CN110366428A - 具有非天然氨基酸的多肽-抗原缀合物 - Google Patents

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Abstract

公开了用于产生含有非天然氨基酸的免疫原性组合物的方法。所述非天然氨基酸可以是附着如细菌荚膜多糖等抗原以制备免疫原性缀合物的位点。并入所述非天然氨基酸中的生物正交附着化学实现针对免疫系统的更高效和更有力的抗原呈递、简化的纯化和这些半合成免疫原的更明确限定的结构。

Description

具有非天然氨基酸的多肽-抗原缀合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年12月30日提交的美国临时专利申请62/441,115、于2017年7月10日提交的美国临时专利申请62/530,803、于2017年10月4日提交的美国临时专利申请62/568,201和于2017年11月27日提交的美国临时专利申请62/591,160的权益，所述美国临时专利申请中的每个申请通过引用并入本文中。
背景技术
基于分离的抗原大分子(例如，第一代脑膜炎球菌、肺炎球菌和嗜血杆菌多糖疫苗)的疫苗代表了相较于基于减毒活疫苗或灭活生物体疫苗的早期疫苗调配物的显著改进。
纯化的大分子明显更易于制造、具有改进的安全特性并且可以产生更有效的特异性免疫应答(例如，纯化的大分子可以针对更加保守或对发病机制很重要的抗原)。此外，纯化的大分子为疫苗生产提供了简化的模板，其中免疫应答可以简单通过提供适当的免疫原而针对特定位点或特定生物体。然而，此策略受不便事实的影响-不是每个大分子都会产生强烈的免疫应答。许多脂质、多糖和某些蛋白抗原(和大多数小分子)产生在某些患者群体中固有地较弱、短暂和/或有缺陷的免疫应答(实例包含婴儿或老年人)。这些弱免疫应答被认为是由主要活化B细胞或以其它方式不能活化参与免疫记忆和抗体成熟的T细胞依赖性途径的抗原结构引起的。
发明内容
本公开涉及用于产生所公开的含有非天然氨基酸的免疫原性组合物的方法、组合物和技术。并入所述非天然氨基酸中的生物正交附着化学实现
针对免疫系统的更高效和更有力的抗原呈递、简化的纯化和这些半合成免疫原的更明确限定的结构。
在一个实施例中，本公开提供了一种缀合物，所述缀合物包括多肽和抗原，其中所述多肽是包括至少一个T细胞活化表位和至少一个非天然氨基酸或“nnAA”的载体蛋白，其中所述抗原与所述nnAA缀合。在另一个实施例中，所述载体蛋白包括来自蛋白质的至少一个T细胞活化表位，所述蛋白质选自由以下组成的组：白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)毒素、破伤风梭菌(Clostridium tetani)破伤风痉挛毒素(也称为破伤风毒素)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)蛋白D(PD、HiD)、血清组B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物(OMPC)和CRM197。在另一个实施例中，所述载体蛋白包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个nnAA。在另一个实施例中，所述至少一个nnAA替换所述天然载体蛋白中的赖氨酸。例如，所述载体蛋白包括CRM197，其中天然CRM197中的39个赖氨酸残基的至少2个赖氨酸残基(例如，至少3个、至少4个、至少5个、或至少6个)已经被nnAA所替换。在另一个实施例中，所述至少一个nnAA替换所述天然载体蛋白中的苯丙氨酸。在另一个实施例中，所述至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个nnAA替换所述天然载体蛋白中的赖氨酸。在另一个实施例中，所述至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个nnAA替换所述天然载体蛋白中的苯丙氨酸。在另一个实施例中，所述至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个nnAA替换所述天然载体蛋白中的赖氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸和苯丙氨酸两者。在另一个实施例中，所述nnAA选自2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸以及2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或其任何组合。在另一个实施例中，所述载体蛋白与选自由以下组成的组的蛋白质具有至少80％的序列一致性：白喉毒素(DT)、破伤风毒素(TT)、流感嗜血杆菌蛋白D(PD)和CRM197。在另一个实施例中，所述载体蛋白与SEQ ID NO:1具有至少80％的序列一致性。在另一个实施例中，根据SEQ ID NO:1，所述至少一个T细胞活化表位来自CRM197。在另一个实施例中，所述至少一个nnAA替换SEQ ID NO:1的K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523或K527。在另一个实施例中，所述至少一个nnAA替换SEQ ID NO:1的F13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531或F532。在另一个实施例中，所述至少两个nnAA替换SEQID NO:1的K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、K527、F13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531或F532。在另一个实施例中，所述至少一个nnAA替换SEQ ID NO:1的K265。在另一个实施例中，所述至少一个nnAA替换SEQ ID NO:1的K386。在另一个实施例中，所述至少一个nnAA替换SEQ ID NO:1的K265和K386。在另一个实施例中，所述nnAA选自2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸以及2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或其任何组合。在另一个实施例中，所述抗原经由三唑连接部分与所述nnAA缀合。在另一个实施例中，所述抗原为多糖。在另一个实施例中，所述抗原为肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、流感嗜血杆菌(尤其是b型，即Hib)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)或无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的荚膜多糖。在另一个实施例中，所述抗原为选自由以下组成的组的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F以及其任何组合。在另一个实施例中，所述抗原是源自牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)的六种血清型中的一种血清型(例如，K1、K2、K3、K4、K5和/或K6)的荚膜多糖。
在一个相关实施例中，所述缀合物包括多肽和抗原，其中所述多肽是包括至少一个T细胞活化表位和至少一个nnAA，并且优选地至少两个nnAA，的载体蛋白，其中所述抗原与所述至少一个nnAA缀合，并且进一步地，其中所述至少一个nnAA是带有以下的2,3-双取代的丙酸：在2位处的氨基取代基；以及在3位处的含叠氮基的取代基、含1,2,4,5-四嗪基的取代基或含乙炔基的取代基。
在另一个相关实施例中，所述缀合物包括多肽和抗原，其中所述多肽是包括至少一个T细胞活化表位和至少一个nnAA残基，并且优选地至少两个nnAA残基，的载体蛋白，其中所述抗原与所述nnAA缀合，并且进一步地，所述nnAA残基对应于具有式XII结构的氨基酸：
其中：
Ar包括任选地含有至少一个杂原子的5元芳香族环或6元芳香族环；
W5选自C1-C10亚烷基、-NH-、-O-和-S-；
Q1为0或1；并且
W6选自叠氮基、任选地被低级烷基C-取代的1,2,4,5-四嗪基以及乙炔基，
使得所述多肽中的所述nnAA残基具有式XIII结构：
其中R3为OH或所述载体蛋白的氨基酸残基，并且R4为H或所述载体蛋白的氨基酸残基。
在一个实施例中，本公开提供了一种多肽，所述多肽包括至少一个nnAA，所述至少一个nnAA根据SEQ ID NO:1替换所述天然多肽内的天然存在的氨基酸，其中所述至少一个nnAA替换SEQ ID NO:1的K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523或K527，其中所述nnAA包括连接部分。在一个实施例中，本公开提供了一种多肽，所述多肽包括至少一个nnAA，所述至少一个nnAA根据SEQ ID NO:1替换所述天然多肽内的天然存在的氨基酸，其中所述至少一个nnAA替换SEQ ID NO:1的F13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531或F532，其中所述nnAA包括连接部分。在一个实施例中，本公开提供了一种多肽，所述多肽包括至少一个nnAA，所述至少一个nnAA根据SEQ ID NO:1替换所述天然多肽内的天然存在的氨基酸，其中所述至少一个nnAA替换SEQ ID NO:1的K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、K527、F13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531或F532，其中所述nnAA包括连接部分。在另一个实施例中，所述nnAA选自2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸以及2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或其任何组合。在另一个实施例中，替换SEQ ID NO:1的K265。在另一个实施例中，替换SEQ ID NO:1的K386。在另一个实施例中，替换SEQ ID NO:1的K265和K386。在另一个实施例中，所述多肽包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个nnAA。在另一个实施例中，所述nnAA选自2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸以及2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或其任何组合。
在一个相关实施例中，所述多肽中的所述至少一个nnAA，并且优选地至少两个nnAA，是带有以下的2,3-双取代的丙酸：在2位处的氨基取代基；以及在3位处的含叠氮基的取代基、含1,2,4,5-四嗪基的取代基或含乙炔基的取代基。
在另一个相关实施例中，所述多肽中的所述至少一个nnAA，并且优选地至少两个nnAA，具有式XII结构：
其中：
Ar包括任选地含有至少一个杂原子的5元芳香族环或6元芳香族环；
W5选自C1-C10亚烷基、-NH-、-O-和-S-；
Q1为0或1；并且
W6选自叠氮基、任选地被低级烷基C-取代的1,2,4,5-四嗪基以及乙炔基。
在一个实施例中，本公开提供了一种组合物，所述组合物包括多肽-抗原缀合物，其中所述多肽是包括至少一个T细胞活化表位和至少一个nnAA的载体蛋白，并且其中所述抗原与所述nnAA缀合。在另一个实施例中，所述多肽-抗原缀合物通过蛋白质-抗原-蛋白质连接交联。在另一个实施例中，所述组合物包括多种载剂-蛋白抗原缀合物，其中每种缀合物包括不同的抗原(例如，来自不同的肺炎球菌血清型的荚膜多糖)。在另一个实施例中，所述抗原源自相同生物体的不同血清型(例如，针对肺炎球菌)或血清组(例如，针对脑膜炎球菌)。在另一个实施例中，所述抗原为多糖。在另一个实施例中，所述抗原为肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血杆菌(例如，Hib)、酿脓链球菌或无乳链球菌的荚膜多糖。在另一个实施例中，所述抗原是源自牙龈卟啉单胞菌的六种血清型中的一种血清型(例如，K1、K2、K3、K4、K5和/或K6)的荚膜多糖。在另一个实施例中，所述抗原为选自由以下组成的组的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F以及其任何组合。在另一个实施例中，所述组合物包括如本文所描述的蛋白质载剂-抗原缀合物，其中存在至少14种、20种、21种、24种或25种不同的载体蛋白-荚膜多糖缀合物，每种缀合物包括选自由以下组成的组的肺炎链球菌血清型的不同的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F。在另一个实施例中，所述多糖与所述载体蛋白的比率(w/w)大于1。在另一个实施例中，所述载体蛋白包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个nnAA。在另一个实施例中，所述nnAA选自2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸以及2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或其任何组合。在另一个实施例中，所述载体蛋白与选自以下的蛋白质具有至少80％的序列一致性：白喉毒素(DT)、破伤风毒素(TT)、嗜血杆菌蛋白D(PD)、血清组B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物(OMPC)和CRM197。在另一个实施例中，所述载体蛋白与CRM197具有至少80％的序列一致性。在另一个实施例中，所述载体蛋白与SEQ ID NO:1具有至少80％的序列一致性。在另一个实施例中，载体蛋白与SEQ ID NO:1具有至少80％的序列一致性，进一步地，其中所述至少一个nnAA替换其中天然存在的氨基酸。在另一个实施例中，所述至少一个nnAA替换选自由以下组成的组的氨基酸：SEQ ID NO:1的K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523或K527。在另一个实施例中，所述至少一个nnAA，并且优选地至少两个nnAA，替换选自由以下组成的组的氨基酸：SEQ ID NO:1的F13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531或F532。在另一个实施例中，所述至少一个nnAA，并且优选地至少两个nnAA，替换选自由以下组成的组的氨基酸：SEQ ID NO:1的K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、K527、F13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531或F532。在另一个实施例中，所述抗原经由连接部分与所述nnAA缀合。在另一个实施例中，所述抗原经由三唑连接部分与所述nnAA缀合。
在一个相关实施例中，所述组合物中的所述多肽-抗原缀合物包括作为所述多肽的载体蛋白，所述载体蛋白包括至少一个T细胞活化表位和至少一个nnAA，并且优选地至少两个nnAA，其中所述抗原与所述nnAA缀合，并且进一步地，其中所述至少一个nnAA是带有以下的2,3-双取代的丙酸：在2位处的氨基取代基；以及在3位处的含叠氮基的取代基、含1,2,4,5-四嗪基的取代基或含乙炔基的取代基。
在另一个相关实施例中，所述组合物中的所述多肽-抗原缀合物包括作为所述多肽的载体蛋白，所述载体蛋白包括至少一个T细胞活化表位和至少一个nnAA，并且优选地至少两个nnAA，其中所述抗原与所述nnAA缀合，并且进一步地，其中所述多肽中的所述至少一个nnAA具有式XII结构：
其中：
Ar包括任选地含有至少一个杂原子的5元芳香族环或6元芳香族环；
W5选自C1-C10亚烷基、-NH-、-O-和-S-；
Q1为0或1；并且
W6选自叠氮基、任选地被低级烷基C-取代的1,2,4,5-四嗪基以及乙炔基。
在一个实施例中，本公开提供了一种用于产生缀合物的方法，所述方法包括：(a)提供活化的抗原，所述活化的抗原包括多个官能团，所述官能团包括能够与nnAA的第二化学柄(chemical handle)缀合的第一化学柄；(b)在所述第一化学柄和所述第二化学柄反应的条件下将所述活化的抗原与包括所述nnAA中的至少一个nnAA的多肽组合以形成抗原-多肽缀合物，其中所述多肽包括至少一个T细胞活化表位；以及(c)回收包括所述缀合物的组合物。在另一个实施例中，所述抗原为多糖。在另一个实施例中，所述抗原为肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血杆菌(例如，Hib)、酿脓链球菌或无乳链球菌的荚膜多糖。在另一个实施例中，所述抗原为选自由以下组成的组的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F以及其任何组合。在另一个实施例中，所述抗原是源自牙龈卟啉单胞菌的六种血清型中的一种血清型(例如，K1、K2、K3、K4、K5和/或K6)的荚膜多糖。在另一个实施例中，在产生所述活化的抗原时，所述抗原与选自由CDAP、CDI或高碘酸盐组成的组的第一试剂反应。在另一个实施例中，所述第一试剂小于1M高碘酸盐。在另一个实施例中，所述多个官能团包括羟基。在另一个实施例中，所述多个官能团包括醛基。在另一个实施例中，所述抗原与第二试剂反应，所述第二试剂包括选自由炔丙基、DIFO、DBCO和DBCO(PEG)n-NH2组成的组的官能团。在另一个实施例中，所述抗原与包括DBCO-NH2的第二试剂反应。在另一个实施例中，所述第一化学柄包括炔烃基团。在另一个实施例中，所述第二化学柄包括叠氮基。在另一个实施例中，所述组合物中的所述缀合物的所述抗原与所述多肽的比率(w/w)大于1。
在一个相关实施例中，所述用于产生缀合物的方法包括：(a)活化抗原以在其中并入至少一个第一化学柄，其中所述第一化学柄能够与所述多肽中的nnAA的第二化学柄缀合；(b)在所述第一化学柄和所述第二化学柄反应的条件下将所述活化的抗原与包括所述nnAA中的至少一个nnAA的多肽组合以形成抗原-多肽缀合物，其中所述多肽包括至少一个T细胞活化表位；以及(c)回收包括所述缀合物的组合物。在此实施例的一方面，活化所述抗原包括将至少一个炔基并入所述抗原中作为所述第一化学柄。
在另一个相关实施例中，提供了一种用于产生多肽-抗原缀合物的方法，所述方法包括：通过在抗原中并入至少一个炔基作为第一化学柄来活化所述抗原；以及使所述抗原与包括至少一个nnAA，并且优选地至少两个nnAA，的多肽反应，所述nnAA带有作为第二化学柄的叠氮基，由此使非催化共价生物缀合反应能够在所述多肽与所述抗原之间进行。在优选的实施例中，限制所述炔基以增加例如环结构(如二芳基应变环辛炔)中的反应性。
在一个实施例中，本公开提供了一种在受试者中引发对抗原的免疫保护性抗体应答的方法，所述方法包括在适于胃肠外给药的赋形剂中向所述受试者给予如本文所描述的缀合物。
在一个实施例中，本公开提供了一种在受试者中引发对抗原的免疫保护性抗体应答的方法，所述方法包括在适于胃肠外给药的赋形剂中向所述受试者给予如本文所描述的组成物。
在一个实施例中，本公开提供了一种用于合成多肽的方法，所述多肽包括维持在约10摄氏度与约30摄氏度之间的温度下的无细胞表达混合物中的至少2个非天然氨基酸(nnAA)，其中所产生的所述多肽包括可溶级分和不可溶级分两者，并且其中所述可溶级分与所述不可溶级分的比率为至少30％(w/w)。例如，对于总量100g的多肽，所述不可溶级分将为70g或更少，并且所述可溶级分将为30g或更多。在另一个实施例中，所述温度高于约20摄氏度。在另一个实施例中，所述温度低于约20摄氏度。在另一个实施例中，所述温度介于约14摄氏度与约18摄氏度之间。在另一个实施例中，所述多肽由包括抑制密码子的核酸编码。在另一个实施例中，所述无细胞表达混合物包括对所述nnAA具有特异性的正交tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对。在另一个实施例中，所述nnAA的浓度为至少20μM(即，所述正交tRNA的浓度)。在另一个实施例中，所述nnAA的浓度低于约2mM，并且所述氨酰基-tRNA合成酶的浓度低于约5μM(即，所述正交合成酶的浓度)。在另一个实施例中，所述方法包括将所述多肽与活性部分缀合。在另一个实施例中，所述活性部分选自由以下组成的组：半抗原、细菌抗原、病毒抗原、肽毒素、大环内酯、聚醚和其任何组合。在另一个实施例中，所述表达混合物包括大肠杆菌、小麦胚芽或兔网织红细胞的细胞提取物。E.coli，wheat germ,or rabbitreticulocyte.在另一个实施例中，所述表达混合物包括至少30％的细胞提取物。在另一个实施例中，所述多肽包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个nnAA。在另一个实施例中，所述nnAA选自由以下组成的组：2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸和其任何组合。在另一个实施例中，所产生的多肽包括可溶级分和不可溶级分两者，并且其中所述可溶级分与所述不可溶级分的比率为至少60％(w/w)。在另一个实施例中，所产生的多肽包括可溶级分和不可溶级分两者，并且其中所述可溶级分与所述不可溶级分的比率为至少80％(w/w)。例如，对于总量100g的多肽，所述不可溶级分将为20g或更少，并且所述可溶级分将为80g或更多。
在一个实施例中，本公开提供了一种制备蛋白质-缀合物疫苗的改进的方法，其中抗原与提供T细胞依赖性免疫应答的载体蛋白缀合，所述改进包括将多肽用作所述载体蛋白，所述多肽包括至少一个非天然氨基酸，所述非天然氨基酸包括生物正交反应性部分，所述抗原通过所述生物正交反应性部分与所述多肽缀合。在另一个实施例中，所述抗原为细菌多糖。在另一个实施例中，所述多肽包括至少两个非天然氨基酸，所述至少两个非天然氨基酸包括生物正交反应性部分，所述抗原通过所述生物正交反应性部分与所述多肽缀合。在另一个实施例中，所述多肽包括至少一个T细胞活化表位，所述至少一个T细胞活化表位不包括非天然氨基酸，所述非天然氨基酸包括生物正交反应性部分，所述抗原通过所述生物正交反应性部分与所述多肽缀合。在另一个实施例中，所述T细胞活化表位来自蛋白质，所述蛋白质选自由以下组成的组：白喉棒状杆菌毒素、破伤风梭菌破伤风痉挛毒素、流感嗜血杆菌蛋白D(PD、HiD)、血清组B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物(OMPC)和CRM197。在另一个实施例中，所述抗原为细菌多糖，并且所述细菌选自由以下组成的组：肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血杆菌(例如，Hib)、酿脓链球菌和无乳链球菌。在另一个实施例中，所述非天然氨基酸中的至少一个非天然氨基酸选自由以下组成的组：2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸以及2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸。
在一个实施例中，本公开提供了一种用于产生载体蛋白的方法，所述载体蛋白将多个非天然氨基酸并入其结构中，所述方法包括：(a)提供编码载体蛋白的核酸，其中所述核酸包括多个抑制密码子；(b)通过将所述核酸与无细胞的细菌提取物组合来产生反应混合物，所述无细胞的细菌提取物包括所述非天然氨基酸、与所述抑制密码子互补的tRNA和氨酰基-tRNA合成酶；以及(c)在足以选择性地在对应于所述载体蛋白中的每个抑制密码子的位点处并入所述非天然氨基酸的条件下培育(b)的所述反应混合物。在另一个实施例中，所述非天然氨基酸为4-叠氮甲基苯丙氨酸(pAMF)。在另一个实施例中，步骤(c)包括在低于20摄氏度下培育所述反应混合物。在另一个实施例中，所述方法另外包括在(c)之后立即纯化所述载体蛋白。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:2的密码子25、34、38、40、213、215、228、245、265、386、523或527处选择性地取代所述抑制密码子。在另一个实施例中，(b)中的所述反应混合物进一步包括蛋白质合成所必需的生物组分。在另一个实施例中，(b)中的所述tRNA能够通过pAMF带电。在另一个实施例中，与20个天然氨基酸相比，(b)中的所述氨酰基-tRNA合成酶优选地用pAMF氨酰化所述tRNA。
在另一个实施例中，本公开提供了一种组合物，所述组合物包括至少14种、20种、21种、24种或25种不同的载体蛋白-抗原缀合物，其中所述抗原为荚膜多糖，并且(a)每种不同的载体蛋白-抗原缀合物中的所述荚膜多糖来自肺炎链球菌的不同血清型；(b)所述载体蛋白-抗原缀合物的所述载体蛋白包括多肽，所述多肽包括至少一个T细胞活化表位和至少两个非天然氨基酸(nnAA)；并且(c)所述荚膜多糖与所述nnAA缀合。在此实施例的优选版本中，根据SEQ ID NO:1，所述至少一个T细胞活化表位来自CRM197；所述多肽与SEQ ID NO:1具有至少80％或95％的序列一致性；并且(i)所述多肽包括2-9个nnAA；(ii)所述多肽包括4-6个nnAA；和/或(iii)至少一个nnAA取代选自由以下组成的组的氨基酸：(a)CRM197的K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、、K245、K265、K386、K523、K527；(b)SEQ ID NO:1的F13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531或F532；或(c)SEQ ID NO:1的K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、K527、F13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531或F532。前述实施例的优选版本包含：包括至少14种、20种、21种、24种或25种不同的载体蛋白-抗原缀合物的组合物，其中每种不同的载体蛋白-抗原缀合物包含单独地选自肺炎链球菌血清型的所述荚膜多糖的抗原，所述肺炎链球菌血清型选自由以下血清型组成的组：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F；至少24种不同的载体蛋白-抗原缀合物的组合物，其中所述不同的载体蛋白-抗原缀合物中的24种载体蛋白-抗原缀合物的所述荚膜多糖来自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F；包括至少25种不同的载体蛋白-抗原缀合物的组合物，其中所述不同的载体蛋白-抗原缀合物中的至少一种载体蛋白-抗原缀合物的所述荚膜多糖来自肺炎链球菌血清型，所述肺炎链球菌血清型选自由以下组成的组：6C、7C、13、15A、15C、16、16F、23A、23B、24F、31、34、35B、33F、35F、37和38；以及包括至少25种不同的载体蛋白-抗原缀合物的组合物，其中所述不同的载体蛋白-抗原缀合物中的至少一种载体蛋白-抗原缀合物的所述荚膜多糖来自肺炎链球菌血清型，所述肺炎链球菌血清型选自由15A和35B组成的组或者可替换地选自由20A、20B和24B组成的组。
在一个实施例中，本公开提供了包括至少14种、20种、21种、24种或25种不同的载体蛋白-抗原缀合物的组合物，其中所述抗原为肺炎链球菌的荚膜多糖，其中(a)每种不同的载体蛋白-抗原缀合物中的所述荚膜多糖来自肺炎链球菌的不同血清型；(b)所述载体蛋白-抗原缀合物的所述载体蛋白是包括至少一个T细胞活化表位和至少两个非天然氨基酸(nnAA)的多肽，并且所述荚膜多糖与所述nnAA缀合；(c)存在不同的载体蛋白-抗原缀合物，其包括肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F中的每种肺炎链球菌血清型的荚膜多糖；并且(d)存在至少一种另外的不同的载体蛋白-抗原缀合物，其包括来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，所述肺炎链球菌血清型选自由以下血清型组成的组：2、6C、8、9N、10A、12F、15A、15B、15C、16F、17F、20、20A、20B、22F、23A、23B、24F、24B、31、33F、34、35B、35F和38。例如，所述组合物可以包含：(i)至少20种或21种不同的载体蛋白-抗原缀合物，其包含肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F中的每种肺炎链球菌血清型的缀合物；或(ii)至少24种不同的载体蛋白-抗原缀合物，其中存在包括肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F中的每种肺炎链球菌血清型的荚膜多糖的不同的载体蛋白-抗原缀合物。
在一个实施例中，本公开提供了一种多肽-抗原缀合物，其中所述多肽包含3个或更多个nnAA残基，并且所述缀合物具有至少500kDa的分子量。所述多肽可以是含有3个或更多个nnAA残基(例如，3-9个或3-8个或3-7个或3-6个nnAA残基)的CRM197(例如，如下文第5a部分所讨论的，包括与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列一致性的氨基酸序列)。所述抗原可以是如肺炎球菌荚膜多糖等细菌多糖。所述缀合物的分子量可以为至少600kDa、至少800kDa、至少900kDa或至少1MDa，例如介于1-5MDa之间。如本文进一步所讨论的，这些缀合物的多种制剂可以组合到用作多价疫苗的本发明的组合物中，其中每种制剂由来自不同的肺炎链球菌血清型的肺炎球菌荚膜多糖制备。本文还进一步讨论了这种缀合物中所表示的肺炎链球菌血清型的优选选择。
在一个实施例中，本公开提供了一种多肽-抗原缀合物，其中所述多肽包含4个或更多个nnAA残基。所述多肽可以是含有4个或更多个nnAA残基(例如，4-9个或4-8个或4-7个或4-6个nnAA残基)的CRM197(例如，如下文第5a部分所讨论的，包括与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列一致性的氨基酸序列)。所述抗原可以是如肺炎球菌荚膜多糖等细菌多糖。所述缀合物的分子量可以为至少500kDa(例如，至少600kDa、至少800kDa、至少900kDa或至少1MDa，例如，在1-5MDa之间)。如本文进一步所讨论的，这些缀合物的多种制剂可以组合到用作多价疫苗的本发明的组合物中，其中每种制剂由来自不同的肺炎链球菌血清型的肺炎球菌荚膜多糖制备。本文还进一步讨论了这种缀合物中所表示的肺炎链球菌血清型的优选选择。
在一个实施例中，本公开提供了一种适于制备免疫原性多糖-蛋白质缀合物的蛋白质，其中所述蛋白质(i)包含至少一个nnAA并且(ii)在20℃下，在pH值为7.4的Tris缓冲液中具有至少50mg/L的溶解度。所述多肽包括至少一个T细胞活化表位(如上文所讨论的)；例如，所述多肽可以是含有2个或更多个nnAA残基(例如，3-9个或4-9个或3-8个或4-8个或3-7个或4-7个或3-6个或4-6个nnAA残基)的CRM197(例如，如下文第5a部分所讨论的，包括与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列一致性的氨基酸序列)。所述蛋白质可以与如肺炎球菌荚膜多糖等细菌多糖缀合以制备缀合物。溶解度可以为至少100mg/L、至少200mg/L或甚至至少250mg/L。如本文进一步所讨论的，这些缀合物的多种制剂可以组合到用作多价疫苗的本发明的组合物中，其中每种制剂由来自不同的肺炎链球菌血清型的肺炎球菌荚膜多糖制备。本文还进一步讨论了这种缀合物中所表示的肺炎链球菌血清型的优选选择。
附图说明
通过参考阐述说明性实施例的以下具体实施方式和附图来进一步说明本文所描述的实施例的特征和优点。
图1示出了在CFPS反应中在30摄氏度、25摄氏度或20摄氏度下产生的含有6个nnAA的eCRM的产率，所述CFPS反应任选地补充有增加量的tRNA(otRNA)或nnAA/aaRS合成酶(nnAA)。每列示出了两个条，所述两个条表示总产率和可溶产率两者。
图2示出了考马斯(coomassie)图像(2A)和荧光(2B)凝胶图像，所述图像展示出针对在无细胞蛋白质合成(CFPS)反应中产生的单一位点eCRM的合成蛋白质的相对产率(2A)和并入eCRM中的pAMF与DBCO-荧光素反应的能力(2B)。在图2A中，序列梯从上到下示出10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、37kDa、50kDa、75kDa、100kDa、150kDa和250kDa。在图2B中，荧光标记物在25kDa和75kDa处。泳道如下：L＝序列梯；W＝野生型；C＝C末端TAG；然后，泳道1-12具有TAG以分别在位置11、25、34、38、40、52、60、77、83、91、96和103处替换Lys。
图3示出了在小鼠中给予单价肺炎球菌多糖-eCRM缀合物后的调理吞噬(OPA)活性(GMT)。在X轴上示出了血清型。白色条为佐剂化的多糖，而黑色条为佐剂化的缀合物。
图4示出了在小鼠中给予单价肺炎球菌多糖-eCRM缀合物后的IgG应答(GMT)。在X轴上示出了血清型。白色条为佐剂化但未缀合的多糖；黑色条为佐剂化的缀合物。
图5示出了在兔中给予多价肺炎球菌疫苗后的IgG应答(GMT)。每种血清型(X轴)具有针对本发明的24价缀合物疫苗(左)、Prevnar-13TM(中)和24价未缀合疫苗(右)的数据。所述数据为平均值+/-95％置信区间。
图6类似于图5但示出了OPA应答(GMT)。
具体实施方式
在蛋白质-缀合物疫苗中，通过附接于已知的“强”蛋白抗原来扩增对“弱”抗原的免疫应答。在这些半合成生物分子中，产生强烈的、长寿命的T细胞依赖性免疫应答的蛋白质(“T细胞依赖性抗原”)通常通过非特异性氧化/还原化学附接于“弱”抗原上。这些免疫原性蛋白上的T细胞活化特征将辅助T细胞募集到识别所附接弱抗原的B细胞上，并且因此允许对其它方面弱免疫原性分子的强烈的、长寿命的免疫应答。
用于蛋白质-缀合物疫苗生产的当前方法和结构单元阻碍了将缀合物疫苗更广泛地应用于治疗和预防疾病。首先，相对较少的强蛋白抗原具有足以用作缀合物疫苗中的载剂的耐化学性、无毒性和可扩展性。其次，通常用于缀合物疫苗生产的氧化/还原化学使得难以保留载剂上的表位和最大免疫原性所需的抗原。第三，这些氧化/还原反应的相对较低的效率使质量控制和纯化复杂化，尤其是在商业规模上。
重组型蛋白产生允许优化载体蛋白的抗原性和无毒性，但是现有载体蛋白难以在重组型细胞中产生，并且完全工程化的蛋白难以以高产率产生。更温和的缀合反应使载剂和抗原表位的变性/阻塞最小化，但是这些反应的较低效率导致载体蛋白上较少负载抗原以及更复杂的纯化方案。重要的是，针对载剂的相对较低的抗原通过抗体对载体蛋白本身的应答导致更高可能性的免疫“干扰”或载剂诱导的表位抑制的公认现象。
因此，已经鉴定了对于允许组合这些技术以产生更高免疫原性、更容易制造的缀合物疫苗的策略和试剂的需求。因此，本文描述的尤其是(1)包含增强型载体蛋白的多肽，所述增强型载体蛋白包括非天然氨基酸；(2)适于与多肽缀合的抗原，所述多肽包含增强型载体蛋白，所述增强型载体蛋白包括天然氨基酸；(3)(1)和(2)的多肽-抗原缀合物，所述多肽-抗原缀合物包含与包括非天然氨基酸的增强型载体蛋白缀合的抗原；(4)包括前述物质的疫苗组合物；以及(5)制备和使用前述物质的方法。
1.定义
术语“抑制密码子”是指在预定位置处引入多核苷酸并且被特异性tRNA识别的核苷酸三联体，所述特异性tRNA可以识别终止密码子(例如，琥珀、赭石或蛋白石终止密码子)并且允许转译通读密码子以产生蛋白质，从而抑制终止密码子。
“非天然氨基酸”(nnAA)是指不是20种常见氨基酸或热解赖氨酸或硒代半胱氨酸中的一种的氨基酸；与术语“非天然氨基酸”同义使用的其它术语是“非天然编码的氨基酸”、“非天然氨基酸”、“非天然存在的氨基酸”以及其各种以连字符连接和非连字符连接的版本。具有生物正交反应性化学侧链的非天然氨基酸能够用作化学“柄”以将各种有效负载缀合到蛋白质中的离散位点上。
在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下，术语“序列一致性”或“一致性百分比”是指如使用序列比较算法测量的，当通过比较窗口比较和比对最大对应性时，相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列(例如，用于氨基酸序列的BLASTP)。出于本文件的目的，通过全长序列(如SEQ ID NO:1中所阐述的参考序列)确定一致性百分比。如本文所提供的用于计算序列一致性的方法是BLASTP程序，所述程序的默认值设置为字长(W)为3、期望值(E)为10以及BLOSUM62评分矩阵(参见例如，Henikoff和Henikoff，1989，《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》89:10915)。参见例如可在WWW上blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi或其它地方处获得的BLAST比对工具。
术语“抗原”是指能够被适应性免疫系统的高度可变抗原受体(B细胞受体、T细胞受体或两者)识别的任何分子或线性分子片段。抗原的非限制性实例包含多糖或聚糖(例如，细菌荚膜多糖)、多核苷酸、聚氨基酸、脂质和小分子(例如，半抗原、滥用药物)。
术语“T细胞活化表位”是指能够诱导T细胞免疫的分子结构的结构单元。包含T细胞活化表位的载体蛋白的功能是众所周知的并且记载了缀合物。不希望受理论束缚，载体蛋白中的T细胞活化表位使得共价附接的抗原能够通过抗原呈递细胞加工并且呈递给CD4+ve T细胞以诱导针对抗原的免疫记忆。
术语“B细胞表位”通常是指能够诱导B细胞应答的大分子结构的那些特征。与T细胞表位相反，B细胞表位不需要包括肽，因为通过抗原呈递细胞的加工和向MHC的肽结合裂隙的加载不是B细胞活化所必需的。
如本文所用，“载体蛋白”是指含有T细胞活化表位的无毒或解毒多肽，所述多肽能够附接到抗原(例如，多糖)上以增强对受试者中的缀合抗原的体液应答。所述术语“载体蛋白”包含在FDA批准的疫苗中用作表位载剂的细菌蛋白中的任何细菌蛋白。在一些实施例中，载体蛋白是白喉棒状杆菌毒素、破伤风梭菌破伤风痉挛毒素、流感嗜血杆菌蛋白D(PD、HiD)、血清组B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物(OMPC)、CRM197或疟原虫动合子特异性表面蛋白Pfs25。在另一个实施例中，载体蛋白是源自链球菌菌株G148的G蛋白的BB。“天然载体蛋白”仅具有天然存在的氨基酸。“增强型载体蛋白”具有至少一个替换载体蛋白中的天然存在的氨基酸的非天然氨基酸。
如本文所用，术语“免疫原性多肽”是指包括至少一个T细胞活化表位的多肽，其中T细胞表位源自能够诱导动物的免疫记忆的蛋白质。
如本文可互换使用的术语“eCRM”或“增强型CRM”是指白喉毒素的G52E密码子变体的经过修饰的版本，其中天然氨基酸残基中的至少一个残基取代非天然氨基酸，并且多肽保留至少一个T细胞活化表位。
如本文所用，当用术语“修饰的”、“替换的”、“增强的”和“取代的”描述多肽的残基时，所述术语被认为是同义的，并且在所有情况下都指用非天然氨基酸替换多肽链内的天然存在的氨基酸。
如本文所用，术语“T非依赖性抗原”是指诱导B细胞介导的免疫特征的抗原或不诱导与如同种型转换或免疫记忆等辅助T细胞介导的免疫相关的过程的抗原。
如本文所用的术语“多糖”是以其普通含义使用的，包含但不限于包括多个重复单元的糖类、包含但不限于具有50个或更多个重复单元的多糖类以及具有50个或更少重复单元的寡糖。通常，多糖类具有约50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个或95个重复单元到约2,000个或更多个重复单元、以及任选地约100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个重复单元到约1100个、1200个、1300个、1400个、1500个、1600个、1700个、1800个或1900个重复单元。寡糖通常具有约6个、7个、8个、9个或10个重复单元到约15个、20个、25个、30个或35个到约40个或45个重复单元。
如本文所用，术语“聚糖”是指由通过糖苷连接彼此连接的单糖(例如，葡萄糖)残基组成的任何直链或支链聚合物。聚糖的实例包含糖原、淀粉、透明质酸和纤维素。“聚糖”的其它实例包含细菌荚膜多糖。
如本文所用，术语多糖或载体蛋白-多糖缀合物的“分子量”是指通过尺寸排阻色谱法(SEC)与多角度激光散射(MALS)的组合计算的分子量。
如本文所用的术语“低级烷基”，并且除非另有说明，是指具有1到6个碳原子的饱和的直链或支链烃，即C1-C6烷基。在某些实施例中，低级烷基团是伯烃、仲烃或叔烃。所述术语包含取代的和未取代的部分两者。还参见US-2014/0066598。术语“低级亚烷基”是指低级烷基的亚烷基。
本文所公开的各个实施例的化合物或其药学上可接受的盐含有一个或多个不对称中心并且产生对映异构体、非对映异构体和其它立体异构形式，其根据绝对立体化学定义为(R)或(S)或者定义为氨基酸的(D)或(L)。本公开意在包含所有这些异构体以及其外消旋和光学纯形式。本文所用的nnAA通常是在α-碳上具有手性中心的α氨基酸，并且其优选地为(L)异构体。
本文所用的化学命名方案和结构图是I.U.P.A.C.命名系统的经过修改的形式，所述系统使用ACD/Name 9.07版软件程序和/或ChemDraw Ultra 11.0.1版软件命名程序(CambridgeSoft公司)。除如下文所描述的之外，本文所有键都在化学结构图中鉴定，除假定与足够的氢原子键合以使化学价完整的一些碳原子上的所述键之外。
2.一般方法
除非另有限定，否则本文所用的所有技术术语和科学术语具有通常理解的含义。从业者特别地参照Green和Sambrook(编辑),《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第4版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress),纽约冷泉港(2012)和Ausubel,F.M.等人,《分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(增刊99),约翰·威利父子出版公司(John Wiley&Sons),纽约(2012)以及Plotkin,S.A.、Orenstein,W.A.和Offit,P.A.,《疫苗(Vaccinies)》,第6版,爱思唯尔公司(Elsevier),伦敦,(2013)，所述文献的定义和术语通过引用并入本文中。标准方法也出现在以下中：Bindereif、Schon和Westhof(2005)《RNA生物化学手册(Handbook of RNA Biochemistry)》,Wiley-VCH出版社,德国魏恩海姆，其描述了RNA操纵和分析的详细方法，并且通过引用并入本文中。用于产生重组型核酸的合适分子技术的实例和许多克隆练习的说明可在Green和Sambrook(同上)中找到；Ausubel,F.M.等人(同上)；Berger和Kimmel,《分子克隆技术指南(Guide to Molecular CloningTechniques)》、《酶学方法(Methods in Enzymology)》(第152卷,学术出版社(AcademicPress,Inc.),圣地亚哥,加利福尼亚州,1987)；以及《PCR方案：方法和应用指南(PCRProtocols:A Guide to Methods And Applications)》(学术出版社,圣地亚哥,加利福尼亚州,1990)，所述文献通过引用并入本文中。用于活化和衍生化具有化学柄的生物分子的合适生物有机技术的实例以及设计这种合成的说明可在Hermanson,G.T,《生物缀合技术(Bioconjugate Techniques)》,第2版,爱思唯尔公司,伦敦(2008)中找到。对于本文所描述的胃肠外给予生物分子所必需的技术和组分的实例，从业者参照Remington,《药剂学要点(Essentials of Pharmaceutics)》,医药出版社(Pharmaceutical Press),伦敦(2012)。用于蛋白质纯化、色谱、电泳、离心和结晶的方法描述于以下中：Coligan等人,(2000)《蛋白质科学实验指南(Current Protocols in Protein Science)》,第1卷,约翰·威利父子出版公司,纽约。用于无细胞合成的方法描述于以下中：Spirin和Swartz(2008)《无细胞蛋白质合成(Cell-free Protein Synthesis)》,Wiley-VCH出版社,魏恩海姆,德国。用于使用无细胞合成将非天然氨基酸并入蛋白质中的方法描述于以下中：Shimizu等人,(2006)《FEBS期刊(FEBS Journal)》,273,4133-4140以及Chong(2014)《分子生物学实验指南》108:16.30.1-11。
例如在以下中描述了PCR扩增方法：Innis等人,《PCR方案：方法和应用指南(PCRProtocols:A Guide to Methods And Applications)》,学术出版社,圣地亚哥,加利福尼亚州,1990以及Domingues(编辑)《PCR：方法和方案(PCR:Methods and Protocols)》ISBN1493970593(2017)。扩增反应通常包含待扩增的DNA、热稳定DNA聚合酶、两个寡核苷酸引物、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、反应缓冲液和镁。通常，热循环的期望数量介于1与25之间。可在分子生物学文本中找到用于引物设计和PCR条件优化的方法，所述文本如Ausubel等人,《精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)》,第5版,Wiley出版社,2002以及Innis等人,《PCR方案(PCT Protocols)》,学术出版社,1990。计算机程序可用于设计具有所需特异性和最佳扩增特性的引物(例如，Oligo 5.0版(NationalBiosciences公司))在一些实施例中，PCR引物另外含有用于限制性核酸内切酶的识别位点，以促进将扩增的DNA片段插入到载体中的特异性限制酶位点中。如果将限制性位点添加到PCR引物的5'末端，则优选地包含少量(例如，两个或三个)额外的5'碱基以允许通过酶进行更高效的切割。在一些实施例中，PCR引物还含有如T7或SP6等RNA聚合酶启动子位点，以允许随后的体外转录。可在原始资料中找到用于体外转录的方法，所述原始资料如VanGelder等人,《美国国家科学院院刊》87:1663-1667,1990；Eberwine等人，《美国国家科学院院刊》，89:3010-3014，1992。
通过尺寸排阻色谱法(SEC)与多角度激光散射(MALS)的组合来测量多糖或载体蛋白-多糖缀合物的分子量。SEC MALS-UV-RI设置由与用于检测洗脱物类的DAWN-HELEOS多角度激光散射检测器和Optilab T-rEX差分折射干涉仪(加利福尼亚州圣塔芭芭拉美国怀雅特技术公司(Wyatt Technology))相符的安捷伦(Agilent)HPLC1100(包含脱气装置、四元泵、温控自动进样器、温控柱室和UV-VIS二极管阵列检测器)组成。将以下柱系列附接到此系统：TSKgel Guard PWXL 6.0mm ID×4.0cm长，12μm颗粒；TSKgel 6000PWXL 7.8mm ID×30cm长，13μm颗粒；以及TSKgel 3000PWXL 7.8mm ID×30cm长，7μm颗粒。将柱室设置为25℃并且将样品室设置为4℃。以0.5mL/min的流速使用由具有5％v/v乙腈的0.2μm过滤的1×PBS组成的流动相。在0.2-1.5mg/mL多糖的浓度范围内注射样品，并且调节注射体积以产生30-40μg的总注射质量。使用安捷伦Open Lab软件来控制HPLC，并且使用怀雅特Astra 7软件来收集和分析数据。所述技术揭示了样品中缀合物的绝对分子量的分布，并且以平均值表示群体的结果。
在一些实施例中，使用本领域普通技术人员已知的分离程序直接从细菌中获得肺炎链球菌分离的荚膜多糖(参见例如在以下中所公开的方法：美国专利申请公开号2006/0228380、2006/0228381、2007/0184071、2007/0184072、2007/0231340以及2008/0102498和WO 2008/118752)。在其它实施例中，从商业来源(例如，ATCC)获得肺炎链球菌分离的荚膜多糖。
3.多肽
本文描述了包括至少一个nnAA残基的多肽。合适的多肽包含任何生物活性多肽。在一些实施例中，多肽为免疫原性多肽。在一些实施例中，nnAA残基取代特定多肽的天然残基。在其它实施例中，nnAA残基附加在特定多肽的序列之前、之后或插入到所述序列内。在另外的实施例中，多肽包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个nnAA残基。在另一个实施例中，所述多肽包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个nnAA残基。在另一个实施例中，所述多肽包括2-9个nnAA残基，并且优选地4-6个nnAA残基。在又另外的实施例中，多肽包括2个或更多个化学上不同的nnAA残基。
在一个实施例中，本公开提供了一种包括nnAA残基的免疫原性多肽。在另一个实施例中，所述多肽包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个nnAA残基。在另一个实施例中，至少两个非天然氨基酸残基包括至少两个不同的非天然氨基酸。在另一个实施例中，至少两个不同的非天然氨基酸选自由以下组成的组：2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸或2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸以及其任何组合。在另一个实施例中，所述多肽包括载体蛋白的T细胞活化表位。在另一个实施例中，所述多肽为载体蛋白。在另一个实施例中，所述nnAA不处于所述载体蛋白的T细胞活化表位中。在另一个实施例中，nnAA取代赖氨酸残基。在另一个实施例中，所述多肽与抗原缀合。在另一个实施例中，抗原与nnAA缀合。在另一个实施例中，抗原包括选自由以下组成的组的T细胞非依赖性抗原：半抗原、细菌荚膜多糖、细菌脂多糖或肿瘤衍生的聚糖。在另一个实施例中，抗原包括如胞外多糖(例如，金黄色葡萄球菌胞外多糖)等细菌非荚膜多糖。
在一个实施例中，本公开提供了一种包括nnAA残基的载体蛋白。在另一个实施例中，载体蛋白包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个nnAA残基。在另一个实施例中，非天然氨基酸选自由以下组成的组：2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸或2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸以及其任何组合。在另一个实施例中，nnAA取代赖氨酸残基。在另一个实施例中，nnAA残基位于不在载体蛋白的T细胞活化表位中的位置处。在另一个实施例中，取代选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1的K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K265、K386、K523和K527以及其任何组合。在另一个实施例中，取代包括SEQ ID NO:1的K25、K213、K245、K265、K386和K523的组合。在另一个实施例中，载体蛋白包括抗原。在另一个实施例中，抗原包括选自由以下组成的组的T非依赖性抗原：半抗原、细菌荚膜多糖、细菌脂多糖或肿瘤衍生的聚糖。在另一个实施例中，所述抗原为多糖。在另一个实施例中，所述多糖为选自由以下组成的组的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F以及其任何组合。在另一个实施例中，所述多肽能够产生T细胞依赖性免疫应答。
在一个实施例中，本公开提供了一种蛋白质，所述蛋白质包括与载体蛋白的氨基酸残基缀合的抗原，其中没有抗原与载体蛋白的天然氨基酸残基缀合。在另一个实施例中，没有抗原与载体蛋白的赖氨酸残基缀合。在另一个实施例中，氨基酸不在载体蛋白的T细胞活化表位中。在另一个实施例中，抗原包括选自由以下组成的组的T非依赖性抗原：半抗原、细菌荚膜多糖、细菌脂多糖或肿瘤衍生的聚糖。在另一个实施例中，所述抗原为多糖。在另一个实施例中，所述多糖为选自由以下组成的组的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F以及其任何组合。
理想地，当在无细胞蛋白合成系统中表达时，载体蛋白应当具有至少50mg/L(例如，至少100mg/L、至少150mg/L、至少200mg/L或至少250mg/L)的溶解度。
当载剂包含多于一个nnAA残基时，优选地仅包含单一种类的nnAA(例如，载剂中唯一的nnAA为pAMF)。这允许在每个nnAA处同时使用相同的缀合化学。如果期望将两种不同的抗原附接到单个载剂分子上，这可以通过在单一载剂内使用不同的nnAA种类并且将每种抗原与不同的nnAA缀合来实现，但优选地为在载剂中将每种抗原与单一种类的nnAA缀合。此外，当组合物包含多种不同的缀合物(例如，不同的肺炎球菌血清型)时，优选地是每种缀合物包含相同的单一种类的nnAA。另外，当组合物包含多种不同的缀合物(例如，不同的肺炎球菌血清型)时，优选地是每种缀合物包含相同的载体蛋白。
在另一个实施例中，本公开提供了一种对本文所描述的多肽进行编码的多核苷酸。在另一个实施例中，本公开提供了一种表达载体，所述表达载体包括对本文所描述的多肽进行编码的多核苷酸。在另一个实施例中，本公开提供了一种包括表达载体的宿主细胞。
4.非天然氨基酸
nnAA残基任选地包括本申请中所描述的非天然氨基酸中的任何非天然氨基酸或已经鉴定为与基于细胞或无细胞的蛋白质合成相容的其它氨基酸(参见例如，Schultz等人,《生物化学年鉴(Annu Rev Biochem)》2010；79:413-44,尤其是第418-420页；以及Chin等人,《生物化学年鉴》,2014；83:5.1-5.30，所述文献通过引用特此并入)。
可以用于实施例的方法中的非天然氨基酸的实例包含：酪氨酸氨基酸的非天然类似物；谷氨酰胺氨基酸的非天然类似物；苯丙氨酸氨基酸的非天然类似物；丝氨酸氨基酸的非天然类似物；苏氨酸氨基酸的非天然类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤代、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、巯基、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸根(borate)、硼酸盐(boronate)、磷酸基、膦酰基、膦、杂环基、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮基或氨基取代的氨基酸或其任何组合；具有可光活化的交联剂的氨基酸；自旋标记的氨基酸；荧光氨基酸；具有新颖官能团的氨基酸；与另一个分子共价或非共价相互作用的氨基酸；金属结合氨基酸；含金属的氨基酸；放射性氨基酸；光笼蔽氨基酸和/或可光致异构化的氨基酸；含生物素或生物素类似物的氨基酸；糖基化或碳水化合物修饰的氨基酸；含酮基的氨基酸；包括聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；化学可裂解或可光裂解的氨基酸；具有细长侧链的氨基酸；含毒性基团的氨基酸；糖取代的氨基酸，例如糖取代的丝氨酸等；碳连接的含糖的氨基酸；氧化还原活性氨基酸；含α-羟基的酸；含氨基硫酸的氨基酸；α,α双取代的氨基酸；β氨基酸；除脯氨酸外的环状氨基酸等。
用于与本发明一起使用的特别优选的nnAA是那些可以在转译期间(在细胞或无细胞系统中)并入并且提供未在20个天然存在的氨基酸中的任何氨基酸中发现的官能团的nnAA。用于将这种氨基酸并入多肽中的各种技术是已知的，例如参见Young和Schultz(2010),《生物化学杂志(J Biol Chem)》,285:11039-44；Maza等人(2015),《生物缀合化学(Bioconjugate Chem.)》,26:1884-9；以及Zimmerman等人,(2014)《生物缀合化学》,25:351-61。
具体地，nnAA残基任选地包括适合于与单独的抗原分子或半抗原上的对应基团进行“点击”化学反应的化学基团。用于“点击”化学的合适的化学基团包含但不限于叠氮化物(N3)、炔烃(C≡C)、烯烃(C＝C)和1,2,4,5-四嗪基团。
缀合物包括多肽和抗原，其中所述多肽是包括至少一个T细胞活化表位和至少一个nnAA，优选地至少两个nnAA，的载体蛋白，其中所述抗原与所述至少一个nnAA缀合。在一些实施例中，所述至少一个nnAA是带有以下的2,3-双取代的丙酸：在2位处的氨基取代基；以及在3位处的含叠氮基的取代基、含1,2,4,5-四嗪基的取代基或含乙炔基的取代基。
在另一个相关实施例中，缀合物包括多肽和抗原，其中所述多肽是包括至少一个T细胞活化表位和至少一个nnAA残基的载体蛋白，其中抗原与nnAA缀合，并且进一步地，其中nnAA残基对应于具有式XII结构的氨基酸：
其中：
Ar包括任选地含有至少一个杂原子的5元芳香族环或6元芳香族环；
W5选自C1-C10亚烷基、-NH-、-O-和-S-；
Q1为0或1；并且
W6选自叠氮基、任选地被低级烷基C-取代的1,2,4,5-四嗪基以及乙炔基，
使得所述多肽中的所述nnAA残基具有式XIII结构：
其中R3为OH或所述载体蛋白的氨基酸残基，并且R4为H或所述载体蛋白的氨基酸残基。
在一个实施例中，本公开提供了一种多肽，所述多肽包括至少一个nnAA，所述至少一个nnAA根据SEQ ID NO:1替换所述天然多肽内的天然存在的氨基酸，其中所述至少一个nnAA替换SEQ ID NO:1的K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523或K527，其中所述nnAA包括连接部分。在另一个实施例中，所述nnAA选自2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸以及2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或其任何组合。在另一个实施例中，替换SEQ ID NO:1的K265。在另一个实施例中，替换SEQID NO:1的K386。在另一个实施例中，替换SEQ ID NO:1的K265和K386。在另一个实施例中，所述多肽包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个nnAA。在另一个实施例中，所述nnAA选自2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸以及2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或其任何组合。
在另一个实施例中，所述多肽中的nnAA是带有以下的2,3-双取代的丙酸：在2位处的氨基取代基；以及在3位处的含叠氮基的取代基、含1,2,4,5-四嗪基的取代基或含乙炔基的取代基。在优选的实施例中，在3位处的取代基是含叠氮基的取代基，并且在更优选的实施例中，含叠氮基的取代基包括通过连接基团与3位处的碳原子结合的末端叠氮基。例如，连接基团可以包括亚芳基部分，所述亚芳基部分被任选地取代和任选地含有杂原子。例如，连接基团可以包括5元或6元亚芳基部分，所述5元或6元亚芳基部分含有0到4个杂原子以及0到4个非氢环取代基。
在更优选的实施例中，nnAA具有式XII结构：
其中：
Ar包括任选地含有至少一个杂原子的5元芳香族环或6元芳香族环；
W5选自C1-C10亚烷基、-NH-、-O-和-S-；
Q1为0或1；并且
W6选自叠氮基、任选地被低级烷基C-取代的1，2,4,5-四嗪基以及乙炔基。
应当理解，在这种情况下，多肽中的对应的nnAA残基具有式XIII结构：
其中R3为OH或所述载体蛋白的氨基酸残基，并且R4为H或所述载体蛋白的氨基酸残基。
在一些实施例中，Ar不含有任何杂原子，在这种情况下，优选的连接子是未取代的亚苯基(即，Ar为-C6H4-)。在其它实施例中，Ar含有氮杂原子和至少一个选自N、O和S的另外的杂原子。下文描述了示例性氮杂环，并且Ar可以是例如吡啶或哒嗪。在特别优选的实施例中，Q1为1，W5为低级亚烷基，并且W6为叠氮基。
含叠氮基的氨基酸：
在一些实施例中，nnAA残基包括含叠氮基的nnAA。在特定实施例中，nnAA残基包括式I的含叠氮基的nnAA：
其中：
D为-Ar-W3-或-W1-Y1-C(O)-Y2-W2-；
Ar为
W1、W2和W3中的每个独立地为单键或低级亚烷基；
每个X1独立地为-NH-、-O-或-S-；
每个Y1独立地为单键、-NH-或-O-；
每个Y2独立地为单键、-NH-、-O-或N-连接或C-连接的吡咯烷基；并且
Z1、Z2和Z3中的一个为-N-，并且Z1、Z2和Z3中的另两个独立地为-CH-。
在其它实施例中，nnAA残基包括式II的含叠氮基的氨基酸：
其中：
W4为C1-C10亚烷基。
在一个实施例中，nnAA残基包括选自由以下组成的组的含叠氮基的氨基酸：2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸或2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸以及其任何组合。在另外的实施例中，nnAA残基包括2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)。pAMF提供非常有利的反应动力学以产生缀合物(例如，当用SPAAC方法与含炔烃的碳水化合物抗原反应时比使用pAF快得多)。
例如在以下中发现根据式I和式II制备含叠氮基的氨基酸：Stafford等人,US2014-0066598A1，特别是段落[0331]-[0333]，所述段落通过引用并入。所述过程涉及使用亚硫酰氯用羟基取代对应芳基氨基酸的衍生物上的氯化物，然后用叠氮化物对氯化物进行亲核置换。商业上也获得了合适的含芳基侧链的氨基酸。
含1,2,4,5-四嗪基的氨基酸：
在一些实施例中，非天然氨基酸残基包括含1,2,4,5-四嗪的nnAA。在特定实施例中，非天然氨基酸包括式III的含1，2，4，5-四嗪的nnAA：
其中：
Ar为
V是单键、低级亚烷基或-W1-W2-；
W1和W2中的一个不存在或是低级亚烷基，并且另一个是-NH-、-O-或-S-；
Z1、Z2和Z3中的每一个为-CH-或-N-，并且Z1、Z2和Z3中的其它几个各自独立地为-CH-；并且X1独立地为-NH-、-O-或-S-；
R为低级亚烷基；
并且，任选地，当Ar为并且V为-NH-时，则Z1、Z2和Z3中的一个为-N-，条件是非天然氨基酸不是：
例如在以下中发现根据式III制备含1,2,4,5-四嗪的氨基酸：Yang等人,US2016-0251336A1，特别是段落[0341]-[0377]，所述段落通过引用并入。所述过程涉及将(R)-2-氨基-3-碘丙酸的氨基/羧基保护的衍生物与氨基吡啶基溴根岸(Negishi)偶联以引入Ar，然后与甲基硫代-1,2,4,5-四嗪衍生物反应以将四嗪部分引入氨基酸中。
含炔烃的氨基酸：
在一些实施例中，nnAA残基包括含炔烃的nnAA。在一个实施例中，此为炔丙基。可在以下中找到包含氨基酸合成的含各种炔丙基的氨基酸：Beatty等人,《应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.)》2006，45，7364-7；Beatty等人，《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》2005(127):14150-1；Nguyen等人，《美国化学学会杂志》2009(131):8720-1。这种含炔丙基的氨基酸适合作为nnAA使用基于细胞的系统并入蛋白质中。在一些实施例中，nnAA残基包括选自由以下组成的组的含炔丙基的nnAA：高炔丙基甘氨酸、乙炔基苯丙氨酸和N6-[(2-丙炔基氧基)羰基]-L-赖氨酸。
5.经过修饰的载体蛋白
一方面，包括至少一个nnAA残基的多肽是天然载体蛋白(例如，eCRM)的经过修饰的版本或包括天然载体蛋白的一个或多个T细胞活化表位的多肽。适合于这种修饰的载体蛋白包含但不限于在缀合物疫苗中使用的蛋白质，如白喉棒状杆菌毒素、破伤风梭菌破伤风痉挛毒素、流感嗜血杆菌蛋白D(PD、HiD)、血清组B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物(OMPC)或CRM197。
许多天然载体蛋白的氨基酸和核酸序列是公众可获得的。然而，如所提到的，这种未修饰的(或天然的)载体蛋白具有限制，包含与任何表面暴露的氨基酸的非区别性抗原缀合。结果，T细胞活化表位通常是发生抗原缀合的位点。在本公开的优选实施例中，免疫原性多肽是通过包含至少一个用作缀合位点的nnAA残基来修饰的载体蛋白。如上文所讨论的，nnAA可以取代天然残基或者通过附加在多肽的序列之前、之后或插入到所述多肽的序列内而添加到多肽中。如本文所描述的，非天然氨基酸的使用允许选择性地放置用于缀合的非天然氨基酸，并且结果是可以在抗原缀合中避免增强型载体蛋白的T细胞活化表位。
表1示出了实例天然载体蛋白的氨基酸和核酸序列(SEQ ID NO:1和2)：CRM197。本领域技术人员将认识到向通过白喉棒状杆菌发酵产生的常规CRM197的氨基酸序列添加N-末端甲硫氨酸，并且由此向常规氨基酸残基位置编号添加1。存在甲硫氨酸，因为在用于产生本文的这些载剂的无细胞蛋白合成方法中包含起始密码子。在一些方面，包括nnAA残基的增强型载体蛋白与缀合物疫苗中使用的同源天然载体蛋白或无毒载体蛋白具有至少80％的序列一致性、至少85％的序列一致性、至少90％的序列一致性或至少95％的序列一致性。
与SEQ ID NO:1(CRM197)具有序列一致性的载体蛋白包含其它突变体白喉毒素蛋白，如也已经用作缀合物中的载体蛋白的无毒K51E/E148K双突变体(Pecetta等人，2016，《疫苗》，34:1405-11)。在SEQ ID NO:1的所有这些变体中，不存在野生型白喉毒素的天然毒性(通过CRM197中的G52E突变或Pecetta等人的K51E/E148K突变)。
表1还示出了来自流感嗜血杆菌的蛋白D的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。包括nnAA残基的增强型载体蛋白可以与SEQ ID NO:8具有至少80％的序列一致性。SEQ ID NO:8中的至少一个Lys残基可以被nnAA所替换。SEQ ID NO:8内存在36个Lys残基，因此若干个残基可以被nnAA所替换并且然后用于缀合。
在相对于白喉毒素或破伤风毒素确定序列一致性的情况下，序列一致性应当相对于加工的重链序列而确定，例如相对于P00588-1的氨基酸226-567或相对于P04958-1的氨基酸458-1315(UniProt序列)。
在一些实施例中，包括nnAA残基的增强型载体蛋白包括少于载体蛋白的完整天然序列，并且相反包括至少一个或多个来自以下的T细胞活化表位：白喉棒状杆菌毒素、破伤风梭菌破伤风痉挛毒素、流感嗜血杆菌蛋白D(PD、HiD)、血清组B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物(OMPC)、CRM197、Pfs25或另一种合适的天然载体蛋白或无毒载体蛋白。在一些实施例中，通过用多聚甲醛(或通过用甲醛或戊二醛处理)然后用猝灭剂处理来限制增强型载体蛋白的毒性。在一个实施例中，包括nnAA残基的增强型载体蛋白是包括天然CRM197的多个T细胞活化表位的多肽。
表1：天然CRM197和NTHi-D氨基酸和核酸序列
5a.含nnAA的CRM197
如上文所提到的，表1示出了CRM197的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。CRM197(‘交叉反应材料197’；也称为CRM197)是白喉毒素的用于许多批准的糖缀合物疫苗的无毒突变体(例如参见，等人,(2011),《生物学(Biologicals)》39:195-204)。用于与本发明一起使用的优选的载体蛋白包括与SEQ ID NO:1具有至少90％序列一致性的氨基酸序列。例如，除存在一个或多个nnAA(其可以插入SEQ ID NO:1内，或者可以取代SEQ ID NO:1内的一个或多个氨基酸残基，例如取代Lys和/或Phe)外，载体蛋白可以包括氨基酸序列SEQ IDNO:1。
在一些实施例中，SEQ ID NO:1中的至少一个Lys残基和/或至少一个Phe残基被nnAA残基所取代。优选地是用nnAA取代SEQ ID NO:1中的多于一个残基，并且理想地，SEQID NO:1中的仅一种残基被nnAA所取代，例如仅Lys残基被取代。在SEQ ID NO:1中的多于一个残基取代nnAA的情况下，优选地是，在每个位置处使用相同的nnAA，例如每个取代位处的pAMF。
在SEQ ID NO:1内具有2-9个nnAA残基的载体蛋白是优选的，并且理想地，具有4-9个、4-8个或4-6个nnAA残基，例如4个、5个或6个nnAA残基的载体蛋白。与使用单个nnAA相比，这允许抗原更广泛地附接到载剂上，从而增加抗原:载剂的比率，同时避免对天然序列和结构的过度破坏-这可能导致不可溶性。
对CRM197的研究已经鉴定了残基P272-D291、V322-G384和Q412-I458内的T细胞表位。因此，优选地避免在SEQ ID NO:1的这些区域内引入nnAA。这些区域包含F274、F356、F361、F369、K420、K441、K446、K448和K457，所以这些区域是对于CRM197中的nnAA取代不太优选的Phe残基和Lys残基。用于被SEQ ID NO:1中的nnAA取代的优选的Lys残基为K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523或K527。用于被nnAA取代的其它有用的Lys残基为K11、K38、K83、K104、K105、K126、K158、K173、K222、K237、K243、K475和K499。用于被nnAA取代的优选的Phe残基为F13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531或F532。
对CRM197的结构研究揭示了两个一般的3D区域：第一区域从N末端延伸到Asn-374；并且第二区域从Ser-375延伸到C末端。理想地，与本发明一起使用的载剂包含第一区域中的至少一个nnAA和第二区域中的至少一个nnAA，例如每个区域中的至少2个nnAA或每个区域中的至少3个nnAA。这允许当附接到载剂时在空间上分离缀合的抗原。在第一区域中具有3个nnAA并且在第二区域中具有3个nnAA的载剂是有用的。
第一区域含有27个Lys残基，并且第二区域含有12个Lys残基。因此，可以用例如pAMF内的nnAA取代SEQ ID NO:1的N末端的374个氨基酸内的一个或多个(例如，3个)Lys残基和C末端的162个氨基酸内的一个或多个(例如，3个)Lys残基。
基于CRM197的含nnAA的载剂的优选实施例具有氨基酸序列SEQ ID NO:1，其中nnAA替换残基K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523和/或K527中的一个或多个残基。一个这样的序列是SEQ ID NO:9，其中每个X代表nnAA(优选地，如pAMF等相同的nnAA)：
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQXGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDXTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAXQYLEEFHQTALEHPELSELXTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHXTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSXLSLFFEIKS(SEQ ID NO:9)
已经发现，在无细胞蛋白合成系统中极好地表达了此载体蛋白，同时保持良好的溶解性并且当与肺炎球菌荚膜多糖缀合时提供良好的免疫原性应答。
本发明还提供了一种包含多种不同的缀合物(例如，不同的肺炎球菌血清型)的组合物，其中每种缀合物包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:9的载体蛋白(理想地，其中每个X残基是相同的nnAA，优选地为pAMF)。
SEQ ID NO:1具有不存在于野生型CRM197中但包含启动转译而不需要完整的天然前导序列的N末端甲硫氨酸(其通常将甲酰化)。在一些实施例中，本文所用的载体蛋白缺乏N末端甲硫氨酸，例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9的N末端甲硫氨酸可能不存在。在一些实施例中，基于CRM197的载体蛋白在SEQ ID NO:1的N末端的上游或SEQ ID NO:1的C末端的下游不包含天然氨基酸(并且更优选地，不包含氨基酸)。
这些含nnAA的CRM197载体蛋白尤其可用于与肺炎球菌荚膜多糖缀合。如在本文其它地方所讨论的，可以组合这些缀合物以形成多价组合物。
本发明还提供了用于制备免疫原性多糖-蛋白缀合物的蛋白质，其中所述蛋白质具有与SEQ ID NO:1具有至少80％序列一致性的氨基酸序列(例如，至少85％、至少90％或至少95％)并且包含至少一个nnAA，其中所述蛋白质具有N末端甲硫氨酸。本发明还提供了通过缀合多糖与蛋白质中的至少一个nnAA而制备的免疫原性多糖-蛋白缀合物。
本发明还提供了用于制备免疫原性多糖-蛋白缀合物的蛋白质，其中除至少一个(例如，2-9个)赖氨酸残基为nnAA外，所述蛋白质包括氨基酸序列SEQ ID NO:1。所述nnAA理想地为含叠氮基的nnAA(如优选的pAMF)、含1,2,4,5-四嗪基的nnAA或含烯基的nnAA。本发明还提供了包括一种缀合物，所述缀合物包括经由其nnAA中的至少一个nnAA与多糖抗原缀合的这种蛋白质。
本发明还提供了一种免疫原性多糖-蛋白缀合物，其中所述蛋白质为具有N末端甲硫氨酸的CRM197。
当用于制备缀合物时，含nnAA的CRM197载剂通常以单体形式存在，而不是与其它CRM197亚单元缔合以形成CRM197多聚体。
6.载体蛋白产生方法
用于产生多肽的一般方法：
通过所描述的用于产生多肽的任何方法来产生增强型载体蛋白。适合于产生多肽的方法包含但不限于固相化学肽合成、基于细胞的重组型蛋白表达(在大肠杆菌或天然宿主中)以及无细胞蛋白表达和其任何组合(例如，使用合成型肽组分和重组型肽组分的组合的表达的蛋白质连接)。
在产生增强型载体蛋白的方法的一个实施例中，带有nnAA的增强型载体蛋白通过包括“密码子重新分配”的方法而产生。在此实施例的一个变型中，使用作为20个典型氨基酸(例如，高烯丙基甘氨酸、氟化亮氨酸、叠氮高丙氨酸)的紧密结构类似物的nnAA。使用野生型氨酰基-tRNA合成酶将nnAA加载到其对应的tRNA上，并且nnAA完全替换在模板DNA序列中指定的20个典型氨基酸中的一个氨基酸。为了防止天然氨基酸的干扰，这通常需要使用被替换的天然氨基酸的营养缺陷型细菌表达菌株。此策略是氨基酸而不是残基特异性的，因为某种类型的所有AA残基都被nnAA所替换。
在产生增强型载体蛋白的方法的另一个实施例中，带有nnAA的增强型载体蛋白通过包括“无义抑制”的策略而产生。在此方法中，非天然氨基酸在模板DNA序列中通过通常不指定自然界中的氨基酸的稀有密码子或“无义”密码子来指定。Schultz(Noren等人,《科学(Science)》1989(244):182-188)和Chamberlin(Bain等人,《美国化学学会杂志(J Am ChemSoc.)》1989(111):8013-8014)已经开拓了无义抑制方法的一种变型，并且所述变型涉及使用稀有终止密码子TAG(“琥珀”密码子；RNA代码中的UAG)连同其tRNA和其对应的氨酰基-tRNA合成酶(aaRS)以将nnAA以位点特异性方式并入多肽中。
在一个实施例中，“无义抑制”方法涉及分离tRNA/aaRS对、修饰反密码子环处的tRNA以识别正交密码子(例如，琥珀密码子TAG、蛋白石密码子TGA或另一个通常不用于指定转译中氨基酸的密码子或碱基序列)以及修饰aaRS以使nnAA优于氨酰基-tRNA天然氨基酸。在此实施例的一些变型中，tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对来自与用于多肽合成的转译机制相同的生物体。在其它实施例中，tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对来自与用于多肽合成的转译机制不同的物种。已经描述了用于修饰tRNA反密码子环和aaRS活性位点的方法，也描述了工程化正交tRNA/aaRS对的实例。
在“无义抑制”方法的另一个实施例中，产生增强型载体蛋白不涉及使用工程化的氨酰基-tRNA合成酶。在此实施例中，在反密码子环处单独分离和修饰正交tRNA以识别正交密码子(例如，琥珀密码子TAG或另一个通常不用于指定转译中氨基酸的密码子或碱基序列)。然后通过合适的化学方法(例如，Heckler等人，《生物化学(Biochemistry)》1984年3月27日；23(7):1468-73的方法，所述方法涉及使用T4 RNA连接酶和突变体tRNAPhe)在体外酰化正交的工程化tRNA并且在无细胞蛋白合成提取物中对其进行补充。因为此实施例使用化学上酰化的tRNA，所以所述实施例仅与无细胞的蛋白合成方法相容。
无细胞蛋白质合成：
用于产生含nnAA的载体蛋白的特别有用的技术使用无细胞蛋白质合成。若干种无细胞蛋白质表达技术是本领域已知的，并且可以以此方式并入各个nnAA(例如参见表1：Quast等人，(2015)，《FEBS快报(FEBS Letters)589:1703-12)，同时避免nnAA的潜在细胞毒性作用。在一些实施例中，通过基于无细胞提取物的蛋白质合成产生增强型载体蛋白。在一些实施例中，无细胞提取物包括兔网织红细胞、小麦胚芽或大肠杆菌的提取物。在另外的实施例中，无细胞提取物补充有氨基酸、能量源、能量再生系统或阳离子辅因子以及其任何组合。在一些实施例中，所述提取物包括外源补充的突变体tRNA或突变体aaRS(氨酰基tRNA合成酶)以及其任何组合。在一些实施例中，所述提取物包括来自基因编码突变体tRNA或突变体aaRS以及其任何组合的大肠杆菌菌株的裂解物。在一些实施例中，用于裂解物的所述大肠杆菌菌株为RF-1减毒菌株。已经描述了用于将式I、式II和式III插入重组型多肽中的相容的无细胞蛋白质合成系统(例如，US 8715958B2、US 20160257946A1和US20160257945A1)。
在一个实例中，US8715958B2展示了基于再生无细胞大肠杆菌的系统，由此来自詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)(Wang等人,(2001)，《科学》292(5516):498-500)的tRNATyr/酪氨酸合成酶对用于将非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸(pAF)引入重组型氯霉素乙酰转移酶(CAT)、GM-CSF和TetA中。使用此系统，可以将tRNA/合成酶对补充到提取物中或转化成用于制备提取物的细菌中。
在另一个实例中，US 20160257946A1展示了：(a)如何使用诱变调整上文的詹氏甲烷球菌酪氨酸合成酶使得其优选地将对叠氮甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)加载到琥珀识别的tRNA上；以及(b)如何使用包括经过修饰的合成酶/tRNA对的无细胞合成系统选择性地将pAMF并入如曲妥珠单抗等抗体中。
在另外的实例中，US 20160257945A1展示了：(a)如何使用诱变调整上文的詹氏甲烷球菌酪氨酸合成酶使得其优选地将(S)-2-氨基-3-(5-((6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基氨基)甲基)吡啶-2-基)丙酸(吡啶基四嗪氨基酸衍生物)加载到琥珀识别的tRNA上；以及(b)如何使用包括经过修饰的合成酶/tRNA对的无细胞合成系统选择性地将(S)-2-氨基-3-(5-((6-甲基-1，2，4，5-四嗪-3-基氨基)甲基)吡啶-2-基)丙酸并入重组型GFP中。
在另外的实施例中，本公开提供了用于在含2个或更多个非天然氨基酸的无细胞提取物中产生多肽的方法。在此实施例中，所述多肽也具有与天然蛋白质相当的生物活性。在其它实施例中，所述多肽具有与天然蛋白质相当的改进的或增强的生物活性。
通过确定功能性测定中的活性水平、定量非功能性测定(例如，免疫染色、ELISA、考马斯或银染凝胶的定量等)中存在的蛋白质的量以及确定生物活性蛋白或非聚集蛋白与总蛋白的比率来任选地确定组合物中的蛋白质的比活性。通常，如此限定的比活性将为天然蛋白质的至少约5％，通常为天然蛋白质的至少约10％，并且任选地为约20％、约40％、约60％或更高。
在一些实施例中，产生含nnAA的多肽的方法涉及改变nnAA特异性tRNA、nnAA特异性合成酶、nnAA本身的浓度或转译温度以及其任何组合。此类条件任选地允许更少的转译误差、改进的nnAA并入速率、对伴随nnAA并入的蛋白质折叠所必需的改进的分子伴侣的活性、干扰nnAA并入的降低的细胞因子活性或上述机制的任何组合。
在增强型多肽产生方法的一些实施例中，nnAA特异性tRNA浓度增加到高于约20μM，这导致可溶性多肽或活性多肽的级分增加。在此实施例的另外的变型中，增加tRNA浓度，同时保持nnAA浓度低于约2mM并且维持nnAA合成酶低于约5μM。
在增强型多肽产生方法的一些实施例中，转译混合培育温度介于20摄氏度与30摄氏度之间、约20摄氏度或低于20摄氏度。在一些实施例中，这些温度改变独立地与在上文段落中所描述的nnAA特异性tRNA浓度、nnAA浓度或nnAA合成酶浓度的改变相结合。
7.序列变体
本公开的改进的载体蛋白包括一个或多个nnAA，只要保留多肽的一个或多个T细胞表位的免疫原性功能，就可在多肽内的任何位置处取代所述nnAA。当将改进的载体蛋白建立在已知载剂的基础上时，通常优选地用nnAA中的一些或所有nnAA取代已知载剂中的现有的天然存在的氨基酸，以最小化不利地影响载剂的性质的机会。然而，应当理解，nnAA可以内部插入或作为起始载剂序列的添加物插入到末端处。在一些实施例中，改进的载体蛋白(例如，eCRM)中的至少一个nnAA不存在于包括T细胞表位的蛋白质的一个或多个区域内。在另一个实施例中，在增强型免疫原性多肽中没有nnAA存在于包括T细胞表位的蛋白质的一个或多个区域内。
在一些实施例中，nnAA残基取代20个天然编码的氨基酸中的一个或多个，所述20个天然编码的氨基酸包含丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一些其它实施例中，nnAA残基取代特定类别的天然氨基酸残基中的一个或多个，如脂族、芳香族、酸性、碱性、羟基、含硫或酰胺(含酰胺基团)。在一些情况下，在一个或多个位置处，仅一个特异性氨基酸(例如，赖氨酸)取代多肽内的nnAA。在其它情况下，在两个或更多个位置处，两个或更多个不同的氨基酸(例如，赖氨酸、苯丙氨酸等)取代多肽内的nnAA。赖氨酸和苯丙氨酸优选地被nnAA所取代，因为(i)赖氨酸通常用于与现有的载体蛋白缀合，所以含nnAA的载剂可以维持相同的附接位点，并且(ii)许多有用的nnAA基于苯丙氨酸，因此与天然序列相比，具有nnAA的载剂可以具有最小的结构修饰。多肽是优选的，在所述多肽中仅单一种类的氨基酸取代nnAA，例如在所述多肽中仅Lys残基被取代。
在一些实施例中，nnAA残基取代载体蛋白的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个天然氨基酸残基。在一些实施例中，nnAA残基取代载体蛋白的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个天然氨基酸残基。在一些实施例中，nnAA残基取代SEQ ID NO:1的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个天然氨基酸残基。
在另外的方面中，nnAA取代载体蛋白内的一个或多个氨基酸残基。任选地通过将蛋白质分成亚结构域并且为取代选择在空间上不相互阻碍的单个氨基酸或氨基酸残基组来确定选定产生本文所描述的单个取代的或多个取代的nnAA变体的特异性氨基酸残基(例如，使得取代位点之间存在多埃距离)。下文讨论将CRM197分成两个结构区域。
在一些实施例中，nnAA取代带电荷的氨基酸残基。因此，nnAA可以取代天冬氨酸氨基酸残基、谷氨酸氨基酸残基、赖氨酸氨基酸残基、精氨酸氨基酸残基或组氨酸氨基酸残基。在一些实施例中，nnAA取代带负电荷的氨基酸残基，例如取代天冬氨酸残基或谷氨酸残基。在一些实施例中，nnAA取代带正电荷的氨基酸残基，例如取代赖氨酸残基、精氨酸残基或组氨酸残基。
在一些实施例中，nnAA取代免疫原性多肽内的一个或多个赖氨酸残基。例如，通过以以下方式用nnAA取代赖氨酸来产生SEQ ID NO:1的增强型版本：1)来自由K25、K34、K38和K40组成的组的一个残基；2)来自由K213和K215组成的组的一个残基；以及3)来自由K228、K245、K265、K386、K523和K527组成的组的2个到4个残基。在又另外的实施例中，被取代的特定类型的天然氨基酸残基中的一个或多个天然氨基酸残基选自由SEQ ID NO:1的K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K265、K386、K523和K527以及其任何组合组成的组。在其它实施例中，SEQ ID NO:1中的nnAA取代选自K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523和K527中的一个或多个。在一个实施例中，nnAA取代包括由SEQ ID NO:1的K25、K215、K228、K265、K386和K523组成的6个残基。在一些实施例中，SEQ ID NO:1中的nnAA取代包括K265。在其它实施例中，SEQ ID NO:1中的nnAA取代包括K386。在另一个实施例中，SEQID NO:1中的nnAA取代包括K265和K386。在另外的实施例中，nnAA取代苯丙氨酸。用于取代的优选的苯丙氨酸包含SEQ ID NO:1的F13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531或F532。由于F531和F532的接近性，通常优选地不在F531和F532两者处进行取代。
被所测试的大多数受试者识别的白喉毒素上的人CD4+细胞的结合表位涵盖残基271-290、321-340、331-350、351-370、411-430或431-450(参见，Raju等人,《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol.)》1995年12月；25(12):3207-14)。因此，在一些实施例中，被取代的一个或多个nnAA不在SEQ ID NO:1的残基271-290、321-340、331-350、351-370、411-430和/或431-450内。在一个实施例中，被取代的一个或多个nnAA不在SEQ ID NO:1的残基331-350内。在另一个实施例中，被取代的一个或多个nnAA不在SEQ ID NO:1的残基321-340内。在又另一个实施例中，被取代的一个或多个nnAA不在SEQ ID NO:1的残基431-450内。
被所测试的所有受试者识别的破伤风毒素上的人CD4+细胞的结合表位涵盖重链残基H176-195(IDKISDVSTIVPYIGPALNI[SEQ ID NO:3])以及H491-510(NNFTVSFWLRVPKVSASHLE[SEQ ID NO:4])(参见，Diethelm-Okita等人,《传染病杂志(JInfect Dis)》1997年2月；175(2):382-91)。因此，在一些实施例中，被取代的一个或多个nnAA不在破伤风毒素前体蛋白的重链肽组分的残基176-195和/或491-510内。在另一个实施例中，被取代的一个或多个nnAA不在破伤风毒素前体蛋白的重链肽组分的残基176-195内。在又另一个实施例中，被取代的一个或多个nnAA不在破伤风毒素前体蛋白的重链肽组分的残基491-510内。
被所测试的大多数受试者识别的脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白(OMP或PorA)上的人CD4+细胞的结合表位涵盖免疫显性T细胞表位，其大多位于可变区域之外并且在不同的脑膜炎球菌(和淋球菌)菌株中是保守的，例如对应于OMP的保守推定的跨膜区域(Wiertz等人,《实验医学杂志(J Exp Med.)》1992；176(1):79-88)。因此，在一些实施例中，被取代的一个或多个nnAA不在OMP的保守区域内。
被所测试的大多数受试者识别的BB(即源自链球菌菌株G148的G蛋白的载体蛋白)上的人CD4+细胞的结合表位涵盖BB序列中的氨基酸25-40(VSDYYKNLINNAKTVE[SEQ ID NO:5])、63-78(DGLSDFLKSQTPAEDT[SEQ ID NO:6])和74-89(AEDTVKSIELAEAKVL[SEQ ID NO:7])(Goetsch等人,《临床诊断实验室免疫学(Clin Diagn Lab Immunol.)》2003年1月；10(1):125-32)。因此，在一些实施例中，被取代的一个或多个nnAA不在BB序列的残基25-40、63-78和/或74-89内。
在一些实施例中，包括至少一个非天然氨基酸残基的免疫原性多肽进一步包括至少一个抗原。在一些实施例中，包括至少一个非天然氨基酸的免疫原性多肽为增强型载体蛋白并且进一步包括至少一个抗原。在一些实施例中，包括至少一个非天然氨基酸的免疫原性多肽为增强型载体蛋白并且进一步包括至少一个抗原。
8.T细胞表位
载体蛋白的T细胞表位任选地由已知方法中的任何方法确定。作为设计本公开的改进的载体蛋白的辅助，使用考虑各个因素的算法来预测蛋白质中的T细胞结合表位，如蛋白质的两亲性特性、序列基序、定量矩阵(QM)、人工神经网络(ANN)、支持向量机(SVM)、定量结构活动关系(QSAR)和分子对接模拟等(参见，Desai等人，《分子生物学方法(Methods MolBiol.)》,2014；1184:333-64)。例如，已经使用DeLisi和Berzofsky算法预测了白喉毒素/CRM中的T细胞结合表位(参见Bixler等人,WO89/06974以及《美国国家科学院院刊(PNAS)》,82:7848，1985)。可以通过实验来确认所预测的T细胞表位。例如，在存在每个片段的情况下，可以通过合成对应于免疫原性多肽(或所预测区域)的完整序列的部分重叠的肽片段并且执行对CD4+细胞系(例如，外周血单核细胞(PBMC))的增殖测定来通过实验确定所关注的免疫原性多肽的T细胞表位。已经采用此一般方法来映射白喉毒素(Raju等人,《欧洲免疫学杂志》,1995年12月,25(12):3207-14)、破伤风毒素(Diethelm-Okita等人,《传染病杂志(JInfect Dis.)》,1997年2月；175(2):382-91)、脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白(OMP)(《实验医学杂志》,1992年7月1日；176(1):79-88)以及源自链球菌菌株G148的G蛋白的载体蛋白BB(Goetsch等人,《临床诊断实验室免疫学》,2003年1月,10(1):125-32)中的T细胞表位。还可以直接筛选本公开的改进的载体蛋白的CD4+细胞增殖和/或细胞因子应答，以确定未被一个或多个nnAA的存在所灭活的T细胞表位的存在。
9.产生缀合物的方法
在一个实施例中，本公开提供了用于合成多肽的方法，所述多肽包括维持在约10摄氏度与约30摄氏度之间的温度下的无细胞表达混合物中的nnAA。在另一个实施例中，所述温度高于约20摄氏度。在另一个实施例中，所述温度低于约20摄氏度。在另一个实施例中，所述温度介于约14摄氏度与约18摄氏度之间。在另一个实施例中，所述多肽由包括抑制密码子的核酸编码。在另一个实施例中，所述无细胞表达混合物包括对所述nnAA具有特异性的正交tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对。在另一个实施例中，tRNA浓度为至少20μM。在另一个实施例中，nnAA的浓度低于约2mM，并且氨酰基-tRNA合成酶的浓度低于约5μM。在另一个实施例中，所述方法包括将所述多肽与活性部分缀合。在另一个实施例中，所述活性部分选自由以下组成的组：半抗原、细菌抗原、病毒抗原、肿瘤衍生的聚糖、肽毒素、大环内酯、聚醚以及其任何组合。在另一个实施例中，所述多肽选自由以下组成的组：生长激素、凝血因子、血浆蛋白、白细胞介素、T细胞受体细胞外结构域、生长因子细胞外结构域、细菌抗原、病毒抗原以及其任何组合。在另一个实施例中，所述表达混合物包括大肠杆菌、小麦胚芽或兔网织红细胞的细胞提取物。在另一个实施例中，所述表达混合物包括至少30％的细胞提取物。在另一个实施例中，所述多肽包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个nnAA。在另一个实施例中，nnAA选自由以下组成的组：2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸以及其任何组合。在另一个实施例中，所产生的多肽包括可溶级分和不可溶级分两者，其中可溶级分与不可溶级分的比率为至少40％(w/w)。在另一个实施例中，所产生的多肽包括可溶级分和不可溶级分两者，其中可溶级分与不可溶级分的比率为至少60％(w/w)。在一个实施例中，通过无细胞表达产生的多肽包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个nnAA，并且可溶级分与不可溶级分的比率为至少20％(w/w)、至少30％(w/w)、至少40％(w/w)、至少50％(w/w)、至少60％(w/w)至少70％(w/w)、至少80％(w/w)、至少90％(w/w)。
抗原：
本文描述了免疫原性抗原，所述免疫原性抗原任选地用化学柄进一步衍生化以促进与增强型载体蛋白附接。在一个实施例中，抗原是任何纯化的天然的、合成的或重组产生的大分子或其片段。实例包含但不限于脂质、多糖、核酸或多肽和其任何组合(例如，糖蛋白、糖脂蛋白、糖脂)。例如，糖脂任选地为糖磷脂酰肌醇。在一个实施例中，抗原为选自由以下组成的组的的T非依赖性或T活化抗原(通常为弱T活化抗原)：细菌多糖、细菌脂多糖、肿瘤衍生的聚糖或半抗原。
细菌衍生的多糖：在一个实施例中，包括多糖的抗原包括如荚膜多糖等细菌衍生的多糖。此类荚膜多糖是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌的高分子量聚合物，所述革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌用于保护微生物免于免疫应答，并且如此当目标是产生中和抗体时，所述革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌代表吸引人的疫苗靶标。此类荚膜多糖通常经由涉及渗滤、蛋白质去除、乙醇沉淀、核酸去除和冷冻干燥的方法由对应细菌的全细胞裂解物或培养上清液制备而成。实例包含但不限于Merieux方案(梅里埃研究所(Institut Merieux)(1980)Brevet Belge,80:26320)和Yavordios方案(Yavordios等人,EP0071515A1(1983))。
肺炎链球菌的荚膜多糖：在一些实施例中，荚膜多糖包括源自肺炎链球菌的荚膜多糖。肺炎链球菌是可能引起肺炎、菌血症和脑膜炎的包封的革兰氏阳性细菌。存在带有具有血清型特异性重复单元结构的荚膜多糖的90种不同的肺炎链球菌的有记录的血清型(概述于例如，Kalin、M.,《胸腔(Thorax)》1998；53:159-162)。因此，在一些情况下，抗原为选自以下的肺炎链球菌荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10F、10A、10B、10C、11F、11A、11B、11C、11D、12F、12A、12B、13、14、15F、15A、15B、15C、16F、16A、17F、17A、18F、18A、18B、18C、19F、19A、19B、19C、20、21、22F、22A、23F、23A、23B、24F、24A、24B、25F、25A、27、28F、28A、29、31、32F、32A、33F、33A、33B、33C、33D、34、35F、35A、35B、35C、36、37、38、39、40、41F、41A、42、43、44、45、46、47F、47A和48(Henrichsen，《临床微生物学杂志(JClin Microbiol)》，1995；33:2759-2762)。然而，只有这些血清型的子集通常会引起细菌感染，所述子集包含血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F。血清型6C、7C、15A、15C、16F、23A、23B、31、34、35B、35F、37和38也已经成为临床关注的血清型，血清型20A、20B和24B也是如此。在另一个实施例中，抗原为选自以下血清型的肺炎链球菌荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F。在另一个实施例中，抗原为选自以下血清型的肺炎链球菌荚膜多糖：6C、7C、15A、15C、16F、23A、23B、31、34、35B、35F、37和38。本文所描述的实施例还可以另外地包括选自血清型20A、20B和24B的肺炎链球菌荚膜多糖中的一种或多种肺炎链球菌荚膜多糖。
如上文所提到的，本发明的组合物可以包含来自至少14种、15种、20种、21种、24种或25种不同的肺炎球菌血清型的荚膜多糖的缀合物。在组合物包含14种或更多种血清型的情况下，这些血清型优选地包含13种血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。除这13种血清型外，组合物优选地包含血清型2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20、22F和/或33F中的一种或多种血清型。可替代地，除上文的13种血清型外，组合物优选地包含一种或多种血清型2、6C、8、9N、10A、12F、15A、15B、15C、16F、17F、20、20A、20B、22F、23A、23B、24F、24B、31、33F、34、35B、35F和38。15种或更多种(例如，16种或更多种)血清型的有用组合包含血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F中的每种血清型，并且也可以包含血清型8。20种或更多种(例如，21种或更多种)血清型的有用组合包含血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F中的每种血清型。24种或更多种血清型的有用组合包含血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F中的每种血清型。
Jones等人描述了常见肺炎链球菌血清型荚膜多糖重复单元的结构(Jones C等人,《巴西科学院年报(An Acad Bras Ciênc)》2005年6月；77(2):293-324)：
1型
[→3)-D-AAT-α-Galp-(1→4)-α-D-GalpA(2/3OAc)-(1→3)-α-D-GalpA-(1→]
2型
[→4)-β-D-Glcp-(1→3)-[α-D-GlcpA-(1→6)-α-D-Glcp-(1→2)]-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rh ap-(1→3)β-L-Rhap-(1→]
3型
[→3)-β-D-GlcA-(1→4)-β-D-Glcp-(1→]
4型
[→3)-β-D-ManpNAc-(1→3)-α-L-FucpNAc-(1→3)-α-D-GalpNAc-(1→4)-α-D-Galp2,3(S)Py-(1→]
5型
[→4)-β-D-Glcp-(1→4)-[α-L-PnepNAc-(1→2)-β-D-GlcpA-(1→3)]-α-L-FucpNAc-(1→3)-β-D-Sugp-(1→]
6B型
[→2)-α-D-Galp-(1→3)-α-D-Glcp-(1→3)-α-L-Rhap-(1→4)-D-Rib-ol-(5→P→]
9N型
[→4)-α-D-GlcpA-(1→3)-α-D-Glcp-(1→3)-β-D-ManpNAc-(1→4)-β-D-Glcp-(1→4)-α-D-GlcpNAc-(1→]
9V型
[→4)-α-D-GlcpA(2/3OAc)-(1→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-ManpNAc(4/6OAc)-(1→4)-β-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→]
12F型
[→4)-[α-D-Galp-(1→3)]α-L-FucpNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→4)-[α-D-Glc-(1→2)-α-D-Glc-(1→3)]-β-D-ManNAcA-(→]
14型
[→4)-β-D-Glcp-(1→6)-[β-D-Galp-(1→4)]-β-D-GlcpNAc-(1→3)-β-D-Galp-(1→]
18C型
[→4)-β-D-Glcp-(1→4)-[α-D-Glcp(6OAc)(1→2)][Gro-(1→P→3)]-β-D-Galp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→3)-β-L-Rhap-(1→]
19F型
[→4)-β-D-ManpNAc-(1→4)-α-D-Glcp-(1→2)-α-L-Rhap-(1→P→]
23F型
[→4)-β-D-Glcp-(1→4)-[α-L-Rhap-(1→2)]-[Gro-(2→P→3)]-β-D-Galp-(1→4)-β-L-Rhap-(1→]
在以下中发现了对多糖的更广泛的讨论：Geno等人,(2015),《临床微生物学评论(Clin.Microbiol.Rev.)》,28:871-99，其中表1示出了97种已知血清型的结构。此表还公开了在乙酰化未完成时被乙酰化的糖残基的比例。
荚膜多糖任选地被O-乙酰化。在一些实施例中，来自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F的荚膜多糖包括O-乙酰化的程度介于以下之间的糖类：介于10-100％之间、介于20-100％之间、介于30-100％之间、介于40-100％之间、介于50-100％之间、介于60-100％之间、介于70-100％之间、介于75-100％之间、介于80-100％之间、介于90-100％之间、介于50-90％之间、介于60-90％之间、介于70-90％之间或介于80-90％之间。在其它实施例中，O-乙酰化的程度大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％或为约100％。例如通过质子NMR来任选地确定多糖的O-乙酰化的程度(参见例如，Lemercinier和Jones,(1996),《碳水化合物研究(Carbohydrate Research)》，296:83-96；Jones等人，(2002)，《药物与生物医学分析杂志(J.Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis)》，30:1233-1247)。在一些实施例中，通过离子-HPLC分析来确定O-乙酰基的存在。通常，缀合物中的多糖将保留从细菌纯化的起始多糖中所见的O-乙酰化水平。
在一个实施例中，来自以下血清型的荚膜多糖的分子量介于10kDa与4,000kDa之间：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F。在其它此类实施例中，多糖的分子量介于50kDa与4,000kDa之间。在其它此类实施例中，多糖的分子量介于50kDa与1,400kDa之间。在另外的此类实施例中，多糖的分子量介于50kDa与3,500kDa之间；介于50kDa与3,000kDa之间；介于50kDa与2,500kDa之间；介于50kDa与2,000kDa之间；介于50kDa与1,750kDa之间；介于50kDa与1,500kDa之间；介于50kDa与1,250kDa之间；介于50kDa与1,000kDa之间；介于50kDa与750kDa之间；介于50kDa与500kDa之间；介于100kDa与4,000kDa之间；介于100kDa与3,500kDa之间；介于100kDa与3,000kDa之间；介于100kDa与2,500kDa之间；介于100kDa与2,000kDa之间；介于100kDa与2,000kDa之间；介于100kDa与1,750kDa之间；介于100kDa与1,500kDa之间；介于100kDa与1,250kDa之间；介于100kDa与1,000kDa之间；介于100kDa与750kDa之间；介于100kDa与500kDa之间；介于200kDa与4,000kDa之间；介于200kDa与3,500kDa之间；介于200kDa与3,000kDa之间；介于200kDa与2,500kDa之间；介于200kDa与2,000kDa之间；介于200kDa与2,000kDa之间；介于200kDa与1,750kDa之间；介于200kDa与1,500kDa之间；介于200kDa与1,250kDa之间；介于200kDa与1,000kDa之间；介于200kDa与750kDa之间；或介于200kDa与500kDa之间。设想上文范围的任何范围内的任何整数为本公开的实施例。
相对于在自然界中发现的荚膜多糖任选地化学修饰所述荚膜多糖。例如，所述多糖任选地被脱-O-乙酰化(部分或完全)、脱-N-乙酰化(部分或完全)、N-丙酰化(部分或完全)等。去乙酰化任选地发生在与化学柄或多肽缀合之前、期间或之后，但是通常发生在缀合之前。
化脓链球菌的多糖：在一些实施例中，包括多糖的抗原包括源自化脓链球菌的多糖。化脓链球菌是引起人类的各种各样感染的革兰氏阳性细菌(也称为A组链球菌属或“GAS”)，所述感染包含咽炎、扁桃体炎、猩红热、蜂窝织炎、丹毒、风湿热、链球菌感染后肾小球肾炎、坏死性筋膜炎、肌坏死和淋巴管炎。在一个实施例中，所述多糖是化脓链球菌的荚膜多糖。化脓链球菌的荚膜多糖由透明质酸组成，所述透明质酸是重复单元具有以下结构的高分子量聚合物：
[→4)-β-D-GlcUAp-(143)-β-D-GlcpNAc-(→]
这似乎在化脓链球菌血清型之间是不变的。
在一个实施例中，来自化脓链球菌的荚膜多糖的分子量介于10kDa与4,000kDa之间。在其它此类实施例中，多糖的分子量介于50kDa与4,000kDa之间。在另外的此类实施例中，多糖的分子量介于50kDa与3,500kDa之间；介于50kDa与3,000kDa之间；介于50kDa与2,500kDa之间；介于50kDa与2,000kDa之间；介于50kDa与1,750kDa之间；介于50kDa与1,500kDa之间；介于50kDa与1,250kDa之间；介于50kDa与1,000kDa之间；介于50kDa与750kDa之间；介于50kDa与500kDa之间；介于100kDa与4,000kDa之间；介于100kDa与3,500kDa之间；介于100kDa与3,000kDa之间；介于100kDa与2,500kDa之间；介于100kDa与2,000kDa之间；介于100kDa与2,000kDa之间；介于100kDa与1,750kDa之间；介于100kDa与1,500kDa之间；介于100kDa与1,250kDa之间；介于100kDa与1,000kDa之间；介于100kDa与750kDa之间；介于100kDa与500kDa之间；介于200kDa与4,000kDa之间；介于200kDa与3,500kDa之间；介于200kDa与3,000kDa之间；介于200kDa与2,500kDa之间；介于200kDa与2,000kDa之间；介于200kDa与2,000kDa之间；介于200kDa与1,750kDa之间；介于200kDa与1,500kDa之间；介于200kDa与1,250kDa之间；介于200kDa与1,000kDa之间；介于200kDa与750kDa之间；或介于200kDa与500kDa之间。设想上文范围的任何范围内的任何整数为本公开的实施例。
在另一个实施例中，所述多糖是来自化脓链球菌的非荚膜多糖。非荚膜多糖包含A组链球菌细胞壁多糖，所述A组链球菌细胞壁多糖包括通过交替的α-L-(1→3)连接和α-L-(1→2)连接而连接的聚-L-吡喃鼠李糖基单元的主链，其中N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基在鼠李糖主链的3位置处附接到所述连接。
在一个实施例中，来自化脓链球菌的A组链球菌细胞壁多糖的分子量介于10kDa与4,000kDa之间。在其它此类实施例中，多糖的分子量介于50kDa与4,000kDa之间。在另外的此类实施例中，多糖的分子量介于50kDa与3,500kDa之间；介于50kDa与3,000kDa之间；介于50kDa与2,500kDa之间；介于50kDa与2,000kDa之间；介于50kDa与1,750kDa之间；介于50kDa与1,500kDa之间；介于50kDa与1,250kDa之间；介于50kDa与1,000kDa之间；介于50kDa与750kDa之间；介于50kDa与500kDa之间；介于100kDa与4,000kDa之间；介于100kDa与3,500kDa之间；介于100kDa与3,000kDa之间；介于100kDa与2,500kDa之间；介于100kDa与2,000kDa之间；介于100kDa与2,000kDa之间；介于100kDa与1,750kDa之间；介于100kDa与1,500kDa之间；介于100kDa与1,250kDa之间；介于100kDa与1,000kDa之间；介于100kDa与750kDa之间；介于100kDa与500kDa之间；介于200kDa与4,000kDa之间；介于200kDa与3,500kDa之间；介于200kDa与3,000kDa之间；介于200kDa与2,500kDa之间；介于200kDa与2,000kDa之间；介于200kDa与2,000kDa之间；介于200kDa与1,750kDa之间；介于200kDa与1,500kDa之间；介于200kDa与1,250kDa之间；介于200kDa与1,000kDa之间；介于200kDa与750kDa之间；或介于200kDa与500kDa之间。设想上文范围的任何范围内的任何整数为本公开的实施例。
无乳链球菌的荚膜多糖：在一些实施例中，包括多糖的抗原包括源自无乳链球菌的荚膜多糖。无乳链球菌(也称为B组链球菌或GBS)是通常与哺乳动物共生的革兰氏阳性细菌，所述细菌在易受免疫影响的人类中引起败血症、肺炎和脑膜炎并且在奶牛中引起牛乳腺炎。存在至少10种具有不同的荚膜多糖重复单元的无乳链球菌血清型(Ia、Ib、II-IX)；然而，只有血清型中的一部分通常引起疾病。这些包含血清型Ia、Ib、II、III和V，并且可以制备来自这些血清型的荚膜多糖的缀合物。已经确定了常见无乳链球菌血清型的荚膜多糖重复单元的结构，并且所述结构为：
Ia型
Ib型
II型
V型
流感嗜血杆菌的荚膜多糖：在一些实施例中，包括多糖的抗原包括源自流感嗜血杆菌的荚膜多糖。流感嗜血杆菌是引起广泛的局部感染和侵入性感染的革兰氏阴性厌氧致病菌，所述感染包含肺炎、菌血症、脑膜炎、会厌炎、蜂窝织炎和感染性关节炎。存在至少6种具有不同的荚膜多糖化学结构的流感嗜血杆菌血清型(a-f型)。然而，只有a型和b型被认为是流感嗜血杆菌的“高毒力”菌株，并且大部分儿童感染被认为是由b型引起的(Jin等人,《感染与免疫(Infect.Immun.),2007年6月,第75卷,第6期,2650-2654)，因此所述b型是用于与本发明一起使用的流感嗜血杆菌多糖的优选类型。已经确定了b型荚膜多糖的重复单元的结构，并且所述结构为：
[→3)-β-D-Ribf-(1→1)-D-Ribitol-(5→OPO3 -→]。
脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖：在一些实施例中，包括多糖的抗原包括源自脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖。脑膜炎奈瑟氏球菌是革兰氏阴性细菌，所述革兰氏阴性细菌是脑膜炎和脑膜炎球菌败血症感染的主要致病因子。存在至少13种具有不同的荚膜多糖化学结构的脑膜炎奈瑟氏球菌血清型(血清型A、B、C、E-29、H、I、K、L、W-135、X、Y、Z和Z'(29E))。然而，只有六种血清组(A、B、C、W-135、X、Y)被认为会导致危及生命的疾病。已经确定了用于制备缀合物的所关注的五种主要危及生命的血清组的荚膜多糖的重复单元的结构，并且所述结构为：
A型
[→6)-α-D-ManpNAc(3/4OAc)-(1→OPO3→]
C型
[→9)-α-D-Neup5Ac(7/8OAc)-(2→]
W-135型
[→6)-α-D-Galp-(1→4)-α-D-Neup5Ac(9OAc)-α-(2→]
X型
[→4)-α-D-GlcpNAc-(1→OPO3→]
Y型
[→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Neup5Ac(9OAc)-α-(2→]
牙龈卟啉单胞菌的荚膜多糖：在另一个实施例中，所述抗原是源自牙龈卟啉单胞菌的六种血清型中的一种血清型(例如，K1、K2、K3、K4、K5和/或K6)的荚膜多糖。参见VanWinkelhoff等人，(1993),《口腔微生物学和免疫学(Oral Microbiol.Immunol.)》，8:259-265；以及Laine等人,(1996),《牙周病研究期刊(J.Periodontal Res.)》,31:278-84。
伤寒沙门菌的荚膜多糖：在另一个实施例中，抗原为Vi多糖。Vi是伤寒沙门菌的荚膜多糖(先前被归类为物种本身，但是现在被称为肠沙门菌的伤寒血清变型)。也可以在沙门氏菌的其它血清变型(如肠沙门菌副伤寒血清变型C或都柏林(dublin)血清变型)和其它细菌(如枸橼酸杆菌(例如，弗氏枸橼酸杆菌和杨氏枸橼酸杆菌))中发现Vi。Vi多糖是己糖醛酸、α1，4-N-乙酰半乳糖-氨基糖醛酸的线性均聚物，所述均聚物在C-3位置处被乙酰化60-90％。Vi上的O-乙酰基取代是能够引发保护性免疫应答的因子。Vi的免疫原性与其O-乙酰化的程度密切相关。部分脱-O-乙酰化能够略微增加免疫原性；完全脱-O-乙酰化消除了Vi的免疫原性。可以相对于如在自然界中发现的荚膜多糖对本发明所使用的Vi多糖进行化学修饰。例如，Vi多糖可以被部分脱-O-乙酰化、脱-N-乙酰化(部分或完全)、N-丙酰化(部分或完全)等。脱乙酰化可以发生在缀合之前、期间或之后，但是优选地发生在缀合之前。可以通过常规测定来评估脱-乙酰化等的影响。
金黄色葡萄球菌的糖类：在另一个实施例中，抗原为来自金黄色葡萄球菌的多糖。多糖可以是金黄色葡萄球菌的胞外多糖，所述多糖是聚-N-乙酰葡糖胺(PNAG)或金黄色葡萄球菌的荚膜多糖，所述多糖可以是例如5型、8型或336型。
艰难梭菌的表面多糖：在另一个实施例中，抗原为来自艰难梭菌的表面聚糖，如PS-I或PS-II。
葡聚糖：在另一个实施例中，抗原是含β-1,3-连接和/或β-1,6-连接的葡聚糖。这些缀合的葡聚糖可以用于产生抗真菌免疫应答，例如抗白念珠菌(Candida albicans)。葡聚糖是尤其在真菌细胞壁中发现的含葡萄糖的多糖。β-葡聚糖包含葡萄糖亚单元之间的一个或多个β-连接。根据本发明使用的葡聚糖包含β-连接，并且可以仅含有β-连接(即，无α连接)。葡聚糖可以包括一个或多个β-1,3-连接和/或一个或多个β-1,6-连接。葡聚糖还可以包括一个或多个β-1,2-连接和/或β-1,4-连接，但是通常其唯一的β连接将为β-1,3-连接和/或β-1,6-连接。葡聚糖可以是支链的或直链的。葡聚糖可以是真菌葡聚糖。‘真菌葡聚糖’通常可以从真菌中获得，但是，如果在真菌和非真菌两者(例如，在细菌、低等植物或藻类中)中发现特定的葡聚糖结构，则可以将非真菌生物体用作替代性来源。因此，葡聚糖可以源自如白念珠菌等念珠菌的细胞壁，或者源自粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、夹膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)或隐袭腐霉(Pythiumn insidiosum)。有各种来源的真菌β-葡聚糖。例如，纯β-葡聚糖是可商购获得的，例如石耳多糖(Calbiochem公司)是从丘疹脐孢(Umbilicaria papullosa)中纯化的β-1,6-葡聚糖。可以以各种方式从真菌细胞壁中纯化β-葡聚糖。在一些实施例中，如例如在昆布多糖(laminarin)中所见的，葡聚糖是具有一些β-1,6-支化的β-1,3-葡聚糖。昆布多糖存在于褐藻和海藻中。昆布多糖的β(1-3):β(1-6)的比率在不同的来源之间变化，例如其在褐藻类(Eisenia bicyclis)昆布多糖中低至3:2，但是在掌状海带(Laminariadigitata)昆布多糖中高达7:1。因此，与本发明一起使用的葡聚糖的β(1-3):β(1-6)的比率可以介于1.5:1与7.5:1之间，例如约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1或7:1。在其它实施例中，如在凝胶多糖中所见的，葡聚糖仅仅具有或主要具有β-1,3-连接。因此，葡聚糖可以仅由β-1,3-连接的葡萄糖残基(例如，仅仅有1,3连接的线性β-D-吡喃葡萄糖)制成。但是，任选地，葡聚糖可以包含单糖残基，所述单糖残基不是β-1，3-连接的葡萄糖残基，例如所述葡聚糖可以包含β-1，6-连接的葡萄糖残基。β-1,3-连接的葡萄糖残基与这些其它残基的比率应当为至少8:1(例如，≥9:1、≥10:1、≥11:1、≥12:1、≥13:1、≥14:1、≥15:1、≥16:1、≥17:1、≥18:1、≥19:1、≥20:1、≥25:1、≥30:1、≥35:1、≥40:1、≥45:1、≥50:1、≥75:1、≥100:1等)。
肿瘤衍生的聚糖：在一些实施例中，包括多糖的抗原包括肿瘤细胞的发育不适当的细胞表面聚糖特征。Danishefsky(综述于Zhu等人,《疫苗专家评论(Expert RevVaccines)》,2009(10):1399-1413)等已经发现，某些寡糖基序(阶段特异性胚胎抗原SSEA)最初在胚胎发生过程中在细胞表面上表达，并且在成人肿瘤中被“重新活化”。由于这些是短多糖，因此所述寡糖主要通过化学合成而获得(综述于上文Zhu中)。在这些寡糖中，与癌发生(例如，前列腺癌和乳腺癌)最明显相关的是Globo-H、Ley、STn、TF和Tn。
半抗原：在一些实施例中，抗原包括半抗原：分子量小于1,000Da的非聚合合成部分。半抗原在治疗性蛋白缀合物中的应用是模仿滥用药物的半抗原，例如尼古丁或可卡因(参见例如，Berkowitz和Spector,《科学》,针对吗啡的1972(178):1290-1292；Kosten等人,《疫苗》,针对可卡因的2002(20):1196-1204；以及Hatsukami等人，《临床药理疗法(ClinPharmacol Ther.)》，2005(78):456-467)。在其它方面免疫原性较弱的小分子与免疫原性多肽的缀合允许产生药物特异性抗体，所述药物特异性抗体将滥用药物与中枢神经系统隔离。
衍生和制备由其产生的抗原和组合物的方法：
本文描述了含有化学柄的抗原，所述化学柄能够与引入如本文前面所描述的多肽的非天然氨基酸中的对应基团进行反应。在一些实施例中，化学柄包括适合于与多肽上的对应基团进行“点击”化学反应的基团。用于“点击”化学的合适的化学基团包含但不限于叠氮基(-N3)、炔烃(C≡C)、膦(例如，-P(Ph)2)、烯烃(C＝C)和1，2，4，5-四嗪基团。
通过包括3个步骤的一般过程引入化学柄：(a)活化抗原；(b)任选地使抗原与连接子或亲核基团进行反应，以引入抗原中通常不存在的反应性；以及(c)将抗原与化学柄缀合。在一些实施例中，步骤(a)-(c)中的两个或更多个步骤是同步的，与在通过加入反应性部分(如N-羟基琥珀酰亚胺酯)来修饰化学柄的情况下一样。在一些实施例中，步骤(a)-(c)中的两个或更多个步骤是离散的，其中在步骤之间任选地对抗原进行纯化。在一些实施例中，步骤(a)另外包括去除抗原上的阻断基团的步骤，使得某些官能团(例如，羟基、胺、硫醇)更易于活化。
在相对于抗原的不同位置处任选地引入化学柄。在一些实施例中，在末端处引入化学柄(例如，多糖的还原末端和非还原末端、多肽的N末端和C末端、或甘油酯的酰基链的末端)。在一些实施例中，在内部位置处引入化学柄(例如，多肽的内部氨基酸或多糖的内部羟基、胺或活化的羟基)。在一些实施例中，除内部位置之外，还在一个或多个末端处引入化学柄。用于抗原的特定的活化方法将影响活化的针对缀合的位置，并且因此影响抗原上的缀合的化学柄的最终位置。优选地将多个化学柄引入抗原中，使得抗原可以实现与载剂的多重连接。
在优选的实施例中，经由化学柄将多肽与抗原缀合的方法如下。活化抗原以在其中并入至少一个第一化学柄，其中第一化学柄能够与多肽中的nnAA的第二化学柄缀合。在第一化学柄和第二化学柄反应的条件下，将活化的抗原与含有带有第二柄的至少一个nnAA的多肽组合以形成抗原-多肽缀合物。由此实现的反应为非催化共价生物缀合反应。作为“第一化学柄”的抗原上的反应性位点优选地为炔基，其中可以将炔基并入增加反应性的分子环境中。例如，可以将炔基并入环中，例如环辛炔基环，如二芳基应变环辛炔。多肽中的优选反应性位点(即由nnAA残基提供的“第二化学柄”)是叠氮基。如本领域已知的，这种情况下的反应是在本领域被称为“应变促进的叠氮基-炔环加成反应”(SPAAC)的[3+2]环加成反应，所述反应将在下文进一步进行详细讨论。
抗原的活化：
使用所描述的用于产生生物缀合物的任何化学方法来任选地活化抗原。这种方法包含但不限于高碘酸氧化、暴露内源醛(例如，多糖的还原末端)、活化1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)或用1,1'-羰基二咪唑(CDI)活化羟基，随后进行亲核加成。Hermanson描述了糖衍生化的另外的化学策略(Hermanson、Greg,《生物缀合技术(Bioconjugate Techniques),(2008))。可以使用氰基化试剂(如对硝基苯基氰酸酯、CDAP或N-氰基三乙基铵四氟硼酸盐)、活性酯、碳二亚胺、酰肼、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺酯、S-NHS、EDC、TSTU等进行活化。
本发明提供了一种抗原(具体地，如本文所公开的多糖抗原，如肺炎球菌荚膜多糖抗原)，所述抗原根据下文所讨论的任何化学进行活化，例如抗原与下文所讨论的一个或多个DBCO基团和DIFO基团反应的产物。
高碘酸盐活化：
在一些实施例中，通过高碘酸盐氧化来活化抗原。在一些实施例中，高碘酸盐氧化用于将醛基引入抗原中并且可以用于将醛加入：1)多糖；2)多肽的N-末端残基以产生活化的抗原。高碘酸盐裂解在任一末端上拥有伯羟基或仲羟基或胺的碳-碳键，并且因此活化带有相邻羟基的碳水化合物糖残基或含2-氨基醇部分(N末端苏氨酸残基或丝氨酸残基)的氨基酸。由于醛部分具有较长的半衰期，因此在活化后对通过此方法活化的抗原任选地进行色谱纯化和/或冻干。
对于抗原的高碘酸盐氧化：(a)将抗原溶解在溶液中；(b)将高碘酸盐源从浓缩的储备溶液加入到抗原中以形成氧化混合物；(c)培育反应混合物；并且(d)除去(任选)过量的高碘酸盐。
任选地使用去离子水或合适的缓冲溶液进行氧化反应。在一些实施例中，步骤(a)中的溶液为去离子水。在一些实施例中，步骤(a)中的溶液包括pKa约为生理pH的有效量的缓冲液。在一些实施例中，步骤(a)中的溶液包括pKa约为生理pH的有效量的缓冲液，其中缓冲液不包括胺基团。无胺缓冲液的实例包含但不限于乙酸盐、甲酸盐和磷酸盐。
步骤(b)中的高碘酸盐源任选地选自在水溶液中具有适当的稳定性的任何高碘酸盐源。高碘酸盐源的实例包含但不限于高碘酸钠、高碘酸钾、(间)高碘酸四丁基铵、高碘酸钡、高碘酸氢钠、(对)高碘酸钠和(间)高碘酸四乙基铵。
在一些实施例中，调节高碘酸盐添加水平和反应条件以将多糖上的所有可用的二醇转化为醛。例如，在室温下大量过量的高碘酸钠(相对于多糖的摩尔浓度>1000×过量，或高碘酸钠的10mM溶液)与培育的组合有利于将二醇完全转化为醛。
在一些实施例中，调节高碘酸盐添加水平和反应条件以将少量的氧化/醛形成引入多糖链中。在氧化反应中低于化学计量的高碘酸钠(例如<1.0当量)有利于少量的多糖链氧化。例如，通过0.001-0.7、0.005-0.5、0.01-0.5、0.1-1.2、0.1-0.5、0.1-0.2、0.5-0.8、0.1-0.8、0.3-1.0或0.4-0.9摩尔当量的高碘酸盐来活化细菌糖(参见WO 2011/110531)。在另一个实施例中，将0.4摩尔当量的高碘酸盐添加到含肺炎球菌荚膜多糖的pH值为6.0的溶液中，并将其在25℃下培育17小时(参见WO 2011/110531)。
在一个实施例中，细菌糖的少于0.001％、0.01％、0.1％、0.5％，1％、2％、5％、10％、30％或50％的邻位二醇在高碘酸盐活化期间被氧化(参见WO 2011/110531)，例如介于5-10％之间。低反应温度也有利于较低量的多糖链氧化。在一些实施例中，将低高碘酸盐浓度(<0.1当量)与反应组合在4℃下过夜，以最小化特定荚膜多糖(如肺炎链球菌19F)的多糖链氧化。
在一些实施例中，调节高碘酸盐添加水平和反应条件以引导将多糖链切割成选择性糖类。例如，文献中使用4摄氏度下的1mM NaIO4来选择性地氧化碳7、8或9处的唾液酸残基，同时使用室温下的10mM NaIO4来氧化各种糖残基，包含唾液酸残基、半乳糖残基和甘露糖残基。
为了氧化蛋白质抗原中的N末端丝氨酸或甲硫氨酸残基，通常使用较温和的氧化条件(低高碘酸盐浓度和反应时间)以避免对抗原的内部侧链的氧化损伤。在一个实施例中，步骤(b)包括将高碘酸钠添加到2.5mM的最终浓度，并且步骤(c)包括在25摄氏度下培育反应混合物持续3分钟。
因为过量未反应的高碘酸盐可能导致高于期望氧化水平或对抗原中的免疫原性部分造成损害，所以任选地在步骤(d)中除去过量的高碘酸盐。对于较大抗原(>10kDa)，在一些实施例中，使用具有合适的分子量筛截或排阻限度的介质通过针对水或缓冲溶液的大小排阻、透析或渗滤来除去过量的高碘酸盐。对于较小抗原，其中基于大小的纯化是不方便的(短肽或寡糖)，并且步骤(d)中除去高碘酸盐包括添加猝灭剂。任选地通过加入甘油(10％(v/v))、加入摩尔过量的亚硫酸钠或加入摩尔过量的N-乙酰基甲硫氨酸来淬灭过量的高碘酸盐。
在一些实施例中，使多糖或蛋白抗原脱保护以增加羟基或胺基团对高碘酸盐活化的可及性。在一个实施例中，去除多糖上的O-乙酰基或N-乙酰基以增加相邻羟基对高碘酸盐的反应性。对于多糖抗原，任选地通过在弱酸(例如，低浓度HCl)或碱性(例如，碳酸氢钠)溶液中进行培育，然后通过任选加热并且调节回生理pH值来完成脱-O-乙酰化或脱-N-乙酰化。在一些实施例中，使用弱酸处理(<0.1M HCl或<0.2M AcOH)，然后通过加热并且中和来部分水解(“确定大小”)高分子量的多糖。在一些实施例中，使用弱酸处理(例如，<0.1M HCl或<0.2M AcOH)，然后同时通过加热(45-95℃)和中和来部分水解(“确定大小”)高分子量的多糖并且使多糖脱保护。在一些实施例中，通过此类酸/加热/中和过程来处理血清型3、4、18C和11A以使多糖脱保护、确定多糖的大小或两者。在一个实施例中，用0.18M乙酸处理肺炎链球菌血清型3多糖，然后在85℃下加热1小时。在一个实施例中，用0.01M HCl处理肺炎链球菌血清型4多糖，然后在45℃下加热1小时。在一个实施例中，用0.18M乙酸处理肺炎链球菌18C血清型，然后在95℃下加热40分钟。在一个实施例中，用0.18M乙酸处理肺炎链球菌血清型11A多糖，然后在80℃下加热1小时。
在另一个实施例中，通过在去离子水或生理pH缓冲溶液中用甲酰基-L-甲硫氨酰基肽酰胺水解酶处理来除去纯化的蛋白质上的N-甲酰基/使胺基团脱甲酰化。在又另一个实施例中，通过在-5℃下用无水肼蒸气处理冻干蛋白质来除去纯化的蛋白质上的N-甲酰基(Miyataki等人,《欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)》,212,785-789(1993))。
CDAP活化
在一些实施例中，通过用氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)形成瞬时加合物来活化抗原(参见例如，WO 2011/110531和US 20120321658)。在一些实施例中，通过与CDAP反应来活化蛋白质或多糖抗原上的羟基以形成瞬时氰酰(-OCN)加合物，然后使所述瞬时氰酰加合物与化学柄或连接子上的合适的亲核试剂反应以形成卡巴咪酯(carbamimidate)连接。在此实施例中，不切割抗原上的C-C键(与高碘酸盐活化相反)。在一些实施例中，使用CDAP来优选地活化特定的荚膜多糖。在特定实施例中，使用CDAP来活化肺炎链球菌血清型3、7F或10A荚膜多糖。
对于抗原的CDAP活化：(a)将抗原溶解在合适的溶剂中；(b)将CDAP从储备溶液添加到抗原中；(c)添加缓冲剂。
在任何合适的溶剂中任选地进行CDAP活化。在一些实施例中，(a)中的溶剂包括蒸馏水。在另外的实施例中，(a)中的溶剂另外包括如DMSO或乙腈等有机溶剂。在特定实施例中，在水中活化肺炎链球菌血清型3、7F或10A荚膜多糖。
在一些实施例中，用超-或亚-化学计算(相对于多糖)量的CDAP进行活化。在一些实施例中，用约0.1当量到约3当量的CDAP来活化多糖。在一些实施例中，用约0.2-0.8当量的CDAP来活化多糖。在一个实施例中，使用2.0当量的CDAP来活化肺炎链球菌血清型3荚膜多糖。在一个实施例中，使用0.8当量的CDAP来活化肺炎链球菌血清型10A荚膜多糖。
在一些实施例中，在(c)中添加缓冲剂用于显著提高CDAP活化的效率(Lees等人,《疫苗》,1996(14):190-198)。在一些实施例中，(c)中的缓冲剂为三乙醇胺(TEA)。在一些实施例中，将约1当量到约4当量的TEA(相对于多糖)用作缓冲剂。在一个实施例中，将约1当量到约4当量的TEA用作缓冲剂，以进行涉及肺炎链球菌血清型7F多糖的CDAP活化反应。在一些实施例中，将2.5当量的TEA用作缓冲剂。在一个实施例中，将2.5当量的TEA用作缓冲剂，以进行涉及肺炎链球菌血清型7F多糖的CDAP活化反应。在一些实施例中，缓冲剂是硼酸钠、碳酸钠或氢氧化钠以及其任何组合。在一些实施例中，缓冲剂的pKa介于约8.0到约11.0之间，或者使用缓冲剂来将反应溶液的pH值调节为介于约8.0到约11.0之间。在一些实施例中，缓冲剂的pKa介于约9.0到约9.5之间，或者使用缓冲剂来将反应溶液的pH值调节为介于约9.0到约9.5之间。在一个实施例中，将pH值调节到9.5的氢氧化钠用于涉及肺炎链球菌血清型3多糖的CDAP活化反应。在一个实施例中，将pH值调节到9.5的氢氧化钠用于涉及肺炎链球菌血清型10A多糖的CDAP活化反应。
羰基二咪唑(CDI)/羰基二三氮唑(CDT)活化：
在一些实施例中，用羰基二咪唑(CDI)或羰基二三氮唑(CDT)来活化抗原。CDI和CDT(与CDAP一样)能够活化抗原上的羟基以形成瞬时反应性部分；在这种情况下，其是不稳定的氨基甲酸酯(对于CDI，并且对于CDT，)，所述不稳定的氨基甲酸酯然后任选地与化学柄或连接子上的胺或硫醇反应以形成氨基甲酸酯或硫代碳酸酯连接。应当在干燥的有机溶剂中进行活化。在一些实施例中，在无水二甲基亚砜(DMSO)中进行CDI/CDT活化。在一些实施例中，相对于抗原，通过添加摩尔过量的CDI/CDT进行CDI/CDT活化。在其它实施例中，通过添加与摩尔量的抗原大致相等的摩尔量的CDI/CDT进行CDI/CDT活化。
无化学活化：
在一些实施例中，天然存在的或作为脱保护步骤(例如，如上文所讨论的)的结果的内源性胺或其它亲核部分(例如，伯胺)用于将给定的多糖与化学柄或载体蛋白缀合。此类亲核部分可宜与各种常见的亲电子缀合试剂如琥珀酸盐衍生物(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)或磺基-NHS酯)反应。在此类实施例中，有时有利的是用如(i)中的高碘酸盐方案进行处理，以促进抗原性污染物(如肺炎链球菌C-多糖)降解。在此实施例中，高碘酸盐处理之后是大量过量的硼氢化钠以淬灭任何化学引入的醛基。在一个实施例中，在室温下用介于约0.05当量到约0.25当量之间的高碘酸钠来处理肺炎链球菌血清型1多糖持续约12小时到约14小时之间，然后用介于约5当量到约15当量之间的硼氢化钠进行处理。在一个实施例中，在室温下用0.15当量的高碘酸钠来处理肺炎链球菌血清型1多糖持续18小时，然后用10当量的硼氢化钠进行处理。
与化学柄缀合：
在一些实施例中，使用与上文所描述的活化方法(“抗原活化”)相容的任何化学方法来将抗原与化学柄缀合。此类方法包含但不限于在还原胺化之后使用合成抗原醛的席夫碱(Schiff-base)形成、腙形成、肟形成、直接亲核加成以及在还原胺化之后使用天然抗原醛的席夫碱形成。在一些实施例中，与化学柄缀合反应的绝对多糖浓度对最小化多糖的聚集或交叉反应性而言很重要。在一些实施例中，与DBCO(二苯并环辛炔)或DBCO衍生物缀合反应的绝对多糖/抗原浓度对用高碘酸盐或CDAP活化的多糖而言很重要。在一些实施例中，DBCO/DBCO衍生物缀合反应中的多糖浓度小于2μmol/mL、小于5μmol/mL、小于7μmol/mL、小于10μmol/mL、小于15μmol/mL、小于17.5μmol/mL或小于20μmol/mL。在一些实施例中，DBCO/DBCO衍生物缀合反应中的多糖浓度为约1.5μmol/mL到约17.5μmol/mL。
与高碘酸盐活化的抗原进行反应：
在一些实施例中，化学柄与如上文的用高碘酸盐活化(“抗原活化”)的多肽或多糖抗原缀合。在这些实施例中，包括与醛形成稳定或半稳定加合物的官能团的化学柄与高碘酸盐活化的抗原结合，然后任选地进行还原以将半稳定加合物转化为稳定加合物(参见例如，WO 2014/111344；Wu等人,《疫苗》,31(2013):5623-2626；Hermanson,G.T.,《生物缀合化学》，第二版,2008)。在这些实施例的一些变型中，相对于活化的抗原上的醛基，以大摩尔过量添加化学柄，使得在化学柄/抗原缀合反应中消耗所有醛。在这些实施例的其它变型中，相对于活化的抗原上的醛基，以较低摩尔比添加化学柄，通过与过量的廉价醛反应性亲核试剂(例如，乙醇胺)进一步反应或者通过用足够强以将醛还原成羟基(例如，NaBH4)的还原剂处理来消耗活化的抗原上的过量未反应的醛。
在一个实施例中，通过在还原胺化之后使用合成抗原醛的席夫碱形成来将化学柄与抗原缀合。此实施例产生在化学柄与抗原之间具有仲胺连接的最终产物：化学柄的胺与抗原上的碳原子之间的直接N-C键。在此实施例中，化学柄包括胺。在此实施例中，缀合方法包括：在DI水或含DMSO的缓冲溶液中将含胺的柄与高碘酸盐活化的抗原结合；进行培育以形成席夫碱；使用氰基硼氢化钠(NaBH3CN)将席夫碱还原成仲胺；以及任选地用NaBH4淬灭未反应的醛。在此方法的一些实施例中，以1:1的化学计量或接近1:1的化学计量结合化学柄和抗原。在此方法的一些实施例中，用摩尔过量的化学柄结合化学柄和抗原。在此方法的一些实施例中，用摩尔过量的抗原结合化学柄和抗原。在一些实施例中，氰基硼氢化钠取代另一种具有类似选择性的用于还原如三乙酰氧基硼氢化钠等C＝N键的还原剂。
在一个实施例中，化学柄通过腙形成与抗原缀合。在此实施例中，化学柄包括酰肼(-C(＝O)-NH-NH2)基团。此实施例产生在化学柄与抗原碳之间具有腙(-C(＝O)-NH-N＝C-)连接或N'-烷基酰肼(-C(＝O)-NH-NH-C-)连接的最终产物。在此实施例中，缀合方法包括：在pH值为6.0-8.5的溶液中将摩尔过量的含酰肼的化学柄与抗原结合以及进行培育以形成腙(-C(＝O)-NH-N＝C-)。在此方法的一些另外的实施例中，反应混合物中包含氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠以还原产生N'-烷基酰肼(-C(＝O)-NH-NH-C-)的N＝C键。
在一个实施例中，化学柄通过肟形成与抗原缀合。在此实施例中，化学柄包括氨氧基(-O-NH2)基团。此实施例产生在化学柄与抗原碳之间具有肟(-O-N＝C-)连接的最终产物。在此实施例中，缀合方法包括：在pH值为6.0-8.5的溶液中将摩尔过量的含氨氧基的化学柄与抗原结合以及进行培育以形成肟连接(-O-N＝C-)。在此方法的一些另外的实施例中，反应混合物中包含氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠以还原N＝C键并且改进稳定性；这会产生N'-烷基羟胺连接(-O-N-C-)。
与CDAP活化的抗原进行反应：
在一些实施例中，化学柄与如上文所描述的用CDAP活化(“CDAP活化”)的多肽或多糖抗原缀合。在这些实施例中，通过CDAP活化产生的瞬时氰酰(-OCN)基团进一步与含胺的化学柄反应，以在化学柄与抗原碳之间产生卡巴咪酯连接(-NH-C(＝NH)-O-)。
对于化学柄的CDAP缀合，如上文所描述的活化抗原上的羟基(“CDAP活化”)，并且另外将包括胺的化学柄添加到活化混合物中。因为氰酰基团不稳定，所以通常在活化抗原后不久(几分钟内)添加化学柄。在一些实施例中，在引入CDAP后添加抗原2.5分钟。在一些实施例中，加入相对于抗原上的活化的羟基的大摩尔过量的含胺的化学柄。在其它实施例中，相对于抗原上的活化的羟基，以接近1:1摩尔比的浓度加入化学柄，并且通过加入过量的廉价胺(例如，乙醇胺或己二胺)来耗尽过量未反应的氰酰基团。
与CDI/CDT活化的抗原进行反应：
在一些实施例中，化学柄与如上文所描述的用CDI/CDT活化(“羰基二咪唑(CDI)/羰基二三氮唑(CDT)活化”)的多肽或多糖抗原缀合。在这些实施例中，通过抗原羟基的CDI/CDT活化(对于CDI，并且对于CDT，)产生的不稳定的氨基甲酸酯进一步与伯胺反应以产生稳定的氨基甲酸酯(-NH-C(＝O)-O-)连接或伯硫醇，从而在化学柄与抗原碳之间产生稳定的硫代碳酸酯(-S-C(＝O)-O-)连接。在一些实施例中，加入相对于抗原上的活化的羟基的大摩尔过量的含胺/硫醇的化学柄。在其它实施例中，相对于抗原上的活化的羟基，以接近1:1摩尔比的浓度添加化学柄。在又另外的实施例中，通过用四硼酸钠处理来使反应中的残留CDI/CDT进一步灭活。
与非活化的抗原进行反应：
在一些实施例中，化学柄与来自如上文所描述的多肽或多糖抗原的天然存在的或作为脱保护步骤的结果的内源性胺或其它亲核部分(例如，伯胺)缀合。在这种的一个实施例中，化学柄上的亲电子基团(例如，NHS或磺基-NHS酯)与抗原上的伯胺基团反应以在化学柄与抗原胺之间产生酰胺连接(-C(＝O)-NH-)。在另一个实施例中，在存在标准肽偶联试剂和条件的情况下，化学柄上的羧酸基团与抗原上的伯胺基团反应，以在化学柄与抗原胺之间产生酰胺连接。
含炔烃的柄
在一些实施例中，化学柄包括允许与多肽的nnAA残基上的对应基团进行“点击”化学反应的部分。一个此类部分为烯烃基团，其能够与包括叠氮基的nnAA残基进行反应。在最简单的实施例中，所述此类部分为炔丙基，使得抗原上的烯烃基团包括式IV结构：
其中：
L22为是C1-C10烷基；并且
U1为抗原的至少一个部分。
在其它实施例中，抗原上的烯烃基团包括式IVa结构：
其中：
L22为-(CH2CH2O)1-10-；并且
U1为抗原的至少一个部分。
在一些实施例中，烯烃基团进一步包括加速或促进烯烃与叠氮基反应的另外的特征。一个此类特征的实例是8元环结构(例如，环辛炔)，使得抗原上的烯烃基团进一步包括DIFO基团或DBCO基团。在一些实施例中，抗原上的烯烃基团包括式V、式VI或式VIa结构：
其中：
L1独立地为一键、-NH-、-O-、-S-、-NH(L12)-、-O(L12)-或-S(L12)-；
L2独立地为一键、-C(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)L12-、-S(＝O)2L12；
L12独立地为L22或L22NH-；
L22独立地为C1-10烷基或-(CH2CH2O)1-10-；并且
U1独立地为抗原的至少一个部分。
在一些实施例中，式V和VIa结构宜由包括亲核基团(例如，伯胺)的抗原和结构V和VIa的对应DIFO羧酸或DBCO羧酸的NHS或磺基-NHS酯形成。在一些实施例中，式VI结构宜由活化的抗原和DBCO衍生物(如DBCO-NH2或DBCO-PEGn-NH2)形成。在一些实施例中，DBCO-PEGn-NH2为DBCO-PEG4-NH2。
“PEGn”中的“n”的值表示氧乙烯重复单元例如在上文所示出的结构中或在式VII、式VIIb、式XI或部分‘A’内或在L22的聚(烷氧基)内的数量。n的值在1-20的范围内，例如在2-18、3-16或4-14内。因此，n可以是例如4、5、11、12或13中的任何值。
在式IV、V或VI的一些实施例中，U1的部分为多糖的至少一种多元醇。在一些实施例中，U1的部分为脂多糖的至少一种多元醇。在一些实施例中，U1的部分为抗原性多肽的至少一个氨基酸。
在另外的实施例中，包括炔烃的抗原包括式VII或VIIa结构：
其中：
X独立地为多糖的至少一种多元醇；并且
n为至少1。
在基团(例如，X、Y或U1)被描述为多元醇的情况下，其可以指化学附接到多糖内的多元醇(例如，化学附接到多糖内的单糖，其中单糖为多元醇)。附接本身可以与任何合适的官能团进行(例如，与醛，其可能由邻位二醇的氧化产生)。
在另外的实施例中，包括炔烃的抗原包括式VIIb或VIIc结构：
其中：
X独立地为多糖的至少一种氨基糖的胺；并且
n为至少1。
在一些实施例中，根据(A-X)z-Y，包括炔烃的抗原包括多糖，其中：
A为
X独立地为至少一种多元醇；
Y独立地为多糖的至少一种多元醇；
n为至少1；并且
z大于1。
在一些实施例中，抗原包括多糖，所述多糖进一步包括DBCO基团，所述DBCO基团包括至少1.5％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％或至少20％(w/w)的共价附接的DBCO。在一些实施例中，所述抗原包括大于约1.5％(w/w)的DBCO。在一些实施例中，所述抗原包括大于约3％(w/w)的DBCO。在一些实施例中，所述抗原包括至多20％、至多19％、至多18％、至多17％、至多16％、至多15％、至多14％、至多13％、至多12％、至多11％、至多10％、至多9％、至多8％、至多7％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3.5％、至多3.0％、至多2.5％、至多2.0％或至多约1.7％(w/w)的共价附接的DBCO。在一些实施例中，所述抗原包括小于20％(w/w)的共价附接的DBCO。在其它实施例中，所述抗原包括小于10％(w/w)的共价附接的DBCO。在一些实施例中，所述抗原包括介于约1.5与20％之间、介于3％与20％之间、介于3％与18％之间、介于3％与16％之间、介于3％与14％之间、介于3％与12％之间、介于3％与10％之间、介于3％与8％之间、介于3％与6％之间、或介于3％与4％之间、或介于1.5与9％(w/w)之间的共价附接的DBCO。
在一些实施例中，抗原包括多糖，所述多糖进一步包括DBCO基团，所述DBCO基团包括每100个多糖重复单元至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％或至少20％的DBCO分子。在一些实施例中，所述抗原包括每100个多糖重复单元大于3％的DBCO分子。在一些实施例中，所述抗原包括每100个多糖重复单元至多20％、至多19％、至多18％、至多17％、至多16％、至多15％、至多14％、至多13％、至多12％、至多11％、至多10％、至多9％、至多8％、至多7％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3.5％的共价附接的DBCO分子。在一些实施例中，所述抗原包括每个多糖重复单元小于20％的共价附接的DBCO。在一些实施例中，所述抗原包括每100个多糖重复单元小于10％的共价附接的DBCO。在一些实施例中，所述抗原包括每100个多糖重复单元介于约3％与20％之间、介于3％与18％之间、介于3％与16％之间、介于3％与14％之间、介于3％与12％之间、介于3％与10％之间、介于3％与8％之间、介于3％与6％之间或介于3％与4％之间的共价附接的DBCO分子。
在一个实施例中，包括多糖的抗原任选地为寡糖。寡糖具有少量的重复单元(通常为5-15个重复单元)并且通常通过合成或通过水解较高分子量的多糖而衍生。
在一个实施例中，包括多糖的抗原的分子量介于约10kDa与约10,000kDa之间。在其它此类实施例中，所述多糖的分子量介于50kDa与10,000kDa之间。在另外的此类实施例中，所述多糖的分子量介于50kDa与10,000kDa之间；介于50kDa与9,500kDa之间；介于50kDa与9,000kDa之间；介于50kDa与8,500kDa之间；介于50kDa与8,000kDa之间；介于50kDa与7,500kDa之间；介于50kDa与7,000kDa之间；介于50kDa与6,500kDa之间；介于50kDa与6,000kDa之间；介于50kDa与5,500kDa之间；介于50kDa与5,000kDa之间；介于50kDa与4,500kDa之间；介于50kDa与4,000kDa之间；介于50kDa与3,500kDa之间；介于50kDa与3,000kDa之间；介于50kDa与2,500kDa之间；介于50kDa与2,000kDa之间；介于50kDa与1,750kDa之间；介于50kDa与1,500kDa之间；介于50kDa与1,250kDa之间；介于50kDa与1,000kDa之间；介于50kDa与750kDa之间；介于50kDa与500kDa之间；介于100kDa与10,000kDa之间；介于100kDa与9,500kDa之间；介于100kDa与9,000kDa之间；介于100kDa与8,500kDa之间；介于100kDa与8,000kDa之间；介于100kDa与7,500kDa之间；介于100kDa与7,000kDa之间；介于100kDa与6,500kDa之间；介于100kDa与6,000kDa之间；介于100kDa与5,500kDa之间；介于100kDa与5,000kDa之间；介于100kDa与4,500kDa之间；介于100kDa与4,000kDa之间；介于100kDa与3,500kDa之间；介于100kDa与3,000kDa之间；介于100kDa与2,500kDa之间；介于100kDa与2,000kDa之间；介于100kDa与2,000kDa之间；介于100kDa与1,750kDa之间；介于100kDa与1,500kDa之间；介于100kDa与1,250kDa之间；介于100kDa与1,000kDa之间；介于100kDa与750kDa之间；介于100kDa与500kDa之间；介于200kDa与10,000kDa之间；介于200kDa与9,500kDa之间；介于200kDa与9,000kDa之间；介于200kDa与8,500kDa之间；介于200kDa与8,000kDa之间；介于200kDa与7,500kDa之间；介于200kDa与7,000kDa之间；介于200kDa与6,500kDa之间；介于200kDa与6,000kDa之间；介于200kDa与5,500kDa之间；介于200kDa与5,000kDa之间；介于200kDa与4,500kDa之间；介于200kDa与4,000kDa之间；介于200kDa与3,500kDa之间；介于200kDa与3,000kDa之间；介于200kDa与2,500kDa之间；介于200kDa与2,000kDa之间；介于200kDa与2,000kDa之间；介于200kDa与1,750kDa之间；介于200kDa与1,500kDa之间；介于200kDa与1,250kDa之间；介于200kDa与1,000kDa之间；介于200kDa与750kDa之间；或介于200kDa与500kDa之间。设想上文范围的任何范围内的任何整数为本公开的实施例。
在一个实施例中，包括多糖的抗原的分子量介于约50kDa与约1,400kDa之间。在一个实施例中，包括多糖的抗原的分子量介于约500kDa与约3,000kDa之间。
含叠氮基的柄
在一些实施例中，化学柄包括允许与多肽的nnAA残基上的对应基团进行“点击”化学反应的部分。一个此类部分为叠氮基，其能够与多肽上的包括炔烃基团或膦的nnAA残基进行反应。在一些实施例中，抗原上的叠氮基包括式VIII结构：
L22为一键、烷基或聚(烷氧基)；并且
U1独立地为抗原的至少一个部分。
含烯烃的柄
在一些实施例中，化学柄包括允许与多肽的nnAA残基上的对应基团进行“点击”化学反应的部分。一个此类部分为烯烃基团，其能够与包括1,2,4,5-四嗪基的nnAA残基进行反应。在最简单的实施例中，所述一个此类部分为乙烯基。在一个此类实施例中，抗原上的烯烃基团包括式IX结构：
其中：
U1独立地为抗原的至少一个部分。
在其它实施例中，抗原上的烯烃基团包括式IXa结构：
其中：
L22为C1-10烷基或-(CH2CH2O)1-10-；并且
U1独立地为抗原的至少一个部分。
在一个实施例中，本公开提供了一种用于产生糖缀合物的方法，所述方法包括：(a)提供编码载体蛋白的核酸，其中所述核酸包括抑制密码子；(b)通过将所述核酸与无细胞的细菌提取物组合来产生反应混合物，所述无细胞的细菌提取物包括4-叠氮甲基苯丙氨酸(pAMF)、与所述抑制密码子互补的tRNA和氨酰基-tRNA合成酶；(c)在足以选择性地在对应于所述载体蛋白中的抑制密码子的位点处并入pAMF的条件下培育(b)的所述反应混合物。以及(d)通过[2+3]环加成来将所述pAMF与多糖缀合。在另一个实施例中，[2+3]环加成包括叠氮化物与炔烃基团之间的反应。在另一个实施例中，步骤(c)包括在低于20摄氏度下培育所述反应混合物。在另一个实施例中，所述方法另外包括在(c)之后立即纯化所述载体蛋白。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:2的密码子25、34、38、40、213、215、228、245、265、386、523或527处选择性地取代所述抑制密码子。在另一个实施例中，(b)中的所述反应混合物进一步包括蛋白质合成所必需的生物组分。在另一个实施例中，(b)中的所述tRNA能够通过pAMF带电。在另一个实施例中，与20个天然氨基酸相比，(b)中的所述氨酰基-tRNA合成酶优选地用pAMF氨酰化所述tRNA。在另一个实施例中，炔烃基团包括与多糖缀合的DBCO部分。在另一个实施例中，所述多糖为肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血杆菌、酿脓链球菌或无乳链球菌的荚膜多糖。在另一个实施例中，所述多糖为选自由以下组成的组的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F或其任何组合。在另一个实施例中，所述抗原是源自牙龈卟啉单胞菌的六种血清型中的一种血清型(例如，K1、K2、K3、K4、K5和/或K6)的荚膜多糖。在另一个实施例中，本公开提供了一种通过包括步骤(a)-(d)的方法制备的糖缀合物。在另一个实施例中，pAMF与多糖缀合以产生式X、Xa、XI或XIa的缀合物。在一个实施例中，本公开提供了一种包括通过步骤(a)-(d)制备的糖缀合物的疫苗。
多肽-抗原缀合物：
本文描述了可以在如上文所描述的免疫原性多肽与如上文所描述的抗原之间形成的多肽-抗原缀合物。在一些实施例中，多肽-抗原缀合物包括增强型载体蛋白和抗原，其中抗原与增强型载体蛋白中的nnAA连接。在一个实施例中，抗原不与免疫原性多肽的天然氨基酸连接。在另一个实施例中，抗原不与免疫原性多肽内的赖氨酸连接。例如，抗原不与SEQ ID NO:1中的赖氨酸连接。在另一个实施例中，抗原仅与免疫原性多肽的一个或多个nnAA连接。所述一个或多个nnAA任选地位于免疫原性多肽的N末端、C末端或N末端与C末端之间的任何位置处。在一些情况下，抗原仅与免疫原性多肽的一个或多个pAMF连接。例如，抗原仅与SEQ ID NO:1中的一个或多个pAMF连接。
在另一个实施例中，至少一个抗原与位于免疫原性多肽的T细胞表位外的氨基酸连接。在另一个实施例中，没有抗原与位于免疫原性多肽的T细胞表位内的氨基酸连接。
选定用于在免疫原性多肽内缀合的氨基酸任选地包括基于多肽的晶体结构(或其它3D结构，如NMR结构)的一个或多个表面可及的残基。另外地或可替代地，在免疫原性多肽上用天然氨基酸全面置换nnAA，然后进行缀合，以评估多肽上的特异性位点对缀合的效用。
在一个实施例中，抗原间接地与增强型载体蛋白缀合(例如，通过首先将增强型载体蛋白或抗原与反应性连接子结合，并且然后分别将增强型载体蛋白-连接子或抗原-连接子加合物与抗原或增强型载体蛋白结合)。在另一个实施例中，抗原直接与增强型载体蛋白缀合(例如，在一次反应中通过将包括增强型载体蛋白和抗原的两种组分结合在一起)。在缀合物包含连接子的情况下，可以使用任何合适的基团。例如，缀合物可以包含选自以下的连接子：己二酸、己二酸二酰肼(ADH)、β-丙酰胺基、硝基苯基-乙胺、卤酰基卤化物、糖苷连接、6-氨基己酸、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸盐(SPDP)、C4-C12部分等。也可以使用由上文所讨论的DBCO基团和DIFO基团产生的连接子，例如包含如二芳基环辛烯等二芳基环辛炔部分的残基。连接子通常将附接到抗原上以进行缀合，而不是附接到载剂上。
因为抗原-多肽缀合物可以形成较大的交联复合物，所以用可用的分析型方法直接测量或确定一些缀合物或所有缀合物的确切位置以及其它物理特征可能是不可能的。然而，应当理解，可以根据合成方案的设计、其预期产物以及与此预期一致的分析型结果来可靠地推断出这种位置或物理特征。
抗原-多肽缀合反应
在一些实施例中，使用适合于使本文所描述的非天然氨基酸和化学柄缀合的任何化学方法来使抗原与增强型载体蛋白缀合。此类方法包含但不限于铜(I)催化的炔烃-叠氮化物环加成(CuAAC)、应变促进的叠氮化物-炔烃环加成(SPAAC)和四嗪-烯烃连接。作为“点击(click)”反应，所有这些反应都能够在水溶液中进行。还可以使用磷化氢与叠氮化物之间的施陶丁格(Staudinger)连接。
CuAAC：在一些实施例中，通过铜(I)催化的炔烃-叠氮化物环加成(CuAAC)使抗原与增强型载体蛋白缀合。在此实施例的一个变体中，增强型载体蛋白包括含有炔丙基的nnAA，并且抗原包括叠氮基。在此实施例的另一变体中，增强型载体蛋白包括含有叠氮基的nnAA，并且抗原包括炔丙基。发现了用于生物分子的CuAAC缀合的合适条件，例如Presolski等人,《化学生物学实验指南(Curr Protoc Chem Biol.)》2011；3(4):153-162，所有所述条件都涉及添加Cu2+。在一些实施例中，通过添加如THPA等Cu配位配体来加速反应。在一些实施例中，通过添加还原剂来保持Cu2+的氧化态，从而加速反应。合适的还原剂包含抗坏血酸钠、DTT或TCEP。
SPAAC：在一些实施例中，通过应变促进的叠氮化物-炔烃环加成(SPAAC)使抗原与增强型载体蛋白缀合。在这些实施例的一个变体中，增强型载体蛋白包括含有叠氮基的nnAA，并且抗原包括环辛炔基团。在这些实施例的另一变体中，增强型载体蛋白包括含有环辛炔的nnAA，并且抗原包括叠氮基。由于SPAAC不需要另外的催化剂或辅因子，因此此反应能够在蒸馏水、0.9％盐水、PBS或生理缓冲溶液中进行。在一个实施例中，增强型载体蛋白和抗原以1.20:1(w/w)的质量比组合。
在一些实施例中，抗原经由式X或Xa结构连接到增强型载体蛋白中的含有叠氮基的nnAA：
其中：
R1独立地为H、甲酰基或增强型载体蛋白的至少一个氨基酸；
R2独立地为OH或增强型载体蛋白的至少一个氨基酸；
D为-Ar-W3-或-W1-Y1-C(O)-Y2-W2-；
Ar为
W1、W2和W3中的每个独立地为单键或低级亚烷基；
每个X1独立地为-NH-、-O-或-S-；
每个Y1独立地为单键、-NH-或-O-；
每个Y2独立地为单键、-NH-、-O-或N-连接或C-连接的吡咯烷基；
Z1、Z2和Z3之一为-N-，并且Z1、Z2和Z3中的另两个独立地为-CH-；
L22独立地为一键、烷基或聚(烷氧基)；并且
X为多糖的至少一种多元醇。
在一些实施例中，抗原经由式XI或XIa结构连接到增强型载体蛋白中的含有叠氮基的nnAA：
其中：
R1独立地为H、甲酰基或增强型载体蛋白的至少一个氨基酸；
R2独立地为OH或增强型载体蛋白的至少一个氨基酸；
W为C或N；
y为至少1；
n为至少1；并且
X独立地为荚膜多糖的至少一种多元醇。
上文关于“PEGn”讨论了“n”的值。根据式XII，“y”的值处于1-10的范围内，并且优选地为低级亚烷基，例如C1-C4亚烷基。
四嗪-炔烃连接：
在一些实施例中，通过四嗪-炔连接使抗原与增强型载体蛋白缀合。在这些实施例的一个变体中，增强型载体蛋白包括含有1,2,4,5-四嗪的nnAA，并且抗原包括烯烃基团。与SPAAC反应类似，四嗪-炔烃连接在没有添加辅因子的情况下进行，并且此反应能够在蒸馏水、0.9％盐水、PBS或生理缓冲溶液中进行。
缀合物表征
方法(尺寸排阻、渗滤、透析)：在缀合物反应之后，任选地根据包含但不限于以下的方法对感兴趣的抗原增强型载体蛋白缀合物进行纯化以获得基本上纯的缀合物：色谱法(例如，离子交换、亲和色谱法、疏水相互作用和尺寸排阻)、分子尺寸排阻(透析、渗滤、切向流过滤、深层过滤)、电泳程序(例如，制备性等电聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)或SDS-PAGE(参见例如，《蛋白质纯化(Protein Purification)》,编辑：J.C.Janson和LarsRyden,VCH出版公司(VCH Publishers),纽约,1989)。
任选地，根据包含但不限于以下的方法对感兴趣的经过缀合的蛋白质进行定量以评估经过缀合的蛋白质的活性：微流体电泳、凝胶电泳、蛋白质印迹法、免疫测定(例如，ELISA)以及其它测定。
示例性物理参数
抗原增强型载体蛋白缀合物的一个重要参数是缀合物的分子量。由于缀合物任选地包括可变数量的与每个蛋白质分子缀合的抗原分子以及可变的高阶交联(例如，蛋白质-抗原-蛋白质连接)，因此不一定可根据增强型载体蛋白和抗原的输入分子量来预测缀合物的输出分子量。大量文献(例如，Howard等人,《免疫学(Immunology)》,1971(21):535-545以及Kabat和Bezer,《生物化学和生物物理学集刊(Arch Biochem Biophys.)》,1958(78)306-18)表明抗原粒径对免疫原性具有重要影响。Wessels等人,(1998),《感染与免疫》,66:2186-92报道，缀合物大小和交联可能影响GBS III型缀合物的免疫原性和保护性功效。
一般而言，可以通过将载体蛋白连接到抗原来形成缀合物，每抗原具有一个或多个柄。在每抗原具有多个柄的情况下，可以形成交联的缀合物，从而涉及蛋白质-抗原-蛋白质连接。在每抗原具有单个柄(例如，多糖中的端基)的情况下，不会形成这种缀合物晶格，因为单个抗原无法结合到多个载体蛋白分子。本文优选交联的缀合物(特别是对于肺炎球菌)，其中期望较高的分子量，并且因此优选具有多个柄的抗原。
在一些实施例中，抗原增强型载体蛋白缀合物的分子量为约750kDa、约1,000kDa、约1,500kDa、约2,000kDa、约2,500kDa、约3,000kDa、约3,500kDa、约4,000kDa、约4,500kDa、约5,000kDa、约5,500kDa、约6,000kDa、约6,500kDa、约7,000kDa、约7,500kDa或约8,000kDa。在一些实施例中，抗原增强型载体蛋白缀合物的分子量为至少约750kDa、至少约1,000kDa或至少约1,500kDa。在一些实施例中，抗原增强型载体蛋白缀合物的分子量介于约750kDa与约2,800kDa之间。在一些实施例中，抗原增强型载体蛋白缀合物的分子量介于约800kDa与约2,800kDa之间。在一些实施例中，抗原增强型载体蛋白缀合物的分子量介于约850kDa与约2,800kDa之间。在一些实施例中，抗原增强型载体蛋白缀合物的分子量介于约900kDa与约2,800kDa之间。在一些实施例中，抗原增强型载体蛋白缀合物的分子量介于约950kDa与约2,800kDa之间。在一些实施例中，抗原增强型载体蛋白缀合物的分子量介于约1,000kDa与约2,800kDa之间。
本公开的缀合物疫苗的另一重要参数是抗原(例如，多糖)与免疫原性多肽载剂(例如，本公开的载体蛋白)的比率。在使用多糖-载体蛋白缀合物来说明一般原理的情况下，通常以重量-重量(w/w)比来表示经过纯化的缀合物的多糖-蛋白质(PS:PC)比率。这些比率常规地表示成包含与单独的糖缀合物一起纯化的任何游离多糖。多糖-载体蛋白缀合物的较高PS:PC比率允许以较少量的增强型载体蛋白递送较多的多糖抗原。对于肺炎球菌缀合物疫苗，所述比率通常处于0.3-3.0的范围内，但是其可以随血清型和缀合化学的各方面而变化(《附录2：《关于产生和控制肺炎球菌缀合物疫苗的建议(Annex 2:Recommendations for the production and control of pneumococcal conjugatevaccines)》；《WHO技术报告系列(WHO Technical Report Series)》,第927期,2005)。商业疫苗Prevnar-13的比率为0.9(参见，《Prevnar 13包装说明书(Prevnar 13PackageInsert)》,M/2016版,第24页；www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/vaccines/approvedproducts/ucm201669.pdf)，从而表明优选范围为1.0-3.0。在配制具有超过13种血清型的疫苗时，可能优选的是达到1.5-3.0的比率，并且特别优选的是采用约1.5到约2.0的比率。这可以是组合物中所有缀合物的平均比率，所述平均比率可以通过确保所有单独的缀合物具有此比率或通过确保一侧处于此范围外部的任何缀合物通过另一侧处于此范围外部的缀合物平衡来实现。
在另一个实施例中，多糖增强型载体蛋白缀合物中的多糖与增强型载体蛋白的比率(重量/重量)介于0.5与4.0之间(例如、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9或约4.0)。在另一个实施例中，载体蛋白缀合物中的(w/w)PS:PC比率介于0.7与2.8之间。在另一个实施例中，载体蛋白缀合物中的(w/w)PS:PC比率介于1.0与2.8之间。在另一个实施例中，载体蛋白缀合物中的(w/w)PS:PC比率为至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4或至少1.5。在另一个实施例中，多糖增强型载体蛋白缀合物中的多糖与增强型载体蛋白的比率大于0.9(w/w)。在另一个实施例中，多糖增强型载体蛋白缀合物中的多糖与增强型载体蛋白的比率介于约0.9与约3.0之间(w/w)。将这种PS:PC比率的单独的缀合物混合可以产生具有期望的总体PS:PC比率的组合。
存在污染物(游离多糖，C-poly)：多糖增强型载体蛋白缀合物的重要参数是不与增强型载体蛋白共价缀合，但仍然存在于缀合物组合物中的游离多糖的水平。例如，在某些情况下，游离多糖与多糖增强型载体蛋白缀合物非共价缔合(即，非共价结合到所述缀合物、吸附到所述缀合物或包埋在所述缀合物中或与所述缀合物一起包埋)。在一些实施例中，与多糖的总量相比，本文所描述的多糖增强型载体蛋白缀合物包括少于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％的游离多糖。在另一个实施例中，与多糖的总量相比，本文所描述的多糖增强型载体蛋白包括少于约10％的游离多糖。在另一个实施例中，与多糖的总量相比，本文所描述的多糖增强型载体蛋白包括少于约25％的游离多糖。在另一个实施例中，与多糖的总量相比，本文所描述的多糖增强型载体蛋白包括少于约30％的游离多糖。在另一个实施例中，与多糖的总量相比，本文所描述的多糖增强型载体蛋白包括少于约15％的游离多糖。任选地通过任何合适的方法来测量游离多糖，所述方法包含Lei等人(《发育生物学(Dev Biol)(巴塞尔)》,2000；103:259-64)，所述方法使用基于HCl/脱氧胆酸盐的沉淀方法来区分多糖库。在优选组合物中，未缀合的细菌多糖的量小于组合物中的细菌多糖总量的5wt％。在具有多种肺炎球菌缀合物的组合物中，优选的是，每种血清型的未缀合的细菌多糖的量小于组合物中的该血清型的细菌多糖总量的5wt％。
肺炎球菌荚膜多糖增强型载体蛋白缀合物的重要参数是缀合物制剂中存在的C多糖污染的水平。C多糖是肺炎链球菌的在免疫学上是非生产性的但具有高免疫原性的细胞壁组分，所述组分“伴随(ride along)”许多肺炎球菌荚膜多糖制备方法。由于C多糖免疫应答通常不产生中和抗体，因此当向动物给予时，C多糖污染可能干扰对抗原增强型载体蛋白缀合物有效性的正确评估。
任选地，通过多糖缀合物制剂的总酸水解、水解产物的色谱分析和胆碱的电导检测来显示C多糖的水平。可替代地，通过对胆碱进行NMR来分析未水解的多糖。NMR技术使用胆碱信号与鼠李糖甲基信号的比率(对于含有鼠李糖的荚膜多糖；对于其它荚膜多糖为不同的信号)来计算C多糖含量。色谱法使用胆碱信号与通过电导测定确定的多糖含量或与荚膜多糖组分峰之一的比率来计算C多糖含量。在任一方法中，胆碱的已知浓度的标准允许直接计算多糖制剂中存在的胆碱水平，一旦已知胆碱浓度，使用C多糖的理论重复结构[Hermans等人，《荷兰化学科学期刊(Recl.Trav.Chim.)》，107，600(1988)]，已知多糖制剂中的C多糖的浓度。
任选地，通过各种技术来测量多糖增强型载体蛋白缀合物样品的多糖浓度，例如任选地通过多糖的总水解和对具体单糖的浓度的测量来确定总多糖浓度。通过将C多糖浓度与总多糖浓度进行比较，确定C多糖污染程度(w/w)。总多糖的C多糖水平低于3％(w/w)被认为是可接受的。在一些实施例中，C多糖水平低于1％。
在一个实施例中，本公开提供了一种包括载体蛋白和抗原的缀合物，其中所述抗原连接到所述载体蛋白中的nnAA。在另一个实施例中，所述载体蛋白保留白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、流感嗜血杆菌蛋白D(PD)、血清组B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物(OMPC)或CRM197的T细胞结合表位。在另一个实施例中，所述nnAA为2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸或2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸和其任何组合。在另一个实施例中，所述nnAA不处于所述载体蛋白的T细胞活化表位中。在另一个实施例中，所述nnAA取代所述载体蛋白中的一个或多个赖氨酸残基。在另一个实施例中，所述缀合物的表观分子量介于约900kDa与约5MDa之间。在另一个实施例中，所取代的一个或多个赖氨酸残基选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1的K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K265、K386、K523和K527和其任何组合。在另一个实施例中，所述nnAA不处于所述载体蛋白的T细胞活化表位中。在另一个实施例中，所述抗原根据式XI或XIa连接到所述载体蛋白：
其中
R1独立地为H、甲酰基或载体蛋白的至少一个氨基酸；
R2独立地为OH或载体蛋白的至少一个氨基酸；
W为C或N；
y为至少1；
n为至少1；并且
X独立地为荚膜多糖的至少一种多元醇。
在另一个实施例中，所述抗原为多糖。在另一个实施例中，所述多糖为肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血杆菌、酿脓链球菌或无乳链球菌的荚膜多糖。在另一个实施例中，所述多糖为选自由以下组成的组的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F以及其任何组合。在另一个实施例中，所述抗原是源自牙龈卟啉单胞菌的六种血清型中的一种血清型(例如，K1、K2、K3、K4、K5和/或K6)的荚膜多糖。
在一个实施例中，本公开提供了一种用于鉴别抗原在载体蛋白上的最佳放置以改进宿主免疫应答的方法，所述方法包括：i)将nnAA取代引入到载体蛋白中；ii)使多糖与所述nnAA缀合以形成糖缀合物；以及iii)测量所述糖缀合物的表观分子量。在另一个实施例中，所述nnAA取代不处于所述载体蛋白的T细胞活化表位中。在另一个实施例中，所述载体蛋白保留白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、流感嗜血杆菌蛋白D(PD)、血清组B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物(OMPC)或CRM197的T细胞结合表位。在另一个实施例中，所述抗原为多糖。在另一个实施例中，至少一种或多种多糖根据式XI或XIa与所述载体蛋白缀合：
其中
R1独立地为H、甲酰基或载体蛋白的至少一个氨基酸；
R2独立地为OH或载体蛋白的至少一个氨基酸；并且
X独立地为荚膜多糖的至少一种多元醇。
在另一个实施例中，所取代的至少一个或多个非天然氨基酸为pAMF。在另一个实施例中，本公开提供了一种具有通过i)-iii)的方法鉴别的抗原最佳放置的载体蛋白。在另一个实施例中，所述取代被引入至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次或至少9次。在另一个实施例中，所述多糖为细菌的荚膜多糖。在另一个实施例中，所述细菌为肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血杆菌、酿脓链球菌或无乳链球菌。在另一个实施例中，所述细菌为肺炎链球菌。在另一个实施例中，所述多糖为选自由以下组成的组的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F以及其任何组合。在另一个实施例中，所述抗原是源自牙龈卟啉单胞菌的六种血清型中的一种血清型(例如，K1、K2、K3、K4、K5和/或K6)的荚膜多糖。
改性多肽和多糖：
在一个实施例中，本公开提供了一种包括至少一种化合物或其盐的改性多肽，所述改性多肽包括式XI或XIa：
其中
R1独立地为H、甲酰基或载体蛋白的至少一个氨基酸；
R2独立地为OH或载体蛋白的至少一个氨基酸；并且
X独立地为多糖的至少一种多元醇。
在另一个实施例中，所述载体蛋白保留白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、嗜血杆菌蛋白D(PD)、血清组B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物(OMPC)或CRM197的T细胞结合表位。在另一个实施例中，所述多糖为细菌物种的荚膜多糖。在另一个实施例中，所述细菌物种为肺炎链球菌。在另一个实施例中，所述细菌物种为肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血杆菌、酿脓链球菌或无乳链球菌。在另一个实施例中，所述多糖为选自由以下组成的组的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F以及其任何组合。在另一个实施例中，R1和R2不是出现在所述载体蛋白的T细胞表位中的氨基酸。在另一个实施例中，所述抗原是源自牙龈卟啉单胞菌的六种血清型中的一种血清型(例如，K1、K2、K3、K4、K5和/或K6)的荚膜多糖。
在一个实施例中，本公开提供了一种包括至少一种化合物或其盐的改性多糖，所述改性多糖包括式VII或VIIa
其中
X独立地为荚膜多糖的至少一种多元醇；并且
n为至少1。
在另一个实施例中，式VII的所述改性多糖进一步与包括至少一个nnAA的载体蛋白缀合。在另一个实施例中，所述改性多糖通过[2+3]环加成缀合。在另一个实施例中，所述多糖源自细菌物种。在另一个实施例中，细菌物种为肺炎链球菌。在另一个实施例中，所述细菌物种为肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血杆菌、酿脓链球菌或无乳链球菌。在另一个实施例中，所述多糖为细菌荚膜多糖。在另一个实施例中，所述荚膜多糖的DBCO与重复单元的摩尔比率大于1。在另一个实施例中，所述荚膜多糖属于包括以下的肺炎链球菌血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F以及其任何组合。在另一个实施例中，所述抗原是源自牙龈卟啉单胞菌的六种血清型中的一种血清型(例如，K1、K2、K3、K4、K5和/或K6)的荚膜多糖。
在一个实施例中，本公开提供了一种根据(A-X)z-Y的改性多糖
其中
A为
X独立地为至少一种多元醇；
Y独立地为多糖的至少一种多元醇；
n为至少1；并且
z大于1。
在另一个实施例中，所述多糖源自细菌物种。在另一个实施例中，所述细菌物种为肺炎链球菌。Streptococcus pneumoniae.在另一个实施例中，所述细菌物种为肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血杆菌、酿脓链球菌或无乳链球菌。在另一个实施例中，所述多糖为细菌荚膜多糖。在另一个实施例中，所述荚膜多糖为属于选自由以下组成的组的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F以及其任何组合。在另一个实施例中，所述抗原是源自牙龈卟啉单胞菌的六种血清型中的一种血清型(例如，K1、K2、K3、K4、K5和/或K6)的荚膜多糖。在另一个实施例中，所述多糖进一步与载体蛋白缀合。在另一个实施例中，所述多糖经由式II的键与载体蛋白缀合。在另一个实施例中，所述载体蛋白保留CRM197的T细胞结合表位。在另一个实施例中，所述多糖通过[2+3]环加成缀合。在另一个实施例中，所述载体蛋白包括一个或多个非天然氨基酸。在另一个实施例中，所述载体蛋白保留白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、嗜血杆菌蛋白D(PD)、血清组B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物(OMPC)或CRM197的T细胞结合表位。Haemophilus influenzae protein D(PD),outermembrane protein complex of serogroup B meningococcus(OMPC),or CRM197。在另一个实施例中，所述载体蛋白进一步与抗原缀合。在另一个实施例中，所述载体蛋白经由式II的键与抗原缀合。在另一个实施例中，所述多糖与所述载体蛋白(PS:PC)的比率(w/w)介于约1.5与约4之间。
多肽-抗原缀合物的组合物：
本文描述了包括至少一种增强型载体蛋白-抗原缀合物连同至少一种赋形剂的免疫原性组合物，其中抗原经由增强型载体蛋白中的nnAA残基与多肽缀合。在一个实施例中，本公开提供了包括本文所描述的糖缀合物的疫苗组合物。在一些实施例中，与包括天然载体蛋白的缀合物疫苗组合物相比，包括至少一种如本文所描述的增强型载体蛋白-抗原缀合物的缀合物疫苗组合物在受试者中引起减少的载剂抑制。在一些实施例中，与包括天然载体蛋白的缀合物疫苗组合物相比，包括至少一种如本文所描述的增强型载体蛋白-抗原缀合物的缀合物疫苗组合物在受试者中改善总体免疫应答和/或增加T细胞相关应答。
在一些实施例中，免疫原性组合物包括单种载剂-蛋白质-抗原缀合物(例如，肺炎球菌的单种血清型)。在一些实施例中，免疫原性组合物包括多种载剂-蛋白质-抗原缀合物(例如，肺炎球菌的多种血清型)。在另外的实施例中，所述多种载剂-蛋白质-抗原缀合物任选地包括：(a)多种与共同的增强型载体蛋白缀合的抗原；或(b)多种与不同的增强型载体蛋白缀合的抗原。在另外的实施例中，所述多种增强型载体蛋白抗原缀合物包括源自同一生物体(例如，肺炎链球菌)的不同血清型的抗原。在组合物包含多种不同抗原(例如，来自肺炎球菌的多种血清型或来自脑膜炎球菌的多种血清组的荚膜多糖)的情况下，优选的是，对每种抗原使用同一类型的载体蛋白，例如，使每种抗原与同一含有nnAA的CRM197变体单独缀合，并且然后组合单独的抗原-蛋白质缀合物以得到多抗原组合物。
在一些实施例中，多价血清型多糖缀合物组合物中的所有血清型多糖与载体蛋白(PS:PC)的总体(重量/重量)比率处于一定范围内。在另一个实施例中，多糖增强型载体蛋白缀合物(或整个多价组合物)中的多糖与增强型载体蛋白的比率(重量/重量)介于0.5与4.0之间(例如、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9或约4.0)。在另一个实施例中，载体蛋白缀合物(或整个多价组合物)中的(w/w)PS:PC比率介于0.7与2.8之间。在另一个实施例中，载体蛋白缀合物(或整个多价组合物)中的(w/w)PS:PC比率介于1.0与2.8之间。在另一个实施例中，载体蛋白缀合物(或整个多价组合物)中的(w/w)PS:PC比率为至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4或至少1.5(w/w)。在另一个实施例中，多糖增强型载体蛋白缀合物(或整个多价组合物)中的多糖与增强型载体蛋白的比率大于0.9(w/w)。在另一个实施例中，多糖增强型载体蛋白缀合物(或整个多价组合物)中的多糖与增强型载体蛋白的比率介于约0.9与约3.0之间(w/w)。优选组合物包含来自多种肺炎球菌血清型的荚膜多糖的蛋白质-糖缀合物，其中多糖与蛋白质的总质量盈余，例如蛋白质:多糖的比率介于1:1.1与1:2(w/w)之间，例如介于1:1.5与1:1.9之间。
在一些实施例中，多价血清型多糖-载体蛋白缀合物组合物中的所有血清型多糖-载体蛋白缀合物的总体分子量范围处于特定范围内。在一些实施例中，抗原增强型载体蛋白缀合物的分子量为约750kDa、约1,000kDa、约1,500kDa、约2,000kDa、约2,500kDa、约3,000kDa、约3,500kDa、约4,000kDa、约4,500kDa、约5,000kDa、约5,500kDa、约6,000kDa、约6,500kDa、约7,000kDa、约7,500kDa或约8,000kDa。在一些实施例中，抗原增强型载体蛋白缀合物的分子量为至少约750kDa、至少约1,000kDa或至少约1,500kDa。在一些实施例中，抗原增强型载体蛋白缀合物的分子量介于约750kDa与约2,800kDa之间。在一些实施例中，抗原增强型载体蛋白缀合物的分子量介于约800kDa与约2,800kDa之间。在一些实施例中，抗原增强型载体蛋白缀合物的分子量介于约850kDa与约2,800kDa之间。在一些实施例中，抗原增强型载体蛋白缀合物的分子量介于约900kDa与约2,800kDa之间。在一些实施例中，抗原增强型载体蛋白缀合物的分子量介于约950kDa与约2,800kDa之间。在一些实施例中，抗原增强型载体蛋白缀合物的分子量介于约1,000kDa与约2,800kDa之间。
在另外的实施例中，免疫原性组合物包括至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种、至少26种、至少27种、至少28种、至少29种或至少30种不同的增强型载体蛋白-抗原缀合物。
在包含多种缀合物(例如，多种肺炎球菌血清型中的每一种血清型的缀合物)的任何组合物中，优选的是，在一些情况下，每种缀合物中的载体蛋白是相同的。。在具有多种缀合物的此类组合物的替代性实施例中，可能优选的是，使用多于一种载剂。虽然每种抗原(例如，来自不同肺炎球菌血清型的荚膜多糖)可以与不同的载剂缀合，但是在此类组合物中的单独缀合物中，通常仅表示2-4种(例如，2种或3种)不同的载剂。通过说明而非限制的方式，在24种不同缀合物(每种缀合物包括来自不同的肺炎球菌血清型的荚膜多糖)的组合物中，所述24种缀合物中的一些但不是所有缀合物包括第一载体蛋白(例如，基于CRM197)并且所述24种缀合物的其余缀合物包括第二蛋白质载剂(例如，基于HiD)。因此，再次通过举例而非限制的方式，所述24种缀合物中的12种、13种、15种或20种缀合物可以包括第一载体蛋白，并且分别地，剩余的12种、11种、9种或4种缀合物可以包括第二载体蛋白。
在一些实施例中，所述至少一种赋形剂包括适合胃肠外给药的组分。
在另外的实施例中，所述至少一种赋形剂任选地包括缓冲剂或pH调节剂。在特定实施例中，缓冲剂或pH调节剂选自由硼酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠、硫酸铵或琥珀酸盐以及其任何组合组成的组。合适的缓冲剂的其它实例包含如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸等酸；如氢氧化钠、乙酸钠、乳酸钠和三-羟基甲基氨基甲烷等碱；以及如柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠和氯化铵等缓冲剂。在免疫原性组合物中还可以使用组氨酸缓冲剂。
在另外的实施例中，所述至少一种赋形剂任选地包括用于使组合物的同渗重摩处于可接受范围内的张度剂。在特定实施例中，张度剂选自由氯化钠、右旋糖和甘油以及其任何组合组成的组。适合胃肠外给药的缓冲剂的其它实例包含钠、钾或铵阳离子以及氯、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的盐；合适的盐包含氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
在另外的实施例中，所述至少一种赋形剂任选地包括表面活性剂(surfaceactive agent或surfactant)。在特定实施例中，所述表面活性剂是聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸酯(聚山梨醇酯20或“吐温(Tween)20”)、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯(聚山梨醇酯80或“吐温80”)、Brij 35、Triton X-10、普朗尼克(Pluronic)F127或十二烷基硫酸钠(SDS)。在一些实施例中，所述表面活性剂以0.0003％与0.3％(w/w)之间的浓度存在。
在一些实施例中，所述至少一种赋形剂任选地包括佐剂，即通过增强抗原呈递(长效调配物，递送系统)和/或通过提供共刺激信号(免疫调节剂)来增加免疫系统刺激的试剂。在此实施例的一些变体中，所述佐剂基于铝盐。在特定实施例中，所述佐剂是磷酸铝钾、羟基磷酸硫酸铝、氢氧化铝或磷酸铝以及其任何组合。在其它变体中，所述佐剂为水包油乳剂。在特定实施例中，所述佐剂为AS03、MF59或AF03以及其任何组合。在又其它变体中，所述佐剂为TLR4激动剂。在特定实施例中，所述佐剂为RC529。用于与本发明一起使用的优选佐剂是铝盐，如磷酸铝佐剂(例如，羟基磷酸铝佐剂)。在组合物包含铝盐佐剂的情况下，优选的是，组合物中的Al3+的浓度≤1.25mg/剂，例如≤1.25mg/0.5ml并且理想地≤0.85mg/剂。可以将组合物中的缀合物吸附到铝盐佐剂上。对于混合组合物，可以将缀合物单独吸附到铝盐上然后进行混合，或者可以将所述缀合物加入铝盐中以实现顺序吸附，由此形成混合的缀合物组合物。
优选的组合物包括(i)一种或多种如本文所定义的缀合物，例如来自多种与含有nnAA的载体蛋白缀合的肺炎球菌血清型的荚膜多糖以及(ii)磷酸铝佐剂。
在一个实施例中，本公开提供了一种用于增加免疫原性组合物的多糖与蛋白质载剂比率(w/w)(PS:PC)的方法，所述方法包括：(a)将一种或多种nnAA取代引入到载体蛋白中；以及(b)经由一种或多种非天然氨基酸取代使多糖与所述载体蛋白缀合。在另一个实施例中，所述一种或多种取代包括至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种或至少9种取代。在另一个实施例中，所述nnAA取代不处于所述载体蛋白的T细胞活化表位中。在另一个实施例中，所述nnAA为pAMF。在另一个实施例中，所述载体蛋白保留白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、嗜血杆菌蛋白D(PD)、血清组B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物(OMPC)或CRM197的T细胞结合表位。在另一个实施例中，所述非天然氨基酸取代在赖氨酸残基处发生。在另一个实施例中，所述赖氨酸残基选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1的K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K265、K386、K523和K527以及其任何组合。在另一个实施例中，所述多糖经由式XI或XIa的键与所述载体蛋白缀合：
其中
R1独立地为H、甲酰基或载体蛋白的至少一个氨基酸；
R2独立地为OH或载体蛋白的至少一个氨基酸；并且
X独立地为荚膜多糖的至少一种多元醇。
在另一个实施例中，所述PS:PC的比率介于约1.5与约4之间。在另一个实施例中，所述多糖为选自由以下组成的组的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F以及其任何组合。在另一个实施例中，所述抗原是源自牙龈卟啉单胞菌的六种血清型中的一种血清型(例如，K1、K2、K3、K4、K5和/或K6)的荚膜多糖。在另一个实施例中，所述多糖为肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血杆菌、酿脓链球菌或无乳链球菌的荚膜多糖。在另一个实施例中，本公开提供了一种通过包括步骤(a)-(b)的方法制备的糖蛋白。
10.提高免疫应答
本文提供了一种通过向受试者给予如本文所描述的缀合物或组合物而在受试者中引发对抗原的免疫保护性抗体应答的方法。通常将所述缀合物或组合物与适合胃肠外给药的赋形剂组合。
还提供了用于引发对抗原的免疫保护性抗体应答的缀合物和组合物。还提供了缀合物和组合物用于制造用于引发对抗原的免疫保护性抗体应答的药物的用途。
免疫保护性抗体应答意味着可以将所述缀合物和组合物用于例如提供主动免疫以预防由肺炎链球菌引起的侵入性疾病、预防由肺炎链球菌引起的中耳炎、预防由肺炎链球菌引起的肺炎、为处于接触脑膜炎奈瑟氏球菌风险的受试者提供主动免疫以预防侵入性疾病等。
在以下实例中对本发明进行了说明。材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨是限制性的。在不背离本发明的情况下，本领域的技术人员将会想到各种变化、改变和取代。除非另外详细描述，否则使用本领域的技术人员所熟知的技术和常规技术来执行实例。
实例
实例1：单位点eCRM部分K11TAG、K25TAG、K34TAG、K38TAG、K40TAG、K52TAG、K60TAG、K77TAG、K83TAG、K91TAG、K96TAG和K103TAG的合成
eCRM在Sutro生物制药有限公司(Sutro Biopharma,Inc.)(加利福尼亚州南旧金山(South San Francisco,Calif.))提供的无细胞蛋白质合成(CFPS)提取物中表达。其它出版物中描述了这种提取物的特征和制备；在这种情况下，提取物通常如在Zawada等人,2011,《生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)》,108(7),1570-1578中所描述的那样制备，使用来自US2016/0257946的以下修改：(1)从外膜蛋白T敏感的RF-1减毒菌株制备无细胞提取物，所述减毒菌株被工程化以过度表达大肠杆菌DsbC；(2)从类似的RF-1减毒大肠杆菌菌株制备无细胞提取物，所述菌株被工程化以产生正交CUA编码tRNA，用于在琥珀终止密码子处插入非天然氨基酸；(3)将来自(1)和(2)的无细胞提取物混合(比率为85:15)并在室温(20℃)下用50μM碘乙酰胺处理30分钟；以及(4)将混合提取物加入到含有无细胞蛋白质合成系统的除DNA编码eCRM外的所有其它组分的预混合物中。无细胞蛋白质合成反应的最终浓度为30％(按体积计)细胞提取物、2mM对-甲基叠氮基-L-苯丙氨酸(pAMF)(RSP氨基酸，Shirley，马萨诸塞州)、5μM pAMF特异性tRNA合成酶(‘RS’)、2mM GSSG(氧化型谷胱甘肽)、8mM谷氨酸镁、10mM谷氨酸铵、130mM谷氨酸钾、35mM丙酮酸钠、1.2mM AMP、0.86mM GMP、UMP和CMP中的每一个、2mM氨基酸(除了0.5mM的酪氨酸和苯丙氨酸外)、4mM草酸钠、1mM腐胺、1.5mM亚精胺、15mM磷酸钾、100nM T7 RNAP、以及2.5μM编码nnAA变体的eCRM质粒。通过添加编码eCRM的质粒DNA引发无细胞合成反应。
将反应物在48孔花板(m2p-labs#MTP-48-B)中以650rpm在摇床上孵育14小时。培养期后，将反应物保持在4℃直到其被处理用于纯化或分析。在无细胞蛋白质合成反应后，将含有pAMF-eCRM的混合物转移到96孔板(DyNa BlockTM，2mL；Labnet，Edison，新泽西州)中，并在40℃下以5000×g离心15分钟。
首先，进行优化实验以评估用于eCRM的CFPS生产的最佳温度和添加剂。CFPS反应在30摄氏度、25摄氏度、和20摄氏度下进行，在三个温度中的每个温度下额外补充CUA编码的tRNA(0％v/v、1％v/v、2％v/v、4％v/v、8％v/v、12％v/v)和nnAA/合成酶混合(50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml)。收集离心前和离心后的CFPS混合物样品并通过SDS-PAGE电泳分析，并且通过光密度测定法对带进行定量，以评估在每种条件下产生的总蛋白质(离心前样品)中的可溶性蛋白质(离心后样品)的量。
图1示出了如通过定量光密度测定法评估的在每种条件下产生的nnAA-eCRM的产率。虽然30度下的CFPS反应产生相对小部分的可溶性蛋白质(在所有条件下最大总量约0.33)，但可溶性蛋白质的产率在25度时提高(在所有条件下可溶性/总量>约0.40)并在20度时进一步提高(在所有条件下可溶性/总量>约0.60)。在两种“低”温度条件下，通过增加tRNA浓度进一步提高可溶性蛋白质产率(1-12x示出产率增加)，而增加nnAA/合成酶浓度对可溶性产率具有不利影响或不具有影响。
基于图1的实验，选择小于20度的温度和至少20μM的tRNA浓度来合成K11TAG、K25TAG、K34TAG、K38TAG、K40TAG、K52TAG、K60TAG、K77TAG、K83TAG、K91TAG、K96TAG和K103TAG变体。
如以上进行CFPS反应。为了便于在这些初步实验中纯化，组氨酸标签(GSGHHHHHH；SEQ ID NO:10)通过表达载剂融合到载体蛋白序列的C末端，并且通过使用含有40μL树脂的IMAC Phytips(phynexus，加利福尼亚州圣何塞)对来自离心后上清液的eCRM变体进行纯化。将树脂床在IMAC平衡缓冲液(1×PBS和10mM咪唑)中预平衡，并且通过平衡的IMACPhytips以4.2μL/分钟的流速将澄清的上清液上下吸移10次。用IMAC平衡缓冲液洗涤结合的蛋白质，并且然后用125μL IMAC洗脱缓冲液(1×PBS和0.5M咪唑)洗脱。组氨酸标签不是必需的，并且为了更大规模的纯化而被省略。
在与DBCO-荧光素反应后，通过SDS-PAGE和荧光分析评估nnAA并入和反应性(图2)。用50μM DBCO荧光素将2-12μM eCRM孵育16小时，使其经受非还原性SDS-PAGE，并用考马斯蓝(可见光)和Sypro-红宝石色滤光片组(荧光、荧光素)进行可视化。图2示出了对应的考马斯(左)和荧光(右)凝胶图像，所述凝胶图像示出了并入eCRM中的pAMF与DBCO反应的能力。K25、K34、K38、和K40琥珀取代显示高表达和缀合效率，而其它则不显示。
实例2：多种nnAA eCRM的设计
如以上详细描述中所描述的选择多种nnAA eCRM变体。通过CFPS合成变体并按照例1对其进行测试。
表2：多种nnAA eCRM变体
变体# K25 K34 K38 K40 K213 K215 K228 K245 K265 K386 K523 K527
1 √ √ √ √ √ √
2 √ √ √ √ √ √
3 √ √ √ √ √ √
4 √ √ √ √ √ √
5 √ √ √ √ √ √
6 √ √ √ √ √ √
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8 √ √ √ √ √ √
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11 √ √ √ √ √ √
12 √ √ √ √ √ √
13 √ √ √ √ √ √
14 √ √ √ √ √ √
15 √ √ √ √ √ √
16 √ √ √ √ √ √
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19 √ √ √ √ √ √
20 √ √ √ √ √ √
21 √ √ √ √ √ √
22 √ √ √ √ √ √
23 √ √ √ √ √ √
24 √ √ √ √ √ √
25 √ √ √ √ √
26 √ √ √ √ √ √
27 √ √ √ √ √ √
28 √ √ √ √ √ √
29 √ √ √ √ √ √
30 √ √ √ √ √ √
31 √ √ √ √ √ √
32 √ √ √ √ √ √
制备包含不同数量的Lys→pAMF取代的另外的变体。一般来说，发现较高数量的取代产生导致较高MW缀合物的载剂(例如，对于血清型14，从具有2个取代的998kDa上升到具有3个取代的1238kDa、到具有4个取代的1789kDa，并且到具有5个取代的2547kDa)，但载剂具有较低的溶解度。具有六个pAMF残基的载剂通常提供良好的溶解性(>>50mg/mL)和免疫原性。高溶解度是令人惊讶的，因为用疏水性pAMF残基替代天然序列中带电荷的Lys残基增加了CRM197的疏水性，所述CRM197是疏水性已经被报道影响其溶解度的蛋白质(Orr等人，1999，《感染免疫学(Infect Immun)》67:4290-4)。因此，这些结果表明，当带电荷的残基丢失时，保持已经在已知的CRM197缀合物(即Lys残基)中使用的相同的附着位点而不造成不溶性是可能的。
CRM197的研究已经鉴别了SEQ ID NO:1的残基P272-D291、V322-G384和Q412-I458内的T细胞表位。这些表位区域包含Lys残基K420、K441、K446、K448和K457，因此这些赖氨酸残基的取代破坏支持CRM197的活性的T细胞表位。因此，如以上在表2中所示出的，用于被SEQ ID NO:1中的nnAA取代的优选的Lys残基是K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523和K527。
期望缀合的多糖在CRM197表面的一个区域中不太紧密地定位。因此，在紧密间隔的残基内，优选的是选择(i)K25、K34、K38、和K40中的仅一种以及(ii)K213或K215。此外，超越其主要结构，对CRM197的3D结构的研究鉴别两个大体区域(第一个运行到Asn-374，并且第二个运行自Ser-375)，因此还优选的是在这些区域中的两个区域中选择残基，例如，针对6个取代，每个区域中选择3个。该一般指导允许多糖在附着于CRM197载剂时在空间上分离。
在产生肺炎球菌缀合物中特别有用的一种序列是表2中的变体12，其中K34、K213、K245、K265、K386和K527被nnAA替代。该蛋白质具有氨基酸序列SEQ ID NO:9，其中每个X是pAMF(优选的nnAA)。该蛋白质用于制备以下所描述的缀合物。
赖氨酸残基是有用的，因为它们是已经在已知的CRM197缀合物中使用的氨基酸，因此这些位处的nnAA允许缀合发生在已知与CRM197相容的相同位点处。然而，如以上所提及的，带电荷的赖氨酸的损失可以导致结构变化、增加的疏水性和较低的溶解度。将苯基丙氨酸残基修饰为基于苯基丙氨酸的nnAA(如对-叠氮基-苯丙氨酸、对-叠氮基-甲基-苯丙氨酸、对-氟-苯丙氨酸、对-乙酰基-苯丙氨酸、或对-苯甲酰-苯丙氨酸)将降低这些变化的风险。因此，残基F13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531或F532还被单独地和组合地选择用于取代。由pAMF对多达五个苯丙氨酸残基的取代被测试并提供可溶性缀合物，但与使用相同数量的多个Lys取代实现相比，具有较低的MW缀合物的趋势。
相比于取代CRM197内的氨基酸，在CRM197序列内插入nnAA也是可能的。例如，将编码pAMF的TAG密码子单独地(以产生六点插入)或组合地(插入2、3、4、5或6个nnAA)直接插入赖氨酸残基K34、K213、K245、K265、K386和K527的下游。如这些等具有插入的nnAA的载剂可用于制备如以上所描述的缀合物和多价组合物。
实例3：Pfs25中T细胞表位的鉴别
按照Diethelm-Okita等人，《感染病学杂志(J Infect Dis.)》1997年2月；175(2):382-91中所描述的方法通过实验确定疟疾动合子特异性表面蛋白Pfs25的T细胞活化表位。简而言之，对应于Pfs25的完整表达序列合成由20个氨基酸构成的并且重叠5个氨基酸的肽片段。CD8+消耗的和CD4+富集的人外周血淋巴细胞(PBL)是从多个受试者获得的。将PBL一式三份铺板，并用跨越充当实验刺激物的Pfs25序列的单独合成肽培养。通过对具有[3H]-胸苷的培养物进行脉冲来测量响应于每个肽片段的PBL增殖，并跨源自不同个体的培养物对其进行比较。刺激增殖的Pfs25片段被鉴别为包括T细胞表位。刺激来自多个或所有受试者的PBL增殖的片段被分类为包括Pfs25中的通用或免疫显性T细胞表位。
实例4：用偏高碘酸钠进行多糖活化的一般方案
将血清型多糖(约30μmol)在水溶液(10mM HCl)中溶解。然后将溶液在45℃下加热30分钟，并且然后冷却，此时加入NaOH溶液以将pH调节到6.70。使用AMICON超离心机(30kDaMWCO)针对HPLC级水透析反应混合物。将上清液转移到50mL离心管中，将乙酸盐缓冲液(pH5.35)添加到25mM，并且加入0.5当量NaIO4。将混合物在25℃下搅拌17小时，之后，任选地用过量的硼氢化钠(10当量)处理氧化的样品，并使用AMICON超离心机(30kDa MWCO)针对几种HPLC级水的变化进行纯化，以得到氧化的多糖溶液。
实例5：用DBCO进行高碘酸盐氧化的多糖衍生化的一般程序
将氧化的多糖(约30μmol)与DBCO-PEG4-NH2(约30μmol)或DBCO-NH2(约30μmol)在25℃下在pH 6.79的含有16％的DMSO的72mM磷酸钠中结合。然后在25℃下将反应混合物搅拌30分钟，之后加入氰基硼氢化钠溶液(16mg/ml水溶液；59.54μmol，20当量)，并在25℃下保持搅拌过夜2天。然后用乙酸乙酯将反应混合物然后洗涤3×，将其转移到AMICON超离心机(30kDa MWCO)，并且然后使用6次20％乙醇水溶液交换然后使用3次水交换进行透析，以得到DBCO衍生物多糖类型的溶液。然后将多糖DBCO衍生物与10:1(w/w)蔗糖混合并冻干，以得到用于下一次缀合反应的白色粉末。
实例6：用CDAP进行多糖活化的一般方案
将荚膜多糖(30mg)(PS 3)溶解于水溶液(具有1.5mL 2M乙酸的13.5mL H2O)中。将混合物在85℃下加热1小时，并在冷却到环境温度后从1M溶液中加入过量的氯化镁。使用利用6次水交换进行的Amicon离心机30kDa MWCO透析来纯化所得到的多糖。
然后将制备的多糖溶解于pH 7.0水中，并加入氰基化试剂CDAP(乙腈中的1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐)。然后将溶液调节到pH 9.5或加入三甲胺(2.5当量)。然后将DBCO-PEG4-NH2或DBCO-NH2加入到溶液中。将溶液调节到5％DMSO并在25℃下搅拌过夜。用20mL乙酸乙酯洗涤溶液3×，并使用Amicon 30kDa MWCO透析单元、使用7次3％DMSO、20％乙醇、0.9％氯化钠交换和3次水交换进行纯化。然后将多糖DBCO衍生物与蔗糖以10:1(w/w)混合并冻干。
实例7：多糖DBCO与eCRM缀合的一般程序
将冻干的并且与10:1w/w蔗糖混合的多糖DBCO样品(通过实例4或5的程序制备)溶解于0.9％NaCl中，并与eCRM在溶液中混合以提供1:1的PS:eCRM输入质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合18小时之前，用手轻轻混合反应混合物。通过加入过量的叠氮化钠溶液将点击反应淬灭。将缀合的PS-eCRM混合物转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235060，300K MWCO)，并且然后在24小时内针对5次0.9％氯化钠溶液交换进行透析。将透析的溶液通过Millex-GP(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到PS-eCRM缀合物溶液。
实例8：肺炎球菌PS血清型1与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
1型PS的纯度：80％(糖醛)
Mol.wt：625g mol-1(每重复单元)
反应程序：
将天然多糖(19.7mg，校正到80％，15.8mg，25.2μmol)溶解于9.85mL水溶液(7.0mL水和2.85mL乙酸盐缓冲液，200mM，pH 5.5)中。向该溶液中加入300μL高碘酸钠溶液(104μg，3.78μmol，0.15当量)。将混合物在25℃下搅拌18小时，然后加入大摩尔过量的硼氢化钠(10摩尔当量)。使用利用至少6次水交换进行的Amicon离心机30k Da MWCO透析纯化氧化的PS以得到纯化的PS-1溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
将PS1-OX(15.8mg，25.2μmol)溶解于磷酸盐缓冲液(3.6mL，50mM pH 7.0)中，向其中加入DBCO-PEG4-NHS酯(1.0当量，DMSO中649.1g mol-1，0.35mL)。将反应混合物在恒温水浴中在37℃下搅拌两天，然后用乙酸乙酯(3×20mL)进行萃取。通过离心透析单元(Amicon30kDa MWCO)使用6次20％乙醇水溶液交换然后使用3次水交换(每次12mL)纯化DBCO衍生物以得到1型DBCO衍生物。向该溶液(2.20mL，9.59mg)中加入蔗糖溶液(在1mL水中96mg)。将合并的溶液分成三个相等的部分，并且将每个部分冻干以得到三个白色粉末样品。每个样品含有3.18mg的1DBCO和32mg的蔗糖，用于下一次缀合反应。
3.PS 1-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 1-DBCO：3.18mg(具有32mg蔗糖)冻干粉末
％ DBCO：1.67％
CRM浓度：6.5mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1:1
反应程序：
将1-DBCO溶解于叠氮基官能化的eCRM溶液(0.51mL)中以提供1:1的PS1:CRM输入质量比(w/w)。用0.9％氯化钠溶液(0.22μmm过滤)进一步稀释到1.0g mL-1是必要的，以缓解凝胶形成。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合18小时之前，用手轻轻混合溶液。通过加入叠氮化钠溶液(10mg/mL，50μL)将点击反应淬灭。将CRM缀合物转移到两个预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，300K MWCO)，并且然后用0.9％氯化钠溶液透析24小时(3次交换，每次800ml)。将透析的溶液通过Millex-GP注射器过滤器(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到1-CRM缀合物溶液。
*CJD＝透析的缀合物
实例9：肺炎球菌PS血清型2与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
2型PS的纯度：80％
Mol.wt：960.84g mol-1
反应程序：
将天然多糖(25.5mg，26.5μmol)溶解于12.75mL水溶液(9.24mL水和3.51mL乙酸盐缓冲液，200mM，pH 5.5)中。向该溶液中加入216μL高碘酸钠溶液(5.26mg/ml，0.20当量)。将混合物在25℃下搅拌18小时，通过222nm处的UV吸收监测NaIO4。使用利用至少6次水交换进行的Amicon离心机100kDa MWCO透析纯化氧化的PS以得到纯化的PS-2溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
用磷酸盐缓冲液(1.95mL，200mM pH 6.0)稀释在2.14mL水中的PS2-OX(18.1mg，18.8μmol)，向其中加入DBCO-PEG4-NH2(9.85mg，1当量，在DMSO中，0.197mL)。25分钟后，加入NaCNBH3(2.36mg，2当量，59μL，来自H2O溶液)。将反应混合物在恒温水浴中在25℃下搅拌两天，然后加入磷酸盐缓冲液(0.5mL的200mM pH＝6)。向此加入NaBH4(60μL的10mg/mL水溶液，1当量)。搅拌30分钟后，将混合物用乙酸乙酯(4×5mL)萃取。通过用氮气鼓泡去除残留的乙酸乙酯，并将混合物转移到100kDa MWCO Amicon离心机过滤器中。通过使用1次水交换然后使用6次20％乙醇水溶液交换然后使用3次水交换(每次12mL)进行的离心透析来纯化DBCO衍生物以得到2型DBCO衍生物。向该溶液(2.14mL，14.3mg)中加入蔗糖溶液(1mL水中100mg)。将合并的溶液分成三个几乎相等的部分，并且将每个部分冻干以得到三个白色粉末样品(4.96mg，4.96mg和4.4mg)。
3.PS 2-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 2-DBCO：4.4mg(具有32mg蔗糖)冻干粉末
％ DBCO：4.03％
CRM浓度：3.18mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.5:1
反应程序：
将PS2-DBCO溶解于0.9％NaCl(3,01mL)中并加入DMSO(0.44mL)。然后加入叠氮基官能化的eCRM溶液(0.95mL)以提供1.5:1的PS2:CRM输入质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合18小时之前，用手轻轻混合溶液。通过加入叠氮化钠溶液(10mg/mL，100μL)将点击反应淬灭。将CRM缀合物转移到两个预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，300K MWCO)，并且然后用0.9％氯化钠溶液透析24小时(5次交换，每次1000ml)。将透析的溶液通过Millex-GP注射器过滤器(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到2-CRM缀合物溶液。
实例10：肺炎球菌PS血清型3与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.水解
3型PS的纯度：86％(蒽酮)
Mol.wt：360.3g mol-1
反应程序：
将天然多糖3(30.0mg)溶解于15.0mL水溶液(13.5mL水和1.5mL乙酸，2M)中。将混合物在85℃下加热1小时，然后在冷却到环境温度后加入氯化镁溶液(1.5mL，1M)。使用利用至少6次水交换进行的Amicon离心机30k Da MWCO透析纯化水解的PS以得到纯化的PS-3溶液，然后将所述溶液以两个相等的等分试样冻干。
2.DBCO衍生化
反应程序：
将水解的PS3(12.75mg，35.4μmol)溶解于水溶液(6.4mL)中，用氢氧化钠溶液(0.2M，100μL)调节到pH 7.0。然后逐滴地加入氰基化试剂CDAP(乙腈中的0.426M，0.2当量，16.7μL)。90s后，用氢氧化钠溶液(0.2M，300μL)将溶液快速调节到pH 9.5。立即逐滴地加入DBCO-PEG4-NH2(DMSO中的0.032M，0.1当量，523g mol-1，0.110mL)。加入额外的DMSO以得到5％(v/v)DMSO(0.320mL)。将反应混合物在恒温水浴中在25℃下搅拌过夜，然后通过0.22μmPES注射器过滤器过滤。用乙酸乙酯(3×20mL)萃取滤液。通过离心透析单元(Amicon 30kDaMWCO)使用总共7次3％DMSO、20％乙醇水溶液、0.9％氯化钠交换然后使用3次水交换(每次12mL)纯化DBCO衍生物以得到3型DBCO衍生物。然后将水溶液通过0.45μm PVDF注射器过滤器过滤。向该溶液(3.84mL，8.52mg)中加入10倍大量过量的蔗糖(在0.85mL水中85mg)。将合并的溶液分成三个部分，将所述三个部分冻干以得到三个白色粉末样品。对于总共三个样品，两个样品中含有用于下一次缀合反应的5.0mg的3-DBCO和50mg的蔗糖，其余样品中含有8.5mg。
3.PS 3-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 3-DBCO：5.0mg(具有50mg蔗糖)冻干粉末
％ DBCO：5.0％
CRM浓度：4.0mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1:1
反应程序：
将3-DBCO溶解于0.9％氯化钠溶液(6.39mL，0.22μm过滤的)、磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.5M，0.333mL)和DMSO(0.833mL)中。然后逐滴地加入叠氮基官能化的eCRM溶液(0.770mL)以提供1:1的PS3:CRM输入质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合18小时之前，用手轻轻混合溶液。通过加入叠氮化钠溶液(10mg/mL，50μL)将点击反应淬灭。将CRM缀合物转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，300K MWCO)，并且然后用0.9％氯化钠溶液透析48小时(4次交换，每次1L)。将透析的溶液通过Millex-GP注射器过滤器(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到3-CRM缀合物溶液。
*CJF＝透析和过滤的缀合物
实例11：肺炎球菌PS血清型3与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
3型PS的纯度：86％(蒽酮)
Mol.wt：360.3g mol-1
反应程序：
将天然多糖3(14.4mg，校正到86％，12.4mg，34.4μmole)溶解于7.2mL水溶液(5.9mL水和1.3mL乙酸盐缓冲液，200mM，pH 5.5)中。向该溶液中加入300μL高碘酸钠溶液(1.10μg，5.16μmol，0.15当量)。将混合物在25℃下搅拌18小时。使用利用至少6次水交换进行的Amicon离心机30k Da MWCO透析纯化氧化的PS以得到纯化的PS3-OX溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
将PS3-OX(9.05mg，25.1μmol)溶解于磷酸盐缓冲液(2.11mL，50mM，pH 6.7)中，向其中加入DBCO-PEG4-NH2(1.0当量，DMSO中523g mol-1，0.40mL)。在加入氰基硼氢化钠溶液(2当量，44.5mg/mL，35μL)之前，将反应混合物在25℃下搅拌25分钟并且搅拌两天。此时，用乙酸乙酯(3×20mL)萃取反应混合物。通过离心透析单元(Amicon 30kDa MWCO)使用6次20％乙醇水溶液交换然后使用3次水交换(每次12mL)纯化DBCO衍生物以得到3型DBCO衍生物。向该溶液(3.20mL，8.60mg)中加入10倍大量过量的蔗糖(在0.86mL水中86mg)。将合并的溶液分成四个部分，并且将每个部分冻干以得到三个白色粉末样品。对于总共四个样品，三个样品中含有用于下一次缀合反应的2.0mg的3-DBCO和20mg的蔗糖，其余样品中含有2.6mg。
3.PS 3-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 3-DBCO：2.0mg(具有20mg蔗糖)冻干粉末
％ DBCO：2.3％
CRM浓度：4.0mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1:1
反应程序：
将3-DBCO溶解于0.9％氯化钠溶液(0.400mL，0.22μm过滤的)和DMSO(0.100mL)中。然后逐滴地加入叠氮基官能化的eCRM溶液(0.330mL)以提供1:1的PS3:CRM输入质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合48小时之前，用手轻轻混合溶液。通过加入叠氮化钠溶液(10mg/mL，50μL)将点击反应淬灭。将CRM缀合物转移到两个预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，300K MWCO)，并且然后用0.9％氯化钠溶液透析48小时(4次交换，每次1L)。将透析的溶液通过Millex-GP注射器过滤器(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到3-CRM缀合物溶液。
实例12：肺炎球菌PS血清型4与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
4型PS的纯度：80％(蒽酮)
Mol.wt：825.78
反应程序：
将类型4PS(27.5mg，33.30μmol)的粉末溶解于13.75mL水溶液(12.38mL水和1.37mL的0.1M HCl)中。然后将溶液在45℃下加热30分钟，并且然后冷却，此时加入NaOH溶液(0.1M，1.37mL)以将pH调节到6.70。使用AMICON超离心机(30kDa MWCO 6-12mL)通过3次HPLC级水(每次12mL)交换来透析反应混合物。将上清液转移到具有9.84mL水的50mL离心管中。向该溶液中加入3.43mL的200mM乙酸盐缓冲液(pH 5.35)和632μL的NaIO4溶液(3.56mg，16.65μmol，0.5当量)。将混合物在25℃下搅拌17小时，之后，使用6次HPLC级水交换(12mL)的AMICON超离心机(30kDa MWCO 6-12mL)来纯化氧化的样品以得到氧化的PS-4溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
在25℃下向氧化的(假定10％的氧化水平)4型PS(24.58mg，29.77μmol，2.4mL水)溶液中加入全部的缓冲溶液(1.8mL的200mM磷酸盐缓冲液，pH＝6.79)、DMSO(0.6mL)和DBCO-PEG-4-NH2溶液(在200μL的DMSO中15mg；28.65μmol，9.6当量)。然后在25℃下将反应混合物搅拌30分钟，之后加入224μL氰基硼氢化钠溶液(在300μL水中5.0mg；59.54μmol，20当量)，并在25℃下保持搅拌2天。在加入225μL硼氢化钠水溶液(0.01mg/μL，10当量)之前，用磷酸盐缓冲液(500μL的200mM溶液，pH＝6)稀释反应混合物。搅拌30分钟后，用乙酸乙酯(3×20mL的乙酸乙酯)萃取反应混合物，并且然后将其转移到AMICON超离心机(30kDa MWCO6-12mL)，并且然后使6次20％乙醇水溶液交换然后使用3次水交换(每次12mL)来透析以得到4型DBCO衍生物的溶液。向该溶液(4.75mL，15.25mg)中加入蔗糖溶液(在1mL水中153mg)。将合并的溶液分成三个部分，并且将每个部分冻干以得到三个白色粉末样品。两个样品含有5.35mg的4DBCO和54mg的蔗糖并且一个样品含有4.55mg的4DBCO和45mg的蔗糖用于下一次缀合反应。
3.PS 4-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 4-DBCO：5.35mg(具有54mg的蔗糖)白色粉末
％ DBCO：3.52％
CRM浓度：4mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.20:1
反应程序：
将4-DBCO样品(具有54mg蔗糖的5.35mg白色粉末)溶解于0.67mL的0.9％NaCl溶液中，并且然后加入叠氮基官能化的eCRM溶液(0.74mL)。10分钟后，加入叠氮基官能化的eCRM的另一部分(0.37mL)以提供1.20:1的PS4:CRM质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合2天之前，用手轻轻混合反应混合物。将缀合的PS-CRM混合物转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235060，300K MWCO)，并且然后用0.9％氯化钠溶液透析24小时(5次交换，每次800ml)。将透析的溶液通过Millex-GP(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到4型PS-CRM缀合物溶液。
实例13：肺炎球菌PS血清型5与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
5型PS的纯度：89％(糖醛酸)
Mol.wt：919.32
反应程序：
将5型PS(22.8mg，24.36μmol)粉末溶解于8.26mL水和3.14mL的200mM乙酸盐缓冲液(pH 5.26)和163μL的NaIO4溶液(1.3mg，6.1μmol，0.25当量)中。将混合物在25℃下搅拌18小时，之后，使用6次HPLC级水交换(12mL)的AMICON超离心机(100kDa MWCO 6-12mL)来纯化氧化的样品以得到氧化的PS-5溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
在25℃下向氧化的(假定10％的氧化水平)5型PS(6.25mg，6.68μmol，0.992mL水)溶液中加入全部的缓冲溶液(0.063mL的200mM磷酸盐缓冲液，pH＝6.74)、DMSO(25μL)和DBCO-PEG-4-NH2溶液(在100μL的DMSO中3.5mg；6.68μmol，10当量)。然后在37℃下将反应混合物搅拌30分钟，之后加入84μL氰基硼氢化钠溶液(在84μL水中0.84mg；13.36μmol，20当量)，并在37℃下保持搅拌24小时。用乙酸乙酯(6×10mL)萃取反应混合物。将萃取物转移到AMICON超离心过滤器(30kDa MWCO 6-12mL)并且然后使用8次20％乙醇水溶液交换(每次12mL)然后使用3次水交换(每次12mL)进行透析以得到5型DBCO衍生物。向该溶液(5.35mL，6.0mg)中加入蔗糖溶液(在0.6mL水中60mg)。将合并的溶液分成两个相等的部分，并且将每个部分冻干以得到两个白色粉末样品。每个样品含有3.0mg的5DBCO和30mg的蔗糖，用于下一次缀合反应。
3.PS 5-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 5-DBCO：3.0mg(具有30mg的蔗糖)白色粉末
％ DBCO：5.17％
CRM浓度：3.25mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1:1
反应程序：
将5-DBCO衍生物(具有30mg蔗糖的3.0mg白色粉末)溶解于0.9％氯化钠溶液(4.48mL)和DMSO(0.6mL)中。加入叠氮基官能化的eCRM溶液(0.92mL)以提供1:1的PS5:CRM质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合5小时之前，轻轻混合反应混合物。加入叠氮化钠(20μL，10mg/mL水溶液)溶液。30分钟之后，将缀合的PS-CRM混合物转移到预洗涤的透析管装置(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235060，300K MWCO)，并且然后用0.9％氯化钠溶液透析24小时(5次交换，每次800ml)。将透析的溶液通过Millex-GP(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到5PS-CRM缀合物溶液。
实例14：肺炎球菌PS血清型6A与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
6A型PS Mol.wt:706
NaIO4水溶液(10mg/mL)
反应程序：
将PS-6A(15mg，21.2μmol)粉末溶解于7.5mL的水溶液(10mM乙酸钠溶液，PH 4.5)中。向该溶液中加入36.3μL的NaIO4溶液(0.363mg，1.69μmol，0.08当量)。将混合物在4℃下搅拌18小时，然后将氧化的样品转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235057，20K MWCO)并且然后用50mm的PB缓冲液，PH 6.8透析24小时(4次交换，每次600ml)以得到氧化的PS-6A溶液。透析后，加入DMSO，以在具有50mm、PH 6.8的PB缓冲液的10％DMSO中制备PS-6A。
2.DBCO衍生化
PS的最终浓度：3.37mg/ml，
缓冲液的最终浓度在50mM PB中的10％DMSO(pH 6.8)
反应程序：
在25℃下向氧化的6A型PS溶液(13.5mg，19.1μmol，在10％DMSO中4mL，50mM PB，PH6.8)加入DBCO-PEG4-NH2溶液(在100.1μL的DMSO中10.01mg；19.1μmol，10当量)。然后在25℃下将反应混合物搅拌60分钟，之后加入氰基硼氢化钠溶液(在120μL水中1.2mg；19.1μmol，10当量)，并在25℃下保持搅拌24小时。然后将反应混合物转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235057，20K MWCO)并且然后使用4次50mM PB缓冲液中的20％乙醇交换然后使用3次50mM PB缓冲液交换来透析以得到6A型DBCO衍生物。
3.PS 6A-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 6A-DBCO：7.1mg(具有71mg的蔗糖)白色粉末
DBCO：9％
CRM浓度：2.617mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：2:1
PS的最终浓度：5.2mg/ml
反应程序：
将叠氮基官能化的eCRM溶液(1.4mL)加入到6A DBCO衍生物(具有71mg蔗糖的7.1mg白色粉末)以提供2:1的PS 6A:CRM质量比(w/w)。在室温(23℃)下在定轨摇床上轻轻混合17小时之前，用手轻轻混合反应混合物。然后将混合物放入孵育箱(37℃)中3小时。反应后，通过0.9％氯化钠溶液将混合物稀释2倍，并通过硼氢化钠(在191μL水中1.9mg；50.2μmol，50当量)还原3小时。将缀合的PS-CRM混合物转移到预洗涤的透析管(SpectrumLabFloat-A-Lyzer G2，Cat.No.G235072，300K MWCO)并且然后用PH 7的PBS透析24小时(3次交换，每次1000ml)。将透析的溶液通过Millex-GP(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到6A PS-CRM缀合物溶液。
实例15：肺炎球菌PS血清型6B与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
6B型PS的纯度：80％(蒽酮)
Mol.wt：706.18
NaIO4水溶液(5.45mg/mL)
反应程序：
将PS-6B(27.28mg，校正到80％，21.82mg，30.9μmol)粉末溶解于14mL水溶液(9.5mL水和4.5mL的0.2M乙酸盐缓冲液中；pH＝5.5)中。向该溶液中加入145μL的NaIO4溶液(0.79mg，3.71μmol，0.12当量)。将混合物在25℃下搅拌18小时，之后，使用6次HPLC级水交换(12mL)的AMICON超离心机装置(30kDa MWCO 6-12mL)来纯化氧化的样品以得到氧化的PS-6B溶液。
2.DBCO衍生化
PS的最终浓度：3.5mg/ml
缓冲液的最终浓度53μM(pH 6.0)
反应程序：
在25℃下向氧化的(假定10％的氧化水平)6B型PS(18.4mg，27.6μmol，3.35mL水)溶液中加入全部的缓冲溶液(1.4mL的200mM磷酸盐缓冲液，pH＝6.01)、DMSO(700μL)和DBCO-PEG-4-NH2溶液(在295μL的DMSO中14.43mg；27.6μmol，10当量)。然后在25℃下将反应混合物搅拌30分钟，之后加入75μL氰基硼氢化钠溶液(在200μL水中9.39mg；55.6μmol，20当量)，并在25℃下保持搅拌2天。在加入104μL硼氢化钠水溶液(0.01mg/μL，10当量)之前，用磷酸盐缓冲液(500μL的200mM溶液，pH＝6)稀释反应混合物。搅拌30分钟后，用乙酸乙酯(3×20mL的乙酸乙酯)萃取反应混合物，并且然后将其转移到AMICON超离心机(30kDa MWCO6-12mL)，并且然后使6次20％乙醇水溶液交换然后使用3次水交换(每次12mL)来透析以得到6B型DBCO衍生物的溶液。向该溶液(2.96mL，20.1mg)中加入蔗糖溶液(在1mL水中200mg)。将合并的溶液分成三个相等的部分，并且将每个部分冻干以得到三个白色粉末样品。每个样品含有6.7mg的6B DBCO和67mg的蔗糖，用于下一次缀合反应。
3.PS 6B-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 6B-DBCO：6.7mg(具有67mg的蔗糖)白色粉末
％ DBCO：3.2％
CRM浓度：2.617mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：2:1
PS的最终浓度：5.23mg/ml
反应程序：
将叠氮基官能化的eCRM溶液(1.28mL)加入到6B-DBCO衍生物(具有67mg蔗糖的6.70mg白色粉末)以提供2:1的PS6B:CRM质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合17小时之前，用手轻轻混合反应混合物。然后将混合物放入烘箱(37℃)中2小时。将缀合的PS-CRM混合物转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235071，100K MWCO)并且然后用0.9％氯化钠溶液透析24小时(3次交换，每次800ml)。将透析的溶液通过Millex-GP(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到6B PS-CRM缀合物溶液。
实例16：肺炎球菌PS血清型7F与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.CDAP活化和DBCO交联
纯度PS 7F：n.d.％(蒽酮)-假定100％
Mol.wt：1227g mol-1(重复单元)
反应程序：
将PS7F(6.2mg，5.1μmol)溶解于水溶液(3.1mL)中，向其中加入CDAP(2.0当量，在乙腈中100mg/mL，24μL)。将反应混合物在室温(RT)下搅拌30秒。此时，加入三乙胺(TEA，2.5当量，0.2M，63μL)并将反应混合物搅拌120秒。加入DBCO-PEG4-NH2(1.0当量，在DMSO中28.7μmol/mL，180μl)连同硼酸盐缓冲液(0.1M，pH 8.5，1.0mL)并在室温下搅拌过夜。通过乙醇沉淀并通过使用3次水交换的离心透析(Amicon 100kDa MWCO)来纯化DBCO衍生的PS7F。在通过UV吸收光谱、蒽酮测定和SEC进行分析后，将该溶液(3.61mL，3.05mg)用蔗糖溶液(10倍质量含量，100mg/mL)稀释并冻干成白色粉末。
2.PS 7F-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 7F-DBCO：2.62mg(具有26.2mg蔗糖)冻干粉末
％ DBCO：8.1％
CRM：在PBS缓冲液中5.0mg/mL
PS:CRM(输入质量比)：1.73:1
反应程序：
将冻干的7F-DBCO溶解于盐水(0.9％(w/v)，0.938mL)、磷酸盐缓冲液(0.5M，pH7.0，58μL)和DMSO(144μL)中，向其中加入eCRM溶液(0.300mL)以提供1.73:1.00的PS7F:CRM输入质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合17小时之前，用手轻轻混合溶液。将CRM缀合物转移到两个预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，300KMWCO)，并且然后用0.9％氯化钠溶液透析24小时(3次交换，每次800ml)。将透析的溶液通过Millex-GP注射器过滤器(0.22μm，33mm聚醚砜)无菌过滤，以得到7F-CRM缀合物溶液。
实例17：肺炎球菌PS血清型8与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
8型PS 84％的纯度
Mol.wt：684.54g mol-1
反应程序：
将天然多糖(42mg，61.3μmol)溶解于21mL水溶液(14.7mL水和6.3mL乙酸盐缓冲液，200mM，pH 5.5)中。向该溶液中加入高碘酸钠溶液(计算值为2.63mg，0.20当量)。将混合物在25℃下搅拌18小时，通过222nm处的UV吸收监测NaIO4。使用利用至少6次水交换进行的Amicon离心机30kDa MWCO透析纯化氧化的PS以得到纯化的PS-8溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
用磷酸盐缓冲液(789μL，0.5M，pH 6.0)、1mL的H2O和DMSO(313μL)稀释3.14mL水中的PS8-OX(33.8mg，49.4μmol)，向其中加入DBCO-PEG4-NH2(25mg，1当量，在DMSO中，250μL)。10分钟后，加入NaCNBH3(6.2mg，2当量，通过从200μL H2O中的9.43mg加入132μL)。将反应混合物在恒温水浴中在25℃下搅拌两天，然后加入磷酸盐缓冲液(0.5mL的200mM pH＝6)。向此加入NaBH4(1当量)。搅拌30分钟后，将混合物用乙酸乙酯(3×5mL)萃取。通过用氮气鼓泡去除残留的乙酸乙酯，并将混合物转移到100kDa MWCO Amicon离心机过滤器中。通过使用6次20％EtOH交换并且使用3次水交换(每次12mL)进行的离心透析来纯化DBCO衍生物以得到8型DBCO衍生物。向该溶液(5.63mL，25mg)中加入蔗糖溶液并冻干。
3.PS 8-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 8-DBCO：3.77mg(具有38mg蔗糖)冻干粉末
％ DBCO：3.57％
CRM浓度：5.966mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.5:1
反应程序：
将PS8-DBCO溶解于0.9％NaCl(2.28mL)中，加入磷酸盐缓冲液(0.126mL，0.5M，pH7.0)和DMSO(0.314mL)。然后加入叠氮基官能化的eCRM溶液(0.42mL)以提供1.5:1的PS8:CRM输入质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合1小时之前，用手轻轻混合溶液，然后在37℃下放入烘箱中过夜。通过加入叠氮化钠溶液(10mg/mL，100μL)将点击反应淬灭。将CRM缀合物转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，300K MWCO)，并且然后用0.9％氯化钠溶液透析48小时(8次交换，每次1000ml)。将透析的溶液通过Millex-GP注射器过滤器(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到8-CRM缀合物溶液。
实例18：肺炎球菌PS血清型9N与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
9N型PS的纯度：75％
Mol.wt：928.29g mol-1
反应程序：
将天然多糖(19.0mg，20.4μmol)溶解于9.49mL水溶液(7.12mL水和2.37mL乙酸盐缓冲液，200mM，pH 5.5)中。向该溶液中加入高碘酸钠溶液(1.31mg，0.30当量，来自1.0mL水溶液中的23.65mg的56μL)。将混合物在25℃下搅拌18小时，通过222nm处的UV吸收监测NaIO4。使用利用4次水交换进行的Amicon离心机30kDa MWCO透析纯化氧化的PS以得到纯化的PS-9溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
用磷酸盐缓冲液(0.945mL，200mM，pH 6.0，含有94.5mg蔗糖)和DMSO(0.33mL)稀释1.643mL水中的PS9N-OX(12.6mg，13.6μmol)，向其中加入DBCO-PEG4-NH2(7.2mg，1当量，在DMSO中，0.142mL)。10分钟后，加入NaCNBH3(1.71mg，2当量，通过从200μL H2O中的7.36mg加入47μL)。将反应混合物在恒温水浴中在25℃下搅拌两天，然后加入磷酸盐缓冲液(0.4mL的200mM pH＝6)。向此加入NaBH4(0.51mg，1当量)。搅拌30分钟后，将混合物用乙酸乙酯(5×5mL)萃取。通过用氮气鼓泡去除残留的乙酸乙酯，并将混合物转移到30kDa MWCO Amicon离心机过滤器中。通过使用3次水交换(每次12mL)然后使用6次20％乙醇水溶液交换(每次12mL)并且最后使用3次水交换(每次12mL)进行的离心透析来纯化DBCO衍生物以得到9N型DBCO衍生物。向该溶液(2.388mL，9.05mg)中加入蔗糖溶液并冻干。
3.PS 9N-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 9N-DBCO：4.5mg(具有45mg蔗糖)冻干粉末
％ DBCO：4.9％
CRM浓度：3.0mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.5:1
反应程序：
将PS9N-DBCO溶解于0.9％NaCl(1.30mL)中，连同加入pH＝7的磷酸盐缓冲液(96μL的0.5M)和DMSO(0.24mL)。然后加入叠氮基官能化的eCRM溶液(0.60mL)以提供1.5:1的PS:CRM输入质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合18小时之前，用手轻轻混合溶液。通过加入叠氮化钠溶液(10mg/mL，100μL)将点击反应淬灭。将CRM缀合物转移到两个预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，300K MWCO)，并且然后用其中加入3mL的pH＝7缓冲液的0.9％氯化钠溶液透析24小时(7次交换，每次1000ml)。将透析的溶液通过Millex-GP注射器过滤器(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到9N-CRM缀合物溶液。
实例19：肺炎球菌PS血清型9V与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
9V型PS的纯度：85％(蒽酮)
Mol.wt：704kDa(重复单元＝971.8g/mol)
反应程序：
用搅拌棒将9V型PS(35.90mg，37.80μmol)粉末溶解于50mL聚苯乙烯样品管中的17.95mL水溶液(12.565mL水和5.385mL 0.2M乙酸盐缓冲液，pH 5.5)中。一旦PS溶解，加入852μL NaIO4溶液(2.83mg，13.23μmol，0.35摩尔当量)。将反应管包裹在箔中并置于24℃的水浴中。将混合物在24℃下搅拌。18小时后，使用三个超-15离心过滤装置(30kDa MWCO；15mL)通过4次HPLC级水交换(每次15mL)来透析反应混合物以得到氧化的PS-9V溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
向氧化的9V型PS溶液(21.64mg，22.78μmol，4.27mL中加入缓冲溶液(0.541mL0.5M磷酸盐缓冲液，pH 6.0)、DMSO(66μL)和DBCO-PEG4-NH2溶液(475μL DMSO中11.9mg；22.78μmol，1摩尔当量)。然后在25℃下将反应混合物搅拌30分钟，之后加入140μL氰基硼氢化钠溶液(140μL水中2.86mg；45.56μmol，2当量)。将反应混合物包裹在铝箔中并在设定为25℃的水浴中保持搅拌2天。第二天通过加入163μL硼氢化钠溶液(163μL水中1.72mg；45.56μmol，2摩尔当量)使反应停止。搅拌30分钟后(当观察到的鼓泡停止时)，用乙酸乙酯(2×10mL)萃取反应混合物，然后用二氯甲烷(2×10mL)萃取。将萃取物用N2鼓泡20分钟以去除残留的二氯甲烷，并且然后转移到2个超-15离心过滤装置(50kDa MWCO；15mL)。通过执行与三次3％DMSO溶液交换(每次15mL)，三次20％乙醇溶液交换(每次15mL)以及两次HPLC级水交换(每次15mL)来进行透析以得到9V DBCO衍生物。向该溶液(4.40mL，12.144mg)中加入蔗糖溶液(121.44mg 1.214mL水)。将该合并的溶液分成三个部分(2×5mg和1×2.14mg)，并且将每个部分冻干以得到细白色粉末。将所有部分在4℃下储存，直到缀合反应需要。
3.PS 9V-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 9V-DBCO：5mg(具有50mg蔗糖)白色粉末
％ DBCO：3.0％
CRM浓度：6.009mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.5:1
反应程序：
将9V DBCO衍生物(具有50mg蔗糖的5.0mg白色粉末)溶解于0.9％氯化钠溶液(0.881mL)、磷酸盐缓冲液pH 7(0.067mL，0.5M)和DMSO(0.167mL)中。加入叠氮基官能化的eCRM溶液(0.555mL溶液)以提供1.5:1的PS9V:CRM质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合反应混合物18小时，然后在37℃下进行另外2小时。在总反应时间后，将叠氮化钠的体积添加到缀合混合物中(0.33mg，5.15μmol)。然后将反应混合物用0.9％氯化钠溶液(2.83mL)稀释，并转移到预洗涤的透析装置(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060，300K MWCO)。样品在0.9％氯化钠溶液中经历48小时透析(8次交换，每次800ml)。将透析的溶液通过Millex-GP(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到9V PS-CRM缀合物溶液。
实例20：肺炎球菌PS血清型9V与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
9V型PS的纯度：81％(蒽酮)
Mol.wt：949.83
NaIO4水溶液(5.41mg/mL)
反应程序：
将PS-9V(21.15mg，校正到81％，17.13mg，18.04μmol)粉末溶解于10.57mL水溶液(7.4mL水和3.17mL的0.2M乙酸盐缓冲液；pH＝5.5)中。向该溶液中加入214μL的NaIO4溶液(1.16mg，5.41μmol，0.3当量)。将混合物在25℃下搅拌20小时。通过使用6次HPLC级水交换(12mL)的AMICON超离心过滤器(30kDa MWCO 6-12mL)来纯化氧化的样品以得到氧化的PS-9V溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
在25℃下向氧化的(假定10％的氧化水平)9V型PS(15.36mg，16.17μmol，2.20mL水)溶液中加入全部的缓冲溶液(1.4mL的200mM磷酸盐缓冲液，pH＝6.01)、DMSO(500μL)和DBCO-PEG-4-NH2溶液(在131μL的DMSO中8.46mg；16.17μmol，10当量)。然后在25℃下将反应混合物搅拌30分钟，之后加入41μL氰基硼氢化钠溶液(在200μL水中15.5mg；32.34μmol，20当量)，并在25℃下保持搅拌2天。在加入62μL硼氢化钠水溶液(0.01mg/μL，10当量)之前，用磷酸盐缓冲液(500μL的200mM溶液，pH＝6)稀释反应混合物。搅拌30分钟后，用乙酸乙酯(3×20mL)萃取反应混合物。将萃取物转移到AMICON超离心过滤器(30kDa MWCO 6-12mL)并且然后使用6次20％乙醇水溶液交换(每次12mL)然后使用3次水交换(每次12mL)进行透析以得到9V型DBCO衍生物。向该溶液(4.0mL，10.08mg)中加入蔗糖溶液(1mL水中100mg)。将合并的溶液分成两个相等的部分，并且将每个部分冻干以得到三个白色粉末样品。每个样品含有5.04mg的9V DBCO和50mg的蔗糖，用于下一次缀合反应。
3.PS 9V-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 9V-DBCO：5.04mg(具有50mg的蔗糖)白色粉末
％ DBCO：3.42％
CRM浓度：3.923mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.11:1
反应程序：
将叠氮基官能化的eCRM溶液(0.1.156mL溶液中的CRM)加入到9V DBCO衍生物(具有50mg蔗糖的5.04mg白色粉末)以提供1.11:1的PS9V:CRM质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合18小时之前，用手轻轻混合反应混合物。将缀合的PS-CRM混合物转移到预洗涤的透析装置(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235060，300K MWCO)，并且然后用0.9％氯化钠溶液透析24小时(5次交换，每次800ml)。将透析的溶液通过Millex-GP(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到9V PS-CRM缀合物溶液。
实例21：肺炎球菌PS血清型10A与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.CDAP活化和DBCO交联
纯度PS 10A：77％(蒽酮)
Mol.wt：1227g mol-1(重复单元)
反应程序：
将PS10A(18.7mg，15.2μmol)溶解于水溶液(7.9mL)中，向其中加入CDAP(0.8当量，在乙腈中100mg/mL，30μL)。将反应混合物在室温(RT)下搅拌30秒。此时，加入氢氧化钠溶液(0.2M，200μL)以达到pH 9.5并将反应混合物搅拌150秒。然后加入DMSO(1.2mL)，接着加入DBCO-PEG4-NH2(0.5eq，在DMSO中32.0μmol/mL，238μL)并搅拌过夜。通过溶剂萃取并且通过使用3次3％(v/v)DMSO交换、使用2次0.9％(v/v)盐水交换和3次水交换进行的和离心透析(Amicon 30kDa MWCO)来纯化DBCO衍生的PS10A。在通过UV吸收光谱、蒽酮测定和SEC进行分析后，将该溶液(3.18mL，13.5mg)用蔗糖溶液(10倍质量含量，100mg/mL)稀释并冻干成白色粉末。
2.PS 10A-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 10A-DBCO：5.00mg(具有50.0mg蔗糖)冻干粉末
％ DBCO：8.8％
CRM：在PBS缓冲液中5.0mg/mL
PS:CRM(输入质量比)：1.75:1
反应程序：
将冻干的10A-DBCO溶解于盐水(0.9％(w/v)，3.759ml)、磷酸盐缓冲液(0.5M，pH7.0，200μL)和DMSO(500μL)中，向其中加入eCRM溶液(0.541mL)以提供1.75:1.00的PS10A:CRM输入质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合17小时之前，用手轻轻混合溶液。将CRM缀合物转移到两个预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，300KMWCO)，并且然后用0.9％氯化钠溶液透析24小时(3次交换，每次800ml)。将透析的溶液通过Millex-GP注射器过滤器(0.22μm，33mm聚醚砜)无菌过滤，以得到10A-CRM缀合物溶液。
实例22：肺炎球菌PS血清型11A与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.水解
11A型PS的纯度：69％(蒽酮)
Mol.wt：908.7g mol-1
反应程序：
将天然多糖11A(35.0mg)溶解于17.5mL水溶液(15.75mL水和1.75mL乙酸，2M)中。将混合物在80℃下加热1小时，然后在冷却到环境温度后将氢氧化钠溶液添加到pH 5.5(3.2mL，1M)。使用利用至少6次水交换进行的Amicon离心机30k Da MWCO透析纯化水解的PS以得到纯化的PS-3溶液，然后将所述溶液以一个等分试样冻干。
2.氧化
反应程序：
向水解的多糖溶液(5.027mL，28.75mg，31.6μmole)中进一步加入水(5.75mL)和乙酸盐缓冲液(0.2M，pH 5.5，3.6mL)。向该溶液中加入135μL高碘酸钠溶液(1.35μg，6.32μmol，0.20当量)。将混合物在25℃下搅拌18小时。使用利用至少6次水交换进行的Amicon离心机100k Da MWCO透析纯化氧化的PS以得到纯化的PS-11A-OX溶液。
3.DBCO衍生化
反应程序：
将PS11A-OX(22.0mg，24.2μmol，2.235mL)加入到磷酸盐缓冲液(1.37mL，200mM，pH6.0)中，向其中加入DBCO-PEG4-NH2(1.0当量，DMSO中523g mol-1，100mg/mL，127μL)和附加量的DMSO(560μL)。在加入氰基硼氢化钠溶液(2当量，44.5mg/mL，68μL)之前，将反应混合物在25℃下搅拌25分钟并且搅拌两天。用乙酸乙酯(3×20mL)萃取反应混合物，并通过0.45μm注射器过滤器过滤。通过离心透析单元(Amicon 100kDa MWCO)使用7次20％乙醇水溶液交换然后使用3次水交换(每次12mL)纯化DBCO衍生物以得到11A型DBCO衍生物。向该溶液(2.535mL，15.00mg)中加入蔗糖溶液(1.5mL水中150mg)。将合并的溶液分成三个相等的部分，并且将每个部分冻干以得到三个白色粉末样品。每个样品含有5.00mg 11A-DBCO和50mg蔗糖，用于下一次缀合反应。
4.PS 11A-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 11A-DBCO：5.0mg(具有50mg蔗糖)冻干粉末
％ DBCO：5.77％
CRM浓度：5.42mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.5:1
反应程序：
将11A-DBCO溶解于0.9％氯化钠溶液(7.656mL，0.22μm过滤的)、磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.5M，0.385mL)和DMSO(0.962mL)中。然后逐滴地加入叠氮基官能化的eCRM溶液(5.42mg/mL，0.617mL)以提供1.5:1的PS11A:CRM输入质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合17小时之前，用手轻轻混合溶液。通过加入叠氮化钠溶液(10mg/mL，50μL)将点击反应淬灭。将CRM缀合物转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，300K MWCO)，并且然后用0.9％氯化钠溶液透析48小时(4次交换，每次1L)。将透析的溶液通过Millex-GP注射器过滤器(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到11A-CRM缀合物溶液。
实例23：肺炎球菌PS血清型12F与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
12F型PS的纯度：82％(蒽酮)
Mol.wt：1094g mol-1
反应程序：
用搅拌棒将12F型PS(21.8mg，20μmol)粉末溶解于50mL聚苯乙烯样品管中的10.9mL水溶液(8.175mL水和2.725mL 0.2M乙酸盐缓冲液，pH 5.5)中。一旦PS溶解，加入160μL NaIO4溶液(0.64mg，3μmol，0.15摩尔当量)。将反应管包裹在箔中并置于25℃的水浴中。将混合物在25℃下搅拌。18小时后，使用两个超-15离心过滤装置(30kDa MWCO；15mL)通过6次HPLC级水交换(每次15mL)来透析反应混合物以得到氧化的PS-12F溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
将PS12F-OX(13.1mg，12μmol，2.68mL)加入到磷酸盐缓冲液(1.00mL，200mM，pH6.0)中，向其中加入DBCO-PEG4-NH2(1.0当量，DMSO中523g mol-1，33mg/mL，199μL)和附加量的DMSO(500μL)。在加入氰基硼氢化钠溶液(2当量，52.5mg/mL，29μL)之前，将反应混合物在25℃下搅拌25分钟并且搅拌两天。用乙酸乙酯(3×20mL)萃取反应混合物并鼓泡为不含溶剂。通过离心透析单元(Amicon 30kDa MWCO)使用6次20％乙醇水溶液交换然后每次使用3次水交换(每次12mL)纯化DBCO衍生物以得到12F-DBCO衍生物。向该溶液(2.2mL，10.45mg)中加入蔗糖溶液(1.05mL水中104.5mg)。将合并的溶液分成两个相等的部分，并且将每个部分冻干以得到三个白色粉末样品。每个样品含有5.0mg 12F-DBCO和50mg蔗糖，用于下一次缀合反应。
3.PS 12F-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 12F-DBCO：5.0mg(具有50mg蔗糖)冻干粉末
％ DBCO：2.0％
CRM浓度：5.29mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.5:1
反应程序：
将12F-DBCO溶解于0.9％氯化钠溶液(6.542mL，0.22μm过滤的)、磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.5M，0.334mL)和DMSO(0.834mL)中。然后逐滴地加入叠氮基官能化的eCRM溶液(5.29mg/mL，0.630mL)以提供1.5:1的PS12F:CRM输入比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合17小时之前，用手轻轻混合溶液。通过加入叠氮化钠溶液(10mg/mL，50μL)将点击反应淬灭。将CRM缀合物转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，300KMWCO)，并且然后用0.9％氯化钠溶液透析48小时(4次交换，每次1L)。将透析的溶液通过Millex-GP注射器过滤器(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到无菌12F-CRM缀合物溶液。
实例24：肺炎球菌PS血清型14与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
14型PS的纯度：91％(蒽酮)
Mol.wt：689.25
NaIO4水溶液(7.8mg/mL)
反应程序：
将PS-14(28.3mg，校正到80％，25.75mg，37.36μmol)粉末溶解于14mL水溶液(10mL水和4mL的0.2M乙酸盐缓冲液中；pH＝5.5)中。向该溶液中加入110μL的NaIO4溶液(0.86mg，4.05μmol，0.13当量)。将混合物在25℃下搅拌3小时，之后，使用6次HPLC级水交换(12mL)的AMICON超离心机(30kDa MWCO 6-12mL)来纯化氧化的样品以得到氧化的PS-14溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
在25℃下向氧化的(假定10％的氧化水平)14型PS(20.5mg，29.74μmol，2.92mL水)溶液中加入全部的缓冲溶液(1.3mL的200mM磷酸盐缓冲液，pH＝6.8)、DMSO(550μL)和DBCO-PEG-4-NH2溶液(在150μL的DMSO中11.68mg；22.3μmol，0.75当量)。然后在25℃下将反应混合物搅拌30分钟，之后加入70μL氰基硼氢化钠溶液(在120μL水中6.39mg；59.48μmol，20当量)，并在25℃下保持搅拌2天。在加入100μL硼氢化钠水溶液(1.13mg，10当量)之前，用磷酸盐缓冲液(500μL的200mM溶液，pH＝6)稀释反应混合物。搅拌30分钟后，用乙酸乙酯(3×20mL的乙酸乙酯)萃取反应混合物，并且然后将其转移到AMICON超离心机(30kDa MWCO 6-12mL)，并且然后使用7次20％乙醇水溶液交换(每次12mL)然后使用3次水交换(每次12mL)来透析以得到14型DBCO衍生物。向该溶液(3.78mL，17.7mg)中加入蔗糖溶液(1.17mL水中177mg)。将合并的溶液分成三个相等的部分，并且将每个部分冻干以得到三个白色粉末样品。每个样品含有5.9mg的14DBCO和59mg的蔗糖，用于下一次缀合反应。
3.PS 14-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 6B-DBCO：5.9mg(具有59mg的蔗糖)白色粉末
％ DBCO：3.5％
CRM浓度：5.06mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.5:1
反应程序：
将叠氮基官能化的eCRM溶液(0.779mL)加入到14DBCO衍生物(具有59mg蔗糖的5.9mg白色粉末)以提供1.5:1的PS14:CRM质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合18小时之前，用手轻轻混合反应混合物。将缀合的PS-CRM混合物转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235071，100K MWCO)并且然后用0.9％氯化钠溶液透析48小时(8次交换，每次800ml)。将透析的溶液通过Millex-GP(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到14PS-CRM缀合物溶液。
实例25：肺炎球菌PS血清型14与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
14型PS的纯度：91％(蒽酮)
Mol.wt：689.25
NaIO4水溶液(10.19mg/mL)
反应程序：
将PS-14(23.5mg，校正到80％，21.38mg，31.02μmol)粉末溶解于11.75mL水溶液(8.2mL水和3.55mL的0.2M乙酸盐缓冲液中；pH＝5.5)中。向该溶液中加入97μL的NaIO4溶液(0.95mg，4.03μmol，0.13当量)。将混合物在25℃下搅拌18小时，之后，使用6次HPLC级水交换(12mL)的AMICON超离心机(30kDa MWCO 6-12mL)来纯化氧化的样品以得到氧化的PS-14溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
在25℃下向氧化的(假定10％的氧化水平)14型PS(14.3mg，20.75μmol，3.46mL水)溶液中加入全部的缓冲溶液(1.3mL的200mM磷酸盐缓冲液，pH＝6.8)、DMSO(637μL)和DBCO-PEG-4-NH2溶液(在263μL的DMSO中10.86mg；20.75μmol，10当量)。然后在25℃下将反应混合物搅拌30分钟，之后加入51μL氰基硼氢化钠溶液(在200μL水中10.2mg；41.50μmol，20当量)，并在25℃下保持搅拌2天。在加入78μL硼氢化钠水溶液(0.01mg/μL，10当量)之前，用磷酸盐缓冲液(500μL的200mM溶液，pH＝6)稀释反应混合物。搅拌30分钟后，用乙酸乙酯(3×20mL的乙酸乙酯)萃取反应混合物，并且然后将其转移到AMICON超离心机(30kDa MWCO 6-12mL)，并且然后使用6次20％乙醇水溶液交换(每次12mL)然后使用3次水交换(每次12mL)来透析以得到14型DBCO衍生物。向该溶液(4.12mL，12.24mg)中加入蔗糖溶液(1mL水中12mg)。将合并的溶液分成三个相等的部分，并且将每个部分冻干以得到三个白色粉末样品。每个样品含有6.12mg的14DBCO和6mg的蔗糖，用于下一次缀合反应。
3.PS 14-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 6B-DBCO：6.12mg(具有62mg的蔗糖)白色粉末
％ DBCO：4.42％
CRM浓度：2.617mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.8:1
反应程序：
将叠氮基官能化的eCRM溶液(1.3mL)加入到14DBCO衍生物(具有62mg蔗糖的6.12mg白色粉末)以提供1.8:1的PS14:CRM质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合17小时之前，用手轻轻混合反应混合物。将缀合的PS-CRM混合物转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235071，100K MWCO)并且然后用0.9％氯化钠溶液透析24小时(3次交换，每次800ml)。将透析的溶液(1.5mL)通过Millex-GP(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到14PS-CRM缀合物溶液。
实例26：肺炎球菌PS血清型15B与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
15B型PS的纯度：71％(蒽酮)
Mol.wt：1185kDa(重复单元＝1069.80g/mol)
反应程序：
用搅拌棒将15B型PS(14.6mg，13.65μmol)粉末溶解于50mL聚苯乙烯样品管中的7.30mL水溶液(5.1mL水和2.2mL 0.2M乙酸盐缓冲液，pH 5.5)中。一旦PS溶解，加入160μLNaIO4溶液(0.59mg，2.75μmol，0.20摩尔当量)。将反应管包裹在箔中并置于水浴中以在24℃下进行搅拌。3.5小时后，使用一个超-15离心过滤装置(30kDa MWCO；15mL)通过6次HPLC级水交换(每次15mL)来透析反应混合物以得到氧化的PS-15B溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
向氧化的15B型PS溶液(7.56mg，7.07μmol，1.271mL)中加入缓冲溶液(0.640mL0.5M磷酸盐缓冲液，pH 6.0)、DMSO(0.063mL)和DBCO-PEG4-NH2溶液(221μL DMSO中17mg；7.07μmol，1摩尔当量)。然后在25℃下将反应混合物搅拌30分钟，之后加入350μL的氰基硼氢化钠溶液(350μL的水中0.90mg；2摩尔当量)。将反应混合物包裹在铝箔中并在设定为25℃的水浴中保持搅拌2天。第二天通过加入163μL硼氢化钠溶液(0.27mg；7.07μmol，2摩尔当量)使反应停止。搅拌30分钟后，将反应混合物用二氯甲烷(3×15mL)萃取。将萃取物用N2鼓泡20分钟以去除残留的二氯甲烷，并且然后转移到一个超-15离心过滤装置(30kDa MWCO；15mL)。通过执行三次3％DMSO溶液交换(15mL)，三次20％乙醇溶液交换(每次15mL)以及三次HPLC级水交换(每次15mL)来进行透析以得到15B DBCO衍生物。向该溶液(1.982mL，6.86mg)中加入蔗糖溶液(0.686mL水中68.6mg)。将该合并的溶液分成两个部分，并且将每个部分冻干以得到细白色粉末。冻干至干燥后，将所有部分在4℃下储存，直到缀合反应需要。
3.PS 15B-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 15B-DBCO：3.85mg(具有38.5mg蔗糖)白色粉末
％ DBCO：5.9％
CRM浓度：6.009mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.5:1
反应程序：
将15B DBCO衍生物(具有38.5mg蔗糖的3.85mg白色粉末)溶解于0.9％氯化钠溶液(4.302mL)、磷酸盐缓冲液pH 7(0.220mL，0.5M)和DMSO(0.550mL)中。然后加入叠氮基官能化的eCRM溶液(0.467mL溶液)以提供1.5:1的PS15B:CRM质量比率(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合反应混合物18小时，然后在37℃下进行另外2小时。通过加入叠氮化钠(0.23mg；3.60μmol)使缀合反应终止。然后将反应混合物用0.9％氯化钠溶液稀释到最终体积7mL，并转移到预洗涤的透析装置(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235060，300K MWCO)。样品在0.9％氯化钠溶液中经历48小时透析(8次交换，每次800ml)。将透析的溶液通过Millex-GP(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到15B PS-CRM缀合物溶液。
实例27：肺炎球菌PS血清型17F与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
17F型PS的纯度：84％(蒽酮)
Mol.wt：1274kDa(重复单元＝1203.00g/mol)
反应程序：
用搅拌棒将17F型PS(28.50mg，23.69μmol)粉末溶解于50mL聚苯乙烯样品管中的14.25mL水溶液(9.925mL水和4.275mL 0.2M乙酸盐缓冲液，pH 5.5)中。一旦PS溶解，加入53.8μL NaIO4溶液(0.65mg，3.03μmol，0.128摩尔当量)。将反应管包裹在箔中并置于水浴中以在24℃下进行搅拌。1小时后，使用两个超-15离心过滤装置(30kDa MWCO；15mL)通过5次HPLC级水交换(每次15mL)来透析反应混合物以得到氧化的PS-17F溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
向氧化的17F型PS溶液(22.0mg，18.29μmol，2.48mL)中加入缓冲溶液(1.31mL的0.5M磷酸盐缓冲液，pH 6.0)和DBCO-PEG4-NH2溶液(95.8μL DMSO中9.58mg；18.29μmol，1摩尔当量)。然后在25℃下将反应混合物搅拌30分钟，之后加入氰基硼氢化钠溶液(200μL水中2.30mg；36.60μmol，2当量)。将反应混合物包裹在铝箔中并在设定为25℃的水浴中保持搅拌2天。第二天通过加入硼氢化钠溶液(0.48mg；18.29μmol，1摩尔当量)使反应停止。搅拌30分钟后，将反应混合物用二氯甲烷(3×15mL)萃取。将萃取物用N2鼓泡20分钟以去除残留的二氯甲烷，并且然后转移到一个超-15离心过滤装置(30kDa MWCO；15mL)。通过执行五次20％乙醇溶液交换(15mL)以及三次HPLC级水交换(每次15mL)来进行透析以得到17F DBCO衍生物。向该溶液(3.27mL，11.58mg)中加入蔗糖溶液(1.158mL水中115.8mg)。将该合并的溶液分成三个部分(2×5mg，1×1.58mg)，并且将每个部分冻干以得到细白色粉末。冻干至干燥后，将所有部分在4℃下储存，直到缀合反应需要。
3.PS 17F-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 17F-DBCO：5mg(具有50mg蔗糖)白色粉末
％ DBCO：3.1％
CRM浓度：5.996mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.5:1
反应程序：
将17F DBCO衍生物(具有50mg蔗糖的5mg白色粉末)溶解于0.9％氯化钠溶液(3.742mL)、磷酸盐缓冲液pH 7(0.200mL，0.5M)和DMSO(0.500mL)中。然后加入叠氮基官能化的eCRM溶液(0.558mL溶液)以提供1.5:1的PS17F:CRM质量比率(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合反应混合物19小时。通过加入叠氮化钠(0.27mg；4.16μmol；1摩尔当量)使缀合反应终止。然后将反应混合物用0.9％氯化钠溶液稀释到最终体积8mL，并转移到预洗涤的透析装置(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060，300K MWCO)。样品在0.9％氯化钠溶液中经历48小时透析(8次交换，每次800ml)。将透析的溶液通过Millex-GP(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到17F PS-CRM缀合物溶液。
实例28：肺炎球菌PS血清型18C与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
18C型PS的纯度：72％(蒽酮)
Mol.wt：970.76
NaIO4水溶液(5.41mg/mL)
反应程序：
将18C型PS(61mg，62.84μmol)粉末溶解于30.5mL水溶液(27.45mL水和3.05mL 2M乙酸)中。然后将溶液在95℃下加热40分钟，并且然后冷却，此时；加入NaOH溶液(1N，5.2mL)以将pH调节到6.0。使用AMICON超离心机(100kDa MWCO 6-12mL)通过3次HPLC级水(每次12mL)交换来透析反应混合物。将上清液转移到具有12.4mL水的50mL离心管中。向该溶液中加入5.15mL水和5.8mL 200mM乙酸盐缓冲液(pH 5.35)和153μL NaIO4溶液(1.53mg，7.175μmol，0.15当量)。将混合物在25℃下搅拌3小时，之后，使用6次HPLC级水交换(12mL)的AMICON超离心机(100kDa MWCO 6-12mL)来纯化氧化的样品以得到氧化的PS-18C溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
在25℃下向氧化的(假定10％的氧化水平)18C型PS(10.0mg，10.3μmol，1.55mL水)溶液中加入全部的缓冲溶液(0.211mL的200mM磷酸盐缓冲液，pH＝6.74)、DMSO(141μL)和DBCO-PEG-4-NH2溶液(54μL DMSO中5.4mg；16.17μmol，10当量)。然后在25℃下将反应混合物搅拌30分钟，之后加入130μL的氰基硼氢化钠溶液(在130μL的水中1.3mg；20.6μmol，20当量)，并在37℃下保持搅拌2天。在加入80μL硼氢化钠水溶液(0.01mg/μL，10当量)之前，用磷酸盐缓冲液(500μL的200mM溶液，pH＝6)稀释反应混合物。搅拌30分钟后，将反应混合物用二氯甲烷(2×10mL)然后通过乙酸乙酯(10mL)萃取。将萃取物转移到AMICON超离心过滤器(100kDa MWCO 6-12mL)并且然后使用4次20％乙醇水溶液交换(每次12mL)然后使用3次水交换(每次12mL)进行的透析以得到18C型DBCO衍生物。向该溶液(1.31mL，7.0mg)中加入蔗糖溶液(0.7mL水中70mg)。将合并的溶液分成两个相等的部分，并且将每个部分冻干以得到两个白色粉末样品。每个样品含有3.5mg的18C DBCO和35mg的蔗糖，用于下一次缀合反应。
3.PS 18C-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 18C-DBCO：3.5mg(具有35mg蔗糖)白色粉末
％ DBCO：5.32％
CRM浓度：2.76mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.5:1
反应程序：
将18C DBCO衍生物(具有35mg蔗糖的3.5mg白色粉末)溶解于0.9％氯化钠溶液(0.661mL)、磷酸盐缓冲液pH 7(0.07mL，0.5M)和DMSO(0.175mL)中。加入叠氮基官能化的eCRM溶液(0.844mL溶液)以提供1.5:1的PS18C:CRM质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合2小时之前，轻轻混合反应混合物。然后将反应混合物用0.9％氯化钠溶液(0.661mL)，磷酸盐缓冲液pH 7(0.07mL，0.5M)和DMSO(0.175mL)稀释，以使PS-18终浓度达到1mg/mL并允许反应18个小时。加入叠氮化钠溶液(23μL，10mg/mL水溶液)。30分钟之后，将缀合的PS-CRM混合物转移到预洗涤的透析管装置(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235060，300K MWCO)，并且然后用0.9％氯化钠溶液透析48小时(8次交换，每次800ml)。将透析的溶液通过Millex-GP(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到18C PS-CRM缀合物溶液。
实例29：肺炎球菌PS血清型18C与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
18C型PS重复单元Mol.wt：1012
NaIO4水溶液(10mg/mL)
反应程序：
将PS-18C(20mg，19.76μmol)粉末溶解于3mL水溶液(10mM乙酸钠溶液，PH4.5)中。向该溶液中加入63.4μL NaIO4溶液(0.634μg，2.96μmol，0.15当量)。将混合物在23℃下搅拌18小时，然后将氧化的样品转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235057，20K MWCO)并且然后用50mm的PB缓冲液，PH 6.8透析24小时(4次交换，每次600ml)以得到氧化的PS-18C溶液。透析后，加入DMSO，以在具有50mm、PH 6.8的PB缓冲液的10％DMSO中制备PS-18C。
2.DBCO衍生化
PS的最终浓度：3.75mg/ml，
缓冲液的最终浓度50mM PB中10％DMSO(pH 6.8)
反应程序：
在25℃向氧化的18C型PS(15mg，14.8μmol，10％DMSO中4.4mL，50mM PB，PH 6.8)的溶液中加入DBCO-PEG4-NH2溶液(在77.6μL DMSO中7.76mg；14.8μmol，10当量)。然后在25℃下将反应混合物搅拌60分钟，之后加入氰基硼氢化钠溶液(在93μL水中0.93mg；14.8μmol，10当量)，并在25℃下保持搅拌24小时。然后将反应混合物转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235057，20K MWCO)并且然后使用4次50mM PB缓冲液中的20％乙醇交换然后使用3次50mM PB缓冲液交换来透析以得到18C型DBCO衍生物。
3.PS 18C-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 18C-DBCO：6mg(具有60mg蔗糖)白色粉末
DBCO：3％
eCRM浓度：6.5mg/mL
PS:CRM(输入比率)：1.5:1
PS的最终浓度：2mg/ml
反应程序：
将叠氮基官能化的eCRM溶液(0.615mL)加入到18C DBCO衍生物(将6mg白色粉末预溶解于3mL水中，5.9μmol)中以提供1.5:1的PS 18C:CRM质量比(w/w)。在室温(23℃)下在定轨摇床上轻轻混合17小时之前，用手轻轻混合反应混合物。然后将混合物放入孵育箱(37℃)中3小时。反应后，通过0.9％氯化钠溶液将混合物稀释2倍，并通过硼氢化钠(112μL水中1.12mg；29.64μmol，50当量)还原3小时。将缀合的PS-CRM混合物转移到预洗涤的透析管(Spectrum Lab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235072，300K MWCO)并且然后用PH 7的PBS透析24小时(3次交换，每次1000ml)。将透析的溶液通过Millex-GP(0.45μm和0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到18C PS-CRM缀合物溶液。
实例30：肺炎球菌PS血清型19A与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
19A型PS的纯度：90％(蒽酮)
Mol.wt：614.44
NaIO4水溶液(5.69mg/mL)
反应程序：
将PS-19A(22.10mg，校正到90％，19.89mg，32.37μmol)粉末溶解于11.05mL水溶液(7.73mL水和3.32mL 0.2M乙酸盐缓冲液；pH＝5.5)中。向该溶液中加入304μL的NaIO4溶液(1.73mg，8.09μmol，0.25当量)。将混合物在25℃下搅拌18小时，之后，使用6次HPLC级水交换(10mL)的AMICON超离心机(30kDa MWCO 6-12mL)来纯化氧化的样品以得到氧化的PS-19A溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
在25℃下向氧化的(假定10％的氧化水平)19A型PS(17.14mg，27.9μmol，2.50mL水)溶液中加入全部的缓冲溶液(1.0mL的200mM磷酸盐缓冲液，pH＝6.01)、DMSO(0.4mL)和DBCO-PEG-4-NH2溶液(在190μL的DMSO中14.61mg；27.9μmol，10当量)。然后在25℃下将反应混合物搅拌30分钟，之后加入70.2μL的氰基硼氢化钠溶液(在313μL的水中15.6mg，55.8μmol，20当量)，并在25℃下保持搅拌2天。在加入105μL硼氢化钠水溶液(0.01mg/μL，10当量)之前，用磷酸盐缓冲液(500μL的200mM溶液，pH＝6)稀释反应混合物。搅拌30分钟后，用乙酸乙酯(3×20mL的乙酸乙酯)萃取反应混合物，并且然后将其转移到AMICON超离心机(30kDaMWCO6-12mL)，并且然后使用6次20％乙醇水溶液交换然后使用3次水交换(每次12mL)来透析以得到19A型DBCO衍生物。向该溶液(3.12mL，11.4mg)中加入蔗糖溶液(1mL水中114mg)。将合并的溶液分成两个相等的部分，并且将每个部分冻干以得到两个白色粉末样品。每个样品含有5.70mg 19A DBCO和57mg蔗糖，用于下一次缀合反应。
3.PS 19A-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 19A-DBCO：5.7mg(具有57mg蔗糖)白色粉末
％ DBCO：3.31％
CRM浓度：6.5mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.8:1
反应程序：
将叠氮基官能化的eCRM溶液(0.49mL)加入到19A DBCO衍生物(具有57mg蔗糖的5.7mg白色粉末)以提供1.8:1的PS19A:CRM质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合18小时之前，用手轻轻混合反应混合物。将缀合的PS-CRM混合物转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235060，300K MWCO)，并且然后用0.9％氯化钠溶液透析24小时(3次交换，每次800ml)。将透析的溶液通过Millex-GP(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到19A PS-CRM缀合物溶液。
实例31：肺炎球菌PS血清型19A与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
19A型PS的纯度：90％(蒽酮)
Mol.wt：614.44
NaIO4水溶液(5.45mg/mL)
反应程序：
将PS-19A(20.83mg，校正到90％，18.75mg，30.5μmol)粉末溶解于9.5mL水溶液(6.5mL水和3mL 0.2M乙酸盐缓冲液；pH＝5.5)中。向该溶液中加入305μL的NaIO4溶液(1.63mg，7.62μmol，0.25当量)。将混合物在25℃下搅拌18小时，之后，使用6次HPLC级水交换(10mL)的AMICON超离心机(30kDa MWCO 6-12mL)来纯化氧化的样品以得到氧化的PS-19A溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
在25℃下向氧化的(假定10％的氧化水平)19A型PS(17.57mg，28.59μmol，2.90mL水)溶液中加入全部的缓冲溶液(0.87mL的200mM磷酸盐缓冲液，pH＝6.01)、DMSO(0.7mL)和DBCO-PEG-4-NH2溶液(在306μL的DMSO中14.97mg；28.59μmol，10当量)。然后在25℃下将反应混合物搅拌30分钟，之后加入79μL的氰基硼氢化钠溶液(在200μL的水中9.39mg，57.2μmol，20当量)，并在25℃下保持搅拌2天。在加入110μL硼氢化钠水溶液(0.01mg/μL，10当量)之前，用磷酸盐缓冲液(500μL的200mM溶液，pH＝6)稀释反应混合物。搅拌30分钟后，用乙酸乙酯(3×20mL的乙酸乙酯)萃取反应混合物，并且然后将其转移到AMICON超离心机(30kDaMWCO6-12mL)，并且然后使用6次20％乙醇水溶液交换然后使用3次水交换(每次12mL)来透析以得到19A型DBCO衍生物。向该溶液(3.56mL，11.9mg)中加入蔗糖溶液(1mL水中120mg)。将合并的溶液分成两个相等的部分，并且将每个部分冻干以得到两个白色粉末样品。每个样品含有5.95mg 19A DBCO和60mg蔗糖，用于下一次缀合反应。
3.PS 19A-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 19A-DBCO：5.95mg(具有60mg蔗糖)白色粉末
％ DBCO：4.68％
CRM浓度：6.5mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.8:1
反应程序：
将叠氮基官能化的eCRM溶液(0.51mL)加入到19A DBCO衍生物(具有60mg蔗糖的5.95mg白色粉末)以提供1.8:1的PS19A:CRM质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合18小时之前，用手轻轻混合反应混合物。然后将混合物放入烘箱(37℃)中2小时。将缀合的PS-CRM混合物转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235071，100K MWCO)并且然后用0.9％氯化钠溶液透析24小时(3次交换，每次800ml)。将透析的溶液通过Millex-GP(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到19A PS-CRM缀合物溶液。
实例32：肺炎球菌PS血清型19F与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
19F型PS的纯度：90.7％(蒽酮)
Mol.wt：614.44
NaIO4水溶液(5.21mg/mL)
反应程序：
将PS-19F(22.0mg，35.8μmol)粉末溶解于13.75mL水溶液(11mL水和2.75mL0.2M乙酸盐缓冲液；pH＝5.5)中。向该溶液中加入117μL的NaIO4溶液(0.61mg，2.86μmol，0.08当量)。将混合物在4℃下在电冰箱中搅拌17小时，之后，使用AMICON超离心机(30kDa MWCO 6-12mL)进行6次10mM磷酸盐缓冲液pH 6.7交换(12mL)来纯化氧化的样品以得到氧化的PS-19F溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
在25℃下向氧化的(假定10％的氧化水平)19F型PS(13.7mg，22.3μmol，2.50mL水)溶液中加入全部的缓冲溶液(1.0mL的200mM磷酸盐缓冲液，pH＝6.0)、DMSO(0.483mL)和DBCO-PEG-4-NH2溶液(在117μL的DMSO中11.68mg；22.3μmol，10当量)。然后在25℃下将反应混合物搅拌30分钟，之后加入70.2μL的氰基硼氢化钠溶液(在280μL的水中2.8mg，44.6μmol，20当量)，并在25℃下保持搅拌过夜。在加入84μL硼氢化钠水溶液(0.01mg/μL，10当量)之前，用磷酸盐缓冲液(500μL的200mM溶液，pH＝6)稀释反应混合物。搅拌30分钟后，用乙酸乙酯(5×12mL的乙酸乙酯)萃取反应混合物，并且然后将其转移到AMICON超离心机(30kDaMWCO 6-12mL)，并且然后使5次20％乙醇水溶液交换然后使用3次5mM磷酸盐缓冲液pH 7.0交换(每次12mL)来透析以得到19F型DBCO衍生物。向该溶液(1.11mL，7.0mg)中加入蔗糖溶液(1mL水中70mg)。将合并的溶液分成各自为4mg和3mg的两个部分，并且冻干以得到两个白色粉末样品。这些冻干的19F DBCO样品用于下一次缀合反应。
3.PS 19F-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 19F-DBCO：4.0mg(具有40mg蔗糖)白色粉末
％ DBCO：5.14％
CRM浓度：5.0mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.6:1
反应程序：
将叠氮基官能化的eCRM溶液(0.5mL)加入到19F DBCO衍生物(具有40mg蔗糖的4.0mg白色粉末)以提供1.6:1的PS19F:CRM质量比(w/w)。用手轻轻混合反应混合物，然后在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合18小时，然后在37℃下混合1小时。添加42μL叠氮化钠(0.42mg，1当量)。30分钟之后，将缀合的PS-CRM混合物转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060，300K MWCO)并且然后用0.9％氯化钠溶液透析2天(8次交换，每次800ml)。将透析的溶液通过Millex-GP(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到19F PS-CRM缀合物溶液。
实例33：肺炎球菌PS血清型19F与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
19F型PS Mol wt：613
NaIO4水溶液(10mg/mL)
反应程序：
将PS-19F(10mg，16.31μmol)粉末溶解于2mL水溶液(10mM乙酸钠溶液，PH4.5)中。向该溶液中加入34.9μL NaIO4溶液(0.349μg，1.63μmol，0.1当量)。将混合物在4℃下搅拌18小时，然后将氧化的样品转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235057，20K MWCO)并且然后用50mm的PB缓冲液，PH 6.8透析24小时(4次交换，每次600ml)以得到氧化的PS-19F溶液。透析后，加入DMSO，以在具有50mm、PH 6.8的PB缓冲液的10％DMSO中制备PS-19F。
2.DBCO衍生化
PS的最终浓度：3.32mg/ml，
缓冲液的最终浓度在50mM PB中的10％DMSO(pH 6.8)
反应程序：
在25℃下向氧化的19F型PS(8.3mg，13.53μmol，10％DMSO中2.5mL，50mM PB，PH6.8)的溶液中加入DBCO-PEG4-NH2溶液(70.84μL DMSO中7.08mg；13.53μmol，10当量)。然后在25℃下将反应混合物搅拌60分钟，之后加入氰基硼氢化钠溶液(在85μL水中0.85mg；13.53μmol，10当量)，并在25℃下保持搅拌24小时。然后将反应混合物转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235057，20K MWCO)并且然后使用4次50mMPB缓冲液中的20％乙醇交换然后使用3次50mM PB缓冲液交换来透析以得到19F型DBCO衍生物。
3.PS 19F-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 19F-DBCO：6mg(具有60mg蔗糖)白色粉末
DBCO：7％
CRM浓度：2.617mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：2:1
PS的最终浓度：5.2mg/ml
反应程序：
将叠氮基官能化的eCRM溶液(1.15mL)加入到19F DBCO衍生物(具有60mg蔗糖的6mg白色粉末，9.7μmol)中以提供2:1的PS19F:CRM质量比(w/w)。在室温(23℃)下在定轨摇床上轻轻混合17小时之前，用手轻轻混合反应混合物。然后将混合物放入孵育箱(37℃)中3小时。反应后，通过0.9％氯化钠溶液将混合物稀释2倍，并通过硼氢化钠(在184.9μL水中1.849mg；48.9μmol，50当量)还原3小时。将缀合的PS-CRM混合物转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235071，100K MWCO)并且然后用PH 7的PBS透析24小时(3次交换，每次1000ml)。将透析的溶液通过Millex-GP(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到19F PS-CRM缀合物溶液。
实例34：肺炎球菌PS血清型20与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
20型PS的纯度：68％(蒽酮)
Mol.wt：1157.9g mol-1
反应程序：
用搅拌棒将20型PS(30.1mg，26μmol)粉末溶解于50mL聚苯乙烯样品管中的15.00mL水溶液(11.25mL水和3.75mL 0.2M乙酸盐缓冲液，pH 5.5)中。一旦PS溶解，加入160μL NaIO4溶液(1.11mg，5.2μmol，0.20摩尔当量)。将反应管包裹在箔中并置于25℃的水浴中。将混合物在25℃下搅拌。18小时后，使用三个超-15离心过滤装置(30kDaMWCO；15mL)通过5次HPLC级水交换(每次15mL)来透析反应混合物以得到氧化的PS-20溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
将PS20-OX(11.7mg，10.1μmol，1.61mL)加入到磷酸盐缓冲液(0.600mL，200mM，pH6.0)中，向其中加入DBCO-PEG4-NH2(1.0当量，DMSO中523g mol-1，33mg/mL，160μL)和附加量的DMSO(207μL)。在加入氰基硼氢化钠溶液(2当量，52.5mg/mL，24μL)之前，将反应混合物在25℃下搅拌25分钟并且搅拌一天。用1当量硼氢化钠溶液封盖后，将反应混合物用乙酸乙酯(3×20mL)萃取并鼓泡为不含溶剂。通过离心透析单元(Amicon 30kDa MWCO)使用5次20％乙醇水溶液交换然后每次使用3次水交换(每次12mL)纯化DBCO衍生物以得到20-DBCO衍生物。向该溶液(2.09mL，13.65mg)中加入蔗糖溶液(1.37mL水中136.5mg)。将合并的溶液分成两个相等的部分，并且将每个部分冻干以得到三个白色粉末样品。每个样品含有6.0mg 20-DBCO和60mg蔗糖，用于下一次缀合反应。
3.PS 20-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 20-DBCO：5.0mg(具有50mg蔗糖)冻干粉末
％ DBCO：2.0％
CRM浓度：5.29mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.5:1
反应程序：
将20-DBCO溶解于0.9％氯化钠溶液(2.684mL，0.22μm过滤的)、磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.5M，0.160mL)和DMSO(0.400mL)中。逐滴加入叠氮基-CRM溶液(5.29mg/mL，0.756mL)以提供1.5:1的PS20:CRM输入比率(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合36小时之前，用手轻轻混合溶液。通过加入叠氮化钠溶液(10mg/mL，50μL)将点击反应淬灭。将CRM缀合物转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，300K MWCO)，并且然后用0.9％氯化钠溶液透析48小时(4次交换，每次1L)。将透析的溶液通过Millex-GP注射器过滤器(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到无菌20-CRM缀合物溶液。
实例35：肺炎球菌PS血清型22F与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
22F型PS的纯度：89％(蒽酮)
Mol.wt：996.88
NaIO4水溶液(5mg/mL)
反应程序：
将22F型PS(30.2mg，30.3μmol)粉末溶解于10.5mL水和4.5mL的200mM乙酸盐缓冲液(pH 5.26)和132μL的NaIO4溶液(0.65mg，3.03μmol，0.1当量)中。将混合物在25℃下搅拌18小时，之后，使用6次HPLC级水交换(12mL)的AMICON超离心机(100kDa MWCO 6-12mL)来纯化氧化的样品以得到氧化的PS-22F溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
在25℃下向氧化的(假定10％的氧化水平)22F型PS(7.0mg，7.02μmol，0.956mL水)溶液中加入全部的缓冲溶液(0.525mL的200mM磷酸盐缓冲液，pH＝6.0)、DMSO(151μL)和DBCO-PEG-4-NH2溶液(在112μL的DMSO中3.67mg；7.02μmol，10当量)。然后在25℃下将反应混合物搅拌30分钟，之后加入17μL的氰基硼氢化钠溶液(17μL的水中0.88mg；14.06μmol，20当量)，并在25℃下保持搅拌2天。在加入9μL硼氢化钠水溶液(31mg/mL，10当量)之前，用磷酸盐缓冲液(250μL的200mM溶液，pH＝6)稀释反应混合物。30分钟后，用乙酸乙酯(4×5mL)萃取反应混合物。将萃取物转移到AMICON超离心过滤器(100kDa MWCO 6-12mL)并且然后使用6次20％乙醇水溶液交换(每次12mL)然后使用3次水交换(每次12mL)进行透析。SEC-HPLC显示出游离DBCO，因此使用3次20％乙醇水溶液交换(每次12mL)然后使用3次水交换(每次12mL)进行再透析以得到22F型DBCO衍生物。向该溶液(2.35mL，5.2mg)中加入蔗糖溶液(0.520mL水中52mg)。将合并的溶液分成两个部分，并且将每个部分冻干以得到两个白色粉末样品。样品分别含有的2.4mg和2.8mg的22F DBCO和24mg和28mg的蔗糖，用于下一次缀合反应。
3.PS 22F-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 22F-DBCO：2.4mg(具有24mg的蔗糖)白色粉末
％ DBCO：1.24％
CRM浓度：4mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.4:1
反应程序：
将22F DBCO衍生物(具有24mg蔗糖的2.4mg白色粉末)溶解于0.9％的氯化钠溶液(0.075mL)中。加入叠氮基官能化的eCRM溶液(0.142mL溶液)以提供1.4:1的PS22F:CRM质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合48小时之前，轻轻混合反应混合物。加入叠氮化钠溶液(16μL，10mg/mL水溶液)。30分钟之后，将缀合的PS-CRM混合物转移到预洗涤的透析管装置(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235060，300K MWCO)，并且然后用0.9％氯化钠溶液透析24小时(5次交换，每次800ml)。将透析的溶液通过Millex-GP(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到22F PS-CRM缀合物溶液。
实例36：肺炎球菌PS血清型23F与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
23F型PS的纯度：85％(蒽酮)
Mol.wt：792.62
NaIO4水溶液(5.86mg/mL)
反应程序：
将PS-23F(20.21mg，校正到85％，17.18mg，26.7μmol)粉末溶解于10mL水溶液(7.5mL水和2.5mL的0.2M乙酸盐缓冲液；pH＝5.5)中。向该溶液中加入119μL的NaIO4溶液(0.695mg，4.0μmol，0.15当量)。将混合物在25℃下搅拌4小时。之后，使用6次HPLC级水交换(12mL)的AMICON超离心过滤器(30kDa MWCO 6-12mL)来纯化氧化的样品以得到氧化的PS-23F溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
在25℃下向氧化的(假定10％的氧化水平)23F型PS(13.51mg，17.0μmol，2.14mL水)溶液中加入全部的缓冲溶液(0.85mL的200mM磷酸盐缓冲液，pH＝6.01)、DMSO(310μL)和DBCO-PEG-4-NH2溶液(在170μL的DMSO中8.93mg；17.0μmol，10当量)。然后在25℃下将反应混合物搅拌30分钟，之后加入42μL的氰基硼氢化钠溶液(120μL的水中6.1mg；34.0μmol，20当量)，并在25℃下保持搅拌2天。用乙酸乙酯(3×20mL的乙酸乙酯)萃取反应混合物，并且然后将其转移到AMICON超离心过滤器(30kDa MWCO 6-12mL)，并且然后使用6次20％乙醇水溶液(每次12ml)交换然后使用3次水交换(每次12mL)来透析以得到23F型DBCO衍生物。向该溶液(7.58mL，13.8mg)中加入蔗糖溶液(1mL水中138mg)。将合并的溶液分成两个相等的部分，并且将每个部分冻干以得到三个白色粉末样品。每个样品含有6.9mg的23F DBCO和69mg的蔗糖，用于下一次缀合反应。
3.PS 23F-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 23F-DBCO：具有69mg蔗糖的6.90mg白色粉末
％ DBCO：5.1％
CRM浓度：2.617mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：2:1
反应程序：
将叠氮基官能化的eCRM溶液(1.32mL溶液)加入到23F DBCO衍生物(具有69mg蔗糖的6.90mg白色粉末)以提供2:1的PS23F:CRM质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合17小时之前，用手轻轻混合反应混合物。然后将混合物放入烘箱(37℃)中3小时。将缀合的PS-CRM混合物转移到预洗涤的透析过滤器(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，Cat.No.G235071，100K MWCO)并且然后用0.9％氯化钠溶液透析24小时(3次交换，每次800ml)。将透析的溶液通过Millex-HV过滤器(0.45μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到23F PS-CRM缀合物溶液。
实例37：肺炎球菌PS血清型33F与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
33F型PS的纯度：75％(蒽酮)
Mol.wt：973
反应程序：
用搅拌棒将33F型PS(34.0mg，35.0μmol)粉末溶解于50mL聚苯乙烯样品管中的17.0mL水溶液(12.0mL水和5.0mL的0.2M乙酸盐缓冲液，pH 5.5)中。一旦PS溶解，加入59μL的NaIO4溶液(1.49mg，7.0μmol，0.20摩尔当量)。将反应管包裹在箔中并置于4℃的水浴中。将混合物在4℃下搅拌。18小时后，使用三个超-15离心过滤装置(100kDa MWCO；15mL)通过4次HPLC级水交换(每次15mL)来透析反应混合物以得到氧化的PS-33F溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
向氧化的33F型PS溶液(11.2mg，11.51μmol，2.49mL)中加入缓冲溶液(0.114mL的0.5M磷酸盐缓冲液，pH 6.0)、DBCO-PEG4-NH2溶液(200μL DMSO中6.039mg；6.33μmol，0.55当量)。然后在25℃下将反应混合物搅拌30分钟，之后加入63μL的氰基硼氢化钠溶液(100μL的水中4.5mg；34.54μmol，2.0当量)。将反应混合物包裹在铝箔中并在设定为25℃的水浴中保持搅拌2天。第二天通过加入44μL的硼氢化钠溶液(312μL水中3.12mg；11.51μmol，1.0当量)使反应停止。搅拌30分钟后，将反应混合物用二氯甲烷(3×10mL)然后通过乙酸乙酯(3×10mL)萃取。将萃取物用N2鼓泡20分钟以去除残留的乙酸乙酯，并且然后转移到2个超-15离心过滤装置(100kDa MWCO；15mL)。通过执行三次3％DMSO溶液交换(每次15mL)，六次20％乙醇溶液交换(每次15mL)以及三次HPLC级水交换(每次15mL)来进行透析以得到33F DBCO衍生物。向该溶液(1.23mL，4.0mg)加入蔗糖溶液(40mg 0.4mL水)。将该合并的溶液冻干以得到细白色粉末。将PS33F DB样品在4℃下储存，直到缀合反应需要。
3.PS 33F-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 33F-DBCO：4mg(具有40mg的蔗糖)白色粉末
％ DBCO：3.0％
CRM浓度：6.009mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.5:1
反应程序：
将33F-DBCO衍生物(具有40mg蔗糖的4.0mg白色粉末)溶解于0.9％氯化钠溶液(5.32mL)、磷酸盐缓冲液pH 7(0.267mL，0.5M)和DMSO(0.667mL)中。加入叠氮基官能化的eCRM溶液(0.445mL溶液)以提供1.5:1的PS33F:CRM质量比(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合反应混合物19小时。通过加入叠氮化钠溶液(10mg/mL，50μL)将点击反应淬灭。然后将反应混合物用0.9％氯化钠溶液(7.0mL)稀释，并转移到预洗涤的透析装置(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060，300K MWCO)。样品在0.9％氯化钠溶液中经历48小时透析(8次交换，每次800ml)。将透析的溶液通过Millex-GP(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到33F PS-CRM缀合物溶液。
实例38：肺炎球菌PS血清型7F与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
7F型PS的纯度：86％(蒽酮，CRB-21-20)
Mol.wt：1227g mol-1
反应程序：
将天然多糖(19.5mg，校正到86％，16.8mg，13.7μmol)溶解于3.9mL水中。向该溶液中加入4.58mL水和0.293mL乙酸钠缓冲液(1.5M，pH 5.4)。然后将30μl高碘酸钠溶液(300μg，1.4μmol，0.1当量)加入到搅拌溶液中。将反应在22℃下搅拌3小时。然后使用旋转浓缩器(Amicon 30k Da MWCO)将氧化的PS浓缩两倍。然后使用凝胶过滤柱(通用电器医疗集团(GEHealthcare)PD-10，旋转方法)将浓缩的PS缓冲交换到水中。
2.DBCO衍生化
反应程序：
向7F-OX(4.0mg/mL的1.9mL，7.6mg，6.2μmol)中加入0.15mL磷酸钠(1M，pH 6.3)。然后将0.23mL DBCO-PEG4-NH2(在DMSO中27.1mM，批次1730；6.2μmol，1.0当量)加入到搅拌溶液中。搅拌5分钟后，向搅拌的溶液中加入0.039mL NaCNBH3(20mg/mL水溶液；12.4μmol，2.0当量)。将反应在22℃下搅拌40小时。然后向所述溶液中加入0.024mL硼氢化钠(10mg/mL水溶液，6.3μmol，1.0当量)。搅拌15分钟后，通过凝胶过滤柱(Thermo Zeba柱，40kDa MWCO)缓冲交换到水中来纯化PS。
3.PS 7F-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 7F-DBCO：2.8mg(2.8mg/mL水溶液)
％ DBCO：4.8％
CRM浓度：4.7mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.6:1
反应程序：
向5mL离心管中的7F-DBCO(1mL的2.8mg/mL水溶液)中加入0.128mL磷酸钾(0.5M，pH 7.5)。然后向该溶液中加入0.372mL叠氮化物官能化的eCRM(20mM磷酸钾中4.7mg/mL，pH7.1，7.5％蔗糖)，从而得到输入质量比1.6:1(w/w)。将溶液置于轨道摇杆上并在22℃下摇动(使得溶液从管的端部移动到端部)16小时。然后使用300kDa透析膜(SpectrumLabFloat-A-Lyzer G2，1mL)将缀合物透析到0.9％氯化钠中，持续48小时，在1小时和4小时后更换透析液(500mL)。将透析的溶液通过注射器过滤器(Pall Acrodisc Supor，0.22μm，13mm直径)过滤，以得到7F-CRM缀合物溶液。
实例39：肺炎球菌PS血清型1与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
1型PS的纯度：80％(糖醛酸测定)
Mol.wt：625g mol-1
反应程序：
将天然多糖(20.2mg，32.32μmol)溶解于9.5mL水溶液(7.0mL水和2.5mL乙酸盐缓冲液，200mM，pH 5.24)中。向该溶液中加入492μL高碘酸钠溶液(3.45μg，16.16μmol，0.5当量)。将混合物在25℃下搅拌18小时。使用利用6次水交换进行的Amicon离心30kDa MWCO透析来纯化氧化的PS以得到纯化的PS-1溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
向氧化的(假定10％的氧化水平)1型PS(16mg，25.6μmol，2.4mL水)溶液中加入缓冲溶液(0.424mL 500mM磷酸盐缓冲液，pH＝6.74)，DMSO(572μL)和DBCO-PEG4-NH2溶液(134μL DMSO中13.4mg；25.6μmol，10当量)。然后在25℃下将反应混合物搅拌30分钟，之后加入32μL氰基硼氢化钠溶液(32μL水中3.2mg；51.2μmol，20当量)并在25℃下保持搅拌3天。加入缓冲溶液(0.300mL 200mM磷酸盐缓冲液，pH＝6.0)，接着加入硼氢化钠(100μL中0.97mg，25.6μmol，10当量)，并在25℃下搅拌30分钟。用二氯甲烷(4×5mL)萃取反应混合物。将含水提取物转移到两个AMICON超离心过滤器(30kDa MWCO 6-12mL)并且然后使用5次20％乙醇水溶液交换(每次12mL)然后使用3次3％DMSO水溶液交换(每次12mL)、3次与0.9％氯化钠交换和3次水交换来进行透析以得到1型DBCO衍生物。向该溶液(1.37mL，10.0mg)中加入蔗糖溶液(1mL水中100mg)。将合并的溶液分成两个相等的部分，并且将每个部分冻干以得到两个白色粉末样品。每个样品含有5.0mg 1-DBCO和50mg蔗糖，用于下一次缀合反应。
3.PS 1-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 1-DBCO：5.0mg(具有50mg蔗糖)冻干粉末
％ DBCO：2.5％
CRM浓度：4.86mg/mL溶液
PS:CRM(输入比率)：1.7:1
反应程序：
将冻干的1型DBCO粉末(5mg)溶解于经过过滤的0.9％氯化钠溶液(5.39mL)和磷酸盐缓冲液(250μL，0.5M，pH 7.0)中。然后加入叠氮基官能化的eCRM溶液(0.47mL)以提供1.7:1的PS-1:CRM输入质量比率(w/w)。在室温(20℃)下在定轨摇床上轻轻混合18小时之前，用手轻轻混合溶液。通过加入叠氮化钠溶液(10mg/mL，52μL)将点击反应淬灭。将CRM缀合物转移到预洗涤的透析管(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2，300K MWCO，10mL)，并且然后用0.9％氯化钠溶液透析48小时(8次交换，每次800ml)。将透析的溶液通过Millex-GP注射器过滤器(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到1-CRM缀合物溶液。
实例40：肺炎球菌PS血清型10A与来自表2的eCRM的缀合物的制备
1.氧化
PS血清型10A批号：63662302(ATCC)
纯度PS 10A：77％(蒽酮)
Mol.wt：1013kDa(重复单元＝1227g/mol)
反应程序：
用搅拌棒将10A型PS(25.99mg，21.18μmol)粉末溶解于50mL聚苯乙烯样品管中的12.995mL水溶液(9.746mL水和3.249mL 0.2M乙酸盐缓冲液，pH 5.5)中。一旦PS溶解，加入135μL NaIO4溶液(0.27mg，1.26μmol，0.06摩尔当量)。将反应管包裹在箔中并置于冰箱中在4℃下搅拌。45分钟后，使用三个超-15离心过滤装置(30kDa MWCO；15mL)通过与6次HPLC级水交换(每次15mL)来透析反应混合物以得到氧化的PS-10A溶液。
2.DBCO衍生化
反应程序：
向氧化的10A型PS溶液(18.15mg，14.79μmol，3.371mL)中加入缓冲溶液(0.259mL0.5M磷酸盐缓冲液，pH 6.0)、DMSO(0.145mL)和DBCO-PEG4-NH2溶液(154μL DMSO中7.7mg；14.79μmol，1摩尔当量)。然后在4℃下将反应混合物搅拌30分钟，之后加入101μL的氰基硼氢化钠溶液(101μL的水中1.9mg；2摩尔当量)。将反应混合物包裹在铝箔中并在4℃下在冰箱中保持搅拌2天。第二天通过加入85μL硼氢化钠溶液(0.56mg；14.79μmol，1摩尔当量)使反应停止。搅拌30分钟后，将反应混合物用二氯甲烷(3×15mL)萃取。将萃取物用N2鼓泡15分钟以去除残留的二氯甲烷，并且然后转移到一个超-15离心过滤装置(30kDaMWCO；15mL)。通过执行三次3％DMSO溶液交换(每次15mL)、三次20％乙醇溶液交换(每次15mL)、两次0.9％氯化钠溶液交换以及两次HPLC级水交换(每次15mL)来进行透析以得到10A DBCO衍生物。向该溶液(3.371mL，15.06mg)中加入蔗糖溶液(1.506mL水中150.6mg)。将该合并的溶液分成三个相等的部分，并且将每个部分冻干以得到细白色粉末。冻干后，将所有部分在4℃下储存，直到缀合反应需要。
3.PS 10A-DBCO衍生物与eCRM的缀合
PS 10A-DBCO：5.20mg(具有52.0mg蔗糖)冻干粉末
％ DBCO：2.1％
CRM：20mM组氨酸中4.962mg/mL，pH 7.1(7.5％蔗糖)
PS:CRM(输入质量比率)：1.25:1
反应程序：
将10A DBCO衍生物(具有52.0mg蔗糖的5.2mg白色粉末)溶解于0.9％氯化钠溶液(1.502mL)、磷酸盐缓冲液pH 7(0.104mL，0.5M)和DMSO(0.156mL)中。然后加入叠氮基官能化的eCRM溶液(0.838mL溶液)以提供1.25:1的PS10A:CRM质量比率(w/w)。将浓度为2.0mg/mL PS的反应混合物，在室温(22℃)下在定轨摇床上轻轻混合2小时。然后将反应混合物稀释到1.0mg/mL并在22℃下另外搅拌20小时。加入叠氮化钠(7.5mg，115μmol)来终止缀合反应。然后将反应混合物用0.9％氯化钠溶液稀释到最终体积7mL，并转移到预洗涤的透析装置(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060，300K MWCO)。样品在0.9％氯化钠溶液中经历48小时透析(2次交换，每次1L；1次交换，每次4L)。将透析的溶液通过Millex-GP(0.22μm，33mm聚醚砜)过滤，以得到10A PS-CRM缀合物溶液。
实例41：对DBCO-PEG4-胺和DBCO-胺并入肺炎球菌多糖中的评估
像上文所述那样氧化各种肺炎球菌多糖，并使其在相同条件下与DBCO-PEG4-胺(DBCO或DB)或DBCO-胺(DBCA或DA)反应，以确定连接子对并入效率的影响。下表显示，在所测试的血清型中除了一种血清型外的所有血清型中，与每100个多糖重复单元的DBCO-PEG4-胺相比，DBCO-胺以更高的效率并入。
实例42：比较DBCO-PEG4-胺和DBCO-胺与eCRM的缀合
连接到DBCO-PEG4-胺(DB)或DBCO-胺(DA)的肺炎球菌多糖在相同的反应条件下沿着上述实例的线与来自表2的相同eCRM缀合，以评估连接子对缀合效率的影响。下表显示，与连接到DBCO-胺的多糖形成的缀合物通常导致较少的游离多糖和较大的缀合物大小。
实例43：肺炎球菌PS血清型-eCRM缀合物的免疫原性
进行实验以确定在给予根据本公开产生的各种单价肺炎球菌多糖-eCRM缀合物后小鼠或兔中的总IgG和功能性OPA抗体应答。使用调理吞噬活性(OPA)测定来测量对各种肺炎链球菌血清型具有特异性的鼠血清中的功能性抗体。OPA测量基于Moon H.Nahm和RobertL.Burton,“针对B组链球菌的抗体的调理吞噬杀伤测定方案(UAB GBS OPA)(Protocol foropsonophagocytic killing assay for antibodies against Group B Streptococcus(UAB GBS OPA)”,版本B.04,2016年3月(原始版本A.01于2011年9月发布)(www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-GBS-OPA.pdf)和“针对肺炎链球菌的抗体的多重调理吞噬细胞杀伤测定(UAB-MOPA)的方案(Protocol for multiplexedopsonophagocytic killing assay(UAB-MOPA)for antibodies against Streptococcuspneumoniae)”,版本E.02,2014年12月(www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf)。图3示出了在小鼠中给予单价肺炎球菌多糖-eCRM缀合物后的调理吞噬(OPA)活性。还根据Yu等人,“用于肺炎链球菌的自动化和多重血清分型测定的发展(Developmentof an Automated and Multiplexed Serotyping Assay for Streptococcuspneumoniae)”，《临床与疫苗免疫学(Clin Vaccine Immunol.)》2011,18(11):1900-7中描述的方法测量对每种肺炎球菌多糖具有特异性的总多糖结合抗体(IgG)。图4示出了在小鼠中给予单价肺炎球菌多糖-eCRM缀合物后的IgG应答。
如下表中所总结的，所测试的每种缀合物在小鼠或兔中引发了IgG和功能性抗体应答，所述应答与图3和图4中所显示的OPA和IgG结果相当或比所述应答更优。
使用CRM197衍生物SEQ ID NO:9作为每种缀合物中的载剂来制备24种肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F中的每一种血清型的缀合物的组合。在7只兔子的组中使用3剂量时间表测试此组合物的免疫原性。还将其与经过缀合的13价PrevnarTM疫苗和未缀合的23价PneumovaxTM疫苗进行比较，已经向其中加入了未缀合的血清型6A多糖以辅助比较。这三种组合物具有相当的每血清型多糖剂量(除了6B之外，其中PrevnarTM包含双剂量)，其涉及稀释PrevnarTM和PneumovaxTM。所有三种组合物包含每剂量60μg磷酸铝佐剂，其涉及将佐剂加入到PneumovaxTM中。
相比所批准的Prevnar-13TM疫苗，本文所公开的缀合技术产生CRM197载剂的量较小的组合物，同时还包含来自11种附加血清型的荚膜多糖。经过缀合的24价组合物中荚膜多糖与CRM197的总体重量比约为13价PrevnarTM中所看到的重量比的两倍。
在图5(IgG应答)和图6(OPA应答)中示出了第三剂量后的应答。如所预期的，使用两种缀合疫苗得到的应答远远大于使用未缀合的疫苗得到的应答。此外，使用24价疫苗得到的IgG和OPA应答与在批准的疫苗所涵盖的血清型中使用Prevnar-13TM得到的应答相当，但另外优于未包含在Prevnar-13中的11种血清型。令人惊讶的是，没有证据显示载剂诱导的表位抑制。
实例44：用于牙周炎的缀合物疫苗的制备
通过如下将来自牙龈卟啉单胞菌血清型K1、K2、K3、K4、K5和/或K6的荚膜多糖(CPS)与eCRM载体蛋白缀合来制备针对牙龈卟啉单胞菌的疫苗。
通过任何适合的方法生长和处理牙龈卟啉单胞菌。参见例如，Huang等人，《分子口腔微生物学(Mol Oral Microbiol)》30:438-50(2015)。通过任何精选的方法纯化CPS。参见，例如，Gonzalez等人,《感染免疫学(Infect.Immun)》71:2283-2287(2003)；Schifferle等人,《免疫学杂志(J.Immunol),143:3035–3042(1989)；Pantosti等人,《感染免疫学》59:2075–2082(1991)。简而言之，通过离心收集牙龈卟啉单胞菌，用盐水冲洗，悬浮在水中并进行热苯酚-水萃取。收集水相，用乙醚萃取并针对无菌过滤水进行透析。将含水物质调节到pH 5.5并用由DNase I和RNase A(西格玛公司(Sigma))组成的核酸酶混合物消化过夜。将pH调节到中性，并将蛋白酶K(1mg/ml；西格玛公司)加入到样品中并在37℃下轻轻振荡温育过夜。然后进行第二次蛋白酶K消化，并使用10,000分子量筛截膜浓缩所得碳水化合物。将CPS用冷乙醇沉淀，悬浮在脱氧胆酸盐缓冲液中并使用S-400凝胶过滤柱(法玛西亚(Pharmacia)，乌普萨拉，瑞典)分离。汇集含有高分子量CPS(通过SEC-MALS)的部分，并丢弃含有LPS的部分。将汇集的部分浓缩、沉淀、透析并冻干。
在剧烈搅拌下，向经过缓冲的多糖溶液中加入X摩尔当量(针对多糖重复单元；X通过筛选测定)的1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP；来自100mg/mL乙腈溶液)。加入CDAP后五分钟，加入0.5摩尔当量的二苯并环辛炔-胺连接子(来自DMSO储备溶液)。在另外一小时后，加入甘氨酸以淬火任何未反应的氰酸酯。可替代地，可以使用高碘酸盐或TEMPO/NCS化学物质来使CPS改性。然后通过透析或UF/DF来纯化衍生化的多糖。使用蒽酮比色测定来测量多糖浓度，并使用309nm的吸光度来测量二苯并环辛炔浓度。可以组合这两个值以得到用二苄基环辛炔官能团衍生的多糖的百分比的估计值。
通过将衍生的多糖与精选eCRM蛋白质，如表2中的eCRM蛋白质，混合来制备缀合物。温育18小时后，添加一摩尔当量的叠氮化钠以淬火任何未反应的二苯并环辛炔官能团。然后通过透析或UF/DF纯化缀合物以去除未反应的eCRM蛋白质。然后分析缀合物以确定多糖浓度(比色)、蛋白质浓度(比色)并计算游离/未缀合的糖百分比。使用SEC-MALS测量分子量。
多糖：通过加入1％脱氧胆酸盐溶液(pH 6.8)来沉淀蛋白质缀合物并在冰上孵育30分钟。孵育后，加入1M HCl，并将混合物以10,000rpm离心20分钟。剩余的上清液含有未缀合的多糖。为了测定多糖浓度，将溶解于硫酸中的蒽酮加入到样品中并加热到95℃，持续10分钟。冷却混合物并测量620nm处的吸光度。使用多糖的单糖组分的标准曲线来计算浓度。
本文所描述的实施例仅通过举例提供，并且在实践本文所描述的实施例时不排除实施例的各种替代方案。
序列表
<110> SUTROVAX公司
<120> 具有非天然氨基酸的多肽-抗原缀合物
<130> 3369-02-WO01
<140> PCT/US2017/069129
<141> 2017-12-29
<150> US 62/441,115
<151> 2016-12-30
<150> US 62/530,795
<151> 2017-07-10
<150> US 62/530,803
<151> 2017-07-10
<150> US 62/568,201
<151> 2017-10-04
<150> US 62/591,160
<151> 2017-11-27
<160> 10
<170> SeqWin2010，版本1.0
<210> 1
<211> 536
<212> PRT
<213> 白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）
<400> 1
Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu
1 5 10 15
Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile
20 25 30
Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp
35 40 45
Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala
50 55 60
Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly
65 70 75 80
Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys
85 90 95
Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr
100 105 110
Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe
115 120 125
Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly
130 135 140
Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu
145 150 155 160
Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln
165 170 175
Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val
180 185 190
Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp
195 200 205
Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His
210 215 220
Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser
225 230 235 240
Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu
245 250 255
Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro
260 265 270
Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln
275 280 285
Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala
290 295 300
Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly
305 310 315 320
Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu
325 330 335
Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val
340 345 350
Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu
355 360 365
Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly
370 375 380
His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn
385 390 395 400
Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly
405 410 415
His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly
420 425 430
Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys
435 440 445
Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala
450 455 460
Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val
465 470 475 480
Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser
485 490 495
Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val
500 505 510
Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu
515 520 525
Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
530 535
<210> 2
<211> 1611
<212> DNA
<213> 白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）
<400> 2
atgggcgcag acgatgttgt ggactcaagt aaatcatttg tcatggaaaa cttctcctca 60
tatcacggca cgaaaccggg ctacgttgat agcattcaga aaggtatcca aaaaccgaaa 120
tctggcacgc agggtaacta cgatgacgat tggaaagaat tctacagcac cgacaacaaa 180
tatgatgcgg ccggttactc agtcgacaac gaaaatccgc tgtcgggcaa agccggcggt 240
gtggttaaag tgacgtatcc gggcctgacc aaagtcctgg ccctgaaagt ggataatgca 300
gaaaccatca aaaaagaact gggtctgagc ctgacggaac cgctgatgga acaggttggc 360
accgaagaat ttatcaaacg cttcggcgat ggtgccagtc gtgtcgtgct gtccctgccg 420
ttcgcagaag gtagctctag tgtggaatat attaacaatt gggaacaagc gaaagccctg 480
tccgttgaac tggaaatcaa ctttgaaacc cgcggcaaac gtggtcagga tgcgatgtat 540
gaatacatgg cacaagcttg cgcgggtaat cgcgttcgtc gcagcgtcgg ctcctcactg 600
tcttgtatca acctggactg ggatgttatc cgtgataaaa ccaaaacgaa aatcgaaagt 660
ctgaaagaac atggcccgat caaaaacaaa atgagcgaat ctccgaataa aacggtgtcc 720
gaagaaaaag ctaaacagta tctggaagaa ttccaccaaa ccgcactgga acatccggaa 780
ctgtcagaac tgaaaaccgt gacgggtacc aacccggttt ttgccggcgc aaattacgca 840
gcttgggctg tgaacgttgc gcaagtgatt gactcggaaa cggccgataa tctggaaaaa 900
accacggcgg ccctgagtat tctgccgggc atcggttccg ttatgggtat tgccgacggc 960
gcagtccatc acaacaccga agaaattgtg gcccagtcta tcgcactgtc gagcctgatg 1020
gttgctcaag cgattccgct ggttggcgaa ctggttgata tcggctttgc agcttacaac 1080
ttcgtggaaa gtattatcaa cctgtttcag gttgtccaca actcatataa tcgcccggcc 1140
tactcgccgg gtcacaaaac ccaaccgttc ctgcatgacg gctacgcggt tagctggaat 1200
acggtcgaag attctattat ccgtaccggc tttcagggtg aatctggcca cgacattaaa 1260
atcacggctg aaaacacccc gctgccgatt gcaggtgttc tgctgccgac gatcccgggt 1320
aaactggatg ttaacaaatc aaaaacccat atctcggtca acggtcgcaa aattcgtatg 1380
cgctgccgtg cgatcgacgg cgatgtgacc ttctgtcgtc cgaaaagccc ggtctatgtg 1440
ggcaacggtg tccatgctaa tctgcacgtg gcgtttcatc gctctagttc cgaaaaaatc 1500
catagtaacg aaatctcatc ggattccatt ggtgtgctgg gctaccagaa aaccgtggac 1560
cataccaaag tgaatagcaa actgagcctg ttcttcgaaa tcaaatcgta a 1611
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 破伤风梭菌（Clostridium tetani）
<400> 3
Ile Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro
1 5 10 15
Ala Leu Asn Ile
20
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 破伤风梭菌（Clostridium tetani）
<400> 4
Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala
1 5 10 15
Ser His Leu Glu
20
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 链球菌G148（Streptococcus G148）
<400> 5
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu
1 5 10 15
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 链球菌G148（Streptococcus G148）
<400> 6
Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr
1 5 10 15
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 链球菌G148（Streptococcus G148）
<400> 7
Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu
1 5 10 15
<210> 8
<211> 346
<212> PRT
<213> 流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）
<400> 8
Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys Ser Asp
1 5 10 15
Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro Glu His
20 25 30
Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp Tyr Leu
35 40 45
Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val Ile His
50 55 60
Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe Pro His
65 70 75 80
Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr Leu Lys
85 90 95
Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Lys Asp Gly
100 105 110
Lys Gln Ala Gln Val Tyr Pro Asn Arg Phe Pro Leu Trp Lys Ser His
115 120 125
Phe Arg Ile His Thr Phe Glu Asp Glu Ile Glu Phe Ile Gln Gly Leu
130 135 140
Glu Lys Ser Thr Gly Lys Lys Val Gly Ile Tyr Pro Glu Ile Lys Ala
145 150 155 160
Pro Trp Phe His His Gln Asn Gly Lys Asp Ile Ala Ala Glu Thr Leu
165 170 175
Lys Val Leu Lys Lys Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Thr Asp Met Val Tyr
180 185 190
Leu Gln Thr Phe Asp Phe Asn Glu Leu Lys Arg Ile Lys Thr Glu Leu
195 200 205
Leu Pro Gln Met Gly Met Asp Leu Lys Leu Val Gln Leu Ile Ala Tyr
210 215 220
Thr Asp Trp Lys Glu Thr Gln Glu Lys Asp Pro Lys Gly Tyr Trp Val
225 230 235 240
Asn Tyr Asn Tyr Asp Trp Met Phe Lys Pro Gly Ala Met Ala Glu Val
245 250 255
Val Lys Tyr Ala Asp Gly Val Gly Pro Gly Trp Tyr Met Leu Val Asn
260 265 270
Lys Glu Glu Ser Lys Pro Asp Asn Ile Val Tyr Thr Pro Leu Val Lys
275 280 285
Glu Leu Ala Gln Tyr Asn Val Glu Val His Pro Tyr Thr Val Arg Lys
290 295 300
Asp Ala Leu Pro Glu Phe Phe Thr Asp Val Asn Gln Met Tyr Asp Ala
305 310 315 320
Leu Leu Asn Lys Ser Gly Ala Thr Gly Val Phe Thr Asp Phe Pro Asp
325 330 335
Thr Gly Val Glu Phe Leu Lys Gly Ile Lys
340 345
<210> 9
<211> 536
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 载体蛋白
<220>
<221> misc_feature
<222> 34, 213, 245, 265, 386, 527
<223> ‘Xaa’是非天然氨基酸
<400> 9
Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu
1 5 10 15
Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile
20 25 30
Gln Xaa Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp
35 40 45
Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala
50 55 60
Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly
65 70 75 80
Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys
85 90 95
Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr
100 105 110
Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe
115 120 125
Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly
130 135 140
Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu
145 150 155 160
Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln
165 170 175
Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val
180 185 190
Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp
195 200 205
Val Ile Arg Asp Xaa Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His
210 215 220
Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser
225 230 235 240
Glu Glu Lys Ala Xaa Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu
245 250 255
Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Xaa Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro
260 265 270
Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln
275 280 285
Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala
290 295 300
Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly
305 310 315 320
Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu
325 330 335
Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val
340 345 350
Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu
355 360 365
Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly
370 375 380
His Xaa Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn
385 390 395 400
Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly
405 410 415
His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly
420 425 430
Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys
435 440 445
Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala
450 455 460
Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val
465 470 475 480
Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser
485 490 495
Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val
500 505 510
Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Xaa Leu
515 520 525
Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
530 535
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 纯化标签
<400> 10
Gly Ser Gly His His His His His His
1 5

Claims (36)

1.一种缀合物，其包括多肽和抗原，其中所述多肽是包括至少一个T细胞活化表位和至少两个非天然氨基酸(‘nnAA’)残基的载体蛋白，其中(i)所述载体蛋白包括来自蛋白质的至少一个T细胞活化表位，所述蛋白质选自由以下组成的组：白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)毒素、破伤风梭菌(Clostridium tetani)破伤风痉挛毒素、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)蛋白D和CRM197，并且(ii)所述抗原与所述nnAA残基缀合。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述载体蛋白包括4到9个nnAA残基。
3.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中至少一个nnAA取代所述天然载体蛋白中的赖氨酸。
4.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述载体蛋白与SEQ ID NO:1具有至少80％的序列一致性。
5.根据权利要求4所述的缀合物，其中至少一个nnAA取代SEQ ID NO:1的K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523或K527。
6.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述载体蛋白包括氨基酸序列SEQID NO:9。
7.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述至少一个nnAA为2,3-双取代的丙酸，所述2,3-双取代的丙酸带有：在2位处的氨基取代基；在3位处的含叠氮基的取代基、1,2,4,5-四嗪基取代基或含乙炔基的取代基。
8.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述nnAA选自2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸以及2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或其任何组合。
9.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述抗原经由三唑连接部分与所述nnAA缀合。
10.一种缀合物，其包括多肽和抗原，其中所述多肽是包括至少一个T细胞活化表位和至少一个非天然氨基酸(nnAA)的载体蛋白，其中所述抗原与所述nnAA缀合，并且进一步地，其中所述至少一个nnAA残基对应于具有式XII结构的氨基酸：
其中Ar包括任选地含有至少一个杂原子的5元芳香族环或6元芳香族环；W5选自C1-C10亚烷基、-NH-、-O-和-S-；Q1为0或1；并且W6选自叠氮基、任选地被低级烷基C-取代的1,2,4,5-四嗪基以及乙炔基，使得所述多肽中的所述nnAA残基具有式XIII结构：
其中R3为OH或所述载体蛋白的氨基酸残基，并且R4为H或所述载体蛋白的氨基酸残基。
11.根据权利要求10所述的缀合物，其中：W6为叠氮基；Ar为亚苯基，或Ar含有氮杂原子以及任选地至少一个选自N、O和S的另外的杂原子；Q1为1；和/或W5为低级亚烷基。
12.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述抗原根据式XI或XIa与所述载体蛋白连接：
其中
R1为H、甲酰基或所述载体蛋白的至少一个氨基酸；
R2为OH或所述载体蛋白的至少一个氨基酸；
W为C或N；
y为至少1；
n为至少1；并且
X为荚膜多糖的至少一种多元醇。
13.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述抗原为细菌荚膜多糖；例如来自细菌的荚膜多糖，所述细菌选自由以下组成的组：肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)和牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)。
14.根据权利要求12所述的缀合物，其中所述抗原为选自由以下组成的组的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F。
15.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中多糖与载体蛋白的比率(w/w)大于1。
16.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述多肽包含3个或更多个nnAA残基，并且所述缀合物具有至少500kDa的分子量。
17.根据权利要求15所述的缀合物，其中所述多肽(a)为CRM197或包括与SEQ ID NO:1具有至少80％序列一致性的氨基酸序列，并且(b)包括3-9个nnAA残基。
18.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物通过蛋白质-抗原-蛋白质连接交联。
19.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物具有至少900kDa的分子量。
20.根据权利要求19所述的缀合物，其具有介于900kDa与5MDa之间的分子量。
21.一种用于产生缀合物的方法，其包括：
a.提供活化的抗原，所述活化的抗原包括多个官能团，所述多个官能团包括能够与非天然氨基酸(‘nnAA’)的第二化学柄(chemical handle)缀合的第一化学柄；
b.在所述第一化学柄和所述第二化学柄反应的条件下将所述活化的抗原与包括所述nnAA中的至少一个nnAA的多肽组合以形成抗原-多肽缀合物，其中所述多肽包括至少一个T细胞活化表位；以及
c.回收包括所述缀合物的组合物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一化学柄包括炔烃基团和/或所述第二化学柄包括叠氮基。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所述抗原与第二试剂反应，所述第二试剂包括选自由炔丙基、DIFO、DBCO、DBCO-NH2和DBCO(PEG)n-NH2组成的组的官能团。
24.根据权利要求21或权利要求22所述的方法，其中(i)所述抗原包括式V、式VI或式VIa结构：
其中：L1为一键、-NH-、-O-、-S-、-NH(L12)-、-O(L12)-或-S(L12)-；
L2为一键、-C(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)L12-、-S(＝O)2L12；
L12为L22或L22NH-；
L22为C1-10烷基或-(CH2CH2O)1-10-；并且
U1为所述抗原的至少一个部分，
或(ii)其中所述抗原包括式VII或式VIIa结构：
其中：X为多糖的至少一种多元醇；并且
n为至少1，
或(iii)其中所述抗原包括式VIIb或式VIIc结构：
其中：X为多糖的至少一种氨基糖的胺；并且
n为至少1，
或(iv)其中所述抗原包括结构A-X的z部分，其中：
A为
X为多糖的至少一种多元醇；
n为至少1；并且
z大于1，
或(v)其中所述抗原包括式VIII结构：
其中：L22为一键、烷基或聚(烷氧基)；并且
U1为抗原的至少一个部分，
或(vi)其中所述抗原包括式IX结构：
其中：U1为抗原的至少一个部分。
或(vii)其中所述抗原包括式IXa结构：
其中：L22为C1-10烷基或-(CH2CH2O)1-10-；并且
U1为抗原的至少一个部分。
25.根据权利要求21到24中任一项所述的方法，其用于产生根据权利要求1到20中任一项所述的缀合物。
26.一种制备蛋白质-缀合物疫苗的改进的方法，其中抗原与提供T细胞依赖性免疫应答的载体蛋白缀合，所述改进包括将多肽用作所述载体蛋白，所述多肽包括至少一个非天然氨基酸，所述非天然氨基酸包括生物正交反应性部分，所述抗原通过所述生物正交反应性部分与所述多肽缀合。
27.一种载体蛋白，其包括至少一个T细胞活化表位和至少两个非天然氨基酸(‘nnAA’)残基，其中(i)所述载体蛋白包括来自蛋白质的至少一个T细胞活化表位，所述蛋白质选自由以下组成的组：白喉棒状杆菌毒素、破伤风梭菌破伤风痉挛毒素、流感嗜血杆菌蛋白D和CRM197。
28.一种载体蛋白，其包括与SEQ ID NO:1具有至少80％序列一致性的氨基酸序列，并且包括取代SEQ ID NO:1内的天然存在的氨基酸的至少一个nnAA，其中所述至少一个nnAA取代SEQ ID NO:1的K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523或K527，并且其中所述nnAA包括连接部分。
29.一种载体蛋白，其用于制备免疫原性多糖-蛋白质缀合物，其中所述蛋白质：(i)包括至少一个T细胞活化表位；(ii)包含至少一个nnAA；并且(iii)在20℃下，在pH值为7.4的Tris缓冲液中具有至少50mg/L的溶解度。
30.一种用于产生根据权利要求26到28中任一项所述的载体蛋白的方法，所述方法包括：
(a)提供编码所述载体蛋白的核酸，其中所述核酸包括多个抑制密码子；
(b)通过将所述核酸与无细胞的细胞提取物组合来产生反应混合物，所述无细胞的细胞提取物包括所述非天然氨基酸、与所述抑制密码子互补的tRNA和氨酰基-tRNA合成酶；以及
(c)在足以选择性地在对应于所述载体蛋白中的每个抑制密码子的位点处并入所述非天然氨基酸的条件下培育(b)的所述反应混合物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述非天然氨基酸为4-叠氮基甲基-苯丙氨酸(pAMF)，并且(b)中的所述tRNA能够通过pAMF带电。
32.一种用于合成多肽的方法，所述多肽包括维持在约10℃与约30℃之间的温度下的无细胞表达混合物中的至少2个nnAA，其中所产生的所述多肽包括可溶级分和不可溶级分两者，并且其中所述可溶级分与所述不可溶级分的比率为至少30％(w/w)。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述温度(i)高于约20℃或(ii)低于约20℃，例如其中所述温度介于约14℃与约18℃之间。
34.一种组合物，其包括根据权利要求1到19所述的多种缀合物，其中所述多种缀合物中的每种缀合物包括不同的抗原。
35.根据权利要求34所述的组合物，其包括：
来自2种或更多种不同的肺炎球菌血清型的荚膜多糖的缀合物，所述肺炎球菌血清型选自由以下血清型组成的组：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F；
来自14种或更多种不同的肺炎球菌血清型的荚膜多糖的缀合物，所述肺炎球菌血清型选自由以下血清型组成的组：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F；
来自15种或更多种不同的肺炎球菌血清型的荚膜多糖的缀合物，所述肺炎球菌血清型选自由以下血清型组成的组：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F；
来自20种或更多种不同的肺炎球菌血清型的荚膜多糖的缀合物，所述肺炎球菌血清型选自由以下血清型组成的组：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F；
来自21种或更多种不同的肺炎球菌血清型的荚膜多糖的缀合物，所述肺炎球菌血清型选自由以下血清型组成的组：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F；
来自24种或更多种不同的肺炎球菌血清型的荚膜多糖的缀合物，所述肺炎球菌血清型选自由以下血清型组成的组：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F；
来自25种或更多种不同的肺炎球菌血清型的荚膜多糖的缀合物，所述肺炎球菌血清型选自由以下血清型组成的组：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31和33F；
来自4种或更多种不同的脑膜炎球菌血清型的荚膜多糖的缀合物，所述脑膜炎球菌血清型选自由血清型A、C、W135、X和Y组成的组；或
来自2种或更多种不同的牙龈卟啉单胞菌血清型的荚膜多糖的缀合物，所述牙龈卟啉单胞菌血清型选自由血清型K1、K2、K3、K4、K5和K6组成的组。
36.一种在受试者中引发对抗原的免疫保护性抗体应答的方法，所述方法包括在适于胃肠外给药的赋形剂中向所述受试者给予根据权利要求1到20中任一项所述的缀合物或根据权利要求34或权利要求35所述的组合物。
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