CN102759618A - 用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法 - Google Patents

用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102759618A
CN102759618A CN201210249229XA CN201210249229A CN102759618A CN 102759618 A CN102759618 A CN 102759618A CN 201210249229X A CN201210249229X A CN 201210249229XA CN 201210249229 A CN201210249229 A CN 201210249229A CN 102759618 A CN102759618 A CN 102759618A
Authority
CN
China
Prior art keywords
serum
add
antibody
hib
colour developing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201210249229XA
Other languages
English (en)
Inventor
陈庚
关晓峰
李洪光
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Original Assignee
Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc filed Critical Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Priority to CN201210249229XA priority Critical patent/CN102759618A/zh
Publication of CN102759618A publication Critical patent/CN102759618A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明公开了用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法，它主要包括以下步骤：（Ⅰ）包被，（Ⅱ）加样，（Ⅲ）加酶标抗体，（Ⅳ）加底物显色，（Ⅴ）终止反应，（Ⅵ）比色。本发明的有益效果是：在测定血清中Hib多糖抗体含量时，用牛血清白蛋白来代替人血清白蛋白作为封闭剂，解决了实验中作为封闭剂的用量很大但人血清白蛋白紧缺且价格昂贵的难题，大幅度地降低了成本，且牛血清白蛋白容易获得，有利于该方法的推广；本发明将反应时间改为2～8℃反应16h，可一次检测更多的血清，反应时间更为充分，减少板间差异，有利于提高测定的准确性。

Description

用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法
技术领域
本发明涉及检测血清中Hib多糖抗体含量的方法技术领域，特别是一种用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法。
背景技术
b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b，Hib)是导致5岁以下婴幼儿发生严重疾病的主要原因之一，脑膜炎和肺炎是Hib感染的两种主要疾病，最常见的是脑膜炎，其患儿的死亡率是5％。避免婴幼儿患病的有效方法是及早免疫预防，目前使用的疫苗是多糖蛋白结合疫苗。
目前，在测定血清中Hib多糖抗体含量时，通常采用人血清白蛋白作为封闭剂，但因人血清白蛋白紧缺且价格昂贵，实验中作为封闭剂的用量很大，给b型流感嗜血杆菌的临床血清测定带来很大困难。另外，由于ELISA方法非常敏感，即使是同一份血清，在不同的酶标板或在不同的时间内完成，其测定值也会有很大差异，由于临床血清样本量很大，现有的血清反应时间为37℃1.5h，这就对加样时间有很严格的要求，且很难在较短时间内处理较多的血清样本。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种节约成本且能处理更多样品的用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法，它主要包括以下步骤：
（Ⅰ）包被：用pH 9.0～9.6的碳酸盐缓冲液将b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的酪胺化衍生物（PRP-Ty）稀释后，以100μl/孔的包被量加入微孔板中，2～8℃过夜，次日洗涤6～8次后，用牛血清白蛋白37℃封闭2～3h；
（Ⅱ）加样：加入稀释好的待测血清及标准血清用保鲜膜封板至2～8℃，16h后洗涤6～8次；
（Ⅲ）加酶标抗体：加入辣根过氧化物酶标抗体IgG，在37℃培养箱中孵育1～2h后洗涤6～8次；
（Ⅳ）加底物显色：于各反应孔中加入邻苯二胺（OPD）底物显色，37℃避光显色20～30min；
（Ⅴ）终止反应：加入2M硫酸终止反应；
（Ⅵ）比色：测定492nm的A值，用线性回归的方法绘制标准曲线后求得待测血清的抗体值。
本发明具有以下优点：本发明公开了一种用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法，在测定血清中Hib多糖抗体含量时，用牛血清白蛋白来代替人血清白蛋白作为封闭剂，解决了实验中作为封闭剂的用量很大但人血清白蛋白紧缺且价格昂贵的难题，大幅度地降低了成本，且牛血清白蛋白容易获得，有利于该方法的推广。
本发明将反应时间改为2～8℃反应16h，可一次检测更多的血清，反应时间更为充分，减少板间差异，有利于提高测定的准确性。因此本发明达到了节约成本和处理更多样品的目的。
具体实施方式
下面结合对比试验及实施例对本发明做进一步的描述：
对比试验1：
反应参数改为37℃，1.5h，采用牛血清白蛋白，用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法，它主要包括以下步骤：
（Ⅰ）包被：用pH 9.5的碳酸盐缓冲液将b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的酪胺化衍生物（PRP-Ty）稀释后，以100μl/孔的包被量加入微孔板中，2～8℃过夜，次日洗涤7次后，用牛血清白蛋白37℃封闭2h；
（Ⅱ）加样：加入稀释好的待测血清及标准血清用保鲜膜封板至37℃，1.5h后洗涤7次；
（Ⅲ）加酶标抗体：加入辣根过氧化物酶标抗体IgG，在37℃培养箱中孵育1h后洗涤7次；
（Ⅳ）加底物显色：于各反应孔中加入邻苯二胺（OPD）底物显色，37℃避光显色20min；
（Ⅴ）终止反应：加入2M硫酸终止反应；
（Ⅵ）比色：测定492nm的A值（吸光度），用线性回归的方法绘制标准曲线后求得待测血清的抗体值。
用七份不同血清，每份血清均测定三次，求其平均值，用t检验统计其是否具有显著性差异，实验结果如表1所示。
对比试验2：
反应参数改为37℃，1.5h，采用人血清白蛋白，用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法，它主要包括以下步骤：
（Ⅰ）包被：用pH 9.5的碳酸盐缓冲液将b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的酪胺化衍生物（PRP-Ty）稀释后，以100μl/孔的包被量加入微孔板中，2～8℃过夜，次日洗涤7次后，用人血清白蛋白37℃封闭2h；
（Ⅱ）加样：加入稀释好的待测血清及标准血清用保鲜膜封板至37℃，1.5h后洗涤7次；
（Ⅲ）加酶标抗体：加入辣根过氧化物酶标抗体IgG，在37℃培养箱中孵育1h后洗涤7次；
（Ⅳ）加底物显色：于各反应孔中加入邻苯二胺（OPD）底物显色，37℃避光显色20min；
（Ⅴ）终止反应：加入2M硫酸终止反应；
（Ⅵ）比色：测定492nm的A值（吸光度），用线性回归的方法绘制标准曲线后求得待测血清的抗体值。
用七份不同血清，每份血清均测定三次，求其平均值，用t检验统计其是否具有显著性差异，实验结果如表1所示。
对比试验3：
反应参数改为37℃，1.5h，采用牛血清白蛋白，用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法，它主要包括以下步骤：
（Ⅰ）包被：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的酪胺化衍生物（PRP-Ty）稀释后，以100μl/孔的包被量加入微孔板中，2～8℃过夜，次日洗涤8次后，用牛血清白蛋白37℃封闭3h；
（Ⅱ）加样：加入稀释好的待测血清及标准血清用保鲜膜封板至37℃，1.5h后洗涤8次；
（Ⅲ）加酶标抗体：加入辣根过氧化物酶标抗体IgG，在37℃培养箱中孵育2h后洗涤8次；
（Ⅳ）加底物显色：于各反应孔中加入邻苯二胺（OPD）底物显色，37℃避光显色30min；
（Ⅴ）终止反应：加入2M硫酸终止反应；
（Ⅵ）比色：测定492nm的A值（吸光度），用线性回归的方法绘制标准曲线后求得待测血清的抗体值。
用七份不同血清，每份血清均测定三次，求其平均值，用t检验统计其是否具有显著性差异，实验结果如表1所示。
对比试验4：
用七份不同血清分别采用本发明所述的用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法检测，其具体检测实施例如下所述：
实施例1：
用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法，它主要包括以下步骤：
（Ⅰ）包被：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的酪胺化衍生物（PRP-Ty）稀释后，以100μl/孔的包被量加入微孔板中，2～8℃过夜，次日洗涤8次后，用牛血清白蛋白37℃封闭3h；
（Ⅱ）加样：加入稀释好的待测血清及标准血清用保鲜膜封板至2～8℃，16h后洗涤8次；
（Ⅲ）加酶标抗体：加入辣根过氧化物酶标抗体IgG，在37℃培养箱中孵育2h后洗涤8次；
（Ⅳ）加底物显色：于各反应孔中加入邻苯二胺（OPD）底物显色，37℃避光显色30min；
（Ⅴ）终止反应：加入2M硫酸终止反应；
（Ⅵ）比色：测定492nm的A值（吸光度），用线性回归的方法绘制标准曲线后求得待测血清的抗体值。
实施例2：
用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法，它主要包括以下步骤：
（Ⅰ）包被：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的酪胺化衍生物（PRP-Ty）稀释后，以100μl/孔的包被量加入微孔板中，2～8℃过夜，次日洗涤7次后，用牛血清白蛋白37℃封闭2.5h；
（Ⅱ）加样：加入稀释好的待测血清及标准血清用保鲜膜封板至2～8℃，16h后洗涤7次；
（Ⅲ）加酶标抗体：加入辣根过氧化物酶标抗体IgG，在37℃培养箱中孵育1.5h后洗涤7次；
（Ⅳ）加底物显色：于各反应孔中加入邻苯二胺（OPD）底物显色，37℃避光显色25min；
（Ⅴ）终止反应：加入2M硫酸终止反应；
（Ⅵ）比色：测定492nm的A值（吸光度），用线性回归的方法绘制标准曲线后求得待测血清的抗体值。
实施例3：
用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法，它主要包括以下步骤：
（Ⅰ）包被：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的酪胺化衍生物（PRP-Ty）稀释后，以100μl/孔的包被量加入微孔板中，2～8℃过夜，次日洗涤6次后，用牛血清白蛋白37℃封闭2h；
（Ⅱ）加样：加入稀释好的待测血清及标准血清用保鲜膜封板至2～8℃，16h后洗涤6次；
（Ⅲ）加酶标抗体：加入辣根过氧化物酶标抗体IgG，在37℃培养箱中孵育1h后洗涤6次；
（Ⅳ）加底物显色：于各反应孔中加入邻苯二胺（OPD）底物显色，37℃避光显色20min；
（Ⅴ）终止反应：加入2M硫酸终止反应；
（Ⅵ）比色：测定492nm的A值（吸光度），用线性回归的方法绘制标准曲线后求得待测血清的抗体值。
用七份不同血清，第1～2份血清采用实施例1所述的方法，第3～4份血清采用实施例2所述的方法，第5～7份血清采用实施例3所述的方法，每份血清均测定三次，求其平均值，用t检验统计其是否具有显著性差异，实验结果如表1所示。
表17份血清不同封闭液及反应时间和温度结果比较
经计算并查表得：t=0.096<t(0.05,6)不同封闭液P>0.05，两组抗体值之间无显著性差异。经计算并查表得：t=0.082<t(0.05,6)不同反应时间和温度P>0.05，两组抗体值之间无显著性差异。

Claims (1)

1.用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法，其特征在于：它主要包括以下步骤：
（Ⅰ）包被：用pH 9.0～9.6的碳酸盐缓冲液将b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的酪胺化衍生物（PRP-Ty）稀释后，以100μl/孔的包被量加入微孔板中，2～8℃     过夜，次日洗涤6～8次后，用牛血清白蛋白37℃封闭2～3h；
（Ⅱ）加样：加入稀释好的待测血清及标准血清用保鲜膜封板至2～8℃ ，16 h后洗涤6～8次；
（Ⅲ）加酶标抗体：加入辣根过氧化物酶标抗体IgG，在 37℃培养箱中孵育1～2 h后洗涤6～8次；
（Ⅳ）加底物显色：于各反应孔中加入邻苯二胺（OPD）底物显色，37℃避光显色20～30min；
（Ⅴ）终止反应：加入2M硫酸终止反应；
（Ⅵ）比色：测定492nm的A 值，用线性回归的方法绘制标准曲线后求得待测血清的抗体值。
CN201210249229XA 2012-07-18 2012-07-18 用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法 Pending CN102759618A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210249229XA CN102759618A (zh) 2012-07-18 2012-07-18 用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210249229XA CN102759618A (zh) 2012-07-18 2012-07-18 用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102759618A true CN102759618A (zh) 2012-10-31

Family

ID=47054136

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210249229XA Pending CN102759618A (zh) 2012-07-18 2012-07-18 用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102759618A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104181301A (zh) * 2014-08-18 2014-12-03 湖北工业大学 基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检的方法和试剂盒
CN112129946A (zh) * 2020-08-16 2020-12-25 陆修委 无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1601381A2 (en) * 2003-03-07 2005-12-07 Wyeth Holdings Corporation Polysaccharide - staphylococcal surface adhesin carrier protein conjugates for immunization against nosocomial infections
CN101883583A (zh) * 2007-06-26 2010-11-10 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 含有肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的疫苗

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1601381A2 (en) * 2003-03-07 2005-12-07 Wyeth Holdings Corporation Polysaccharide - staphylococcal surface adhesin carrier protein conjugates for immunization against nosocomial infections
CN101883583A (zh) * 2007-06-26 2010-11-10 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 含有肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的疫苗

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
侯亚莉等: "人血清中Hib荚膜多糖抗体定量的ELISA方法建立及初步验证", 《微生物学免疫学进展》, vol. 40, no. 3, 20 June 2012 (2012-06-20), pages 34 - 38 *
李红等: "b型流感嗜血杆菌总抗体ELISA定量检测方法的建立", 《中国生物制品学杂志》, vol. 24, no. 8, 20 August 2011 (2011-08-20), pages 974 - 976 *
李红等: "ELISA方法测定血清中Hib多糖抗体含量的条件比较研究", 《微生物学免疫学进展》, vol. 37, no. 1, 15 February 2009 (2009-02-15), pages 36 - 38 *
李红等: "定量测定血清中Hib总抗体ELISA方法的建立", 《2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集》, 1 November 2010 (2010-11-01), pages 7398 - 7403 *
祝婧烨等: "b型流感嗜血杆菌多糖ELISA检测方法的建立", 《中国生物制品学杂志》, vol. 24, no. 11, 20 November 2011 (2011-11-20), pages 1360 - 1362 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104181301A (zh) * 2014-08-18 2014-12-03 湖北工业大学 基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检的方法和试剂盒
CN104181301B (zh) * 2014-08-18 2016-01-06 湖北工业大学 基于磁性分离和多色量子点标记的抗人流感嗜血杆菌IgM、IgG抗体快速共检的方法和试剂盒
CN112129946A (zh) * 2020-08-16 2020-12-25 陆修委 无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101949944B (zh) 三碘甲状腺原氨酸定量检测试剂盒
CN103217414B (zh) 血清中3,5,3’-三碘甲腺原氨酸的化学发光免疫测定方法
CN103901034B (zh) 一种检测尿液中微量白蛋白的检测试剂条及其制备方法
CN101256188A (zh) 检测林可霉素药物的酶联免疫试剂盒及其应用
CN101949942A (zh) 游离三碘甲状腺原氨酸定量检测试剂盒及其制备方法
CN101949943A (zh) 促甲状腺激素定量检测试剂盒及其制备方法
CN201654036U (zh) Mpo奶牛隐性乳房炎检测试剂盒
CN103293299A (zh) 拓宽双抗体夹心免疫检测浓度范围的方法及其试剂盒
CN102759618A (zh) 用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法
CN105759055A (zh) P1np检测试剂盒及其制备方法
CN103901199A (zh) 一种用于检测塑化剂(dbp)的elisa试剂盒的制备
CN101566632A (zh) 耐热菌的elisa快速检测方法
CN101666802A (zh) 定量检测金黄色葡萄球菌肠毒素b的胶体金免疫层析方法以及胶体金免疫检测试纸条
CN102928417A (zh) 检测磺胺类药物的磁颗粒化学发光试剂盒及其应用
Indyk et al. Biotin content of paediatric formulae, early lactation milk and seasonal bovine milk powders by biosensor immunoassay
CN202614763U (zh) 一种莱克多巴胺的免疫学检测试剂盒
CN103575914A (zh) 检测维生素b12的酶联免疫试剂盒及其应用
CN202614766U (zh) 一种黄曲霉毒素b1的免疫学检测试剂盒
CN109254145B (zh) 用于改善新鲜血清和第三方质控之间基质效应的稀释液
CN203178285U (zh) 赛庚啶残留快速检测试纸条
CN102680713A (zh) 竞争法胶乳颗粒增强免疫比浊c肽检测试剂盒及制备方法
CN103383354B (zh) 一种检测肠毒素sea的磁微粒化学发光试剂盒的检测方法
CN102809657B (zh) 食物不耐受血清特异性IgG检测试剂盒及其制备方法
CN102650640A (zh) 流感疫苗中的过敏原卵类粘蛋白或卵运铁蛋白定量检测
CN105301245A (zh) 一种用于检测盐酸赛庚啶的酶联免疫试剂盒的制备

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20121031