CN102883745A - 缀合方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了通过还原胺化用于缀合细菌糖类包括肺炎链球菌和流感嗜血杆菌糖类的方法。

Description

缀合方法
技术领域
本发明涉及用于缀合的方法。特别地，它涉及使用还原胺化的糖和蛋白质的缀合。
背景技术
细菌荚膜多糖已广泛用于免疫学许多年用于预防细菌疾病。然而，关于此类使用的问题是免疫应答的T不依赖性特性。这些抗原因此在幼儿中是弱免疫原性的。这个问题已通过将多糖抗原与载体蛋白质（T辅助表位的来源）缀合得到克服，其随后可以用于甚至在生命的第一年中引发T依赖性免疫应答。
多种缀合技术是本领域已知的。缀合物可以通过如US200710184072（Hausdorff）US 4365170（Jennings）和US 4673574（Anderson）中所述的直接还原胺化法进行制备。其他方法在EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中描述。缀合法可以可替代地依赖用1-氰基-4-二甲氨基吡啶嗡四氟硼酸盐（CDAP）活化糖类的羟基，以形成氰酸酯。此类缀合物在PCT公开申请WO 93/15760 Uniformed Services University以及WO 95/08348和WO 96/29094中描述。还参见Chu C.等人Infect. Immunity，1983 245 256。
还原胺化涉及两个步骤，（1）抗原的氧化，（2）抗原和载体蛋白质的还原，以形成缀合物。氧化步骤可以涉及与高碘酸盐的反应，然而，通过高碘酸盐的氧化可以导致尺寸减小（WO94/05325）。
发明内容
本发明人已惊讶地发现在低磷酸盐的存在下使用较低浓度的高碘酸盐可以导致尺寸的保留和/或表位的保留。
在本发明的第一个方面，提供了用于缀合细菌糖类的方法，其包括步骤
a）将细菌糖类与0.001-0.7、0.005-0.5、0.01-0.5、0.1-1.2、0.1-0.5、0.1-0.2、0.5-0.8、0.1-0.8、0.3-1.0或0.4-0.9摩尔当量的高碘酸盐反应，以形成活化的细菌糖类；
b）将活化的细菌糖类与载体蛋白质混合；
c）将活化的细菌糖类和载体蛋白质与还原剂反应，以形成缀合物；
或
a）将细菌糖类与0.001-0.7、0.005-0.5、0.01-0.5、0.1-1.2、0.1-0.5、0.1-0.2、0.5-0.8、0.1-0.8、0.3-1.0或0.4-0.9摩尔当量的高碘酸盐反应，以形成活化的细菌糖类；
b）将活化的细菌糖类与接头混合；
c'）使用还原剂将活化的细菌糖类与接头反应，以形成细菌糖类-接头；
d）将细菌糖类-接头与载体蛋白质反应，以形成缀合物；
其中步骤a）在不含胺基团的缓冲液中发生，并且所述缓冲液具有1-100mM的浓度。
在本发明的第二个方面，提供了可通过本发明的方法获得的缀合物。
在本发明的第三个方面，提供了通过本发明的方法获得的缀合物。
在本发明的第四个方面，提供了免疫原性组合物，其包含本发明的缀合物和药学可接受的赋形剂。
在本发明的第五个方面，提供了包含本发明的免疫原性组合物的疫苗。
在本发明的第六个方面，提供了本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗在预防或治疗细菌疾病中的用途。
在本发明的第七个方面，提供了本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗在制备用于预防或治疗细菌疾病的药物中的用途。
在本发明的第八个方面，提供了预防或治疗细菌感染的方法，其包括给患者施用本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗。
在本发明的第九个方面，提供了活化的细菌糖类，其中所述活化的细菌糖类包含式（I）的重复单位：
Figure 496227DEST_PATH_IMAGE001
其中所述活化的细菌糖类包含n个重复单位，并且n是2 - 2400、500 - 2000、750 - 1500、1000 - 2000或1500 - 2300。
其中至少0.001%、0.01%、0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%或30%但小于0.001%、0.01%、0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%、30%或50%的S1是
Figure 85472DEST_PATH_IMAGE002
并且剩余部分是
Figure 68471DEST_PATH_IMAGE003
其中S2是 
Figure 463681DEST_PATH_IMAGE004
 或者 
并且其中S3是 
Figure 710302DEST_PATH_IMAGE006
 或者。
附图说明
图1. 在高碘酸盐处理后的23F和6B多糖的大小。用三角形标记的线显示6B在10mM磷酸盐缓冲液中的大小，用菱形标记的线显示23F在10mM磷酸盐缓冲液中的大小，并且用正方形标记的线显示23F在100mM磷酸盐缓冲液中的大小。
图2. 使用CDAP 或还原胺化缀合的23F缀合物的免疫原性比较。图表a）描述ELISA测定的结果。图表b）描述调理吞噬测定的结果。
图3 在Balb/c小鼠模型中使用实施例4中所述的缀合方法缀合的PS06B-CRM的免疫原性的估计。
图4 在豚鼠模型中使用实施例4中所述的缀合方法缀合的PS06B-CRM的免疫原性的估计。
具体实施方式
本发明涉及用于将抗原与载体蛋白质缀合的改善过程。特别地，本发明提供了用于缀合细菌糖类的方法，其包括步骤
a）将细菌糖类与0.001-0.7、0.005-0.5、0.01-0.5、 0.1-1.2、0.1-0.5、0.1-0.2、0.5-0.8、0.1-0.8、0.3-1.0或0.4-0.9摩尔当量的高碘酸盐反应，以形成活化的细菌糖类；
b）将活化的细菌糖类与载体蛋白质混合；
c）将活化的细菌糖类和载体蛋白质与还原剂反应，以形成缀合物；
或
a）将细菌糖类与0.001-0.7、0.005-0.5、0.01-0.5、0.1-1.2、0.1-0.5、0.1-0.2、0.5-0.8、0.1-0.8、0.3-1.0或0.4-0.9摩尔当量的高碘酸盐反应，以形成活化的细菌糖类；
b）将活化的细菌糖类与接头混合；
c'）使用还原剂将活化的细菌糖类与接头反应，以形成细菌糖类-接头；
d）将细菌糖类-接头与载体蛋白质反应，以形成缀合物；
其中步骤a）在不含胺基团的缓冲液中发生，并且所述缓冲液具有1-100mM的浓度。
术语‘高碘酸盐’包括高碘酸盐和高碘酸。这个术语还包括偏高碘酸盐（IO4 -）和正高碘酸盐（IO6 5-），然而，在一个特定实施方案中，在本发明的方法中使用的高碘酸盐是偏高碘酸盐。术语‘高碘酸盐’还包括高碘酸盐的多种盐，包括高碘酸钠和高碘酸钾。在一个实施方案中，使用的高碘酸是偏高碘酸钠。当抗原与高碘酸盐反应时，高碘酸盐氧化邻位羟基，以形成羰基或醛基，且引起C-C键的切割。为此，术语‘将抗原与高碘酸盐反应’包括通过高碘酸盐的邻位羟基氧化。
为了本发明的目的，‘活化的细菌糖类’是已通过本发明的方法的步骤a）活化的细菌糖类。
为了本发明的目的，术语‘缀合物’指示与载体蛋白质共价连接的细菌糖类。在一个实施方案中，细菌糖类与载体蛋白质直接连接。在第二个实施方案中，细菌糖类通过间隔物/接头与蛋白质连接。
步骤a）中使用的缓冲液是不含氨基的缓冲液。在一个实施方案中，缓冲液选自磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、马来酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。在第二个实施方案中，缓冲液是无机缓冲液。术语无机缓冲液包括任何缓冲溶液，其中缓冲能力是由于不含碳的化合物的存在。本发明的无机缓冲液包括磷酸盐缓冲液和硼酸盐缓冲液。在一个实施方案中，缓冲液是磷酸盐缓冲液。
在一个实施方案中，缓冲液具有1-100mM、5-80mM、1-50mM、1-25mM、10-40mM、1-10mM、5-15mM、8-12mM、10-20mM、5-20mM、10-50mM、约10mM或约20mM的浓度。在一个进一步的实施方案中，步骤a）中的pH是pH 2.5-8.0、pH5.0-7.0、pH 5.5-6.5、pH 5.8-6.3或约pH 6.0。
本说明书自始至终术语“糖类”可以指示多糖、磷壁酸或寡糖且包括所有三种。它可以指示脂多糖（LPS）或脂寡糖（原文为lipooliogosaccharide，疑为lipooligosaccharide）（LOS）。在使用前，多糖可以从来源菌株中分离，或从来源菌株中分离且通过已知方法（参见例如EP497524和EP497525；Shousun Chen Szu等人 – Carbohydrate Research第152卷第7-20页（1986））例如通过微流化使大小合适至一定程度。寡糖具有低数目的重复单位（一般为5-30个重复单位）且一般为水解的多糖。
在一个实施方案中，细菌糖类是细菌荚膜糖类。在本发明的一个实施方案中，细菌糖类源于B组链球菌、霍乱弧菌（Vibrio cholera）、肺炎链球菌（Streptococus pneumoniae（S.pneumoniae））、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae（H.influenzae））、脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis（N.meningitidis））、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus（S.aureus））、肠球菌、沙门氏菌Vi（Salmonella Vi）或表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis（S.epidermidis））。在一个进一步的实施方案中，细菌糖类源于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、沙门氏菌Vi或表皮葡萄球菌。在一个再进一步的实施方案中，细菌糖类是选自下述列表的细菌荚膜糖类：脑膜炎奈瑟菌血清群A（MenA）、B（MenB）、C（MenC）、W135（MenW）或Y（MenY），B组链球菌组Ia、Ib、II、III、IV、V、VI或VII，金黄色葡萄球菌5型，金黄色葡萄球菌8型，伤寒沙门氏菌（Vi糖类），霍乱弧菌或流感嗜血杆菌b型。在一个实施方案中，细菌糖类是来自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F的荚膜糖类。在一个进一步的实施方案中，细菌糖类是选自5、6B、6A、7F、9V、14或23F的肺炎链球菌荚膜糖类。任选地，本发明的细菌糖类是肺炎链球菌荚膜糖类23F、6B或6A。在一个实施方案中，细菌糖类是肺炎链球菌荚膜糖类23F。在一个实施方案中，细菌糖类是肺炎链球菌荚膜糖类6B。在一个实施方案中，细菌糖类是肺炎链球菌荚膜糖类6A。在一个再进一步的实施方案中，细菌糖类是流感嗜血杆菌b（Hib）多糖或寡糖。在一个实施方案中，细菌糖类含有邻位反二醇。
细菌糖类可以是天然多糖，或可以在尺寸上减少不超过x2、x4、x6、x8、x10或x20倍（例如通过微流化[例如通过Emulsiflex C-50仪器]或其他已知技术[例如热、化学制品、氧化、超声处理法]）。在一个实施方案中，在步骤a）前，细菌糖类是微流化的。寡糖可以已在尺寸上基本上进一步减少[例如通过已知热、化学制品或氧化法]。
为了本发明的目的，“天然多糖”指未实施目的在于减少糖类大小的方法的细菌糖类。多糖可以在正常纯化程序过程中变得在尺寸上轻微减少。此类糖类仍是天然的。只有当多糖已实施在尺寸上减少糖类的技术时，该多糖将不视为天然的。
适合于通过本发明的方法缀合的细菌糖类的重量平均分子量可以是20kDa - 2000kDa、30kDa - 1000kDa、40kDa - 500kDa、50kDa - 400kDa、75kDa - 300kDa或1000kDa - 2000kDa。在来自天然肺炎链球菌的天然23F荚膜糖类的情况下，天然多糖的平均分子量是750-1500 kDa或1200-1300kDa。在天然Hib糖类的情况下，天然多糖的平均分子量是100 - 250kDa。糖类的分子量或平均分子量在本文中指在缀合前测量的细菌糖类的重量平均分子量（Mw），且通过MALLS进行测量。MALLS技术是本领域众所周知的。对于糖类的MALLS分析，可以组合使用两个柱（TSKG6000和5000PWxl），并且在水中洗脱糖类。使用光散射检测器（例如配备以488nm的10mW氩激光器的Wyatt Dawn DSP）和干涉测量折射计（例如配备P100室和以498nm的红色滤光器的Wyatt Otilab DSP）检测糖类。MALLS分析可以使用TSKGMPwxl和以0.75 ml/分钟的50 mM Na/K PO4、200 mM NaCl pH 7.0作为洗脱缓冲液执行，使用RI/DAWN-EOS检测器。在一个实施方案中，糖类的多分散性是1-1.5、1-1.3、1-1.2、1-1.1或1-1.05，并且在与载体蛋白质缀合后，缀合物的多分散性是1.0-2.5、1.0-2.0、1.0-1.5、1.0-1.2、1.5-2.5、1.7-2.2或1.5-2.0。所有多分散性测量通过MALLS生成。
用高碘酸盐的处理可以导致细菌糖类大小上的减少（筛分效应）。在一个实施方案中，本发明的方法减少这种筛分效应。这对于来自肺炎链球菌的23F细菌糖类可见（如在实施例1中）。为此，在一个实施方案中，本发明的细菌糖类的平均分子量在步骤a）后是1-1100kDa、100-470kDa、200-300kDa、600-1100kDa或800-1000kDa（如上所述通过MALLS测量的）。在一个实施方案中，23F糖类的平均分子量在步骤a）后是100-470kDa或200-300kDa。在一个实施方案中，Hib细菌糖类的平均分子量在步骤a）后是1 - 50kDa或5 - 10kDa。
术语“载体蛋白质”意欲涵盖小肽和大肽（>10 kDa）。载体蛋白质可以是任何肽或蛋白质。它可以包含一个或多个T辅助表位。载体蛋白质可以是破伤风类毒素（TT），破伤风类毒素的片段C，破伤风毒素的无毒突变体[应当指出为了本发明的目的，TT的所有此类突变体都视为相同类型的载体蛋白质]，包含破伤风毒素T细胞表位的多肽例如N19（WO2006/067632），白喉类毒素（DT），CRM197，白喉毒素的其他无毒突变体[例如CRM176、CRM 197、CRM228、CRM 45（Uchida等人J. Biol. Chem. 218；3838-3844，1973）；CRM 9、CRM 45、CRM102、CRM 103和CRM107以及由Nicholls和Youle在Genetically Engineered Toxins，Ed: Frankel，Maecel Dekker Inc，1992中描述的其他突变；Glu-148至Asp、Gln或Ser和/或Ala 158至Gly的缺失或突变及公开于US 4709017或US 4950740中的其他突变；至少一个或多个残基Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534的突变及公开于US 5917017或US 6455673中的其他突变；或公开于US 5843711中的片段]（应当指出为了本发明的目的，DT的所有此类突变体都视为相同类型的载体蛋白质），肺炎球菌溶血素（Kuo等人（1995）Infect Immun 63；2706-13），OMPC（脑膜炎球菌外膜蛋白质 – 通常从脑膜炎奈瑟菌血清群B中提取– EP0372501），合成肽（EP0378881、EP0427347），热休克蛋白（WO 93/17712、WO 94/03208），百日咳蛋白质（WO 98/58668、EP0471177），细胞因子，淋巴因子，生长因子或激素（WO 91/01146），包含来自多种病原体衍生抗原的多重人CD4+ T细胞表位的人工蛋白质（Falugi等人（2001）Eur J Immunol 31；3816-3824），例如N19蛋白质（Baraldoi等人（2004）Infect Immun 72；4884-7）、肺炎球菌表面蛋白质PspA（WO 02/091998）、铁摄取蛋白质（WO 01/72337）、难辨梭菌（C. difficile）的毒素A或B（WO 00/61761）、流感嗜血杆菌蛋白质D（EP594610和WO 00/56360）、肺炎球菌PhtA（WO 98/18930，也称为Sp36）、肺炎球菌PhtD（公开于WO 00/37105中，并且也称为Sp036D）、肺炎球菌PhtB（公开于WO 00/37105中，并且也称为Sp036B）、或PhtE（公开于WO00/30299中，并且也称为BVH-3）。
在本发明的一个实施方案中，载体蛋白质选自：破伤风类毒素（TT）、破伤风类毒素的片段C、白喉类毒素（DT）、CRM197、肺炎球菌溶血素（Ply）、蛋白质D、PhtD、PhtDE和N19。在一个进一步的实施方案中，载体蛋白质是CRM197。在一个再进一步的实施方案中，载体蛋白质是破伤风类毒素（TT）。
在一个实施方案中，步骤a）在黑暗中进行。
当抗原与高碘酸盐反应时，高碘酸盐氧化邻位羟基，以形成羰基或醛基且引起C-C键的切割。氧化步骤（步骤a））可以如下所述发生：
Figure 376568DEST_PATH_IMAGE008
当使用低浓度的缓冲液特别是磷酸盐缓冲液和少量高碘酸盐时，这可以减少上述筛分效应。
肺炎链球菌荚膜糖类含有能够由高碘酸盐氧化的邻位羟基，如由下文所示的重复区结构可见的：
PS1
Figure 717551DEST_PATH_IMAGE009
PS4
Figure 710915DEST_PATH_IMAGE010
PS5
Figure 402927DEST_PATH_IMAGE011
PS 6A
Figure 77622DEST_PATH_IMAGE012
PS 6B
Figure 538691DEST_PATH_IMAGE013
PS9
Figure 968535DEST_PATH_IMAGE014
PS7F
PS14
Figure 360650DEST_PATH_IMAGE016
PS19F
Figure 4121DEST_PATH_IMAGE017
PS19A
Figure 276971DEST_PATH_IMAGE018
PS23F
Figure 940646DEST_PATH_IMAGE019
PS18C
Figure 19460DEST_PATH_IMAGE020
。
在一个实施方案中，细菌糖类的小于0.001%、0.01%、0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%、30%或50%的邻位二醇在步骤a）过程中变得氧化。
在一个实施方案中，步骤a）中产生的羰基与步骤c）中的载体蛋白质上的氨基反应。这可以根据下述反应方案发生：
Figure 455121DEST_PATH_IMAGE021
。
在一个实施方案中，在步骤a）中，细菌糖类以0.2g/l - 14g/l、8g/l - 12g/l、10 g/l - 12g/l、1g/l - 4g/l、0.2g/l - 1g/l或0.4g/l - 0.6g/l或约11g/l或约0.5g/l的浓度存在。在一个实施方案中，在步骤b）中，载体蛋白质的起始浓度是0.5g/l - 35g/l、25g/l - 35g/l、0.5g/l - 5g/l或0.8g/l - 2g/l或约32g/l或1g/l。在一个进一步的实施方案中，在步骤b）中，活化的细菌糖类的起始浓度是0.2g/l - 20g/l、10g/l - 28g/l、或0.2g/l - 4g/l或1g/l - 2g/l或约15g/l或1.6 g/l。在一个进一步的实施方案中，在步骤b）中，活化的细菌糖类与载体蛋白质的起始比值是2.0:1至0.1:1、1.8:1至0.4:1、1.4:1至1.6:1、1:1至1.4:1、 1.8:1至1.6:1、0.8:1至0.4:1、0.7:1至0.5:1、或0.7:1至0.6:1（w/w）。在一个进一步的实施方案中，在步骤c）或c’）后，载体蛋白质与细菌糖类的最终比值是0.5:1至4:1、0.8:1至3.2:1、0.5:1至1.8:1、1.4:1至1.8:1、1:1至1.2:1或2.5:1至3.5:1。
在一个实施方案中，在步骤a）中的反应温度是4-40℃、10-32℃、17-30℃或22-27℃。一般地，这个温度在步骤a）自始至终维持。在步骤c）过程中的反应温度是4-40℃、10-32℃、17-30℃或22-27℃。一般地，这个温度在步骤c）自始至终维持。
在一个实施方案中，本发明的方法的步骤a）在小于30小时内、在5 - 25 小时之间、在15 - 25 小时之间、在30分钟 - 25 小时之间、在1小时 - 35 小时之间、在10 - 20 小时之间、或在15 - 20 小时之间、约18 小时或约1小时发生。在一个实施方案中，本发明的方法的步骤c）在10-60 小时、10-20 小时、20-60 小时之间，在30-50 小时之间或在35-45 小时之间发生。
缀合还可以使用本发明的化学法通过杂或同双功能接头的添加而发生。接头的一个末端将通过还原胺化与活化的抗原反应，然而，接头的另一个末端可以使用任何类型的化学法与载体蛋白质反应。为此，接头将含有至少一个反应氨基，如果接头是同双功能的，那么它将含有两个反应氨基，如果接头是异双功能的，那么它将含有一个反应氨基和不同的反应基团，在一个实施方案中，这个第二反应基团是反应羰基。在一个实施方案中，接头是长度1 - 20埃。在一个进一步的实施方案中，接头具有4 – 20、4 - 12或5 - 10个碳原子。可能的接头是己二酸二酰肼（ADH）。其他接头包括B-丙酰胺基（WO 00/10599）、硝基苯基-乙胺（Gever等人（1979）Med. Microbiol. Immunol. 165；171-288）、卤代烷基卤化物、糖苷键（US4673574、US4808700）、己二胺和6-氨基己酸（US4459286）。
一般而言，在载体蛋白质上的下述类型的化学基团可以作为第二反应基团用于偶联/缀合：
A）羧基（例如经由天冬氨酸或谷氨酸）。在一个实施方案中，这个基团用碳化二亚胺化学法例如用EDAC（1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺））与接头上的氨基连接。
注：代替上文的EDAC，可以使用任何合适的碳化二亚胺。
B）氨基（例如经由赖氨酸）。在一个实施方案中，这个基团用碳化二亚胺化学法例如用EDAC与接头上的羧基连接。在另一个实施方案中，这个基团连接至接头上用CDAP或CNBr活化的羟基；连接至具有醛基的接头；连接至具有琥珀酰亚胺酯基的接头。
C）巯基（例如经由半胱氨酸）。在一个实施方案中，这个基团用马来酰亚胺化学法与溴或氯乙酰化接头连接。在一个实施方案中，这个基团是用双二偶氮联苯胺活化/修饰的。
D）蛋白质可以进行修饰，以含有炔基或叠氮基，这可以使用‘点击（click）’化学法（在Tetrahedron letters（2005年6月）46:4479-4482中描述）与接头缀合。
注：代替上文的EDAC，可以使用任何合适的碳化二亚胺。
适合于在本发明的方法中使用的还原剂包括氰基硼氢化物，例如氰基硼氢化钠、硼烷-吡啶或硼氢化物交换树脂。在一个实施方案中，还原剂是氰基硼氢化钠。在一个实施方案中，0.5 – 2、0.6 - 1.5或0.8 - 1.2或约1.0摩尔当量的氰基硼氢化钠用于步骤c）中。在一个进一步的实施方案中，还原剂包含三乙酰氧基硼氢化钠，在一个进一步的实施方案中，2 - 10或3 – 9摩尔当量或约2.5摩尔当量的三乙酰氧基硼氢化钠用于步骤c）中。
在步骤c）前，活化的细菌糖类和载体蛋白质可以是冻干的。在一个实施方案中，活化的细菌糖类和载体蛋白质是一起冻干的。这可以在步骤b）前或在步骤b）后发生。在一个实施方案中，冻干在非还原糖的存在下发生，可能的非还原糖包括蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、松三糖、右旋糖酐、甘露醇、拉克替醇和palatinit。在一个进一步的实施方案中，非还原糖选自蔗糖、海藻糖或甘露醇。
在一个实施方案中，步骤b）和/或c）在DMSO（二甲亚砜）溶剂中进行。在一个进一步的实施方案中，步骤和/或c）在DMF（二甲基甲酰胺）溶剂中进行。DMSO或DMF溶剂可以用于重构已冻干的活化的细菌糖类和载体蛋白质。
在步骤c）结束时，可以存在未反应的羰基在缀合物中保留的，这可以使用合适的加帽试剂进行加帽。在一个实施方案中，这种加帽试剂是硼氢化钠（NaBH4），例如步骤c）的产物可以与硼氢化钠反应15分钟-15小时、 15分钟-45分钟、 2-10小时或3-5小时、 约30 分钟或约4 小时。在一个进一步的实施方案中，加帽通过将步骤c）的产物与约2摩尔当量或1.5 - 10摩尔当量的NaBH4混合来实现。
本发明还提供了纯化缀合物的另外的步骤e），步骤e）可以包含渗滤（原文为diafilitration，疑为diafiltration），例如具有100kDa截止的渗滤。另外或可替代地，步骤e）可以包含离子交换层析。在一个进一步的实施方案中，步骤e）可以包含尺寸排阻层析。在一个实施方案中，权利要求1-51的方法包含其中将缀合物无菌过滤的另外的步骤f）。
缀合物还可以与另外的抗原混合。在一个实施方案中，另外的抗原包含选自1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种肺炎链球菌糖类。在一个实施方案中，另外的抗原包含肺炎链球菌糖类4、6B、9V、14、18C、19F和23F。在一个实施方案中，另外的抗原包含肺炎链球菌糖类4、6B、9V、14、18C和19F。在一个实施方案中，另外的抗原包含肺炎链球菌糖类4、9V、14、18C、19F和23F。在一个实施方案中，另外的抗原包含肺炎链球菌糖类1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F。在一个实施方案中，另外的抗原包含肺炎链球菌糖类1、4、5、6B、7F、9V、14、18C和19F。在一个实施方案中，另外的抗原包含肺炎链球菌糖类1、4、5、7F、9V、14、18C、19F和23F。在一个实施方案中，另外的抗原包含肺炎链球菌糖类1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。在一个实施方案中，另外的抗原包含肺炎链球菌糖类1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F。在一个实施方案中，另外的抗原包含肺炎链球菌糖类1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。在一个实施方案中，另外的抗原包含肺炎链球菌糖类1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。在一个实施方案中，另外的抗原包含肺炎链球菌糖类1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F。在一个实施方案中，另外的抗原包含肺炎链球菌糖类1、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。
作为‘另外的抗原’列出的任何糖类都任选通过本发明的方法或通过不同过程与载体蛋白质缀合。任选地，这些另外的抗原与上文列出的载体蛋白质缀合。
在一个实施方案中，另外的抗原包含与蛋白质D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖类1。在一个实施方案中，另外的抗原包含与蛋白质D、CRM197、肺炎球菌溶血素或PhtD或其片段或融合蛋白缀合的肺炎链球菌荚膜糖类3。在一个实施方案中，另外的抗原包含与蛋白质D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖类4。在一个实施方案中，另外的抗原包含与蛋白质D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖类5。在一个实施方案中，另外的抗原包含与蛋白质D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖类6B。在一个实施方案中，另外的抗原包含与蛋白质D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖类7F。在一个实施方案中，另外的抗原包含与蛋白质D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖类9V。在一个实施方案中，另外的抗原包含与蛋白质D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖类14。在一个实施方案中，另外的抗原包含与蛋白质D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖类23F。在一个实施方案中，另外的抗原包含与破伤风类毒素或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖类18C。在一个实施方案中，另外的抗原包含与肺炎球菌溶血素或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖类19A。在一个实施方案中，另外的抗原包含与CRM197或PhtD或其片段或融合蛋白缀合的肺炎链球菌荚膜糖类22F。在一个实施方案中，另外的抗原包含与肺炎球菌溶血素或流感嗜血杆菌蛋白质任选蛋白质D或PhtD或其融合蛋白或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖类6A。在一个实施方案中，另外的抗原包含与肺炎球菌溶血素或流感嗜血杆菌蛋白质任选蛋白质D或PhtD或其融合蛋白或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖类6C。在一个实施方案中，另外的抗原包含与白喉类毒素（DT）缀合的肺炎链球菌荚膜糖类19F。
另外的抗原还可以包含肺炎链球菌蛋白质。在一个实施方案中，另外的抗原包含选自聚组氨酸三联体家族（PhtX）、胆碱结合蛋白家族（CbpX）、CbpX平截、LytX家族、LytX平截、CbpX平截-LytX平截嵌合蛋白质（或融合物）、肺炎球菌溶血素（Ply）、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133的至少1种蛋白质。
另外的抗原还可以包含来自进一步的细菌物种的抗原。在一个实施方案中，疫苗或免疫原性组合物包含源于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、大肠埃希杆菌（Escherichia coli（ E.coli））、卡他莫拉菌（Moraxella cattharlis（M.cattarhalis））、破伤风、白喉、百日咳、表皮葡萄球菌、肠球菌、假单胞菌属（Pseudomonas）或金黄色葡萄球菌的抗原。
在一个实施方案中，另外的抗原包含卡他莫拉菌抗原，优选的卡他莫拉菌抗原是：OMP106 [WO 97/41731（Antex）& WO 96/34960（PMC）]；OMP21；LbpA & LbpB [WO 98/55606（PMC）]；TbpA & TbpB [WO 97/13785 & WO 97/32980（PMC）]；CopB [Helminen ME,等人（1993）Infect. Immun. 61:2003-2010]；UspA1/2 [WO 93/03761（University of Texas）]；和OmpCD。可以包括在组合疫苗（尤其是用于预防中耳炎）中的无法分类的流感嗜血杆菌抗原的例子包括：纤毛素蛋白质[（US 5766608 - Ohio State Research Foundation）]和包含来自其的肽的融合物[例如LB1（f）肽融合物：US 5843464（OSU）或WO 99/64067]；OMP26 [WO 97/01638（Cortecs）]；P6 [EP 281673（State University of New York）]；TbpA和TbpB；Hia；Hmw1,2；Hap；和D15。
在一个进一步的实施方案中，另外的抗原包含白喉类毒素（DT）、破伤风类毒素（TT）和百日咳组分[一般为去毒的百日咳毒素（PT）和丝状血凝素（FHA）与任选的百日咳杆菌粘附素（PRN）和/或凝集素1+2]，例如销售的疫苗INFANRIX-DTPaTM（SmithKlineBeecham Biologicals），其含有DT、TT、PT、FHA和PRN抗原，或用例如如由SmithKlineBeecham Biologicals s.a.作为TritanrixTM销售的全细胞百日咳组分。在一个进一步的实施方案中，另外的抗原包含乙型肝炎表面抗原（HepB）。
在一个进一步的实施方案中，另外的抗原包含流感嗜血杆菌（Hib）的PRP荚膜糖类。
在一个进一步的实施方案中，另外的抗原包含来自脑膜炎奈瑟菌A、C、W或Y的至少一种荚膜糖类。在一个进一步的实施方案中，另外的抗原包含来自脑膜炎奈瑟菌A、C、W或Y的荚膜糖类的至少一种缀合物。
缀合物还可以与佐剂混合。合适的佐剂包括但不限于铝盐（磷酸铝或氢氧化铝）、单磷酰脂质A（例如3D-MPL）、皂苷（例如QS21）、水包油乳剂、来自革兰氏阴性菌菌株的大疱或外膜囊泡制备物（例如由WO02/09746教导的那些）、脂质A或其衍生物、烷基葡糖酰胺磷酸盐或这些佐剂中的两种或更多种的组合。
在一个进一步的实施方案中，将本发明的缀合物与药学可接受的赋形剂混合。
在本发明的一个进一步方面，提供了可通过本发明的方法获得的缀合物。在本发明的一个进一步方面，提供了通过本发明的方法获得的缀合物。本发明还提供了包含本发明的缀合物和药学可接受的赋形剂的免疫原性组合物。在一个实施方案中，药学可接受的赋形剂不含氯化物盐，在一个进一步的实施方案中，药学赋形剂不含氯化钠。在一个实施方案中，药学赋形剂包含选自马来酸盐、tris或柠檬酸盐的缓冲液。在一个进一步的实施方案中，缓冲液是马来酸盐缓冲液。
本发明的免疫原性组合物可以包含另外的抗原，特别是上文描述为‘另外的抗原’的那些。免疫原性组合物可以包含佐剂，特别是上文描述的那些。
本发明还提供了包含本发明的免疫原性组合物的疫苗。
借助于经由全身或粘膜途径施用所述疫苗，含有本发明的免疫原性组合物的疫苗制备物可以用于保护或治疗对感染敏感的哺乳动物。这些施用可以包括经由肌内、腹膜内、皮内或皮下途径的注射；或经由粘膜施用于口/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。用于治疗肺炎或中耳炎的疫苗的鼻内施用是可能的（因为肺炎球菌的鼻咽运输（nasopharyngeal carriage）可以得到更有效地预防，从而在其最早阶段时减弱感染）。尽管本发明的疫苗可以作为单次剂量施用，但其组分也可以同时或在不同时间一起共施用（例如肺炎球菌糖类缀合物可以分开、同时或在疫苗的任何细菌蛋白质组分施用后1-2周施用，用于免疫应答就彼此而言的最佳配合）。除单一施用途径外，可以使用2个不同的施用途径。例如，糖类或糖类缀合物可以IM（或ID）施用，并且细菌蛋白质可以IN（或ID）施用。此外，本发明的疫苗可以对于致敏剂量IM施用并且对于加强剂量IN施用。
在疫苗中蛋白质抗原的含量一般在1-100μg范围中，任选5-50μg，最一般在5 - 25μg范围中。在最初疫苗接种后，受试者可以接受充分隔开的一次或几次加强免疫接种。
疫苗制备一般在Vaccine Design（“The subunit and adjuvant approach”（编辑Powell M.F. & Newman M.J.）（1995）Plenum Press New York）中描述。在脂质体内装入胶囊由Fullerton，美国专利4,235,877描述。
尽管本发明的疫苗可以通过任何途径施用，但上述疫苗施用到皮肤（ID）内构成本发明的一个实施方案。人皮肤包含外部‘角质’外皮，称为角质层，其覆盖表皮。在这个表皮下是称为真皮的层，其继而又覆盖皮下组织。研究者已显示疫苗注射到皮肤并且特别是真皮内刺激免疫应答，这还可以与许多另外的优点结合。用本文描述的疫苗的真皮内疫苗接种构成本发明的任选特点。
真皮内注射的常规技术，“曼托试验程序（mantoux procedure）”包含步骤清洁皮肤，且随后用一只手拉伸，并且用面对针向上的窄计量针（26-31规格（gauge））的斜面以10-15o的角度插入。一旦插入针的斜面，就将针的筒降低且进一步推进，同时提供轻微压力以使其在皮肤下升高。随后非常缓慢地注射液体，从而在皮肤表面上形成大疱或肿块，随后为针的缓慢撤出。
最近以来，专门设计为将液体试剂施用到皮肤内或跨越皮肤的装置已得到描述，例如WO 99/34850和EP 1092444中描述的装置，以及例如在下述中描述的喷射注射装置：WO 01/13977；US 5,480,381、US 5,599,302、US 5,334,144、US 5,993,412、US 5,649,912、US 5,569,189、US 5,704,911、US 5,383,851、US 5,893,397、US 5,466,220、US 5,339,163、US 5,312,335、US 5,503,627、US 5,064,413、US 5,520、639、US 4,596,556、US 4,790,824、US 4,941,880、US 4,940,460、WO 97/37705和WO 97/13537。疫苗制备物的真皮内施用的可替代方法可以包括常规注射器和针，或设计用于固体疫苗的弹道递送的装置（WO 99/27961），或经皮贴片（WO 97/48440；WO 98/28037）；或应用于皮肤的表面（经皮或经皮肤递送，WO 98/20734 ；WO 98/28037）。
当本发明的疫苗待施用于皮肤或更具体而言施用到真皮内时，疫苗处于低液体容积，特别是约0.05 ml - 0.2 ml的容积。
在本发明的皮肤或真皮内疫苗中的抗原含量可以类似于如在肌内疫苗中发现的常规剂量（参见上文）。然而，制剂可以是“低剂量的”，这是皮肤或真皮内疫苗的特点。相应地，在“低剂量”疫苗中的蛋白质抗原任选以少至0.1 - 10μg或0.1 - 5 μg/剂量存在；并且糖类（任选缀合的）抗原可以以0.01-1μg的范围或0.01 - 0.5 μg糖类/剂量存在。
如本文使用的，术语“真皮内递送”意指疫苗递送至皮肤中的真皮区域。然而，疫苗不一定唯一地位于真皮中。真皮是在皮肤中位于距离人皮肤表面约1.0 - 约2.0 mm的层，但在个体之间和在身体的不同部分中存在一定量的变动。一般而言，可以预期通过进入皮肤表面下1.5 mm达到真皮。真皮位于在表面上和下方的皮下层的角质层和表皮之间。取决于递送模式，疫苗最终可以单独或主要位于真皮内，或它最终可以分布在表皮和真皮内。
在本发明的一个方面，提供了疫苗试剂盒，其包括包含任选以冻干形式的本发明免疫原性组合物的小瓶，且进一步包含含有如本文描述的佐剂的小瓶。设想在本发明的这个方面，佐剂将用于重构冻干的免疫原性组合物。
本发明的一个进一步方面是针对细菌疾病感染免疫接种人宿主的方法，其包括给宿主施用免疫保护剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒。本发明的一个进一步方面是针对由肺炎链球菌和/或流感嗜血杆菌引起的感染免疫接种人宿主的方法，其包括给宿主施用免疫保护剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒。
本发明的一个进一步方面是用于在治疗或预防细菌疾病中使用的本发明的免疫原性组合物。本发明的一个进一步方面是用于在治疗或预防由肺炎链球菌和/或流感嗜血杆菌感染引起的疾病中使用的本发明的免疫原性组合物。
本发明的一个进一步方面是本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒在用于治疗或预防细菌疾病的药物制造中的用途。本发明的一个进一步方面是本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒在用于治疗或预防由肺炎链球菌和/或流感嗜血杆菌感染引起的疾病的药物制造中的用途。
本发明还提供了活化的细菌糖类，其中所述活化的细菌糖类包含式（I）的重复单位：
其中所述活化的细菌糖类包含n个重复单位，并且n是2 - 2400、20 - 2000、50 - 1500、1000 - 2000、1000 - 2500或1500 - 2300。
其中至少0.001%、0.01%、0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%或30%但小于0.001%、0.01%、0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%、30%或50%的S1是
Figure 52772DEST_PATH_IMAGE023
并且剩余部分是
Figure 935277DEST_PATH_IMAGE024
其中S2是 
Figure 163128DEST_PATH_IMAGE025
或者
Figure 105676DEST_PATH_IMAGE026
并且其中S3是 
Figure 481293DEST_PATH_IMAGE027
 或者
Figure 839594DEST_PATH_IMAGE028
。
在一个实施方案中，小于0.001%、0.1%、0.5% 1%、2%、3%、5%、10%、30%或50%的S2是
Figure 312163DEST_PATH_IMAGE029
。
在一个实施方案中，小于0.1%、0.5%、1%、2%、3%、5%、10%、30%或50%的S3是
Figure 360366DEST_PATH_IMAGE030
。
为了本发明的目的，“约”或“大约”定义为在给定数字的多或少10%内。
在每一种情况下，术语“包含”在本文中由本发明人预期为任选地可与术语“由……组成”替代。
在本文中涉及本发明的“疫苗组合物”的实施方案也可应用于涉及本发明的“免疫原性组合物”的实施方案，并且反之亦然。
在本专利说明书内引用的所有参考文献或专利申请引入本文作为参考。
为了可以更好地理解本发明，阐述下述实施例。这些实施例仅为了举例说明的目的，并且不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1 –使用高碘酸盐的23F和6B氧化
将多糖（PS）23F或6B溶解于100mM KH2PO4（pH 7.4）、10mM KH2PO4或WFI中，以形成2mg PS/ml的溶液。将溶液在搅动下在室温孵育2小时。在这个时间后，将pH用1NHCl调整至pH 6.0。将高碘酸盐作为粉末或以液体形式（在WFI中10mg/ml）以各种量加入，以实现一系列摩尔比（表1）。将溶液在室温（20-25℃）孵育17小时，在这个时间后将样品针对WFI透析或渗滤。
与折射率和多角度激光散射（MALLS-）检测器偶联的高效凝胶过滤层析用于测量分子量。尺寸排阻介质（TSK5000PWXL-Tosoh）用于概况分析多糖的分子大小分布（在NaCl 0.2M-NaN3 0.02%中洗脱0.5ml/分钟）。
表1和图1描述了这些实验的结果。这些证实对于23F糖类，大量筛分在使用在100mM磷酸盐缓冲液中的高摩尔当量的高碘酸盐的氧化时发生。这种筛分效应可以通过减少磷酸盐缓冲液的浓度或使用的高碘酸盐的摩尔当量得到减少。
表1：
Figure 223280DEST_PATH_IMAGE031
实施例2 –使用还原胺化和CDAP化学法的23F与CRM197缀合
还原胺化
将1g PS23F溶解于500ml 10mM KH2PO4，pH 7.15中。将这种溶液在室温孵育2小时。将pH用1M HCl调整至pH 6.0N。将111mg高碘酸盐（NaIO4，0.4摩尔当量的高碘酸盐）加入PS23F溶液中，并且将溶液在黑暗中在室温孵育17小时，以氧化PS23F。随后将溶液针对WFI渗滤。
在稳定剂的存在下，将活化的PS23F与CRM197蛋白质一起（以CRM/PS比值（w/w）: 0.625）冻干。
通过加入350ml DMSO溶剂且在室温孵育2小时，将900mg冻干的PS23F/CRM197混合物溶解。为了减少PS23F/CRM197混合物，加入1摩尔当量的NaBH3CN（735μl在WFI中的100mg/ml溶液）。将溶液在搅动下在室温（15℃-25℃）进一步孵育40小时。在这个时间后，加入2摩尔当量的NaBH4（在WFI中100mg/ml），并且将溶液在室温孵育4小时。在通过DEAE渗滤（截止100kDa）和纯化前，加入2200ml 150mM NaCl。将目的级分合并且通过0.22μm滤器过滤。
CDAP
将200mg微流化的PS23F溶解于水中，直至获得10mg/ml的浓度。将NaCl以2M的终浓度加入这种溶液中。
加入足够的CDAP溶液（在5/50 v/v乙腈/WFI中新鲜制备的100mg/ml），以达到0.75mg/mg PS的CDAP:PS比值。
在90秒后，通过加入0.1N NaOH将pH升高至pH 9.5。
3分钟后，加入足够的CRM197（在0.15M NaCl中10mg/ml），以达到1.5（CRM197:PS（w/w））的比值，将pH维持在pH 9.5。将这个溶液在pH 9.5孵育1小时。
在这个偶联步骤后，将10ml 2M甘氨酸溶液加入混合物中，将pH调整至pH9.0（猝灭pH）。将溶液在室温搅拌30分钟。使用5μm滤器随后为Sephacryl S400HR（XK50/100）纯化缀合物，所述Sephacryl S400HR去除小分子和未缀合的多糖和蛋白质。将流速固定在150ml/小时。使用150mM NaCl实现洗脱。将目的级分合并且使用Milipack 20过滤。所得到的缀合物具有1.35/w的最终CRM197/PS比值（w/w）。
实施例3 –通过还原胺化和CDAP化学法制备的23F-CRM197缀合物的免疫原性
使用实施例2中所述的方法制备缀合物。将雌性豚鼠用0.25μg PS23F-CRM197缀合物肌内免疫接种三次（在第0、14和28天时）。将动物在第42天时放血，并且通过ELISA和OPA测量针对PS23F的抗体应答。
ELISA
将微板用在PBS缓冲液中的纯化肺炎球菌多糖包被。将板用0.9% NaCl和0.05% Tween 20洗涤四次。将血清在37℃与CPS（V/V）一起在PBS 0.05 % Tween 20中孵育1小时。将血清加入微孔中且在PBS- 0.05% Tween中连续稀释（两倍稀释步骤）。将板在搅动下在室温孵育30分钟。将板如上洗涤且加入抗豚鼠IgG抗体过氧化物酶缀合物，随后将板在RT孵育30分钟。在洗涤后，将底物（在10 ml 柠檬酸盐0.1M pH 4.5和5 μl H2O2中的4 mg OPDA）加入每个孔15分钟。通过加入HCl 1N停止反应。使用分光光度计在490-620 nm处阅读吸光度。发展的颜色与血清中存在的抗体量成正比。通过与每块板上加入的参考曲线血清比较来测定血清中存在的抗PS IgG的水平，且以μg/ml表示。
在假定方差的同质性（通过Cochrans’s C检验检查）和正态性（使用Shapiro-Wilk检验检查）后统计分析结果。对于对数转化浓度IgG使用Anova（Tukey-HSD）进行所有统计学。
调理吞噬
将血清样品在56℃加热45分钟，以失活任何剩余的内源补体。将每种1:2稀释的血清样品的二十五微升等分试样在96孔圆底微量滴定板每孔的25 μl OPA缓冲液（HBSS–14.4%失活的FBS）中连续稀释（两倍）。随后，将25 μl活化的HL-60细胞（1 × 107细胞/ml）、新鲜解冻的肺炎球菌工作种子和新鲜解冻的幼兔补体的混合物以例如4/2/1比值（v/v/v）加入稀释的血清中，以获得50 μl的终体积。将测定板在37℃伴随轨道振荡（210 rpm）孵育2小时，以促进吞噬过程。通过将微板在冰上放置至少1分钟来停止反应。随后将板的每孔的20 μl等分试样转移到96孔平底微板的相应孔内，并且将50 μl Todd–Hewitt Broth–0.9%琼脂加入每个孔中。在37℃和5% CO2过夜孵育后，使用自动化图像分析系统（KS 400，Zeiss，Oberkochen，德国）计数琼脂中出现的肺炎球菌菌落。不含血清样品的八个孔用作细菌对照，以测定肺炎球菌数目/孔。测定对照孔的CFU的平均数目且用于计算关于每个血清样品的杀死活性。通过能够促进肺炎球菌的50%杀死的血清的倒数稀释度测定关于血清样品的OPA滴度。通过使用4参数曲线拟合分析计算调理吞噬滴度。
在假定方差的同质性（通过Cochrans’s C检验检查）和正态性（使用Shapiro-Wilk检验检查）后统计分析结果。对于ELISA的对数转化浓度IgG通过Anova（Tukey-HSD），并且对于OPA的对数稀释度通过Kruskal-Wallis进行所有统计学。
如图2中可见，在用通过还原胺化缀合的PS23F-CRM197免疫接种后比通过CDAP化学法缀合的PS23F-CRM197在豚鼠中诱导明显更高的抗体应答。  
测定 通过还原胺化制备的23F-CRM197 通过CDAP制备的23F-CRM197
ELISA滴度（μg/ml） 213.3 40.5
OPA（50% 杀死） 9232 591
表2。
实施例4 – 23F的还原胺化的进一步例子
23F-CRM-RA-116
将150 mg天然的PS23F（PS23FP114）以2 mg/ml的浓度溶解于10 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.2）中4小时。在溶解后，将pH用1N HCl调整至pH 6.0。随后将0.4摩尔当量的高碘酸盐（NaIO-4）加入PS溶液中，并且在黑暗中在25℃孵育17小时。随后将溶液针对WFI渗滤（截止30 kDa），并且将氧化的PS在0.22 μm膜上过滤。
在稳定剂的存在下，将50 mg氧化的PS和75 mg CRM197一起冻干（CRM/PS比值（w/w）: 1.5/1）。将冻干的PS + CRM197用20 ml DMSO在室温（15-25℃）溶解2小时。随后加入1摩尔当量的TAB（三乙酰氧基硼氢化钠）（13.7 mg），并且在搅动下17小时后，加入2摩尔当量的NaBH4（在0.1M NaOH中100mg/ml），随后在室温孵育30分钟。通过加入WFI随后针对10 mM磷酸盐缓冲液、150 mM NaCl  pH 7.2渗滤（截止30 kDa）将溶液稀释5x。随后将缀合物装载到DEAE树脂上，并且在10 mM磷酸盐缓冲液、500 mM NaCl pH 7.2中洗脱。最后将缀合物在0.22 μm上过滤。所得到的缀合物具有2.3 /1的最终CRM/PS比值（w/w）。
关于进一步的缀合物，在DEAE柱后添加第二个渗滤步骤，以便改变缓冲液（150 mM NaCl作为最终缓冲液）。
实施例5 –使用还原胺化（使用不同的蛋白质:糖类比值和不同大小的微流化6B糖类）和CDAP化学法的6B与CRM197的缀合
6B-CRM-RA-122
将200 mg微流化的PS6B（84 kDa，11.7 mg/ml）以2 mg/ml在10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.2）中稀释。将pH用1N HCl调整至pH 6.0。随后将0.1摩尔当量的高碘酸盐（Na IO-4）加入PS溶液中，并且在黑暗中在室温孵育17小时。随后将溶液针对WFI渗滤（截止30 kDa）。在稳定剂的存在下，将50 mg PS和30 mg CRM197一起冻干（CRM/PS比值（w/w）: 0.6/1）。将冻干的PS + CRM197用20 ml DMSO在室温溶解3小时。随后加入2.5摩尔当量的TAB（三乙酰氧基硼氢化钠）（38.7 mg），并且在搅动下16小时后，加入2摩尔当量的NaBH4（在0.1M NaOH中100mg/ml），随后在室温孵育30分钟。通过加入WFI随后渗滤（截止100 kDa）将溶液稀释4x。随后将缀合物在0.22 μm上过滤。所得到的缀合物具有1.1/1的最终CRM/PS比值（w/w）。
6B-CRM-RA-123：
如对于6B-CRM-RA-122所述，将微流化的PS6B（84 kDa）与CRM197缀合，除了使用2/1的起始CRM197/PS比值（w/w）进行冷冻干燥步骤，并且30ml DMSO用于DMSO步骤中的溶解（代替20 ml）外。所得到的缀合物具有3.0/1的最终CRM/PS比值（w/w）。
6B-CRM-RA-124：
将200 mg具有350 kDa分子量的微流化的PS6B（350 kDa，11.7 mg/ml）在10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.2）中稀释至2 mg/ml。将pH用1N HCl调整至pH 6.0。随后将0.1摩尔当量的高碘酸盐（Na IO-4）加入PS溶液中，并且在黑暗中在室温孵育17小时。随后将溶液针对WFI渗滤（截止100 kDa）。在稳定剂的存在下，将50 mg PS和60 mg CRM197一起冻干（CRM/PS比值（w/w）: 1.2/1）。将冻干的PS + CRM197用20 ml DMSO在室温溶解5小时。随后加入2.5摩尔当量的TAB（三乙酰氧基硼氢化钠）（38.7 mg），并且在搅动下16小时后，加入2摩尔当量的NaBH4（在0.1M NaOH中100mg/ml），随后在室温孵育30分钟。通过加入WFI随后渗滤（截止100 kDa）将溶液稀释4x。随后将缀合物在0.22 μm上过滤。所得到的缀合物具有1.6/1的最终CRM/PS比值（w/w）。
6B-CRM-RA-125：
如对于6B-CRM-RA-124所述，将微流化的PS6B（350 kDa）与CRM197缀合，除了使用2/1的起始CRM197/PS比值（w/w）进行冷冻干燥步骤，并且使用33 ml（代替20 ml）进行DMSO步骤中的溶解外。所得到的缀合物具有2.9/1的最终CRM/PS比值（w/w）。
6B-CRM-003：
将50 mg微流化的PS6B在水（10 mg/ml）中以10 mg/ml稀释。加入以固体形式的NaCl，以达到2M的终浓度。加入CDAP溶液（在50/50 v/v乙腈/WFI中新鲜制备的100 mg/ml），以达到合适的CDAP/PS比值（1.5 mg/mg PS）。在1.5分钟后，通过加入0.1N NaOH将pH升高至活化pH 9.5，并且在这个pH稳定直至CRM197添加时。在3分钟后，加入CRM197（在0.15 M NaCl 中10 mg/ml），以达到CRM197 /PS（w/w）比值2；pH维持在偶联pH 9.5。将溶液在pH调节下静置2小时。
在偶联步骤后，将2.5 ml 2M甘氨酸溶液加入混合物中，将pH调整至猝灭pH（pH 9.0）。将溶液在室温搅拌30分钟。使用5 μm滤器将缀合物过滤且注射到Sephacryl S400HR（XK50/100）柱上，以去除小分子（包括DMAP）和未缀合的PS和蛋白质。将流速固定在30 ml/小时。在150mM NaCl中进行洗脱。将目的级分合并且在Milipack 20上过滤。所得到的缀合物具有1.5/1的最终CRM197/PS比值（w/w）。
6B-CRM-RA-144
将1 g微流化的PS6B（245 kDa，9.47 mg/ml）在10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.2）中稀释至2 mg/ml。将pH用1N HCl调整至pH 6.0。随后将0.1摩尔当量的高碘酸盐（NaIO-4）加入PS溶液中，并且在黑暗中在室温孵育18小时。随后将溶液针对WFI（Sartocon Slice200 Hydrosart 100kDa）渗滤。在稳定剂的存在下，将200 mg氧化的PS和240 mg CRM197一起冻干（CRM/PS比值（w/w）: 1.2/1）。将冻干的PS + CRM197用80 ml DMSO在25℃溶解6小时。随后加入2.5摩尔当量的TAB（三乙酰氧基硼氢化钠）（154.9 mg），并且在搅动下在25℃16小时后，加入2摩尔当量的NaBH4（在0.1M NaOH中100mg/ml），并且孵育30分钟。将溶液在WFI中稀释5x，并且在30分钟后用150 mM NaCl渗滤10x，并且随后用PO4（K/K2）10mM  pH7.2+ 150 mM NaCl（Sartorius Sartocon Slice 200 Hydrosart 100 kDa）渗滤5x。随后将渗余物装载到DEAE柱（XK26/40）上。将该柱用PO4（K/K2）10mM pH7.2 /NaCl 150mM缓冲液洗涤。将缀合物用PO4（K/K2）10mM pH7.2 /NaCl 500 mM缓冲液洗脱。将洗脱物浓缩且用5体积的150 mM NaCl渗滤，且随后在0.22 μm滤器上过滤。所得到的缀合物具有1.6/1的最终CRM/PS比值（w/w）。
实施例6 –通过还原胺化和CDAP化学法制备的6B-CRM197缀合物的免疫原性
用在AlPO4上配制的通过还原胺化或CDAP化学法产生的0.1 μg PS6B缀合物，将40只雌性Balb/c小鼠（4周龄）的组在第0、14和28天时肌内免疫接种三次。PS6B-PD用作基准。将小鼠在第42天时放血，并且通过ELISA和OPA测量针对每种抗原的抗体应答。
用AlPO4佐剂化（AlPO4）的通过还原胺化或CDAP化学法产生的0.25 μg PS6B缀合物，将20只雌性豚鼠（150克，来自Hartley）的组在第0、14和28天时肌内免疫接种三次。PS6B-PD用作基准。将豚鼠在第42天时放血，并且通过ELISA和OPA测量针对每种抗原的抗体应答。
小鼠和豚鼠OPA
将血清样品在56℃加热45分钟，以失活任何剩余的内源补体。将每种1:2稀释的血清样品的二十五微升等分试样在96孔圆底微量滴定板每孔的25 μl OPA缓冲液（HBSS–14.4%失活的FBS）中两倍连续稀释。随后，将25 μl活化的HL-60细胞（1 × 107细胞/ml）、新鲜解冻的肺炎球菌工作种子和新鲜解冻的幼兔补体的混合物以例如4/2/1比值（v/v/v）加入稀释的血清中，以获得50 μl的终体积。将测定板在37℃伴随轨道振荡（210 rpm）孵育2小时，以促进吞噬过程。通过将微板在冰上放置至少1分钟来停止反应。随后将板的每孔的20 μl等分试样转移到96孔平底微板的相应孔内，并且将50 μl Todd–Hewitt Broth–0.9%琼脂加入每个孔中。在37℃和5% CO2过夜孵育后，使用自动化图像分析系统（KS 400，Zeiss，Oberkochen，德国）计数琼脂中出现的肺炎球菌菌落。不含血清样品的八个孔用作细菌对照，以测定肺炎球菌数目/孔。测定对照孔的CFU的平均数目且用于计算关于每个血清样品的杀死活性。通过能够促进肺炎球菌的50%杀死的血清的倒数稀释度测定关于血清样品的OPA滴度。通过使用4参数曲线拟合分析计算调理吞噬滴度。
表3描述了通过用使用实施例4的方法制备的缀合物免疫接种balb/c小鼠获得的GMC水平。  
Figure 447588DEST_PATH_IMAGE032
表3。
这些缀合物在balb/c小鼠中的免疫原性在图3中描述。连同图3和表3证实在小鼠模型中，通过还原胺化产生的缀合物与使用CDAP化学法产生的那些可比较。特别地，图3证实使用还原胺化产生的缀合物的免疫原性高于使用CDAP化学法制备的缀合物的免疫原性。
表4描述了通过用使用实施例4的方法制备的缀合物免疫接种豚鼠获得的GMC水平。  
Figure 446768DEST_PATH_IMAGE033
表4。
这些缀合物在豚鼠中的免疫原性在图4中描述。类似于在小鼠模型中进行的实验，表4和图4中的结果显示通过还原胺化产生的缀合物与使用CDAP化学法产生的那些可比较，特别地，PS06B-CRM125证实比使用CDAP产生的缀合物明显更高的GMC水平和免疫原性。
实施例7使用还原胺化的Hib与破伤风类毒素的缀合
Hib-IO4-LS080
将2.9 g PS（苔黑酚剂量，AHIBCPA007批次）在室温溶解于260 ml 10 mM磷酸盐缓冲液（Na/K2）pH 6.2中4小时30分钟，并且随后在+4℃过夜。在溶解过程中完成粘度跟踪观察。在4小时溶解后，粘度看起来是稳定的。将PS用磷酸盐缓冲液以10 mg/ml稀释，并且随后在60分钟过程中在黑暗中用0.07摩尔当量的NaIO4氧化。将氧化的PS针对3.5体积的磷酸盐缓冲液渗滤（Sartorius Hydrosart 2 kDa），且随后在0.22μm滤器上过滤。通过1H-NMR估计在氧化后获得的重复单位的数目，并且发现是约21。
Hib-TT-LS210、212和213
将200 mg氧化的PS（14.56 mg/ml）与300 mg TT（31.18 mg/ml，TT/PS比值（w/w）: 1.5/1）混合，并且用36.64 ml 10 mM磷酸盐缓冲液（Na/K2）pH 6.2稀释至4 mg/ml。在稳定剂的存在下将溶液冻干。将冻干的PS + TT用20 ml DMSO在25℃溶解6小时。随后加入10毫克当量的TAB（三乙酰氧基硼氢化钠）（38.7 mg），并且在搅动下16小时后，加入2摩尔当量的NaBH4（在0.1M NaOH中100mg/ml），随后在室温孵育30分钟。通过加入WFI随后为渗滤步骤（5体积的WFI随后为5体积的10 mM乙酸盐缓冲液150 mM NaCl pH 6.2，100 kDa MWCO），将溶液稀释3x。随后将样品装载到Sephacryl S300HR树脂上。使用150 mM NaCl（pH 6.2）在10 mM乙酸盐缓冲液中进行洗脱。将目的级分合并且在0.22μm滤器上过滤。所得到的缀合物具有2.1/1的最终TT/PS比值（w/w）。

Claims (110)

1.一种用于缀合细菌糖类的方法，其包括步骤
a）将所述细菌糖类与0.001-0.7、0.005-0.5、0.01-0.5、0.1-1.2、0.1-0.5、0.1-0.2、0.5-0.8、0.1-0.8、0.3-1.0或0.4-0.9摩尔当量的高碘酸盐反应，以形成活化的细菌糖类；
b）将所述活化的细菌糖类与载体蛋白质混合；
c）将所述活化的细菌糖类和所述载体蛋白质与还原剂反应，以形成缀合物；
或
a）将所述细菌糖类与0.001-0.7、0.005-0.5、0.01-0.5、0.1-1.2、0.1-0.5、0.1-0.2、0.5-0.8、0.1-0.8、0.3-1.0或0.4-0.9摩尔当量的高碘酸盐反应，以形成活化的细菌糖类；
b）将所述活化的细菌糖类与接头混合；
c'）使用还原剂将所述活化的细菌糖类与所述接头反应，以形成细菌糖类-接头；
d）将所述细菌糖类-接头与载体蛋白质反应，以形成缀合物；
其中步骤a）在不含胺基团的缓冲液中发生，并且所述缓冲液具有1-100mM的浓度。
2.权利要求1的方法，其中所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。
3.权利要求1-2中任一项的方法，其中所述缓冲液是无机缓冲液。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述缓冲液是磷酸盐缓冲液。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述缓冲液具有1-50mM、1-25mM、1-10mM、5-15mM、8-12mM、或10-50mM或约10mM的浓度。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述步骤a）中的pH是pH 3.5-8.0、5.0-7.0、或pH 5.5-6.5或约pH 6.0。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述细菌糖类包含细菌荚膜糖类。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述细菌糖类源于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、沙门氏菌Vi或表皮葡萄球菌。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述细菌糖类选自1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的肺炎链球菌荚膜糖类。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述细菌糖类选自5、6B、6A、7F、9V、14、19F或23F。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述细菌糖类是肺炎链球菌荚膜糖类23F。
12.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述细菌糖类是肺炎链球菌荚膜糖类6B。
13.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述细菌糖类是肺炎链球菌荚膜糖类6A。
14.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述细菌糖类是流感嗜血杆菌b（Hib）多糖或寡糖。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述细菌糖类含有邻位二醇。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述细菌糖类是天然多糖，或在大小中减少不超过x20倍（例如通过微流化）。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中在步骤a）前，所述细菌糖类是微流化的。
18.权利要求16-17中任一项的方法，其中所述天然多糖的平均分子量是20kDa - 2000kDa或30kDa - 1000kDa。
19.权利要求18的方法，其中所述天然多糖的平均分子量是750-1500 kDa。
20.权利要求18的方法，其中所述天然多糖的平均分子量是100 - 250 kDa。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其中在步骤a）前，所述细菌糖类的平均分子量是1-1100kDa、100-470kDa、200-300kDa、600-1100kDa或800-1000kDa。
22.权利要求11的方法，其中在步骤a）后，所述23F糖类的平均分子量是100-470kDa或200-300kDa。
23.权利要求14的方法，其中在步骤a）后，所述Hib细菌糖类的平均分子量是1 - 50 kDa或5 - 10kDa。
24.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述载体蛋白质选自破伤风类毒素、破伤风类毒素的片段C、白喉类毒素、CRM197、肺炎球菌溶血素、蛋白质D、PhtD、PhtDE和N19。
25.权利要求1-25中任一项的方法，其中步骤a）在黑暗中进行。
26.权利要求15的方法，其中小于0.001%、0.01%、0.1%、0.5%、1%、2%或5%的所述细菌糖类的邻位二醇在步骤a）过程中变得氧化。
27.权利要求26的方法，其中在步骤c）过程中，所述羰基与所述载体蛋白质上的氨基反应。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中在步骤a）中，所述细菌糖类以0.2g/l - 14 g/l、8g/l - 12g/l、10g/l - 12g/l、1g/l - 4g/l 0.2g/l - 1g/l或0.4g/l - 0.6g/l的浓度存在。
29.权利要求1-28中任一项的方法，其中在步骤b）中，所述载体蛋白质的起始浓度是05.g/l - 35 g/l、25g/l - 35g/l、或0.5g/l - 5g/l。
30.权利要求1-29中任一项的方法，其中在步骤b）中，所述活化的细菌糖类的起始浓度是0.2g/l - 20g/l、10g/l - 28g/l、或0.2g/l - 4g/l。
31.权利要求1-30中任一项的方法，其中在步骤b）中，所述活化的细菌糖类的起始比值是2.0:1至0.1:1、1.8:1至0.4:1、1:1至1.4:1、1.8:1至1.6:1、1.4:1至1.6:1、0.8:1至0.4:1、0.7:1至0.5:1、或0.7:1至0.6:1（wt/wt）。
32.权利要求1-31中任一项的方法，其中在步骤c）或c’）后，所述载体蛋白质与细菌糖类的最终比值是0.5:1至4:1、0.8:1至3.2:1、0.5:1至1.8:1、1.4:1至1.8:1、1:1至1.2:1、2:1至2.4:1、或2.5:1至3.5:1。
33.权利要求1-32中任一项的方法，其中在步骤a）中的所述反应温度维持在4-40℃、10-32℃、17-30℃或22-27℃。
34.权利要求1-33中任一项的方法，其中在步骤c）中的所述反应温度维持在4-40℃、10-32℃、17-30℃或22-27℃。
35.权利要求1-34中任一项的方法，其中步骤a）具有小于30小时或15 - 25 小时、或10 - 20 小时、30分钟 – 25小时、1小时 – 35小时的持续时间。
36.权利要求1-35中任一项的方法，其中步骤c）具有10 - 60 小时或20 - 60 小时的持续时间。
37.权利要求1-36中任一项的方法，其中所述活化的细菌糖类与所述载体蛋白质直接缀合。
38.权利要求1-36中任一项的方法，其中所述活化的细菌糖类通过接头与所述载体蛋白质缀合。
39.权利要求38的方法，其中所述接头是长度1 - 20埃。
40.权利要求38或39中任一项的方法，其中所述接头包含ADH接头。
41.权利要求1-40中任一项的方法，其中所述还原剂包含氰基硼氢化物。
42.权利要求1-40中任一项的方法，其中所述还原剂包含三乙酰氧基硼氢化钠。
43.权利要求42的方法，其中0.5 - 2或0.8 - 1.2摩尔当量的还原剂用于步骤c）中。
44.权利要求43的方法，其中2 - 10摩尔当量的还原剂用于步骤c）中。
45.权利要求1-44中任一项的方法，其中任何未反应的羰基通过与硼氢化钠（NaBH4）反应进行加帽。
46.权利要求45的方法，其中使用约2M当量的硼氢化钠。
47.权利要求45或46中任一项的方法，其中所述步骤c）的产物与硼氢化钠反应15分钟-15小时、 15分钟-45分钟、 2-10小时或3-5小时。
48.权利要求1-47中任一项的方法，其中在步骤b）前，所述活化的细菌糖类和所述载体蛋白质是冻干的。
49.权利要求1-48中任一项的方法，其中在步骤c）前，所述活化的细菌糖类和所述载体蛋白质是冻干的。
50.权利要求48-49中任一项的方法，其中所述活化的细菌糖类和所述载体蛋白质在非还原糖的存在下冻干。
51.权利要求48-50中任一项的方法，其中所述非还原糖包括蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、松三糖、右旋糖酐、甘露醇、拉克替醇和palatinit。
52.权利要求1-51中任一项的方法，步骤b）和/或c）在DMSO溶剂中进行。
53.权利要求1-51中任一项的方法，步骤b）和/或c）在DMF溶剂中进行。
54.权利要求1-53中任一项的方法，其包含纯化所述缀合物的另外步骤e）。
55.权利要求54的方法，其中步骤e）包含使用渗滤纯化所述缀合物。
56.权利要求54-55中任一项的方法，其中步骤e）包含使用离子交换层析纯化所述缀合物。
57.权利要求56的方法，其中步骤e）包含使用尺寸排阻层析纯化所述缀合物。
58.权利要求1-57中任一项的方法，其包含其中将所述缀合物无菌过滤的另外步骤f）。
59.权利要求1-58中任一项的方法，其含有将所述缀合物与另外的抗原混合的另外步骤。
60.权利要求59的方法，其中所述另外的抗原包含选自1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、 17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种肺炎链球菌糖类。
61.权利要求59-60中任一项的方法，其中所述另外的抗原包含肺炎链球菌糖类4、9V、14、18C和19F。
62.权利要求59-61中任一项的方法，其中所述另外的抗原包含肺炎链球菌糖类19A。
63.权利要求59-62中任一项的方法，其中所述另外的抗原包含肺炎链球菌糖类6A。
64.权利要求50-63中任一项的方法，其中所述另外的抗原包含肺炎链球菌糖类1。
65.权利要求59-64中任一项的方法，其中所述另外的抗原包含肺炎链球菌糖类5。
66.权利要求59-65中任一项的方法，其中所述另外的抗原包含肺炎链球菌糖类7F。
67.权利要求59-66中任一项的方法，其中所述另外的抗原包含肺炎链球菌糖类3。
68.权利要求59-67中任一项的方法，其中所述另外的抗原包含肺炎链球菌糖类23F。
69.权利要求59-68中任一项的方法，其中所述另外的抗原包含肺炎链球菌糖类6B。
70.权利要求59-70中任一项的方法，其中所述另外的抗原包含肺炎链球菌糖类6B。
71.权利要求59-70中任一项的方法，其中所述另外的抗原包含选自聚组氨酸三联体家族（PhtX）、胆碱结合蛋白家族（CbpX）、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白质（或融合物）、肺炎球菌溶血素（Ply）、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133的一种或多种肺炎链球菌蛋白质。
72.权利要求60-71中任一项的方法，其中所述另外的抗原包含白喉类毒素（DT）、破伤风类毒素（TT）、和被杀死的全细胞百日咳博得特菌（Bordetella pertussis）（Pw）、或两种或更多种无细胞百日咳组分（Pa）。
73.权利要求60-72中任一项的方法，其中所述另外的抗原包含乙型肝炎表面抗原（HepB）。
74.权利要求60-73中任一项的方法，其中所述另外的抗原包含流感嗜血杆菌b（Hib）多糖或寡糖。
75.权利要求60-74中任一项的方法，其中所述另外的抗原包含载体蛋白质和选自下述的细菌的荚膜多糖的一种或多种缀合物：脑膜炎奈瑟菌A型（MenA）、脑膜炎奈瑟菌C型（MenC）、脑膜炎奈瑟菌W型（MenW）和脑膜炎奈瑟菌Y型（MenY）。
76.权利要求1-75中任一项的方法，其中将所述缀合物与佐剂混合。
77.权利要求76的方法，其中所述佐剂是铝盐。
78.权利要求1-77中任一项的方法，其中将所述缀合物与药学可接受的赋形剂混合。
79.一种可通过权利要求1-78中任一项的方法获得的缀合物。
80.一种通过权利要求1-78中任一项的方法获得的缀合物。
81.一种免疫原性组合物，其包含权利要求79-80中任一项的缀合物和药学可接受的赋形剂。
82.权利要求81的免疫原性组合物，其中所述药学赋形剂不含氯化物盐。
83.权利要求81-82中任一项的免疫原性组合物，其中所述药学赋形剂包含缓冲液。
84.权利要求83的免疫原性组合物，其中所述缓冲液是马来酸盐缓冲液。
85.权利要求84的免疫原性组合物，其包含至少一种另外的抗原。
86.权利要求86的免疫原性组合物，其中所述另外的抗原包含选自1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的肺炎链球菌糖类。
87.权利要求85-86中任一项的免疫原性组合物，其中所述另外的抗原包含肺炎链球菌糖类4、9V、14、18C和19F。
88.权利要求85-87中任一项的免疫原性组合物，其中所述另外的抗原包含肺炎链球菌糖类19A。
89.权利要求85-88中任一项的免疫原性组合物，其中所述另外的抗原包含肺炎链球菌糖类6A。
90.权利要求85-89中任一项的免疫原性组合物，其中所述另外的抗原包含肺炎链球菌糖类1。
91.权利要求85-90中任一项的免疫原性组合物，其中所述另外的抗原包含肺炎链球菌糖类5。
92.权利要求85-91中任一项的免疫原性组合物，其中所述另外的抗原包含肺炎链球菌糖类7F。
93.权利要求85-92中任一项的免疫原性组合物，其中所述另外的抗原包含肺炎链球菌糖类3。
94.权利要求85-93中任一项的免疫原性组合物，其中所述另外的抗原包含肺炎链球菌糖类23F。
95.权利要求85-94中任一项的免疫原性组合物，其中所述另外的抗原包含肺炎链球菌糖类6B。
96.权利要求85-95中任一项的免疫原性组合物，其中所述另外的抗原包含肺炎链球菌糖类6C。
97.权利要求85-96中任一项的免疫原性组合物，其中所述另外的抗原包含选自聚组氨酸三联体家族（PhtX）、胆碱结合蛋白家族（CbpX）、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白质（或融合物）、肺炎球菌溶血素（Ply）、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133的一种或多种肺炎链球菌蛋白质。
98.权利要求85-97中任一项的免疫原性组合物，其中所述另外的抗原包含白喉类毒素（DT）、破伤风类毒素（TT）、和被杀死的全细胞百日咳博得特菌（Bordetella pertussis）（Pw）、或两种或更多种无细胞百日咳组分（Pa）。
99.权利要求85-98中任一项的免疫原性组合物，其中所述另外的抗原包含流感嗜血杆菌b（Hib）多糖或寡糖。
100.权利要求85-99中任一项的免疫原性组合物，其中所述另外的抗原包含乙型肝炎表面抗原（HepB）。
101.权利要求85-100中任一项的免疫原性组合物，其中所述另外的抗原包含载体蛋白质和选自下述的细菌的荚膜多糖的一种或多种缀合物：脑膜炎奈瑟菌A型（MenA）、脑膜炎奈瑟菌C型（MenC）、脑膜炎奈瑟菌W型（MenW）和脑膜炎奈瑟菌Y型（MenY）。
102.权利要求85-101中任一项的免疫原性组合物，其另外包含佐剂。
103.权利要求102的免疫原性组合物，其中所述佐剂是铝盐。
104.一种疫苗，其包含权利要求81-103中任一项的免疫原性组合物。
105.权利要求81-103中任一项的免疫原性组合物或权利要求104的疫苗在预防或治疗细菌疾病中的用途。
106.权利要求81-103中任一项的免疫原性组合物或权利要求104的疫苗在制备用于预防或治疗细菌疾病的药物中的用途。
107.一种预防或治疗细菌感染的方法，其包括给患者施用权利要求81-103中任一项的免疫原性组合物或权利要求104的疫苗。
108.一种活化的细菌糖类，其中所述活化的细菌糖类包含式（I）的重复单位：
Figure 667355DEST_PATH_IMAGE001
其中所述活化的细菌糖类包含n个重复单位，并且n是2 - 2400、500 - 2000、750 - 1500、1000 - 2000或1500 – 2300.
其中至少 0.001%但小于50%的S1是
Figure 584495DEST_PATH_IMAGE002
并且剩余部分是 
其中S2是 
Figure 634808DEST_PATH_IMAGE004
或者
Figure 449180DEST_PATH_IMAGE005
并且其中S3是
Figure 209326DEST_PATH_IMAGE006
或者
Figure 434550DEST_PATH_IMAGE007
。
109.权利要求108的化合物，其中小于0.001%、0.1%、0.5% 1%、2%、3%、5%、10%、30%或50%的S2是
Figure 633450DEST_PATH_IMAGE008
。
110.权利要求108或109的化合物，其中小于0.1%、0.5%、1%、2%、3%、5%、10%、30%或50%%的S3是
Figure 240012DEST_PATH_IMAGE009
。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103402544A (zh) * 2011-03-07 2013-11-20 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 缀合方法
CN105934251A (zh) * 2014-01-21 2016-09-07 辉瑞大药厂 肺炎链球菌荚膜多糖及其缀合物
CN106413747A (zh) * 2014-01-21 2017-02-15 辉瑞大药厂 肺炎链球菌荚膜多糖及其缀合物

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
GB0505518D0 (en) * 2005-03-17 2005-04-27 Chiron Srl Combination vaccines with whole cell pertussis antigen
US8431136B2 (en) * 2005-06-27 2013-04-30 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
GB201003922D0 (en) * 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
WO2012025873A2 (en) 2010-08-23 2012-03-01 Wyeth Llc STABLE FORMULATIONS OF NEISSERIA MENINGITIDIS rLP2086 ANTIGENS
PE20140173A1 (es) 2010-09-10 2014-02-20 Wyeth Llc Variantes no lipidadas de antigenos orf2086 de neisseria meningitidis
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
SG10201602558UA (en) 2012-03-09 2016-05-30 Pfizer Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
MX2014014067A (es) * 2012-05-22 2015-02-04 Novartis Ag Conjugado de serogrupo x de meningococo.
EP3363806B1 (en) * 2012-12-20 2022-11-16 Pfizer Inc. Glycoconjugation process
EP2964665B1 (en) 2013-03-08 2018-08-01 Pfizer Inc Immunogenic fusion polypeptides
PL404247A1 (pl) 2013-06-07 2014-12-08 Wrocławskie Centrum Badań Eit + Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością Koniugat oligocukru LOS Bordetella pertussis i toksyny krztuśca i jego zastosowanie w profilaktyce i leczeniu zakażeń wywoływanych przez Bordetella pertussis
CA2923129C (en) 2013-09-08 2020-06-09 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
PE20212335A1 (es) 2014-01-21 2021-12-16 Pfizer Composiciones inmunogenicas que comprenden antigenos sacaridos capsulares conjugados y usos de los mismos
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
BR112017017460A2 (pt) 2015-02-19 2018-04-10 Pfizer Inc. composições de neisseria meningitidis e métodos das mesmas
US11058757B2 (en) 2016-03-31 2021-07-13 Pogona, LLC Saccharide-polypeptide conjugate compositions and methods of use thereof
SG11201901394XA (en) 2016-09-02 2019-03-28 Sanofi Pasteur Inc Neisseria meningitidis vaccine
BR112019013475A2 (pt) 2016-12-30 2020-02-27 Sutrovax, Inc. Conjugados de polipeptídeo-antígeno com aminoácidos não naturais
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
AU2018215585B2 (en) 2017-01-31 2022-03-17 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
CN110225757A (zh) 2017-01-31 2019-09-10 默沙东公司 由肺炎链球菌血清型19f生产荚膜多糖蛋白缀合物的方法
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
CA3084436A1 (en) 2017-12-06 2019-07-18 Merck Sharp & Dohme Corp. Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
WO2020010000A1 (en) 2018-07-04 2020-01-09 Sutrovax, Inc. Improved methods for the preparation of immunogenic conjugates
WO2020010016A1 (en) 2018-07-04 2020-01-09 Sutrovax, Inc. Self-adjuvanted immunogenic conjugates
KR20210042904A (ko) 2018-07-04 2021-04-20 박사이트, 인코포레이티드 면역원성 접합체의 개선
AU2019401535B2 (en) 2018-12-19 2023-12-14 Merck Sharp & Dohme Llc Compositions comprising Streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
WO2022101745A2 (en) 2020-11-10 2022-05-19 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
US20220387576A1 (en) 2021-05-28 2022-12-08 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4356170A (en) * 1981-05-27 1982-10-26 Canadian Patents & Development Ltd. Immunogenic polysaccharide-protein conjugates
WO2007000322A1 (en) * 2005-06-27 2007-01-04 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
CN101304765A (zh) * 2005-02-01 2008-11-12 诺华疫苗和诊断有限公司 链球菌荚膜糖的偶联
CN101600459A (zh) * 2006-12-22 2009-12-09 惠氏公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白质共轭物组合物

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4057685A (en) 1972-02-02 1977-11-08 Abbott Laboratories Chemically modified endotoxin immunizing agent
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
DE3071552D1 (en) 1979-09-21 1986-05-22 Hitachi Ltd Semiconductor switch
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US4902506A (en) 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4459286A (en) 1983-01-31 1984-07-10 Merck & Co., Inc. Coupled H. influenzae type B vaccine
US4695624A (en) 1984-05-10 1987-09-22 Merck & Co., Inc. Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency
US4808700A (en) 1984-07-09 1989-02-28 Praxis Biologics, Inc. Immunogenic conjugates of non-toxic E. coli LT-B enterotoxin subunit and capsular polymers
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4709017A (en) 1985-06-07 1987-11-24 President And Fellows Of Harvard College Modified toxic vaccines
IT1187753B (it) 1985-07-05 1987-12-23 Sclavo Spa Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente
US5173294A (en) 1986-11-18 1992-12-22 Research Foundation Of State University Of New York Dna probe for the identification of haemophilus influenzae
US4950740A (en) 1987-03-17 1990-08-21 Cetus Corporation Recombinant diphtheria vaccines
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
DE3841091A1 (de) 1988-12-07 1990-06-13 Behringwerke Ag Synthetische antigene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
EP0378881B1 (en) 1989-01-17 1993-06-09 ENIRICERCHE S.p.A. Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
CA2063271A1 (en) 1989-07-14 1991-01-15 Subramonia Pillai Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
ATE128628T1 (de) 1990-08-13 1995-10-15 American Cyanamid Co Faser-hemagglutinin von bordetella pertussis als träger für konjugierten impfstoff.
US5153312A (en) 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
CA2059692C (en) 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
CA2059693C (en) 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
US5552146A (en) 1991-08-15 1996-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
ATE245446T1 (de) 1992-02-11 2003-08-15 Jackson H M Found Military Med Dualer träger für immunogene konstrukte
IT1262896B (it) 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
JP3506431B2 (ja) 1992-05-06 2004-03-15 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ジフテリア毒素受容体結合領域
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
DE69331495T2 (de) 1992-08-31 2002-10-31 Baxter Healthcare Sa Impfstoffe gegen neisseria meningitidis gruppe c
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
WO1994026304A1 (en) 1993-05-18 1994-11-24 Ohio State Research Foundation Otitis media vaccine
AU678613B2 (en) 1993-09-22 1997-06-05 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Method of activating soluble carbohydrate using novel cyanylating reagents for the production of immunogenic constructs
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
US6455673B1 (en) 1994-06-08 2002-09-24 President And Fellows Of Harvard College Multi-mutant diphtheria toxin vaccines
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain
US5565204A (en) 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
ATE241384T1 (de) 1995-03-22 2003-06-15 Jackson H M Found Military Med Herstellung von immunogenen konstrukten unter verwendung von löslichen kohlehydraten, die durch organische cyanylierungs-reagenzien aktiviert wurden
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
GB9513074D0 (en) 1995-06-27 1995-08-30 Cortecs Ltd Novel anigen
US6290970B1 (en) 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
US6090576A (en) 1996-03-08 2000-07-18 Connaught Laboratories Limited DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
US7341727B1 (en) 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
US6230051B1 (en) 1996-06-18 2001-05-08 Alza Corporation Device for enhancing transdermal agent delivery or sampling
EP1770164B1 (en) 1996-10-31 2010-09-01 Human Genome Sciences, Inc. Streptococcus pneumoniae antigens and vaccines
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
CN1133472C (zh) 1996-12-20 2004-01-07 阿尔萨公司 增加经皮样剂流量的装置
AU722315B2 (en) 1997-01-21 2000-07-27 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Polysaccharide-peptide conjugates
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
ATE380867T1 (de) 1997-06-03 2007-12-15 Sanofi Pasteur Ltd Lactoferrinrezeptorgen von moraxella
GB9713156D0 (en) 1997-06-20 1997-08-27 Microbiological Res Authority Vaccines
CN1285753A (zh) 1997-12-02 2001-02-28 鲍德杰克特疫苗公司 透皮给药微粒疫苗组合物
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
US7018637B2 (en) * 1998-02-23 2006-03-28 Aventis Pasteur, Inc Multi-oligosaccharide glycoconjugate bacterial meningitis vaccines
GB9812613D0 (en) 1998-06-11 1998-08-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CA2340692A1 (en) 1998-08-19 2000-03-02 North American Vaccine, Inc. Immunogenic .beta.-propionamido-linked polysaccharide protein conjugate useful as a vaccine produced using an n-acryloylated polysaccharide
ES2322306T3 (es) 1998-12-21 2009-06-18 Medimmune, Inc. Proteinas de streptpcpccus pneumoniae y fragmentos inmunogenicos para vacunas.
BR0009163A (pt) 1999-03-19 2001-12-26 Smithkline Beecham Biolog Vacina
JP2002541808A (ja) 1999-04-09 2002-12-10 テクラブ， インコーポレイテッド ポリサッカリド結合体ワクチンのための組換えトキシンａタンパク質キャリア
US6319224B1 (en) 1999-08-20 2001-11-20 Bioject Medical Technologies Inc. Intradermal injection system for injecting DNA-based injectables into humans
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
GB0007432D0 (en) 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Proteins for use as carriers in conjugate vaccines
GB0103170D0 (en) 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
GB0022742D0 (en) 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
AU2002309706A1 (en) 2001-05-11 2002-11-25 Aventis Pasteur, Inc. Novel meningitis conjugate vaccine
ES2451620T3 (es) 2002-11-07 2014-03-28 Synergy America, Inc. Composiciones y métodos destinados a tratar o prevenir la infección neumocócica
JP4850512B2 (ja) 2003-05-15 2012-01-11 独立行政法人科学技術振興機構 免疫刺激剤
EP1651261B1 (en) 2003-08-06 2014-10-08 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Polysaccharide-protein conjugate vaccines
US8048432B2 (en) 2003-08-06 2011-11-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Polysaccharide-protein conjugate vaccines
GB0428394D0 (en) 2004-12-24 2005-02-02 Chiron Srl Saccharide conjugate vaccines
US20070184072A1 (en) * 2005-04-08 2007-08-09 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
KR101730748B1 (ko) 2005-04-08 2017-04-26 와이어쓰 엘엘씨 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
JO2813B1 (en) * 2005-12-22 2014-09-15 جلاكسو سميث كلاين بايولوجيكالز اس.ايه A vaccine with multiple pneumococcal saccharides
CN105267974A (zh) 2007-06-20 2016-01-27 辉瑞爱尔兰制药公司 用于缀合疫苗的经过修饰的多糖
PT2167121E (pt) 2007-06-26 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacina compreendendo conjugados de polissacáridos capsulares de streptococcus pneumoniae
GB201003922D0 (en) * 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4356170A (en) * 1981-05-27 1982-10-26 Canadian Patents & Development Ltd. Immunogenic polysaccharide-protein conjugates
CN101304765A (zh) * 2005-02-01 2008-11-12 诺华疫苗和诊断有限公司 链球菌荚膜糖的偶联
WO2007000322A1 (en) * 2005-06-27 2007-01-04 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
CN101600459A (zh) * 2006-12-22 2009-12-09 惠氏公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白质共轭物组合物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDERSON PW, ET AL: "Vaccines consisting of periodate-cleaved oligosaccharides from the capsule of Haemophilus influenzae type b coupled to a protein carrier: structural and temporal requirements for priming in the human infant", 《J IMMUNOL.》 *
JOHN S. KIM，ET AL: "Monitoring activation sites on polysaccharides by GC-MS", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 *
M.C.STEINHOFF，ET AL: "A randomized comparison of three bivalent Streptococcus pneumoniae glycoprotein conjugate vaccines in young children:effect of polysaccharide size and linkage characteristics", 《PEDIATR INFECT DIS J》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103402544A (zh) * 2011-03-07 2013-11-20 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 缀合方法
CN105934251A (zh) * 2014-01-21 2016-09-07 辉瑞大药厂 肺炎链球菌荚膜多糖及其缀合物
CN106413747A (zh) * 2014-01-21 2017-02-15 辉瑞大药厂 肺炎链球菌荚膜多糖及其缀合物
CN112168957A (zh) * 2014-01-21 2021-01-05 辉瑞大药厂 肺炎链球菌荚膜多糖及其缀合物
CN112336854A (zh) * 2014-01-21 2021-02-09 辉瑞大药厂 肺炎链球菌荚膜多糖及其缀合物

Also Published As

Publication number Publication date
SG10201500413UA (en) 2015-03-30
AU2011226160B2 (en) 2013-05-23
CA2791926C (en) 2015-09-29
EP2815762A3 (en) 2015-03-25
KR20160005793A (ko) 2016-01-15
EA201290692A1 (ru) 2013-06-28
US20140186389A1 (en) 2014-07-03
ES2545221T3 (es) 2015-09-09
HRP20171161T1 (hr) 2017-10-06
SI2544708T1 (sl) 2015-10-30
GB201003922D0 (en) 2010-04-21
JP2013521394A (ja) 2013-06-10
SI2815762T1 (sl) 2017-09-29
US9265839B2 (en) 2016-02-23
LT2815762T (lt) 2017-08-25
US20140186390A1 (en) 2014-07-03
EP2815762A2 (en) 2014-12-24
JP5698770B2 (ja) 2015-04-08
CA2791926A1 (en) 2011-09-15
MX351345B (es) 2017-10-11
PL2544708T3 (pl) 2015-11-30
US20120321660A1 (en) 2012-12-20
AU2011226160A1 (en) 2012-10-25
CY1119244T1 (el) 2018-02-14
DK2544708T3 (en) 2015-08-24
ZA201206637B (en) 2016-09-28
US8753645B2 (en) 2014-06-17
EP2544708B1 (en) 2015-06-24
DK2815762T3 (en) 2017-09-11
MX2012010388A (es) 2012-10-10
CY1116685T1 (el) 2017-03-15
WO2011110531A2 (en) 2011-09-15
SG183476A1 (en) 2012-09-27
HRP20150935T1 (en) 2015-09-25
PT2544708E (pt) 2015-10-09
ES2636940T3 (es) 2017-10-10
BR112012022358A2 (pt) 2020-07-28
US9265840B2 (en) 2016-02-23
PL2815762T3 (pl) 2017-10-31
HUE035971T2 (en) 2018-05-28
PT2815762T (pt) 2017-08-28
EP2544708A2 (en) 2013-01-16
HUE027621T2 (en) 2016-11-28
SMT201500211B (it) 2015-10-30
KR20130038233A (ko) 2013-04-17
WO2011110531A3 (en) 2012-03-08
RS54188B1 (en) 2015-12-31
ME02204B (me) 2016-02-20
EP2815762B1 (en) 2017-05-31
EA023059B1 (ru) 2016-04-29

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