CN101784282A - 包含肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明披露了包含来自血清型19A和19F的肺炎链球菌荚膜糖缀合物(capsular saccharide conjugates)的免疫原性组合物，其中19A与第一细菌类毒素缀合，19F与第二细菌类毒素缀合。本发明还描述了疫苗、制备疫苗的方法以及该疫苗的用途。

Description

包含肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的疫苗
技术领域
本发明涉及改良的肺炎链球菌疫苗。
背景技术
2岁以下的儿童不能形成对大多数多糖疫苗的免疫应答，因此需要通过与蛋白载体化学缀合使多糖具有免疫原性。将多糖(T非依赖性抗原)与蛋白(T依赖性抗原)偶联，使该多糖具有包括同种型转换、亲和成熟和记忆诱导的T依赖性特性。
然而，在重复施用多糖-蛋白缀合物或多糖-蛋白缀合物的组合以形成多价疫苗时可能存在问题。例如，已报道了使用破伤风类毒素(TT)作为蛋白载体的流感嗜血杆菌b型多糖(PRP)疫苗在剂量范围内进行测试，其根据标准婴儿方案同时以(游离)TT和肺炎球菌多糖-TT缀合物疫苗进行免疫。随着肺炎球菌疫苗的剂量上升，对Hib缀合物疫苗的PRP多糖部分的免疫应答下降，提示多糖的免疫干扰，这可能是由于相同载体蛋白的使用(Dagan等人，InfectImmun.(1998)；66：2093-2098)。
载体蛋白剂量对于针对蛋白本身的体液应答的效应也被证明具有多面性。据报道，在人类婴儿体内四价破伤风类毒素缀合物剂量的上升导致对破伤风载体的应答的下降(Dagan等人，见上文)。对组合疫苗这些效应的经典分析已被描述为载体诱导的表位抑制，这尚未被完全理解，但被认为是载体蛋白的过量所导致(Fattom，Vaccine 17：126(1999))。这表现为导致针对载体蛋白的B-细胞和针对多糖的B-细胞对Th-细胞的竞争。如果针对载体蛋白的B-细胞占优，则没有足够的Th-细胞可对特异性针对多糖的B-细胞提供必要的帮助。然而，观察到的免疫效应并不一致，在某些情况下载体蛋白的总量提高了免疫应答，在其它情况下则减少了免疫应答。
因此，将多个多糖缀合物组合为单个、有效的疫苗制剂存在着技术难题。
肺炎链球菌是一种革兰氏阳性细菌，其造成了相当大的致病率和死亡率(特别是在青年和老年人中)，引起了侵袭性疾病如肺炎、菌血症和脑膜炎，以及与移生有关的疾病，如急性中耳炎。据估计在美国60岁以上人群中肺炎球菌肺炎的发病率为每100,000人中3至8人。在20％的情况下其导致了菌血症，以及其它表现如脑膜炎，即使接受抗菌治疗，其死亡率仍然接近30％。
肺炎球菌被化学连接的多糖包封，该多糖带来了血清型特异性。肺炎球菌具有90种已知的血清型，而荚膜是肺炎球菌主要的毒性决定因子，因为荚膜不仅针对补体保护该细菌的内部表面，其本身免疫原性也较差。多糖是T-非依赖性抗原，且不能在MHC分子上加工或呈现以与T-细胞相互作用。然而，它们可以通过替代性的机制刺激免疫系统，该机制包括B细胞上表面受体的交联。
在多个实验中显示，针对侵袭性肺炎双球菌疾病的保护很大程度上与特异性针对该荚膜的抗体相关，所述保护具有血清型特异性。
肺炎链球菌是婴儿和幼儿的侵袭性细菌性疾病和中耳炎最常见的诱因。同样地，老年人对肺炎球菌疫苗具有较差的应答[Roghmann等人，(1987)，J.Gerontol.42：265-270]，因此增加了在该人群中细菌性肺炎的发病率[Verghese和Berk，(1983)Medicine(Baltimore)62：271-285]。
因此，本发明的一个目标在于开发一种改良的多重血清型肺炎链球菌多糖缀合物疫苗的制剂。
附图简述
图1在老年恒河猴中的缀合物免疫原性(II期后的抗-PS IgG水平)
柱形图显示了在老年恒河猴中11价缀合物的免疫原性。浅色条棒表示用在磷酸铝佐剂中的11价缀合物两次接种后的GMC。深色条棒表示用在佐剂C中的11价缀合物两次接种后的GMC。
图2在老年恒河猴中的缀合物免疫原性(II期后抗-PS3记忆B细胞频率)
柱形图显示了在用佐剂C或磷酸铝佐剂中的11价缀合物接种后针对PS3的记忆B细胞。
图3在Balb/c小鼠中PS19F的免疫原性(III期后IgG水平)
柱形图显示了4价纯多糖和4价dPly缀合物在Balb/C小鼠中的抗多糖19F免疫原性。
图4在Balb/c小鼠中PS22F的免疫原性(III期后IgG水平)
柱形图显示了4价纯多糖和4价PhtD缀合物在Balb/C小鼠中的抗多糖22F免疫原性。
图5血清抗-PS IgG抗体水平
柱形图显示了在Balb/c小鼠中的抗-22F IgG应答。
图6在Balb/c小鼠中的抗-22F调理-吞噬效价
柱形图显示了在Balb/c小鼠中的抗-22F调理-吞噬效价。
图7在幼年C57BI小鼠III期后以新型佐剂或AlPO4免疫诱导的IgG应答的比较
柱形图比较了在幼年C57B1小鼠中以与不同佐剂制成的13价缀合物疫苗免疫后的IgG应答。所述柱与右侧栏所示的顺序相同。
图8PhtD和dPly蛋白组合在恒河猴中针对19F型肺部移生的保护效力
柱形图显示不同疫苗组合在猴肺炎模型中的保护效力。“死亡”组包括将死亡但施用了抗生素处理的猴。
图9血清抗-PhtD IgG应答
柱形图显示在Balb/c小鼠中以22F-PhtD或22F-AH-PhtD缀合物免疫后的抗PhtD IgG应答。
图10在小鼠中针对4型肺炎球菌攻击的保护
在小鼠中以22F-PhtD或22F-AH-PhtD免疫后针对4型肺炎球菌攻击的保护。
图11在以PhtD免疫和以针对血清型3多糖的抗体被动免疫后针对肺炎链球菌菌株3/43的致命攻击的保护。
图12在以PhtD免疫和以针对血清型1多糖的抗体被动免疫后针对肺炎链球菌菌株1/57的致命攻击的保护。
图13在以多价缀合物疫苗免疫的老年C57黑色小鼠中针对血清型19A的调理吞噬效价。
图14在以多价缀合物疫苗免疫的老年C57黑色小鼠中针对血清型22F的调理吞噬效价。
图15在以多价缀合物疫苗免疫的Balb/c小鼠中针对血清型19A的调理吞噬效价。
柱2-11V+19A-dPly gmbs+22F-PhtD 0.1μg/50μl；柱4-11V+19A-dPly gmbs+22F-PhtD-E 0.1μg/50μl；柱62-11V+19A-DT+22F-PD0.1μg/50μl
图16在以多价缀合物疫苗免疫的Balb/c小鼠中针对血清型22F的调理吞噬效价。
图17在以多价缀合物疫苗免疫的豚鼠中针对血清型19A的调理吞噬效价。
图18在以多价缀合物疫苗免疫的豚鼠中针对血清型22F的调理吞噬效价。
图19在以多价缀合物疫苗免疫的Balb/c小鼠中针对血清型19A的调理吞噬效价。
图20在以多价缀合物疫苗免疫的Balb/c小鼠中针对血清型22F的调理吞噬效价。
图21在以多价缀合物疫苗免疫的OF1小鼠中针对血清型19A的调理吞噬效价。
图22在以多价缀合物疫苗免疫的OF1小鼠中针对血清型22F的调理吞噬效价。
发明详述
本发明提供了包含来自血清型19A和19F的肺炎链球菌荚膜糖缀合物的免疫原性组合物，其中19A与作为第一细菌类毒素的载体蛋白缀合，19F与作为第二细菌类毒素的载体蛋白缀合，且该肺炎链球菌荚膜糖中的2-8种与蛋白D缀合。
术语荚膜糖包括荚膜多糖和由荚膜多糖衍生的寡糖。寡糖包含至少4个糖残基。术语缀合物和缀合的涉及与载体蛋白共价结合的荚膜糖。
针对本发明的目的，“免疫人类宿主抗COPD的恶化”或“治疗或预防COPD的恶化”或“减少COPD的恶化的严重性”指降低COPD的恶化的发生率或比例(例如减少0.1、0.5、1、2、5、10、20％或更多的比例)，例如在以本发明的组合物或疫苗免疫的患者组中。
术语细菌类毒素包括通过遗传突变、通过化学处理或通过缀合失活的细菌毒素。合适的细菌类毒素包括破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳类毒素、细菌溶细胞素或肺炎球菌溶血素。肺炎球菌溶血素(Ply)的突变已被描述减弱了肺炎球菌溶血素的毒性(WO 90/06951，WO 99/03884)。类似地，已知降低毒性的白喉毒素遗传突变(参见下文)。白喉毒素的遗传解毒类似物包括CRM197和在US 4,709,017、US 5,843,711、US 5,601,827和US 5,917,017中描述的其它突变体。CRM197是白喉毒素的非毒性形式，但与白喉毒素在免疫学上无法区分。CRM197可由通过产毒素的棒状杆菌噬菌体b的亚硝基胍突变生成的无产毒相β197tox感染的白喉杆菌生成(Uchida等人.Nature NewBiology(1971)233；8-11)。CRM197蛋白与白喉毒素具有相同的分子量，但因在结构基因中具有单个碱基变化而与之不同。这导致在52号位上由甘氨酸转变为谷氨酰胺的变化，使得片段A不能结合NAD，从而不具毒性(Pappenheimer 1977，Ann Rev，Biochem.46；69-94，Rappuoli Applied andEnvironmental Microbiology Sept 1983 p560-564)。
第一和第二细菌类毒素可相同或不同。当第一和第二细菌类毒素不同时，意味着它们具有不同的氨基酸序列。
例如，19A和19F可被分别缀合至破伤风类毒素和破伤风类毒素；白喉类毒素和白喉类毒素；Crm197和CRM197、肺炎球菌溶血素和肺炎球菌溶血素、破伤风类毒素和白喉类毒素；破伤风类毒素和CRM197；破伤风类毒素和肺炎球菌溶血素；白喉类毒素和破伤风类毒素；白喉类毒素和CRM197、白喉类毒素和肺炎球菌溶血素；CRM197和破伤风类毒素、CRM197和白喉类毒素；CRM197和肺炎球菌溶血素；肺炎球菌溶血素和破伤风类毒素；肺炎球菌溶血素和白喉类毒素；或肺炎球菌溶血素和CRM197。
本发明的免疫原性组合物包含2-8、2-7、2-6、2-5、3-5、4-5、2-4、2-3、3-4或2、3、4、5、6、7或8种荚膜糖缀合物，其中蛋白D为载体蛋白。例如，来自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F或23F的糖被缀合至蛋白D。例如，选自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的2-8、2-7、2-6、2-5、3-5、4-5、2-4、2-3、3-4或2、3、4、5、6、7或8种糖被缀合至蛋白D。
在一个实施方式中，来自至少血清型1和3、1和4、1和5、1和6A、1和6B、1和7、1和9V、1和14、1和22F、1和23F、3和4、3和5、3和6A、3和6B、3和7F、3和9V、3和14、3和22F、3和23F、4和5、4和6A、4和6B、4和7F、4和9V、4和14、4和22F、4和23F、5和6A、5和6B、5和7F、5和9V、5和14、5和22F、5和23F、6A和6B、6A和7F、6A和9V、6A和14、6A和22F、6A和23F、6B和7F、6B和9V、6B和14、6B和22F、6B和23F、7F和9V、7F和14、7F和22F、7F和23F、9V和14、9V和22F、9V和23F、14和22F、14和23F或者22F和23F的糖被缀合至蛋白D。
在一个实施方式中，来自至少血清型1、3和4；1、3和5；1、3和6A；1、3和6B；1、3和7F；1、3和9V；1、3和14；3、4和7F；3、4和5；3、4和7F；3、4和9V；3、4和14；4、5和7F；4、5和9V；4、5和14；5、7F和9V；5、7F和14；7F、9V和14；1、3、4和5；3、4、5和7F；4、5、7F和9V；4、5、7F和14；4、5、9V和14；4、7F、9V和14；5、7F、9V和14；或者4、5、7F、9V和14的糖被缀合至蛋白D。
在一个实施方式中，在本发明的免疫原性组合物中存在的荚膜糖缀合物中的一半或少于一半或少数包含作为载体蛋白的蛋白D。例如，在10价肺炎链球菌疫苗中，来自不同血清型的荚膜糖中的2、3、4或5种与蛋白D缀合。例如，在11价肺炎链球菌疫苗中，来自不同血清型的荚膜糖中的2、3、4或5种与蛋白D缀合。例如，在12价肺炎链球菌疫苗中，来自不同血清型的荚膜糖中的2、3、4、5或6种与蛋白D缀合。例如，在13价肺炎链球菌疫苗中，来自不同血清型的荚膜糖中的2、3、4、5或6种与蛋白D缀合。例如，在14价肺炎链球菌疫苗中，来自不同血清型的荚膜糖中的2、3、4、5、6或7种与蛋白D缀合。例如，在15价肺炎链球菌疫苗中，来自不同血清型的荚膜糖中的2、3、4、5、6或7种与蛋白D缀合。例如，在16价肺炎链球菌疫苗中，来自不同血清型的荚膜糖中的2、3、4、5、6、7或8种与蛋白D缀合。例如，在17价肺炎链球菌疫苗中，来自不同血清型的荚膜糖中的2、3、4、5、6、7或8种与蛋白D缀合。例如，在18价肺炎链球菌疫苗中，来自不同血清型的荚膜糖中的2、3、4、5、6、7、8或9种与蛋白D缀合。例如，在19价肺炎链球菌疫苗中，来自不同血清型的荚膜糖中的2、3、4、5、6、7、8或9种与蛋白D缀合。可选地，与蛋白D缀合的血清型选自上述的组。
在一个实施方式中，除了19A和19F的肺炎链球菌糖缀合物外，该免疫原性组合物进一步包含肺炎链球菌荚膜糖4、6B、9V、14、18C和23F的缀合物。
在一个实施方式中，除了19A和19F的肺炎链球菌糖缀合物外，该免疫原性组合物进一步包括肺炎链球菌荚膜糖1、4、5、6B、7F、9V、14、18C和23F的缀合物。
在一个实施方式中，除了19A和19F的肺炎链球菌糖缀合物外，该免疫原性组合物进一步包括肺炎链球菌荚膜糖1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、22F和23F的缀合物。
在一个实施方式中，除了19A和19F的肺炎链球菌糖缀合物外，该免疫原性组合物进一步包括肺炎链球菌荚膜糖1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、22F和23F的缀合物。
在一个实施方式中，除了19A和19F的肺炎链球菌糖缀合物外，该免疫原性组合物进一步包括肺炎链球菌荚膜糖1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、22F和23F的缀合物。
本发明的肺炎链球菌疫苗通常将包含荚膜糖抗原(可选地缀合)，其中所述糖来自至少十种肺炎链球菌血清型。肺炎链球菌荚膜糖的数量范围可从10种不同血清型(或“v”，价)至23种不同血清型(23v)。在一个实施方式中，具有10、11、12、13、14或15种不同血清型。在本发明另一实施方式中，该疫苗可包含缀合的肺炎链球菌糖和未缀合的肺炎链球菌糖。任选地，糖血清型的总数少于或等于23。例如，本发明可包含10种缀合血清型和13种未缀合糖。该疫苗可以类似的方式包含11、12、13、14或16种缀合糖和分别12、11、10、9或7种未缀合糖。
在一个实施方式中，本发明的多价肺炎球菌疫苗将选自如下血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，尽管可以理解，根据接受该疫苗的接受者的年龄以及该疫苗将施用的地理位置，一种或两种其它血清型可被取代。例如，10价疫苗可包含来自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的多糖。11价疫苗还可包含来自血清型3或19A的糖。12或13价儿童(婴儿)疫苗还可包括添加了血清型6A和19A，或者6A和22F，或者19A和22F，或者6A和15，或者19A和15，或者22F和15的11价制剂(包含来自血清型3的糖)，而13价老年疫苗可包括添加了血清型19A和22F、8和12F，或者8和15，或者8和19A，或者8和22F，或者12F和15，或者12F和19A，或者12F和22F，或者15和19A，或者15和22F的10或11价制剂。14价儿童疫苗可包括添加了血清型3、6A、19A和22F；血清型6A、8、19A和22F；血清型6A、12F、19A和22F；血清型6A、15、19A和22F；血清型3、8、19A和22F；血清型3、12F、19A和22F；血清型3、15、19A和22F；血清型3、6A、8和22F；血清型3、6A、12F和22F；或者血清型3、6A、15和22F的上述10价制剂。
在一个实施方式中该组合物包含来自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F(任选地缀合)的荚膜糖。在本发明进一步的实施方式中包括至少11种糖抗原(任选地缀合)，例如，来自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的荚膜糖。在本发明进一步的实施方式中包括至少12或13种糖抗原，例如，疫苗可包含来自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的荚膜糖或者来自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的荚膜糖，尽管本发明还可预期其它的糖抗原，例如23价(例如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)。
本发明的免疫原性组合物包含来自流感嗜血杆菌的蛋白D(PD)(参见EP0594610图9)。流感嗜血杆菌是中耳炎的关键引发微生物，本发明人已显示在肺炎链球菌疫苗中包含该蛋白将提供针对与中耳炎相关的流感嗜血杆菌的保护水平(Pyrmula等人Lancet 367；740-748(2006))。一方面，PD作为一种或多种糖的载体蛋白存在。在另一方面，蛋白D可作为游离蛋白存在于疫苗组合物中。在进一步方面，蛋白D同时作为载体蛋白和作为游离蛋白存在。蛋白D可以全长蛋白或片段使用(WO0056360)。在其它方面，蛋白D作为多数糖的载体蛋白存在，例如糖中的6、7、8、9或更多种可与蛋白D缀合。在该方面，蛋白D还可作为游离蛋白存在。
本发明的疫苗将包含两种或两种以上不同类型的载体蛋白。每种类型的载体蛋白可作为一种以上糖的载体，该糖可以相同或不同。例如，血清型3和4可被缀合至相同的载体蛋白，缀合至载体蛋白的相同分子或相同载体蛋白的不同分子。在一个实施方式中，两种或两种以上不同的糖可被缀合至相同的载体蛋白，缀合至载体蛋白的相同分子或相同载体蛋白的不同分子。
在本发明的免疫原性组合物中存在的除了19A和19F以外的任意肺炎链球菌荚膜糖可被缀合至载体蛋白，所述载体蛋白独立选自TT、DT、CRM197、TT的片段C、PhtD、PhtBE或PhtDE融合体(特别是WO01/98334和WO 03/54007中描述的那些)、解毒肺炎链球菌溶血素和蛋白D。下文显示了可用于本发明缀合物的蛋白载体的更完整清单。
缀合至本发明的免疫原性组合物中存在的缀合物中的一种或多种肺炎链球菌荚膜糖的载体蛋白任选地是聚组氨酸三联体家族(Pht)蛋白成员，其片段或融合蛋白。PhtA、PhtB、PhtD或PhtE蛋白可与WO 00/37105或WO00/39299中披露的序列(例如，与WO 00/37105中PhtD的SEQ ID NO：4的氨基酸序列1-838或21-838)具有80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致性。例如，融合蛋白由全长PhtA、PhtB、PhtD、PhtE或其2、3或4个片段组成。融合蛋白的范例为PhtA/B、PhtA/D、PhtA/E、PhtB/A、PhtB/D、PhtB/E、PhtD/A、PhtD/B、PhtD/E、PhtE/A、PhtE/B和PhtE/D，其中该蛋白与首先提及的蛋白在N末端连接(例如参见WO01/98334)。
在使用Pht蛋白片段时(单独或作为融合蛋白的部分)，每个片段可选地包含该种多肽的一个或多个组氨酸三联体基序和/或卷曲螺旋区。组氨酸三联体基序是多肽的部分，其具有序列HxxHxH，其中H为组氨酸，x为非组氨酸的氨基酸。卷曲螺旋区是通过“卷曲”算法预测的区域Lupus，A等人(1991)Science 252；1162-1164。在一个实施方式中，该片段或每个片段包含一个或多个组氨酸三联体基序和至少一个卷曲螺旋区。在一个实施方式中，该片段或每个片段包含恰好或至少2、3、4或5个组氨酸三联体基序(任选地，具有介于2或2个以上三联体的天然Pht序列，或者与天然肺炎球菌内三联体Pht序列具有超过50、60、70、80、90或100％一致性的内三联体序列-例如，WO00/37105中PhtD的SEQ ID NO：4中所示的内三联体序列)。在一个实施方式中，该片段或每个片段包含恰好或至少2、3或4个卷曲螺旋区。在一个实施方式中，此处披露的Pht蛋白包含连接信号序列的全长蛋白，去除信号肽(例如在N末端的20个氨基酸)的成熟全长蛋白，Pht蛋白的天然存在变体以及Pht蛋白的免疫原性片段(例如，如上所述的片段或者包含来自WO00/37105(SEQ ID NOs 4，6，8或10)或WO00/39299(SEQ ID NOs 2，4，6，8，10或14)的氨基酸序列的至少15或20个连续氨基酸的多肽，其中所述多肽能够引发特异性针对WO00/37105或WO00/39299所述氨基酸序列的免疫应答)。
具体而言，此处所用的“PhtD”包含连接信号序列的全长蛋白，去除信号肽(例如在N末端的20个氨基酸)的成熟全长蛋白，PhtD的天然存在变体以及PhtD的免疫原性片段(例如，如上所述的片段或者包含来自WO00/37105或WO00/39299的PhtD氨基酸序列的至少15或20个连续氨基酸的多肽，其中所述多肽能够引发特异性针对WO00/37105或WO00/39299所述PhtD氨基酸序列(例如，针对PhtD的WO 00/37105的SEQ ID NO：4或WO 00/39299的SEQ ID NO：14)的免疫应答)。上述PhtD的所有形式均可用于本发明。
如果该组合物中蛋白载体有2种或2种以上的糖相同，该糖可被缀合至该蛋白载体的相同分子(载体分子具有另外2种与之缀合的不同的糖)[例如参见WO 04/083251]。替代性地，该糖可各自独立地缀合至该蛋白载体的不同分子(每个蛋白载体分子仅具有一种类型的糖与之缀合)。
可用于本发明的载体蛋白的范例为DT(白喉类毒素)，TT(破伤风类毒素)或TT的片段C，DT CRM197(一种DT突变体)，其它DT点突变体如CRM176、CRM228、CRM 45(Uchida等人J.Biol.Chem.218；3838-3844，1973)；CRM 9、CRM 45、CRM102、CRM 103和CRM107以及Nicholls和Youle在Genetically Engineered Toxins，Ed：Frankel，Maecel Dekker Inc，1992中所述的其它突变体；Glu-148缺失或突变为Asp、Gln或Ser和/或Ala 158删除或突变为Gly以及US 4709017或US 4950740中披露的其它突变；在至少一个或多个残基Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534的突变以及US5917017或US 6455673中披露的其它突变；或者US 5843711中披露的片段，肺炎球菌肺炎球菌溶血素(Kuo等人(1995)Infect Immun 63；2706-13)，其包括以某些方式解毒的ply例如dPLY-GMBS (WO 04081515，PCT/EP2005/010258)或dPLY-formol，PhtX，其包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE以及Pht蛋白融合体如PhtDE融合体、PhtBE融合体(WO 01/98334和WO 03/54007)，(Pht A-E在下文更加具体描述)，OMPC(脑膜炎球菌外膜蛋白-通常由脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B提取-EP0372501)，PorB(来自脑膜炎奈瑟氏球菌)、PD(流感嗜血杆菌蛋白D-参见，例如EP 0 594 610 B)，或其免疫学功能等同物，合成肽(EP0378881，EP0427347)，热休克蛋白(WO 93/17712，WO 94/03208)，百日咳蛋白(WO 98/58668，EP0471177)，细胞因子，淋巴因子，生长因子或激素(WO 91/01146)，包含多个来自不同病原体衍生抗原的人CD4+T细胞表位的人工蛋白(Falugi等人(2001)Eur J Immunol 31；3816-3824)，例如N19蛋白(Baraldoi等人(2004)Infect Immun 72；4884-7)肺炎球菌表面蛋白PspA (WO 02/091998)，铁摄取蛋白(WO 01/72337)，艰难梭菌的毒素A或B (WO 00/61761)。
Nurkka等人Pediatric Infectious Disease Journal.23(11)：1008-14，2004Nov描述了所有血清型缀合至PD的11价肺炎球菌疫苗。然而本发明人显示与缀合至PD的19F相比，具有与DT缀合的19F缀合物诱导的抗体的调理吞噬活性更高。此外，本发明人显示与DT缀合的19F具有对19A更大的交叉反应。因此，本发明的组合物的一个特征是血清型19F被缀合至细菌类毒素，例如，TT、肺炎球菌溶血素、DT或CRM197。一方面，血清型19F被缀合至DT。本发明的另一特征是血清型19A被缀合至细菌类毒素，例如，TT、肺炎球菌溶血素、DT或CRM197。该免疫原性组合物剩余的糖血清型可全部缀合至一种或多种非DT载体蛋白(即，仅19F缀合至DT)，或者可部分缀合至非DT载体蛋白，部分DT缀合至DT。在一个实施方式中，19F缀合至DT或CRM197，剩余的血清型分别缀合至PD，以及TT或DT或CRM197。在进一步的实施方式中，19F缀合至DT或CRM197，且不超过一种糖缀合至TT。在该实施方式的一个方面，所述的一种糖为18C或12F。在进一步的实施方式中，19F缀合至DT或CRM197，且不超过两种糖缀合至TT。在进一步的实施方式中，19F缀合至DT或CRM197，剩余的血清型分别缀合至PD，TT和DT或CRM197。在进一步的实施方式中，19F缀合至DT或CRM197，剩余的血清型分别缀合至PD，TT和肺炎球菌溶血素。在进一步的实施方式中，19F缀合至DT或CRM197，剩余的血清型分别缀合至PD，TT和CRM197。在进一步的实施方式中，19F缀合至DT或CRM197，剩余的血清型分别缀合至PD，TT，肺炎球菌溶血素和任选地PhtD或PhtD/E融合蛋白。在进一步的实施方式中，19F缀合至DT或CRM197，19A缀合至肺炎球菌溶血素或TT，剩余的血清型分别缀合至PD，TT，肺炎球菌溶血素和任选地PhtD或PhtD/E融合蛋白。在进一步的实施方式中，19F缀合至DT或CRM197，19A缀合至肺炎球菌溶血素或TT，一种其它的糖缀合至TT，一种其它的糖缀合至PhtD或PhtD/E，且所有其它的糖缀合至PD。在进一步的实施方式中，19F缀合至DT或CRM197，19A缀合至肺炎球菌溶血素，一种其它的糖缀合至TT，一种其它的糖缀合至肺炎球菌溶血素，2种其它的糖缀合至PhtD或PhtD/E，且所有其它的糖缀合至PD。
在整个说明书中术语“糖”可指多糖或寡糖，并同时包括两者。多糖可从细菌分离并可通过已知的方法(例如参见EP497524和EP497525)和可选地通过微射流(microfluidisation)进行一定程度的大小处理。可对多糖进行大小处理(sized)以减少多糖样本的粘度和/或提高缀合产物的可滤过性。寡糖具有少量的重复单元(通常5-30重复单元)，并通常为水解的多糖。
肺炎链球菌的荚膜多糖包含重复的寡糖单元，该寡糖单元可包含多达8个糖残基。关键肺炎链球菌血清型的寡糖单元可参见综述JONES，Christopher.Vaccines based on the cell surface carbohydrates of pathogenic bacteria.An.Acad.Bras.Ciênc.，2005年6月，第77卷，第2期，第293-324页.表II ISSN0001-3765。在一个实施方式中，荚膜糖抗原可以是全长多糖，然而在其它实施方式中，它可以是一个寡糖单元或短于天然长度的重复寡糖单元的糖链。在一个实施方式中，在疫苗中存在的所有糖都是多糖。全长多糖可被“大小处理(sized)”，即，它们的大小可通过各种方法减小，所述方法例如酸水解处理、过氧化氢处理、通过
Figure GPA00001032855600121
大小处理后以过氧化氢处理以生成寡糖片段或者微射流。
本发明人还注意到本领域曾关注采用寡糖以便于缀合物生成。本发明人已发现通过采用天然或略微进行大小处理的多糖缀合物，可实现以下一种或多种优点：1)具有高免疫原性的可滤过缀合物，2)可改变多糖与蛋白在缀合物中的比例，使得在缀合物中多糖与蛋白的比例(w/w)增加(这可对载体抑制作用具有影响)，3)可通过使用更大的糖进行缀合来稳定易于水解的免疫原性缀合物。更大的多糖的使用可导致与缀合物载体的更多交联，并可减少游离糖从缀合物的释放。在现有技术中描述的缀合物疫苗倾向于在缀合前将多糖解聚以改善缀合。本发明人已发现保留更大大小的糖的糖缀合物疫苗可提供针对肺炎球菌疾病的良好免疫应答。
本发明的免疫原性组合物因而可包含一种或多种糖缀合物，其中在缀合前每种糖的平均大小(重均分子量；Mw)在80kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa或1000kDa以上。在一个实施方式中，该缀合后的缀合物应当易于通过0.2微米过滤器，从而与过滤前样本相比，在过滤后可得到50、60、70、80、90或95％以上的产率。
为了本发明的目的，“天然多糖”指未经过加工的糖，该加工过程在于减小该糖的大小。在常规纯化步骤中多糖可能会被略微减小。这种糖仍然是天然的。仅当多糖采用了大小处理技术后，该多糖会被认为不是天然的。天然多糖的大小例如介于250kDa-2,000kDa、400-1,500kDa、750kDa-1,250kDa、300kDa-600kDa、500-1,000kDa或1,000-1,500kDa，如本领域技术人员将理解，不同的血清型具有不同大小的天然多糖。
针对本发明的目的，“以最大x2的因子进行大小处理”表示该糖通过加工意图减小糖的大小，但保留天然多糖一半以上的大小。x3、x4等可以相同方式解释，即，该糖通过加工减小多糖的大小，但保留天然多糖三分之一、四分之一等以上的大小。
在本发明的一个方面，该免疫原性组合物包含与载体蛋白缀合的来自至少10种血清型的肺炎链球菌糖，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或每一种肺炎链球菌糖是天然多糖。
在本发明的一个方面，该免疫原性组合物包含与载体蛋白缀合的来自至少10种血清型的肺炎链球菌糖，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或每一种肺炎链球菌糖以最多x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的因子进行大小处理。在该方面的一个实施方式中，大部分糖(例如，6、7、8或更多种糖)以多达x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的因子进行大小处理。
本文的糖的分子量或平均分子量指在缀合前通过MALLS测量的糖的重均分子量(Mw)。
MALLS技术已为本领域公知，并通常可按实施例2所述进行。为对肺炎球菌糖进行MALLS分析，可联合使用两根柱(TSKG6000和5000PWxl)并在水中洗脱糖。糖可采用光散射检测器(例如配置10mW氩激光器的WyattDawn DSP以488nm)和干涉折射仪(例如装备P100池和红色滤光器的Wyatt Otilab DSP以498nm)进行检测。
在一个实施方式中，该肺炎链球菌糖为天然的多糖或在常规提取过程中大小减小的天然多糖。
在一个实施方式中，该肺炎链球菌糖通过机械切割进行大小处理，例如可通过微射流或超声。微射流和超声具有能够减小更大的天然多糖的大小，从而足以提供可滤过缀合物的优势。大小处理的因子不超过x20、x10、x8、x6、x5、x4、x3或x2。
在一个实施方式中，该免疫原性组合物包含肺炎链球菌缀合物，其由通过以不超过x20的因子进行大小处理的天然多糖和糖的混合物制成。在该实施方式的一个方面，大部分糖(例如，6、7、8或更多种糖)以多达x2、x3、x4、x5或x6的因子进行大小处理。
在一个实施方式中，该肺炎链球菌糖通过接头(例如，双功能接头)缀合至载体蛋白。该接头可选地为异双功能或同双功能的，其具有例如一个反应性氨基基团和一个反应性羧酸基团，2个反应性氨基基团或两个反应性羧酸基团。该接头具有例如介于4和20、4和12、5和10个碳原子。一种可能的接头是ADH。其它的接头包括B-丙酰胺基(WO 00/10599)、硝基苯基-乙胺(Gever等人(1979)Med.Microbiol.Immunol.165；171-288)、卤烷基卤化物(US4057685)、糖苷键(US4673574，US4808700)、己二胺和6-氨基己酸(US4459286)。在一个实施方式中，ADH被用作缀合来自血清型18C的糖的接头。
本发明的免疫原性组合物中存在的糖缀合物可通过任意已知的偶联技术制备。该缀合方法可依赖于以1-氰基-4-二甲氨基四氟硼酸吡啶(CDAP)活化糖形成氰酸酯。该活化的糖可由此直接地或通过间隔(接头)基团偶联至载体蛋白上的氨基基团。例如，该间隔基可以是胱胺或半胱胺以得到硫醇多糖，后者可通过与马来酰亚胺活化的载体蛋白(例如采用GMBS)或者卤代乙酰化载体蛋白(例如采用碘乙酰亚胺[例如，乙基碘乙酰亚胺HCl]或N-溴乙酸琥伯酰亚胺酯或SIAB，或SIA，或SBAP)反应后获得的硫醚键偶联至载体。任选地，该氰酸酯(任选地通过CDAP化学制备)与己二胺或ADH偶联，且该氨基衍生的糖采用碳二亚胺(例如EDAC或EDC)化学通过蛋白载体上的羧基基团被缀合至载体蛋白。该种缀合物描述于PCT公布申请Uniformed ServicesUniversity的WO 93/15760以及WO 95/08348和WO 96/29094。
其它合适的技术采用碳二亚胺、碳亚胺、肼、活性酯、降莰烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。许多描述于WO98/42721。缀合可涉及羰基接头，其可通过糖的游离羟基基团与CDI反应(Bethell等人J.Biol.Chem.1979，254；2572-4，Hearn等人J.Chromatogr.1981.218；509-18)，然后与蛋白反应形成氨基甲酸酯键而形成。这可包括将还原为伯羟基基团的末端异构反应，任选地在伯羟基基团与CDI的反应中保护/脱保护该伯羟基基团以形成CDI氨基甲酸酯中间体，并将该CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白上的氨基基团缀合。
该缀合物可通过US 4365170(Jennings)和US 4673574(Anderson)所述的直接还原胺化法制备得到。其它方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508。
其它方法包括将溴化氰(或CDAP)活化的糖的己二酸双肼(ADH)衍生物通过碳二亚胺缩合(例如采用EDAC)缀合至蛋白载体(Chu C.等人Infect.Immunity，1983245256)。
在一个实施方式中，糖上的羟基基团(任选地活化羟基基团，例如[如采用CDAP]活化制备氰酸酯的羟基基团)被直接或间接(通过接头)连接至蛋白上的氨基或羧基基团。当接头存在时，糖上的羟基基团任选地连接至接头上的氨基基团，例如，通过CDAP缀合连接。在接头如ADH中的其它氨基基团可被缀合至蛋白上的羧酸基团，例如，可采用碳二亚胺化学，例如采用EDAC进行缀合。在一个实施方式中，该肺炎球菌荚膜糖在缀合至载体蛋白前先背缀合至接头。替代性地，该接头可在缀合至糖之前被缀合至载体。
也可采用组合技术，其中部分糖-蛋白缀合物通过CDAP制备，部分通过还原胺化制备。
总体而言，在蛋白载体上的以下类型的化学基团可用于缀合/结合：
A)羧基(例如通过天冬氨酸或谷氨酸)。在一个实施方式中该基团被直接连接至糖上的氨基基团或通过碳二亚胺化学(例如通过EDAC)连接至接头上的氨基基团。
B)氨基基团(例如通过赖氨酸)。在一个实施方式中该基团被直接连接至糖上的羧基基团或通过碳二亚胺化学(例如通过EDAC)连接至接头上的羧基基团。在另一实施方式中该基团直接连接至糖上以CDAP或CNBr活化的羟基基团或者连接至接头上的该种基团；连接至具有醛基团的糖或接头；连接至具有丁二酰亚胺酯基团的糖或接头。
C)硫氢基(例如通过半胱氨酸)。在一个实施方式中，该基团被连接至溴或氯乙酰化的糖或具有马来酰亚胺化学的接头。在一个实施方式中，该基团通过双重氮联苯胺活化/修饰。
D)羟基基团(例如通过酪氨酸)。在一个实施方式中，该基团通过双重氮联苯胺活化/修饰。
E)咪唑基基团(例如通过组氨酸)。在一个实施方式中，该基团通过双重氮联苯胺活化/修饰。
F)胍基基团(例如通过精氨酸)。
G)吲哚基基团(例如通过色氨酸)。
在糖上，总体而言如下基团可用于缀合：OH、COOH或NH2。醛基团可本领域已知的不同处理后生成，例如：高碘酸、酸解、过氧化氢等。
直接缀合方法：
糖-OH+CNBr或CDAP-----＞氰酸酯+NH2-Prot----＞缀合物
糖-醛+NH2-Prot----＞Schiff碱+NaCNBH3----＞缀合物
糖-COOH+NH2-Prot+EDAC----＞缀合物
糖-NH2+COOH-Prot+EDAC----＞缀合物
通过间隔(接头)间接缀合法：
糖-OH+CNBr或CDAP---＞氰酸酯+NH2----NH2----＞糖----NH2+COOH-Prot+EDAC-----＞缀合物
糖-OH+CNBr或CDAP----＞氰酸酯+NH2-----SH-----＞糖----SH+SH-Prot(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白或通过例如SPDP对蛋白的氨基基团修饰后获得)-----＞糖-S-S-Prot
糖-OH+CNBr或CDAP---＞氰酸酯+NH2----SH-------＞糖----SH+马来酰亚胺-Prot(氨基基团的修饰)----＞缀合物
糖-OH+CNBr或CDAP---＞氰酸酯+NH2-----SH---＞糖-SH+卤代乙酰化-Prot----＞缀合物
糖-COOH+EDAC+NH2-----NH2---＞糖------NH2+EDAC+COOH-Prot----＞缀合物
糖-COOH+EDAC+NH2----SH-----＞糖----SH+SH-Prot(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白或通过例如SPDP对蛋白的氨基基团修饰后获得)-----＞糖-S-S-Prot
糖-COOH+EDAC+NH2----SH-----＞糖----SH+马来酰亚胺-Prot(氨基基团的修饰)----＞缀合物
糖-COOH+EDAC+NH2----SH---＞糖-SH+卤代乙酰化-Prot----＞缀合物
糖-醛+NH2-----NH2----＞糖---NH2+EDAC+COOH-Prot----＞缀合物
注意：任意合适的碳二亚胺可用于替代上述EDAC。
综上，通常可用于与糖缀合的蛋白载体化学基团的类型为氨基基团(例如在赖氨酸残基上)、COOH基团(例如在天冬氨酸和谷氨酸残基上)和SH基团(如可及)(例如在半胱氨酸残基上)。
任选地载体蛋白与肺炎链球菌糖的比例介于1∶5和5∶1；1∶2和2.5∶1；1∶1和2∶1(w/w)。在一个实施方式中，大部分缀合物，例如6、7、8、9或更多种缀合物中载体蛋白和糖的比例大于1∶1，例如1.1∶1、1.2∶1、1.3∶1、1.4∶1、1.5∶1或1.6∶1。
在一个实施方式中，至少一种肺炎链球菌糖采用CDAP和EDAC经接头缀合至载体蛋白。例如，18C可按如上所述采用CDAP和EDAC经接头(例如具有两个末端肼基基团的接头，如ADH)缀合至载体蛋白。在使用接头时，CDAP可用于将糖缀合至接头，而EDAC可随后用于将接头缀合至蛋白，或者替代性地EDAC可用于首先将接头缀合至蛋白，然后CDAP可用于将接头缀合至糖。
总体而言，本发明的免疫原性组合物可包含剂量介于0.1和20μg、1和10μg或者1和3μg之间的每种糖缀合物。
在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含剂量介于0.1-20μg、0.5-10μg、0.5-5μg或者1-3μg糖之间的每种肺炎链球菌荚膜糖。在一个实施方式中，荚膜糖可以不同剂量存在，例如，部分荚膜糖可以大约或正好1μg的剂量存在，或者部分荚膜糖可以大约或正好3μg的剂量存在。在一个实施方式中，来自血清型3、18C和19F(或者4、18C和19F)的糖以比其它糖更高的剂量存在。在该实施方式的一个方面，血清型3、18C和19F(或者4、18C和19F)以大约或正好3μg的剂量存在，而免疫原性组合物中的其它糖以大约或正好1μg的剂量存在。
“约”或“大约”针对本发明的目的定义为比给定数值多或少10％以内。
在一个实施方式中，肺炎链球菌荚膜糖中至少一种与载体蛋白直接缀合。任选地，肺炎链球菌荚膜糖中至少一种通过CDAP直接缀合。在一个实施方式中，荚膜糖中的大部分例如5、6、7、8、9或更多种通过CDAP直接连接至该载体蛋白(参见WO 95/08348和WO 96/29094)。
该免疫原性组合物可包含肺炎链球菌蛋白，此处称为本发明的肺炎链球菌蛋白。该种蛋白可用作载体蛋白，或者可作为游离蛋白存在，或者可同时作为载体蛋白和游离蛋白存在。本发明的肺炎链球菌蛋白可至少在肺炎球菌生命周期的一部分中暴露在表面，或者可作为由肺炎球菌分泌或释放的蛋白。任选地，本发明的蛋白选自如下类别，例如具有LXXC II型信号序列基序的蛋白(其中X为任意氨基酸，例如，聚组氨酸三联体家族(PhtX))，胆碱结合蛋白，具有I型信号序列基序的蛋白(如，Sp101)，具有LPXTG基序的蛋白(其中X为任意氨基酸，例如，Sp128，Sp130)，以及毒素(例如，Ply)。这些类别(或基序)中的范例为如下蛋白，或者其免疫学功能等同物。
在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含至少1种选自如下组合的蛋白：聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、截短CbpX、LytX家族、截短LytX、截短CbpX-截短LytX嵌合蛋白(或融合体)、肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133。在进一步的实施方式中，该免疫原性组合物包含2种或多种选自如下组合的蛋白：聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、截短CbpX、LytX家族、截短LytX、截短CbpX-截短LytX嵌合蛋白(或融合体)、肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA和Sp128。在进一步的实施方式中，该免疫原性组合物包含2种或多种选自如下组合的蛋白：聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、截短CbpX、LytX家族、截短LytX、截短CbpX-截短LytX嵌合蛋白(或融合体)、肺炎球菌溶血素(Ply)和Sp128。
该Pht(聚组氨酸三联体)家族包含蛋白PhtA、PhtB、PhtD和PhtE。该家族的特征在于脂酶序列、被富脯氨酸区分离的两个结构域和多个组氨酸三联体，可能涉及金属或核苷结合或酶催化活性、(3-5)卷曲螺旋区、保守N末端和异种C末端。它存在于所有测试的肺炎双球菌菌株中。在链球菌和奈瑟菌中也曾发现了同源蛋白。在本发明的一个实施方式中，本发明的Pht蛋白为PhtD。然而，可以理解，术语Pht A、B、D和E指具有下文引用文献中披露的序列的蛋白以及与该参考蛋白具有至少90％一致性的序列同源性的天然存在(和人工)变体。任选地，具有至少95％一致性或至少97％一致性。
对于PhtX蛋白，PhtA披露于WO 98/18930，也被称为Sp36。如上文指出，它是一种来自聚组氨酸三联体家族的蛋白，并具有LXXC的II型信号基序。PhtD披露于WO 00/37105，也被称为Sp036D。如上文指出，它也是一种来自聚组氨酸三联体家族的蛋白，并具有II型LXXC信号基序。PhtB披露于WO 00/37105，也被称为Sp036B。PhtB家族的另一成员为C3-降解多肽，披露于WO 00/17370。该蛋白也来自于聚组氨酸三联体家族，并具有II型LXXC信号基序。例如，一种免疫原性功能等同物是披露于WO 98/18930的蛋白Sp42。一种截短PhtB(约79kD)披露于WO99/15675，也被认为是PhtX家族的一元。PhtE披露于WO00/30299并被称为BVH-3。此处提及Pht蛋白时表示可使用Pht蛋白的免疫原性片段或其融合体。例如，提及PhtX时包括任意Pht蛋白的免疫原性片段或其融合体。提及PhtD时也表示提及在例如WO0198334中发现的PhtDE或PhtBE融合体。
肺炎球菌溶血素是一种多功能毒素，其具有明显的细胞溶解性(溶血性)和补体激活活性(Rubins等人，Am.Respi.Cit Care Med，153：1339-1346(1996))。该毒素不由肺炎双球菌分泌，但在自溶素影响下在肺炎双球菌溶解时释放。它的影响包括，例如，刺激人单核细胞生成炎症性细胞因子，抑制纤毛对人呼吸道上皮的拍打，以及减少细菌活性和嗜中性白血球迁移。肺炎球菌溶血素最明显的影响是在红血细胞的溶解，其涉及与胆固醇结合。由于它是一种毒素，它需要在体内施用前被解毒(在适于保护的剂量下提供时对人体无毒)。野生型或天然肺炎球菌溶血素的表达和克隆已为本领域所知。例如，参见Walker等人(Infect Immun，55：1184-1189(1987))、Mitchell等人(BiochimBiophys Acta，1007：67-72(1989)和Mitchell等人(NAR，18：4010(1990))。ply的解毒可通过化学手段实现，例如，进行甲醛或戊二醛处理或两者的组合(WO 04081515，PCT/EP2005/010258)。该种方法在本领域中公知由于各种毒素。替代性地，ply可遗传解毒。因此，本发明包括可以是例如突变蛋白的肺炎球菌蛋白衍生物。此处所用的术语“突变的”表示采用公知的定点突变技术或其它常规方法进行了一个或多个氨基酸的删除、添加或替换的分子。例如，如上所述，突变体ply蛋白可被改变为生物失活，同时保持其免疫原性表位，例如参见WO90/06951，Berry等人(Infect Immun，67：981-985(1999))和WO99/03884。
此处所用的术语“Ply”应理解为适于医学用途的突变或解毒肺炎球菌溶血素(即，无毒的)。
对于胆碱结合蛋白家族(CbpX)，该家族的成员最初被鉴定为可通过胆碱亲合层析纯化的肺炎球菌蛋白。所有的胆碱结合蛋白为非共价结合至细胞壁磷壁酸和膜关联脂磷壁酸的磷酸胆碱部分。这整个家族在结构上具有多个共同区域，尽管这些蛋白的确切性质(氨基酸序列、长度等)可能不同。总体而言，胆碱结合蛋白包含N末端区(N)、保守重复区(R1和/或R2)、脯氨酸富集区(P)和保守胆碱结合区(C)，由多个重复单元组成，构成了该蛋白的约一半。本申请中所用的术语“胆碱结合蛋白家族(CbpX)”选自在WO97/41151中鉴定的胆碱结合蛋白PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA披露于WO97/41151。CbpD和CbpG披露于WO00/29434。PspC披露于WO97/09994。PbcA披露于WO98/21337。SpsA是一种披露于WO 98/39450的胆碱结合蛋白。任选地胆碱结合蛋白选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。
本发明的一个实施方式包括截短CbpX，其中“CbpX”如上定义，而“截短”指CbpX蛋白缺失了50％或更多的胆碱结合区(C)。任选地，该种蛋白缺失了整个胆碱结合区。任选地，该种截短蛋白缺失了(i)胆碱结合区和(ii)N末端一部分以及该蛋白的一半，并保留了至少一个重复区(R1或R2)。任选地，该截短物具有2个重复区(R1或R2)。该种实施方式的范例为WO99/51266或WO99/51188中所示的NR1xR2和R1xR2，然而，缺失了类似胆碱结合区的其它胆碱结合蛋白通常在本发明的范围之内。
LytX家族是与细胞溶解相关的膜相关蛋白。N末端结构与包含胆碱结合结构域，然而，LytX家族并不具有上述指出的CbpA家族中发现的所有特征，因此对于本发明，LytX家族被认为不同于CbpX家族。与CbpX家族相反，C末端结构域包含LytX蛋白家族的催化结构域。该家族包括了LytA、B和C。对于LytX家族，LytA披露于Ronda等人，Eur J Biochem，164：621-624(1987)。LytB披露于WO 98/18930，也被称为Sp46。LytC也披露于WO98/18930，也被称为Sp9。本发明的一个实施方式包括LytC。
另一实施方式包括截短LytX，其中“LytX”如上定义，而“截短”指缺失了胆碱结合区50％或更多的LytX蛋白。任选地，该种蛋白缺失了整个胆碱结合区。本发明的另一实施方式包括了截短CbpX-截短LytX嵌合蛋白(或融合体)。任选地，其包含了CbpX的NR1xR2(或R1xR2)和LytX的C末端部分(Cterm，即，缺失了胆碱结合结构域)(例如，LytCCterm或Sp91Cterm)。任选地，CbpX选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。任选地，它是CbpA。任选地，LytX是LytC(也称为Sp91)。本发明的另一实施方式是缺失了胆碱结合结构域(C)并作为具有LytX的融合蛋白表达截短的PspA或PsaA。任选地，LytX为LytC。
PsaA和PspA均为本领域所知。例如，PsaA及其跨膜删除变体已被Berry & Paton，Infect Immun 1996 Dec；64(12)：5255-62描述。PspA及其跨膜删除变体已被例如US 5804193、WO 92/14488和WO 99/53940所披露。
Sp128和Sp130披露于WO00/76540。Sp125是具有LPXTG细胞壁锚定基序的肺炎球菌表面蛋白的范例(其中X为任意氨基酸)。在具有该基序的该类肺炎球菌表面蛋白中的任意蛋白已被发现可用于本发明的背景中，因此被认为本发明的其它蛋白。Sp125本身披露于WO 98/18930，并被称为ZmpB-一种锌金属蛋白酶。Sp101披露于WO 98/06734(其中它具有参考编号y85993)。它以I型信号序列为特征。Sp133披露于WO 98/06734(其中它具有参考编号y85992)。它同样以I型信号序列为特征。
可包括在组合疫苗(特别是用于预防中耳炎)中的粘膜炎莫拉菌蛋白抗原的范例为：OMP106[WO 97/41731(Antex) & WO 96/34960(PMC)]；OMP21或其片段(WO 0018910)；LbpA和/或LbpB[WO 98/55606(PMC)]；TbpA和/或TbpB[WO 97/13785 & WO 97/32980(PMC)]；CopB[Helminen ME，等人(1993)Infect.Immun.61：2003-2010]；UspA1和/或UspA2[WO 93/03761(University of Texas)]；OmpCD；HasR(PCT/EP99/03824)；PilQ(PCT/EP99/03823)；OMP85(PCT/EP00/01468)；lipo06(GB 9917977.2)；lipo10(GB 9918208.1)；lipo11(GB 9918302.2)；lipo18(GB 9918038.2)；P6(PCT/EP99/03038)；D15(PCT/EP99/03822)；OmplA1(PCT/EP99/06781)；Hly3(PCT/EP99/03257)；以及OmpE。可包括在组合疫苗(特别是用于预防中耳炎)中的不可分型的流感嗜血杆菌抗原或其片段的范例：Fimbrin蛋白[(US 5766608-Ohio State Research Foundation)]其包含其肽的融合体[例如LB1(f)肽融合体；US 5843464(OSU)或WO 99/64067]；OMP26[WO 97/01638(Cortecs)]；P6[EP 281673(State University of New York)]；TbpA和/或TbpB；Hia；Hsf；Hin47；Hif；Hmw1；Hmw2；Hmw3；Hmw4；Hap；D15(WO 94/12641)；P2；以及P5(WO 94/26304)。
本发明的蛋白还可被有利地合并。合并表示该免疫原性组合物包含来自以下组合的所有蛋白，该蛋白可作为载体蛋白或作为游离蛋白或者作为这两者的混合物。例如，在下文所示的两种蛋白的组合中，两种蛋白均被用作载体蛋白，或者均作为游离蛋白存在，或者可同时作为载体蛋白和游离蛋白，或者一种可作为载体蛋白和游离蛋白而另一种仅作为载体蛋白或仅作为游离蛋白，或者一种可作为载体蛋白而另一种作为游离蛋白。当给出三种蛋白的组合时，存在类似的可能性。组合包括，但不限于PhtD+NR1xR2、PhtD+NR1xR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtD+Ply、PhtD+Sp128、PhtD+PsaA、PhtD+PspA、PhtA+NR1xR2、PhtA+NR1xR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtA+Ply、PhtA+Sp128、PhtA+PsaA、PhtA+PspA、NR1xR2+LytC、NRlxR2+PspA、NR1xR2+PsaA、NR1xR2+Sp128、R1xR2+LytC、R1xR2+PspA、RlxR2+PsaA、R1xR2+Sp128、R1xR2+PhtD、R1xR2+PhtA。任选地，NR1xR2(或R1xR2)来自于CbpA或PspC。任选地，它来自于CbpA。其它组合包括3蛋白组合，例如PhtD+NR1xR2+Ply和PhtA+NR1xR2+PhtD。在一个实施方式中，该疫苗组合物包含作为载体蛋白的解毒肺炎球菌溶血素和PhtD或PhtDE。在进一步的实施方式中，该疫苗组合物包含作为游离蛋白的解毒肺炎球菌溶血素和PhtD或PhtDE。
在一个独立的方面，本发明提供了免疫原性组合物，其包含至少四种含有来自不同肺炎链球菌血清型的糖的肺炎链球菌荚膜糖缀合物，其中至少一种糖缀合PhtD或其融合蛋白，且该免疫原性组合物能够引发针对PhtD的有效免疫应答。
对PhtD或其融合蛋白的有效免疫应答可通过例如实施例15所述的保护测定进行测量。有效免疫应答可在异种菌株攻击后7天提供至少40％、50％、60％、70％、80％或90％的存活。假定该攻击菌株是异种的，所提供的保护是由于对PhtD或其融合蛋白的免疫应答。
替代性地，对PhtD的有效免疫应答可通过例如实施例14所述的ELISA进行测量。有效免疫应答给出了至少250、300、350、400、500、550或600μg/ml GMC的抗-PhtD IgG应答。
例如，该免疫原性组合物包含缀合至PhtD或其融合蛋白的来自不同血清型的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种肺炎链球菌荚膜糖。例如进一步选自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15、17F、18C、19A、19F、20、23F和33F的血清型22F和1、2、3、4、5、6或7被缀合至PhtD。在一个实施方式中，血清型3、6A和22F中的两种或三种被缀合至PhtD或其融合蛋白。
在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含至少一种通过接头(例如ADH)缀合至PhtD或其融合蛋白的肺炎链球菌荚膜糖。在一个实施方式中，采用了如下列举的其中一种缀合化学。
在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含了至少一种缀合至PhtD或其融合蛋白的肺炎链球菌荚膜糖，其中PhtD与糖在缀合物中的比例介于6∶1和1∶5、6∶1和2∶1、6∶1和2.5∶1、6∶1和3∶1、6∶1和3.5∶1(w/w)或大于(即，包含更大比例的PhtD)2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1、3.5∶1或4.0∶1(w/w)。
在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含肺炎球菌溶血素。
本发明进一步提供了包含本发明的免疫原性组合物和药学可接受的赋形剂的疫苗。
本发明的疫苗可补充佐剂，特别是当该疫苗意图用于老年人群，同时用于婴儿时。合适的佐剂包括铝盐，例如氢氧化铝凝胶或磷酸铝或明矾，但也可以是其它的金属盐，例如钙、镁、铁或锌的盐，或者可以是酰化酪氨酸或者酰化糖、阳离子或阴离子衍生的糖或者聚磷腈的不溶性悬浮液。
该佐剂任选地选择为TH1型应答的优选诱导剂。该种高水平的Th1型细胞因子倾向于促进针对给定抗原的细胞介导免疫应答的诱导，而高水平的Th2型细胞因子倾向于促进针对该抗原的体液免疫应答的诱导。
Th2和Th2型免疫应答的区别并不绝对。实际上一个个体将支持被描述为主要是Th1或主要是Th2的免疫应答。然而，通常可方便的以Mosmann和Coffman对鼠CD4+ve T细胞克隆的描述来考虑细胞因子家族(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)TH1 and TH2 cells：different patterns oflymphokine secretion lead to different functional properties.(Annual Review ofImmunology，7，p145-173)。习惯上，Th1型应答与T淋巴细胞生成INF-γ和IL-2细胞因子相关联。其它通常与Th1型免疫应答的诱导关联的细胞因子并非由T细胞生成，例如IL-2。相反地，Th2型应答与IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌关联。促进主要是Th1应答的合适佐剂系统包括：单磷酰脂质A或其衍生物(或者一般而言的解毒lipid A-例如参见WO2005107798)，特别是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)(其制备可参见GB 2220211A)；以及单磷酰脂质A，任选地3-脱-O-酰化单磷酰脂质A，和铝盐(例如磷酸铝或氢氧化铝)或水包油乳液的组合。在该种组合中，抗原和3D-MPL包含在相同的颗粒结构中，从而允许抗原性和免疫刺激信号被更有效传递。研究显示3D-MPL能够进一步增强alum吸附抗原的免疫原性[Thoelen等人Vaccine(1998)16：708-14；EP 689454-B1]。
增强系统包括单磷酰脂质A和皂甙衍生物的组合，特别是WO 94/00153中披露的QS21和3D-MPL的组合，或者WO 96/33739中披露的反应原性较低的组合物，其中以胆固醇淬灭QS21。特别有效的佐剂配方包括在WO95/17210中描述的在水包油乳液中的QS21、3D-MPLS和生育酚。在一个实施方式中，该免疫原性组合物额外包含皂甙，其可以是QS21。该配方还可包含水包油乳液和生育酚(WO 95/17210)。含有未甲基化的CpG的寡核苷酸(WO 96/02555)和其它免疫调节寡核苷酸(WO0226757和WO03507822)也是TH1应答的潜在诱导剂，并适于在本发明使用。
具体的佐剂选自金属盐、水包油乳液、Toll样受体激动剂(特别是Toll样受体2激动剂、Toll样受体3激动剂、Toll样受体4激动剂、Toll样受体7激动剂、Toll样受体8激动剂和Toll样受体9激动剂)、皂甙及其组合。
一种可用于本发明的疫苗组合物的佐剂为来自革兰氏阴性细菌菌株的疱(bleb)或外膜囊泡，例如WO02/09746所启示-特别是脑膜炎奈瑟氏球菌疱。疱的佐剂特性可通过在其表面保留LOS(脂低聚糖)得到增强(通过以低浓度清洁剂[例如0-0.1％脱氧胆酸盐]萃取)。LOS可通过WO02/09746中讨论的msbB(-)或htrB(-)突变进行解毒。佐剂特性还可通过从脑膜炎球菌疱保留PorB(并任选地去除PorA)得到增强。佐剂特性还可通过截短脑膜炎球菌疱上的LOS的外核糖结构得到增强-例如通过WO2004/014417中讨论的lgtB(-)突变。替代性地，前述LOS(例如，从msbB(-)和/或lgtB(-)菌株分离)可被纯化并被用作本发明组合物的佐剂。
可用于本发明的组合物的另一佐剂选自如下组合：皂甙、脂质A或其衍生物、免疫刺激寡核苷酸、烷基氨基葡糖苷磷酸酯、水包油乳液或其组合。可用于本发明的组合物的其它佐剂为与另一佐剂组合的金属盐。在一个实施方式中，该佐剂为Toll样受体激动剂，特别是Toll氧受体2、3、4、7、8或9的激动剂，或者皂甙，特别是Qs21。在一个实施方式中，佐剂系统包含来自上文列表的两种或多种佐剂。具体而言，该组合任选地包含皂甙(特别是Qs21)佐剂和/或Toll样受体9激动剂，例如含CpG的免疫刺激寡核苷酸。其它的组合包含皂甙(特别是Qs21)佐剂和Toll样受体4激动剂或其3脱酰化衍生物3D-MPL，或者包含皂甙(特别是Qs21)佐剂和Toll样受体4配体如烷基氨基葡糖苷磷酸酯。
在一个实施方式中，佐剂为3D-MPL和QS21的组合(EP 0 671 948 B1)，包含3D-MPL和QS21的水包油乳液(WO 95/17210，WO 98/56414)，或者与其它载体配制的3D-MPL(EP 0 689 454 B1)。在一个实施方式中，佐剂系统包含中所述的3D MPL、QS21和CpG寡核苷酸的组合。
在一个实施方式中，该佐剂为Toll样受体(TLR)4配体，任选地如脂质A衍生物激动剂，具体而言单磷酰脂质A，更具体而言3脱酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)。
3D-MPL可由GlaxoSmithKline Biologicals North America获得，主要促进具有IFN-g(Th1)表型的CD4+T细胞应答。它可根据GB 2 220 211A中披露的方法生成。从化学上看它是具有2、3、4或6条酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A。在一个实施方式中，本发明的该组合物采用了微粒3D-MPL。微粒3D-MPL具有可通过0.22μm过滤器进行无菌过滤的粒径。该种制备物描述于国际专利申请WO 94/21292。脂质A的人工衍生物已知，并被认为是TLR4激动剂，包括但不限于：
OM174(2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧基四-癸酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]-α-D-吡喃葡糖基二氢磷酸)，(WO 95/14026)
OM 294DP(3S，9R)-3--[(R)-十二烷酰氧基四癸酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1，10-双(二氢磷酸)(WO99/64301和WO 00/0462)
OM 197 MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基四癸酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1-二氢磷酸10-(6-氨基己酸)(WO 01/46127)
其它可用的TLR4配体为例如WO9850399或US6303347所披露的烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)(同样披露了AGP的制备方法)或者US6764840中披露的AGP药学可接受的盐。部分AGP为TLR4激动剂，部分为TLR4拮抗剂。两者均为认为可用作佐剂。
可用于本发明的另一免疫刺激剂是Quil A及其衍生物。Quil A是一种从南美树种Quilaja Saponaria Molina中分离的皂甙制备物，并由Dalsgaard等人在1974年首次描述为具有佐剂活性(“saponin adjuvants”，Archiv.für diegesamte Virusforschung，Vol.44，Springer Verlag，Berlin，p243-254)。以通过HPLC分离了Quil A的纯化片段，其保留了佐剂活性，而不具有Quil A的毒性(EP 0 362 278)，例如QS7和QS21(也被称为QA7和QA21)。QS-21是一种来自的Quillaja saponaria Molina树皮的天然皂甙，其诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTLs)、Th1细胞和主要的IgG2a抗体应答，并且是本发明背景中的皂甙。
QS21的具体配方已被表述，并且是本发明的实施方式，这些配方进一步包含固醇(WO96/33739)。本发明的皂甙形成部分可以微团、混合微团(可选地具有胆盐)或者可以ISCOM基质(EP 0 109 942 B1)、脂质体或相关胶体结构例如蠕虫状或环状多聚体复合物或油脂/分层结构以及与胆固醇和脂质配制形成的薄片、或以水包油乳液(例如在WO 95/17210)的形式分离。该皂甙可与金属盐(例如氢氧化铝或磷酸铝)(WO 98/15287)相关联。
任选地，该皂甙以脂质体、ISCOM或水包油乳液形式存在。
增强系统包括单磷酰脂质A(或解毒脂质A)和皂甙衍生物的组合，特别是WO 94/00153中披露的QS21和3D-MPL的组合，或者WO 96/33739中披露的反应原性较低的组合物，其中以胆固醇淬灭QS21。一种特别有效的佐剂配方包括在WO 95/17210中描述的在水包油乳液中的具有或不具有QS21和/或3D-MPL的生育酚。在一个实施方式中，该免疫原性组合物额外包含皂甙，其可以是QS21。
也可使用免疫刺激寡核苷酸或任意其它Toll样受体(TLR)9激动剂。在本发明的佐剂或疫苗中使用的寡核苷酸为可选地含CpG的寡核苷酸，任选地包含被至少三个、任选地至少六个或更多个核苷酸分离的两个或多个双核苷酸CpG基序。CpG基序是一种后接鸟嘌呤核苷酸的胞嘧啶核苷酸。本发明的CpG寡核苷酸通常为脱氧核苷酸。在一个实施方式中，该寡核苷酸中的核苷酸间键合为二硫代磷酸酯或硫代磷酸酯键，尽管磷酸二酯和其它核苷酸间键合键也在本发明的范围内。同样包含在本发明范围内的是与核苷酸间键合混合的寡核苷酸。生产硫代磷酸酯寡核苷酸或而硫代磷酸酯的方法描述于US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204。
寡核苷酸的范例具有如下序列。这些序列任选地包含硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键合。
OLIGO 1(SEQ ID NO：1)：TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)
OLIGO 2(SEQ ID NO：2)：TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)
OLIGO 3(SEQ ID NO：3)：ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGCACC ACG
OLIGO 4(SEQ ID NO：4)：TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)
OLIGO 5(SEQ ID NO：5)：TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG1668)
OLIGO 6(SEQ ID NO：6)：TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G(CpG5456)
替代性的CpG寡核苷酸可包含上述序列，其中具有序列内删除或添加。
本发明中采用的CpG寡核苷酸可通过本领域已知的方法合成(例如参见EP 468520)。这些寡核苷酸可方便地采用自动合成仪合成得到。
该佐剂可以是水包油乳液或者可包含于其它佐剂组合的水包油乳液。该乳液系统的油相可选地包含可代谢的油。术语可代谢的油的含义已为本领域公知。可代谢的可被定义为“能够通过代谢转化的”(Dorland’s Illustrated MedicalDictionary，W.B.Sanders Company，25th edition(1974))。该油可以是任意植物油、鱼油、动物或人造油，其对受体没有毒性并能够通过代谢转化。坚果、种子和谷物是植物油的常见来源。人造有也是本发明的一部分，并可包括已有市售的油，例如
Figure GPA00001032855600261
等。角鲨烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳己烯)是一种不饱和油，其大量发现于鲨鱼肝油中，少量发现于橄榄油、麦胚油、米糠油和酵母中，并且是一种可用于本发明的油。角鲨烯是一种可代谢的油，事实上它是胆固醇生物合成中的一种中间体(Merck index，10th Edition，entry no.8619)。
母育酚(例如，维生素E)也常被用在油乳液佐剂中(EP 0 382 271 B1；US5667784；WO 95/17210)。在本发明的油乳液(任选地水包油乳液)中所用的母育酚可参照EP 0 382 271 B1所述进行配制，其中母育酚可作为母育酚液体的分散体，任选地包含乳化剂，任选地其直径小于1微米。替代性恶，该母育酚可与另一种油联用，以形成油乳液的油相。可与母育酚联用的油乳液的范例已在此处描述，例如上述可代谢的油。
水包油乳液本身已被建议用作佐剂组合物(EP 0 399 843B)，此外水包油乳化和其它活性剂的组合也被描述为疫苗的佐剂(WO 95/17210；WO 98/56414；WO 99/12565；WO 99/11241)。其它的油乳液佐剂已被描述，例如油包水乳液(US 5,422,109；EP 0 480 982 B2)和水包油乳液(US 5,424,067；EP 0 480 981 B)。所有这些形成油乳液系统(特别当结合了母育酚时)，以形成本发明的佐剂和组合物。
在一个实施方式中，该油乳液(例如水包油乳液)进一步包含乳化剂，例如TWEEN 80和/或固醇(如胆固醇)。
在一个实施方式中，该油乳液(任选地水包油乳液)包含可代谢的无毒性油，例如角鲨烷、角鲨烯或生育酚如α生育酚(以及可选地角鲨烯和α生育酚两者)以及任选地包含乳化剂(或表面活性剂)如Tween 80。还可包含固醇(如胆固醇)。
生产水包油乳液的方法已为本领域技术人员公知。该方法通常包括将含母育酚的油相与表面活性剂(如PBS/TWEEN80TM溶液)混合，然后采用匀浆机匀浆化，本领域技术人员显然了解将混合物两次通过注射器针头的方法可用于将小量液体匀浆化。同样地，本领域技术人员可采用微射流仪(M110S微射流机器，最大50次，周期2分钟，最大输入压力6bar(输出压约850bar))中的乳化过程来生成更小或更大体积的乳液。这种方法可通过包括测量所得乳液直至制备物达到所需直径的油滴的常规实验实现。
在水包油乳液中，该油和乳化剂应当在水性载体中。该水性载体可以是，例如，磷酸盐缓冲盐水。
在稳定的水包油乳液中发现的油滴的大小任选地小于1微米，可以在大约30-600nm范围内，任选地直径大约为30-500nm，且任选地直径大约为150-500nm，特别是直径大约150nm，该直径可通过光子相关光谱学测定。就此而言，数量上80％的油滴应在该范围内，任选地数量上超过90％和任选地超过95％的油滴在指定的大小范围内。在本发明的油乳液中存在的成分如角鲨烯的量通常约油(总剂量体积)的0.5-20％或2-10％范围内；当α生育酚存在时为2-10％；表面活性剂(例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)为0.3-3％。任选地油(例如角鲨烯)∶母育酚(例如α-母育酚)的比例等于或小于1，因为这提供了更稳定的乳液。乳化剂如Tween80或Span 85也可以约1％的水平存在。在部分情况下，本发明的疫苗可有利地进一步包含稳定剂。
乳液系统的范例描述于WO 95/17210、WO 99/11241和WO 99/12565，其中披露了基于角鲨烯、生育酚和TWEEN 80，任选地与免疫刺激剂QS21和/或3D-MPL配制的乳液佐剂。
因此在本发明的一个实施方式中，本发明的佐剂可额外地进一步包含免疫刺激剂，例如LPS或其衍生物和/或皂甙。其它免疫刺激剂的范例在此处描述，并描述于“Vaccine Design-The Subunit and Adjuvant Approach”1995，Pharmaceutical Biotechnology，Volume 6，Eds.Powell，M.F.，and Newman，M.J.，Plenum Press，New York and London，ISBN 0-306-44867-X。
在一个实施方式中，根据本发明的佐剂和免疫原性组合物在上述油乳液中包含皂甙(例如QS21)和/或LPS衍生物(例如3D-MPL)，任选地具有固醇(例如，胆固醇)。此外，该油乳液(任选地水包油乳液)可包含span 85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。包含水包油乳液、固醇和皂甙的佐剂描述于WO 99/12565。
典型地，用于向人施用时，皂甙(例如QS21)和/或LPS衍生物(例如3D-MPL)在人用剂量的免疫原性组合物中的范围为每剂量1μg-200μg，例如10-100μg，或10μg-50μg。通常油乳液(任选地水包油乳液)将包含2-10％可代谢油。任选地它将包含2-10％角鲨烯，2-10％α生育酚和0.3-3％(任选地0.4-2％)乳化剂(任选地tween 80[聚氧乙烯山梨醇单油酸酯])。当角鲨烯和α生育酚都存在时，任选地角鲨烯∶α生育酚的比例等于或小于1，这提供了更稳定的乳液。Span 85(去水山梨糖醇三油酸酯)也可在本发明所用乳液中以0.5-1％的水平存在。在部分情况下，本发明的免疫原性组合物和疫苗可有利地进一步包含稳定剂，例如其它乳化剂/表面活性剂，包括辛酸(merckindex 10th Edition，entry no.1739)，例如三辛酸甘油酯。
当包含角鲨烯和皂甙(任选地QS21)时，在配方中还可有利地包含固醇(任选地胆固醇)，这允许减少乳液中油的总体水平。这带来了生产成本的下降，疫苗总体舒适性的提高，以及所得免疫应答的定性和定量改善，例如提高了IFN-γ生产。相应地，本发明的佐剂系统通常包含的可代谢的油∶皂甙(w/w)比例范围为200∶1至300∶1，此外本发明还可以“低油”方式使用，其任选的范围为1∶1至200∶1，任选地20∶1至100∶1，或者约48∶1，该疫苗保留了所有成分的有益佐剂性能，同时反应原性大大下降。相应地，部分实施方式中的角鲨烯∶QS21(w/w)比例范围为1∶1至250∶1，或20∶1至200∶1，或20∶1至100∶1，或约48∶1。任选地以此处所述的皂甙∶固醇比例包含固醇(例如，胆固醇)。
本发明的乳液系统任选地具有在亚微米范围内的小油滴大小。任选地该油滴直径将在120-750nm或120-600nm范围内。
一种特别有效的佐剂配方(最终与AlPO4在本发明的免疫原性组合物中合并)包含了皂甙(例如，QS21)、LPS衍生物(例如3D-MPL)和油乳液(例如含于水包油乳液的角鲨烯和α生育酚)，其描述于WO 95/17210或WO 99/12565(特别是实施例2，表1中的佐剂配方11)。
TLR 2激动剂的范例包括肽聚糖或脂蛋白。咪唑喹啉，例如咪喹莫特和瑞喹莫德是已知的TLR7激动剂。单链RNA也是已知的TLR激动剂(人TLR8的和小鼠的TLR7)，而取链RNA和聚IC(聚肌苷酸-聚胞苷酸，一种商业合成的病毒RNA模拟物)是示范性的TLR 3激动剂。3D-MPL是TLR4激动剂的范例，而CPG是TLR9动剂的范例。
免疫原性组合物可包含吸附在金属盐上的抗原和免疫刺激剂。EP 0 576478 B1、EP 0 689 454 B1和EP 0 633 784 B1描述了基于铝的疫苗制剂，在其颗粒上吸附了抗原和免疫刺激剂3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)。在这些情况下，抗原首先被吸附在铝盐上，然后将免疫刺激剂3D-MPL吸附到相同的铝盐颗粒上。该方法包括用超声在水浴中悬浮3D-MPL，直至颗粒大小介于80和500nm。该抗原通常在室温搅拌下在铝盐上吸附一小时。然后将3D-MPL悬浮液添加至吸附抗原，并将该配方在室温下孵育1小时，并在4℃下保存待用。
在另一方法中，该免疫刺激剂和该抗原分别吸附在单独的金属颗粒上，如EP 1126876所述。这种改进的方法包括将免疫刺激剂吸附在金属盐颗粒上，然后将抗原吸附在另一金属盐颗粒上，然后混合分散的金属盐颗粒以形成疫苗。在本发明中所用的佐剂可以是包含吸附在金属盐颗粒上的免疫刺激剂的佐剂组合物，其特征在于该金属盐颗粒基本不含其它抗原。此外，本发明提供的疫苗的特征在于该免疫刺激剂被吸附在基本不含其它抗原的金属盐颗粒上，且该金属盐颗粒吸附至基本不含其它免疫刺激剂的抗原。
相应地，本发明提供了包含免疫刺激剂的佐剂配方，其被吸附在金属盐颗粒上，特征在于该组合物基本不含其它抗原。此外，本发明的佐剂配方可以是中间体，如果采用该种佐剂时，疫苗的生产中需要该种中间体。相应地提供了一种生产疫苗的方法，其包括将一种或多种免疫刺激剂吸附在金属颗粒上的佐剂组合物与抗原相混合。任选地，该抗原已被预先吸附在金属盐上。所述的金属盐与吸附了免疫刺激剂的金属盐相同或类似。任选地，该金属盐为铝盐，例如磷酸铝或氢氧化铝。
本发明进一步提供了疫苗组合物，其包含了第一金属盐颗粒上的免疫刺激剂，以及吸附在金属盐上的抗原，其特征在于该第一和第二金属盐颗粒是单独的颗粒。
此处所述的LPS或LOS衍生物或突变体或脂质A衍生物被设计为别天然脂多糖具有更低的毒性(例如，3D-MPL)，并对于此处所述的部分的任意用途而言是可以互换的等同物。
在一个实施方式中，在本发明的组合物中所用的佐剂包含脂质体载体(通过已知技术由磷脂(例如二油酰基磷脂酰胆碱[DOPC])和可选地固醇[例如胆固醇]制备)。该种脂质体载体可携带脂质A衍生物[例如3D-MPL，-参见上文]和/或皂甙(例如QS21参见上文)。在一个实施方式中，该佐剂包含(每0.5mL剂量)0.1-10mg、0.2-7、0.3-5、0.4-2或0.5-1mg(e.g.0.4-0.6、0.9-1.1、0.5或1mg)磷脂(例如DOPC)、0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25or 0.125mg)固醇(例如胆固醇)、5-60、10-50、or 20-30μg(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)脂质A衍生物(例如3D-MPL)以及5-60、10-50或20-30μg(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)皂甙(例如QS21)。
该佐剂特别适用于老年疫苗制剂。在一个实施方式中，含有该佐剂的该疫苗组合物包含来自至少如下血清型的糖缀合物：4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(还可包含一种或多种来自血清型3、6A、19A和22F的糖缀合物)，其中在人类接种者中针对一种或多种(或者所有)疫苗成分4、6B、9V、14、18C、19F和23F诱导的GMC抗体效价不明显低于由
Figure GPA00001032855600301
疫苗诱导的相应效价。
在一个实施方式中，本发明的组合物中所用的佐剂包含由可代谢的油(例如角鲨烯)、乳化剂(例如Tween 80)和任选地母育酚(例如α生育酚)制成的水包油乳液。在一个实施方式中，该佐剂包含(每0.5mL剂量)0.5-15、1-13、2-11、4-8或5-6mg(例如2-3、5-6或10-11mg)可代谢的油(如角鲨烯)、0.1-10、0.3-8、0.6-6、0.9-5、1-4或2-3mg(例如0.9-1.1、2-3或4-5mg)乳化剂(如Tween 80)以及任选地0.5-20、1-15、2-12、4-10、5-7mg(例如11-13、5-6或2-3mg)母育酚(如α生育酚)。
该佐剂可任选地进一步包含5-60、10-50或20-30μg(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)脂质A衍生物(例如3D-MPL)。
这些佐剂特别适于婴儿或老年疫苗制剂。在一个实施方式中，含有该佐剂的该疫苗组合物包含来自至少如下血清型的糖缀合物：4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(还可包含一种或多种来自血清型3、6A、19A和22F的糖缀合物)，其中在人类接种者中针对一种或多种(或者所有)疫苗成分4、6B、9V、14、18C、19F和23F诱导的GMC抗体效价不明显低于由
Figure GPA00001032855600311
疫苗诱导的相应效价。
该佐剂可任选地包含0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125mg)固醇(例如胆固醇)、5-60、10-50或20-30μg(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)脂质A衍生物(例如3D-MPL)以及5-60、10-50或20-30μg(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)皂甙(例如QS21)。
该佐剂特别适用于老年疫苗制剂。在一个实施方式中，含有该佐剂的该疫苗组合物包含来自至少如下血清型的糖缀合物：4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(还可包含一种或多种来自血清型3、6A、19A和22F的糖缀合物)，其中在人类接种者中针对一种或多种(或者所有)疫苗成分4、6B、9V、14、18C、19F和23F诱导的GMC抗体效价不明显低于由
Figure GPA00001032855600312
疫苗诱导的相应效价。
在一个实施方式中，用于本发明组合物的该佐剂包含磷酸铝和脂质A衍生物(如3D-MPL)。该佐剂可包含(每0.5mL剂量)100-750、200-500、400-500或300-400μg Al(磷酸铝)以及5-60、10-50或20-30μg(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)脂质A衍生物(例如3D-MPL)。
该佐剂特别适用于老年或婴儿疫苗制剂。在一个实施方式中，含有该佐剂的该疫苗组合物包含来自至少如下血清型的糖缀合物：4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(还可包含一种或多种来自血清型3、6A、19A和22F的糖缀合物)，其中在人类接种者中针对一种或多种(或者所有)疫苗成分4、6B、9V、14、18C、19F和23F诱导的GMC抗体效价不明显低于由
Figure GPA00001032855600321
疫苗诱导的相应效价。
包含该疫苗制备物的本发明的免疫原性组合物可通过经全身或粘膜途径施用所述疫苗的方式保护或治疗易受传染的哺乳动物。这些施用可包括通过肌肉内(IM)、腹膜内(IP)、皮内(ID)或皮下(SC)途径注射；或通过粘膜施用至口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。通过鼻内(IN)施用疫苗治疗肺炎或中耳炎是可能的(因为肺炎双球菌的鼻咽运输能被更有效的预防，从而在其最早的阶段减少感染)。尽管本发明的疫苗可作为单个剂量施用，其成分也可同时或不同时共同施用(例如肺炎球菌糖缀合物可在该疫苗的任意细菌蛋白成分的施用同时或1-2周后单独施用，以最佳最佳协调彼此的免疫应答)。对于同时施用，任选地Th1佐剂可存在于任意或所有的不同施用中。处理单途径施用，可采用2种不同的施用途径。例如，糖或糖缀合物可IM(或ID)施用，而细菌蛋白可IN(或ID)施用。此外，本发明的疫苗可IM施用初次剂量，IN施用促升剂量。
在疫苗中的蛋白抗原含量通常在1-100μg范围内，任选地在5-50μg范围内，例如在5-25μg范围内。在初次接种后，对象可以充分的间隔接受一次或多次促升接种。
疫苗制备总体描述于疫苗设计中(“The subunit and adjuvant approach”(eds Powell M.F.& Newman M.J.)(1995)Plenum Press New York)。Fullerton的美国专利US 4,235,877描述了在脂质体中的胶囊化。
本发明的疫苗或免疫原组合物可被贮存在溶液中或被冻干。在一个实施方式中，该溶液在作为无定形冻干保护剂的糖(例如蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖或者乳糖)的存在下被冻干。在一个实施方式中，该溶液在作为无定形冻干保护剂的糖以及提供改善的饼结构的填充剂(例如甘氨酸或甘露糖醇)的存在下被冻干。结晶填充剂的存在允许在高盐浓度存在下缩短冷冻干燥周期。用于本发明的免疫原性组合物或疫苗的冷冻干燥的该种混合物的范例包括蔗糖/甘氨酸、海藻糖/甘氨酸、葡萄糖/甘氨酸、甘露糖/甘氨酸、麦芽糖/甘氨酸、蔗糖/甘露糖醇/海藻糖/甘露糖醇、葡萄糖/甘露糖醇、甘露糖/甘露糖醇和麦芽糖/甘露糖醇。典型的两种组分的摩尔比例任选地为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5或1∶6。本发明的免疫原性组合物任选地包含上述冻干试剂。
上述稳定剂和稳定剂的混合物可以进一步包含能够提高制剂的玻璃转化温度(Tg’)的聚合物如聚(乙烯-吡咯烷酮)(PVP)、羟乙基淀粉或葡聚糖，或者作为结晶填充剂的聚合物如分子量介于1500和6000的聚乙二醇(PEG)和葡聚糖。
本发明的免疫原性组合物任选地冻干并在使用前临时复原。冻干可导致更稳定的组合物(疫苗)，并可能导致在3D-MPL存在下和铝基佐剂缺失下更高的抗体效价。
在本发明的一个方面提供了疫苗试剂盒，其包含了含有本发明的免疫原性组合物(任选地呈冻干形式)的小瓶，并进一步包含含有此处所述的佐剂的小瓶。在本发明的该方面预想，该佐剂将被用于复原该冻干的免疫原性组合物。
尽管本发明的疫苗可通过任意途径施用，所述疫苗施用至皮肤(ID)形成了本发明的一个实施方式。人类的皮肤包含了外部“角质”表皮，被称为角质层，其覆盖了表皮。在表皮下是一个成为真皮的层，其进而覆盖了皮下组织。研究人员已经显示将疫苗注射进入皮肤，特别是真皮时，可刺激免疫应答，这还伴随了多种额外的优点。以此处所述的疫苗进行皮内疫苗接种形成了本发明的任选特征。
皮内注射的常规技术“mantoux步骤”包括清洁皮肤，然后伸展一只手，用窄轨针头(26-31号)的斜面向上，将针头以介于10-15°的角度插入。当针头的斜面插入时，针头的圆筒部分下降，进一步插入同时提供略微的压力使其在皮肤下抬升。然后极为缓慢地注射液体，从而在皮肤表面形成疱或肿块，然后缓慢退出针头。
最近，已描述了特别设计用于将液体药剂施用至皮肤或透过皮肤的装置，例如，在WO 99/34850和EP 1092444中描述的装置，以及在例如WO01/13977；US 5,480,381，US 5,599,302，US 5,334,144，US 5,993,412，US5,649,912，US 5,569,189，US 5,704,911，US 5,383,851，US 5,893,397，US5,466,220，US 5,339,163，US 5,312,335，US 5,503,627，US 5,064,413，US 5,520,639，US 4,596,556，US 4,790,824，US 4,941,880，US 4,940,460，WO 97/37705和WO 97/13537中描述的快速注射装置。替代性地皮内施用疫苗制剂的方法包括常规的注射器和针头，或者设计用于冲击传递固体疫苗的装置(WO99/27961)，或者透皮贴剂(WO 97/48440；WO 98/28037)；或者应用于皮肤表面(经真皮或经表皮传递WO 98/20734；WO 98/28037)。
当本发明的疫苗被施用至皮肤时，或者更具体而言被施用至真皮时，该疫苗具有较少的液体体积，特别是介于约0.05ml和0.2ml的体积。
本发明的皮肤或皮内疫苗中抗原的含量类似于肌肉疫苗中的常规剂量(见上文)。然而，皮肤或皮内疫苗的一个特征在于该制剂可能是“低剂量的”。相应的，该“低剂量”疫苗中的蛋白抗原任选地以低至每剂量0.1-10μg或0.1-5μg存在；且该糖(任选地糖缀合物)抗原可以每剂量0.01-1μg或0.01-0.5μg存在。
此处所用的术语“皮内传递”指将疫苗传递至皮肤的真皮区域。然而，该疫苗并不必须仅处于真皮中。真皮是皮肤内从人皮肤表面约1.0和2.0mm的层，但它随着个体和身体的不同部位有着一定程度的变化。总体而言，预计在皮肤表面以下1.5mm可达到真皮。真皮位于表面的角质层和表皮与下方的皮下层之间。根据传递的模式，该疫苗最终可唯一或主要存在于真皮中，或者最终分布在表皮和真皮内。
本发明进一步提供了用于预防或缓解由流感嗜血杆菌引起的中耳炎的改良疫苗，该改良疫苗通过添加流感嗜血杆菌蛋白例如缀合形式的蛋白D得到。此外，本发明进一步提供了用于预防或缓解婴儿肺炎球菌感染(例如，中耳炎)的改良疫苗，其通过向本发明的肺炎链球菌缀合物组合物添加一种或两种作为游离或缀合蛋白的肺炎球菌蛋白得到。所述肺炎球菌游离蛋白可与用作载体蛋白的任意肺炎链球菌蛋白相同或不同。一种或多种粘膜炎莫拉菌蛋白抗原可以游离或缀合形式包含在组合疫苗中。因此，本发明是一种诱发针对婴儿中耳炎的(保护性)免疫应答的改良方法。
在另一实施方式中，本发明是通过施用安全和有效量的本发明的疫苗[儿科疫苗]诱发婴儿(在本发明的上下文中定义为0-2岁大)的(保护性)免疫应答的改良方法。本发明进一步的实施方式包括准备本发明的抗原性肺炎链球菌缀合物组合物以用于药物，以及本发明的肺炎链球菌缀合物在生产用于预防(或治疗)肺炎球菌疾病的药物中的应用。
在另一实施方式中，本发明是一种通过施用安全和有效量的本发明的疫苗、任选地结合一种或两种作为游离或缀合蛋白肺炎链球菌蛋白(其中游离肺炎链球菌蛋白可与此处用作载体蛋白的任意肺炎链球菌蛋白相同或不同)，诱发老年人群(在本发明的上下文中定义为50岁或更大，通常超过55岁，更通常超过60岁)的(保护性)免疫应答的改良方法。
本发明的进一步的方面是一种针对肺炎链球菌和任选地流感嗜血杆菌引起的疾病免疫人类宿主的方法，其包括向该宿主施用免疫保护剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒。
本发明的进一步的方面是用于治疗或预防由肺炎链球菌和任选地流感嗜血杆菌感染引起的疾病的本发明的免疫原性组合物。
本发明进一步的方面是本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒在生产用于治疗或预防由肺炎链球菌和任选地流感嗜血杆菌感染引起的疾病的药物中的用途。
此处的术语“包含”、“包括”“含有”在每种情况下可任选地分别被术语“由......组成”所取代。
涉及本发明的“疫苗组合物”的实施方式同样适用于涉及本发明“免疫原性组合物”的实施方式，反之亦然。
在本发明说明书中所引用的所有参考文献或专利申请均引入作为参考。
为使本发明被更好地理解，列举了以下实施例。这些实施例仅用于阐述，不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：蛋白D的表达
流感嗜血杆菌蛋白D
蛋白D表达的遗传构建
起始材料
蛋白D编码DNA
蛋白D在所有血清型和不可分型菌株的流感嗜血杆菌之间高度保守。含有编码完整蛋白D基因的DNA序列的载体pHIC348已从瑞典
Figure GPA00001032855600351
的
Figure GPA00001032855600352
综合医院，Lund大学医学微生物部的A.Forsgren博士处获得。蛋白D的DNA序列已由Janson等人(1991)Infect.Immun.59：119-125公开。
表达载体pMG1
表达载体pMG1是一种pBR322衍生物(Gross等人，1985)，其中导入了来自噬菌体λ的用于外源插入基因转录和翻译的控制元件(Shatzman等人，1983)。此外，氨苄青霉素抗性基因与卡那霉素抗性基因相交换。大肠杆菌菌株AR58
大肠杆菌菌株AR58可通过以预先在SA500衍生物上生长的P1噬菌体储液转导N99后生成(galE::TN10，lambdaKil-cI857ΔH1)。N99和SA500是来自国立卫生研究院的Martin Rosenberg博士实验室的大肠杆菌K12菌株。
表达载体pMG 1
为了生产蛋白D，编码该蛋白的DNA被克隆进入表达载体pMG 1。该质粒采用了来自lambda噬菌体DNA的信号来推动插入外源基因的转录和翻译。该载体包含启动子PL、操纵子OL和两个使用位点(NutL和NutR)以接受N蛋白被提供时的转录极性效应。包含该PL启动子的载体被导入大肠杆菌溶源性宿主，以稳定质粒DNA。溶源性宿主菌株包含整合进入基因组的复制缺陷型lambda噬菌体DNA(Shatzman等人，1983)。染色体的lambda噬菌体DNA引导与载体的OL阻遏物结合的cI阻遏蛋白的合成，并防止RNA聚合酶结合至PL启动子从而转录插入基因。表达菌株AR58的cI基因包含温度敏感性突变体，从而使PL引导的转录可被温度变化调节，即，培养温度的上升可使阻遏物失活，并启动外援蛋白的合成。这种表达系统允许外源蛋白(特别是对细胞可能有毒性的那些蛋白)的受控合成(Shimataka & Rosenberg，1981)。
大肠杆菌菌株AR58
用于生产蛋白D载体的AR58溶源性大肠杆菌菌株是标准NIH大肠杆菌K12菌株N99的衍生物(F-su-galK2，lacZ-thr-)。它包含了缺陷型溶源性lambda噬菌体(galE::TN10，lambdaKil-cI857ΔH1)。Kil-表型可阻止宿主大分子合成的切断。cI857突变赋予了cI阻遏蛋白温度敏感性损伤。ΔH1缺失去除了lambda噬菌体右操纵子和宿主bio、uvr3和chlA基因座。AR58菌株可通过以预先在SA500衍生物上生长的P1噬菌体储液转导N99后生成(galE::TN10，lambdaKil-cI857ΔH1)。缺陷型溶源体导入N99中可采用四环素通过邻近galE基因的编码四环素抗性的TN10转座子的存在进行选择。
载体pMGMDPPrD的构建
包含编码流感病毒非结构S1蛋白的基因的pMG 1载体(pMGNSI)被用于构建pMGMDPPrD。蛋白D基因通过PCR从pHIC348载体扩增(Janson等人1991 Infect.Immun.59：119-125)，其中采用了在5′和3′端分别包含了NcoI和XbaI限制性位点的PCR引物。该NcoI/XbaI片段随后被导入NcoI和XbaI之间的pMGNS1，从而创建了含有后接PD蛋白的NS1蛋白的N末端81氨基酸的融合蛋白。该载体被标记为pMGNS1PrD。
基于上述构建体，生成了用于蛋白D表达的最终构建体。从pMGNS1PrD去除BamHI/BamHI片段。该DNA水解去除NS1编码区(除了前三个N末端残基)。再次连接载体时，生成了具有WO 07/71711第44页实施例1所示序列的编码融合蛋白的基因。
蛋白D不包含通常连接了脂质链的前导肽或N末端半胱氨酸。因此该蛋白既不分泌进入周质，也不脂化，而是以可溶形式保留在细胞质中。
最终的构建体pMG-MDPPrD通过37℃下热休克导入AR58宿主株。含质粒的细菌可在卡那霉素存在下进行选择。蛋白D编码DNA插入物的存在可通过采用选定的内切核酸酶消化分离的质粒DNA进行证实。该重组大肠杆菌菌株被称为ECD4。
蛋白D的表达受到lambda PL启动子/OL操纵子的控制。宿主株AR58在基因组中包含了温度敏感型cI基因，其通过与OL结合在低温下阻断lambdaPL的表达。一旦温度升高，cI从OL释放，蛋白D被表达。
小规模制备
在发酵末期，该细胞被浓缩并冷冻。
从收获细胞的提取和蛋白D的纯化按照如下进行。将冷冻的细胞培养物团解冻，并重悬浮于细胞破坏溶液(柠檬酸缓冲液pH 6.0)中，至最终OD650＝60。将悬浮液在P＝1000bar下两次通过高压匀浆机。离心澄清细胞培养匀浆液，通过过滤去除细胞碎片。在第一纯化步骤中，过滤的细胞溶解物被应用至阳离子交换层析柱(SP Sepharose Fast Flow)。PD通过离子相互作用结合至凝胶基质，并通过增加洗脱缓冲液的离子强度的步骤来洗脱。
在第二纯化步骤中，杂质被保留在阴离子交换基质(Q Sepharose FastFlow)上。PD不与凝胶结合，并可在流出液中收集。
在两个柱层析步骤中，通过OD监测收集的组分。用超滤浓缩通过该阴离子交换柱层析的含有纯化蛋白D的流出液。
将含有蛋白D的超滤保留物最终通过0.2μm膜。
大规模制备
从收获细胞的提取和蛋白D的纯化按照如下进行。冷却收集的肉汤，直接在约800的压力下两次通过高压匀浆机。
在第一纯化步骤中，细胞培养匀浆液被稀释并被应用至阳离子交换层析柱(SP Sepharose Big beads)。PD通过离子相互作用结合至凝胶基质，通过增加洗脱缓冲液的离子强度的步骤来洗脱并过滤。
在第二纯化步骤中，杂质被保留在阴离子交换基质(Q Sepharose FastFlow)上。PD不与凝胶结合，并可在流出液中收集。
在两个柱层析步骤中，通过OD监测收集的组分。用超滤浓缩通过该阴离子交换柱层析的含有纯化蛋白D的流出液并进行渗滤。
将含有蛋白D的超滤留物最终通过0.2μm膜。
实施例1b：PhtD的表达
PhtD蛋白是肺炎球菌组氨酸三联体(Pht)蛋白家族的成员，其特征在于组氨酸三联体(HXXHXH基序)的存在。PhtD是一个838aa-的分子，并携带5个组氨酸三联体(参见MedImmune WO00/37105的氨基酸序列SEQ ID NO：4和DNA序列SEQ ID NO：5)。PhtD还在中部(氨基酸位置348-380)含有富脯氨酸区。PhtD具有带LXXC基序的20aa-N-末端信号序列。
遗传构建体
成熟MedImmune PhtD蛋白的基因序列(从aa 21至aa 838)通过携带pλ启动子的内部pTCMP14载体重组转移至大肠杆菌。该大肠杆菌宿主菌株为AR58，其携带了cI857热敏感性阻遏物，允许启动子的热诱导。
实施聚合酶链式反应以从MedImmune质粒(携带来自肺炎链球菌菌株Norway 4(血清型4)的phtD基因-WO 00/37105中所述的SEQ ID NO：5)扩增phtD基因。仅特异性针对phtD基因的引物被用于扩增两个片段中的phtD基因。引物携带NdeI和JKpnI或者KpnI和XbaI限制性位点。这些引物不与除了phtD特异性基因序列外的载体的任何核苷酸杂交。人工ATG起始密码子可采用携带NdeI限制性位点的第一引物插入。然后将所生成的PCR产物插入pGEM-T克隆载体(Promega)，并确认该DNA序列。然后采用标准技术对TCMP14表达载体中的片段亚克隆，然后将载体转化进入AR58大肠杆菌。
PhtD纯化
PhtD纯化按如下方式实现：
□在卡那霉素存在下生长大肠杆菌细胞：在30℃下生长30小时，然后在39.5℃下诱导18小时
□在EDTA 5mM和作为蛋白酶抑制剂的PMSF 2mM存在下从OD±115全培养物破裂大肠杆菌细胞：Rannie，2代，1000bars。
□在室温下(20℃)在膨胀床模式Streamline Q XL色谱上进行抗原捕获和细胞碎片去除，用NaCl 150mM+Empigen 0.25％pH6.5洗柱，并用含于pH7.4的25mM磷酸钾缓冲液的NaCl 400mM+Empigen 0.25％洗脱。
□在Sartobran 150柱体(0.45+0.2μm)上过滤
□在4℃下5mM咪唑存在下于pH7.4下将抗原结合在Zn++螯合Sepharose FF IMAC色谱上；用咪唑5mM和Empigen 1％洗柱，并用50mM咪唑洗脱，两者均在pH8.0的25mM磷酸钾缓冲液中。
□在4℃下于pH8.0(25mM磷酸钾)的Fractogel EMD DEAE上以正电荷模式进行弱阴离子交换色谱；用140mM NaCl洗柱，并用200mM NaCl洗脱，同时污染物(蛋白和DNA)保持吸附在交换剂上。
□在50kDa膜上用pH7.15的2mM Na/K磷酸盐浓缩和超滤。
□在Millipak-20 0.2μm过滤筒上对纯化物进行无菌过滤。
实施例1c：肺炎球菌溶血素的表达
肺炎球菌的肺炎球菌溶血素可参照WO2004/081515和WO2006/032499所述进行制备和解毒。
实施例2：
缀合物制备
本领域公知如何制备纯化的肺炎球菌多糖。针对这些实施例的目的，这些多糖主要参照EP072513所述或通过密切相关的方法制备。在缀合之前，该多糖可通过如下所述的微射流进行大小处理。
活化和偶联条件对每种多糖均为特定。这些条件在表1中给出。将大小处理的多糖(除PS5、6B和23F)溶解于NaCl 2M、NaCl 0.2M或水中以进行注射(WFI)。对所有血清型评估最佳多糖浓度。如下文具体描述，除血清型18C外的所有血清型直接缀合至载体蛋白。制备了两种替代型的血清型22F缀合物；一种直接缀合，一种通过ADH接头缀合。
从含于乙腈或乙腈/水50％/50％溶液的100mg/ml储备液中，将CDAP(CDAP/PS比例0.5-1.5mg/mg PS)添加至多糖溶液。1.5分钟后，添加0.2M-0.3M NaOH以获得特定的活化pH。多糖的活化可在该pH下于25℃下在3分钟内进行。将纯化蛋白(蛋白D、PhtD、肺炎球菌溶血素或DT)(其数量取决于初始PS/载体蛋白比例)添加至活化多糖，经pH调节在特定pH下进行偶联反应达2小时(取决于血清型)。为了淬灭未反应的氰酸酯基团，向混合物中添加2M甘氨酸溶液。将pH调节至淬灭pH(pH9.0)。将所述溶液在25℃下搅拌30分钟，然后在2-8℃下连续缓慢搅拌过夜。
18C的制备：
将18C通过接头-己二酸双肼(ADH)连接至载体蛋白
在缀合前对多糖血清型18C进行微射流。
以EDAC衍生破伤风类毒素
对于破伤风类毒素的衍生，在0.2M NaCl中稀释纯化TT至25mg/ml，并添加ADH间隔基以达到最终浓度0.2M。当间隔基的溶解完全时，将pH调节至6.2。然后加入EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺)以达到最终浓度0.02M，将混合物在pH调节下搅拌1小时。通过在25℃下将pH升至9.0至少30分钟终止缩合反应。
然后渗滤(10kDa CO膜)衍生化TT，从而去除残留ADH和EDAC试剂。
TTAH整体最终无菌过滤直至偶联步骤，并在-70℃下贮存。
将TTAH化学偶联至PS 18C
详细缀合参数可参见表1。
将2克微射流PS在水中稀释至指定浓度，并通过添加NaCl粉末调节至2M NaCl。
添加CDAP溶液(100mg/ml，在50/50v/v乙腈/WFI中新鲜制备)至达到合适的CDAP/PS比例。
通过添加0.3M NaOH将pH升高至活化pH9.0，并在该pH下稳定至添加TTAH。
3分钟后，添加衍生TTAH(20mg/ml，含于0.2M NaCl)至TTAH/PS比例为2；将pH调节至偶联pH9.0。将溶液在pH调节下保持一小时。
向混合物PS/TTAH/CDAP添加2M甘氨酸溶液以淬灭。
将pH调节至淬灭pH(pH9.0)。
将溶液在25℃下搅拌30分钟，然后在2-8℃下连续缓慢搅拌过夜。
PS22F AH -PhtD缀合物
在该糖的第二种缀合方法中(第一种为表1所示的直接PS22-PhtD缀合法)，通过接头-己二酸双肼(ADH)将22F连接至载体蛋白。在缀合前对多糖血清型22F进行微射流。
PS 22F衍生
在温控水浴中在25℃连续搅拌下进行活化和偶联。
稀释微射流PS22F以获得在0.2M NaCl中的6mg/ml的最终PS浓度，并用0.1N HCl将该溶液调节至pH6.05±0.2。
添加CDAP溶液(100mg/ml，在50/50乙腈/WFI中新鲜制备)至达到合适的CDAP/PS比例(1.5/1ww)。
通过添加0.5M NaOH将pH升高至活化pH9.00±0.05，并在该pH下稳定至添加ADH。
3分钟后，添加ADH以达到合适的ADH/PS比例(8.9/1w/w)；将pH调节至偶联pH9.0。将溶液在pH调节下保持一小时。
浓缩并渗滤该PSAH衍生物。
偶联
将含于0.2M NaCl的10mg/ml PhtD添加至PS22FAH衍生物，以使PhtD/PS22FAH比例为4/1(w/w)。用HCl将pH调节至5.0±0.05。在10分钟内人工添加(250μl/min)EDAC溶液(20mg/ml，含于0.1M Tris-HCl，pH7.5)以达到1mg EDAC/mg PS22FAH。在25℃搅拌和pH调节下将所得溶液孵育150分钟(尽管也使用60分钟)。通过添加1M Tris-HCl pH7.5(最终体积的1/10)中和该溶液，并在25℃下保持30分钟。
在Sephacryl S400HR上洗脱前，使用5μm Minisart过滤器澄清缀合物。
所得缀合物的最终PhtD/PS比例为4.1(w/w)，游离PS含量低于1％，抗原性(α-PS/α-PS)36.3％，抗-PhtD抗原性7.4％。蛋白和多糖比例的测定采用Lowry和Resorcinol法进行，抗原性采用夹心ELISA进行测定。
缀合物纯化：
采用以0.15M NaCl平衡的Sephacryl S400HR凝胶过滤柱(18C采用S500HR)对缀合物进行凝胶过滤纯化以去除小分子(包括DMAP)和未结合的PS和蛋白。基于反应成分的不同分子大小，PS-PD、PS-TT、PS-PhtD、PS-肺炎球菌溶血素或PS-DT缀合物被首先洗脱，然后是游离PS，然后为游离PD或游离DT，最后为DMAP和其它盐(NaCl，甘氨酸)。
含有缀合物的组分可通过UV280nm-检测。根据它们的Kd汇集组分，无菌过滤(0.22μm)并在+2-8℃下贮存。测定缀合物制剂中的PS/蛋白比例。
PS肺炎链球菌-蛋白D/TT/DT/PhtD/Ply缀合物的特定活化/偶联/淬灭条件“μfluid”在表头中出现时表示该糖在缀合前通过微射流调节大小。微射流后的糖的大小在表2中给出。
表1  PS肺炎链球菌-蛋白D/TT/DT/PhtD/Ply缀合物的特定活化/偶联/淬灭条 件
 血清型   1μfluid   4μfluid   5   6A   6B   7Fμfluid
 PS浓度(mg/ml)   2.5   2.5   7.1   5.0   5.0   5.0
 PS溶解   WFI   WFI   WFI   NaCl2M   NaCl2M   NaCl2M
 PD浓度(mg/ml)   10.0   10.0   5.0   5.0   5.0   10.0
 初始PD/PS比例(w/w)   1.5/1   1.5/1   1/1   1/1   1.1/1   1.2/1
 CDAP浓度(mg/mg PS)   0.50   0.50   0.79   0.83   0.83   0.75
 pHa＝pHc＝pHq   9.0/9.0/9.0   9.5/9.5/9.0   9.0/9.0/9.0   9.5/9.5/9.0   9.5/9.5/9.0   9.5/9.5/9.0
  血清型  9Vμfluid   14μfluid  18Cμfluid  19Aμfluid   19Fμfluid   22Fμfluid   23F
  PS浓度(mg/ml)  5.0   5.0  4.5  15.0   9.0   6.0   2.38
  PS溶解   NaCl2M   NaCl2M   NaCl2M   NaCl2M   NaCl2M   NaCl0.2M   NaCl2M
  载体蛋白浓度(mg/ml)   10.0   10.0   20.0(TT)   10.0(Ply)   20.0(DT)   10.0(PhtD)   5.0
  初始载体蛋白/PS比例(w/w)   1.2/1   1.2/1   2/1   2.5/1   1.5/1   3/1   1/1
  CDAP浓度(mg/mgPS)   0.50   0.75   0.75   1.5   1.5   1.5   0.79
  pHa＝pHc＝pHq   9.5/9.5/9.0   9.5/9.5/9.0   9.0/9.0/9.0   9.0/9.0/9.0   9.0/9.0/9.0   9.0/9.0/9.0   9.5/9.5/9.0
注：pHa、c、q分别对应于活化、偶联和淬灭pH
鉴别：
每种缀合物均经过鉴别并满足了表2中所述的规格。多糖含量(μg/ml)通过Resorcinol测试检测，蛋白含量(μg/ml)通过Lowry测试检测。最终的PS/PD比例(w/w)通过浓度的比例确定。
游离多糖含量(％)：
在4℃下保存或在37℃下贮存7天的缀合物的游离多糖含量可在与α-载体蛋白抗体和饱和硫酸铵孵育后离心所得的上清液中测定。
在上清液中游离多糖的定量采用α-PS/α-PS ELISA。不含缀合物还作为α-载体蛋白/α-PS ELISA的对照。
抗原性：
在相同缀合物上的抗原性可在夹心型ELISA中分析，其中抗体的捕获和检测分别为α-PS和α-蛋白。
游离蛋白含量(％)：
未缀合的载体蛋白可在纯化步骤中从缀合物中分离。游离残留蛋白的含量可在分子排阻色谱(TSK 5000-PWXL)后通过UV检测(214nm)进行测定。洗脱条件允许分离游离载体蛋白和缀合物。然后相对校正曲线测定在大量缀合物中的游离蛋白含量(0-50μg/ml载体蛋白)。以％表示的游离载体蛋白参照如下获得：％游离载体＝(游离载体(μg/ml)/(通过Lowry测定的相应载体蛋白总浓度(μg/ml)＊100％)。
稳定性：
在HPLC-SEC凝胶过滤(TSK 5000-PWXL)上对4℃下保存和在37℃下贮存7天的缀合物测定分子量分布(Kav)和稳定性。
10/11/13/14-价鉴别在表2中给出(参见下方的注释)。
蛋白缀合物可被吸附在磷酸铝上，并汇集形成最终的疫苗。
表2-缀合物的特性
Figure GPA00001032855600451
＊天然PS微射流后的PS大小
＊＊＊未进行大小处理的多糖
ND-未测定
10价疫苗可通过将血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F混合缀合物(例如，每人剂量分别采用1、3、1、1、1、1、1、3、3、1μg糖)后制备得到。11价疫苗可通过进一步添加表5中的血清型3缀合物(例如每人剂量添加1μg糖)制备得到。13价疫苗可通过进一步添加上述血清型19A和22F缀合物(22F既可直接连接至PhtD，也可通过ADH接头连接)[例如每人剂量添加3μg的每种糖]制备得到。14价疫苗可通过进一步添加上述血清型6A缀合物[例如每人剂量添加1μg糖]制备得到。
实施例3：在本发明免疫原性组合物中包含流感嗜血杆菌蛋白D可提供对急性中耳炎(AOM)增强的保护的证据
研究设计。
该研究采用了11Pn-PD疫苗，其包含了各自与来自流感嗜血杆菌的蛋白D缀合的血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F(参见实施例4表5)。研究对象被随机分成两组以在约3、4、5和12-15个月龄时接受四个剂量的11Pn-PD疫苗或贺福立适(Havirx)。所有对象在3、4和5个月龄时同时接受GSK Biologicals的Infanrix-hexa(DTPa-HBV-IPV/Hib)疫苗。Infanrix-hexa是在施用前混合的Pediarix和Hib的组合。在“根据方案”分析的效力随访起始于第三疫苗剂量施用后2周，并持续至24-27个月龄。肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的鼻咽运输可在选定的对象亚组中评估。
如果儿童出现恶心、耳部疼痛、鼓膜自发穿孔或自发性耳液溢，建议家长向研究人员咨询。如果该研究人员怀疑是AOM事件，则该儿童应立即让耳鼻喉(ENT)专家确认诊断。
AOM的临床诊断可基于鼓膜的外观(即，发红、肿胀、光反射损失)或者中耳液体流出的存在(可通过简单的或气动式耳镜检查或通过显微镜观察证实)。此外，至少应存在如下迹象或症状中的两种：耳部疼痛、耳液溢、听力损失、发烧、昏睡、过敏、厌食、呕吐或腹泻。如果ENT专家确认临床诊断，则通过鼓膜穿刺术采集中耳液样本进行细菌学测试。
对于重复患病的对象，如果在前一事件开始后持续了30天以上，则认为出现了新的AOM事件。此外，如果分离的细菌/血清型不同于之前的分离物，不管两个连续事件之间的间隔，AOM事件被认为新的细菌事件。
试验结果
总计4968名婴儿入组，2489名进入11Pn-PD组，2479名进入对照组。在两个组之间没有人口统计特征或风险因素的较大差异。
临床事件和AOM案例定义
在依据方案的随访期，在11Pn-PD组总计记录了333次临床AOM事件，在对照组记录了499次。
表3显示了11Pn-PD疫苗和之前在芬兰测试的两种7价疫苗(Eskola等人N Engl J Med 2001；344：403-409和Kilpi等人Clin Infect Dis 2003 37：1155-64)对任意AOM事件或不同肺炎球菌血清型、流感嗜血杆菌、NTHi和卡他莫拉菌引起的AOM的保护性效力。
不管针对何种病原学，11Pn-PD实现了总体AOM疾病负担的33.6％的统计学显著的和临床相关的减少(表3)。
在11Pn-PD疫苗中包含的11种肺炎球菌血清型中任意一种对AOM事件的总体效力为57.6％(表3)。
在当前研究中另一重要的发现是11Pn-PD疫苗对流感嗜血杆菌引起的AOM提供了35.6％的保护(特别地，对NTHi引起的AOM提供了35.3％的保护)。鉴于在肺炎球菌缀合物疫苗时代流感嗜血杆菌作为AOM主要起因的持续增加的重要性，这一发现具有重要的临床意义。与针对AOM提供的保护一致，11Pn-PD疫苗还减少了生命的第二年中的加强剂量后流感嗜血杆菌的鼻咽运输。这些发现不同于之前在芬兰的观察结果，其中作为病因替换的证据，对于两种7价肺炎球菌缀合物疫苗均观察到了流感嗜血杆菌引起的AOM事件的增加(Eskola等人和Kilpi等人)。
在对Hi引起的AOM事件的保护和针对载体蛋白D的抗体水平之间无法建立明确的关联，因为在11Pn-PD疫苗中初次免疫后的抗-PD IgG抗体浓度(其保持无Hi AOM事件)，与在效力随访期过程中发生至少一次Hi AOM事件时在11Pn-PD疫苗中测得的初始剂量后抗-PD IgG抗体水平基本相同。然而，尽管在疫苗的生物学影响和初次免疫后IgG抗-PD免疫原性之间无法建立关联，可以合理地假设在流感嗜血杆菌菌株之间高度保守的PD载体蛋白很大程度上有助于诱导针对Hi的保护。
对AOM疾病的作用伴随着对鼻咽运输的作用，对此，疫苗血清型肺炎双球菌和流感嗜血杆菌的作用在类似的等级上(图1)。PD-缀合物疫苗对流感嗜血杆菌的鼻咽运输的减少支持了PD-缀合物疫苗针对流感嗜血杆菌的直接保护作用的假设，即使这种保护效力无法与ELISA测得的抗-PD IgG免疫应答相关联。
在以下实验中采用了毛丝鼠中耳炎模型和以本实施例的11价制剂或实施例2的10价疫苗免疫的婴儿获得的血清汇集物(还可参见表1和2以及下方的注释)。两种汇集物均相对免疫前血清汇集物使得患中耳炎动物百分比的明显减少。在10和11价免疫汇集物之间不存在显著差异。这证明了两种疫苗对于在该模型中诱导针对不可分型流感嗜血杆菌引起的中耳炎的保护具有类似的潜力。
Figure GPA00001032855600481
Figure GPA00001032855600491
实施例4：
血清型19F载体蛋白的选择
采用的ELISA测定
22F抑制ELISA法主要基于Concepcion和Frasch在2001年提出的测定，并在Henckaerts等人，2006，Clinical and Vaccine Immunology 13：356-360中报道。简单而言，将纯化的肺炎球菌多糖与甲基化人血清白蛋白混合，并吸附在Nunc MaxisorpTM(Roskilde，DK)高结合微量滴定板上4℃过夜。用含于PBS的10％胎牛血清(FBS)在室温搅拌下封闭该板1小时。用含10％FBS、10μg/mL细胞壁多糖(SSI)和2μg/mL血清型22F的肺炎球菌多糖(ATCC)的PBS稀释血清样本，并用相同缓冲液在该微量滴定板上进一步稀释。采用89-SF中血清型-特异性IgG浓度针对标准血清89-SF校准的内部参照以相同方式处理并包含在每块板上。洗涤后，采用在10％FBS(含于PBS)中稀释的过氧化物酶缀合的抗人IgG单克隆抗体(Stratech Scientific Ltd.，Soham，UK)并在室温小搅拌1小时孵育，以检测结合抗体。采用即时可用的单组份四甲基联苯胺过氧化物酶免疫测定底物试剂盒(BioRad，Hercules，CA，US)在室温下暗处显色。用H2SO4 0.18M终止反应，在450nm下读取光密度。通过参考内部参照血清曲线指定限度内的光密度点计算样本中的血清型特异性IgG浓度(μg/mL)，所述曲线可通过用SoftMax ProTM(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)软件计算的4-参数逻辑对数方程建模。对于所有的血清型(考虑检测限和定量极限)，ELISA的截断为0.05μg/mL IgG。
调理吞噬测定
在2003年6月的WHO咨询会议上建议使用Romero-Steiner等人ClinDiagn Lab Immunol 2003 10(6)：pp1019-1024提出的OPA测定。该方案用于在如下试验中测试血清型的OPA活性。
缀合物制备
在研究11Pn-PD&Di-001以及11Pn-PD&Di-007中包括了三种11价疫苗制剂(表4)，其中3μg的19F多糖被缀合至白喉类毒素(19F-DT)，而非将1μg多糖缀合至蛋白D(19F-PD)。研究11Pn-PD、11Pn-PD&Di-001和11Pn-PD&Di-007的缀合参数分别披露于表5、6和7。
这些19F-DT制剂进行初次免疫后一个月时针对血清型19F的抗肺炎球菌抗体应答和OPA活性分别显示于表8和9中。表10显示了在23价纯多糖加强免疫之前和之后的22F-ELISA抗体浓度和达到0.2μg/mL阈值的对象比例。
以这些19F-DT制剂诱导的抗体显示明显提高了调理吞噬活性，这可通过初次免疫后一个月时更高的血清阳性比例(调理吞噬效价≥1∶8)和OPAGMT得到证明(表9)。23价纯多糖加强免疫后一个月时，19F抗体的调理吞噬活性依旧明显高于用19F-DT制剂初次免疫的儿童(表11)。
表12显示了在之前以19F-DT或19F-PD缀合物接种的幼儿在11Pn-PD加强剂量后与第四次连续
Figure GPA00001032855600511
剂量对比的免疫原性数据。考虑在美国
Figure GPA00001032855600512
的引入后报道的爆发案例，血清型19F缀合至DT载体蛋白时提高的调理吞噬活性可能对该候选疫苗有利。
表13提供了19F-DT缀合物相对于交叉反应性血清型19A的ELISA和OPA数据。据发现19F-DT诱导了少量但明显的针对19A的OPA活性。
表4在临床研究中所用的肺炎球菌缀合物疫苗制剂
Figure GPA00001032855600513
表5PS肺炎链球菌-蛋白D/TT/DT缀合物的特异性活化/偶联/淬灭条件
血清型 1 3 4 5 6B 7F
  天然   μfluid   天然   天然   天然   天然
  PS浓度(mg/ml)   1.5   2   2.0   7.5   5.5   3.0
  PS溶解   NaCl150mM   NaCl2M   WFI   WFI   NaCl2M   NaCl2M
  PD浓度(mg/ml)   5.0   5.0   5.0   5.0   5.0   5.0
  初始PS/PD比例(w/w)   1/0.7   1/1   1/1   1/1   1/1   1/1
  CDAP浓度(mg/mg PS)   0.75   0.75   0.75   0.75   0.75   0.75
  pHa＝pHc＝pHq   9.0/9.0/9.0   9.5/9.5/9.0   8.8/8.8/9.0   9.0/9.0/9.0   9.5/9.5/9.0   9.0/9.0/9.0
  偶联时间   60分钟   60分钟   45分钟   40分钟   60分钟   60分钟
  血清型   9V天然   14天然   18C天然   19F天然   23F天然
  PS浓度(mg/ml)   1.75   2.5   1.75   4.0   2.5
  PS溶解   NaCl2M   NaCl 2M   WFI   NaCl 2M   NaCl 2M
  PD浓度(mg/ml)   5.0   5.0   5.0   5.0   5.0
  初始PS/PD比例(w/w)   1/0.75   1/0.75   1/1.2   1/1   1/1
  CDAP浓度(mg/mg PS)   0.75   0.75   0.75   0.75   0.75
  pHa＝pHc＝pHq   8.5/8.5/9.0   9.0/9.0/9.0   9.0/9.0/9.0   9.5/9.5/9.0   9.5/9.5/9.0
  偶联时间   60分钟   60分钟   45分钟   30分钟   60分钟
表6用于11Pn-PD&Di-001研究的PS肺炎链球菌-蛋白D/DT缀合物的特异 性活化/偶联/淬灭条件
  血清型   1μfluid   3μfluid   4μfluid   5μfluid   6Bμfluid   7F天然
  PS浓度(mg/ml)   4   2.0   2.5   7.5   10   3.0
  PS溶解   NaCl2M   NaCl2M   NaCl2M   NaCl2M   NaCl2M   NaCl2M
  PD浓度(mg/ml)   10.0   5.0   5.0   5.0NaCl2M   20(DT)NaCl2M   5.0
  初始PD/PS比例(w/w)   1.2/1   1/1   1/1   1/1   1.5/1   1/1
  CDAP浓度(mg/mg PS)   1.50   0.75   1.5   2   1.5   0.75
  pHa＝pHc＝pHq   9.0/9.0/9.0   9.5/9.5/9.0   9.5/9.5/9.0   9.0/9.0/9.0   9.5/9.5/9.0   9/9/9
  偶联时间   60分钟   60分钟   60分钟   60分钟   60分钟   60分钟
  血清型   9V天然   14天然   18Cμfluid   19Fμfluid   23Fμfluid
  PS浓度(mg/ml)   1.75   2.5   5.0   9.0   10
  PS溶解   NaCl2M   NaCl2M   NaCl 2M   NaCl2M   NaCl 2M
  载体蛋白浓度(mg/ml)   5.0   5.0   5.0   20(DT)   10(DT)
  初始载体蛋白/PS比例(w/w)   0.75/1   0.75/1   1.2/1   1.5/1   1.5/1
  CDAP浓度(mg/mg PS)   0.75   0.75   1.5   1.5   0.75
  pHa＝pHc＝pHq   8.5/8.5/9.0   9.0/9.0/9.0   9.0/9.0/9.0   9.0/9.0/9.0   9.5/9.5/9.0
  偶联时间   60分钟   60分钟   30分钟   60分钟   60分钟
表7用于11Pn-PD&Di-007研究的PS肺炎链球菌-蛋白D/DT缀合物的特异 性活化/偶联/淬灭条件
  血清型   1天然   3μfluid   4天然   5天然   6B天然   7Fμfluid
  PS浓度(mg/ml)   1.5   2.0   2   7.5   5.5   5.0
  PS溶解   NaCl150mM   NaCl2M   WFI   WFI   NaCl2M   NaCl2M
  PD浓度(mg/ml)   5.0   5.0   5.0   5.0   5   10
  初始PD/PS比例(w/w)   0.7/1   1/1   1   1/1   1/1   1.2/1
  CDAP浓度(mg/mg PS)   0.75   0.75   0.75   0.75   0.75   0.75
  pHa＝pHc＝pHq   9.0/9.0/9.0   9.5/9.5/9.0   8.8/8.8/9.0   9.0/9.0/9.0   9.5/9.5/9.0   9.5./9.5/9
  偶联时间   60分钟   60分钟   45分钟   40分钟   60分钟   60分钟
  血清型   9Vμfluid   14μfluid   18C天然   19Fμfluid   19Fμfluid   23Fμfluid
  PS浓度(mg/ml)   5.0   5.0   1.75   9.0   10.0   9.5
  PS溶解   NaCl2M   NaCl2M   WFI   NaCl2M   NaCl 2M   NaCl 2M
  载体蛋白浓度(mg/ml)   10   10.0   5.0   20(DT)   5.0(PD)   10
  初始载体蛋白   1.2/1   1.2/1   1.2/1   1.5/1   1.2/1   1/1
 /PS比例(w/w)
 CDAP浓度(mg/mg PS)   0.5   0.75   0.75   1.5   0.75   0.75
 pHa＝pHc＝pHq   9.5/9.5/9.0   9.5/9.5/9.0   9.0/9.0/9.0   9.0/9.0/9.0   9.0/9.0/9.0   9.5/9.5/9.0
 偶联时间   60分钟   60分钟   45分钟   120分钟   120分钟   60分钟
表8在1μg 19F-PD、3μg 19F-DT或Prevnar(2μg 19F-CRM)初次免疫(全组)后一个月时的19F抗体浓度≥0.20μg/mL的对象的百分比和19F抗体几何平均抗体浓度(95％CI的GMC；μg/mL)
Γ不同制剂的组成在表4中提供。
表9在1μg 19F-PD、3μg 19F-DT或Prevnar(2μg 19F-CRM)初次免疫(全组)后一个月时的19F OPA效价≥1∶8的对象的百分比和19FOPA GMT
Figure GPA00001032855600561
Γ不同制剂的组成在表4中提供。
表10对儿童以1μg 19F-PD、3μg 19F-DT或Prevnar(2μg 19F-CRM)初次免疫后以23价纯多糖加强免疫前或一个月后(全组)19F抗体浓度≥0.20μg/mL的对象的百分比和19F抗体GMC(μg/mL)
Figure GPA00001032855600562
Figure GPA00001032855600571
Γ不同制剂的组成在表4中提供。
表11对儿童以1μg 19F-PD、3μg 19F-DT或Prevnar(2μg 19F-CRM)初次免疫后以23价纯多糖加强免疫前或一个月后(全组)19F OPA效价≥1∶8的对象的百分比和19F OPA GMT
Figure GPA00001032855600572
Γ不同制剂的组成在表4中提供。
表12对儿童以1μg 19F-PD、3μg 19F-DT或Prevnar(2μg 19F-CRM)初次免疫后以11Pn-PD或Prevnar加强免疫一个月后(全组)针对19F肺炎双球菌的抗体浓度≥0.20μg/mL、OPA≥1∶8的对象的百分比和GMC/GMT
Figure GPA00001032855600581
Γ不同制剂的组成在表4中提供。
表13以1μg 19F-PD、3μg 19F-DT或Prevnar(2μg 19F-CRM)(全组)初次免疫后一个月时针对19A肺炎双球菌的抗体浓度≥0.20μg/mL、OPA≥1∶8的对象的百分比和GMC/GMT
Figure GPA00001032855600582
Figure GPA00001032855600591
Γ不同制剂的组成在表4中提供。
实施例5：在临床前模型中的佐剂实验：对老年恒河猴中肺炎球菌11价多糖缀合物的免疫原性的影响
为了优化老年群体中引发的对缀合肺炎球菌疫苗的应答，GSK配制了具有新型佐剂佐剂C的11价多糖(PS)缀合疫苗-见下文。
5只老年恒河猴(14-28岁)组成的组在第0天和第28天以500μl的吸附在315μg AlPO4上的11价PS缀合物或与佐剂C混合的11价PS缀合物进行肌肉内免疫。
在两种疫苗制剂中，该11价PS缀合物分别由以下缀合物组成：PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-PD、PS19F-PD、PS23F-DT和PS6B-DT。所用的疫苗为该疫苗的人用剂量的1/5剂量(除6B[10μg]外每人用剂量每种糖5μg)，该疫苗根据表6的条件(实施例4)缀合，除了19F参照如下CDAP工艺条件制备：9mg/ml大小处理的糖、5mg/ml的PD、初始PD/PS比例为1.2/1、CDAP浓度为0.75mg/mgPS、pHa＝pHc＝pHq 9.0/9.0/9.0且偶联时间为60min。
抗-PS ELISA IgG水平和调理吞噬效价可在第42天采集的血清中测定。抗-PS3记忆B细胞频率可从第42天采集的外周血细胞通过Elispot测定。
根据下文所示的结果，佐剂C相比具有AlPO4的缀合物明显提高了老年猴中11价PS缀合物的免疫原性。该新型佐剂增强了对PS的IgG应答(图1)和调理吞噬抗体效价(表14)。另有支持证据显示通过使用佐剂C增加了PS3-特异性记忆B细胞的频率(图2)。
表14在老年恒河猴中的缀合物免疫原性(II期后的调理-吞噬效价)
B细胞Elispot
该测定的原理依赖于记忆B细胞与CpG体外培养5天后发育成浆细胞的事实。体外生成的抗原特异性浆细胞可被容易地检测，因此通过B细胞elispot测定进行计算。特异性浆细胞的数量反映了培养中发生的记忆B细胞的频率。
简单而言，在涂覆了抗原的培养板上孵育体外生成的浆细胞。通过常规免疫-酶催化步骤检测并作为记忆B细胞计算的抗原特异性浆细胞形成了抗体/抗原斑点。
在本研究中，多糖曾被用于涂覆培养板，从而计算相应的记忆B细胞。结果表示为一百万个记忆B细胞中PS特异性记忆B细胞的频率。
该研究显示佐剂C能够减少PS3加强性的已知问题(参见5thInternational Symposium on Pneumococci and Pneumococcal Diseases，April 2-62006，Alice Springs，Central Australia)
Specificities of immune responses against a serotype 3 pneumococcalconjugate.Schuerman L，Prymula R，Poolman J.Abstract book p 245，PO10.06)。
实施例6解毒肺炎球菌溶血素(dPly)作为蛋白载体增强幼年Balb/c小鼠中的PS 19F免疫原性的效力
40只雌性Balb/c小鼠(4周龄)的组在第0、14和28天用50μl的4价纯PS或4价dPly-缀合PS(均与佐剂C混合)IM免疫。
两种疫苗制剂均由0.1μg(糖的量)的各种如下PS组成：PS8、PS12F、PS19F和PS22F。
在第42天采集的血清中检测抗-PS ELISA IgG水平。
与纯PS免疫的小鼠相比，4价dPly缀合物免疫的小鼠中的抗-PS19F应答明显增加(在图3中作为范例显示)。对于抗-PS8、12F和22F IgG应答，观察到了相同的提高(数据未显示)。
实施例7肺炎球菌组氨酸三联体蛋白D(PhtD)作为蛋白载体增强幼年Balb/c小鼠中的PS 22F免疫原性的效力
40只雌性Balb/c小鼠(4周大)的组在第0、14和28天用50μl的4价纯PS或4价PhtD-缀合PS(均与佐剂C混合)IM免疫。
两种疫苗制剂均由0.1μg(糖的量)的各种如下PS组成：PS8、PS12F、PS19F和PS22F。
在第42天采集的血清中检测抗-PS ELISA IgG水平。
与纯PS免疫的小鼠相比，4价PhtD缀合物免疫的小鼠中的抗-PS22F应答明显增加(在图4中作为范例显示)。对于抗-PS8、12F和19F IgG应答，观察到了相同的提高(数据未显示)。
实施例8含19A-dPly和22F-PhtD的13价PS缀合物在老年C57Bl小鼠中的免疫原性
30只老年C57Bl小鼠(＞69周龄)的组在第0、14和28天用50μl的11价PS缀合物或13价PS缀合物(均与佐剂C混合)IM免疫(见下文)。
该11价疫苗制剂由如下每种缀合物的0.1μg糖组成：PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(参见表1和表2下方对11价疫苗的注释)。该13价疫苗制剂额外包含0.1μg的PS19A-dPly和PS22F-PhtD缀合物(参见表1和表2下方对13价疫苗的注释[使用直接缀合的22F])。在第2和第4组中，该肺炎球菌溶血素载体通过GMBS处理解毒，在第3和第5组中，其通过甲醛解毒(该方法描述于WO 04/81515)。在第2和第3组中，PhtD被用于缀合PS 22F，在第4和第5组中，采用了PhtD_E融合体(构建体VP147来自于WO 03/054007)。在第6组中，19A被缀合至白喉类毒素，22F被缀合至蛋白D。
抗-PS19A和22F ELISA IgG水平可通过如下步骤在第42天采集的单独血清中确定。在汇集的血清中测量对其它PS生成的ELISA IgG应答。
小鼠血清学步骤：
抗-PS19A ELISA IgG水平可用如下所述步骤在第42天采集的血清中评估：
用含于PBS缓冲液的纯化19A型肺炎球菌PS(10μg/ml)在37℃下涂覆微量滴定板2小时。用NaCl 0.9％mM-Tween 20 0.05％洗涤滴定板四次。将血清与含于PBS 0.05％Tween 20的50μg/ml CPS(V/V)在37℃下孵育1小时。将血清加入微孔，并在PBS-BSA 0.05％Tween 0.05％中系列稀释(两倍稀释步骤)。将滴定板在室温下搅拌孵育30分钟。参照上文洗涤滴定板，添加抗-小鼠IgG-过氧化物酶缀合物(1/2500稀释)并将滴定板在室温下孵育30分钟。洗涤后，向每个微孔添加底物(含于10ml 0.1M pH4.5柠檬酸盐的4mgOPDA和5μl H2O2)，反应进行15分钟。添加1N HCl终止反应。使用分光光度计读取490-620nm下的吸收值。形成的颜色与血清中存在的抗体的量成直接比例。
通过与参考曲线比较确定血清样本中存在的抗-PS19A IgG水平，并以μg/ml表示。可由针对所添加血清的已知量的ELISA结果对每块板生成参考曲线。
抗-PS22F ELISA IgG水平可用如下所述的步骤在第42天采集的血清中评估：
用含于PBS缓冲液的纯化22F型肺炎球菌PS(10μg/ml)在37℃下涂覆微量滴定板2小时。用NaCl 0.9％mM-Tween 200.05％洗涤滴定板四次。将血清与含于PBS 0.05％Tween 20的50μg/ml CPS(V/V)在37℃下孵育1小时。将血清加入微孔，并在PBS-BSA 0.05％Tween 0.05％中系列稀释(两倍稀释步骤)。将滴定板在室温下搅拌孵育30分钟。参照上文洗涤滴定板，添加抗-小鼠IgG抗体过氧化物酶缀合物(1/2500稀释)并将滴定板在室温下孵育30分钟。洗涤后，向每个微孔添加底物(含于10ml柠檬酸盐0.1M pH4.5的4mg OPDA和5μl H2O2)，反应进行15分钟。添加1N HCl终止反应。使用分光光度计读取490-620nm下的吸收值。形成的颜色与血清中存在的抗体的量成直接比例。
通过与各板上添加血清的参考曲线比较确定未知血清中存在的抗-PS22FIgG水平，并以μg/ml表示。
除了将小鼠血清汇集以外，可参照相同的步骤实现针对所有其它血清型的免疫应答。
在13价缀合物疫苗制剂中施用的19A-dPly和22F-PhtD在老年C57Bl小鼠中显示了免疫原性(表15)。与用11价疫苗制剂免疫的小鼠相比，用13价制剂免疫的小鼠中针对其他PS诱导的免疫应答未受到负面影响。
表15在老年C57Bl小鼠中的PS免疫原性(III期后IgG水平)
Figure GPA00001032855600631
Figure GPA00001032855600641
NR-未测得实验结果
小鼠OPA步骤：
将血清样本在56℃下加热45分钟，以灭活任意残留的内源性补体。将每等分二十五微升的每种1∶2稀释的血清样本在96孔圆底微量滴定板的每个微孔中以25μl OPA缓冲液(HBSS-14.4％灭活FBS)两倍系列稀释。然后，将25μl的活化HL-60细胞(1×107细胞/ml)、新鲜解冻的肺炎球菌工作种子和新鲜解冻的幼兔补体混合物以例如4/2/1比例(v/v/v)添加至稀释的血清中，以得到50μl的终体积。将测定板在37℃下定轨振荡(210rpm)孵育2小时，以促进吞噬过程。通过将微量滴定板在冰上放置至少1分钟终止反应。将板上每个微孔的20μl等分转移至96孔平底微量滴定板的相应微孔中，并向每个微孔添加50μl Todd-Hewitt Broth-0.9％琼脂。在37℃和5％CO2下孵育过夜后，在琼脂中出现肺炎球菌集落，采用自动化图像分析系统(KS 400，Zeiss，Oberkochen，Germany)进行计数。八个无血清样本的微孔被用作细菌对照，以确定每个微孔的肺炎球菌数量。测定对照微孔的CFU平均数，并用于计算每个血清样本的杀伤活性。血清样本的OPA效价可通过能够杀伤50％的肺炎球菌的血清的倒数(reciprocal)稀释进行确定。调理吞噬效价可采用4参数曲线拟合分析进行计算。
调理吞噬测定的结果显示于图13和14中。
实施例9含19A-dPly和22F-PhtD的13价PS缀合物在幼年Balb/c小鼠中的免疫原性
30只幼年Balb/c小鼠(4周龄)的组在第0、14和28天用50μl的11价PS缀合物或13价PS缀合物(均与佐剂C混合)IM免疫(见下文)。
该11价疫苗制剂由如下每种缀合物的0.1μg糖组成：PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS 14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(参见表1和表2下方对11价疫苗的注释)。该13价疫苗制剂额外包含0.1μg的PS19A-dPly和PS22F-PhtD缀合物(参见表1和表2下方对13价疫苗的注释[使用直接缀合的22F])。在第2和第4组中，该肺炎球菌溶血素载体通过GMBS处理解毒，在第3和第5组中，其通过甲醛解毒(该方法描述于WO 04/81515)。在第2和第3组中，PhtD被用于缀合PS 22F，在第4和第5组中，采用了PhtD_E融合体(构建体VP147来自于WO 03/054007)。在第6组中，19A被缀合至白喉类毒素，22F被缀合至蛋白D。
抗-PS19A和22F ELISA IgG水平可在第42天采集的单独血清中确定。在汇集的血清中测量对其它PS生成的ELISA IgG应答。
在13价缀合物疫苗制剂中施用的19A-dPly和22F-PhtD在幼年Balb/c小鼠中显示了免疫原性(表16)。与用11价疫苗制剂免疫的小鼠相比，用13价制剂免疫的小鼠中针对其他PS诱导的免疫应答未受到负面影响。
ELISA按照实施例8所述进行。
表16在幼年Balb/c小鼠中的PS免疫原性(III期后IgG水平)
Figure GPA00001032855600671
NR-未测得实验结果
小鼠OPA步骤：
将血清样本在56℃下加热45分钟，以灭活任意残留的内源性补体。将每等分二十五微升的每种1∶2稀释的血清样本在96孔圆底微量滴定板的每个微孔中以25μl OPA缓冲液(HBSS-14.4％灭活FBS)两倍系列稀释。然后，将25μl的活化HL-60细胞(1×107细胞/ml)、新鲜解冻的肺炎球菌工作种子和新鲜解冻的幼兔补体混合物以例如4/2/1比例(v/v/v)添加至稀释的血清中，以得到50μl的终体积。将测定板在37℃下定轨振荡(210rpm)孵育2小时，以促进吞噬过程。通过将微量滴定板在冰上放置至少1分钟终止反应。将板上每个微孔的20μl等分转移至96孔平底微量滴定板的相应微孔中，并向每个微孔添加50μl Todd-Hewitt Broth-0.9％琼脂。在37℃和5％CO2下孵育过夜后，在琼脂中出现肺炎球菌集落，采用自动化图像分析系统(KS 400，Zeiss，Oberkochen，Germany)进行计数。八个无血清样本的微孔被用作细菌对照，以确定每个微孔的肺炎球菌数量。测定对照微孔的CFU平均数，并用于计算每个血清样本的杀伤活性。血清样本的OPA效价可通过能够杀伤50％的肺炎球菌的血清的倒数稀释进行确定。调理吞噬效价可采用4参数曲线拟合分析进行计算。
结果显示于图15和16。
在alum制剂中的结是：
含19A-dPly和22F-PhtD的13价PS缀合物在幼年Balb/c小鼠中的免疫原性
40只幼年Balb/c小鼠(4周龄)的组在第0、14和28天用50μl的11价PS缀合物或13价PS缀合物(均吸附在AlPO4上)IM免疫。同时施用Infanrix Hexa。
该11价疫苗制剂由如下每种缀合物的0.1μg糖组成：PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(参见表1和表2下方对11价疫苗的注释)。该13价疫苗制剂额外包含0.1μg的PS19A-dPly和PS22F-PhtD缀合物(参见表1和表2下方对13价疫苗的注释[使用直接缀合的22F])。在第2和第4组中，该肺炎球菌溶血素载体通过GMBS处理解毒，在第3和第5组中，其通过甲醛解毒。在第2和第3组中，PhtD被用于缀合PS 22F，在第4和第5组中，采用了PhtD_E融合体(构建体VP147来自于WO03/054007)。在第6组中，19A被缀合至白喉类毒素，22F被缀合至蛋白D。
抗-PS19A和22F ELISA IgG水平以及调理吞噬效价可在第42天采集的单独血清中确定。在汇集的血清中测量对其它PS生成的ELISA IgG应答。
在13价缀合物疫苗制剂中施用的19A-dPly和22F-PhtD在幼年Balb/c小鼠中显示了免疫原性和调理吞噬效价(表17和图19-20)。与用11价疫苗制剂免疫的小鼠相比，用13价制剂免疫的小鼠中针对其他PS诱导的免疫应答未受到负面影响。
调理吞噬测定被用于评估该血清，结果显示于图19和20。
Figure GPA00001032855600691
含19A-dPly和22F-PhtD的13价PS缀合物在幼年OF1小鼠中的免疫原性
40只幼年OF1小鼠(4周龄)的组在第0、14和28天用50μl的11价PS缀合物或13价PS缀合物(均吸附在AlPO4上)IM免疫。同时施用Infanrix Hexa。
该11价疫苗制剂由如下每种缀合物的0.1μg糖组成：PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(参见表1和表2下方对11价疫苗的注释)。该13价疫苗制剂额外包含0.1μg的PS19A-dPly和PS22F-PhtD缀合物(参见表1和表2下方对13价疫苗的注释[使用直接缀合的22F])。在第2和第4组中，该肺炎球菌溶血素载体通过GMBS处理解毒，在第3和第5组中，其通过甲醛解毒(该方法描述于WO 04/81515)。在第2和第3组中，PhtD被用于缀合PS 22F，在第4和第5组中，采用了PhtD_E融合体(构建体VP147来自于WO 03/054007)。在第6组中，19A被缀合至白喉类毒素，22F被缀合至蛋白D。
抗-PS19A和22F ELISA IgG水平以及调理吞噬效价可在第42天采集的单独血清中确定。在汇集的血清中测量对其它PS生成的ELISA IgG应答。
在13价缀合物疫苗制剂中施用的19A-dPly和22F-PhtD在幼年OF1小鼠中显示了免疫原性和调理吞噬效价(表18和图21-22)。与用11价疫苗制剂免疫的小鼠相比，用13价制剂免疫的小鼠中针对其他PS诱导的免疫应答未受到负面影响。
该血清同样通过调理吞噬测定评估，结果显示于图21和22。
Figure GPA00001032855600711
实施例10含19A-dPly和22F-PhtD的13价PS缀合物在豚鼠中的免疫原性
20只幼年豚鼠(Hartley株；5周龄)的组在第0、14和28天用125μl的11价PS缀合物或13价PS缀合物(均与佐剂C混合)IM免疫(见下文)。
该11价疫苗制剂由如下每种缀合物的0.25μg糖组成：PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(参见表1和表2下方对11价疫苗的注释)。该13价疫苗制剂额外包含0.1μg的PS19A-dPly和PS22F-PhtD缀合物(参见表1和表2下方对13价疫苗的注释[使用直接缀合的22F])。在第2和第4组中，该肺炎球菌溶血素载体通过GMBS处理解毒，在第3和第5组中，其通过甲醛解毒。在第2和第3组中，PhtD被用于缀合PS 22F，在第4和第5组中，采用了PhtD_E融合体(构建体VP147来自于WO 03/054007)。在第6组中，19A被缀合至白喉类毒素，22F被缀合至蛋白D。
抗-PS19A和22F ELISA IgG水平可通过如下方案在第42天采集的单独血清中确定。在汇集的血清中测量对其它PS生成的ELISA IgG应答。
豚鼠血清学步骤：
抗-PS19A ELISA IgG水平可用如下所述步骤在第42天采集的血清中评估：
用含于PBS缓冲液的纯化19A型肺炎球菌PS(10μg/ml)在37℃下涂覆微量滴定板2小时。用NaCl 0.9％ mM-Tween 200.05％洗涤滴定板四次。将血清与含于PBS 0.05％Tween 20的50μg/ml CPS(V/V)在37℃下孵育1小时。将血清加入微孔，并在PBS-BSA 0.05％Tween 0.05％中系列稀释(两倍稀释步骤)。将滴定板在室温下搅拌孵育30分钟。参照上文洗涤滴定板，添加抗-豚鼠IgG过氧化物酶缀合物(1/1000稀释)并将滴定板在室温下孵育30分钟。洗涤后，向每个微孔添加底物(含于10ml柠檬酸盐0.1M pH4.5的4mgOPDA和5μlH2O2)，反应进行15分钟。添加1N HCl终止反应。使用分光光度计读取490-620nm下的吸收值。形成的颜色与血清中存在的抗体的量成直接比例。
通过与各板上添加血清的参考曲线比较确定未知血清中存在的抗-PS19AIgG水平，并以μg/ml表示。
抗-PS22F ELISA IgG水平可用如下所述步骤在第42天采集的血清中确定：
用含于PBS缓冲液的纯化22F型肺炎球菌PS(10μg/ml)在37℃下涂覆微量滴定板2小时。用NaCl 0.9％mM-Tween 200.05％洗涤滴定板四次。将血清与含于PBS 0.05％Tween 20的50μg/ml CPS(V/V)在37℃下孵育1小时。将血清加入微孔，并在PBS-BSA 0.05％Tween 0.05％中系列稀释(两倍稀释步骤)。将滴定板在室温下搅拌孵育30分钟。参照上文洗涤滴定板，添加抗-豚鼠IgG过氧化物酶缀合物(1/1000稀释)并将滴定板在室温下孵育30分钟。洗涤后，向每个微孔添加底物(含于10ml柠檬酸盐0.1M pH4.5的4mgOPDA和5μl H2O2)，反应进行15分钟。添加1N HCl终止反应。使用分光光度计读取490-620nm下的吸收值。形成的颜色与血清中存在的抗体的量成直接比例。
通过与各板上添加血清的参考曲线比较确定未知血清中存在的抗-PS22FIgG水平，并以μg/ml表示。
除了将豚鼠血清汇集以外，可根据相同的步骤实现针对所有其它血清型的免疫应答。
表19在豚鼠中的PS免疫原性(III期后IgG水平)
Figure GPA00001032855600731
Figure GPA00001032855600741
Figure GPA00001032855600751
调理吞噬测定同样被用于测试该血清，结果显示于图17和18。
实施例11制备和测试的制剂
a)制备以下制剂(采用了表1的13价疫苗和表5的血清型3-参见表2下方关于14价疫苗的注释[采用了直接缀合的22F或通过ADH接头缀合])。所述糖按如下所示与磷酸铝和3D-MPL配制。
Figure GPA00001032855600752
b)向相同的糖制剂添加如下佐剂中的每一种：
-在下文的表中显示了每500μl剂量的乳液成分的浓度。
          佐剂A1           佐剂A2              佐剂A3
成分      250μl o/w乳液   125μl o/w乳液      50μl o/w乳液
α生育酚  11.88mg          5.94mg              2.38mg
角鲨烯    10.7mg           5.35mg              2.14mg
Tween80   4.85mg           2.43mg              0.97mg
          佐剂A4      佐剂A5        佐剂A6        佐剂A7
成分      250μl o/w  250μl o/w 乳 125μl o/w 乳 50μl o/w
          乳液        液            液            乳液
α生育酚  11.88mg     11.88mg       5.94mg        2.38mg
角鲨烯    10.7mg      10.7mg        5.35mg        2.14mg
Tween 80  4.85mg      4.85mg        2.43mg        0.97mg
3D-MPL    50μg       25μg         25μg         10μg
c)该糖还可与两种基于脂质体的佐剂配制：
佐剂B1组成
性质数量(每0.5mL剂量)
脂质体：
-DOPC 1mg
-胆固醇0.25mg
3DMPL 50μg
QS21 50μg
KH2PO4 13.124mg缓冲液
Na2HPO4 10.290mg缓冲液
NaCl 2.922mg
(100mM)
WFI添加额外(q.s.ad)0.5ml溶剂
pH6.1
1.总PO4浓度＝50mM
佐剂B2组成
性质数量(每0.5mL剂量)
脂质体：
-DOPC 0.5mg
-胆固醇0.125mg
3DMPL 25μg
QS21 25μg
KH2PO4 13.124mg缓冲液
Na2HPO4 10.290mg缓冲液
NaCl 2.922mg
(100mM)
WFI添加额外0.5ml溶剂
pH6.1
d)该糖还可与佐剂C配制(参见上文使用了该佐剂的其它组合物)：
性质数量(每0.5mL剂量)
水包油乳液：50μl
-角鲨烯2.136mg
-α-生育酚2.372mg
-Tween 80 0.97mg
-胆固醇0.1mg
3DMPL 50μg
QS21 50μg
KH2PO4 10.470mg缓冲液
Na2HPO4 10.219mg缓冲液
NaCl 4.003mg
(137mM)
KCl 0.101mg
(2.7mM)
WFI添加额外0.5ml溶剂
pH6.8
实施例12缀合化学对22F-PhtD缀合物在Balb/c小鼠中免疫原性的影响
30只雌性Balb/c小鼠的组在第0、14和28天用包含PS 1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的13价PS制剂(剂量：对于PS 4、18C、19A、19F和22F为0.3μg糖/缀合物，对于其它PS为0.1μg糖/缀合物)肌肉内(IM)途径免疫。
PS 18C被缀合至破伤风类毒素，19F被缀合至白喉类毒素，19A被缀合至甲醛-解毒Ply，22F被缀合至PhtD，其它PS被缀合至PD。
对通过直接CDAP化学制备的22F-PhtD或22F-AH-PhtD(ADH衍生PS)组成的两种制剂进行比较。以直接缀合或通过ADH间隔基缀合22F制备的13价疫苗的特征参见实施例2，表1以及表2下方的注释。该疫苗制剂添加了佐剂C。
抗-PS22F ELISA IgG水平和调理吞噬效价在42天采集的血清中测定。
对于IgG水平(图5)和调理吞噬效价(图6)，22F-AH-PhtD均显示了比22F-PhtD高得多的免疫原性。
实施例13新佐剂对肺炎链球菌荚膜PS缀合物的免疫原性的影响
40只幼年C57B1小鼠的组在第0、14和28天用包含PS 1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的13价PS制剂(剂量：对于PS 4、18C、19A、19F和22F为0.3μg/缀合物，对于其它PS为0.1μg/缀合物)IM途径免疫。
PS 18C被缀合至破伤风类毒素，19F被缀合至白喉类毒素，19A被缀合至甲醛-解毒Ply，22F被缀合至PhtD，其它PS被缀合至PD。以22F直接缀合制备的13价疫苗的特征参见实施例2，表1以及表2下方的注释。
添加了AlPO4、佐剂A1、佐剂A4或佐剂A5的四种制剂进行对比。
在42天采集并每组汇集的血清中测定抗-PS、Ply、PhtD和PD ELISAIgG水平。对每种抗原计算以下比例：以所测试新佐剂诱导的IgG水平/以AlPO4诱导的IgG水平。
与经典的AlPO4制剂相比，所有测试的新型佐剂使得对血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和22F缀合物的免疫应答均提高了至少2倍(图7)。在本实验中，血清型23F未获得可靠应答。
实施例14PhtD/解毒Ply组合在肺炎球菌猴肺炎模型中的保护效力
将按照具有最低预先存在的抗-19F抗体水平选择的6只恒河猴(3至8岁)的组在第0和28天用包含PS缀合物(即，1μg[糖的]PS 1、3、5、6B、7F、9V、14和23F以及3μgPS 4、18C和19F)或PhtD(10μg)+甲醛-解毒Ply(10μg)或PhtD/E融合蛋白(10μg)和甲醛-解毒Ply(10μg)或单独的佐剂肌肉内免疫。
PS 18C被缀合至破伤风类毒素，19F被缀合至白喉类毒素，其它PS被缀合至PD。11价疫苗的特征参见实施例2，表1以及表2下方的注释。所有制剂添加了佐剂C。
在第42天于右肺中接种19F型肺炎球菌(5.108cfu)。在攻击后第1、3和7天采集的支气管肺泡灌洗液中对集落进行计数。所述结果表示为攻击后7天每组死亡、肺部移生或清除的动物数量。
如图8所示，与单独佐剂组相比，11价缀合物和PhtD+dPly组合获得了接近统计显著性(尽管所用动物数量较少)的良好保护(p＜0.12，Fisher精确检验)。
实施例15缀合化学对针对22F-PhtD缀合物诱导的4型攻击的抗-PhtD抗体应答和保护效力的影响
20只雌性OF1小鼠的组在第0和14天用3μg的22F-PhtD(通过直接CDAP化学制备)或22F-AH-PhtD(ADH-衍生PS)或单独的佐剂肌肉内途径免疫。两种单价22F缀合物均通过实施例2的方法制备(也参见表1和表2)。每种制剂均添加佐剂C。
在第28天采集的血清中检测抗-PhtD ELISA IgG水平。
在第29天用5.106cfu的4型肺炎球菌鼻内攻击小鼠(即，未被所测试疫苗制剂中存在的PS所潜在涵盖的肺炎球菌血清型)。监测死亡率至攻击后10天。
图9所示的结果证明了与22F-PhtD相比，22F-AH-PhtD诱导了明显更高的抗-PhtD IgG应答。如在图10中所示反映，与22F-PhtD相比，对4型攻击有更好的保护。
实施例16在生成保护性免疫应答中结合多糖和蛋白的益处
在小鼠致命肺炎链球菌攻击模型中评估了针对PhtD和荚膜多糖的免疫应答之间的潜在协同作用。小鼠以PhtD肌肉内免疫三次(第0、14和28天)。在细菌攻击前一小时，将抗多糖抗体被动转移至小鼠(IP，200μl)。在攻击后8或11天通过肺炎链球菌诱导致死率。这里对两种肺炎链球菌菌株(血清型3和血清型1)存在保护的协同作用。
肺炎链球菌3/43攻击模型：
在此实验中，用吸附在AlPO4上的PhtD免疫OF1小鼠，并在用肺炎链球菌血清型3(Spn 3/43)攻击前1小时被动转移1.25μg抗-PS3豚鼠抗体。
结果显示于图11。在仅接受PBS的小鼠中观察到了70％的致死率。在接受抗-PS3抗体或以PhtD免疫的小鼠的组中观察到了中等的保护。在结合了分别针对PhtD和PS3的主动和被动免疫的小鼠中得到了几乎导致完全保护的协同作用。
肺炎链球菌血清型1/57攻击模型：
在此实验中，用添加了TH1佐剂的PhtD免疫OF1小鼠，并在用肺炎链球菌血清型1(Spn 1/57)攻击前一小时被动转移抗-PS1豚鼠抗体。
结果显示于图12。在仅接受了TH1佐剂(主动免疫)和PBS(被动免疫)的对照组的小鼠中观察到了较高的致死率。在接受抗-PS1抗体(55％存活)或以PhtD免疫(25％存活)的小鼠的组中观察到了中等的保护。在结合了分别针对PhtD和PS1的主动和被动免疫的小鼠中得到了几乎导致完全保护的协同作用。
这些数据支持在针对肺炎链球菌感染的保护机制中针对肺炎链球菌蛋白(即PhtD)和荚膜多糖的免疫应答的协同作用。
实施例17肺炎球菌PS-TT和PS-DT缀合物对11价疫苗制剂中剩余的肺炎球菌PS-PD缀合物免疫应答的影响
含有11PS-PD缀合物的制剂与含有7PS-PD、2PS-TT(PS 6B和23F)和2PS-DT(PS 18C和19F)缀合物的制剂在小鼠和豚鼠免疫原性模型中比较。
小鼠用疫苗人用剂量的1/10(0.1μgPS)肌肉内免疫三次。在第42天采集血液样本，通过ELISA测定针对每种多糖的免疫应答。
豚鼠用疫苗人用剂量的1/4(0.25μgPS)肌肉内免疫三次。同时施用Infanrix Hexa以模拟人的情形。在第42天采集血液样本，通过ELISA测定针对每种多糖的免疫应答。
E：实验N°PN115(plms 20040304)小鼠
  ELISA
均在PD上1μg   6B-TTAH 1μg23F-TTAH 1μg18C-DTAH 1μg19F-DT 1μg1/4PD1μg其它在PD上1μg
  1GMC95％CI％seropos   6.1484.54-8.33100％   19.961＊14.73-27.05100％
  3GMC95％CI％seropos   1.7631.223-2.542100％   2.4831.693-3.643100％
  4GMC95％CI％seropos   3.6432.498-5.311100％   11.849＊8.909-15.759100％
  5GMC95％CI％seropos   2.2911.575-3.332100％   5.154＊3.829-6.939100％
  6B GMC95％CI％seropos   0.0480.031-0.07544％   0.537＊0.342-0.843100％
  7F GMC95％CI％seropos   0.2970.22-0.41100％   0.7740.48-1.25100％
  ELISA
  9V GMC95％CI％seropos   2.0981.575-2.793100％   8.098＊6.507-10.078100％
  14GMC95％CI％seropos   4.9833.742-6.634100％   9.327＊7.669-11.344100％
  18C GMC95％CI％seropos   0.4690.32-0.69100％   3.274＊2.67-4.01100％
  19F GMC95％CI％seropos   3.0522.14-4.35100％   21.274＊16.54-27.37100％
  23F GMC95％CI％seropos   0.0720.044-0.11738％   1.2090.457-3.271％
E)实验N°PN116(plms 20040308)豚鼠
  ELISA
均在PD上1μg   6B-TTAH 1μg23F-TTAH 1μg18C-DTAH 1μg19F-DT 1μg1/4PD 1μg其它在PD上1μg
  1GMC95％CI％seropos   8.2444.745-14.324100％   33.479＊21.507-52.114100％
  ELISA
  3GMC95％CI％seropos   2.348142-3.89100％   1.6190.84-3.13100％
  4GMC95％CI％seropos   9.2115.535-15.238100％   19.03310.816-33.494100％
  5GMC95％CI％seropos   14.049.967-19.776100％   14.79110.227-21.392100％
  6B GMC95％CI％seropos   0.4910.292-0.825100％   1.6670.746-3.726100％
  7F GMC95％CI％seropos   10.4675.979-18.324100％   37.49＊21.944-64.051100％
  9V GMC95％CI％seropos   5.4593.106-9.589100％   10.3096.183-17.187100％
  14GMC95％CI％seropos   1.2350.686-2.224100％   4.358＊2.073-9.161100％
  19F GMC95％CI％seropos   7.7695.617-10.745100％   15.933＊12.036-21.092100％
  18C GMC95％CI％seropos   2.3731.297-4.341100％   8.744＊5.128-14.908100％
  ELISA
  23F GMC95％CI％seropos   5.6213.289-9.608100％   33.791＊20.838-54.797100％
含有与TT(PS 6B和23F)和DT(PS 18C和19F)缀合的两种多糖的制剂与11-V PD制剂相比，在小鼠和豚鼠中均观察到针对与PD缀合的大部分多糖的增加的免疫应答。这些差异分别在小鼠和豚鼠中针对PS 1、4、5、9V和14以及PS 1、7F和14具有统计显著性。
序列表
0963963xl序列表
<110>葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司
<120>疫苗
 
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<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
 
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Claims (133)

1.包含至少7种肺炎链球菌荚膜糖缀合物的免疫原性组合物，所述肺炎链球菌荚膜糖缀合物包括来自血清型19A和19F的荚膜糖缀合物，其中19A与第一细菌类毒素缀合，19F与第二细菌类毒素缀合，而2-9种肺炎链球菌荚膜糖与蛋白D缀合。
2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述第一细菌类毒素是不同于所述第二细菌类毒素的蛋白。
3.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其中所述第一细菌类毒素选自破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、百日咳类毒素、细菌溶细胞素以及肺炎球菌溶血素。
4.如权利要求1-3任意一项所述的免疫原性组合物，其中所述第二细菌类毒素选自破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、百日咳类毒素、细菌溶细胞素和肺炎球菌溶血素。
5.如权利要求1-4任意一项所述的免疫原性组合物，其中所述第一细菌类毒素为肺炎球菌溶血素。
6.如权利要求1-5任意一项所述的免疫原性组合物，其中所述第二细菌类毒素为白喉类毒素。
7.如权利要求1-6任意一项所述的免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C和23F荚膜糖缀合物。
8.如权利要求1-7所述的免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌血清型1、5和7F荚膜糖缀合物。
9.如权利要求1-8所述的免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌血清型22F荚膜糖缀合物。
10.如权利要求1-9所述的免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌荚膜糖3缀合物。
11.如权利要求1-10所述的免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌荚膜糖6A缀合物。
12.如权利要求1-11任意一项所述的免疫原性组合物，其中所述荚膜糖中的第3、4或5型与蛋白D缀合。
13.如权利要求7-12任意一项所述的免疫原性组合物，其中所述血清型4荚膜糖与蛋白D缀合。
14.如权利要求8-13任意一项所述的免疫原性组合物，其中所述血清型5荚膜糖与蛋白D缀合。
15.如权利要求8-14任意一项所述的免疫原性组合物，其中所述血清型7F荚膜糖与蛋白D缀合。
16.如权利要求7-15任意一项所述的免疫原性组合物，其中所述血清型9V荚膜糖与蛋白D缀合。
17.如权利要求7-16任意一项所述的免疫原性组合物，其中所述血清型14荚膜糖与蛋白D缀合。
18.如权利要求9-17任意一项所述的免疫原性组合物，其中所述血清型22F荚膜糖与蛋白D缀合。
19.如权利要求7-18任意一项所述的免疫原性组合物，其中所述血清型23F荚膜糖与蛋白D缀合。
20.如权利要求1-19任意一项所述的免疫原性组合物，其中所述荚膜糖中的少数与蛋白D缀合。
21.如权利要求1-20任意一项所述的免疫原性组合物，其中3种不同的载体蛋白分别与至少3种不同的肺炎链球菌荚膜糖血清型缀合。
22.如权利要求1-21任意一项所述的免疫原性组合物，其中4种不同的载体蛋白分别与至少4种不同的肺炎链球菌荚膜糖血清型缀合。
23.如权利要求1-22任意一项所述的免疫原性组合物，其中5种不同的载体蛋白分别与至少5种不同的肺炎链球菌荚膜糖血清型缀合。
24.如权利要求1-22任意一项所述的免疫原性组合物，其中6种不同的载体蛋白分别与至少6种不同的肺炎链球菌荚膜糖血清型缀合。
25.如权利要求21-24任意一项所述的免疫原性组合物，其包含了选自如下的3、4、5或6种载体蛋白：破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、肺炎球菌溶血素、蛋白D和PhtD或其融合蛋白。
26.如权利要求1-25所述的免疫原性组合物，其包含与破伤风类毒素缀合的肺炎链球菌荚膜糖18C。
27.如权利要求1-26所述的免疫原性组合物，其包含与肺炎球菌溶血素缀合的肺炎链球菌荚膜糖19A。
28.如权利要求1-27所述的免疫原性组合物，其包含与PhtD或其融合蛋白缀合的肺炎链球菌荚膜糖22F。
29.如权利要求1-28所述的免疫原性组合物，其包含与肺炎球菌溶血素或流感嗜血杆菌蛋白，可选的蛋白D或PhtD或其融合蛋白缀合的肺炎链球菌荚膜糖6A。
30.如前述任意一项权利要求所述的免疫原性组合物，其中19A荚膜糖直接与所述载体蛋白缀合。
31.如权利要求1-29任意一项所述的免疫原性组合物，其中19A荚膜糖通过接头与所述载体蛋白缀合。
32.如权利要求31所述的免疫原性组合物，其中所述接头为ADH。
33.如权利要求31或32所述的免疫原性组合物，其中所述接头通过碳二亚胺化学，可选地采用EDAC与所述载体蛋白连接。
34.如权利要求30-33任意一项所述的免疫原性组合物，其中所述19A糖与所述载体蛋白缀合或用CDAP化学与接头缀合。
35.如权利要求1-30任意一项所述的免疫原性组合物，其中载体蛋白与19A糖的比例介于5∶1和1∶5、4∶1和1∶1或3.5∶1和2.5∶1(w/w)之间。
36.如前述任意一项权利要求所述的免疫原性组合物，其中19F荚膜糖直接与所述载体蛋白缀合。
37.如权利要求1-35任意一项所述的免疫原性组合物，其中19F荚膜糖通过接头与所述载体蛋白缀合。
38.如权利要求37所述的免疫原性组合物，其中所述接头为ADH。
39.如权利要求37或38所述的免疫原性组合物，其中所述接头通过碳二亚胺化学，可选地采用EDAC与所述载体蛋白连接。
40.如权利要求36-39任意一项所述的免疫原性组合物，其中所述19F糖与所述载体蛋白缀合或通过CDAP化学与所述接头缀合。
41.如权利要求1-40任意一项所述的免疫原性组合物，其中载体蛋白与19F糖的比例介于5∶1和1∶5、4∶1和1∶1或2∶1和1∶1(w/w)之间。
42.如权利要求1-41任意一项所述的免疫原性组合物，其包含与所述载体蛋白直接缀合的22F荚膜糖。
43.如权利要求1-41任意一项所述的免疫原性组合物，其包含与所述载体蛋白通过接头缀合的22F荚膜糖。
44.如权利要求43所述的免疫原性组合物，其中所述接头为ADH。
45.如权利要求43或44所述的免疫原性组合物，其中所述接头通过碳二亚胺化学，可选地采用EDAC与所述载体蛋白连接。
46.如权利要求42-45任意一项所述的免疫原性组合物，其中所述22F糖与所述载体蛋白缀合或使用CDAP化学与所述接头缀合。
47.如权利要求1-46任意一项所述的免疫原性组合物，其中载体蛋白与22F糖的比例介于5∶1和1∶5、4∶1和1∶1或2∶1和1∶1(w/w)之间。
48.如前述任意一项权利要求所述的免疫原性组合物，其中19A糖的平均大小在100kDa以上。
49.如权利要求48所述的免疫原性组合物，其中19A糖的平均大小介于110-700kDa、110-300、120-200、130-180或140-160kDa之间。
50.如权利要求48或49所述的免疫原性组合物，其中所述19A糖为天然多糖或以不超过x5的因子进行大小处理。
51.如权利要求48、49或50所述的免疫原性组合物，其中所述19A糖已通过微射流进行大小处理。
52.如前述任意一项权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述19A糖缀合物的剂量为介于1-10μg、2-8μg或3-7μg的糖之间。
53.如权利要求52所述的免疫原性组合物，其中所述19A糖缀合物的剂量为5μg的糖。
54.如前述任意一项权利要求所述的免疫原性组合物，其包含22F糖缀合物，其中所述22F糖的平均大小在100kDa以上。
55.如权利要求54所述的免疫原性组合物，其中22F糖的平均大小介于110-700kDa、110-300、120-200、130-180或150-170kDa之间。
56.如权利要求54或55所述的免疫原性组合物，其中22F糖为天然多糖或以不超过x5的因子进行大小处理。
57.如权利要求54、55或56所述的免疫原性组合物，其中22F糖已通过微射流进行大小处理。
58.如前述任意一项权利要求所述的免疫原性组合物，其包含22F糖缀合物，其中所述22F糖缀合物的剂量为介于1-10μg、2-8μg或3-7μg的糖之间。
59.如权利要求58所述的免疫原性组合物，其中22F糖缀合物的剂量为5μg的糖。
60.如前述任意一项权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述糖的平均大小在50kDa以上。
61.如权利要求60所述的免疫原性组合物，其包含平均糖大小介于300和400kDa之间的血清型1。
62.如权利要求60和61所述的免疫原性组合物，其包含平均糖大小介于75和125kDa之间的血清型4。
63.如权利要求60、61和62所述的免疫原性组合物，其包含平均糖大小介于350和450kDa之间的血清型5。
64.如权利要求60-63任意一项所述的免疫原性组合物，其包含平均糖大小介于1000和1400kDa之间的血清型6B。
65.如权利要求60-64任意一项所述的免疫原性组合物，其包含平均糖大小介于200和300kDa之间的血清型7F。
66.如权利要求60-65任意一项所述的免疫原性组合物，其包含平均糖大小介于250和300kDa之间的血清型9V。
67.如权利要求60-66任意一项所述的免疫原性组合物，其包含平均糖大小介于200和250kDa之间的血清型14。
68.如权利要求60-67任意一项所述的免疫原性组合物，其包含平均糖大小介于900和1000kDa之间的血清型23F。
69.如前述任意一项权利要求所述的免疫原性组合物，其包含作为天然糖的血清型5、6B和23F(以及可选的6A)。
70.如前述任意一项权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述荚膜糖缀合物的剂量为每种缀合物介于1-10μg、1-5μg或1-3μg的糖之间。
71.如前述任意一项权利要求所述的免疫原性组合物，其包含每种缀合物的剂量为3μg糖的血清型4、18C和19F(以及可选的19A和22F)。
72.如前述任意一项权利要求所述的免疫原性组合物，其包含每种缀合物的剂量为1μg糖的血清型1、5、6B、7F、9V、14和23F(以及可选的6A和/或3)。
73.如前述任意一项权利要求所述的免疫原性组合物，其进一步包含血清型不同于缀合的血清型的未缀合肺炎链球菌糖，使得缀合和未缀合糖血清型的数量少于或等于23。
74.如前述任意一项权利要求所述的免疫原性组合物，其进一步包含一种或多种未缀合或缀合的肺炎链球菌蛋白。
75.如权利要求74所述的免疫原性组合物，其包含一种或多种未缀合的肺炎链球菌蛋白。
76.如权利要求74或75所述的免疫原性组合物，其中所述一种或多种肺炎链球菌蛋白选自聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、截短CbpX、LytX家族、截短LytX、截短CbpX-截短LytX嵌合蛋白、解毒肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133。
77.如权利要求74、75或76所述的免疫原性组合物，其包含肺炎球菌溶血素。
78.如权利要求74-77任意一项所述的免疫原性组合物，其包含PhtX蛋白。
79.如前述任意一项权利要求所述的免疫原性组合物，其包含作为游离或载体蛋白的肺炎球菌溶血素。
80.如前述任意一项权利要求所述的免疫原性组合物，其包含作为游离或载体蛋白的PhtX蛋白。
81.如权利要求80所述的免疫原性组合物，其中所述PhtX蛋白为PhtD，或者，PhtBD或PhtDE融合蛋白。
82.如前述任意一项权利要求所述的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。
83.如权利要求82所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含脂质体载体。
84.如权利要求83所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含(每0.5mL剂量)0.1-10mg、0.2-7、0.3-5、0.4-2或0.5-1mg(如0.4-0.6、0.9-1.1、0.5或1mg)磷脂(例如DOPC)。
85.如权利要求83或84所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含(每0.5mL剂量)0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg(如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125mg)固醇(例如胆固醇)。
86.如权利要求83-85任意一项所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含(每0.5mL剂量)5-60、10-50或20-30μg(如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)脂质A衍生物(例如3D-MPL)。
87.如权利要求83-86任意一项所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含(每0.5mL剂量)5-60、10-50或20-30μg(如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)皂甙(例如QS21)。
88.如权利要求82所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含水包油乳液。
89.如权利要求88所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含(每0.5mL剂量)0.5-15、1-13、2-11、4-8或5-6mg(如2-3、5-6或10-11mg)可代谢的油(例如角鲨烯)。
90.如权利要求88或89所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含(每0.5mL剂量)0.1-10、0.3-8、0.6-6、0.9-5、1-4或2-3mg(如0.9-1.1、2-3或4-5mg)乳化剂(例如Tween 80)。
91.如权利要求88-90所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含(每0.5mL剂量)0.5-20、1-15、2-12、4-10、5-7mg(如11-13、5-6或2-3mg)母育酚(例如α生育酚)。
92.如权利要求88-91所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含(每0.5mL剂量)5-60、10-50或20-30μg(如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)脂质A衍生物(例如3D-MPL)。
93.如权利要求88-92所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含(每0.5mL剂量)0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg(如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125mg)固醇(例如胆固醇)。
94.如权利要求88-93所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含(每0.5mL剂量)5-60、10-50或20-30μg(如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)皂甙(例如QS21)。
95.如权利要求82所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含金属盐和脂质A衍生物。
96.如权利要求95所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含(每0.5mL剂量)100-750、200-500或300-400μg磷酸铝形式的Al。
97.如权利要求95或96所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含(每0.5mL剂量)5-60、10-50或20-30μg(如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)脂质A衍生物(例如3D-MPL)。
98.如权利要求1-97任意一项所述的免疫原性组合物，其至少或恰好包含与PhtD或其融合蛋白缀合的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或13种肺炎链球菌荚膜糖。
99.如权利要求1-97任意一项所述的免疫原性组合物，其至少或恰好包含与肺炎球菌溶血素缀合的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或13种肺炎链球菌荚膜糖。
100.疫苗试剂盒，其包含如权利要求1-97任意一项所述的免疫原性组合物，并进一步包含用于同时或依次施用的如权利要求83-99任意一项所定义的佐剂。
101.疫苗，其包含如权利要求1-99任意一项所述的免疫原性组合物及药学上可接受的赋形剂。
102.制备如权利要求101所述的疫苗的方法，其包括将如权利要求1-99任意一项所述的免疫原性组合物与药学上可接受的赋形剂相混合的步骤。
103.对人类宿主进行免疫以对抗肺炎链球菌感染引起的疾病的方法，其包括向所述宿主施用免疫保护剂量的如权利要求1-99任意一项所述的组合物或如权利要求101所述的疫苗。
104.如权利要求103所述的方法，其中所述人类宿主为老年人，且所述疾病是肺炎或侵袭入性肺炎球菌性疾病(IPD)之一或两者。
105.如权利要求103或104所述的方法，其中所述人类宿主为老年人，且所述疾病是慢性阻塞性肺病(COPD)的恶化。
106.如权利要求103所述的方法，其中所述人类宿主为婴儿，且所述疾病为中耳炎。
107.如权利要求103或106所述的方法，其中所述人类宿主为婴儿，且所述疾病为脑膜炎和/或菌血症。
108.如权利要求103、106或107所述的方法，其中所述人类宿主为婴儿，且所述疾病为肺炎和/或结膜炎。
109.如权利要求1-99所述的免疫原性组合物或如权利要求101所述的疫苗，其用于预防治疗由肺炎链球菌感染引起的疾病。
110.如权利要求1-99所述的免疫原性组合物或疫苗或如权利要求101所述的疫苗在生产用于治疗或预防由肺炎链球菌感染引起的疾病的药物中的用途。
111.如权利要求110所述的用途，其中所述疾病是老年人的肺炎或侵袭性肺炎球菌性疾病(IPD)之一或两者。
112.如权利要求110或111所述的用途，其中所述疾病是老年人慢性阻塞性肺病(COPD)的恶化。
113.如权利要求110所述的用途，其中所述疾病是人类婴儿的中耳炎。
114.如权利要求110或113所述的用途，其中所述疾病是人类婴儿的脑膜炎和/或菌血症。
115.如权利要求110、113或114所述的用途，其中所述疾病是人类婴儿的肺炎和/或结膜炎。
116.在婴儿体内引发对抗中耳炎的保护性免疫应答的方法，其包括作为单独或组合成分相继或同时施用(i)如权利要求1-99任意一项所述的免疫原性组合物或疫苗和(ii)来自流感嗜血杆菌的蛋白D，其中所述蛋白D可以是游离的和/或缀合的。
117.通过施用任意前述权利要求的免疫原性组合物或疫苗在婴儿体内引发对抗肺炎链球杆菌的保护性免疫应答的方法。
118.引发老年患者对抗肺炎链球杆菌的保护性免疫应答的方法，其通过相继或同时联合施用如下成分：(i)如前述任意权利要求所述的免疫原性组合物或疫苗，(ii)选自PhtX家族和肺炎球菌溶血素的一种或多种肺炎链球菌表面蛋白。
119.如权利要求1-99所述的免疫原性组合物或权利要求101所述的疫苗，其包含由至少所有如下血清型衍生的糖缀合物：4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F，其中在人类疫苗接种者中针对一种或多种疫苗成分4、6B、9V、14、18C、19F和23F诱导的GMC抗体效价不明显低于由
Figure FPA00001032855500091
疫苗诱导的GMC抗体效价。
120.如权利要求119所述的免疫原性组合物，其中在人类疫苗接种者中针对血清型4诱导的GMC抗体效价不明显低于由
Figure FPA00001032855500092
疫苗诱导的GMC抗体效价。
121.如权利要求119或120所述的免疫原性组合物，其中在人类疫苗接种者中针对血清型6B诱导的GMC抗体效价不明显低于由
Figure FPA00001032855500093
疫苗诱导的GMC抗体效价。
122.如权利要求119-121所述的免疫原性组合物，其中在人类疫苗接种者中针对血清型9V诱导的GMC抗体效价不明显低于由
Figure FPA00001032855500094
疫苗诱导的GMC抗体效价。
123.如权利要求119-122所述的免疫原性组合物，其中在人类疫苗接种者中针对血清型14诱导的GMC抗体效价不明显低于由
Figure FPA00001032855500101
疫苗诱导的GMC抗体效价。
124.如权利要求119-123所述的免疫原性组合物，其中在人类疫苗接种者中针对血清型18C诱导的GMC抗体效价不明显低于由疫苗诱导的GMC抗体效价。
125.如权利要求119-124所述的免疫原性组合物，其中在人类疫苗接种者中针对血清型19F诱导的GMC抗体效价不明显低于由
Figure FPA00001032855500103
疫苗诱导的GMC抗体效价。
126.如权利要求119-125所述的免疫原性组合物，其中在人类疫苗接种者中针对血清型23F诱导的GMC抗体效价不明显低于由
Figure FPA00001032855500104
疫苗诱导的GMC抗体效价。
127.如权利要求119-126所述的免疫原性组合物，其包含血清型3糖缀合物。
128.如权利要求119-127所述的免疫原性组合物，其包含血清型6A糖缀合物。
129.如权利要求119-128所述的免疫原性组合物，其包含血清型19A糖缀合物。
130.如权利要求119-129所述的免疫原性组合物，其包含血清型22F糖缀合物。
131.如权利要求119-130所述的免疫原性组合物，其包含结晶填充剂，任选甘露糖醇。
132.如权利要求131所述的免疫原性组合物，其包含糖，任选蔗糖。
133.免疫原性组合物，其包含至少四种肺炎链球菌荚膜糖缀合物，其含有来自不同肺炎链球菌血清型的糖，其中至少一种糖缀合PhtD或其融合蛋白，且所述免疫原性组合物能够引发针对PhtD的有效免疫应答。
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DK (1) DK2167121T3 (zh)
EA (3) EA201391788A1 (zh)
ES (2) ES2552366T3 (zh)
HR (1) HRP20151122T1 (zh)
HU (1) HUE026853T2 (zh)
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PL (1) PL2167121T3 (zh)
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RS (1) RS54349B1 (zh)
SI (1) SI2167121T1 (zh)
WO (3) WO2009000824A2 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104837504A (zh) * 2012-12-11 2015-08-12 Sk化学公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白结合组合物
CN106102770A (zh) * 2014-01-21 2016-11-09 辉瑞公司 包含缀合荚膜糖抗原的免疫原性组合物及其用途
CN108003225A (zh) * 2017-12-11 2018-05-08 北京北生研生物制品有限公司 一种破伤风类毒素的精制方法
CN108289938A (zh) * 2015-09-10 2018-07-17 创赏有限公司 多价vlp缀合物
CN108524926A (zh) * 2018-06-29 2018-09-14 康希诺生物股份公司 一种多价肺炎球菌结合疫苗的制剂组合及其应用
CN109289045A (zh) * 2012-09-19 2019-02-01 国立大学法人大阪大学 含有肺炎球菌表面蛋白a的肺炎球菌疫苗
WO2023025003A1 (zh) * 2021-08-27 2023-03-02 康希诺生物股份公司 一种肺炎球菌结合疫苗制备方法

Families Citing this family (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AP1695A (en) * 2000-06-29 2006-12-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Multivalent vaccine composition.
EP2425855A1 (en) 2005-04-08 2012-03-07 Wyeth LLC Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
PT2351578T (pt) * 2005-06-27 2017-04-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Processo para o fabrico de vacinas
LT3017827T (lt) 2005-12-22 2019-01-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Pneumokokinė polisacharidinė konjuguota vakcina
KR20100045445A (ko) 2007-06-26 2010-05-03 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 다당류 컨쥬게이트를 포함하는 백신
HUE046859T2 (hu) * 2008-12-18 2020-03-30 Wyeth Llc Eljárás Streptococcus pneumoniae poliszacharid molekulatömegének szabályozására szén alkalmazásával
BRPI1014494A2 (pt) 2009-04-30 2016-08-02 Coley Pharm Group Inc vacina pneumocócica e usos da mesma
PE20161560A1 (es) 2009-09-03 2017-01-11 Pfizer Vaccines Llc Vacuna de pcsk9
US9649372B2 (en) * 2009-12-22 2017-05-16 Sanofi Pasteur Limited Immunogenic compositions and related methods
TW201136603A (en) * 2010-02-09 2011-11-01 Merck Sharp & Amp Dohme Corp 15-valent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine composition
GB201003924D0 (en) * 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
GB201003922D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
KR102222869B1 (ko) * 2010-05-14 2021-03-04 박스알타 인코퍼레이티드 키메라 ｏｓｐａ 유전자, 단백질 및 이의 사용 방법
US20140004142A1 (en) 2011-03-02 2014-01-02 Pfizer Inc. Pcsk9 vaccine
US10766932B2 (en) 2011-05-11 2020-09-08 The Children's Medical Center Corporation Multiple antigen presenting immunogenic composition, and methods and uses thereof
AU2012265320B2 (en) 2011-06-01 2016-11-03 Xiamen Innovax Biotech Co. Ltd. Fusion protein comprising diphtheria toxin non-toxic mutant CMR197 or fragment thereof
WO2013078172A1 (en) * 2011-11-23 2013-05-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Tempo-mediated glycoconjugation of an immunogenic composition against campylobacter jejuni
KR102057217B1 (ko) 2012-06-20 2020-01-22 에스케이바이오사이언스 주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
CN102759618A (zh) * 2012-07-18 2012-10-31 成都欧林生物科技股份有限公司 用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法
GB201218660D0 (en) 2012-10-17 2012-11-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
EP2908854A2 (en) * 2012-10-17 2015-08-26 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic composition
KR20140075196A (ko) 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
EP4169929A1 (en) 2012-12-20 2023-04-26 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising pn-serotype 12f
EP4272750A3 (en) 2013-02-07 2024-01-24 Children's Medical Center, Corp. Protein antigens that provide protection against pneumococcal colonization and/or disease
US11708411B2 (en) 2013-12-20 2023-07-25 Wake Forest University Health Sciences Methods and compositions for increasing protective antibody levels induced by pneumococcal polysaccharide vaccines
ES2883343T3 (es) * 2014-01-21 2021-12-07 Pfizer Polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae y conjugados de los mismos
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
EP3583947B1 (en) 2014-01-21 2023-10-11 Pfizer Inc. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and conjugates thereof
US10668164B2 (en) 2014-02-14 2020-06-02 Pfizer Inc. Immunogenic glycoprotein conjugates
CN103893751B (zh) * 2014-03-26 2016-04-20 天津康希诺生物技术有限公司 一种肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗及其制备方法
US20150344530A1 (en) * 2014-05-29 2015-12-03 Subhash V. Kapre Synthetic Peptides as Carriers for Conjugation with Polysaccharides
EP3000820A1 (en) * 2014-09-26 2016-03-30 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Synthetic vaccines against Streptococcus pneumoniae serotype 8
CN106879257B (zh) * 2014-09-26 2020-08-11 马普科技促进协会 针对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型8的疫苗
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
CN104306965B (zh) * 2014-10-31 2017-05-10 康希诺生物股份公司 预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物及制备方法
DK3244917T5 (da) 2015-01-15 2024-10-14 Pfizer Inc Immunogene sammensætninger til anvendelse i pneumokokvacciner
IL297740A (en) * 2015-05-04 2022-12-01 Pfizer Protein-polysaccharide conjugates of group b streptococcus, methods for preparing the conjugates, immunogenic preparations containing conjugates and their uses
US10729780B2 (en) * 2015-06-08 2020-08-04 Serum Institute Of India Private Ltd. Methods for improving the adsorption of polysaccharide-protein conjugates and multivalent vaccine formulation obtained thereof
ES2880957T3 (es) * 2015-06-08 2021-11-26 Max Planck Gesellschaft Vacunas contra Streptococcus pneumoniae serotipo 5
PL3313436T3 (pl) * 2015-06-23 2021-06-14 Biological E Limited Wielowartościowa skoniugowana szczepionka przeciw pneumokokom
PE20180657A1 (es) 2015-07-21 2018-04-17 Pfizer Composiciones inmunogenas que comprenden antigenos de sacarido capsular conjugados, kits que las comprenden y sus usos
GB201518684D0 (en) * 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
CA3005524C (en) 2015-11-20 2023-10-10 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
CN106110317A (zh) * 2016-06-30 2016-11-16 武汉博沃生物科技有限公司 肺炎球菌‑百白破联合疫苗
SG11201900794PA (en) * 2016-08-05 2019-02-27 Sanofi Pasteur Inc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EA039427B1 (ru) 2016-08-05 2022-01-26 Санофи Пастер Инк. Поливалентная пневмококковая полисахаридно-белковая конъюгатная композиция
CA3037056A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Biological E Limited Multivalent pneumococcal vaccine compositions comprising polysaccharide-protein conjugates
WO2018080213A1 (ko) * 2016-10-28 2018-05-03 주식회사 엘지화학 향상된 IgG 역가를 갖는 다가면역원성 조성물 및 이의 용도
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
CN118662649A (zh) 2016-12-30 2024-09-20 Vaxcyte公司 具有非天然氨基酸的多肽-抗原缀合物
SI3570879T1 (sl) 2017-01-20 2022-06-30 Pfizer Inc. Imunogenska kompozicija za uporabo v pnevmokoknih cepivih
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
AU2018243910A1 (en) 2017-03-28 2019-11-14 The Children's Medical Center Corporation A multiple antigen presenting system (MAPS)-based staphylococcus aureus vaccine, immunogenic composition, and uses thereof
US10688170B2 (en) * 2017-06-10 2020-06-23 Inventprise, Llc Multivalent conjugate vaccines with bivalent or multivalent conjugate polysaccharides that provide improved immunogenicity and avidity
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
BR112019027387A8 (pt) 2017-06-23 2022-12-06 Univ Maryland Composições imunogênicas
TWI725359B (zh) 2017-12-06 2021-04-21 美商默沙東藥廠 包含肺炎鏈球菌多醣-蛋白結合物之組合物及其使用方法
US11147864B2 (en) 2018-02-05 2021-10-19 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
IL304977A (en) 2018-02-05 2023-10-01 Sanofi Pasteur Inc A multivalent pneumococcal protein-polysaccharide conjugate preparation
KR20190121713A (ko) 2018-04-18 2019-10-28 에스케이바이오사이언스(주) 스트렙토코커스 뉴모니애 협막 다당류 및 그의 면역원성 접합체
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
AU2019338473A1 (en) 2018-09-12 2021-05-06 Affinivax, Inc. Multivalent pneumococcal vaccines
CA3120926A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 Biological E Limited Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine
JP2022512345A (ja) 2018-12-12 2022-02-03 ファイザー・インク 免疫原性多重ヘテロ抗原多糖－タンパク質コンジュゲートおよびその使用
JOP20210148A1 (ar) 2018-12-19 2023-01-30 Merck Sharp & Dohme تركيبات تشتمل على متقارنات بولي سكاريد-بروتين للمكورات العقدية الرئوية وطرق استخدامها
JP7239509B6 (ja) 2019-02-22 2023-03-28 ファイザー・インク 細菌多糖類を精製するための方法
US20220184199A1 (en) 2019-04-10 2022-06-16 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
MX2022001241A (es) 2019-07-31 2022-04-20 Sanofi Pasteur Inc Composiciones de conjugados neumococicos multivalentes polisacarido - proteina y metodos para usar los mismos.
IL292494A (en) 2019-11-01 2022-06-01 Pfizer Preparations of Escherichia coli and their methods
WO2021165847A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Pfizer Inc. Purification of saccharides
EP4107170A2 (en) 2020-02-23 2022-12-28 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CN111304816B (zh) 2020-02-24 2022-01-14 刘舞 一种牵拉机构
JP2023537945A (ja) 2020-08-10 2023-09-06 インベントプライズ・インコーポレイテッド 出現血清型２４ｆを含む多価肺炎球菌複合糖質ワクチン
JP2023546446A (ja) 2020-10-22 2023-11-02 ファイザー・インク 細菌多糖を精製する方法
IL302362A (en) 2020-10-27 2023-06-01 Pfizer ESCHERICHIA COLI preparations and their methods
CN116744965A (zh) 2020-11-04 2023-09-12 辉瑞大药厂 用于肺炎球菌疫苗的免疫原性组合物
US20220202923A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Pfizer Inc. E. coli fimh mutants and uses thereof
CA3218544A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Pfizer Inc. Vaccination against bacterial and betacoronavirus infections
WO2022234416A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Pfizer Inc. Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections
JP2024522395A (ja) 2021-05-28 2024-06-19 ファイザー・インク コンジュゲートさせた莢膜糖抗原を含む免疫原性組成物およびその使用
US20220387576A1 (en) 2021-05-28 2022-12-08 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
US12036276B2 (en) 2021-09-09 2024-07-16 Affinivax, Inc. Multivalent pneumococcal vaccines
AU2023207315A1 (en) 2022-01-13 2024-06-27 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2023161817A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Pfizer Inc. Methods for incorporating azido groups in bacterial capsular polysaccharides
WO2023218322A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Pfizer Inc. Process for producing of vaccine formulations with preservatives
WO2024084397A1 (en) 2022-10-19 2024-04-25 Pfizer Inc. Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections
WO2024110827A1 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Pfizer Inc. Methods for preparing conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
US20240181028A1 (en) 2022-11-22 2024-06-06 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024116096A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Pfizer Inc. Pneumococcal conjugate vaccine formulations
WO2024166008A1 (en) 2023-02-10 2024-08-15 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024201324A2 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof

Family Cites Families (163)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4057685A (en) 1972-02-02 1977-11-08 Abbott Laboratories Chemically modified endotoxin immunizing agent
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
DE3071552D1 (en) 1979-09-21 1986-05-22 Hitachi Ltd Semiconductor switch
BE889979A (fr) 1981-08-14 1982-02-15 Smith Kline Rit Procede de preparation de polysaccharides bacteriens capsulaires antigeniques purifies, produits obtenus et leur utilisation
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
SE8205892D0 (sv) 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
US4459286A (en) 1983-01-31 1984-07-10 Merck & Co., Inc. Coupled H. influenzae type B vaccine
US4695624A (en) 1984-05-10 1987-09-22 Merck & Co., Inc. Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency
US4808700A (en) 1984-07-09 1989-02-28 Praxis Biologics, Inc. Immunogenic conjugates of non-toxic E. coli LT-B enterotoxin subunit and capsular polymers
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4709017A (en) 1985-06-07 1987-11-24 President And Fellows Of Harvard College Modified toxic vaccines
IT1187753B (it) 1985-07-05 1987-12-23 Sclavo Spa Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente
US5173294A (en) 1986-11-18 1992-12-22 Research Foundation Of State University Of New York Dna probe for the identification of haemophilus influenzae
US4950740A (en) 1987-03-17 1990-08-21 Cetus Corporation Recombinant diphtheria vaccines
JP2851288B2 (ja) 1987-06-05 1999-01-27 アメリカ合衆国 癌診断および管理における自己分泌運動性因子
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5785973A (en) 1988-02-01 1998-07-28 Praxis Biologics, Inc. Synthetic peptides representing a T-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
DE3841091A1 (de) 1988-12-07 1990-06-13 Behringwerke Ag Synthetische antigene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
AU626961B2 (en) * 1988-12-16 1992-08-13 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezonheid En Cultuur Pneumolysin mutants and pneumococcal vaccines made therefrom
ES2055785T3 (es) 1989-01-17 1994-09-01 Eniricerche Spa Peptidos sinteticos y su uso como vehiculos universales para la preparacion de conjugados inmunogenos aptos para el desarrollo de vacunas sinteticas.
EP0382271B1 (en) 1989-02-04 1994-12-21 Akzo Nobel N.V. Tocols as adjuvant in vaccine
HU212924B (en) 1989-05-25 1996-12-30 Chiron Corp Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
FR2649012B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Emulsions multiphasiques injectables
FR2649013B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Vaccins et vecteurs de principes actifs fluides contenant une huile metabolisable
JPH04506662A (ja) 1989-07-14 1992-11-19 アメリカン・サイアナミド・カンパニー 接合体ワクチンのためのサイトカイニンおよびホルモンのキヤリヤー
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
EP0471177B1 (en) 1990-08-13 1995-10-04 American Cyanamid Company Filamentous hemagglutinin of bordetella pertussis as a carrier molecule for conjugate vaccines
US5153312A (en) 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
CA2059693C (en) 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
CA2059692C (en) 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
WO1992014488A1 (en) 1991-02-15 1992-09-03 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
GB9105992D0 (en) 1991-03-21 1991-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US5552146A (en) 1991-08-15 1996-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
NZ249704A (en) 1992-02-11 1996-11-26 Jackson H M Found Military Med A two carrier immunogenic construct comprising a 70+ kd molecule conjugated to at least 1 t-dependent antigen, preparation, compositions containing the construct
IT1262896B (it) 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
MY111880A (en) 1992-03-27 2001-02-28 Smithkline Beecham Biologicals S A Hepatitis vaccines containing 3-0 deacylated monophosphoryl lipid a
CA2135052A1 (en) 1992-05-06 1993-11-11 R. John Collier Diphtheria toxin receptor-binding region
WO1993025210A1 (en) 1992-06-18 1993-12-23 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines
ES2143716T3 (es) 1992-06-25 2000-05-16 Smithkline Beecham Biolog Composicion de vacuna que contiene adyuvantes.
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
GB9224584D0 (en) 1992-11-23 1993-01-13 Connaught Lab Use of outer membrane protein d15 and its peptides as vaccine against haempohilus influenzae diseases
SG48309A1 (en) 1993-03-23 1998-04-17 Smithkline Beecham Biolog Vaccine compositions containing 3-0 deacylated monophosphoryl lipid a
DE69431624T2 (de) 1993-05-18 2003-07-10 The Ohio State University Research Foundation, Columbus Impfstoff gegen mittelohrentzündung
JP3828145B2 (ja) 1993-09-22 2006-10-04 ヘンリー エム．ジャクソン ファウンデイション フォー ザ アドバンスメント オブ ミリタリー メディスン 免疫原性構成物の製造のための新規シアン化試薬を使った可溶性炭水化物の活性化方法
PT729473E (pt) 1993-11-17 2001-02-28 Deutsche Om Arzneimittel Gmbh Dissacaridos de glucosamina metodo para a sua preparacao composicao farmaceutica contendo os mesmos e sua utilizacao
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6455673B1 (en) 1994-06-08 2002-09-24 President And Fellows Of Harvard College Multi-mutant diphtheria toxin vaccines
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain
EP1167377B2 (en) 1994-07-15 2012-08-08 University of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
NZ304715A (en) 1995-03-22 1999-07-29 Jackson H M Found Military Med Production of immunogenic constructs using organic cyanylating reagents to activate carbohydrates and then coupling the carbohydrate to a protein, peptide or hapten
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
GB9620795D0 (en) 1996-10-05 1996-11-20 Smithkline Beecham Plc Vaccines
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US5695768A (en) 1995-06-07 1997-12-09 Alberta Research Council Immunostimulating activity of Streptococcus pneumoniae serotype 8 oligosaccharides
GB9513074D0 (en) 1995-06-27 1995-08-30 Cortecs Ltd Novel anigen
US5666153A (en) 1995-10-03 1997-09-09 Virtual Shopping, Inc. Retractable teleconferencing apparatus
US6290970B1 (en) 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
US6090576A (en) 1996-03-08 2000-07-18 Connaught Laboratories Limited DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
JP2000511411A (ja) 1996-05-01 2000-09-05 ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ 抗―肺炎球菌ワクチン用のコリン結合タンパク質
US7341727B1 (en) 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
ZA975326B (en) 1996-06-18 1998-01-14 Alza Corp Device and method for enhancing transdermal flux of agents being delivered or sampled.
JP2000514308A (ja) 1996-08-16 2000-10-31 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 新規原核生物ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびそれらの使用
US6420135B1 (en) 1996-10-31 2002-07-16 Human Genome Sciences, Inc. Streptococcus pneumoniae polynucleotides and sequences
JP2002503087A (ja) 1996-11-12 2002-01-29 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ ストレプトコッカス・ニューモニアのｃ３結合タンパク質
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
ES2195190T3 (es) 1996-12-20 2003-12-01 Alza Corp Dispositivo y metodo para mejorar el flujo de agente transdermico.
DE19708537A1 (de) 1997-03-03 1998-09-10 Biotechnolog Forschung Gmbh Neues Oberflächenprotein (SpsA-Protein) von Streptococcus pneumoniae etc.
US6299881B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
US6303347B1 (en) 1997-05-08 2001-10-16 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6764840B2 (en) 1997-05-08 2004-07-20 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
FR2763244B1 (fr) 1997-05-14 2003-08-01 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition vaccinale multivalente a porteur mixte
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
CA2292838A1 (en) 1997-06-03 1998-12-10 Connaught Laboratories Limited Lactoferrin receptor genes of moraxella
GB9711990D0 (en) 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9713156D0 (en) 1997-06-20 1997-08-27 Microbiological Res Authority Vaccines
AU740956B2 (en) 1997-07-21 2001-11-15 Baxter Healthcare Sa Modified immunogenic pneumolysin compositions as vaccines
DE69815692T2 (de) 1997-09-05 2004-04-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Öl in wasser emulsionen mit saponinen
GB9718901D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
KR20010024299A (ko) 1997-09-24 2001-03-26 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터의 사람 보체 ｃ3 분해단백질분해효소
US6224880B1 (en) 1997-09-24 2001-05-01 Merck & Co., Inc. Immunization against Streptococcus pneumoniae using conjugated and unconjugated pneumoccocal polysaccharide vaccines
US5965714A (en) 1997-10-02 1999-10-12 Connaught Laboratories, Inc. Method for the covalent attachment of polysaccharides to protein molecules
NZ504894A (en) 1997-12-02 2002-12-20 Powderject Vaccines Inc Crystalline vaccine and adjuvant compositions jointly and separately administered to animals using a transdermal or transmucosally delivery technique
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
US7018637B2 (en) * 1998-02-23 2006-03-28 Aventis Pasteur, Inc Multi-oligosaccharide glycoconjugate bacterial meningitis vaccines
CN1200731C (zh) 1998-04-07 2005-05-11 免疫医疗公司 用作疫苗的肺炎球菌胆碱结合蛋白衍生物
KR100638503B1 (ko) 1998-04-07 2006-10-26 세인트 쥬드 칠드런즈 리써치 호스피탈 Ｎ-말단 콜린 결합 단백질 ａ 절두물의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 이로부터 유도된 백신 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
EP1073450A4 (en) 1998-04-23 2003-04-23 Uab Research Foundation PNEUMOCOCCAL SURFACE PROTEIN C (PSPC), EPITOPIC REGIONS, SELECTION OF CORRESPONDING STRES AND USES
HUP0102332A3 (en) 1998-06-08 2002-11-28 Sca Emballage France Fast flattening packaging
GB9812613D0 (en) 1998-06-11 1998-08-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
ATE355266T1 (de) 1998-06-30 2006-03-15 Om Pharma Neue acylierte pseudodipeptide, verfahren zu ihrer herstellung, und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen
EP1109576B1 (en) 1998-08-19 2009-10-21 Baxter Healthcare SA Immunogenic beta-propionamido-linked polysaccharide protein conjugate useful as a vaccine produced using an n-acryloylated polysaccharide
GB9818548D0 (en) 1998-08-25 1998-10-21 Microbiological Res Authority Treatment of mucas hypersecretion
MXPA01003073A (es) 1998-09-24 2002-04-24 Univ Minnesota Polipeptido que degrada la proteina c3 complementaria humana a partir de streptococcus pneumoniae.
US6541616B1 (en) 1998-10-01 2003-04-01 Antex Biologics Inc. Moraxella catarrhalis protein, gene sequence and uses thereof
CA2773698C (en) 1998-10-16 2015-05-19 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Adjuvant systems comprising an immunostimulant adsorbed to a metallic salt particle and vaccines thereof
AU1819400A (en) 1998-11-17 2000-06-05 Schlumberger Technology Corporation Transmitting information over a communication link
WO2000029434A2 (en) 1998-11-19 2000-05-25 St. Jude Children's Research Hospital PNEUMOCOCCAL CHOLINE BINDING PROTEINS, CbpG AND CbpD, DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC USES THEREOF
EP1140157B1 (en) 1998-12-21 2009-02-18 MedImmune, Inc. Streptococcus pneumoniae proteins and immunogenic fragments for vaccines
TR200200633T2 (tr) 1998-12-23 2002-06-21 Shire Biochem Inc. Yeni streptococcus antijenleri
HU228499B1 (en) * 1999-03-19 2013-03-28 Smithkline Beecham Biolog Streptococcus vaccine
CA2365914A1 (en) 1999-04-09 2000-10-19 Techlab, Inc. Recombinant clostridium toxin a protein carrier for polysaccharide conjugate vaccines
US6558670B1 (en) 1999-04-19 2003-05-06 Smithkline Beechman Biologicals S.A. Vaccine adjuvants
PT1187629E (pt) 1999-04-19 2005-02-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicao adjuvante que compreende saponina e um oligonucleotido imunoestimulador
DE60045721D1 (de) 1999-06-10 2011-04-21 Medimmune Inc Streptococcus pneumoniae Proteine und Impfstoffe
US6319224B1 (en) 1999-08-20 2001-11-20 Bioject Medical Technologies Inc. Intradermal injection system for injecting DNA-based injectables into humans
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
US20040191834A1 (en) 1999-10-28 2004-09-30 Laferriere Craig Antony Joseph Novel method
WO2001046127A1 (fr) 1999-12-22 2001-06-28 Om Pharma Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise
FR2806304B1 (fr) 2000-03-17 2002-05-10 Aventis Pasteur Conjugues polysaccharidiques du pneumocoque a usage vaccinal contre le tetanos et la diphterie
GB0007432D0 (en) 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Proteins for use as carriers in conjugate vaccines
NZ553554A (en) 2000-06-20 2008-11-28 Id Biomedical Corp Streptococcus antigens
AP1695A (en) 2000-06-29 2006-12-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Multivalent vaccine composition.
GB0108364D0 (en) * 2001-04-03 2001-05-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine composition
GB0103170D0 (en) 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
WO2002012258A1 (en) 2000-08-04 2002-02-14 Corixa Corporation New immunoeffector compounds
GB0022742D0 (en) 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
ES2298269T3 (es) 2000-09-26 2008-05-16 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulacion de la actividad inmunoestimulante de analogos oligonucleotidicos inmunoestimulantes mediante cambios quimicos posicionales.
WO2002078673A1 (fr) 2001-03-29 2002-10-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Procede de production d'un medicament sous forme de granules fins
US20030035806A1 (en) 2001-05-11 2003-02-20 D'ambra Anello J. Novel meningitis conjugate vaccine
GB0123580D0 (en) 2001-10-01 2001-11-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
GB0130215D0 (en) * 2001-12-18 2002-02-06 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US7262024B2 (en) 2001-12-20 2007-08-28 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
CN1301134C (zh) 2002-02-04 2007-02-21 科里克萨有限公司 新的免疫效应化合物
WO2004015099A2 (en) 2002-08-02 2004-02-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine composition comprising lipooligosaccharide with reduced phase variability
DE602004010376T2 (de) 2003-03-13 2008-10-23 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Verfahren zur reinigung von bakteriellem cytolysin
EP1603950A2 (en) 2003-03-17 2005-12-14 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
GB0408977D0 (en) 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
BRPI0510315A (pt) 2004-04-30 2007-10-16 Chiron Srl integração de vacinação com conjugado meningocócico
NZ551250A (en) 2004-05-11 2010-03-26 Nederlanden Staat Neisseria meningitidis 1gtB LOS as adjuvant
GB0421083D0 (en) 2004-09-22 2004-10-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Purification process
EP2425855A1 (en) * 2005-04-08 2012-03-07 Wyeth LLC Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
PT2351578T (pt) * 2005-06-27 2017-04-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Processo para o fabrico de vacinas
EP2308505A3 (en) * 2005-09-01 2011-11-30 Novartis Vaccines and Diagnostics GmbH Multiple vaccines including serogroup C meningococcus
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
LT3017827T (lt) * 2005-12-22 2019-01-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Pneumokokinė polisacharidinė konjuguota vakcina
GB0607088D0 (en) * 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
KR20100045445A (ko) 2007-06-26 2010-05-03 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 다당류 컨쥬게이트를 포함하는 백신

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109289045A (zh) * 2012-09-19 2019-02-01 国立大学法人大阪大学 含有肺炎球菌表面蛋白a的肺炎球菌疫苗
CN104837504A (zh) * 2012-12-11 2015-08-12 Sk化学公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白结合组合物
CN106102770A (zh) * 2014-01-21 2016-11-09 辉瑞公司 包含缀合荚膜糖抗原的免疫原性组合物及其用途
CN108289938A (zh) * 2015-09-10 2018-07-17 创赏有限公司 多价vlp缀合物
CN108003225A (zh) * 2017-12-11 2018-05-08 北京北生研生物制品有限公司 一种破伤风类毒素的精制方法
CN108524926A (zh) * 2018-06-29 2018-09-14 康希诺生物股份公司 一种多价肺炎球菌结合疫苗的制剂组合及其应用
WO2023025003A1 (zh) * 2021-08-27 2023-03-02 康希诺生物股份公司 一种肺炎球菌结合疫苗制备方法

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