier sur le SGB, les découvertes des inventeurs s'appliquent aussi à la préparation de polysaccharides chimères de S. pneumoniae.
Les structures chimiques précises des polysaccharides capsulaires du SGB sérotypes la, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII et IX, sont bien décrites (13-20). Elles sont composées d'unités répétées de quatre à sept monosaccharides avec un squelette et une ou deux chaînes latérales. Quatre monosaccharides (plus précisément Glcp, Glap, GlcpNAc et NeupNAc) sont présents dans l'ensemble des dix sérotypes décrits, et le résidu NeupNAc est toujours rencontré au niveau de l'extrémité terminale de l'une de leurs chaînes latérales. Cependant, le profil de liaisons glycosidiques est unique à chaque sérotype. Ainsi, une sous-unité ou unité répétée (UR) est la partie du polysaccharide capsulaire dont la répétition par liaison des unités répétées ensemble successivement produit le polysaccharide complet. Particulièrement, l'unité répétée est une unité répétée oligosaccharidique. Les structures des UR des polysaccharides capsulaires du SGB la, Ib, III sont présentées sur la figure 3. Les structures des UR des polysaccharides capsulaires du SGB IV, V et VI sont présentées sur la figure 4. Les structures des UR des polysaccharides capsulaires du SGB VII et VIII sont présentées sur la figure 5. Les structures des UR des polysaccharides capsulaires du SGB IX et II sont présentées sur la figure 6.
Les inventeurs ont découvert que les souches recombinantes du SGB exprimant les gènes cps étrangers ou exogènes pouvaient produire des polysaccharides capsulaires chimères. Ces polysaccharides capsulaires chimères comprennent deux unités répétées différentes ou plus ayant la structure des unités répétées de deux sérotypes différents ou plus. Les polysaccharides capsulaires chimères peuvent être utilisés pour simplifier la fabrication de vaccins conjugués multivalents.
Les polysaccharides capsulaires chimères de l'invention peuvent aussi comprendre de nouveaux épitopes non présents dans les polysaccharides capsulaires natifs, de type sauvage, des sérotypes du SGB la, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, et des sérotypes de Streptococcus pneumoniae 1, 2, 3, 4, 5, 6b, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F, et 33F. Étant donné que le polysaccharide capsulaire est l'une des principales cibles pour la vaccination, une préoccupation majeure en matière de vaccin, tant relative au SGB qu'à S. pneumoniae, est la possibilité de commutation capsulaire entre les sérotypes. La vaccination basée sur les polysaccharides capsulaires peut exercer une pression sélective responsable d'une commutation de capsules des génotypes virulents, et de leur échappement à la couverture vaccinale. En résultat, l'utilisation de ces polysaccharides capsulaires chimères comprenant de nouveaux épitopes peut être avantageuse pour prévenir ou réduire la commutation capsulaire en priorisant l'émergence de nouveaux sérotypes capsulaires.
Bactéries
Les polysaccharides capsulaires chimères de l'invention sont préparés à partir de Streptococcus agalactiae exprimant au moins un gène cps exogène en raison d'une modification génétique. Ainsi, la présente invention concerne une bactérie Streptococcus agalactiae génétiquement modifiée pour la production d'un polysaccharide capsulaire chimère, dans lequel la bactérie comprend une batterie de gènes de polysaccharides capsulaires endogènes et au moins un gène cps exogène ou étranger.
La région d'ADN de l'opéron cps est composée de 16 à 18 gènes dans les différents sérotypes de SGB [149]. Il est prédit que les gènes cpsABCD en 5' sont impliqués dans la régulation de la synthèse de la capsule ; la région centrale de cpsE et cpsL code pour les enzymes responsables de la synthèse, du transport, et de la polymérisation des unités répétées polysaccharidiques ; finalement, les gènes neuBCDA sont responsables de la synthèse de l'acide sialique actif, un composant sucre présent dans tous les polysaccharides capsulaires du SGB [150]. La figure 10 propose un schéma de l'opéron cps avec les gènes cps respectifs. Les gènes cps dérivés du sérotype V sont identifiés en utilisant la nomenclature cpsSG, cps5H, cps5M, cps50 et ainsi de suite. Les gènes cps dérivés du sérotype IX sont identifiés en utilisant la nomenclature cps9G, cps9H, cps9M et ainsi de suite. Les gènes cps dérivés d'autres sérotypes sont identifiés en utilisant une nomenclature similaire et les identifiants, la, lb, 2, 3, 4, 6, 7 et 8. Un opéron cps similaire existe dans Streptococcus pneumoniae.
Le terme « endogène » fait référence à un gène natif à son emplacement naturel dans le génome d'un organisme. Un gène « étranger » ou « exogène » fait référence à des séquences d'ADN ou des gènes qui ne sont pas normalement présents dans la cellule étant transformée, ou éventuellement ne sont simplement pas présents sous la forme, la structure, etc., telle que rencontrée dans le gène ou segment d'ADN transformant, par exemple, un gène cps que l'on ne rencontre pas normalement dans le sérotype de la cellule hôte mais qui est introduit par transfert de gènes. Ainsi, l'utilisation du terme « gène cps exogène » dans ce sens signifie que la bactérie génétiquement modifiée est d'un premier sérotype, par exemple, sélectionné parmi les sérotypes la, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX du SGB et le ou les gènes cps exogènes sont d'un deuxième sérotype différent. Dans certains modes de réalisation, Streptococcus agalactiae ou Streptococcus pneumoniae génétiquement modifiés expriment au moins deux gènes cps exogènes des deuxième et/ou troisième sérotypes différents. Le ou les gènes cps exogènes peuvent être sélectionnés dans le groupe constitué de cpsE, cpsF, cpsG, cpsH, cpsM, cpsO, cpsl, cps J, cpsP, cpsQ, cpsK et cpsL. Des gènes cps exogènes particuliers comprennent cpsM, cpsO et cpsl. Le ou les gènes cps exogènes sont codés par un acide nucléique exogène (par exemple, recombinant), qui a été introduit dans la cellule de Streptococcus agalactiae ou Streptococcus pneumoniae génétiquement modifiée. L'acide nucléique peut être introduit dans un vecteur d'expression pour l'expression dans une cellule de Streptococcus agalactiae ou de Streptococcus pneumoniae. Le vecteur d'expression comprendra généralement des signaux capables d'exprimer le gène cps endogène codé par l'acide nucléique introduit. Par exemple, un vecteur d'expression peut comprendre un ensemble complet de séquences de contrôle comprenant des séquences d'initiation, promotrices et de terminaison qui fonctionnent dans une cellule bactérienne. Des vecteurs d'expression appropriés peuvent comprendre des séquences de régulation en 5' et en 3' liées de manière fonctionnelle aux séquences d'intérêt. La nature de toutes les séquences de régulation fournies dans la construction d'expression dépendra du profil d'expression souhaité. Les types de séquences de régulation seront connus des hommes du métier. Un vecteur peut également contenir un ou plusieurs sites de restriction ou sites de recombinaison homologue, pour permettre l'insertion du gène dans le génome de la cellule hôte, à une position présélectionnée. Dans le cas de la séquence nucléotidique, celle-ci peut être liée de manière fonctionnelle à la séquence génique dont l'expression doit être modifiée. Des régions d'initiation de la transcription et de la traduction peuvent également être fournies sur le vecteur d'expression, pour permettre l'expression des gènes entrants, des régions de terminaison de la transcription et de la traduction, et des séquences régulatrices.
Dans certains modes de réalisation, le vecteur est délivré et intégré dans le chromosome bactérien par recombinaison homologue et/ou site-spécifique. Les vecteurs intégratifs utilisés pour délivrer ces gènes et/ou opérons peuvent être des plasmides suicides ou à réplication conditionnelle, des bactériophages, des transposons ou des fragments d'ADN linéaires obtenus par hydrolyse de restriction ou par amplification par PCR. L'intégration est de préférence ciblée sur des régions chromosomiques dont il est possible de se passer pour la croissance in vitro. En variante, le vecteur d'expression peut être non intégratif, par exemple, un vecteur épisomique tel que des plasmides réplicatifs circulaires/linéaires, des cosmides, des phasmides, des bactériophages lysogéniques ou des chromosomes bactériens artificiels. La sélection de l'événement de recombinaison peut être réalisée au moyen d'un marqueur génétique sélectionnable par exemple des gènes conférant une résistance aux antibiotiques (par exemple, à la kanamycine, à l'érythromycine, au chloramphénicol, ou à la gentamycine), des gènes conférant une résistance aux métaux lourds et/ou aux composés toxiques ou des gènes complémentant les mutations auxotrophiques. Les vecteurs et systèmes de transformation appropriés sont connus dans la technique et des exemples sont proposés ci-dessous.
Les gènes cps d'intérêt peuvent être codés dans un vecteur d'expression unique, ou dans des vecteurs d'expression différents. Dans le dernier cas, les vecteurs d'expression différents peuvent être cotransfectés soit simultanément soit successivement dans la cellule de Streptococcus agalactiae ou Streptococcus pneumoniae. « Co-transfection » signifie le processus de transfection d'une cellule de Streptococcus agalactiae ou Streptococcus pneumoniae avec plus d'un vecteur d'expression. Lorsque la cellule a été cotransfectée avec un vecteur d'expression capable d'exprimer un ou plusieurs premiers gènes cps et un vecteur capable d'exprimer un ou plusieurs deuxièmes gènes cps, les vecteurs peuvent contenir des marqueurs indépendamment sélectionnables. Lorsque des séquences nucléotidiques codant pour deux gènes cps d'intérêt ou plus sont contenues dans un vecteur d'expression unique, dans certains modes de réalisation, les séquences nucléotidiques seront fonctionnellement liées à un élément de contrôle commun (par exemple, un promoteur), par exemple, l'élément de contrôle commun contrôle l'expression de toutes les séquences nucléotidiques codant pour des gènes cps sur le vecteur d'expression unique. Dans certains modes de réalisation, les séquences nucléotidiques codant pour différents gènes cps sont liées de manière fonctionnelle à différents éléments de contrôle (par exemple, un promoteur/des promoteurs). Dans certains modes de réalisation, l'une des séquences nucléotidiques peut être fonctionnellement liée à un promoteur inductible, et une ou plusieurs des autres séquences nucléotidiques peuvent être fonctionnellement liées à un promoteur constitutif.
La compétition entre les unités répétées alternées en tant que substrats pour les enzymes catalysant les étapes en aval de la production de cps, peut favoriser la synthèse de l'unité répétée homologue ou hétérologue. Ainsi, la production efficace de polysaccharides capsulaires chimères peut nécessiter l'expression correctement équilibrée des gènes cps endogènes et exogènes. De manière à équilibrer l'expression, l'homme du métier aura connaissance d'un certain nombre d'options. Celles-ci peuvent comprendre, à titre d'exemple non restrictif, (i) le remplacement du promoteur ; (ii) l'ajout de gènes ; et/ou (iii) le remplacement de gènes.
Dans le remplacement du promoteur, le promoteur qui contrôle l'expression d'un ou plusieurs gènes cps endogènes peut être remplacé par un promoteur pour fournir des niveaux d'expression inférieurs ou supérieurs. Un promoteur particulier pour son utilisation dans l'invention est le promoteur du SGB P80 (Buccato S., et al. (2006) J. Infect. Dis. 194, 331.340). D'autres promoteurs sont connus dans la technique et comprennent, de manière non restrictive, un promoteur de l'ARN polymérase du bactériophage T7 ; un promoteur trp ; un promoteur de l'opéron lac ; un promoteur hybride ; par exemple, un promoteur hybride lac/tac, un promoteur hybride lac/trc, un promoteur trp/lac, un promoteur T7/lac ; un promoteur trc ; un promoteur tac ; et équivalents. Dans certains modes de réalisation les gènes cps d'intérêt sont liés de manière fonctionnelle à un promoteur inductible ou à un promoteur constitutif. Les promoteurs inductibles et constitutifs sont bien connus des hommes du métier.
Dans l'ajout de gènes, une bactérie qui exprime déjà le gène cps endogène reçoit une seconde copie du gène pertinent. Cette seconde copie peut être intégrée dans le chromosome bactérien ou peut être sur un élément épisomique tel qu'un plasmide. L'effet de l'ajout de gène est de faire augmenter de manière additive l'expression par augmentation du nombre de copies de gènes. Lorsqu'un plasmide est utilisé, il s'agit idéalement d'un plasmide avec un grand nombre de copies par exemple, plus de 10, voire plus de 100. Dans le remplacement de gènes, l'ajout de gènes se produit mais est accompagné de la délétion de la copie existante du gène. Par exemple, au moins un gène cps endogène peut être délété et remplacé par une copie codée par un plasmide. L'expression par la copie de remplacement, selon le promoteur utilisé, peut être plus élevée ou moins élevée que l'expression par la copie précédente. Ainsi, dans certains modes de réalisation, la bactérie Streptococcus agalactiae ou Streptococcus pneumoniae génétiquement modifiée comprend une délétion ou une inactivation d'un ou plusieurs gènes de la batterie de gènes de polysaccharides capsulaires endogènes. Le ou les gènes délétés peuvent comprendre au moins un des gènes cpsE, cpsF, cpsG, cpsM, cpsl et cps J, cpsM, cpsO et cpsl. La copie de remplacement peut être un gène cps exogène et/ou une copie du gène cps endogène natif.
Dans certains modes de réalisation, plus d'un événement d'ajout de gène ou de remplacement de gène peut se produire de telle sorte que l'expression par de multiples copies du gène cps d'intérêt ou combinaisons de sur- ou sous-expression de différents gènes cps d'intérêt peut avoir lieu.
Dans certains modes de réalisation une bactérie exprime un gène cpsO exogène, en particulier un gène cps50, notamment la bactérie est Streptococcus agalactiae sérotype IX. La figure 9 propose un exemple d'une unité répétée chimère de sérotype IX obtenue de bactéries exprimant cps50 avec la chaîne latérale supplémentaire présentée en gras.
Dans certains modes de réalisation une bactérie exprime des gènes cpsM et cpsl exogènes, particulièrement des gènes cps9M et cps9I, en particulier la bactérie est Streptococcus agalactiae sérotype V.
Dans certains modes de réalisation une bactérie exprime des gènes cpsM, cpsO et cpsl exogènes, en particulier des gènes cps5M, cps50 et cps5I, en particulier la bactérie est Streptococcus agalactiae sérotype IX.
Dans certains modes de réalisation, une bactérie produit un polysaccharide capsulaire chimère qui comprend au moins une unité répétée d'un polysaccharide capsulaire du SGB sérotype la, au moins une unité répétée d'un polysaccharide capsulaire du SGB sérotype Ib et au moins une unité répétée d'un polysaccharide capsulaire du SGB sérotype III, dans lequel les unités répétées sont jointes par des liaisons glycosidiques. En particulier, le rapport des unités répétées de la, Ib et III est d'environ 1/1/1.
Dans certains modes de réalisation, une bactérie produit un polysaccharide capsulaire chimère qui comprend au moins une unité répétée de polysaccharide capsulaire du SGB sérotype V et au moins une unité répétée de polysaccharide capsulaire du SGB sérotype IX, dans lequel les unités répétées sont jointes par des liaisons glycosidiques. En particulier, le rapport des unités répétées de V sur IX est d'environ 1/1.
Dans certains modes de réalisation, une bactérie produit un polysaccharide capsulaire chimère qui comprend au moins une unité répétée d'un polysaccharide capsulaire du SGB sérotype V, au moins une unité répétée d'un polysaccharide capsulaire du SGB sérotype IX et au moins une unité répétée d'un polysaccharide capsulaire du SGB sérotype VII, dans lequel les unités répétées sont jointes par des liaisons glycosidiques. En particulier, le rapport des unités répétées de V, IX et VII est d'environ 1/1/1.
En particulier, la référence à « au moins une unité répétée » peut faire référence à au moins 2, 10, 20, 50, 60, 70, 80, 90, 100 unités répétées, au moins 150, 200, 250, 500, 1000 unités répétées ou plus. En particulier, le rapport des unités répétées est d'environ 1/1 ou 1/1/1.
Des procédés de préparation des constructions d'acide nucléique et des vecteurs décrits dans le présent document sont connus des hommes du métier, et des procédés spécifiques sont illustrés dans les exemples. Des procédés de clonage et de transformation bactérienne, des vecteurs d'ADN et l'utilisation de séquences de régulation sont bien connus des hommes du métier et peuvent, par exemple, être retrouvés dans Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., Wiley Interscience, 2004, intégré au présent document à titre de référence.
Polysaccharide capsulaire chimère
Les polysaccharides capsulaires chimères de l'invention comprennent deux unités répétées différentes ou plus ayant la structure des unités répétées de deux sérotypes différents ou plus du SGB ou de Streptococcus pneumoniae. Les polysaccharides capsulaires chimères de l'invention comprennent également au moins un pont ou liaison glycosidique entre une molécule dans une première unité répétée et une molécule dans une seconde unité répétée. À titre d'exemple non restrictif, les molécules sont généralement des molécules d'hydrate de carbone, par exemple des molécules de sucre. La molécule dans la première unité répétée peut être β-d-Glcp. La molécule dans la seconde unité répétée peut être β-d-Glap, β-d-GlcpNAc, β-d-Glcp ou α-d-Glcp. Les molécules de sucre peuvent être jointes par une liaison entre l'atome de carbone numéro 1 (Cl) dans un sucre de la première unité répétée et le quatrième atome de carbone (C4) de la deuxième unité répétée dans le polysaccharide capsulaire chimère, (désignée l->4) , par une liaison entre l'atome de carbone numéro 1 (Cl) dans un sucre de la première unité répétée et le deuxième atome de carbone (C2) d'un sucre de la deuxième unité répétée dans le polysaccharide capsulaire chimère (désignée l->2) , ou par une liaison entre l'atome de carbone numéro 1 (Cl) dans un sucre de la première unité répétée et le sixième atome de carbone (C6) d'un sucre de la deuxième unité répétée dans le polysaccharide capsulaire chimère (désignée l->6) . L'utilisation de l-»4, l->2 et l->6 fait référence à la liaison covalente entre des atomes de carbone à des positions différemment numérotées dans le sucre. Des exemples particuliers de différentes liaisons glycosidiques se produisant entre des unités répétées dans les polysaccharides capsulaires comprennent, β-d-Glcp-(1—»4)-β-d-Galp, β-d-Glcp- (l->6)-β-d-GlcpNAc, β-d-Glcp-(l-»6)-β-d-Glcp, β-d-
Glcp-(1—2)-β-d-Galp et β-d-Glcp-(1—4)-α-d-Glcp. Dans certains modes de réalisation, l'invention concerne des polysaccharides capsulaires chimères comprenant des unités répétées oligosaccharidiques jointes par au moins deux types différents de liaisons glycosidiques. En particulier, les polysaccharides capsulaires chimères peuvent comprendre des unités répétées oligosaccharidiques jointes par au moins deux types différents de liaisons glycosidiques sélectionnées dans le groupe constitué de β-d-Glcp-(1—4)-β-d-Galp, β-d-Glcp-(1-6)-β-d-GlcpNAc, β-d-Glcp-(1-6)-β-d-Glcp, β-d-Glcp-(1—2)-β-d-Galp et β-d-Glcp-(1—4)-a-d-Glcp.
Les unités répétées de type la et III du SGB sont pratiquement identiques, contenant le disaccharide et le trisaccharide variable liés par une liaison 1—3. L'unique différence entre les polysaccharides capsulaires de type sauvage des sérotypes la et III de SGB est la liaison glycosidique qui relie une unité répétée à la suivante. Dans le type la, les unités répétées ont une liaison 1—4 via le β-d-Galp du disaccharide. Dans le type III, les unités répétées ont une liaison 1—6 via le β-d-GlcpNAc du trisaccharide variable. Ainsi, un polysaccharide capsulaire chimère des sérotypes la et III du SGB comprend des unités répétées à liaison 1—4 par le β-d-Galp du disaccharide et des unités répétées à liaison 1—6 via le β-d-GlcpNAc du trisaccharide variable. Plus particulièrement, un polysaccharide capsulaire chimère des sérotypes la et III du SGB comprend les UR oligosaccharidiques jointes par les liaisons glycosidiques β-d-Glcp (1—4)-β-d-Galp et β-d-Glcp-(1—6)-β-d-GlcpNAc. À titre d'exemple, un polysaccharide chimère de type Ia/III peut comprendre les UR de type la et les UR de type II jointes par les liaisons glycosidiques β-d-Glcp (l->4)-β-d-Galp et β-d-Glcp- (l->6)-β-d-GlcpNAc dans l'agencement présenté sur la figure 7. Un homme du métier reconnaîtra que d'autres agencements d'UR et d'autres liaisons sont possibles.
Dans certains modes de réalisation, l'invention concerne des polysaccharides capsulaires chimères comprenant des UR oligosaccharidiques jointes par au moins deux, au moins trois, au moins quatre ou au moins cinq types différents de liaisons glycosidiques. En particulier, les liaisons glycosidiques sont sélectionnées dans le groupe constitué de β-d-Glcp-( 1-^4)-β-d-Galp, β-d-Glcp- (l->6)-β-d-GlcpNAc, β-d-Glcp- (l->6)-β-d-Glcp, β-d-Glcp-(l->2) β-d-Galp et β-d-Glcp-(l->4) -α-d-Glcp. La figure 8 propose un exemple d'un polysaccharide chimère de type Ia/Ib/III qui comprend des unités répétées de type la, de type III et de type Ib jointes par des liaisons glycosidiques β-d-Glcp-(1^4)-β-d-Galp et β-d-Glcp- (l->6)-β-d-GlcpNAc. Un homme du métier reconnaîtra que d'autres agencements de ces UR et d'autres liaisons sont possibles.
Le rapport des UR oligosaccharidiques du premier sérotype de polysaccharide capsulaire sur les UR oligosaccharidiques du deuxième sérotype différent de polysaccharides capsulaires peut varier. Des rapports appropriés, par exemple déterminés par le nombre ou la masse, peuvent comprendre 1/1, 1/2, 1/3 1/4, 2/1, 3/1 or 4/1. Des rapports généralement préférés seront équilibrés et de l'ordre de 1/1 mais le rapport précis peut être difficile à contrôler exactement. En variante, la teneur en UR oligosaccharidiques du premier sérotype de polysaccharide capsulaire et en UR oligosaccharidiques du deuxième sérotype différent de polysaccharide capsulaire peut être présentée en termes de pourcentage (%) , par exemple déterminée par le nombre ou la masse. Lorsque les polysaccharides capsulaires chimères comprennent deux différents types d'UR, de préférence environ 50 % des UR seront d'un type et environ 50 % des liaisons seront de l'autre type. Un homme du métier comprendra que ces pourcentages ne seront pas toujours précis et qu'il peut y avoir certaines variations dans ces chiffres. Par exemple, il peut y avoir environ X % des UR du premier type et environ Y % du second type, où Y = 100 - X, par exemple, lorsque X = 30 %, Y = 70 % ; lorsque X = 35 %, Y = 65 % ; lorsque X = 40 %, Y = 60 %, etc.
Des variances de plus ou moins 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 % peuvent être attendues. Lorsque des polysaccharides chimères comprennent au moins trois différents types d'UR, des rapports appropriés peuvent comprendre 1/1/1, 1/1/2, 1/1/3, 1/1/4, 1/2/1, 1/3/1, 1/2/2, 1/2/3, 1/2/4, 1/4/1, 1/4/2, 1/4/3, 1/4/4, 2/1/1, 2/1/2, 2/1/3, 2/1/4, 2/2/1, 2/3/1, 2/4/1, 4/1/1, 4/1/2, 4/1/3, 4/1/4, 4/2/1, 4/3/1 and 4/4/1. De manière similaire, des pourcentages appropriés peuvent suivre le profil, X%+Y%+Z%= 100 %, etc.
Lorsque les polysaccharides capsulaires chimères comprennent deux différents types de liaisons glycosidiques, de préférence environ 50 % des liaisons glycosidiques seront d'un type et environ 50 % des liaisons seront de l'autre type. Un homme du métier comprendra que ces pourcentages ne seront pas toujours précis et qu'il peut y avoir certaines variations dans ces chiffres. Par exemple, il peut y avoir environ X % des liaisons glycosidiques d'un type et environ Y % du second type, où U = 100 - X. Par exemple, lorsque X = 30 %, Y = 70 % ; lorsque X = 35 %, Y = 65 % ; lorsque X = 40 %, Y = 60 %, etc.
Les polysaccharides capsulaires chimères de l'invention peuvent être sous leur forme native, ou peuvent être modifiés. Par exemple, les polysaccharides peuvent être dépolymérisés pour donner des fragments plus courts pour leur utilisation avec l'invention, par hydrolyse dans un acide modéré, par chauffage, par chromatographie d'exclusion de taille, etc. La longueur de chaîne affecterait l'immunogénicité des saccharides du SGB chez les lapins [4].
En particulier, le polysaccharide capsulaire chimère est un polymère de masse moléculaire élevée. Pour le SGB, on préfère utiliser des polysaccharides capsulaires chimères ayant une MW > 30 kDa, par exemple, une MW pouvant atteindre ~50 kDa, environ 100 kDa, environ 140 kDa, environ 200 kDa, environ 230 kDa, environ 260 kDa ou toute plage entre ces MW, par exemple, ayant une MW dans la plage de 50 à 200 kDa, de 80 à 150 kDa, de 150 à 300 kDa, de 175 à 275 kDa ou de 175 à 250 kDa. Les masses moléculaires peuvent être mesurées par filtration sur gel relativement à des étalons dextrane, par exemple ceux disponibles auprès de Polymer Standard Service [11].
Les polysaccharides capsulaires chimères peuvent être chimiquement modifiés, par exemple, le saccharide peut être dé-O-acétylé (partiellement ou totalement), dé-N-acétylé (partiellement ou totalement), N-propionaté (partiellement ou totalement), etc. La désacétylation peut se produire avant, pendant ou après la conjugaison, mais se produit de préférence avant la conjugaison. En fonction du saccharide particulier, la désacétylation peut ou non affecter l'immunogénicité. La pertinence de la O-acétylation sur les saccharides de SGB dans différents sérotypes est abordée dans la référence 12, et dans certains modes de réalisation la O-acétylation des résidus acide sialique aux positions 7, 8 et/ou 9 est conservée avant, pendant ou après la conjugaison, par exemple, par protection/déprotection, par ré-acétylation, etc. Cependant, typiquement, le polysaccharide capsulaire chimère utilisé dans la présente invention n'a sensiblement pas de 0-acétylation des résidus acide sialique aux positions 7, 8 et/ou 9. En particulier, lorsque le polysaccharide capsulaire chimère a été purifié par extraction de bases tel que décrit ci-dessous, alors la O-acétylation est typiquement perdue (référence 12). L'effet de la désacétylation etc. peut être évalué par des dosages en routine.
Les polysaccharides capsulaires chimères peuvent être purifiés par des techniques connues, tel que décrit dans les références 2 et 13, par exemple. Un processus typique implique l'extraction de bases, la centrifugation, la filtration, un traitement par RNase/DNase, un traitement par protéase, la concentration, la chromatographie d'exclusion diffusion, l'ultrafiltration, la chromatographie par échange d'anions, et en outre l'ultrafiltration. Le traitement des cellules du SGB avec l'enzyme mutanolysine, qui clive la paroi cellulaire bactérienne pour libérer les composants de la paroi cellulaire, est également utile.
En variante, le processus de purification décrit dans la référence 14 peut être utilisé. Il implique l'extraction de bases, un traitement à 1'éthanol/CaCl2, la précipitation au CTAB, et la re-solubilisation. Une autre variante de processus est décrite dans la référence 15.
Les polysaccharides capsulaires de Streptococcus pneumoniae peuvent être préparés par des techniques standard connues des hommes du métier, par exemple, telles que décrites dans les documents EP497524 et EP497525.
Les polysaccharides capsulaires chimères de l'invention peuvent également être décrits ou spécifiés en termes de leur réactivité croisée. Le terme « à réactivité croisée » tel qu'il est utilisé dans le présent document fait référence à la capacité de la réponse immunitaire induite par les polysaccharides capsulaires chimères de l'invention à stimuler la production d'anticorps capables de réagir avec au moins deux sérotype différents du SGB ou de Streptococcus pneumoniae. Le terme « à protection croisée » tel qu'il est utilisé dans le présent document fait référence à la capacité de la réponse immunitaire, induite par les polysaccharides capsulaires chimères de l'invention, à prévenir ou atténuer une infection ou une maladie par au moins deux sérotypes différents du SGB ou de Streptococcus pneumoniae. Dans des modes de réalisation particuliers de la présente description, les polysaccharides capsulaires chimères de la présente description ne présentent pas de réaction croisée et/ou de protection croisée contre une pluralité de sérotypes de SGB ou de Streptococcus pneumoniae, par exemple, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 sérotypes. On estime que la réactivité croisée est un indicateur de la protection croisée. Les hommes du métier apprécieront facilement que la présente invention facilite la fabrication de vaccins en permettant la production d'un polysaccharide capsulaire chimère qui est capable d'offrir une protection contre de multiples sérotypes infectieux de SGB ou de Streptococcus pneumoniae.
Conjugaison de polysaccharides capsulaires chimères
Les polysaccharides capsulaires chimères de l'invention peuvent être fournis sous la forme d'un conjugué comprenant (i) un polysaccharide capsulaire chimère et ( i i ) une protéine porteuse. Ainsi, dans certains modes de réalisation, des conjugués comprenant (i) un polysaccharide capsulaire et (ii) une protéine porteuse, sont caractérisés en ce que le polysaccharide capsulaire comprend au moins une UR oligosaccharidique d'un premier sérotype de polysaccharide capsulaire du SGB et au moins une UR oligosaccharidique d'un deuxième sérotype de polysaccharide capsulaire du SGB et facultativement, au moins une UR oligosaccharidique d'un troisième sérotype de polysaccharide capsulaire du SGB dans lequel les UR oligosaccharidiques sont jointes par des liaisons glycosidiques. Dans d'autres modes de réalisation, des conjugués comprenant (i) un polysaccharide capsulaire et (ii) une protéine porteuse, sont caractérisés en ce que le polysaccharide capsulaire comprend au moins une UR oligosaccharidique d'un premier sérotype de polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae et au moins une UR oligosaccharidique d'un deuxième sérotype de polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae et facultativement, au moins une UR oligosaccharidique d'un troisième sérotype de polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae dans lequel les UR oligosaccharidiques sont jointes par des liaisons glycosidiques. En général, la conjugaison covalente de saccharides à des porteurs améliore l'immunogénicité des saccharides étant donné qu'elle les convertit d'antigènes T-indépendants en antigènes T-dépendants, permettant ainsi la sensibilisation de la mémoire immunologique. La conjugaison est particulièrement utile pour les vaccins pédiatriques [par exemple, référence 16] et il s'agit d'une technique bien connue [par exemple, passée en revue dans les références 17 à 25]. Ainsi, les procédés de l'invention peuvent comprendre l'étape supplémentaire de conjugaison du saccharide purifié à une molécule porteuse.
Le terme « conjugué » fait référence à un saccharide capsulaire chimère lié de façon covalente à une protéine porteuse. Dans certains modes de réalisation, un saccharide capsulaire chimère est directement lié à une protéine porteuse. Dans d'autres modes de réalisation, un saccharide capsulaire chimère est indirectement lié à une protéine par un espaceur ou un lieur. Tel qu'il est utilisé dans le présent document, le terme « directement lié » signifie que les deux entités sont raccordées par une liaison chimique, de préférence une liaison covalente. Tel qu'il est utilisé dans le présent document, le terme « indirectement lié » signifie que les deux entités sont raccordées via une fraction de liaison (par opposition à une liaison covalente directe). Dans certains modes de réalisation, le lieur est le dihydrazide d'acide adipique. Des conjugués représentatifs selon la présente invention comprennent ceux formés par jonction du polysaccharide capsulaire chimère à la protéine porteuse.
La liaison covalente des polysaccharides aux protéines est connue dans la technique et est généralement réalisée par ciblage des amines des lysines, des groupes carboxyliques des acides aspartique/glutamique ou des groupes sulfhydryle des cystéines. Par exemple, les esters de cyanate formés de façon aléatoire à partir des groupes hydroxyle du sucre peuvent être mis en réaction avec les lysines de la protéine ou l'hydrazine d'un espaceur qui sont alors condensées aux acides carboxyliques de la protéine porteuse par la chimie des carbodiimides. En variante, les aldéhydes générés sur un polysaccharide purifié par oxydation du periodate aléatoire peuvent soit être utilisés directement pour l'amination réductive sur les amines de la protéine porteuse, soit être convertis en amines pour l'insertion ultérieure d'un espaceur permettant l'étape de conjugaison à la protéine via la formation d'une liaison thioéther ou amide. Les glycoconjugués obtenus par ces procédés présentent des structures réticulées complexes. Une stratégie visant à simplifier la structure du conjugué final utilise l'hydrolyse partielle du polysaccharide capsulaire purifié et le fractionnement ultérieur pour sélectionner une population de longueur de chaîne intermédiaire. Un groupe amino primaire peut être introduit au niveau des extrémités réductrices de l'oligosaccharide à utiliser finalement pour l'insertion d'un diester ou d'un lieur bifonctionnel prêt pour la conjugaison à la protéine.
Le terme « protéine porteuse » fait référence à une protéine à laguelle le polysaccharide chimère est couplé ou fixé ou conjugué, typiquement afin d'améliorer ou de faciliter la détection de l'antigène par le système immunitaire. Les polysaccharides capsulaires sont des antigènes T-indépendants qui sont faiblement immunogènes et ne conduisent pas à des réponses immunitaires protectrices à long terme. La conjugaison de l'antigène polysaccharidique à une protéine porteuse modifie le contexte dans lequel les cellules effectrices immunitaires répondent aux polysaccharides. Le terme protéine porteuse est destiné à couvrir à la fois des petits peptides et des grands polypeptides (> 10 kDa). La protéine porteuse peut comprendre un ou plusieurs épitopes T-auxiliaires. Le peptide peut être couplé à la protéine porteuse par tout moyen tel qu'une conjugaison chimique.
Des protéines porteuses utiles préférées sont les anatoxines ou toxines bactériennes, par exemple l'anatoxine diphtérique ou l'anatoxine tétanique. Des fragments de toxines ou d'anatoxines peuvent également être utilisés, par exemple, le fragment C de l'anatoxine tétanique [26] . Le mutant CRM197 de l'anatoxine diphtérique [27-29] est particulièrement utile avec l'invention. D'autres protéines porteuses appropriées comprennent la protéine de membrane externe de N. meningitidis [30], des peptides synthétiques [31, 32], des protéines de choc thermique [33, 34], des protéines de la coqueluche [35, 36], des cytokines [37], des lymphokines [37], des hormones [37], des facteurs de croissance [37], la sérum albumine humaine (de préférence recombinante), des protéines artificielles comprenant de multiples épitopes des lymphocytes T CD4+ de différents antigènes dérivés de pathogènes [38] par exemple N19 [39], la protéine D d'H. influenzae [40, 41], la protéine de surface pneumococcique PspA [42], la pneumolysine [43], les protéines de capture du fer [44], la toxine A ou B de C. difficile [45], l'exoprotéine A recombinante de Pseudomonas aeruginosa (rEPA) [46], une protéine du SGB [123], etc.
Des protéines porteuses particulièrement appropriées comprennent CRM197, l'anatoxine tétanique (TT), le fragment C de l'anatoxine tétanique, la protéine D, des mutants non toxiques de la toxine tétanique et de l'anatoxine diphtérique (DT). On a observé que la préexposition au support pouvait, dans certains cas, conduire à la réduction de la réponse immunitaire anti-hydrate de carbone contre les vaccins glycoconjugués (suppression de l'épitope du support). L'utilisation de variantes aux DT, TT et CRM197, généralement utilisées dans la fabrication de la plupart des vaccins glycoconjugués actuellement sur le marché, pourrait être une manière d'éviter cette possibilité. D'autres protéines porteuses appropriées comprennent les antigènes protéiques GBS80, GBS67 et GBS59 de Streptococcus agalactiae. D'autres protéines porteuses appropriées comprennent les protéines de fusion, par exemple, GBS59(6xD3) divulguée dans le document WO2011/121576 et GBS59(6xD3)-1523 divulguée dans le document EP1417 9945.2. L'utilisation de ces antigènes protéiques du SGB peut être avantageuse pour un vaccin contre le SGB parce que, contrairement aux porteurs hétérologues tels que CRM197, la protéine possède un rôle duel d'augmentation de l'immunogénicité du polysaccharide tout en provoquant également une réponse immunitaire protectrice. Par conséquent, la réponse immunologique élicitée contre le support peut fournir une réponse immunologique protectrice supplémentaire contre le SGB, particulièrement contre une protéine du SGB.
La conjugaison de saccharides du SGB a été largement rapportée, par exemple, voir la référence 1. Le procédé classique de la technique antérieure pour la conjugaison de saccharide du SGB implique typiquement l'amination réductrice d'un saccharide purifié à une protéine porteuse, telle que l'anatoxine tétanique (TT) ou CRM197 [2]. L'amination réductrice implique un groupe amine sur la chaîne latérale d'un acide aminé dans le support et un groupe aldéhyde dans le saccharide. Un groupe aldéhyde peut être généré avant la conjugaison par oxydation (par exemple, oxydation du periodate) d'une partie (par exemple, entre 5 et 40 %, particulièrement entre 10 et 30 %, de préférence environ 20 %) des résidus acide sialique du saccharide [2, 47] . Une variante de procédé de conjugaison implique l'utilisation de groupes -NH2 dans le saccharide (soit de la dé-N-acétylation, soit après l'introduction d'amines) conjointement à des lieurs bifonctionnels, tel que ceci est décrit dans la référence 48. Dans certains modes de réalisation, un ou plusieurs des conjugués de la présente invention ont été préparés de cette manière. Une autre variante de procédé est décrite dans le document WO96/40795 et par Michon et al. (2006) Clin Vaccine Immunol 2006 August ; 13(8) : 936-43.
La fixation au support est de préférence via un groupe -NH2, par exemple, dans la chaîne latérale d'un résidu lysine dans une protéine porteuse, ou d'un résidu arginine, ou au niveau de l'extrémité N terminale. La fixation peut aussi être réalisée via un groupe -SH, par exemple, dans la chaîne latérale d'un résidu cystéine.
Des conjugués avec un rapport saccharide/protéine (p/p) entre 1/5 (en d'autres termes protéine en excès) et 5/1 (en d'autres termes saccharide en excès) sont typiquement utilisés, en particulier des rapports compris entre 1/5 et 2/1, entre environ 1/1 et 1/2, particulièrement d'environ 1/1,3, entre environ 1/1 et 1/2, en particulier d'environ 1/1,3, entre environ 3/1 et 1/1, en particulier d'environ 2/1, entre environ 1/1 et 1/5, en particulier d'environ 1/3,3, entre environ 2/1 et 1/1, en particulier environ 1,1/1. Ainsi, un excès en poids de saccharide est typique, notamment avec des chaînes saccharidiques plus longues.
Les compositions peuvent inclure une petite quantité de support libre [49]. Lorsqu'une protéine porteuse donnée est présente sous sa forme libre et sous sa forme conjuguée dans une composition de l'invention, la forme non conjuguée ne représente de préférence pas plus de 5 % de la quantité totale de la protéine porteuse dans la composition dans sa totalité, et est de manière davantage préférée présente à moins de 2 % en poids.
Après la conjugaison, les saccharides libres et conjugués peuvent être séparés. Il existe un grand nombre de procédés appropriés, y compris la chromatographie hydrophobe, l'ultrafiltration tangentielle, la diafiltration etc. [voir également les références 50 & 51, etc.]. Un procédé préféré est décrit dans la référence 52.
Compositions immunogènes
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une composition immunogène comprenant un conjugué qui est un saccharide capsulaire chimère de l'invention conjugué à une protéine porteuse. Les compositions immunogènes peuvent comprendre plus d'un conjugué. Les modes de réalisation de l'invention peuvent comprendre deux, trois, quatre, cinq ou six conjugués comprenant différents types de polysaccharides capsulaires chimères.
Dans certains modes de réalisation, les compositions immunogènes ne comprendront pas de conjugués autres que ceux spécifiquement mentionnés. Cependant, dans certains modes de réalisation, les compositions peuvent comprendre d'autres conjugués. Les compositions immunogènes peuvent comprendre toute quantité appropriée du (des) saccharide(s) capsulaire(s) chimère(s) par dose unitaire. Des quantités appropriées du (des) saccharide(s) capsulaires peuvent varier de 0,1 à 50 yg par dose unitaire. Typiquement, chaque saccharide capsulaire chimère est présent en une quantité de 1 à 30 yg, par exemple de 2 à 25 yg, et en particulier de 5 à 20 yg. Des quantités appropriées du (des) saccharides capsulaire (s) peuvent comprendre 5, 10 et 20 yg par dose unitaire.
Des procédés d'administration des compositions immunogènes de l'invention sont abordés ci-dessous. Brièvement, les compositions immunogènes de l'invention peuvent être administrées en doses uniques ou multiples. Les inventeurs ont découvert que l'administration d'une dose unique des compositions immunogènes de l'invention était efficace. En variante, une dose unitaire suivie d'une seconde dose unitaire peut être efficace. Typiquement, la deuxième (ou troisième, quatrième, cinquième, etc.) dose unitaire est identique à la première dose unitaire. La seconde dose unitaire peut être administrée à un moment approprié après la première dose unitaire, en particulier après l, 2 ou 3 mois. Typiquement, les compositions immunogènes de l'invention seront administrées par voie intramusculaire, par exemple, par administration intramusculaire dans la cuisse ou le bras tel que décrit ci-dessus.
Les compositions immunogènes de l'invention peuvent comprendre un ou plusieurs adjuvants. Cependant, l'utilisation de compositions non adjuvantées est également envisagée, par exemple, il peut être avantageux de ne pas inclure d'adjuvant en vue de réduire la toxicité potentielle. En conséquence, des compositions immunogènes qui ne contiennent pas d'adjuvant du tout ou qui ne contiennent pas d'adjuvant sel d'aluminium sont envisagées.
Combinaisons de conjugués et autres antigènes
Les compositions immunogènes de l'invention peuvent comprendre un ou plusieurs antigènes supplémentaires.
Le ou les antigènes supplémentaires peuvent comprendre en outre des conjugués du SGB. Les différents conjugués du SGB peuvent comprendre différents types de conjugués du même sérotype du SGB et/ou des conjugués de différents sérotypes du SGB. La composition sera typiquement produite par préparation de conjugués distincts (par exemple, un conjugué différent pour chaque sérotype) puis par combinaison des conjugués.
Le ou les antigènes supplémentaires peuvent comprendre des séquences d'acides aminés du SGB, telles qu'exposées ci-dessous.
Le ou les antigènes supplémentaires peuvent comprendre des antigènes de pathogènes autres que le SGB. Ainsi, les compositions immunogènes de l'invention peuvent en outre comprendre un ou plusieurs antigènes autres que le SGB, y compris des antigènes bactériens, viraux ou parasitaires supplémentaires. Ceux-ci peuvent être sélectionnés parmi les suivants : un antigène protéique de N. meningitidis sérogroupe B, par exemple ceux proposés dans les références 53 à 59, avec la protéine '287' (voir ci-dessous) et ses dérivés (par exemple, 'Δ287') étant particulièrement préférés. - une préparation à base de vésicules de membrane externe (OMV) de N. meningitidis sérogroupe B, comme celles décrites dans les références 60, 61, 62, 63 etc. un antigène saccharidique de N. meningitidis sérogroupe A, C, W135 et/ou Y, comme les oligosaccharides décrits dans la référence 64 du sérogroupe C ou les oligosaccharides de la référence 65. un antigène saccharidique de Streptococcus pneumoniae [par exemple, les références 66-68 ; chapitre 22 & 23 de la référence 75]. un antigène du virus de l'hépatite A, par exemple un virus inactivé [par exemple, 69, 70 ; chapitre 15 de la référence 75]. - un antigène du virus de l'hépatite B, tel que des antigènes de surface et/ou capsidiques [par exemple, 70, 71 ; chapitre 16 de la référence 75]. un antigène du virus de l'hépatite C [par exemple, 72] . - un antigène de Bordetella pertussis, tel que l'holotoxine de la coqueluche (PT) et 1'hémagglutinine filamenteuse (FHA) de B. pertussis, facultativement aussi en combinaisons avec la pertactine et/ou les agglutinogènes 2 et 3 [par exemple, les références 73 & 74 ; chapitre 21 de la référence 75]. un antigène de la diphtérie, tel qu'une anatoxine diphtérique (par exemple, chapitre 13 de la référence 75]. un antigène tétanique, tel qu'une anatoxine tétanique [par exemple, chapitre 27 de la référence 75]. un antigène saccharidique d' Haemophilus influenzae B [par exemple, chapitre 14 de la référence 75] - un antigène de N. gonorrhoeae [par exemple, 53, 54, 55] . - un antigène de Chlamydia pneumoniae [par exemple, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82]. un antigène de Chlamydia trachomatis [par exemple, 83]. un antigène de Porphyromonas gingivalis [par exemple, 84]. - un (des) antigène(s) de la polio [par exemple, 85, 86 ; chapitre 24 de la référence 75] par exemple l'IPV. - un (des) antigène(s) de la rage [par exemple, 87] tel qu'un virus inactivé lyophilisé [par exemple, 88 RabAvert™]. - des antigènes de la rougeole, des oreillons et/ou de la rubéole [par exemple, chapitres 19, 20 et 26 de la référence 75]. - un (des) antigène(s) de la grippe [par exemple, chapitre 17 & 18 de la référence 75], tels que les protéines de surface hémagglutinine et/ou neuraminidase. un antigène de Moraxella catarrhalis [par exemple, 89]. un antigène de Streptococcus pyogenes (streptocoque du groupe A) [par exemple, 90, 91, 92]. un antigène de Staphylococcus aureus [par exemple, 93] .
Lorsqu'un antigène saccharidique ou glucidique est utilisé, il est de préférence conjugué à un support pour améliorer l'immunogénicité. La conjugaison des antigènes saccharidiques de H. influenzae B, méningococciques et pneumococciques est bien connue. Les antigènes protéiques toxiques peuvent être détoxifiés si besoin (par exemple, détoxification de la toxine de la coqueluche par des moyens chimiques et/ou génétiques [74]).
Lorsqu'un antigène diphtérique est inclus dans la composition, un antigène du tétanos et au moins un antigène de la coqueluche peuvent également être inclus. De manière similaire, lorsqu'un antigène tétanique est inclus, des antigènes de la diphtérie et de la coqueluche peuvent aussi être inclus. De manière similaire, lorsqu'un antigène de la coqueluche est inclus, des antigènes diphtériques et tétaniques peuvent aussi être inclus.
Les antigènes peuvent être adsorbés à un sel d'aluminium. Lorsqu'il y a plus d'un conjugué dans une composition, il n'est pas nécessaire qu'ils soient tous absorbés.
Un type de composition préféré comprend d'autres antigènes de pathogènes sexuellement transmissibles, tels que : herpesvirus ; N. gonorrhoeae ; C. trachomatis ; etc. Un autre type de composition préférée comprend d'autres antigènes qui affectent les personnes âgées et/ou immunodéprimées, et ainsi les antigènes du SGB de l'invention peuvent être combinés avec un ou plusieurs antigènes des pathogènes non SGB suivants : virus de la grippe, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Pseudomonas aeruginosa, Légionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis, et virus parainfluenza.
Les antigènes dans la composition seront typiquement présents en une concentration d'au moins 1 yg/mL chacun. En général, la concentration de tout antigène donné sera suffisante pour éliciter une réponse immunitaire contre cet antigène.
En variante à l'utilisation d'antigènes protéiques dans la composition de l'invention, l'acide nucléique codant pour l'antigène peut être utilisé [par exemple, références 94 à 102] . Les composants protéiques des compositions de l'invention peuvent ainsi être remplacés par un acide nucléique (de préférence l'ADN par exemple sous la forme d'un plasmide) qui code pour la protéine.
En termes pratiques, il peut y avoir une limite supérieure au nombre d'antigènes inclus dans les compositions de l'invention. Le nombre d'antigènes (y compris des antigènes du SGB) dans une composition de l'invention peut être inférieur à 20, inférieur à 19, inférieur à 18, inférieur à 17, inférieur à 16, inférieur à 15, inférieur à 14, inférieur à 13, inférieur à 12, inférieur à 11, inférieur à 10, inférieur à 9, inférieur à 8, inférieur à 7, inférieur à 6, inférieur à 5, inférieur à 4, inférieur à 3, ou inférieur à 2. Le nombre d'antigènes du SGB dans une composition de l'invention peut être inférieur à 6, inférieur à 5, inférieur à 4, inférieur à 3, ou inférieur à 2.
Procédés pharmaceutiques et utilisations
Les compositions immunogènes de l'invention peuvent en outre comprendre un support pharmaceutiquement acceptable. Des « supports pharmaceutiquement acceptables » typiques comprennent tout support qui n'induit pas lui-même la production d'anticorps nuisibles à l'individu recevant la composition. Des supports appropriés sont typiquement de grandes macromolécules lentement métabolisées telles que des protéines, des polysaccharides, des acides polylactiques, des acides polyglycoliques, des acides aminés polymères, des copolymères d'acides aminés, le saccharose [103], le tréhalose [104], le lactose, et des agrégats lipidiques (tels que des gouttelettes d'huile ou des liposomes). Ces supports sont bien connus des hommes du métier. Les vaccins peuvent également contenir des diluants, tels que l'eau, une solution saline, le glycérol, etc. En outre, des substances auxiliaires, telles que des agents mouillants ou émulsifiants, des substances tampons du pH, et équivalents, peuvent être présentes. Une solution saline physiologique, tamponnée au phosphate, apyrogène et stérile est un support typique. Une discussion détaillée relative aux excipients pharmaceutiquement acceptables est disponible dans la référence 105.
Les compositions de l'invention peuvent se trouver sous une forme aqueuse (en d'autres termes, solutions ou suspensions) ou sous une forme sèche (par exemple, lyophilisée). Si un vaccin sec est utilisé, alors il sera reconstitué dans un milieu liquide avant l'injection. La lyophilisation des vaccins conjugués est connue dans l'art, par exemple le produit Menjugate™ se présente sous une forme lyophilisée. Lorsque les compositions immunogènes de l'invention comprennent des conjugués comprenant plus d'un type de saccharide capsulaire chimère, il est typique que les conjugués soient préparés séparément, mélangés puis lyophilisés. De cette manière, des compositions lyophilisées comprenant deux, trois ou quatre etc. conjugués tels que décrits dans le présent document peuvent être préparées. Pour stabiliser les conjugués durant la lyophilisation, il peut être préféré d'inclure un polyol (par exemple, du mannitol) et/ou un disaccharide (par exemple, le saccharose ou le tréhalose) par exemple entre 1 mg/mL et 30 mg/mL (par exemple, environ 25 mg/mL) dans la composition. L'utilisation de saccharose a été recommandée en tant que stabilisant pour les vaccins conjugués contre le SGB (référence 106) . Cependant, il est typique que le stabilisant de la présente invention soit le mannitol. Lorsque le vaccin sec est reconstitué dans un milieu liquide avant l'injection, la concentration de mannitol résiduel sera typiquement d'environ 2 à 20 mg/mL, par exemple, 3,75 mg/mL, 7,5 mg/mL ou 15 mg/mL. L'utilisation de mannitol est avantageuse parce que le mannitol est chimiquement différent des unités répétées monosaccharidiques des saccharides capsulaires du SGB. Ceci signifie que la détection des saccharides capsulaires, par exemple, pour l'analyse de contrôle qualité, peut être basée sur la présence des unités répétées des saccharides sans interférence du mannitol. En revanche, un stabilisant tel que le saccharose contient du glucose, qui peut interférer avec la détection d'unités répétées de glucose dans les saccharides.
Les compositions peuvent se présenter dans des flacons, ou elles peuvent se présenter dans des seringues pré-remplies. Les seringues peuvent ou non être dotées d'aiguilles. Une seringue comprendra une dose unique de la composition, alors qu'un flacon peut comprendre une dose unique ou des doses multiples.
Les compositions aqueuses de l'invention sont également appropriées pour la reconstitution d'autres vaccins à partir d'une forme lyophilisée. Lorsqu'une composition de l'invention est destinée à être utilisée pour une telle reconstitution extemporanée, l'invention fournit un kit, qui peut comprendre deux flacons, ou peut comprendre une seringue pré-remplie et un flacon, le contenu de la seringue étant utilisé pour réactiver le contenu du flacon avant l'injection.
Les compositions de l'invention peuvent être emballées sous la forme d'une dose unique ou sous la forme de doses multiples. Pour les formes de doses multiples, on préfère les flacons aux seringues préremplies. Des volumes de dosage efficaces peuvent être établis en routine, mais une dose humaine typique de la composition a un volume de 0,5 mL par exemple, pour une injection intramusculaire.
Le pH de la composition est de préférence compris entre 6 et 8, et est de préférence d'environ 7. Le pH peut être maintenu stable par l'utilisation d'un tampon. Les compositions immunogènes de l'invention comprennent typiquement un tampon dihydrogénophosphate de potassium. Le tampon dihydrogénophosphate de potassium peut comprendre environ 1 à 10 mM de dihydrogénophosphate de potassium, par exemple, 1,25 mM, 2,5 mM ou 5,0 mM. Si une composition comprend un sel d'hydroxyde d'aluminium, on préfère utiliser un tampon histidine [107] . La composition peut être stérile et/ou apyrogène. Les compositions de l'invention peuvent être isotoniques relativement aux humains.
Les compositions de l'invention sont immunogènes, et sont de manière davantage préférée des compositions de vaccin. Les vaccins selon l'invention peuvent être soit prophylactiques (en d'autres termes, ils préviennent l'infection) soit thérapeutiques (en d'autres termes, ils traitent l'infection), mais ils seront typiquement prophylactiques. Les compositions immunogènes utilisées comme vaccins comprennent une quantité immunologiquement efficace d'antigène (s), ainsi que d'autres composants, au besoin. Par « quantité immunologiquement efficace », on entend que l'administration de cette quantité à un individu, en une dose unique ou comme une partie d'une série de doses, est efficace pour le traitement ou la prévention. Cette quantité varie en fonction de la santé et de la condition physique de l'individu à traiter, de l'âge, du groupe taxonomique de l'individu à traiter (par exemple, un primate non humain, un primate, etc.), de la capacité du système immunitaire de l'individu à synthétiser les anticorps, du degré de protection souhaité, de la formulation du vaccin, de l'évaluation de la situation médicale par le médecin traitant, et d'autres facteurs pertinents. On s'attend à ce qu'une quantité thérapeutiquement efficace tombe dans une plage relativement vaste qui peut être déterminée par des essais en routine. À l'intérieur de chaque dose, la quantité d'un antigène saccharidique individuel sera généralement comprise entre 0,1 et 50 yg (mesuré comme la masse de saccharide), notamment entre 1 et 50 yg ou 0,5 et 25 yg, plus particulièrement entre 2,5 et 7,5 yg, par exemple, environ 1 yg, environ 2,5 yg, environ 5 yg, environ 10 yg, environ 15 yg, environ 20 yg ou environ 25 yg. À l'intérieur de chaque dose, la quantité totale de saccharides capsulaires chimères sera généralement ^ 70 yg (mesurée comme la masse de saccharide), par exemple, ^ 60 yg. En particulier, la quantité totale peut être ^ 40 yg (par exemple, ^ 30 yg) ou ^ 20 yg (par exemple, < 15 yg) . Il peut être avantageux de minimiser la quantité totale de saccharide(s) capsulaire(s) chimère(s) par dose unitaire de manière à réduire la toxicité potentielle. En conséquence, une quantité totale ^ 20 yg peut être utilisée, par exemple, ^ 15 yg, < 7,5 yg ou < 1,5 yg.
Le SGB et Streptococcus pneumoniae affectent différentes zones du corps et ainsi les compositions de l'invention peuvent être préparées sous différentes formes. Par exemple, les compositions peuvent être préparées sous la forme de produits injectables, soit comme des solutions soit comme des suspensions liquides. La composition peut être préparée pour une administration pulmonaire, par exemple, sous la forme d'un inhalateur, en utilisant une poudre fine ou une pulvérisation. La composition peut être préparée sous la forme d'un suppositoire ou d'un pessaire. La composition peut être préparée pour une administration nasale, auriculaire ou oculaire, par exemple, sous la forme de pulvérisation, de gouttes, de gel ou de poudre [par exemple, références 108 &amp; 109]. Le succès de l'administration nasale des saccharides pneumococciques [110, 111], des saccarides Hib [112], des saccharides MenC [113], et des mélanges de conjugués de saccharides Hib et MenC [114] a été rapporté.
Les compositions de l'invention peuvent comprendre un antimicrobien, notamment lorsqu'elles sont emballées en un format de doses multiples. Les compositions de l'invention peuvent comprendre un détergent, par exemple, un Tween (polysorbate), tel que le Tween 80. Les détergents sont généralement présents à de faibles niveaux, par exemple, < 0,01 %. Les compositions de l'invention peuvent comprendre des sels de sodium (par exemple, le chlorure de sodium) pour conférer une tonicité. Une concentration de 10 1 2 mg/mL de NaCl est typique. Dans certains modes de réalisation, une concentration de 4 à 10 mg/mL de NaCl peut être utilisée, par exemple, 9,0, 7,0, 6,75 ou 4,5 mg/mL. Les compositions de l'invention comprendront généralement un tampon. Un tampon phosphate est typique. Les compositions de l'invention peuvent être administrées conjointement à d'autres agents immunorégulateurs. En particulier, les compositions peuvent comprendre un ou plusieurs adjuvants. Ces adjuvants sont connus dans l'art et comprennent, de manière non restrictive, des sels d'aluminium tels que l'alun et MF59.
Procédé de traitement L'invention concerne également un procédé destiné à développer une réponse immunitaire chez un mammifère approprié, comprenant l'administration d'une composition pharmaceutique de l'invention au mammifère. La réponse immunitaire est de préférence protectrice et implique de préférence des anticorps. Plus particulièrement, la réponse immunitaire est protectrice contre au moins deux sérotypes du SGB différents et implique de préférence des anticorps contre au moins deux sérotypes du SGB respectivement. Le procédé peut induire une réponse anamnestique.
Le mammifère approprié est de préférence un être humain. Lorsque le vaccin est destiné à une utilisation prophylactique l'être humain est de préférence un enfant (par exemple, un jeune enfant ou un nourrisson) ou un adolescent ; lorsque le vaccin est destiné à une utilisation thérapeutique, l'être humain est de préférence un adulte. Un vaccin destiné à un enfant peut également être administré aux adultes, par exemple, pour évaluer la tolérance, la posologie, l'immunogénicité, etc. Une classe préférée d'êtres humains pour le traitement est représenté par les femmes en âge de procréer (par exemple, les adolescentes et femmes plus âgées) . Une autre classe préférée comprend les femmes enceintes. Les patients âgés (par exemple, ceux âgés de plus de 50, 60, 70, 80 ou 90 etc. ans, notamment de plus de 65 ans), notamment ceux vivants dans des maisons de repos où le risque d'infection par le SGB peut être accru ([115]), sont une autre classe préférée d'êtres humains pour le traitement. Les nouveau-nés de femmes avec un (des) niveau(x) non détectable (s) d'anticorps contre le(s) saccharide (s) capsulaire (s) du SGB peuvent avoir des taux plus élevés d'infections par le SGB. Ceci est dû au fait que des niveaux plus élevés d'anticorps maternels contre les saccharides sont corrélés à un risque réduit de maladie chez les nouveau-nés [références 116 et 117]. En conséquence, l'administration à ces femmes est spécifiquement envisagée dans la présente invention. L'invention concerne également une composition de l'invention destinée à être utilisée en tant que médicament, par exemple, un vaccin. Le médicament est de préférence capable de monter une réponse immunitaire chez un mammifère approprié (en d'autres termes, il s'agit d'une composition immunogène) et il est de manière davantage préférée un vaccin. L'invention concerne en outre l'utilisation d'une composition de l'invention dans la fabrication d'un médicament destiné à monter une réponse immunitaire chez un mammifère approprié.
Ces utilisations et ces procédés peuvent être destinés à la prévention et/ou au traitement d'une maladie provoquée par S. agalactiae par exemple, le sepsis néonatal ou une bactériémie, la pneumonie néonatale, la méningite néonatale, l'endométrite, l'ostéomyélite, l'arthrite septique, etc. Ces utilisations et ces procédés sont de préférence pour la prévention et/ou le traitement d'une maladie provoquée par S. pneumoniae, par exemple, la bronchite, la rhinite, la sinusite aiguë, l'otite moyenne, la conjonctivite, la méningite, la bactériémie, le sepsis, l'ostéomyélite, l'arthrite septique, l'endocardite, la péritonite, la péricardite, la cellulite, et un abcès cérébral.
Le sujet chez lequel la maladie fait l'objet d'une prévention peut n'être pas le même que le sujet qui reçoit le conjugué de l'invention. Par exemple, un conjugué peut être administré à une femme (avant ou pendant la grossesse) en vue de protéger sa progéniture (ce qu'on appelle l'« immunisation maternelle » [118-120]) .
Une manière de vérifier l'efficacité du traitement thérapeutique implique la surveillance de l'infection par le SGB après l'administration de la composition de l'invention. Une manière de vérifier l'efficacité du traitement prophylactique implique la surveillance des réponses immunitaires contre, par exemple, les antigènes du SGB après l'administration de la composition.
Les compositions préférées de l'invention peuvent conférer un titre en anticorps à un patient qui est supérieur au critère de séroprotection pour chaque composant antigénique pour un pourcentage acceptable de sujets humains. Les antigènes avec un titre en anticorps associé au-dessus duquel un hôte est considéré séroconverti contre l'antigène sont bien connus, et ces titres sont publiés par des organisations telles que l'OMS. De préférence, plus de 80 % d'un échantillon statistiquement significatif de sujets sont séroconvertis, de manière davantage préférée plus de 90 %, de manière encore davantage préférée plus de 93 % et idéalement de 96 à 100 %.
Les compositions de l'invention seront généralement administrées directement à un patient. L'administration directe peut être réalisée par injection parentérale (par exemple, sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire, ou dans l'espace interstitiel d'un tissu), ou par administration rectale, orale, vaginale, topique, transdermique, intranasale, oculaire, auriculaire, pulmonaire ou muqueuse autre. L'administration intramusculaire dans la cuisse ou dans le bras est préférée. L'injection peut être réalisée via une aiguille (par exemple, une aiguille hypodermique), mais une injection sans aiguille peut en variante être utilisée. Une dose intramusculaire typique est 0,5 mL. L'invention peut être utilisée pour éliciter une immunité systémique et/ou muqueuse.
Le schéma posologique peut être un régime de dose unique ou un régime de doses multiples. Les doses multiples peuvent être utilisées dans un régime d'immunisation primaire et/ou un régime d'immunisation de rappel. Un régime de dose primaire peut être suivi par un régime de dose de rappel. Un intervalle approprié entre les doses de sensibilisation (par exemple entre 4 et 16 semaines) et entre la sensibilisation et le rappel peut être déterminé en routine.
Antigènes protéiques du SGB
Tel que ceci a été mentionné ci-dessus, pour la protection contre le SGB, des protéines du SGB peuvent être incluses dans des compositions de l'invention. Celles-ci peuvent être utilisées en tant que protéines porteuses pour les conjugués de l'invention, en tant que protéines porteuses pour d'autres conjugués, ou en tant qu'antigènes protéiques non conjugués.
Les antigènes protéiques du SGB pour leur utilisation avec l'invention comprennent également ceux décrits dans les références 90 et 121 à 123. Deux antigènes protéiques du SGB particuliers pour leur utilisation avec l'invention sont connus comme : GBS67 ; et GBS80 [voir la référence 90] . Un autre antigène protéique de SGB préféré pour son utilisation avec l'invention est connu comme Spbl [voir la référence 124] . Les protéines de fusion du SGB particulières pour leur utilisation dans l'invention comprennent GBS59(6xD3) et GBS59(6xD3)-1523. D'autres détails relatifs à ces antigènes sont proposés ci-dessous.
Les séquences de ces protéines sont fournies dans SEQ ID NO : 1 à 22 dans le présent document. Les compositions de l'invention peuvent comprendre (a) un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi SEQ ID NO : là 22, et/ou (b) un polypeptide comprenant (i) une séquence d'acides aminés qui présente une identité de séquence avec une ou plusieurs de SEQ ID NO : 1 à 22 et/ou (ii) un fragment de SEQ ID NO : 1 à 22.
Les compositions de l'invention peuvent également comprendre des mélanges de ces antigènes protéiques du SGB.
En particulier, les compositions de l'invention peuvent comprendre : (ai) un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, et/ou (bi) un polypeptide comprenant (i) une séquence d'acides aminés qui présente une identité de séquence avec SEQ ID NO : 1 et/ou (ii) un fragment de SEQ ID NO : 1 ; (a2) un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 7, et/ou (b2) un polypeptide comprenant (i) une séquence d'acides aminés qui présente une identité de séquence avec SEQ ID NO : 7 et/ou (ii) un fragment de SEQ ID NO : 7 ; et (a3) un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 13, et/ou (b3) un polypeptide comprenant (i) une séquence d'acides aminés qui présente une identité de séquence avec SEQ ID NO : 13 et/ou (ii) un fragment de SEQ ID NO : 13 ; et ( a4 ) un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 17, et/ou (b3) un polypeptide comprenant (i) une séquence d'acides aminés qui présente une identité de séquence avec SEQ ID NO : 17 ; et (as) un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 22, et/ou (b3) un polypeptide comprenant (i) une séquence d'acides aminés qui présente une identité de séquence avec SEQ ID NO : 22.
En fonction de la SEQ ID NO particulière, le degré d'identité de séquence dans (i) est de préférence supérieur à 50 % (par exemple, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou plus) . Ces polypeptides comprennent des homologues, des orthologues, des variants alléliques et des mutants fonctionnels. Typiquement, une identité de 50 % ou plus entre deux séquences polypeptidiques est considérée comme une indication d'une équivalence fonctionnelle. L'identité entre les polypeptides est de préférence déterminée par l'algorithme de recherche d'homologie de Smith-Waterman tel qu'il est implémenté dans le programme de MPSRCH (Oxford Molecular), en utilisant une recherche de gap affine avec les paramètres pénalité d'ouverture de gap = 12 et pénalité d'extension de gap = 1.
En fonction de la SEQ ID NO particulière, les fragments de (ii) devraient comprendre au moins n acides aminés consécutifs des séquences et, en fonction de la séquence particulière, n vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou plus) . Le fragment peut comprendre au moins un épitope de lymphocyte T ou, de préférence, un épitope de lymphocytes B de la séquence. Les épitopes des lymphocytes T et B peuvent être identifiés empiriquement (par exemple, en utilisant PEPSCAN [125, 126] ou des procédés similaires), ou ils peuvent être prédits (par exemple, en utilisant l'indexation antigénique de Jameson-Wolf [127], des approches basées sur une matrice [128], TEPITOPE [129], des réseaux neuraux [130], OptiMer &amp; EpiMer [131, 132], ADEPT [133], Tsites [134], 1'hydrophilicité [135], l'indexation antigénique [136] ou les procédés décrits dans la référence 137 etc.). Le retrait d'un ou de plusieurs domaines, par exemple le peptide signal N-terminal, une région de séquence signal ou de tête, une région transmembranaire, une région cytoplasmique ou un motif d'ancrage à la paroi cellulaire peuvent être utilisés.
Ces polypeptides peuvent, comparé à SEQ ID NO : 1 à 22, comprendre un ou plusieurs (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) remplacements d'acides aminés conservatifs, en d'autres termes, remplacements d'un acide aminé par un autre qui a une chaîne latérale apparentée. Les acides aminés génétiquement codés sont généralement divisés en quatre familles : (1) acides, en d'autres termes, aspartate, glutamate ; (2) basiques, en d'autres termes, lysine, arginine, histidine ; (3) non polaires, en d'autres termes, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phénylalanine, méthionine, tryptophane ; et (4) polaires non chargés, en d'autres termes, glycine, asparagine, glutamine, cystine, sérine, thréonine, tyrosine. La phénylalanine, le tryptophane, et la tyrosine sont parfois classés conjointement comme des acides aminés aromatiques. En général, la substitution d'acides aminés uniques à l'intérieur de ces familles n'a pas d'effet majeur sur l'activité biologique. Les polypeptides peuvent également comprendre une ou plusieurs (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) délétions d'acides aminés uniques relativement à SEQ ID NO : 1 à 22. Les polypeptides peuvent également comprendre une ou plusieurs (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) insertions (par exemple, chacune de 1, 2, 3, 4 ou 5 acides aminés) relativement aux SEQ ID NO : 1 à 22.
Les polypeptides de l'invention peuvent être préparés d'un grand nombre de manières, par exemple, par synthèse chimique (en totalité ou en partie), par digestion de polypeptides plus longs en utilisant des protéases, par traduction à partir d'ARN, par purification d'une culture cellulaire (par exemple, d'une expression par voie de recombinaison), de l'organisme lui-même (par exemple, après une culture bactérienne, ou directement de patients), etc. Un procédé préféré de production de peptides d'une longueur <40 acides aminés implique la synthèse chimique in vitro [138, 139] . La synthèse de peptides en phase solide est particulièrement préférée, par exemple des procédés basés sur la chimie Boc ou Fmoc [140] . La synthèse enzymatique [141] peut également être utilisée en partie ou en totalité. En variante à la synthèse chimique, la synthèse biologique peut être utilisée, par exemple, les polypeptides peuvent être produits par traduction. Cela peut être réalisé in vitro ou in vivo. Les procédés biologiques se limitent en général à la production de polypeptides basés sur des acides L-aminés, mais la manipulation de la machinerie de traduction (par exemple, de molécules d'aminoacyl-ARNt) peut être utilisée pour permettre l'introduction d'acides D-aminés (ou d'autres acides aminés non naturels, tels que 1'iodotyrosine ou la méthylphénylalanine, l'azidohomoalanine, etc.) [142]. Lorsque des acides D-aminés sont inclus, cependant, on préfère utiliser la synthèse chimique. Les polypeptides de l'invention peuvent avoir des modifications covalentes au niveau de l'extrémité C-terminale et/ou de l'extrémité N-terminale.
Si ces protéines du SGB sont incluses dans les compositions de l'invention, alors elles peuvent prendre différentes formes (par exemple, natives, fusions, glycosylées, non glycosylées, lipidées, non lipidées, phosphorylées, non phosphorylées, myristoylées, non myristoylées, monomères, multimères, particulaires, dénaturées, etc.). Elles sont de préférence utilisées sous une forme purifiée ou sensiblement purifiée, en d'autres termes, sensiblement dépourvue d'autres polypeptides (par exemple, dépourvue de polypeptides naturels), notamment d'autres polypeptides du SGB ou de cellules hôtes). GBS67
Les séquences nucléotidiques et d'acides aminés de GBS67 séquencées à partir de la souche 2603 V/R sérotype V sont exposées dans la référence 90 comme SEQ ID NO : 3745 &amp; 3746. La séquence d'acides aminés est SEQ ID NO : 1 dans le présent document :
GBS67 contient une région transmembranaire C-terminale qui est indiquée par la région soulignée la plus proche de l'extrémité C-terminale de SEQ ID NO : 1 ci-dessus. Un ou plusieurs acides aminés de la région transmembranaire peuvent être retirés, ou l'acide aminé peut être tronqué avant la région transmembranaire. Un exemple d'un tel fragment de GBS67 est exposé ci-dessous comme SEQ ID NO : 2.
GBS67 contient un motif d'acide aminé indiquant un ancrage à la paroi cellulaire, présenté en italique dans SEQ ID NO : 1 ci-dessus. Dans certains systèmes de cellules hôtes recombinantes, il peut être préférable de retirer ce motif pour faciliter la sécrétion d'une protéine GBS67 recombinante de la cellule hôte. En conséquence, dans un fragment préféré de GBS67 pour son utilisation dans l'invention, la région transmembranaire et le motif d'ancrage à la paroi cellulaire sont retirés de GBS67. Un exemple d'un tel fragment de GBS67 est exposé ci-dessous comme SEQ ID NO : 3.
En variante, dans certains systèmes de cellules hôtes recombinantes, il peut être préférable d'utiliser le motif d'ancrage à la paroi cellulaire pour ancrer la protéine exprimée par voie de recombinaison à la paroi cellulaire. Le domaine extracellulaire de la protéine exprimée peut être clivé durant la purification ou la protéine recombinante peut être laissée attachée aux cellules hôtes inactivées ou aux membranes cellulaires dans la composition finale.
Trois motifs piline, contenant des résidus lysine conservés ont été identifiés dans GBS67. Les résidus lysine conservés se situent au niveau des résidus acides aminés 478 et 488, au niveau des résidus acides aminés 340 et 342, et au niveau des résidus acides aminés 703 et 717. Les séquences de la piline, en particulier les résidus lysine conservés, sont supposées être importants pour la formation des structures oligomères de type pilus de GBS67. Les fragments préférés de GBS67 comprennent au moins un résidu lysine conservé. Deux boîtes E contenant des résidus glutamiques conservés ont également été identifiées dans GBS67. Les fragments préférés de GBS67 comprennent au moins un résidu acide glutamique conservé. GBS67 contient plusieurs régions dont il est prédit qu'elles formeront des structures hélicoïdales alpha. Ces régions hélicoïdales alpha sont susceptibles de former des structures à enroulement hélicoïdal et peuvent être impliquées dans 1'oligomérisation de GBS67. GBS67 contient également une région qui est homologue au domaine Cna_B de la protéine de surface liant le collagène de S. aureus (pfam05738). Cela peut former une structure de sandwich bêta. GBS67 contient une région qui est homologue à un domaine du facteur de von Willebrand (vWF) type A.
La séquence d'acides aminés de GBS67 séquencé de la souche H36B sérotype Ib est exposée dans la référence 143 comme SEQ ID NO : 20906. La séquence d'acides aminés est SEQ ID NO : 4 dans le présent document :
Dans certains modes de réalisation, ce variant de GBS67 peut être utilisé. En conséquence, lorsque des modes de réalisation de la présente invention sont définis dans le présent document par référence à SEQ ID NO : 1, les références à SEQ ID NO : 1 peuvent être remplacées par des références à SEQ ID NO : 4.
Comme GBS67 séquencé de la souche 2603 V/R sérotype V, GBS67 séquencé de la souche H36B sérotype Ib contient une région transmembranaire C-terminale qui est indiquée par la région soulignée la plus proche de l'extrémité C-terminale de SEQ ID NO : 2 ci-dessus. Un ou plusieurs acides aminés de la région transmembranaire peuvent être retirés, ou l'acide aminé peut être tronqué avant la région transmembranaire. Un exemple d'un tel fragment de GBS67 est exposé ci-dessous comme SEQ ID NO : 5.
Comme GBS67 séquencé de la souche 2603 V/R sérotype V, GBS67 séquencé de la souche H36B sérotype Ib contient un motif d'acides aminés indiquant un ancrage à la paroi cellulaire, présenté en italique dans SEQ ID NO : 4 ci-dessus. En conséquence, dans un fragment préféré de GBS67 pour son utilisation dans l'invention, la région transmembranaire et le motif d'ancrage à la paroi cellulaire sont retirés de GBS67. Un exemple d'un tel fragment de GBS67 est exposé ci-dessous comme SEQ ID NO : 6.
GBS80 GBS80 fait référence à une protéine de la famille d'ancrage à la surface de la paroi cellulaire putative. Les séquences nucléotidiques et d'acides aminés de GBS80 séquencées à partir de la souche isolée 2603 V/R sérotype V sont exposées dans la référence 90 comme SEQ ID NO : 8779 &amp; 8780 . La séquence d'acides aminés est exposée ci-dessous comme SEQ ID NO : 7 :
GBS80 contient une région de séquence signal ou de tête N-terminale qui est indiquée par la séquence souliqnée ci-dessus. Un ou plusieurs acides aminés de la réqion de séquence signal ou de tête de GBS80 peuvent être retirés. Un exemple d'un tel fragment de GBS80 est exposé ci-dessous comme SEQ ID NO : 8 :
GBS80 contient une région transmembranaire C-terminale qui est indiquée par la région soulignée proche de l'extrémité de SEQ ID NO : 7 ci-dessus. Un ou plusieurs acides aminés de la région transmembranaire et/ou d'une région cytoplasmique peuvent être retirés. Un exemple d'un tel fragment est exposé ci-dessous comme SEQ ID NO : 9 :
GBS80 contient un motif d'acide aminé indiquant un ancrage à la paroi cellulaire, présenté en italique dans SEQ ID NO : 7 ci-dessus. Dans certains systèmes de cellules hôtes recombinantes, il peut être préférable de retirer ce motif pour faciliter la sécrétion d'une protéine GBS80 recombinante de la cellule hôte. Ainsi, les régions transmembranaires et/ou cytoplasmiques et le motif d'ancrage à la paroi cellulaire peuvent être retirés de GBS80. Un exemple d'un tel fragment est exposé ci-dessous comme SEQ ID NO : 10.
En variante, dans certains systèmes de cellules hôtes recombinantes, il peut être préférable d'utiliser le motif d'ancrage à la paroi cellulaire pour ancrer la protéine exprimée par voie de recombinaison à la paroi cellulaire. Le domaine extracellulaire de la protéine exprimée peut être clivé durant la purification ou la protéine recombinante peut être laissée attachée aux cellules hôtes inactivées ou aux membranes cellulaires dans la composition finale. Dans un mode de réalisation, la région de séquence signal ou de tête, les régions transmembranaire et cytoplasmique et le motif d'ancrage à la paroi cellulaire sont retirés de la séquence de GBS80. Un exemple d'un tel fragment de GBS80 est exposé ci-dessous comme SEQ ID NO : 11 :
Un fragment immunogène particulier de GBS80 se situe en direction de l'extrémité N-terminale de la protéine, et est proposé dans le présent document comme SEQ ID NO : 12 :
Spbl
La séquence de Spbl de type sauvage de la souche C0H1 sérotype III est SEQ ID NO : 13 dans le présent document :
Spbl de type sauvage contient une région de séquence signal ou de tête N-terminale qui est indiquée par la séquence soulignée (aa 1 à 29). Un ou plusieurs acides aminés de la région de séquence signal ou de tête de Spbl peuvent être retirés. Un exemple d'un tel fragment de Spbl est exposé ci-dessous comme SEQ ID NO : 14 :
La séquence de Spbl de type sauvage contient un motif d'acides aminés indiquant un ancrage à la paroi cellulaire (LPSTG). Dans certains systèmes de cellules hôtes recombinantes, il peut être préférable de retirer ce motif pour faciliter la sécrétion d'une protéine Spbl recombinante par la cellule hôte. Ainsi, le motif d'ancrage à la paroi cellulaire et la séquence C-terminale à ce motif peuvent être retirés de Spbl. Un exemple d'un tel fragment est exposé ci-dessous comme SEQ ID NO : 15 :
En variante, dans certains systèmes de cellules hôtes recombinantes, il peut être préférable d'utiliser le motif d'ancrage à la paroi cellulaire pour ancrer à la paroi cellulaire la protéine exprimée par voie de recombinaison. Le domaine extracellulaire de la protéine exprimée peut être clivé durant la purification ou la protéine recombinante peut être laissée attachée aux cellules hôtes inactivées ou aux membranes cellulaires dans la composition finale. Dans un mode de réalisation, la région de séquence signal ou de tête, le motif d'ancrage à la paroi cellulaire et la séquence C-terminale à ce motif sont retirés de Spbl.
Un exemple d'un tel fragment de Spbl est exposé ci-dessous comme SEQ ID NO : 16 :
Une boîte E contenant un résidu acide glutamique conservé a également été identifiée dans Spbl (souligné), avec un résidu acide glutamique conservé au niveau du résidu 423 (gras) . Le motif de boîte E peut être important pour la formation de structures oligomères de type pilus, et ainsi des fragments utiles de Spbl peuvent inclure le résidu acide glutamique conservé.
La séquence Spbl de type sauvage comprend un codon méthionine interne (Met-162) qui a une séquence TAATGGAGCTGT de 12 motifs monomères qui comprend la séquence centrale (soulignée) d'une séquence de Shine-Dalgarno. Cette séquence de Shine-Dalgarno s'est avéré initier la traduction d'une séquence de Spbl tronquée. Pour empêcher l'initiation de la traduction au niveau de ce site, la séquence de Shine-Dalgarno peut être interrompue dans une séquence codant pour Spbl utilisée pour l'expression. Bien que tout nucléotide approprié puisse être muté pour empêcher la liaison au ribosome, la séquence comprend un codon glycine GGA qui fait partie de la séquence centrale de Shine-Dalgarno et est en phase avec le codon méthionine interne. La troisième base dans ce codon peut être mutée en C, G ou T sans modifier la glycine codée, évitant ainsi toute modification de la séquence Spbl. GBS59(6xD3)
Les séquences d'acides aminés d'un nombre approprié de protéines de fusion GBS59(6xD3) sont proposées ci-dessous : SEQ ID NO : 17 (Fusion E)
SEQ ID NO : 18 (Fusion F)
SEQ ID NO : 19 (Fusion G)
SEQ ID NO : 20 (Fusion H)
SEQ ID NO : 21 (Fusion I)
D'autres séquences appropriées sont proposées dans le document W02011/121576. GBS59(6xD3)-1523
La séquence de GBS59(6xD3)-1523 est SEQ ID NO : 22 ici :
D'autres séquences appropriées sont proposées dans le document EP14179945. Généralités
Le terme « comprenant » comprend les termes « y compris » et « constitué de », par exemple une composition « comprenant » X peut être exclusivement constitué de X ou peut inclure un élément supplémentaire, par exemple, X + Y.
Le terme « sensiblement » n'exclut pas complètement, par exemple, une composition qui est « sensiblement dépourvue » de Y peut être complètement dépourvue de Y. Au besoin, le terme « sensiblement » peut être omis de la définition de l'invention.
Dans certaines mises en application, le terme « comprenant » fait référence à l'inclusion de l'agent actif indiqué, par exemple les polypeptides décrits, ainsi qu'à l'inclusion d'autres agents actifs, et des supports, excipients, émollients, stabilisants, etc. pharmaceutiquement acceptables, tels que connus dans l'industrie pharmaceutique. Dans certaines mises en application, le terme « sensiblement constitué de » fait référence à une composition dont l'unique ingrédient actif est l'ingrédient (les ingrédients) actif(s) indiqué (s), cependant, d'autres composés peuvent être inclus qui sont destinés à stabiliser, conserver, etc. la formulation, mais ne sont pas directement impliqués dans l'effet thérapeutique de l'ingrédient actif indiqué. L'utilisation de la phrase de transition « sensiblement constitué » signifie que la portée d'une revendication doit être interprétée pour comprendre les matériaux spécifiés ou les étapes décrites dans la revendication, et celles qui n'affectent pas matériellement la (les) caractéristique (s) fondamentale (s) et nouvelle (s) de l'invention revendiquée. Voir l'affaire Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461, 463 (CCPA 1976) (souligné dans l'original) ; voir également MPEP § 2111.03. Ainsi, le terme « sensiblement constitué de » lorsqu'il est utilisé dans une revendication de cette invention n'est pas destiné à être interprété comme étant équivalent à « comprenant ». Le terme « constitué de », et ses variantes comprennent y compris et limité à, sauf spécification contraire expresse. Le terme « environ » relativement à une valeur numérique x signifie, par exemple, x + 10 %, x + 5 %, x + 4 %, x + 3 %, x + 2 %, x + 1 %. Le terme « sensiblement » n'exclut pas « complètement », par exemple, une composition qui est « sensiblement dépourvue » de Y peut être complètement dépourvue de Y. Au besoin, le terme « sensiblement » peut être omis de la définition de l'invention.
On appréciera que les cycles sucre peuvent exister sous la forme ouverte et sous la forme fermée et que, alors que des formes fermées sont présentées dans les formules structurales dans le présent document, les formes ouvertes sont également comprises dans l'invention. De manière similaire, on appréciera que les sucres peuvent exister sous les formes pyranose et furanose et que, alors que des formes pyranose sont présentées dans les formules structurales dans le présent document, les formes furanose sont également comprises. Différentes formes anomères de sucres sont également comprises.
Sauf spécification contraire, un procédé comprenant une étape de mélange de deux composants ou plus ne nécessite pas d'ordre de mélange spécifique. Ainsi, les composants peuvent être mélangés dans tout ordre. Lorsqu'il y a trois composants, alors deux composants peuvent être combinés l'un avec l'autre, et la combinaison peut alors être combinée avec le troisième composant, etc.
Les anticorps seront généralement spécifiques de leur cible. Ainsi, ils auront une plus grande affinité pour la cible que pour une protéine de contrôle sans intérêt, telle que la sérum albumine bovine.
Sauf spécification contraire, l'identité entre les séquences polypeptidiques est de préférence déterminée par l'algorithme de recherche d'homologie de Smith-
Waterman tel qu'il est implémenté dans le programme de MPSRCH (Oxford Molecular) , en utilisant une recherche de gap affine avec les paramètres pénalité d'ouverture de gap = 12 et pénalité d'extension de gap = 1.
MODES DE REALISATION DE L'INVENTION
Souches bactériennes et conditions de croissance.
La souche IT-NI-016 du SGB type IX (isolée d'un cas de maladie néonatale d'apparition précoce) était une courtoisie d'Alberto Berardi (Policlinico di Modena, Italie), isolée et typée par des approches sur latex et moléculaires dans le cadre de l'étude DEVANI (144) . Le génotype capsulaire des isolats de type IX a été confirmé par analyse du génome (voir ci-dessous) . La souche 2603 V/R (sérotype V) a été obtenue auprès de Dennis Kasper (Harvard Medical School, Boston, MA) . La souche CJB111 (sérotype V) a été obtenue auprès de Carol Baker (Baylor College of Medicine, Houston, TX) . Les souches de SGB de type sauvage ont été cultivées à 37 °C dans un bouillon de Todd Hewitt (Difco Laboratories) ou dans de la gélose de soja trypticase supplémentée de 5 % de sang de mouton. On a sélectionné les clones transformés portant le plasmide « pAM-IX » et « pAM-IV-V » (voir ci-dessous) et on les a propagés dans le milieu susmentionné, en ajoutant du chloramphénicol (Chl) (10 pg/mL). Pour le clonage du plasmide, on a utilisé des cellules compétentes HB101 d' E. coli (Promega) . On a cultivé les cellules à 37 °C dans un incubateur à agitation orbitale (180 tr/min) dans un milieu Luria-Bertani (LB, Difco laboratories) ou sur des plaques de gélose à 15 g/L (LBA) . On a utilisé du Chl pour la sélection de clones positifs (20 pg/mL).
Modification génétique du SGB de types IX, V et VII
On a conçu un plasmide pour obtenir la souche exprimant les CPS chimères. Un fragment d'ADN, constitué des gènes spécifiques de 1'opéron cps de type IX (cps9M and cps9I) a été amplifié par PCR de l'ADN génomique de Streptococcus agalactiae IT-NI-016 en utilisant des amorces spécifiquement conçues (SEQ ID NO : 23 : pAM-IX-F : 'GCGCGCGCCGCGACATATTTGCTCTGATATGCAG' ; et SEQ ID NO : 24 : pAM-IX-R : 'GCGCAGATCTGATAATGATACTAATCATCTTC') et le cycle de réaction suivant : 1' à 98 °C ; 10'' à 98 °C, 20" à 55 °C, 3' à 72 °C (30 cycles) ; 7' à 72 °C. Le fragment résultant (insert cps9M-9I, SEQ ID NO : 43) a été digéré par Notl/BglII et ligaturé dans le vecteur d'expression pAM-p80 (145) (SEQ ID NO : 44) pour obtenir le plasmide pAM-cps9MI, (cps9M et cps9I ; « pAM-IX », SEQ ID NO : 45 - figure 11) . On a purifié le plasmide du clone sélectionné HB101, on l'a séquencé, et utilisé pour transformer des cellules 2603 V/R ou des cellules CJB111 de SGB électrocompétentes par électroporation à 1 800 V tel que préalablement décrit (146). Cette configuration résulte en une souche avec un répertoire glycosyltransférase constitué d'une seule copie des gènes spécifiques du sérotype V ps5MOI et de multiples copies des gènes spécifiques du type IX.
Des fragments d'ADN constitués de cps spécifiques du type V (cps5Mr cps50, et cps5I, SEQ ID NO : 40, 41 et 42) ont été amplifiés par PCR à partir d'ADN génomique de S. agalactiae CJB111, en utilisant des amorces spécifiquement conçues :
SEQ ID NO : 25 : pAM-V-F GCGGCGCGGCCGCGCTCTGATATGGCAGGAGGTAAGG 3 7
SEQ ID NO : 26 : pAM-V-R GCGGCAGATCTGGGATAATGATACTAACTTTATCC 35) et le cycle de réaction suivant : 1 min à 98 °C ; 10 s à 98 °C, 20 s à 55 °C, et à 3 min à 72 °C (30 cycles) ; et 7 min à 72 °C. On a cloné le fragment résultant (insert cps5MOI, SEQ ID NO : 53) dans le vecteur d'expression pAM-p80 (26) pour obtenir le plasmide pAM-cps5MOI (contenant cps5M, cpsSO, et cps5I ; « pAM-V » SEQ ID NO : 52 - figure 11). On a purifié le plasmide et on l'a utilisé pour transformer le SGB par électroporation. On a transformé la souche IT-NI-016 (sérotype IX) avec ρΑΜ-V. On a également utilisé les deux plasmides pour transformer la souche CZ-PW-045 sérotype VII.
Nous avons étudié l'effet d'une variation de la dose de gènes cps spécifigues du sérotype sur la structure des CPS par construction d'un nouveau vecteur où la région cps5MOI était placée en aval de la région cps9MI de pAM-IX. Cela a résulté en une nouvelle souche exprimant un CPS chimère V-IX mieux équilibré, en d'autres termes PS V-IXb. Pour obtenir cela, un fragment d'ADN, constitué de gènes spécifiques du type V de l'opéron cps (cps5M, cps50 et cps5I) a été amplifié par PCR de l'ADN génomique de S. agalactiae CJB111 en utilisant des amorces spécifiquement conçues ; pAM-V-IX-F (SEQ ID NO : 54) : 'GCGCAGATCTGTAAGAAGAAAATGATACCTAAAGTTAT ' ; et ρΑΜ-V-R : (SEQ ID NO : 26) : 'GCGCAGATCTGATAATGATACTAACTTTATCC', et le cycle de réaction suivant : 1' à 98 °C ; 10'' à 98 °C, 20'' à 55 °C, 3' à 72 °C (30 cycles) ; 7' à 72 °C. Le fragment résultant a été digéré par BglII et ligaturé dans le vecteur pAM-cps9MI préalablement généré pour obtenir le plasmide pAM-cps9MI-cps5MOI, (insert cps9M, cps9I, cps5M, cps50 et cps5I : SEQ ID NO : 56 ; « pAM-IX-V » : SEQ ID NO : 55) . On a purifié le plasmide obtenu des clones sélectionnés HB101, on l'a séquencé, et utilisé pour transformer des cellules 2603 V/R électrocompétentes de SGB par électroporation à 1 800 V, tel que ceci a été préalablement décrit (146). Sérums et réactifs à base d'anticorps monoclonaux
Des anticorps monoclonaux de souris (mAcM) dirigés contre les PS IX et PS V du SGB conjugués à CRM197 ont été générés par Areta International en utilisant des protocoles standard. Brièvement, on a isolé des clones d'hybridomes de lymphocytes B de cellules spléniques de souris CD1 immunisées avec le polysaccharide capsulaire purifié respectif conjugué à CRM197. On a d'abord sélectionné des clones positifs par ELISA puis on a criblé les surnageants de culture pour la liaison à la surface de la souche de référence apparentée par cytométrie en flux. On a soumis des clones d'hybridomes primaires positifs à un clonage de cellule unique et à un sous-clonage par dilution limite. La monoclonalité d'un clone était acceptée uniquement lorsque les puits d'une plaque de microtitration avec des cellules en croissance ont donné une réaction par ELISA indirect après un sous-clonage répété. Les AcM sélectionnés ont été finalement purifiés par chromatographie d'affinité sur protéine G. On a déterminé les classes et sous-classes des anticorps monoclonaux avec le kit IsoQuick Mouse Monoclonal Isotyping (Sigma).
Pour la détection immunochimique du polysaccharide chimère, on a biotinylé une fraction des anticorps monoclonaux en utilisant le kit EZ-Link Suifo-NHS-LC-Biotinylation (Thermo Scientific), selon les instructions du fabricant. Les traitements des animaux étaient conformes aux lois italiennes et ont été approuvés par le comité d'éthique indépendant (comité pour la protection des animaux) de Novartis Vaccines and Diagnostics, Sienne, Italie. Sérotypage de CPS et analyse par cytométrie en flux
On a réalisé le sérotypage de SGB par dosage d'agglutination sur latex en utilisant le kit Strep-B-Latex (Statens Sérum Institut) selon les instructions du fabricant. On a réalisé la cytométrie en flux en utilisant des anticorps anti-polysaccharides capsulaires. Les bactéries cultivées dans du THB jusqu'à la phase exponentielle ont été récoltées et fixées dans du PBS contenant 0,1 % (p/v) de PFA pendant 1 h à 37 °C. On a lavé les cellules fixées avec du PBS et on les a fait incuber pendant 1 h à température ambiante avec des sérums immuns de souris dirigés contre les polysaccharides purifiés de type V ou de type IX, dilués à 1/200 dans du PBS contenant du BSA à 0,1 %. On a fait incuber les cellules pendant 1 heure à 23 °C avec un F(ab2) d'immunoglobuline G de chèvre anti-souris conjugué à la R-phycoérythrine, dilués à 1/100 dans du PBS contenant du BSA à 0,1 %. Toutes les données ont été collectées en utilisant un BD FACS Calibur et un BD FACS CANTO II (BD Bioscience) par acquisition de 10 000 événements, et l'analyse de données a été réalisée avec un logiciel Flow-Jo (v. 8.6, TreeStar Inc.). PS V-IX donne un signal positif indiquant que la souche de type V (pAM-IX) produit des chaînes de polysaccharides capsulaires chimères qui contiennent des unités répétées spécifiquement reconnues par les AcM spécifiques du type V et du type IX (figure 12). L'expression en trans hétérologue de cps9M et de cps9I permet l'assemblage par SGB 2603 (V) de polysaccharides capsulaires réagissant avec des antisérums spécifiques de CPS de type V et de type IX (figure 12). L'expression en trans hétérologue de cps5M, cps50 and cps5I permet l'assemblage par SGB IT-NI-016 (IX) de polysaccharides capsulaires réagissant avec les antisérums spécifiques de CPS de type V et de type IX (figure 13). La confirmation sérologique du fait que le type V (pAM-IX-V) produit des chaînes polysaccharidiques capsulaires chimères qui contiennent des unités répétées spécifiquement reconnues pour les AcM spécifiques du type V et spécifiques du type IX a été obtenue (figure 17).
Analyse de la séquence d'ADN de batteries biosynthétiques de capsules de cps À des fins de comparaisons d'alignement, on a récupéré des séquences nucléotidiques de la région spécifique du sérotype de cps de la souche de référence de type V de la base de données NCBI (2603V/R, numéro d'accès NC_004116). La région spécifique du sérotype de cps de l'isolat de type IX (IT-NI-016) a été extraite de la séquence génomique (147). On a réalisé des alignements de séquences multiples et par paire avec MUSCLE en utilisant Geneious version 7.05 (Biomatters, http ://www.geneious.com/).
Isolement et purification du polysaccharide capsulaire chimère de type V-IX
On a utilisé la souche de SGB 2603 V/R (pAM-IX) ayant subi une modification génétique pour la préparation de CPS chimères V-IX à partir d'une culture bactérienne de 8 L cultivée jusqu'à la phase stationnaire dans du THB avec du chloramphénicol (10 pg/mL). De manière à purifier le polysaccharide, on a récupéré le culot bactérien par centrifugation à 4 000 tr/minute pendant 30 minutes, on l'a lavé dans du PBS et fait incuber avec du NaOH 0,8 N à 37 °C pendant 36 heures. Après la centrifugation à 4 000 tr/minute pendant 30 min, on a ajouté un tampon TRIS 1 M (1/9 v/v) au surnageant et on a dilué avec du HCl 3 N pour atteindre un pH neutre. Pour davantage purifier le CPS chimère de type V-IX, on a ajouté à la solution du CaC12 2 M (concentration finale de 0,1 M) et de l'éthanol (concentration finale de 30 % v/v). Après la centrifugation à 4 000 tr/minute pendant 30 min, on a soumis le surnageant à une filtration à flux tangentiel avec un seuil de coupure MW de 10 kDa (Hydrosart Sartorius, surface de 0,2 m2) contre 16 volumes de TRIS 50 mM/NaCl 500 mM pH 8,8, et 10 volumes de phosphate de sodium 10 mM pH 7,2.
On a alors concentré l'échantillon en utilisant un évaporateur rotatif (Rotovapor®, Büchi) et on l'a divisé en aliquotes de 3 mL que l'on a séparément purifiées par chromatographie d'exclusion diffusion (SEC) en utilisant une colonne garnie de résine S-500 Sephacryl®, pré-équilibrée dans du NaP04 100 mM/NaCl 1 M pH 7,2. On a réalisé la séparation chromatographique sur un système pur ÂKTA (GE Healthcare) à un débit de 0,3 mL/min dans du NaP04 10 mM/NaCl 150 mM pH 7,2. Le polysaccharide a été détecté par mesure de l'absorption UV à 214 nm, 254 nm, et 280 nm et collecté par fraction dans le premier pic élué, apparaissant principalement sous la forme d'un large pic. On a soumis la solution polysaccharidique à une étape de dessalage sur une colonne garnie de résine Sephadex® G-15 (GE Healthcare), dans l'eau à un débit de 1 mL/min.
Pour reconstituer une N-acétylation complète des résidus GlcpNAc et NeupNAc éventuellement présents, on a ajouté à l'échantillon une solution diluée 1/1 de 4,15 yL/mL d'anhydride acétique dans de l'éthanol, puis on a mis la réaction à incuber à température ambiante pendant 2 heures. On a concentré l'échantillon en utilisant un Rotavapor et on l'a injecté sur une colonne garnie de Sephadex® de G-15 pour purifier le polysaccharide ré-acétylé. On a évalué la pureté de la préparation de polysaccharide par dosages colorimétriques, qui ont indiqué une teneur en protéines résiduelles et en acides nucléiques inférieure à 1 % p/p. On a obtenu des CPS de SGB de type V, IX et V-IX hautement purifiés par application d'un processus de purification similaire à celui décrit ci-dessus pour les PS chimères V-IX. Détection immunochimique du polysaccharide chimère ELISA en sandwich
On a revêtu des puits de microtitration pendant une nuit à 4 °C avec 100 yL de 2,5 yg/mL de chaque AcM de revêtement dans du PBS, selon le schéma expérimental. Pour bloquer les sites de liaison aux protéines supplémentaires, on a traité les puits pendant 2 h à TA avec 350 yL de BSA à 3 % dans du PBS. On a alors mis les plaques à incuber pendant 2 h à 37 °C avec des quantités décroissantes de polysaccharide selon la conception expérimentale. On a ajouté aux puits l'anticorps monoclonal de marquage biotinylé spécifique dilué à 1/100 dans du PBS/Tween à 0,05 % (PBST) /BSA à 1 %, suivi par une incubation d'une durée de 1 h à 37 °C sous agitation. Après un lavage rigoureux, on a mis les plaques à incuber pendant 45 min avec 100 pL de streptavidine conjuguée à la peroxydase de raifort (Thermo Scientific) diluée à 1/200 dans du PBST/BSA à 1 %. Après le lavage, on a ajouté un substrat chromogène à l'enzyme conjuguée liée, et on a déterminé l'absorbance à 450 nm.
Dot blot en sandwich
Pour révéler la nature chimère des molécules de polysaccharide, on a mis au point un dot blot en sandwich dans lequel des polysaccharides étaient capturés sur une membrane, revêtus d'un AcM spécifique contre les PS V natifs, puis révélés avec une seconde liaison de l'AcM à PS IX avec une grande affinité. Les résultats (figure 18) ont mis en évidence que les polysaccharides chimères obtenus (PS V-IX et PS V-IXb) étaient positivement révélés par cette approche, différemment des PS V et PS IX natifs, qui représentaient des témoins négatifs. Ces données mettent en évidence que PS V-IX et PS V-IXb sont des polysaccharides capsulaires chimères (cCPS), constitués de chaînes hybrides de masse moléculaire élevée qui héritent des épitopes caractéristiques des types V et IX étant donné qu'ils sont liés par les deux AcM spécifiques du sérotype avec une grande affinité et avec une grande spécificité.
On a déposé des points de 5 pL de chaque AcM de revêtement, concentré à 0,45 mg/mL dans du PBS, sur une membrane en nitrocellulose, selon le schéma expérimental. Pour bloquer les sites de liaison aux protéines supplémentaires, on a fait incuber la membrane pendant une nuit à 4 °C avec du PBST/réactif de blocage à 5 % (BioRad) sous agitation. On a coupé la membrane pour séparer les points originaux d'AcM. On a alors séparé chacun des disques en nitrocellulose résultants dans l'un des 12 puits d'une plaque de culture cellulaire (Costar). On a rempli chaque puits de 500 pL du polysaccharide spécifique dilué à 25 pg/mL dans du PBST/réactif de blocage à 3 %, selon la conception expérimentale (figure 18). On a mis la plaque à incuber pendant 2 h à TA sous agitation modérée. On a ajouté l'anticorps monoclonal anti-PS-IX de marquage, biotinylé, spécifique, dilué à 1/100 dans 500 pL de PBST/agent de blocage à 3 %, à chaque puits suivi par une incubation de 1 h à TA sous agitation. Après un lavage rigoureux, on a mis la plaque à incuber pendant 45 min avec 500 pL de streptavidine conjuguée à la peroxydase de raifort (Thermo Scientific) diluée à 1/5 000 dans du PBST/agent de blocage à 3 %. On a développé le transfert en utilisant le substrat chimiluminescent SuperSignal® West Pico (Thermo Scientific) selon les instructions du fabricant. ELISA compétitif
Pour mesurer l'efficacité de liaison des AcM spécifiques des CPS aux cCPS, et pour obtenir une estimation plus quantitative de leurs éléments structuraux, on a mis au point un ELISA compétitif. Les résultats (figure 19) ont confirmé que le PS V-IXb se lie aux AcM spécifiques du type V et aux AcM spécifiques du type IX avec la moitié de l'efficacité des polysaccharides natifs à la même concentration. A l'inverse, le PS V-IX est capable de se lier aux AcM spécifiques du type X à 15 % et aux AcM spécifiques du type IX à 75 % relativement aux polysaccharides natifs. Ces résultats confirment que l'équilibre du nombre de copies de gènes spécifiques du sérotype conduit à un rapport d'épitopes équilibré dans les cCPS finaux.
Revêtement avec les PS du SGB V ou IX conjugués à HAS-adh
-1 yg/mL dans du PBS pH 7,4 (100 yL/puits) pour V et IX dans du PBS pH 7,4 (100 yL/puits) - Incubation à 4 °C pendant une nuit - lavage 3x dans un tampon de lavage (Tween 20 à 0,05 % dans du PBS IX)
Post-revêtement - Répartition de 250 yL/puits (BSA à 2 %, Tween 20 à 0,05 % dans du PBS IX)
- Incubation pendant 1,5 h at 37 °C - Aspiration
Pré-incubation des AcM avec le PS
AcM oî-CRM-V - dilution de PS dans une plaque de microtitration en polypropylène distincte (17 dilutions, tampon de dilution) ; - IX : étape de 2 fois (première dilution dans la plaque : 25 yg/mL de PS), - V-IX : étape de 2 fois (première dilution dans la plaque : 25 pg/mL de PS), - V-IXb : étape de 2 fois (première dilution dans la plaque : 25 pg/mL de PS), - V : étape de 2 fois (première dilution dans la plaque : 0,3 pg/mL de PS),
AcM oî-CRM-IX - dilution de PS dans une plaque de microtitration en polypropylène distincte (9 dilutions, tampon de dilution) ; - IX : étape de 3 fois (première dilution dans la plaque : 0,3 pg/mL de PS), - V-IX : étape de 3 fois (première dilution dans la plaque : 0,75 pg/mL de PS), - V-IXb : étape de 3 fois (première dilution dans la plaque : 0,75 pg/mL de PS), - V : étape de 3 fois (première dilution dans la plaque : 0,75 pg/mL de PS), - On a ajouté à chaque puits une concentration fixe d'AcM (volume égal de PS de test) : 0,03 pg/mL pour 12F1/H8 (oî-CRM-V) , 0,1 pg/mL pour 17B2/F6 (a-CRM-IX).
- Incubation pendant 20 min à TA
Compétition pour la liaison à l'AcM - On a transféré le mélange pré-incubation à la plaque revêtue et saturée
- Incubation pendant 1 h at 37 °C - Lavage 3x dans un tampon de lavage (Tween 2 0 à 0,05 % dans du PBS IX)
Anticorps secondaire - On a distribué dans chaque puits 100 pL d'une solution d'IgG anti-souris conjuguée à l'AP à 1/2 000 dans un tampon de dilution.
- Incubation pendant 1,5 h at 37 °C - Lavage avec tampon de lavage 3x (Tween 20 à 0,05 % dans du PBS IX)
Ajout de substrat - Ajout de 100 pL de p-nitrophénylphosphate (p-NPP) à 1,0 mg/mL dans un tampon de substrat.
Incubation pendant 30 minutes à température ambiante - Ajout de 100 pL d'EDTA à 7 % pour mettre un terme à la réaction enzymatique
Lecture de plaque à 405 à 620 nm.
Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire
On a enregistré les expériences de RMN du 1H sur un spectromètre Bruker Avance III 400 MHz, équipé d'un dispositif de régulation de la température haute précision, et utilisant une sonde à large bande de 5 mm (Bruker) . On a utilisé le logiciel TopSpin version 2.6 (Bruker) pour l'acquisition et le traitement de données.
On a collecté les spectres à 25 ou 35 ± 0,1 °C avec 32 k points de données sur une largeur de spectre de 10 ppm, accumulant 128 balayages. On a pondéré les spectres avec un élargissement des lignes de 0,2 Hz et on les a soumis à une transformée de Fourrer. On a réglé l'émetteur à la fréquence de l'eau, qui a été utilisée en tant que signal de référence (4,79 ppm) .
Tous les spectres de RMN protonique monodimensionnels ont été obtenus de manière quantitative en utilisant un temps de recyclage total pour assurer une récupération complète de chaque signal (temps de relaxation longitudinale 5x Tl) . Pour mieux analyser les différences entre les deux cCPS obtenus (PS V-IX et PS V-IXb) , nous avons réalisé des expériences de spectroscopie par RMN du carbone sur les polysaccharides chimères et les polysaccharides natifs.
Le spectre de RMN 1H de PS V-IX est hautement similaire à ceux de PS V et PS IX et contient des éléments qui sont caractéristiques des deux polysaccharides capsulaires. Le spectre de RMN 1H de PS V-IXb a une intensité supérieure de pics signatures de PS V relativement à PSV-IX (figure 14). La composition moyenne des unités répétées des deux polysaccharides chimères (PS V-IX et PS V-IXb) a été estimée par RMN DEPT. Dans la région du spectre couvrant d'approximativement 21,5 à 23 ppm, les atomes de carbone du CH3 des groupes N-acétyle de GlcpNAc et NeupNAc résonnent. Le décalage chimique de la ramification GlcpNAc CH3 de PS IX est différent du décalage correspondant dans le spectre du PS V (22,55 et 22,61 ppm, respectivement). En outre, le signal à 21,8 ppm dans le spectre de DEPT de PS IX a été assigné au squelette GlcpNAc CH3 et est par conséquent absent du spectre de PS V.
En se basant sur ces observations, on a pu estimer le rapport relatif des éléments structuraux de PS V sur PS IX pour les deux cCPS, à partir de l'intégration des aires de pics relatives à ces signaux de CH3.
Tel que ceci est évident à partir de la superposition des spectres agrandie (figure 15) , le rapport des éléments des types V et IX est d'approximativement de 1/3 dans les PS V-IX, est grossièrement un quart de l'intensité du type IX, alors que le rapport est proche de 1/1 dans PS V-IXb. Ces observations suggèrent que l'ajout d'une dose supérieure de gènes cps5 résulte vraisemblablement en une activité accrue des glycosyltransférases spécifiques du sérotype V et, finalement en un rapport plus équilibré des éléments physicochimiques de PS V sur IX relativement à PS V-IX. Environ 75 % des unités répétées du polysaccharide de type V-IX chimère sont de type IX alors que les 25 % restants sont de type V (figure 15). Environ 50 % des unités répétées du polysaccharide de type V-IXb chimère sont de type IX alors que les 50 % restant sont de type V (figure 15).
Production de conjugué
On a conjugué des polysaccharides capsulaires chimères purifiés à partir de Streptococcus agalactiae sérotypes V et IX génétiquement modifiés à une protéine porteuse par oxydation au periodate, suivi par l'amination réductrice selon les procédures décrites dans la référence 2 avec certaines modifications. On a utilisé CRM197 en tant que protéine porteuse bien que les processus soient applicables à d'autres protéines porteuses telles que l'anatoxine tétanique, GBS80, GBS5 9, GBS5 9(6xD3), etc. (1) Réaction d'oxydation
On a réalisé une réaction d'oxydation pour générer des groupes aldéhydiques au niveau du C8 des résidus acide sialique par clivage oxydatif de la liaison diol C8-C9. La réaction a été réalisée par ajout d'une solution de periodate de sodium 0,1 M à la solution de polysaccharide capsulaire chimère purifiée et en maintenant sous agitation dans le noir pendant au moins 2 heures.
On a immédiatement purifié la solution par une étape d'ultrafiltration pour éliminer les produits intermédiaires formaldéhyde et periodate de sodium, par exemple les ions iodate, générés durant la réaction. On a réalisé l'ultrafiltration avec une diafiltration/concentration à flux tangentiel en utilisant des membranes de cellulose régénérées d'UF de 30 kD (1 membrane Hydrosart 30kD 0,1 sm) contre 13 volumes de tampon phosphate de sodium 100 mM pH 7,2. La membrane de 30 kD a retenu le polysaccharide et on a récupéré le conjugué dans le rétentat d'UF. On a soumis le polysaccharide oxydé à une filtration à 0,2 ym et on l'a stocké à 2° à 8 °C pendant une durée pas supérieure à 7 jours. (2) Réaction de conjugaison
La réaction de conjugaison se produit entre certains groupes aldéhydiques générés par la réaction d'oxydation et certains groupes ε-aminés de lysines de la protéine porteuse, par amination réductive en présence de cyanoborohydrure de sodium. On a dilué le polysaccharide capsulaire chimère traité au periodate avec du phosphate de sodium 100 mM et on a ajouté CRM197 concentré en vrac pour obtenir une concentration finale de 6,35 mg/mL en tant que concentration de PS.
Les conditions de réaction cible pour la conjugaison CPS-CRM sont : - Rapport polysaccharide/CRM (0,75/1 p/p), - Concentration de saccharides (6,35 mg/mL) - NaCNBH3 (6,35 mg/mL).
On a utilisé le rapport polysaccharide/CRM pour garantir une conversion pratiquement complète du polysaccharide. La réaction a été réalisée à température ambiante (TA) pendant au moins 10 heures, mais pas plus de 28 heures, à pH 7,2 jusqu'à une conversion de CRM d'au moins 45 % (surveillée par un test SEC-CLHP en cours de processus). (3) Dilution du conjugué brut À la fin de la réaction de conjugaison, on a ajouté de l'eau pour injection (EPI) pour obtenir une concentration finale de tampon de phosphate de sodium de 35 mM. On a soumis le produit à une filtration de 0,2 ym et on l'a stocké à 2° à 8 °C pendant une durée pas supérieure à 24 heures, lorsqu'il n'a pas été utilisé immédiatement. (4) Chromatographie sur hydroxyapatite
On a séparé le glycoconjugué de la CRM non conjuguée par chromatographie sur hydroxyapatite.
On a collecté le glycoconjugué dans le flux, alors que la CRM se lie à la résine et est retirée.
On a garni la colonne de résine hydroxylapatite de type I et les conditions de purification étaient : 1) Équilibration : phosphate de sodium 35 mM pH = 7,2 (5 volumes de colonne) 2) Chargement : phosphate de sodium 35 mM pH = 7,2 (2,9 volumes de colonne) 3) Extraction : phosphate de sodium 400 mM pH = 6,8 (2 volumes de colonne)
On a soumis le produit à une filtration à 0,2 ym et on l'a stocké à 2° à 8 °C pendant une durée pas supérieure à 24 heures. (5) Réaction d'extinction
On a utilisé une étape d'extinction pour éliminer les groupes aldéhydiques des saccharides résiduels par réaction avec du borohydrure de sodium (NaBH4) . La réaction d'extinction a été réalisée en utilisant une solution de borohydrure de sodium de 10 mg/mL à un excès molaire de 25/1 relativement à l'acide sialique oxydé estimé (en d'autres termes, 20 % de l'acide sialique total). La réaction a été réalisée pendant au moins 2 heures en maintenant le pH à 8,3 ± 0,2 par ajout de phosphate de sodium 500 mM. On a utilisé une ultrafiltration finale de 30 kD pour éliminer les produits intermédiaires et les réactifs de conjugaison et d'extinction de faible masse moléculaire et pour la concentrer dans une plage d'environ 1,0 à 1,5 mg/mL en tant que concentration de saccharide.
Immunisation et test de provocation PS V-IX
On a utilisé un modèle de provocation murin d'infection par le SGB pour vérifier l'efficacité de protection des antigènes, tel que ceci a été préalablement décrit (148). Brièvement, on a immunisé des groupes de huit à seize souris femelles CD-I (âge : 6 à 8 semaines) avec un conjugué de polysaccharide chimère ou un tampon (PBS) formulé avec un adjuvant alun. On a calculé les valeurs de protection comme [ (% de décès dans le témoin - % de décès dans le vaccin)/% de décès dans le témoin)] x 100
La vaccination de souris avec des conjugués comprenant le polysaccharide capsulaire chimère de type V-IX a protégé les souris contre la provocation avec le SGB sérotype IX, mettant en évidence que le conjugué de polysaccharide chimère était aussi efficace que le conjugué de polysaccharide IX natif, de type sauvage. PS V-IXb
On a utilisé le modèle de provocation murin pour l'infection par SGB décrit ci-dessus pour vérifier l'efficacité de protection de PS V-IXb. On a immunisé des groupes de huit à seize souris femelles CD-I (âgées de 6 à 8 semaines) avec le nouveau conjugué de polysaccharide chimère, avec PS V ou IX non chimère, ou avec un tampon (PBS) formulé avec un adjuvant alun. On a calculé les valeurs de protection comme [(% de décès dans le témoin - % de décès dans le vaccin)/% de décès dans le témoin)] x 100. Tel que ceci est présenté dans le tableau ci-dessous, la vaccination des souris avec les conjugués comprenant le PS V-IXb a protégé les souris contre le test de provocation avec le SGB sérotype IX et V, mettant en évidence que ce nouveau conjugué de polysaccharide chimère était efficace contre les souches des deux sérotypes contenus dans la chimère.
Amorces_et_vecteurs pour_la production_de polysaccharides chimères Ia-Ib-III dans un contexte de sérotype la
On a conçu trois plasmides pour obtenir un polysaccharide chimère Ia-III « divalent » et une souche exprimant les CPS chimères Ia-Ib-III « trivalents ». Des fragments d'ADN, constitués de gènes spécifiques de l'opéron cps de type la, Ib et III (cps laH, cpslbJ, cpslbK et cps3H) ont été amplifiés par PCR à partir de l'ADN génomique de S. agalactiae en utilisant des amorces sens et antisens spécifiquement conçues :
On a utilisé le cycle de réaction suivant : 1' à 98 °C ; 10" à 98 °C, 20" à 55 °C, 3' à 72 °C (30 cycles) ; 7' à 72 °C.
On a ligaturé les fragments résultants (insert cps3H-cpslbJ-cpslbK, SEQ ID NO : 49 ; insert cps3H- cpslbj, SEQ 5 ID NO : 51 ; insert cps3H-cpslaH, SEQ ID NO : 47) dans le vecteur d'expression pAM-p80 (145) (SEQ ID NO : 44) pour obtenir les plasmides pAM-Tris-L (SEQ ID NO : 48), pAM-Tris-S (SEQ ID NO : 50) et pAM-III-Ia-cpsH (SEQ ID NO : 46). On a purifié les plasmides d'un clone sélectionné, on les a séquencés, et utilisés pour transformer des cellules de SGB sérotype la électrocompétentes (souche 090) par électroporation à 1 800 V tel que préalablement décrit (146). Les vecteurs sont présentés sur la figure 16. Les cellules transformées avec pAM-Tris-L ou pAM-Tris-S produisent un polysaccharide chimère comprenant des unités répétées de sérotypes la, Ib et III. Les cellules transformées avec pAM-III-Ia-cpsH produisent un polysaccharide chimère comprenant une unité répétée des sérotypes la et III. Des séquences représentatives de cpslaH, cps3H, cpslbJ, cpslbK sont proposées dans SEQ ID NO : 36, 37, 38 et 39 respectivement.
Alors que certains modes de réalisation de la présente invention ont été décrits et sont spécifiquement illustrés ci-dessus, l'invention n'est pas destinée à se limiter à ces modes de réalisation. Différentes modifications peuvent y être apportées sans s'éloigner de la portée et de l'esprit de la présente invention telle qu'exposée dans les revendications suivantes.
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Claims (15)

  1. REVENDICATIONS
    1. Conjugué comprenant (i) un polysaccharide capsulaire, et (ii) une protéine porteuse caractérisé en ce que le polysaccharide capsulaire est un polysaccharide chimère qui comprend, (a) au moins une unité répétée d'un premier sérotype de polysaccharide capsulaire de Streptococcus agolactiae (SGB) et au moins une unité répétée d'un deuxième sérotype de polysaccharide capsulaire de Streptococcus agaiactiae (SGB) dans lequel les unités répétées sont jointes par une liaison glycosidique.
  2. 2. Conjugué selon la revendication 1 dont le polysaccharide capsulaire comprend en outre au moins une unité répétée d'un troisième sérotype de polysaccharide capsulaire du SGB,
  3. 3. Conjugué selon Sa revendication 1 ou 2, dans lequel le premier sérotype de polysaccharide capsulaire du SGB est le type la et le deuxième sérotype de polysaccharide capsulaire du SGB est le type Ib.
  4. 4. Conjugué selon la revendication 3, lorsqu’elle dépend de la revendication 2, dans lequel le troisième sérotype de polysaccharide capsulaire du SGB est le type III.
  5. 5. Conjugué selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le premier sérotype de polysaccharide capsulaire du SGB est le type V et le deuxième sérotype de polysaccharide capsulaire du SGB est le type IX.
  6. 6. Conjugué selon la revendication 5, lorsqu’elle dépend de la revendication 2, dans lequel le troisième sérotype de polysaccharide capsulaire du SGB est le type VIL
  7. 7. Conjugué selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le rapport des unités répétées des premier et deuxième sérotypes de polysaccharides capsulaires du SGB est de 1/1 et/ou des premier, deuxième et troisième sérotypes de polysaccharides capsulaires du SGB est 1/1/1.
  8. 8. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel la protéine porteuse est liée de manière covalente au polysaccharide capsulaire.
  9. 9. Conjugué selon la revendication 8, dans lequel la protéine porteuse est liée de manière covalente au polysaccharide capsulaire.
  10. 10. Conjugué selon la revendication 9, dans lequel le lieur est le dïhydrazide d'acide adipique.
  11. 11. Conjugué selon l’une quelconque des revendications 8 à 10, dans lequel la protéine porteuse est sélectionnée dans le groupe constitué de l'anatoxine tétanique, de l'anatoxine diphtérique, de CRM 197, de GBS80, de GBS67 et de GBS59.
  12. 12. Composition pharmaceutique comprenant le conjugué selon l’une quelconque des revendications 8 à 11, en une quantité efficace pour prévenir ies infections systémiques chez un animal chez lequel lesdites infections systémiques sont provoquées par le streptocoque de groupe B et un diluant, support ou excipient pharmaceutiquement acceptable.
  13. 13. Composition pharmaceutique selon la revendication 12, dans laquelle la composition est un vaccin.
  14. 14. Composition pharmaceutique selon la revendication 13, dans laquelle le vaccin est destiné à être administré à des êtres humains sélectionnés parmi des femmes en âge de procréer, des femmes enceintes et des patients âgés.
  15. 15. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, dans laquelle la composition est destinée à la prévention et/ou au traitement d'une maladie provoquée par 5. agalactiae, notamment dans laquelle la maladie est Sa septicémie néonatal, la bactériémie, ia pneumonie néonataie, la méningite néonatale, l'endométrite, i'ostéomyéüte ou i'arthrite septique.
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