BRPI0813644B1 - Composição imunogênica, vacina, processo para fabricar a mesma, e, uso da composição imunogênica ou vacina - Google Patents

Composição imunogênica, vacina, processo para fabricar a mesma, e, uso da composição imunogênica ou vacina Download PDF

Info

Publication number
BRPI0813644B1
BRPI0813644B1 BRPI0813644-0A BRPI0813644A BRPI0813644B1 BR PI0813644 B1 BRPI0813644 B1 BR PI0813644B1 BR PI0813644 A BRPI0813644 A BR PI0813644A BR PI0813644 B1 BRPI0813644 B1 BR PI0813644B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
protein
conjugated
saccharide
vaccine
immunogenic composition
Prior art date
Application number
BRPI0813644-0A
Other languages
English (en)
Inventor
Ralph Leon Biemans
Philippe Vincent Hermand
Jan Poolman
Original Assignee
Glaxosmithkline Biologicals S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0712420A external-priority patent/GB0712420D0/en
Priority claimed from GB0712435A external-priority patent/GB0712435D0/en
Priority claimed from GB0712428A external-priority patent/GB0712428D0/en
Application filed by Glaxosmithkline Biologicals S.A. filed Critical Glaxosmithkline Biologicals S.A.
Publication of BRPI0813644A2 publication Critical patent/BRPI0813644A2/pt
Publication of BRPI0813644B1 publication Critical patent/BRPI0813644B1/pt
Publication of BRPI0813644B8 publication Critical patent/BRPI0813644B8/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/116—Polyvalent bacterial antigens

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

composição imunogênica, vacina, processo para fabricar a mesma, e, uso da composição imunogênica ou vacina a presente invenção está no campo de vacinas capsulares de sacarídeo conjugado pneumocócico. especificamente, uma composição imunogênica de streptococcus. pneumoniae multivalente é fornecida com vários sacarídeos conjugados capsulares de sorotipos de s. pneumoniae diferentes conjugado a 2 ou mais proteínas carreadoras diferentes, onde a composição compreende sacarídeo capsular do sorotipo 19f conjugado ao toxóide da difteria (dt) ou crm197, opcionalmente em que 19f é o único sacarídeo na composição conjugada ao toxóide da difteria (dt) ou crm197.

Description

“COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, VACINA, PROCESSO PARA FABRICAR A MESMA, E, USO DA COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA OU VACINA” Campo da invenção A presente invenção diz respeito a uma vacina contra Streptococcus pneumonia melhorada.
Fundamentos da invenção Crianças menores do que 2 anos de idade não montam uma resposta imune para a maioria das vacinas de polissacarídeo, assim tem sido necessário tomar os polissacarídeos imunogênicos pela conjugação química a um carreador de proteína. Ligar o polissacarídeo, um antígeno independente de T, a uma proteína, um antígeno dependente de T, confere ao polissacarídeo as propriedades de dependência de T incluindo a comutação de isótipo, maturação de afinidade e indução de memória.
Entretanto, pode haver problemas com a administração repetida de conjugados de polissacarídeo-proteína ou a combinação de conjugados de polissacarídeo-proteína para formar vacinas multivalentes. Por exemplo, foi relatado que uma vacina de polissacarídeo (PRP) tipo b de Haemophilus influenzae usando toxóide do tétano (TT) como o carreador de proteína foi testada em uma faixa de dosagem com imunização simultânea com TT (livre) e uma vacina conjugada de polissacarídeo pneumocócico-TT seguindo um programa infantil padrão. Como a dosagem da vacina pneumocócica foi aumentada, a resposta imune à porção de polissacarídeo de PRP da vacina conjugada com Hib foi diminuída, indicando interferência imune do polissacarídeo, possivelmente por intermédio do uso do mesmo carreador de proteína (Dagan et al., Infect Immun. (1998); 66:2093-2098). O efeito da dosagem de carreador-proteína sobre a resposta humoral com a própria proteína também tem mostrado ser multifacetada. Em crianças humanas foi relatado que aumentar a dosagem de um conjugado do toxóide do tétano tetravalente resultou em uma resposta diminuída ao carreador de tétano (Dagan et al. supra). A análise clássica destes efeitos de vacinas de combinação foi descrita como supressão epitópica induzida por carreador, que não é totalmente entendida, mas acreditada resultar de uma quantidade em excesso de carreador de proteína (Fattom, Vaccine 17:126 (1999)). Isto parece resultar na competição para as células Th, pelas células B com o carreador de proteína e as células B para o polissacarídeo. Se as células B com o carreador de proteína predominam, não existe células Th suficientes disponíveis para fornecer a ajuda necessária para as células B específicas do polissacarídeo. Entretanto, os efeitos imunológicos observados foram incompatíveis, com a quantidade total de carreador de proteína em alguns casos aumentando a resposta imune e em outros casos diminuindo a resposta imune.
Consequentemente permanecem dificuldades técnicas na combinação de conjugados de polissacarídeo múltiplos em uma formulação de vacina única, eficaz.
Streptococcus. pneumoniae é uma bactéria Gram positiva responsável por morbidez e mortalidade consideráveis (particularmente no jovem e no idoso), causando doenças invasivas tais como pneumonia, bacteremia e meningite e doenças associadas com a colonização, tais como Otite média aguda. A taxa de pneumonia pneumocócica nos US para pessoas acima de 60 anos de idade é estimadas ser de 3 a 8 por 100.000. Em 20% dos casos isto leva à bacteremia e outras manifestações tais como meningite, com uma taxa de mortalidade próxima aos 30% mesmo com tratamento antibiótico. O pneumococo é encapsulado com um polissacarídeo quimicamente ligado que confere especificidade de sorotipo. Existem 90 sorotipos conhecidos de pneumococos e a cápsula é o componente determinante da virulência para os pneumococos, visto que a cápsula não apenas protege a superfície interna das bactérias de complemento, mas é ela própria deficientemente imunogênica. Os polissacarídeos são antígenos independentes de T e podem não ser processados ou apresentados nas moléculas MHC para interagir com as células T. Eles podem entretanto, estimular o sistema imune através de um mecanismo alternativo que envolve a reticulação de receptores de superfície nas células B.
Foi mostrado em vários experimentos que a proteção contra a doença pneumocócica invasiva está correlacionada mais fortemente com anticorpo específico para a cápsula e a proteção é específica de sorotipo.
Streptococcus. pneumoniae é a causa mais comum de doença bacteriana invasiva e Otite média em bebês e crianças jovens. Do mesmo modo, o idoso monta respostas deficientes para as vacinas pneumocócicas [Roghmann et al., (1987), J. Gerontol. 42:265-270], consequentemente a incidência aumentada de pneumonia bacteriana nesta população [Verghese e Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62:271-285].
As síndromes clínicas principais causadas pela S. pneumoniae são amplamente reconhecidas e debatidas em todos os livros textos médicos padrão (Fedson DS, Muscher DM. Em: Plotkin SA, Orenstein WA, editores. Vaccines. 4a edição. PhiladelphiaWB Saunders Co, 2004a:529588). Por exemplo, a doença pneumocócica invasiva (IPD) é definida como qualquer infecção em que a S. pneumoniae é isolada do sangue ou um outro sítio normalmente estéril (Musher DM. Streptococcus. pneumoniae. Em Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (eds). Principies and Practice of Infectious Diseases (5a ed). Nova Iorque, Churchill Livingstone, 2001, p21282147). A doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) é reconhecida como abrangendo diversas condições (obstrução do fluxo de ar, bronquite crônica, bronquiolite ou doença das vias aéreas pequenas e enfisema) que frequentemente coexistem. Os pacientes sofrem exacerbações da sua condição que são usualmente associadas com dispnéia aumentada e frequentemente têm tosse aumentada que pode ser produtiva de muco ou catarro purulento (Wilson, Eur Respir J 2001 17: 995-1007). COPD é definido fisiologicamente pela presença de obstrução das vias aéreas irreversível ou parcialmente reversível em pacientes com bronquite crônica e/ou enfisema (Standards for the diagnosis and care of patients with chronic obstructive pulmonary disease. American Thoracic Society. Am J Respir Crit Care Med. Nov de 1995; 152(5 Pt 2):577-121). As exacerbações da COPD são frequentemente causadas pela infecção bacteriana (por exemplo pneumocócica) (Sethi S, Murphy TF. Bacterial infection in chronic obstructive pulmonary disease in 2000: a state-of-the-art review. Clin Microbiol Rev. Abril de 2001; 14(2): 336-63). É assim um objetivo da presente invenção desenvolver uma formulação melhorada de uma vacina de conjugado de polissacarídeo de Streptococcus. pneumoniae de sorotipo múltiplo.
Descrição Resumida das Figuras Figura 1 Imunogenicidade de conjugado em macacos Rhesus idosos (níveis de IgG anti-PS pós-II) Diagrama de barras mostrando imunogenicidade de conjugado 11 valente em macacos Rhesus idosos. As barras mais claras representam a GMC depois de duas inoculações com conjugado 11 valente em adjuvante de fosfato de alumínio. As barras mais escuras representam a GMC depois de duas inoculações com conjugado 11 valente em adjuvante C.
Figura 2 Imunogenicidade de conjugado em macacos Rhesus idosos (frequências de célula B de memória pós-Π anti-PS3) Diagrama de barras mostrando as células B de memória para PS3 depois da inoculação com o conjugado 11 valente em adjuvante C ou adjuvante de fosfato de alumínio.
Figura 3 Imunogenicidade de PS19F em camundongos Balb/c (níveis de IgG pós-III) Diagrama de barras mostrando a imunogenicidade anti polissacarídeo 19F em camundongos Balb/C para os polissacarídeos 4-valentes puros e os conjugados de dPly 4-valentes.
Figura 4 Imunogenicidade de PS22F em camundongos Balb/C (níveis de IgG pós-ΠΙ) Diagrama de barras mostrando imunogenicidade anti polissacarídeo 22F em camundongos Balb/C para os polissacarídeos puros 4-valentes e os conjugados PhtD 4-valente.
Figura 5 Níveis de anticorpo IgG anti-PS Diagrama de barras mostrando a resposta de IgG anti-22F em camundongos Balb/C
Figura 6 Títulos de opsono-fagocitose anti-22F em camundongos Balb/C Diagrama de barras mostrando títulos de opsono-fagocitose anti-22F em camundongos Balb/C.
Figura 7 Comparação de respostas de IgG induzidas em imunizações pós-ΙΠ em camundongos C57BI jovens com os novos adjuvantes ou A1PO4 Diagrama de barras comparando respostas de IgG induzidas em camundongos C57B1 jovens depois da imunização com vacina conjugada 13 Valente formulada em adjuvantes diferentes. As barras estão na mesma ordem indicada na coluna à direita.
Figura 8 Eficácia protetora da combinação de proteínas PhtD e dPly contra a colonização pulmonar tipo 19F em macacos Rhesus Diagrama de barras mostrando a eficácia protetora de combinações de vacina diferentes em um modelo de pneumonia de macaco. A categoria “morto” inclui macacos que poderiam ter morrido se não a administração de tratamento antibiótico.
Figura 9 Resposta de IgG anti-PhtD sérica Diagrama de barras mostrando respostas de IgG anti PhtD em camundongos Balb/C depois da imunização com conjugados 22F-PhtD ou 22F-AH-PhtD.
Figura 10 Proteção contra a inoculação pneumocócica tipo 4 em camundongos Proteção contra a inoculação pneumocócica tipo 4 em camundongos depois da imunização com 22F-PhtD ou 22FAH-PhtD.
Figura 11 Proteção contra a inoculação letal com a cepa 3/43 de S. pneumoniae a seguir da imunização com PhtD e imunização passiva com anticorpos contra polissacarídeo sorotipo 3.
Figura 12 Proteção contra a inoculação letal com a cepa 1/57 de S. pneumoniae seguindo a imunização com PhtD e imunização passiva com anticorpos contra polissacarídeo sorotipo 1.
Descrição da invenção A presente invenção fornece uma vacina melhorada contra a Streptococcus. pneumoniae que compreende 10 ou mais (por exemplo 11, 12, 13, 14 ou 15 ou mais) sacarídeos capsulares de sorotipos de & pneumoniae diferentes conjugados a 2 ou mais proteínas carreadoras, em que a vacina compreende sacarídeo capsular do sorotipo 19F conjugado ao toxóide da difteria ou CRM197 e 2 a 8 sacarídeos capsulares da S. pneumoniae selecionados de sorotipos diferentes conjugados à proteína D.
Para os propósitos desta invenção, “imunizar um hospedeiro humano contra exacerbações da COPD” ou “tratamento ou prevenção das exacerbações da COPD” ou “redução na severidade das exacerbações da COPD” referem-se a uma redução na incidência ou taxa de exacerbações de COPD (por exemplo uma redução na taxa de 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20 % ou mais) ou uma redução na severidade das exacerbações de COPD como definido acima, por exemplo dentro de um grupo de pacientes imunizados com as composições ou vacinas da invenção.
Tipicamente a vacina contra a Streptococcus. pneumoniae da presente invenção compreenderá antígenos de sacarídeo capsular (preferivelmente conjugado), em que os sacarídeos são derivados de pelo menos dez sorotipos de S. pneumoniae. O número de sacarídeos capsulares da S. pneumoniae pode variar de 10 sorotipos diferentes (ou “v”, valências) a 23 sorotipos diferentes (23v). Em uma forma de realização existem 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 sorotipos diferentes. Em uma outra forma de realização da invenção, a vacina pode compreender sacarídeos de S. pneumoniae conjugados e sacarídeos de S. pneumoniae não conjugados. Preferivelmente, o número total de sorotipos de sacarídeo é menor do que ou igual a 23. Por exemplo, a invenção pode compreender 10 sorotipos conjugados e 13 sacarídeos não conjugados. Em um maneira similar, a vacina pode compreender 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 sacarídeos conjugados e 12, 11, 10, 9, 8 ou 7, respectivamente, sacarídeos não conjugados. O termo “selecionado de sorotipos diferentes” significa que os sacarídeos capsulares conjugados à proteína D são dos sorotipos de ó’. pneumoniae outros que não 19F. A composição imunogênica da invenção contém 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 3-5, 4-5, 2-4, 23, 3-4 ou 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 conjugados de sacarídeo capsular em que proteína D é o carreador de proteína. Por exemplo, sacarídeo do sorotipo 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F ou 23F é conjugado à proteína D. Por exemplo, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 3-5, 4-5, 2-4, 2-3, 3-4 ou 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 sacarídeos selecionados dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F e 23F são conjugados à proteína D.
Em uma forma de realização, sacarídeos pelo menos dos sorotipos 1 e 3, 1 e 4, 1 e 5, 1 e 6A, 1 e 6B, 1 e 7, 1 e 9V, 1 e 14, 1 e 22F, 1 e 23F, 3 e 4, 3 e 5, 3 e 6A, 3 e 6B, 3 e 7F, 3 e 9V, 3 e 14, 3 e 22F, 3 e 23F, 4 e 5, 4 e 6A, 4 e 6B, 4 e 7F, 4 e 9V, 4 e 14, 4 e 22F, 4 e 23F, 5 e 6A, 5 e 6B, 5 e 7F, 5 e 9V, 5 e 14, 5 e 22F, 5 e 23F, 6A e 6B, 6A e 7F, 6A e 9V, 6A e 14, 6A e 22F, 6A e 23F, 6B e 7F, 6B e 9V, 6B e 14, 6B e 22F, 6B e 23F, 7F e 9V, 7F e 14, 7F e 22F, 7F e 23F, 9V e 14, 9V e 22F, 9V e 23F, 14 e 22F, 14 e 23F ou 22F e 23F são conjugados à proteína D.
Em uma forma de realização, sacarídeos de pelo menos sorotipos 1, 3 e 4; 1, 3 e 5; 1, 3 e 6A; 1, 3 e 6B; 1, 3 e 7F; 1, 3 e 9V; 1, 3 e 14; 3, 4 e 7F; 3, 4 e 5; 3, 4 e 7F; 3, 4 e 9V; 3, 4 e 14; 4, 5 e 7F; 4, 5 e 9V; 4, 5 e 14; 5, 7F e 9V; 5, 7F e 14; 7F, 9V e 14; 1, 3, 4 e 5; 3, 4, 5 e 7F; 4, 5, 7F e 9V; 4, 5, 7F e 14; 4, 5, 9V e 14; 4, 7F, 9V e 14; 5, 7F, 9V e 14; ou 4, 5, 7F, 9V e 14 são conjugados à proteína D.
Em uma forma de realização, metade ou uma minoria dos conjugados de sacarídeo capsular presentes na composição imunogênica da invenção contêm proteína D como carreador de proteína. Por exemplo, em uma vacina contra a S. pneumoniae 10 valente, 2, 3, 4 ou 5 dos sacarídeos capsulares de sorotipos diferentes são conjugados à proteína D. Por exemplo, em uma vacina contra a S. pneumoniae 11 valente, 2, 3, 4 ou 5 dos sacarídeos capsulares de sorotipos diferentes são conjugados à proteína D. Por exemplo, em uma vacina contra a S. pneumoniae 12 valente, 2, 3, 4, 5 ou 6 dos sacarídeos capsulares de sorotipos diferentes são conjugados à proteína D. Por exemplo, em uma vacina contra a S. pneumoniae 13 valente, 2, 3, 4, 5 ou 6 dos sacarídeos capsulares de sorotipos diferentes são conjugados à proteína D. Por exemplo, em uma vacina contra a S. pneumoniae 14 valente, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dos sacarídeos capsulares de sorotipos diferentes são conjugados à proteína D. Por exemplo, em uma vacina contra a S. pneumoniae 15 valente, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dos sacarídeos capsulares de sorotipos diferentes são conjugados à proteína D. Por exemplo, em uma vacina contra a 5. pneumoniae 16 valente, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 dos sacarídeos capsulares de sorotipos diferentes são conjugados à proteína D. Por exemplo, em uma vacina contra a 5. pneumoniae 17 valente, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 dos sacarídeos capsulares de sorotipos diferentes são conjugados à proteína D. Por exemplo, em uma vacina contra a £. pneumoniae 18 valente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 dos sacarídeos capsulares de sorotipos diferentes são conjugados à proteína D. Por exemplo, em uma vacina contra a S. pneumoniae 19 valente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 dos sacarídeos capsulares de sorotipos diferentes são conjugados à proteína D. Opcionalmente, os sorotipos conjugados à proteína D são selecionados dos grupos descritos acima.
Em uma forma de realização a vacina pneumocócica multivalente da invenção será selecionada dos seguintes sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6Β, 7F, 8, 9Ν, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F, embora seja avaliado que um ou dois outros sorotipos podem ser substituídos dependendo da idade do receptor que recebe a vacina e da localização geográfica onde a vacina será administrada, por exemplo o sorotipo 6A pode ser incluído na lista. Por exemplo, uma vacina 10-valente pode compreender os polissacarídeos dos sorotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F. Uma vacina 11-valente também pode incluir sacarídeos do sorotipo 3. Uma vacina pediátrica (infantil) 12 ou 13-valente também pode incluir a formulação 10 ou 11 valente suplementada com sorotipos 6A e 19A ou 6A e 22F ou 19A e 22F ou 6A e 15 ou 19A e 15 ou 22F e 15, ao passo que uma vacina de idoso 13-valente pode incluir a formulação 11 valente suplementada com os sorotipos 19A e 22F, 8 e 12Fou8el5ou8e 19A ou 8 e 22F ou 12F e 15 ou 12F e 19A ou 12F e 22F ou 15 e 19A ou 15 e 22F. Uma vacina pediátrica 14 valente pode incluir a formulação 10 valente descrita acima suplementada com os sorotipos 3, 6A, 19A e 22F; sorotipos 6A, 8, 19A e 22F; sorotipos 6A, 12F, 19A e 22F; sorotipos 6A, 15, 19A e 22F; sorotipos 3, 8, 19A e 22F; sorotipos 3, 12F, 19A e 22F; sorotipos 3, 15, 19A e 22F; sorotipos 3, 6A, 8 e 22F; sorotipos 3, 6A, 12F e 22F; ou sorotipos 3, 6A, 15 e 22F. A composição em uma forma de realização inclui sacarídeos capsulares derivados de sorotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F (opcionalmente conjugados). Em uma outra forma de realização da invenção pelo menos 11 antígenos de sacarídeo (opcionalmente conjugados) são incluídos, por exemplos sacarídeos capsulares derivados de sorotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F. Em uma outra forma de realização da invenção, pelo menos 12 ou 13 antígenos de sacarídeo são incluídos, por exemplo uma vacina pode compreender sacarídeos capsulares derivados de sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F ou sacarídeos capsulares derivados de sorotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F e 23F, embora outros antígenos de sacarídeo, por exemplo 23 valente (tais como sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F), também sejam considerados pela invenção. A composição imunogênica da presente invenção compreende proteína D (PD) de Haemophilus influenzae (ver por exemplo a EP 0594610 Fig 9). Haemophilus influenzae é um organismo causativo chave da otite média e os presentes inventores têm mostrado que a inclusão desta proteína em uma vacina contra a Streptococcus. pneumoniae fornecerá um nível de proteção contra otite média relacionada com a Haemophilus influenzae (Pirmula et al Lancet 367; 740-748 (2006)). Em um aspecto, a PD está presente como um carreador de proteína para um ou mais dos sacarídeos. Em um outro aspecto, a proteína D pode estar presente na composição de vacina como uma proteína livre. Em um outro aspecto, a proteína D está presente tanto como um carreador de proteína quanto como proteína livre. A Proteína D pode ser usada como uma proteína de tamanho natural ou como um fragmento (W00056360). Em um outro aspecto, a proteína D está presente como um carreador de proteína para a maioria dos sacarídeos, por exemplo 6, 7, 8, 9 ou mais dos sacarídeos podem estar conjugados à proteína D. Neste aspecto, a proteína D também pode estar presente como proteína livre. A vacina da presente invenção compreende dois ou mais tipos diferentes de carreador de proteína. Cada tipo de carreador de proteína pode atuar como carreador para mais do que um sacarídeo, sacarídeos estes que podem ser os mesmos ou diferentes. Por exemplo, os sorotipos 3 e 4 podem estar conjugados ao mesmo carreador de proteína, à mesma molécula de carreador de proteína ou a moléculas diferentes do mesmo carreador de proteína. Em uma forma de realização, dois ou mais sacarídeos diferentes podem estar conjugados ao mesmo carreador de proteína, à mesma molécula de proteína carreadora ou a moléculas diferentes da mesma proteína carreadora.
Cada sacarídeo de Streptococcus. pneumoniae capsular pode estar conjugado a uma proteína carreadora independentemente selecionada do grupo que consiste de TT, DT, CRM197, fragmento C de TT, PhtD, fusões PhtDE (particularmente aquelas descritas na WO 01/98334 e WO 03/54007), pneumolisina destoxificada e proteína D, outro sacarídeo do sorotipo 19F que é sempre conjugado a DT ou CRM 197, preferivelmente DT. Uma lista mais completa de carreadores de proteína que podem ser usados nos conjugados da invenção é apresentada abaixo.
Se o carreador de proteína é o mesmo para 2 ou mais sacarídeos na composição, os sacarídeos podem ser conjugados à mesma molécula do carreador de proteína (moléculas carreadoras tendo 2 ou mais sacarídeos diferentes conjugados a ela) [ver por exemplo WO 04/083251]. Alternativamente os sacarídeos podem cada um ser separadamente conjugado a moléculas diferentes do carreador de proteína (cada molécula de carreador de proteína tendo apenas um tipo de sacarídeo conjugado a ele).
A proteína carreadora conjugada a um ou mais dos sacarídeos capsulares da S. pneumoniae nos conjugados presentes nas composições imunogênicas da invenção é opcionalmente um membro das proteínas da família da tríade da poliistidina (Pht), fragmentos ou proteínas de fusão destas. As proteínas PhtA, PhtB, PhtD ou PhtE podem ter uma seqüência de aminoácido compartilhando 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com uma sequência divulgada na WO00/37105 ou WOOO/39299 (por exemplo com as sequências de aminoácido 1-838 ou 21-838 da SEQ ID NO:4 da WO00/37105 para PhtD). Por exemplo, as proteínas de fusão são compostas de tamanho natural ou fragmentos de 2, 3 ou 4 de PhtA, PhtB, PhtD, PhtE. Os exemplos de proteínas de fusão são PhtA/Β, PhtA/D, PhtA/E, PhtB/Α, PhtB/D, PhtB/E, PhtD/Α, PhtD/Β, PhtD/E, PhtE/Α, PhtE/Β e PhtE/D, em que as proteínas são ligadas com o primeiro mencionado no terminal N (ver por exemplo WOO1/98334).
Onde os fragmentos de proteínas Pht são usados (separadamente ou como parte de uma proteína de fusão), cada fragmento opcionalmente contém um ou mais motivos da tríade da histidina e/ou regiões de espiral espiralada de tais polipeptídeos. Um motivo da tríade da histidina é a porção de polipeptídeo que tem a sequência HxxHxH onde H é histidina e x é um aminoácido outro que não histidina. Uma região de espiral espiralada é uma região prognosticada pelo algoritmo “Coils” Lupus, A et al (1991) Science 252; 1162-1164. Em uma forma de realização o ou cada fragmento inclui um ou mais motivos da tríade de histidina assim como pelo menos uma região de espiral espiralada. Em uma forma de realização, o ou cada fragmento contém exatamente ou pelo menos 2, 3, 4 ou 5 motivos da tríade de histidina (opcionalmente, com sequências de Pht nativas entre as 2 ou mais tríades ou sequência intra-tríade que é mais do que 50, 60, 70, 80, 90 ou 100% idêntica a uma sequência de Pht intra-tríade pneumocócica nativa - por exemplo a sequência intra-tríade mostrada na SEQ ID NO:4 da WO00/37105 para PhtD). Em uma forma de realização, o ou cada fragmento contém exatamente ou pelo menos 2, 3 ou 4 regiões de espiral espiralada. Em uma forma de realização uma proteína Pht aqui divulgada inclui a proteína de tamanho natural com a sequência de sinal ligada, a proteína de tamanho natural madura com o peptídeo de sinal (por exemplo 20 aminoácidos no terminal N) removido, as variantes que ocorrem naturalmente da proteína Pht e fragmentos imunogênico da proteína Pht (por exemplo fragmentos como descritos acima ou polipeptídeos que compreendem pelo menos 15 ou 20 aminoácidos contíguos de uma sequência de aminoácido na WO00/37105 (SEQ ID NOs 4, 6, 8 ou 10) ou WOOO/39299 (SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10 ou 14) em que o dito polipeptídeo é capaz de eliciar uma resposta imune específica para a dita sequência de aminoácido na WO00/37105 ou WOOO/39299.
Em particular, o termo “PhtD” como aqui usado inclui a proteína de tamanho natural com a sequência de sinal ligada, a proteína de tamanho natural madura com o peptídeo de sinal (por exemplo 20 aminoácidos no terminal N) removido, variantes que ocorrem naturalmente de PhtD e fragmentos imunogênicos de PhtD (por exemplo fragmentos como descritos acima ou polipeptídeos que compreendem pelo menos 15 ou 20 aminoácidos contíguos de uma sequência de aminoácido de PhtD na WO00/37105 ou WOOO/39299 em que o dito polipeptídeo é capaz de eliciar um resposta imune específica para a dita sequência de aminoácido de PhtD na WO00/37105 ou WOOO/39299 (por exemplo a SEQ ID NO:4 da WOOO/37105 ou SEQ ID NO: 14 da WOOO/39299 para PhtD). Todas as formas de PhtD mencionadas acima podem ser usadas na presente invenção.
Se o carreador de proteína for o mesmo para 2 ou mais sacarídeos na composição, os sacarídeos podem ser conjugados à mesma molécula do carreador de proteína (moléculas carreadoras tendo 2 ou mais sacarídeos diferentes conjugados às mesmas) [ver por exemplo a W004/083251]. Alternativamente os sacarídeos podem ser cada um separadamente conjugados a moléculas diferentes do carreador de proteína (cada molécula de carreador de proteína tendo apenas um tipo de sacarídeo conjugado à mesma).
Os exemplos de proteínas carreadoras que podem ser usadas na presente invenção são DT (toxóide da difteria), TT (toxóide do tétano) ou fragmento C de TT, DT CRM197 (um mutante de DT) outros mutantes pontuais de DT, tais como CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 e CRM107 e outras mutações descritas por Nicholls e Youle em Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; deleção ou mutação de Glu-148 para Asp, Gin ou Ser e/ou Ala 158 para Gly e outras mutações divulgadas na US 4709017 ou US 4950740; a mutação de pelo menos um ou mais resíduos Lys 516, Lys 526, Phe 530 e/ou Lys 534 e outras mutações divulgadas na US 5917017 ou US 6455673; ou fragmento divulgado na US 5843711, pneumolisina pneumocócica (Kuo et al (1995) Infect Immun 63; 2706-13) incluindo ply destoxificado de alguma maneira por exemplo dPLY-GMBS (W004081515, PCT/EP2005/010258) ou dPLY-formol, PhtX, incluindo PhtA, PhtB, PhtD, PhtE e fusões de proteína Phts por exemplo fusões de PhtDE, fusões de PhtBE (WOO 1/98334 e W003/54007), (Pht A-E são descritos em mais detalhes abaixo) OMPC (proteína de membrana externa meningocócica - usualmente extraída da N. meningitidis sorogrupo Β — EP0372501), PorB (da N. meningitidis), PD (proteína D de Haemophilus influenzae — ver, por exemplo, EP 0 594 610 B) ou equivalentes destas imunologicamente funcionais, peptídeos sintéticos (EP0378881, EP0427347), proteínas de choque térmico (WO93/17712, W094/03208), proteínas da coqueluche (WO98/58668, EP0471177), citocinas, linfocinas, fatores de crescimento ou hormônios (WO91/01146), proteínas artificiais que compreendem epítopos de célula T CD4+ humanos múltiplos de antígenos derivados de vários patógenos (Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824) tais como a proteína NI 9 (Baraldoi et al (2004) Infect Immun 72; 4884-7) proteína de superfície pneumocócica PspA (W002/091998), proteínas de captação de ferro (WOO 1/72337), toxina A ou B de C. difficile (WOOO/61761).
Nurkka et al Pediatric Infectious Disease Journal. 23(11):1008-14, Nov. de 2004 descreve uma vacina pneumocócica 11 valente com todos os sorotipos conjugados a PD. Entretanto, os presentes inventores têm mostrado que a atividade opsonofagocítica foi melhorada para os anticorpos induzidos com conjugados tendo 19F conjugado a DT comparado com 19F conjugado a PD. além disso, os presentes inventores têm mostrado que uma reatividade cruzada maior para 19A é observada com 19F conjugado a DT. E portanto uma característica da composição da presente invenção que o sorotipo 19F é conjugado a um toxóide bacteriano, por exemplo TT, pneumolisina, DT ou CRM 197. Em um aspecto, o sorotipo 19F é conjugado a DT. também é uma característica da invenção que o sorotipo 19A é conjugado a um toxóide bacteriano, por exemplo TT, pneumolisina, DT ou CRM 197. Os sorotipos de sacarídeo remanescentes da composição imunogênica podem ser todos conjugados a uma ou mais proteínas carreadoras que não são DT (isto é, apenas 19F é conjugada a DT) ou pode ser dividida entre uma ou mais proteínas carreadoras que não são DT e o próprio DT. Em uma forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e os sorotipos remanescentes são dividido entre PD e TT ou DT ou CRM 197. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e não mais do que um sacarídeo é conjugado a TT. Em um aspecto desta forma de realização, o dito um sacarídeo é 18C ou 12F. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e não mais do que dois sacarídeos são conjugados a TT. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e os sorotipos remanescentes são divididos entre PD, TT e DT ou CRM 197. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e os sorotipos remanescentes são divididos entre PD, TT e pneumolisina. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e os sorotipos remanescentes são divididos entre PD, TT e CRM 197. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e os sorotipos remanescentes são divididos entre PD, TT, pneumolisina e opcionalmente PhtD ou proteína de fusão de PhtD/E. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM197, 19A é conjugado à pneumolisina ou TT e os sorotipos remanescentes são divididos entre PD, TT, pneumolisina e opcionalmente PhtD ou proteína de fusão de PhtD/E. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM197, 19A é conjugado à pneumolisina ou TT, um outro sacarídeo é conjugado a TT, um outro sacarídeo é conjugado à PhtD ou PhtD/E e todos os outros sacarídeos são conjugados a PD. Em uma outra forma de realização 19F é conjugado a DT ou CRM 197.
Em um aspecto, o sorotipo 19F é conjugado a DT. Os sorotipos remanescentes de sacarídeo da composição imunogênica podem ser todos conjugados a uma ou mais proteínas carreadoras que não são DT (isto é, apenas 19F é conjugada a DT) ou podem ser divididos entre uma ou mais proteínas carreadoras que não são DT e a própria DT. Em uma forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e todos os sorotipos remanescentes são conjugados a PD. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e os sorotipos remanescentes são divididos entre PD e TT ou DT ou CRM 197. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e não mais do que um sacarídeo é conjugado à TT. Em um aspecto desta forma de realização, o dito um sacarídeo é 18C ou 12F. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e não mais do que dois sacarídeos são conjugados a TT. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e os sorotipos remanescentes são divididos entre PD, TT e DT ou CRM 197. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e os sorotipos remanescentes são divididos entre PD, TT e pneumolisina. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e os sorotipos remanescentes são divididos entre PD, TT e CRM 197. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM197 e os sorotipos remanescentes são divididos entre PD, TT, pneumolisina e opcionalmente PhtD ou proteína de fusão PhtD/E. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197, 19A é conjugado à pneumolisina ou TT, um (dois ou três) outros sacarídeos é conjugado à TT, um outro sacarídeo é conjugado à PhtD ou PhtD/E e todos os outros sacarídeos são conjugados a PD. Em uma outra forma de realização 19F é conjugado a DT ou CRM 197, 19A é conjugado à pneumolisina, um (dois ou três) outros sacarídeos é conjugado à TT, um outro sacarídeo é conjugado à pneumolisina, 2 outros sacarídeos são conjugados a PhtD ou PhtD/E e todos os outros sacarídeos são conjugados a PD. O termo “sacarídeo” por todo este relatório descritivo pode indicar polissacarídeo ou oligossacarídeo e inclui ambos. Os polissacarídeos são isolados de bactérias e podem ser dimensionados em algum grau pelos métodos conhecidos (ver por exemplo EP497524 e EP497525) e preferivelmente pela microfluidização. Os polissacarídeos podem ser dimensionados de modo a reduzir a viscosidade em amostras de polissacarídeo e/ou melhorar a filtrabilidade dos produtos conjugados. Os oligossacarídeos têm um número baixo de unidades de repetição (tipicamente 5 a 30 unidades de repetição) e são tipicamente polissacarídeos hidrolisados.
Os polissacarídeos capsulares de Streptococcus. pneumoniae compreendem unidades de oligossacarídeo de repetição que podem conter até 8 resíduos de açúcar. Para uma revisão das unidades de oligossacarídeo para os sorotipos de Streptococcus. pneumoniae chave ver JONES, Christopher. Vaccines based on the cell surface carbohydrates of pathogenic bactéria. An. Acad. Bras. Ciênc., Junho de 2005, vol. 77, no. 2, p. 293-324. Tabela II ISSN 00013765. Em uma forma de realização, um antígeno de sacarídeo capsular pode ser um polissacarídeo de tamanho natural, entretanto em outras o mesmo pode ser uma unidade de oligossacarídeo ou uma cadeia de sacarídeo de comprimento mais curto do que a nativa de unidades de oligossacarídeo de repetição. Em uma forma de realização, todos os sacarídeos presentes na vacina são polissacarídeos. Os polissacarídeos de tamanho natural podem ser “dimensionados” isto é, o seu tamanho pode ser reduzido por vários métodos tais como tratamento com hidrólise ácida, tratamento com peróxido de hidrogênio, classificação por emulsiflex® seguido por um tratamento com peróxido de hidrogênio para gerar fragmentos de oligossacarídeo ou microfluidização.
Os inventores também mencionaram que o foco da técnica tem sido usar oligossacarídeos quanto a facilidade de produzir conjugado. Os inventores descobriram que pelo uso de conjugados de polissacarídeo nativos ou levemente dimensionados, uma ou mais das seguintes vantagens podem ser realizadas: 1) um conjugado tendo alta imunogenicidade que é filtrável, 2) a razão de polissacarídeo para proteína no conjugado pode ser alterada tal que a razão de polissacarídeo para proteína (p/p) no conjugado possa ser aumentada (que pode ter um efeito sobre o efeito de supressão de carreador), 3) conjugados imunogênico propensos à hidrólise podem ser estabilizados pelo uso de sacarídeos maiores para a conjugação. O uso de polissacarídeos maiores pode resultar em mais reticulação com o conjugado carreador e pode diminuir a liberação de sacarídeo livre do conjugado. As vacinas conjugadas descritas na técnica anterior tendem a despolimerizar os polissacarídeos antes da conjugação de modo a melhorar a conjugação. Os presentes inventores descobriram que as vacinas de conjugado de sacarídeo que retêm um tamanho grande de sacarídeo podem fornecer uma boa resposta imune contra a doença pneumocócica. A composição imunogênica da invenção pode assim compreender um ou mais sacarídeos conjugados em que o tamanho médio (por exemplo peso molecular médio ponderado; Mw) de cada sacarídeo antes da conjugação está acima de 80 kDa, 100 kDa, 200 kDa, 300 kDa, 400 kDa, 500 kDa ou 1000 kDa. Em uma forma de realização um ou mais sacarídeos conjugados da invenção devem ter um tamanho médio de pré-conjugação de sacarídeo de 50-1600, 801400, 100-1000, 150-500 ou 200-400 kDa (observe que onde o tamanho médio é Mw, as unidades ‘kDa’ devem ser aqui substituídas ‘xlO ’). Em uma forma de realização o conjugado pós conjugação deve ser facilmente filtrável através de um filtro de 0,2 mícron tal que um rendimento de mais do que 50, 60, 70, 80, 90 ou 95 % seja obtido após a filtração comparado com a amostra pré filtração.
Para os propósitos da invenção, “polissacarídeo nativo” refere-se a um sacarídeo que não foi submetido a um processo (por exemplo, pós-purificação), o propósito do qual é reduzir o tamanho do sacarídeo. Um polissacarídeo pode se tomar levemente reduzido no tamanho durante procedimentos de purificação normal. Um tal sacarídeo é ainda nativo. Apenas se o polissacarídeo fosse submetido às técnicas de classificação por tamanho o polissacarídeo não seria considerado nativo. O tamanho de um polissacarídeo nativo está por exemplo entre 250kDa a 2.000kDa, 400 a 1.500kDa, 750kDa a 1.250kDa, 300kDa a 600kDa, 500 a l.OOOkDa ou 1.000 a 1.500kDa com sorotipos diferentes tendo tamanhos diferentes de polissacarídeo nativo como será avaliado pela pessoa habilitada.
Para os propósitos da invenção, “dimensionado por um fator de até x2” significa que o sacarídeo é submetido a um processo intencionado a reduzir o tamanho do sacarídeo mas para reter um tamanho maior do que a metade do tamanho do polissacarídeo nativo. x3, x4 etc. devem ser interpretados do mesmo modo isto é, o sacarídeo é submetido a um processo intencionado a reduzir o tamanho do polissacarídeo mas para reter um tamanho maior do que um terço, um quarto etc., do tamanho do polissacarídeo nativo.
Em um aspecto da invenção, a composição imunogênica compreende sacarídeos de Streptococcus. pneumoniae de pelo menos 10 sorotipos conjugados a um carreador de proteína, em que pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou cada sacarídeo de S. pneumoniae é polissacarídeo nativo.
Em um aspecto da invenção, a composição imunogênica compreende sacarídeos de Streptococcus. pneumoniae de pelo menos 10 sorotipos conjugados a um carreador de proteína, em que pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou cada sacarídeo de S. pneumoniae é dimensionado por um fator de até x2, x3, x4, x5, xó, x7, x8, x9 ou xlO. Em uma forma de realização deste aspecto, a maioria dos sacarídeos, por exemplo 6, 7, 8 ou mais dos sacarídeos são dimensionados por um fator de até x2, x3, x4, x5, x6, x7, x8, x9 ou xlO. O peso molecular ou peso molecular médio de um sacarídeo aqui refere-se ao peso molecular médio ponderado (Mw) do sacarídeo medido antes da conjugação e é medido por MALLS. A técnica MALLS é bem conhecida no ramo e é tipicamente realizada como descrito no exemplo 2. Para a análise de MALLS de sacarídeos pneumocócicos, duas colunas (TSKG6000 e 5000PWxl) podem ser usadas em combinação e os sacarídeos são eluídos em água. Os sacarídeos são detectados usando um detector de dispersão de luz (por exemplo Wyatt Dawn DSP equipado com um laser de argônio de 10 mW a 488 nm) e um refratômetro inferométrico (por exemplo Wyatt Otilab DSP equipado com uma célula P100 e um filtro vermelho a 498 nm).
Em uma forma de realização os sacarídeos de S. pneumoniae são polissacarídeos nativos ou polissacarídeos nativos que foram reduzidos no tamanho durante um processo de extração normal.
Em uma forma de realização, os sacarídeos de S. pneumoniae são dimensionados pela clivagem mecânica, por exemplo pela microfluidização ou sonicação. A microfluidização e sonicação têm a vantagem de diminuir o tamanho dos polissacarídeos nativos maiores suficientemente para fornecer um conjugado filtrável. A classificação por tamanho é por um fator de não mais do que x20, xlO, x8, xó, x5, x4, x3 ou x2.
Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende conjugados de S. pneumoniae que são fabricados a partir de uma mistura de polissacarídeos nativos e sacarídeos que são dimensionados por um fator de não mais do que x20. Em um aspecto desta forma de realização, a maioria dos sacarídeos, por exemplo 6, 7, 8 ou mais dos sacarídeos são dimensionados por um fator de até x2, x3, x4, x5 ou xó.
Em uma forma de realização, o sacarídeo de Streptococcus. pneumoniae é conjugado à proteína carreadora por intermédio de um ligador, por exemplo um ligador bifimcional. O ligador é preferivelmente heterobifuncional ou homobifuncional, tendo por exemplo um grupo amino reativo e um grupo de ácido carboxílico, 2 grupos amino reativos ou dois grupos de ácido carboxílico. O ligador tem por exemplo entre 4 e 20, 4 e 12, 5 e 10 átomos de carbono. Um ligador possível é ADH. Outros ligadores incluem B-propionamido (WO00/10599), nitrofenil-etilamina (Geyer et al (1979) Med. Microbiol. Immunol. 165; 171-288), haletos de haloalquila (US4057685), ligações glicosídicas (US4673574, US4808700), hexano diamina e ácido 6-aminocapróico (US4459286). Em uma forma de realização, ADH é usado como um ligador para conjugar sacarídeo do sorotipo 18C. Em uma forma de realização, ADH é usado como um ligador para conjugar sacarídeo do sorotipo 22F.
Os conjugados de sacarídeo presentes nas composições imunogênicas da invenção podem ser preparadas por qualquer técnica de ligação conhecida. O método de conjugação pode contar com a ativação do sacarídeo com tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilamino piridínio (CDAP) para formar um éster de cianato. O sacarídeo ativado pode ser assim ligado diretamente ou por intermédio de um grupo espaçador (ligador) a um grupo amino na proteína carreadora. Por exemplo, o espaçador pode ser cistamina ou cisteamina para dar um polissacarídeo tiolado que pode ser ligado ao carreador por intermédio de uma ligação de tioéter obtida depois da reação com uma proteína carreadora ativada com maleimida (por exemplo usando GMBS) ou uma proteína carreadora haloacetilada (por exemplo usando iodoacetimida [por exemplo etil iodoacetimida HCl] ou bromoacetato de N-succinimidila ou STAB ou SIA ou SB AP). Preferivelmente, o éster de cianato (opcionalmente fabricado pela química de CDAP) é ligado com hexano diamina ou ADH e o sacarídeo derivado em amida é conjugado à proteína carreadora usando a química da carbodiimida (por exemplo EDAC ou EDC) por intermédio de um grupo carboxila na proteína carreadora. Tais conjugados são descritos no pedido publicado PCT WO93/15760 Uniformed Services University e WO95/08348 e WO96/29094.
Outras técnicas adequadas usam carbodiimidas, hidrazidas, ésteres ativos, norborano, ácido p-nitrobenzóico, N-hidroxissuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU. Muitas são descritas na WO98/42721. A conjugação pode envolver um ligador de carbonila que pode ser formado pela reação de um grupo hidroxila livre do sacarídeo com CDI (Bethel) et al J. Biol. Chem. 1979, 254; 2572 a 4, Heam et al J. Chromatogr. 1981, 218; 509-18) seguida pela reação com uma proteína para formar uma ligação de carbamato. Isto pode envolver a redução do terminal anomérico a um grupo hidroxila primário, a proteção/ desproteção opcional da reação do grupo hidroxila primário do grupo hidroxila primário com CDI para formar um intermediário de carbamato de CDI e ligar o intermediário de carbamato de CDI com um grupo amino em uma proteína.
Os conjugados também podem ser preparados pelos métodos de aminação redutiva direta como descritos na US 4365170 (Jennings) e US 4673574 (Anderson). Outros métodos são descritos na EP-0-161-188, EP-208375 e EP-0-477508.
Um outro método envolve a ligação de um sacarídeo ativado com brometo de cianogênio (ou CDAP) derivado com diidrazida de ácido adípico (ADH) com a proteína carreadora pela condensação de carbodiimida (Chu C. et al Infect. Immunity, 1983 245 256), por exemplo usando EDAC.
Em uma forma de realização, um grupo hidroxila (preferivelmente um grupo hidroxila ativado por exemplo um grupo hidroxila ativado para compor um éster de cianato [por exemplo usando CDAP]) em um sacarídeo é ligado a um grupo amino ou carboxílico em uma proteína direta ou indiretamente (através de um ligador). Onde um ligador está presente, um grupo hidroxila em um sacarídeo é preferivelmente ligado a um grupo amino em um ligador, por exemplo pelo uso da conjugação de CDAP. Um outro grupo amino no ligador por exemplo ADH) pode estar conjugado a um grupo de ácido carboxílico em uma proteína, por exemplo pelo uso da química da carbodiimida, por exemplo usando-se EDAC. Em uma forma de realização, o(s) sacarídeo(s) capsular(es) pneumocócico(s) é(são) conjugado(s) ao primeiro ligador antes que o ligador seja conjugado à proteína carreadora. Alternativamente o ligador pode estar conjugado ao carreador antes da conjugação ao sacarídeo.
Uma combinação de técnicas também pode ser usada, com alguns conjugados de sacarídeo-proteína sendo preparados por CDAP e alguns pela aminação redutiva.
No geral os seguintes tipos de grupos químicos em uma proteína carreadora podem ser usados para a ligação / conjugação: A) Carboxila (por exemplo por intermédio de ácido aspártico ou ácido glutâmico). Em uma forma de realização este grupo está ligado aos grupos de amino nos sacarídeos diretamente ou a um grupo amino em um ligador com a química da carbodiimida por exemplo com EDAC. B) Grupo amino (por exemplo por intermédio de lisina). Em uma forma de realização este grupo está ligado aos grupos carboxila nos sacarídeos diretamente ou a um grupo carboxila em um ligador com a química da carbodiimida por exemplo com EDAC. Em uma outra forma de realização este grupo está ligado aos grupos hidroxila ativados com CDAP ou CNBr nos sacarídeos diretamente ou a tais grupos em um ligador; aos sacarídeos ou ligadores tendo um grupo aldeído; aos sacarídeos ou ligadores tendo um grupo de éster de succinimida. C) Sulfidrila (por exemplo por intermédio de cisteína). Em uma forma de realização este grupo está ligado a um sacarídeo acetilado com bromo ou cloro ou ligador com a química da maleimida. Em uma forma de realização este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina. D) Grupo hidroxila (por exemplo por intermédio da tirosina). Em uma forma de realização este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina. E) Grupo Imidazolila (por exemplo por intermédio de histidina). Em uma forma de realização este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina. F) Grupo guanidila (por exemplo por intermédio de arginina). G) Grupo indolila (por exemplo por intermédio de triptofano).
Em um sacarídeo, no geral os seguintes grupos podem ser usados para uma ligação: OH, COOH ou NH2. Grupos aldeído podem ser gerados depois de tratamentos diferentes conhecidos na técnica tais como: periodato, hidrólise ácida, peróxido de hidrogênio, etc. Métodos de ligação direta: Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP —> éster de cianato + NH2-Prot —> conjugado Sacarídeo-aldeído + NH2-Prot —> base de Schiff + NaCNBH3 —> conjugado Sacarídeo-COOH + NH2-Prot + EDAC —> conjugado Sacarídeo-NH2 + COOH-Prot + EDAC —> conjugado Métodos de ligação indireta por intermédio de espaçador (ligador): Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP —> éster de cianato + NH2-—NH2 —> sacarídeo—NH2 + COOH-Prot + EDAC —> conjugado Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP —> éster de cianato + NH2-—SH — -> sacarídeo—SH + SH-Prot (Proteína nativa com uma cisteína exposta ou obtida depois da modificação de grupos amino da proteína por SPDP por exemplo) —> sacarídeo-S-S-Prot Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP —> éster de cianato + NH2-—SH —> sacarídeo—SH + maleimida-Prot (modificação de grupos amino) —> conjugado Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP —> éster de cianato + NH2— -SH —> Sacarídeo-SH + haloacetilado-Prot —> conjugado Sacarídeo-COOH + EDAC + NH2—NH2 —> sacarídeo— NH2 + EDAC + COOH-Prot —> conjugado Sacarídeo-COOH + EDAC+ NH2—SH —> sacarídeo—SH + SH-Prot (Proteína nativa com uma cisteína exposta ou obtida depois da modificação de grupos amino da proteína por SPDP por exemplo) —> sacarídeo-S-S-Prot Sacarídeo-COOH + EDAC+ NE12—SH —> sacarídeo—SH + maleimida-Prot (modificação de grupos amino) —> conjugado Sacarídeo-COOH + EDAC + NH2—SH —> Sacarídeo-SH + haloacetilado-Prot —> conjugado Sacarídeo-Aldeído + NH2—NH2 —> sacarídeo—NH2 + EDAC + COOH-Prot —> conjugado Nota: ao invés de EDAC acima, qualquer carbodiimida adequada pode ser usada.
Em resumo, os tipos of grupo químico da proteína carreadora que pode ser no geral usado para a ligação com um sacarídeo são grupos amino (por exemplo nos resíduos de lisina), grupos COOH (por exemplo nos resíduos de ácido aspártico e glutâmico) e grupos SH (se acessíveis) (por exemplo nos resíduos de cisteína).
Preferivelmente a razão de proteína carreadora para sacarídeo de S. pneumoniae está entre 1:5 e 5:1; 1:2 e 2,5:1; 1:1 e 2:1 (p/p). Em uma forma de realização, a maioria dos conjugados, por exemplo 6, 7, 8, 9 ou mais dos conjugados têm uma razão de proteína carreadora para sacarídeo que é maior do que 1:1, por exemplo 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1 ou 1,6:1.
Em uma forma de realização, pelo menos um sacarídeo de & pneumoniae é conjugado a uma proteína carreadora por intermédio de um ligador usando CDAP e EDAC. Por exemplo, 18C ou 22F pode estar conjugado a uma proteína por intermédio de um ligador (por exemplo aqueles com dois grupos hidrazina nas suas extremidades tais como ADH) usando CDAP e EDAC como descritos acima. Quando um ligador é usado, CDAP pode ser usado para conjugar o sacarídeo a um ligador e EDAC pode ser depois usado para conjugar o ligador a uma proteína ou, alternativamente EDAC pode ser usado primeiro para conjugar o ligador com a proteína, depois que CDAP pode ser usado para conjugar o ligador ao sacarídeo.
No geral, a composição imunogênica da invenção pode compreender uma dose de cada conjugado de sacarídeo entre 0,1 e 20 pg, 1 e 10 pg ou 1 e 3 pg de sacarídeo.
Em uma forma de realização, a composição imunogênica da invenção contém cada sacarídeo de S. pneumoniae capsular em uma dose entre 0,1 a 20 pm; 0,5 a 10 pm; 0,5 a 5 pg ou 13 pg de sacarídeo. Em uma forma de realização, sacarídeos capsulares podem estar presentes em dosagens diferentes, por exemplo alguns sacarídeos capsulares podem estar presentes em uma dose em tomo de ou exatamente 1 pg ou alguns sacarídeos capsulares podem estar presentes em uma dose em tomo de ou exatamente 3 pg. Em uma forma de realização, os sacarídeos dos sorotipos 3, 18C e 19F (ou 4, 18C e 19F) estão presentes em uma dose mais alta do que os outros sacarídeos. Em um aspecto desta forma de realização, os sorotipos 3, 18C e 19F (ou 4, 18C e 19F) estão presentes em uma dose em tomo de ou exatamente 3 pg enquanto que os outros sacarídeos na composição imunogênica estão presentes em uma dose em tomo de ou exatamente 1 pg. “Em tomo de” ou “aproximadamente” são definidos como dentro de 10% mais ou menos da figura dada para os propósitos da invenção.
Em uma forma de realização, pelo menos um dos sacarídeos capsulares da <S. pneumoniae é diretamente conjugado a uma proteína carreadora (por exemplo usando uma das químicas aqui descritas).
Preferivelmente o pelo menos um dos sacarídeos capsulares da S. pneumoniae é diretamente conjugado por CDAP. Em uma forma de realização, a maioria dos sacarídeos capsulares por exemplo 5, 6, 7, 8, 9 ou mais são diretamente ligadas com a proteína carreadora por CDAP (ver WO 95/08348 e WO 96/29094) A composição imunogênica pode compreender proteínas de Streptococcus. pneumoniae, aqui chamada de proteínas de Streptococcus. pneumoniae da invenção. Tais proteínas podem ser usadas como proteínas carreadoras ou podem estar presentes como proteínas livres ou podem estar presentes tanto como proteínas carreadoras quanto como proteínas livres. As proteínas de Streptococcus. pneumoniae da invenção são expostas na superfície, pelo menos durante parte do ciclo de vida dos pneumococos ou são proteínas que são secretadas ou liberadas pelos pneumococos. Preferivelmente as proteínas da invenção são selecionadas das seguintes categorias, tais como proteínas tendo um motivo de sequência de Sinal Tipo II de LXXC (onde X é qualquer aminoácido, por exemplo, a família da tríade da poliistidina (PhtX)), proteínas de ligação de colina (CbpX), proteínas tendo um motivo de sequência de Sinal Tipo I (por exemplo, SplOl), proteínas tendo um motivo LPXTG (onde X é qualquer aminoácido, por exemplo, Spl28, Spl30) e toxinas (por exemplo, Ply). Os exemplos preferidos dentro destas categorias (ou motivos) são as seguintes proteínas ou equivalentes imunologicamente funcionais destes.
Em uma forma de realização, a composição imunogênica da invenção compreende pelo menos 1 proteína selecionada do grupo que consiste da família da Tríade da Poli Histidina (PhtX),família da Proteína de Ligação de Colina (CbpX), truncados de CbpX, família LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas de truncado de CbpX-truncado de LytX (ou fusões), pneumolisina (Ply), PspA, PsaA,Spl28, SplOl, Spl30, Spl25 e Spl33. Em uma outra forma de realização, a composição imunogênica compreende 2 ou mais proteínas selecionadas do grupo que consiste da família da Tríade da PoliHistidina (PhtX), família da Proteína de Ligação de Colina (CbpX), truncados de CbpX, família LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas de truncado de CbpX-truncado de LytX (ou fusões),pneumolisina (Ply), PspA, PsaA e Spl28. Em mais uma forma de realização, a composição imunogênica compreende 2 ou mais proteínas selecionadas do grupo que consiste da família da Tríade da Poli Histidina (PhtX), família da Proteína de Ligação de Colina (CbpX), truncados de CbpX, família LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas de truncado de CbpX-truncado de LytX (ou fusões), pneumolisina (Ply) e Spl28. A família Pht (Tríade de Poli Histidina) compreende as proteínas PhtA, PhtB, PhtD e PhtE. A família é caracterizada por uma sequência de lipidação, dois domínios separados por uma região rica em prolina e várias tríades de histidina, possivelmente envolvidas na ligação de metal ou nucleosídeo ou atividade enzimática, (3 a 5) regiões de espiral espiralada, um terminal N e um terminal C conservados heterogêneos. Ela está presente em todas as cepas de pneumococo testadas. As proteínas homólogas também foram descobertas em outros Estreptococos e Neisseria. Em uma forma de realização da invenção, a proteína Pht da invenção é PhtD. É entendido, entretanto, que os termos Pht A, B, D e E referem-se às proteínas tendo sequências divulgadas nas citações abaixo assim como as variantes que ocorrem naturalmente (e as fabricadas pelo ser humano) destas que têm uma homologia de sequência que é pelo menos 90% idêntica às proteínas aludidas. Preferivelmente, a mesma é pelo menos 95% idêntica e mais preferivelmente é 97% idêntica.
Com respeito às proteínas PhtX, PhtA é divulgada na WO98/18930 e também é indicada Sp36. Como mencionado acima, a mesma é uma proteína da família da tríade da poliistidina e tem o motivo de sinal tipo II de LXXC. PhtD é divulgada na WO00/37105 e também é indicada SpO36D. Como mencionado acima, a mesma também é uma proteína da família da tríade da poliistidina e tem o motivo de sinal LXXC tipo II. PhtB é divulgada na WO00/37105 e também é indicada SpO36B. Um outro membro da família PhtB é o Polipeptídeo de Degradação C3, como divulgado na WO00/17370. Esta proteína também é da família da tríade da poliistidina e tem o motivo de sinal tipo II LXXC. Por exemplo, um equivalente imunologicamente funcional é a proteína Sp42 divulgada na WO98/18930. Uma PhtB truncada (aproximadamente 79kD) é divulgada na WO99/15675 que também é considerada um membro da família PhtX. PhtE é divulgada na WO00/30299 e é indicada como BVH-3. Onde qualquer proteína Pht é aqui indicada, é intencionado que fragmentos imunogênicos ou fusões destes da proteína Pht podem ser usados. Por exemplo, uma referência a PhtX inclui fragmentos imunogênicos ou fusões destes de qualquer proteína Pht. Uma referência a PhtD ou PhtB também é uma referência às fusões PhtDE ou PhtBE como encontrado, por exemplo, na WOO 198334. A pneumolisina é uma toxina multifuncional com atividades citolíticas (hemolíticas) e de ativação de complemento distintas (Rubins et al., Am. Respi. Cit Care Med, 153:1339-1346 (1996)). A toxina não é secretada pelos pneumococos, mas a mesma é liberada na lise de pneumococos sob a influência da autolisina. Os seus efeitos incluem por exemplo, a estimulação da produção de citocinas inflamatórias pelos monócitos humanos, a inibição da vibração de cílios no epitélio respiratório humano e a diminuição da atividade e migração bactericida de neutrófilos. O efeito mais óbvio da pneumolisina está na lise de células sanguíneas vermelhas, que envolve a ligação ao colesterol. Porque o mesmo é uma toxina, necessita ser destoxificado (isto é, não tóxico a um ser humano quando fornecido e uma dosagem adequada por proteção) antes que possa ser administrado in vivo. A expressão e clonagem de pneumolisina do tipo selvagem ou nativa são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Walker et al. (Infect Immun, 55:1184-1189 (1987)), Mitchell et al. (Biochim Biophys Acta, 1007:67-72 (1989) e Mitchell et al (NAR, 18:4010 (1990)). A destoxificação de ply pode ser conduzida por meios químicos, por exemplo, submetida ao tratamento com formalina ou glutaraldeído ou uma combinação de ambos (W004081515, PCT/EP2005/010258). Tais métodos são bem conhecidos na técnica para várias toxinas. Alternativamente, ply pode ser geneticamente destoxificada. Assim, a invenção abrange derivados de proteínas pneumocócicas que podem ser, por exemplo, proteínas mutadas. O termo “mutado” é aqui usado para significar uma molécula que sofreu deleção, adição ou substituição de um ou mais aminoácidos usando técnicas bem conhecidas para a mutagênese direcionada ao sítio ou qualquer outro método convencional. Por exemplo, como descrito acima, uma proteína ply mutante pode ser alterada de modo que a mesma seja biologicamente inativa embora ainda mantenha seus epítopos imunogênicos, ver, por exemplo, a W090/06951, Berry et al. (Infect Immun, 67:981-985 (1999)) e WO99/03884.
Como aqui usado, é entendido que o termo “Ply” refere-se à pneumolisina mutada ou destoxificada adequada para uso médico (isto é, não tóxico).
Com respeito à família da Proteína de Ligação de Colina (CbpX), membros desta família foram originalmente identificados como proteínas pneumocócicas que podem ser purificadas pela cromatografia de afinidade de colina. Todas as proteínas de ligação de colina são ligadas de modo não covalente às porções de fosforilcolina do ácido tecóico da parede celular e ácido lipotecóico associado à membrana. Estruturalmente, eles têm várias regiões em comum em relação à família inteira, embora a natureza exata das proteínas (sequência de aminoácido, comprimento, etc.) pode variar. No geral, as proteínas de ligação de colina compreendem uma região de terminal N (N), regiões de repetição conservadas (Rl e/ou R2), uma região rica em prolina (P) e uma região de ligação de colina conservada (C), feita de repetições múltiplas, que compreendem aproximadamente uma metade da proteína. Como usado neste pedido, o termo “família da Proteína de Ligação de Colina (CbpX)” é selecionado do grupo que consiste das Proteínas de Ligação de Colina como identificadas na WO97/41151, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD e CbpG. CbpA é divulgada na WO97/41151. CbpD e CbpG são divulgadas na WOOO/29434. PspC é divulgada na WO97/09994. A PbcA é divulgada na WO98/21337. A SpsA é uma proteína de ligação de colina divulgada na WO98/39450. Preferivelmente as Proteínas de Ligação de Colina são selecionadas do grupo que consiste de CbpA, PbcA, SpsA e PspC.
Uma outra forma de realização preferida é truncados de CbpX em que “CbpX” é definida acima e “truncados” refere-se às proteínas CbpX que carecem de 50% ou mais da região de ligação de colina (C). Preferivelmente tais proteínas carecem da região de ligação de colina inteira. Mais preferivelmente, a tal proteína truncada carece (i) da região de ligação de colina e (ii) também uma porção da metade de terminal N da proteína, ainda retém pelo menos uma região de repetição (Rl ou R2). Mais preferivelmente ainda, o truncado tem 2 regiões de repetição (Rl e R2). Os exemplos de tais formas de realização são NRlxR2 e RlxR2 como ilustradas na WO99/51266 ou WO99/51188, entretanto, outras proteínas de ligação de colina que carecem de uma região de ligação de colina similar também são consideradas dentro do escopo desta invenção. A família de LytX é de proteínas associadas à membrana associadas com a lise de célula. O domínio de terminal N compreende domínio(s) de ligação de colina, entretanto a família LytX não tem todas as características encontradas na família CbpA mencionada acima e assim para a presente invenção, a família LytX é considerada distinta da família CbpX. Ao contrário com a família CbpX, o domínio de terminal C contém o domínio catalítico da família de proteína LytX. A família compreende LytA, B e C.
Com respeito à família LytX, LytA é divulgada em Ronda et al., Eur J Biochem, 164:621-624 (1987). LytB é divulgada na WO98/18930 e também é indicada como Sp46. LytC também é divulgada em WO98/18930 e também é indicada como Sp91. Uma forma de realização da invenção compreende LytC.
Uma outra forma de realização compreende truncados de LytX em que “LytX” é definido acima e “truncados” refere-se às proteínas LytX que carecem de 50% ou mais da região de ligação de Colina. Preferivelmente tais proteínas carecem a região de ligação de colina inteira. Já uma outra forma de realização desta invenção compreende proteínas quiméricas de truncado de CbpX-truncado de LytX (ou fusões). Preferivelmente isto compreende NRlxR2 (ou RlxR2) de CbpX e a porção de terminal C (Cterm, isto é, que carecem dos domínios de ligação de colina) de LytX (por exemplo, LytCCterm ou Sp91 Cterm). Mais preferivelmente CbpX é selecionado do grupo que consiste de CbpA, PbcA, SpsA e PspC. Mais preferivelmente ainda, a mesma é CbpA. Preferivelmente, LytX é LytC (também indicada como Sp91). Uma outra forma de realização da presente invenção é uma PspA ou PsaA truncada que carece do domínio de ligação de colina (C) e expressada como uma proteína de fusão com LytX. Preferivelmente, LytX é LytC.
Com respeito a PsaA e PspA, ambas são conhecidas na técnica. Por exemplo, PsaA e suas variantes de deleção de transmembrana foram descritas por Berry & Paton, Infect Immun Dez de 1996; 64(12):5255-62. PspA e suas variantes de deleção de transmembrana foram divulgadas, por exemplo, naUS 5804193, WO92/14488 e WO99/53940.
Spl28 e Spl30 são divulgadas na WO00/76540. Spl25 é um exemplo de uma proteína de superfície pneumocócica com o motivo Ancorado na Parede Celular de LPXTG (onde X é qualquer aminoácido). Qualquer proteína dentro desta classe de proteína de superfície pneumocócica com seu motivo foram descoberto serem úteis dentro do contexto desta invenção e são portanto consideradas uma outra proteína da invenção. A própria Spl25 é divulgada na WO98/18930 e também é conhecida como ZmpB - uma metaloproteinase do zinco. A SplOl é divulgada na WO98/06734 (onde a mesma tem a referência # y85993). Ela é caracterizada por uma sequência de sinal Tipo I. a Spl33 é divulgada na WO98/06734 (onde a mesma tem referência # y85992). Ela também é caracterizada por uma sequência de sinal Tipo I.
Os exemplos de antígenos de proteína de Moraxella catarrhalis que podem ser incluídos em uma vacina de combinação (especialmente para a prevenção da otite média) são:OMP106 [WO97/41731 (Antex) & WO96/34960 (PMC)]; OMP21 ou fragmentos deste (W00018910); LbpA &/ou LbpB [WO98/55606 (PMC)]; TbpA &/ou TbpB [WO97/13785 & WO97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010]; UspAl e/ou UspA2 [WO93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/ 03824); PilQ (PCT/EP99/03823); OMP85 (PCT/EP00/01468); lipoOÓ (GB 9917977.2); lipolO (GB 9918208.1); lipoll (GB 9918302.2); lipol8 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/ 03822); OmplAl (PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/03257); e OmpE. Os exemplos de antígenos da Haemophilus influenzae não tipáveis ou fragmentos destes que podem ser incluídos em uma vacina de combinação (especialmente para a prevenção da otite média) incluem:proteína de Fimbrina [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] e fusões que compreende peptídeos desta [por exemplo, fusões de peptídeo LBl(f); US 5843464 (OSU) ou WO99/64067]; OMP26 [WO97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (State University of New York)]; TbpA e/ou TbpB; Efia; Hsf; Elin47; Hit Hmwl; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO94/12641); P2; e P5 (WO94/26304).
As proteínas da invenção também podem ser beneficamente combinadas. Por combinado é intencionado que a composição imunogênica compreende todas as proteínas de dentro das seguintes combinações, como proteínas carreadoras ou como proteínas livres ou uma mistura das duas. Por exemplo, em uma combinação de duas proteínas como demonstrado em seguida, ambas as proteínas podem ser usadas como proteínas carreadoras ou ambas as proteínas podem estar presentes como proteínas livres ou ambas podem estar presentes como proteína carreadora e como proteína livre ou uma pode estar presente como uma proteína carreadora e uma proteína livre enquanto que a outra está presente apenas como uma proteína carreadora ou apenas como uma proteína livre ou uma pode estar presente como uma proteína carreadora e a outra como uma proteína livre. Onde uma combinação destas três proteínas é dada, possibilidades similares existem. As combinações preferidas incluem, mas não são limitadas a, proteínas quiméricas ou de fusão PhtD + NRlxR2, PhtD + NRlxR2-Sp91Cterm, PhtD + Ply, PhtD + Spl28, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NRlxR2, proteínas quiméricas ou de fusão PhtA + NRlxR2-Sp91Cterm, PhtA + Ply, PhtA + Spl28, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, NRlxR2 + LytC, NRlxR2 + PspA, NRlxR2 + PsaA, NRlxR2 + Spl28, RlxR2 + LytC, RlxR2 + PspA, RlxR2 + PsaA, RlxR2 + Spl28, RlxR2 + PhtD, RlxR2 + PhtA. Preferivelmente, NRlxR2 (ou RlxR2) é de CbpA ou PspC. Mais preferivelmente a mesma é de CbpA. Outras combinações incluem 3 combinações de proteína tais como PhtD + NRlxR2 + Ply e PhtA + NRlxR2 + PhtD. Em uma forma de realização, a composição de vacina compreende pneumolisina destoxificada e PhtD ou PhtDE como proteínas carreadoras. Em uma outra forma de realização, a composição de vacina compreende pneumolisina destoxificada e PhtD ou PhtDE como proteínas livres. A presente invenção fornece ainda uma vacina contendo as composições imunogênicas da invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
As vacinas da presente invenção podem ser adjuvantadas, particularmente quando intencionadas para o uso em uma população idosa mas também para o uso em populações infantis. Os adjuvantes adequados incluem um sal de alumínio tal como gel de hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio ou alúmen, mas também podem ser um sal de cálcio, magnésio, ferro ou zinco ou pode ser uma suspensão insolúvel de tirosina acilada ou açúcares acilados, sacarídeos catiônica ou anionicamente derivados ou polifosfazenos. É preferido que o adjuvante seja selecionado para ser um indutor preferencial de um tipo TH1 de resposta. Tais níveis altos de citocinas tipo Thl tendem a favorecer a indução das respostas imunes mediadas por célula a um dado antígeno, embora níveis altos de citocinas tipo Th2 tendem a favorecer a indução de respostas imunes humorais para o antígeno. A distinção de resposta imune Thl e Th2 não é absoluta. Na realidade um indivíduo sustentará uma resposta imune que é descrita como sendo predominantemente Thl ou predomínantemente Th2. Entretanto, é frequentemente conveniente considerar as famílias de citocinas em termos daquelas descritas em clones de célula T CD4 +ve de murino pela Mosmann e Coffman (Mosmann, T. R. e Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 cellsrdifferent pattems of limphokine secretion lead to different functional properties. (Annual Review of Immunology, 7, pl45-173). Tradicionalmente, as respostas tipo Thl são associadas com a produção das citocinas INF-γ e IL-2 pelos linfócitos T. Outras citocinas de modo frequente diretamente associadas com a indução de resposta imunes tipo Thl não são produzidas pelas células T, tais como IL-12. Ao contrário, as respostas tipo Th2 são associadas com a secreção de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Os sistemas de adjuvante adequados que promovem uma resposta predominantemente Thl incluem: Monofosforil lipídeo A ou um derivado deste, particularmente monofosforil lipídeo A 3-des-O-acilado (3D-MPL) (para a sua preparação ver a GB 2220211 A); e uma combinação de monofosforil lipídeo A, preferivelmente monofosforil lipídeo A 3-de-O-acilado, junto com um sal de alumínio (por exemplo fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio) ou uma emulsão de óleo em água. Em tais combinações, o antígeno e 3D-MPL estão contidos nas mesmas estruturas particuladas, possibilitando a liberação mais eficiente de sinais antigênicos e sinais imunoestimuladores. Os estudos têm mostrado que 3D-MPL é capaz de realçar ainda mais o realce adicional da imunogenicidade de um antígeno absorvido em alúmen [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1].
Um sistema realçado envolve a combinação de um monofosforil lipídeo A e um derivado de saponina, particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL como divulgada na W094/00153 ou uma composição menos reatogênica onde a QS21 é extinta com colesterol como divulgado na WO96/33739. Uma formulação de adjuvante particularmente potente envolvendo QS21, 3D-MPL e tocoferol em uma emulsão de óleo em água é descrita na WO95/17210. Em uma forma de realização a composição imunogênica adicionalmente compreende uma saponina, que pode ser QS21. A formulação também pode compreender uma emulsão de óleo em água e tocoferol (WO95/17210). Oligonucleotídeos contendo CpG não metilado (WO96/02555) e outros oligonucleotídeos imunomodulatórios (WO0226757 e WO03507822) também são indutores preferenciais de uma resposta TH1 e são adequados para o uso na presente invenção.
Os adjuvantes particulares são aqueles selecionados do grupo de sais metálicos, emulsões de óleo em água, agonistas de receptores equivalentes a Toll, (em particular agonista 2 do receptor equivalente a Toll, agonista 3 do receptor equivalente a Toll, agonista 4 do receptor equivalente a Toll, agonista 7 do receptor equivalente a Toll, agonista 8 do receptor equivalente a Toll e agonista 9 do receptor equivalente a Toll), saponinas ou combinações destas.
Um adjuvante que pode ser usado com as composições de vacina da invenção são preparações de bolhas ou vesículas de membrana externa de cepas bacterianas Gram negativas tais como aquelas divulgadas pela W002/09746 - particularmente bolhas de N. meningitidis. As propriedades adjuvantes das bolhas podem ser melhoradas pela retenção de LOS (lipooligossacarídeo) na sua superfície (por exemplo através da extração com concentrações baixas de detergente [por exemplo, de 0 a 0,1% de desoxicolato]). LOS pode ser destoxificado através das mutações msbB(-) ou htrB(-) debatidas na W002/09746. As propriedades adjuvantes também podem ser melhoradas pela retenção de PorB (e opcionalmente removendo PorA) de bolhas meningocócicas. As propriedades adjuvantes também podem ser melhoradas truncando-se a estrutura de sacarídeo de núcleo externa de LOS em bolhas meningocócicas - por exemplo por intermédio da mutação IgtB(-) debatida na W02004/014417. Alternativamente, o LOS anteriormente mencionado (por exemplo isolado de uma cepa msbB(-) e/ou IgtB(-)) pode ser purificado e usado como um adjuvante nas composições da invenção.
Um outro adjuvante que pode ser usado com as composições da invenção pode ser selecionado do grupo: uma saponina, lipídeo A ou um derivado deste, um oligonucleotídeo imunoestimulador, um fosfato de alquil glicosaminida, uma emulsão de óleo em água ou combinações destes. Um outro adjuvante preferido é um sal metálico em combinação com um outro adjuvante. É preferido que o adjuvante seja um agonista de receptor equivalente a Toll em particular um agonista de um receptor equivalente a r Toll 2, 3, 4, 7, 8 ou 9 ou uma saponina, em particular Qs21. E ainda preferido que o sistema de adjuvante compreenda dois ou mais adjuvantes da lista acima. Em particular as combinações preferivelmente contêm um adjuvante de saponina (em particular Qs21) e/ou um agonista de receptor equivalente a Toll 9 tal como um oligonucleotídeo imunoestimulador contendo CpG. Outras combinações preferidas compreendem uma saponina (em particular QS21) e um agonista de receptor equivalente a Toll 4 tal como monofosforil lipídeo A ou seu derivado 3 desacilado, 3 D - MPL ou uma saponina (em particular QS21) e um ligando de receptor equivalente a Toll 4 tal como um fosfato de alquil glicosaminida.
Os adjuvantes particularmente preferidos são combinações de 3D-MPL e QS21 (EP 0 671 948 Bl), emulsões de óleo em água que compreendem 3D-MPL e QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414) ou 3D-MPL formulado com outros carreadores (EP 0 689 454 Bl). Outros sistemas de adjuvante preferidos compreendem uma combinação de 3 D MPL, QS21 e um oligonucleotídeo de CpG como descritos na US6558670, US6544518.
Em uma forma de realização o adjuvante é (ou compreende) um ligando de receptor equivalente a Toll (TLR) 4, preferivelmente um agonista tal como um derivado de lipídeo A particularmente monofosforil lipídeo A ou mais particularmente monofosforil lipídeo A 3 Desacilado (3 D -MPL). 3D-MPL é disponível da GlaxoSmithKline Biologicals North America e primariamente promove as respostas de célula T CD4+ com um fenótipo IFN-g (Thl). Este pode ser produzido de acordo com os métodos divulgados na GB 2 220 211 A. Quimicamente é uma mistura de monofosforil lipídeo A 3-desacilado com 3, 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Preferivelmente nas composições da presente invenção partículas pequenas de 3D-MPL são usadas. As partículas pequenas de 3D-MPL tem um tamanho de partícula tal que as mesmas possam ser filtradas estéril através de um filtro de 0,22 pm. Tais preparações são descritas no Pedido de Patente Internacional Ns WO94/21292. Os derivados sintéticos de lipídeo A são conhecidos e considerados serem agonistas de TLR4 incluindo, mas não limitado a: OM174 (2-desóxi-6-o-[2-desóxi-2-[(R)-3- dodecanoiloxitetra-decanoilamino] -4-o-fosfono- [3 -D-glicopiranosil]-2- [(R)- 3-hidroxitetra-decanoilamino]-a-D-glicopiranosildiidrogenofosfato), (WO95/14026) ΟΜ294 DP (3S,9R)-3-[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]- 4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10-diol, 1,10-bis-(diidrogenofosfato) (WO99/64301 e WO00/0462) OM197 MP-Ac DP (3S,9R)-3-[(R)- dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10-diol, 1 -diidrogenofosfato 10-(6- aminoexanoato) (WOO 1/46127) Outros ligandos de TLR4 que podem ser usados são fosfatos de alquil Glicosaminida (AGPs) tais como aqueles divulgados na WO9850399 ou US6303347 (processos para a preparação de AGPs também são divulgados) ou sais farmaceuticamente aceitáveis de AGPs como divulgados na US6764840. Alguns AGPs são agonistas de TLR4 e alguns são antagonistas de TLR4. Ambos são considerados serem úteis como adjuvantes.
Um outro imunoestimulante preferido para o uso na presente invenção é Quil A e seus derivados. Quil A é uma preparação de saponina isolada da árvore da América do Sul Quilaja Saponaria Molina e foi primeiro descrita como tendo atividade adjuvante por Dalsgaard et al. em 1974 (“Saponin adjuvants”, Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlim, p243-254). Os fragmentos purificadas de Quil A foram isolados pela HPLC que retêm a atividade de adjuvante sem a toxicidade associada com a Quil A (EP 0 362 278), por exemplo QS7 e QS21 (também conhecidos como QA7 e QA21). QS-21 é um derivado de saponina natural da casca da Quillaja saponaria Molina que induz células T CD8+ citotóxicas (CTLs), células Thl e uma resposta de anticorpo de IgG2a predominante e é uma saponina no contexto da presente invenção.
As formulações particulares de QS21 foram descritas que são particularmente preferidas, estas formulações compreendem ainda um esterol (WO96/33739). As saponinas que formam parte da presente invenção pode ser separada na forma de micelas, micelas misturadas (preferivelmente, mas não exclusivamente com sais biliares) ou podem estar na forma de matrizes ISCOM (EP 0 109 942 Bl), lipossomas ou relacionadas com as estruturas coloidais tais como complexos multiméricos como verme ou como anel ou estruturas lipídicas/em camada e lamelas quando formuladas com colesterol e lipídeo ou na forma de uma emulsão de óleo em água (por exemplo como na WO95/17210). As saponinas podem estar preferivelmente associadas com um sal metálico, tal como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio (WO98/15287).
Preferivelmente, a saponina é apresentada na forma de uma lipossoma, ISCOM ou uma emulsão de óleo em água.
Um sistema realçado envolve a combinação de um monofosforil lipídeo A (ou lipídeo A destoxificado) e um derivado de saponina, particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL como divulgado na W094/00153 ou uma composição menos reatogênica onde a QS21 é extinta com colesterol como divulgado na WO96/33739. Uma formulação adjuvante particularmente potente envolvendo tocoferol com ou sem QS21 e/ou 3D-MPL em uma emulsão de óleo em água é descrita na WO95/17210. Em uma forma de realização a composição imunogênica adicionalmente compreende uma saponina, que pode ser QS21.
Oligonucleotídeos imunoestimuladores ou qualquer outro agonista 9 de receptor equivalente a Toll (TLR) também podem ser usados. Os oligonucleotídeos preferidos para o uso em adjuvantes ou vacinas da presente invenção são oligonucleotídeos contendo CpG, preferivelmente contendo dois ou mais motivos CpG de dinucleotídeo separados por pelo menos três, mais preferivelmente pelo menos seis ou mais nucleotídeos. Um motivo CpG é um nucleotídeo de citosina seguido por um nucleotídeo de guanina. Os oligonucleotídeos de CpG da presente invenção são tipicamente desoxinucleotídeos. Em uma forma de realização preferida o intemucleotídeo no oligonucleotídeo é fosforoditioato ou mais preferivelmente uma ligação de fosforotioato, embora o fosfodiéster e outras ligações de intemucleotídeo estejam dentro do escopo da invenção. Também incluídos dentro do escopo da invenção estão os oligonucleotídeos com ligações de intemucleotídeo misturadas. Os métodos para produzir oligonucleotídeos de fosforotioato ou fosforoditioato são descritos na US5.666.153, US5.278.302 e WO95/26204.
Os exemplos de oligonucleotídeos têm as seguintes sequências. As sequências preferivelmente contêm ligações intemucleotídicas modificadas por fosforotioato. OLIGO 1 (SEQ ID NO: 1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) OLIGO 2 (SEQ ID NO: 2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) OLIGO 3 (SEQ ID NO: 3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG OLIGO 4 (SEQ ID NO: 4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) OLIGO 5 (SEQ ID NO: 5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) OLIGO 6 (SEQ ID NO: 6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456) Os oligonucleotídeos de CpG alternativos podem compreender as sequências acima em que elas têm deleções ou adições sem importância nelas.
Os oligonucleotídeos de CpG utilizados na presente invenção podem ser sintetizados por qualquer método conhecido na técnica (por exemplo ver a EP 468520). Convenientemente, tais oligonucleotídeos podem ser sintetizados utilizando um sintetizador automatizado. O adjuvante pode ser uma emulsão de óleo em água ou pode compreender uma emulsão de óleo em água em combinação com outros adjuvantes. A fase de óleo do sistema de emulsão preferivelmente compreende um óleo metabolizável. O significado do termo óleo metabolizável é bem conhecido na técnica. Metabolizável pode ser definido como “sendo capaz de ser transformado pelo metabolismo” (Dorland’s Illustrated Medicai Dictionary, W. B. Sanders Company, 25a edição (1974)). O óleo pode ser qualquer óleo vegetal, de peixe, óleo, óleo animal ou sintético, que não é tóxico para o receptor e é capaz de ser transformado pelo metabolismo. Nozes, sementes e grãos são fontes comuns de óleos vegetais. Óleos sintéticos também são parte desta invenção e podem incluir óleos comercialmente disponíveis tais como NEOBEE® e outros. Esqualeno (2,6,10,15,19,23-Hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosaexaeno) é um óleo insaturado que é encontrado em quantidades grandes em óleo de fígado de tubarão e em quantidades menores em óleo de oliva, óleo de germe de trigo, óleo de farelo de arroz e levedura e é um óleo particularmente preferido para o uso nesta invenção. O esqualeno é um óleo metabolizável em virtude do fato que é um intermediário na biossíntese de colesterol (índice Merck, 10a Edição, entrada nfi 8619).
Tocóis (por exemplo vitamina E) também são frequentemente usados em adjuvantes de emulsões oleosas (EP 0 382 271 Bl; US5667784; WO95/17210). Os tocóis usados nas emulsões oleosas (preferivelmente emulsões de óleo em água) da invenção podem ser formuladas como descrito na EP 0 382 271 Bl, em que os tocóis podem ser dispersões de gotículas de tocol, opcionalmente compreendendo um emulsificador, preferivelmente de menos do que 1 mícron no diâmetro. Alternativamente, os tocóis podem ser usados em combinação com um outro óleo, para formar a fase oleosa de uma emulsão oleosa. Os exemplos de emulsões oleosas que podem ser usadas em combinação com o tocol são aqui descritos, tais como os óleos metabolizáveis descritos acima.
Os adjuvantes de emulsão de óleo em água por si foram sugeridos serem úteis como composições de adjuvante (EP 0 399 843B), também combinações de emulsões de óleo em água e outros agentes ativos foram descritos como adjuvantes para vacinas (WO95/17210; WO98/56414; WO99/12565; WO99/11241). Outros adjuvantes de emulsão oleosa foram descritos, tais como emulsões de água em óleo (US 5.422.109; EP 0 480 982 B2) e água em emulsões de óleo em água (US 5.424,067; EP 0 480 981 B). Todos os quais formam sistemas de emulsão oleosa preferidos (em particular quando da incorporação de tocóis) para formar adjuvantes e composições da presentes invenção.
Mais preferivelmente a emulsão oleosa (por exemplo emulsões de óleo em água) compreendem ainda um emulsificador tal como TWEEN 80 e/ou um esterol tal como colesterol.
Uma emulsão oleosa preferida (preferivelmente emulsão de óleo em água) compreende um óleo metabolizável, não tóxico, tal como esqualano, esqualeno ou um tocoferol tal como alfa tocoferol (e preferivelmente tanto esqualeno quanto alfa tocoferol) e preferivelmente um emulsificador (ou tensoativo) tal como Tween 80. Um esterol (por exemplo colesterol) também pode ser incluído. O método de produzir emulsões de óleo em água é bem conhecido para o ser humano habilitado na técnica. Habitualmente, o método compreende misturar a fase oleosa contendo tocol com um tensoativo tal como uma solução de PBS/TWEEN80®, seguida pela homogeneização usando um homogeneizador, estaria evidente a uma pessoa habilitada na técnica que um método que compreende passar a mistura duas vezes através de uma agulha de seringa seria adequado para a homogeneização de pequenos volumes de líquido. Igualmente, o processo de emulsificação em microfluidizador (Ml 10S Microfluidics machine, máximo de 50 passadas, por um período de 2 minutos na entrada de pressão máxima de 6 bar (pressão de saída de cerca de 850 bar)) pode ser adaptado pela pessoa habilitada na técnica para produzir volumes menores ou maiores de emulsão. A adaptação pode ser obtida pela experimentação de rotina que compreende a medição da emulsão resultante até que uma preparação fosse obtida com gotículas de óleo do diâmetro requerido.
Em uma emulsão de óleo em água, o óleo e emulsificador devem estar em um carreador aquoso. O carreador aquoso pode ser, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato. O tamanho das gotículas de óleo encontradas dentro do óleo estável na emulsão aquosa são preferivelmente menores do que 1 mícron, podem estar na faixa substancialmente de 30 a 600 nm, de modo preferivelmente substancial em tomo de 30 a 500 nm no diâmetro e de modo mais preferivelmente substancial de 150 a 500 nm no diâmetro e em particular de cerca de 150 nm no diâmetro como medido pela espectroscopia de correlação de fóton. A este respeito, 80% das gotículas de óleo em número devem estar dentro das faixas preferidas, mais preferivelmente mais do que 90% e o mais preferivelmente mais do que 95% das gotículas de óleo em número estão dentro das faixas de tamanho definidas. As quantidades dos componentes presentes nas emulsões oleosas da presente invenção estão convencionalmente na faixa de 0,5 a 20% ou 2 a 10% de óleo (do volume de dose total), tal como esqualeno; e quando presentes, de 2 a 10% de alfa tocoferol; e de 0,3 a 3% de tensoativo, tais como monooleato de polioxietileno sorbitano. Preferivelmente a razão de óleo (por exemplo esqualeno) :tocol (por exemplo α-tocoferol) é igual ou menor do que 1 visto que isto fornece uma emulsão mais estável. Um emulsificador, tal como Tween80 ou Span 85 também pode estar presente em um nível de cerca de 1%. Em alguns casos pode ser vantajoso que as vacinas da presente invenção contenham ainda um estabilizador.
Os exemplos de sistemas de emulsão preferidos são descritos na WO95/17210, WO99/11241 e WO99/12565 que divulgam adjuvantes de emulsão com base no esqualeno, α-tocoferol e TWEEN 80, opcionalmente formulada com os imunoestimulantes QS21 e/ou 3D-MPL. Assim em uma forma de realização particularmente preferida da presente invenção, o adjuvante da invenção pode adicionalmente compreender outros imunoestimulantes, tais como LPS ou derivados destes, e/ou saponinas. Os exemplos de outros imunoestimulantes são aqui descritos e em “Vaccine Design - The Subunity and Adjuvant Approach” 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds. Powell, M. F. e Newman, M. J., Plenum Press, Nova Iorque e Londres, ISBN 0-306-44867-X.
Em um aspecto preferido o adjuvante e as composições imunogênicas de acordo com a invenção compreendem uma saponina (preferivelmente QS21) e/ou um derivado de LPS (preferivelmente 3D-MPL) em uma emulsão oleosa descrita acima, opcionalmente com um esterol (preferivelmente colesterol). Adicionalmente a emulsão oleosa (preferivelmente emulsão de óleo em água) pode conter span 85 e/ou lecitina e/ou tricaprilina. Os adjuvantes que compreendem uma emulsão de óleo em água, um esterol e uma saponina são descritos na WO 99/12565.
Tipicamente para a administração humana a saponina (preferivelmente QS21) e/ou derivado de LPS (preferivelmente 3D-MPL) estarão presentes em uma dose humana da composição imunogênica na faixa de 1 pg a 200 pg, tal como 10 a 100 pg, preferivelmente de 10 pg a 50 pg por dose. Tipicamente a emulsão oleosa (preferivelmente emulsão de óleo em água) compreenderá de 2 a 10 % de óleo metabolizável. Preferivelmente a mesma compreenderá de 2 a 10 % de esqualeno, de 2 a 10 % de alfa tocoferol e de 0,3 a 3 % (preferivelmente 0,4 a 2 %) de emulsificador (preferivelmente tween 80 [monooleato de polioxietileno sorbitano]). Onde tanto esqualeno quanto alfa tocoferol estão presentes, preferivelmente a razão de esqualeno: alfa tocoferol é igual a ou menor do que 1 visto que isto fornece uma mais emulsões estáveis. Span 85 (Triolato de sorbitano) também podem estar presentes em um nível de 0,5 a 1 % nas emulsões usadas na invenção. Em alguns casos pode ser vantajoso que as composições imunogênicas e vacinas da presente invenção conterão ainda um estabilizador, por exemplo outros emulsificadores/tensoativos, incluindo o ácido caprílico (índice Merck 10a Edição, entrada na 1739), dos quais a Tricaprilina é particularmente preferida.
Onde esqualeno e uma saponina (preferivelmente QS21) são incluídos, é de benefício para também incluir um esterol (preferivelmente colesterol) para a formulação visto que isto permite uma redução no nível total de óleo na emulsão. Isto leva a um custo reduzido de fabricação, melhora do conforto global da vacinação e também melhorias qualitativas e quantitativas das respostas imunes resultantes, tais como produção de EFN-γ melhorada. Consequentemente, o sistema de adjuvante da presente invenção tipicamente compreende uma razão de óleo metabolizável: saponina (p/p) na faixa de 200:1 a 300:1, também a presente invenção pode ser usada em uma forma de “óleo baixo” a faixa preferida da qual é de 1:1 para 200:1, preferivelmente 20:1 a 100:1 e o mais preferivelmente de modo substancial 48:1, esta vacina retém as propriedades adjuvantes benéficas de todos os componentes, com um perfil de reatogenicidade muito reduzido. Consequentemente, as formas de realização particularmente preferidas têm uma razão de esqualeno:QS21 (p/p) na faixa de 1:1 a 250:1, também uma faixa preferida é de 20:1 a 200:1, preferivelmente 20:1 a 100:1 e o mais preferivelmente substancialmente 48:1. Preferivelmente um esterol (o mais preferivelmente colesterol) também é incluído presente a uma razão de saponina:esterol como aqui descrito.
Os sistemas de emulsão da presente invenção preferivelmente têm um tamanho de gotícula de óleo pequeno na faixa de sub-mícron. Mais Preferivelmente os tamanhos de gotícula de óleo estará na faixa de 120 a 750 nm ou de 120 a 600 nm no diâmetro.
Uma formulação adjuvante particularmente potente (para a combinação final com A1PO4 nas composições imunogênicas da invenção) envolve uma saponina (preferivelmente QS21), um derivado de LPS (preferivelmente 3D-MPL) e uma emulsão oleosa (preferivelmente esqualeno e alfa tocoferol em uma emulsão de óleo em água) como descrito na WO95/17210 ou na WO99/12565 (em particular formulação adjuvante 11 no Exemplo 2, Tabela 1).
Os exemplos de um agonista de TLR 2 incluem peptidoglicano ou lipoproteína. Imidazoquinolinas, tais como Imiquimod e Resiquimod são conhecido agonistas de TLR7. RNA de filamento único também é um agonista de TLR conhecido (TLR8 em seres humanos e TLR7 em camundongos), ao passo que RNA de filamento duplo e poli IC (ácido poliinosínico-policitidílico - um mimético sintético comercial de RNA viral) são exemplares de agonistas de TLR3. 3D-MPL é um exemplo de um agonista de TLR4 enquanto CPG é um exemplo de um agonista de TLR9. A composição imunogênica pode compreender um antígeno e um imunoestimulante absorvido em um sal metálico. As formulações de vacina com base em alumínio em que o antígeno e o imunoestimulante monofosforil lipídeo A 3-des-O-acilado (3D-MPL), são absorvidos na mesma partícula são descritas na EP 0 576 478 Bl, EP 0 689 454 BI e EP 0 633 784 Bl. Nestes casos então o antígeno é primeiro absorvido no sal de alumínio seguido pela absorção do imunoestimulante 3D-MPL nas mesmas partículas de sal de alumínio. Tais processos primeiro envolvem a suspensão de 3D-MPL pela sonificação em um banho de água até que as partículas atinjam um tamanho entre 80 e 500 nm. O antígeno é tipicamente absorvido em sal de alumínio por uma hora na temperatura ambiente sob agitação. A suspensão de 3D-MPL é depois adicionado ao antígeno absorvido e a formulação é incubada na temperatura ambiente por 1 hora e depois mantida a 4°C até o uso.
Em um outro processo, o imunoestimulante e o antígeno estão em partículas metálicas separadas, como descrito na EP 1126876. O processo melhorado compreende a absorção de imunoestimulante, em uma partícula de sal metálico, seguida pela absorção do antígeno em uma outra partícula de sal metálico, seguida pela mistura das partículas metálicas discretas para formar uma vacina. O adjuvante para o uso na presente invenção pode ser uma composição adjuvante que compreenda um imunoestimulante, absorvido em uma partícula de sal metálico, caracterizada em que a partícula de sal metálico é substancialmente livre de outro antígeno. Além disso, as vacinas são fornecidas pela presente invenção e são caracterizadas em que o imunoestimulante é absorvido em partículas de sal metálico que são substancialmente livres de outro antígeno e em que as partículas de sal metálico que são absorvidas no antígeno são substancialmente livres de outros imunoestimulantes.
Consequentemente, a presente invenção fornece uma formulação adjuvante que compreende imunoestimulantes que foram absorvidos em uma partícula de um sal metálico, caracterizado em que a composição é substancialmente livre de outro antígeno. Além disso, esta formulação adjuvante pode ser um intermediário que, se um tal adjuvante é usado, é requerido para a fabricação de uma vacina. Consequentemente é fornecido um processo para a fabricação de uma vacina que compreende misturar uma composição adjuvante que é um ou mais imunoestimulantes absorvido em uma partícula metal com um antígeno. Preferivelmente, o antígeno foi pré-absorvido em um sal metálico. O dito sal metálico pode ser idêntico ou similar ao sal metálico que é absorvido sobre o imunoestimulante. Preferivelmente o sal metálico é um sal de alumínio, por exemplo fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio. A presente invenção fornece ainda uma composição de vacina que compreende imunostimulante absorvido em uma primeira partícula de um sal metálico e antígeno absorvido em um sal metálico, caracterizada em que a primeira e segunda partículas de sal metálico são partículas separadas.
Derivados de LPS ou LOS ou mutações ou derivados de lipídeo A aqui descritos são planejados para serem menos tóxicos (por exemplo 3D-MPL) do que os lipopolissacarídeos nativos e são equivalentes intercambiáveis com respeito a qualquer uso destas porções aqui descritas. Estes podem ser ligandos de TLR4 como descrito acima. Outros de tais derivados são descritos na WO020786737, WO9850399, WO0134617, WO0212258, W003065806.
Em uma forma de realização o adjuvante usado para as composições da invenção compreendem um carreador de lipossoma (fabricado por técnicas conhecidas a partir de um fosfolipídeo (tal como dioleoil fosfatidil colina [DOPC]) e opcionalmente um esterol [tal como colesterol]). Tais carreadores de lipossoma podem carregar derivados de lipídeo A [tais como 3D-MPL - ver acima] e/ou saponinas (tais como QS21 -ver acima). Em uma forma de realização o adjuvante compreende (por dose de 0,5ml) de 0,1 a 10 mg, 0,2 a 7, 0,3 a 5, 0,4 a 2 ou 0,5 a 1 mg (por exemplo 0,4 a 0,6, 0,9 a 1,1, 0,5 ou 1 mg) de fosfolipídeo (por exemplo DOPC), de 0,025 a 2,5, 0,05 a 1,5, 0,075 a 0,75, 0,1 a 0,3 ou 0,125 a 0,25 mg (por exemplo de 0,2 a 0,3, 0,1 a 0,15, 0,25 ou 0,125 mg) esterol (por exemplo colesterol), 5 a 60, 10 a 50 ou 20 a 30 pg (por exemplo de 5 a 15, 40 a 50, 10, 20, 30, 40 ou 50 pg) derivado de lipídeo A (por exemplo 3D-MPL) e 5 a 60, 10 a 50 ou 20 a 30 pg (por exemplo 5 a 15, 40 a 50, 10, 20, 30, 40 ou 50 pg) de saponina (por exemplo QS21).
Este adjuvante é particularmente adequado para as formulações de vacina de idoso. Em uma forma de realização a composição de vacina que compreende este adjuvante compreende sacarídeos conjugados derivados de pelo menos todos os seguintes sorotipos:4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F (e também pode compreender um ou mais dos sorotipos 3, 6Α, 19Α e 22F), em que o título de anticorpo GMC induzido contra um ou mais (ou todos) os componentes de vacina 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F não é significantemente inferior a aquele induzido pela vacina Prevnar® em vacinados humanos.
Em uma forma de realização o adjuvante usado para as composições da invenção compreende uma emulsão de óleo em água fabricada a partir de um óleo metabolizável (tal como esqualeno), um emulsificador (tal como Tween 80) e opcionalmente um tocol (tal como alfa tocoferol). Em uma forma de realização o adjuvante compreende (por dose de 0,5ml) 0,5 a 15, 1 a 13, 2 a 11, 4 a 8 ou 5 a 6 mg (por exemplo 2 a 3, 5 a 6 ou 10 a 11 mg) de óleo metabolizável (tal como esqualeno), 0,1 a 10, 0,3 a 8, 0,6 a 6, 0,9 a 5, 1 a4ou2 a3 mg (por exemplo 0,9 a 1,1, 2 a 3 ou 4 a 5 mg) de emulsificador (tal como Tween 80) e opcionalmente de 0,5 a 20, 1 a 15, 2 a 12, 4 a 10, 5 a 7 mg (por exemplo llal3, 5 a 6 ou 2 a 3 mg) de tocol (tal como alfa tocoferol).
Este adjuvante pode opcionalmente compreender ainda 5 a 60, 10 a 50 ou 20 a 30 pg (por exemplo de 5 a 15, 40 a 50, 10, 20, 30, 40 ou 50 mg) de derivado de lipídeo A (por exemplo 3D-MPL).
Estes adjuvantes são particularmente adequados para as formulações de vacina de criança ou idoso. Em uma forma de realização a composição de vacina que compreende este adjuvante compreende conjugados de sacarídeo derivados de pelo menos todos os seguintes sorotipos:4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F (e também pode compreender um ou mais dos sorotipos 3, 6A, 19A e 22F), em que o título de anticorpo GMC induzido contra um ou mais (ou todos) os componentes de vacina 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F não é significantemente inferior a aquele induzida pela vacina Prevnar® em vacinados humanos.
Este adjuvante pode opcionalmente conter de 0,025 a 2,5, 0,05 a 1,5, 0,075 a 0,75, 0,1 a 0,3 ou 0,125 a 0,25 mg (por exemplo 0,2 a 0,3, 0,1 a 0,15, 0,25 ou 0,125 mg) de esterol (por exemplo colesterol), 5 a 60, 10 a 50 ou 20 a 30 pg (por exemplo 5 a 15, 40 a 50, 10, 20, 30, 40 ou 50 pg) de derivado de lipídeo A (por exemplo, 3D-MPL) e 5 a 60, 10 a 50 ou 20 a 30 pg (por exemplo 5 a 15, 40 a 50, 10, 20, 30, 40 ou 50 [por exemplo, saponina (por exemplo QS21).
Este adjuvante é particularmente adequado para as formulações de vacina de idoso. Em uma forma de realização a composição de vacina que compreende este adjuvante compreende conjugados de sacarídeo derivados de pelo menos todos os seguintes sorotipos:4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F (e também pode compreender um ou mais dos sorotipos 3, 6A, 19A e 22F), em que o título de anticorpo GMC induzido contra um ou mais (ou todos) os componentes de vacina 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F não é significantemente inferior a aquele induzido pela vacina Prevnar® em vacinados humanos.
Em uma forma de realização o adjuvante usado para as composições da invenção compreendem fosfato de alumínio e um derivado de lipídeo A (tal como 3D-MPL). Este adjuvante pode compreender (por dose de 0,5ml) de 100-750, 200-500, ou 300-400 pg de Al como fosfato de alumínio e 5-60, 10-50 ou 20-30 pg (por exemplo 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50 pg) de derivado de lipídeo A (por exemplo 3D-MPL).
Este adjuvante é particularmente adequado para formulações de vacina de idoso ou criança. Em uma forma de realização a composição de vacina que compreende este adjuvante compreende conjugados de sacarídeo derivados de pelo menos todos os seguintes sorotipos:4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F (e também podem compreender um ou mais dos sorotipos 3, 6A, 19A e 22F), em que o título de anticorpo GMC induzido contra um ou mais (ou todos) os componentes de vacina 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F não é significantemente inferior a aquele induzido pela vacina Prevnar® em vacinados humanos.
As preparações de vacina contendo composições imunogênicas da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um mamífero suscetíveis à infecção, por meio da administração da dita vacina por intermédio da via sistêmica ou mucósica. Estas administrações podem incluir a injeção por intermédio das vias intramusculares (IM), intraperitoneais (IP), intradérmicas (ED) ou subcutâneas (SC); ou por intermédio da administração mucósica aos tratos oral/alimentar, respiratório, genitourinário. A administração intranasal (IN) das vacinas para o tratamento de pneumonia ou otite média é possível (visto que a portabilidade nasofaríngea depneumococos pode ser mais eficazmente impedido, atenuando assim a infecção no seu estágio mais inicial). Embora a vacina da invenção possa ser administrada como uma dose única, seus componentes também podem ser co-administrados juntos ao mesmo tempo ou em tempos diferentes (por exemplo conjugados de sacarídeo pneumocócicos podem ser administrados separadamente, ao mesmo tempo ou 1 a 2 semanas depois da administração de qualquer componente de proteína bacteriana da vacina para a coordenação ótima das respostas imunes com respeito a cada um). Para a co-administração, o adjuvante Thl opcional pode estar presente em qualquer ou todas as administrações diferentes. Além de uma via única de administração, 2 vias diferentes de administração podem ser usadas. Por exemplo, sacarídeos ou conjugados de sacarídeo podem ser administrados IM (ou ID) e as proteínas bacterianas podem ser administradas IN (ou ID). Além disso, as vacinas da invenção podem ser administradas IM para as doses de preparação e IN para as doses de reforço. O teor de antígenos de proteína na vacina tipicamente estará na faixa de 1 a 100 pg, preferivelmente de 5 a 50 pg, por exemplo na faixa de 5 a 25 pg. A seguir de uma vacinação inicial, os pacientes podem receber uma ou várias imunizações de reforço adequadamente espaçadas. A preparação de vacina é no geral descrita em Vaccine Design (“The subunity and adjuvant approach” (eds Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press Nova Iorque). A encapsulação dentro de lipossomas é descrita por Fullerton, Patente US 4.235.877.
As vacinas da presente invenção podem ser armazenadas em solução ou liofilizado. Preferivelmente a solução é liofilizado na presença de um açúcar tal como sacarose ou lactose. É ainda mais preferível que eles sejam liofilizados e extemporaneamente reconstituído antes do uso. A liofilização pode resultar em uma composição (vacina) mais estável e pode possivelmente levar a títulos de anticorpo mais altos na presença de 3D-MPL e na ausência de um adjuvante com base em alumínio.
Em um aspecto da invenção é fornecido um kit de vacina, que compreende um frasco contendo uma composição imunogênica da invenção, opcionalmente na forma liofilizada e compreende ainda um frasco contendo um adjuvante como aqui descrito. E previsto que neste aspecto da invenção, o adjuvante será usado para reconstituir a composição imunogênica liofilizada.
Embora as vacinas da presente invenção possam ser administradas por qualquer via, a administração das vacinas descritas na pele (ID) forma uma forma de realização da presente invenção. A pele humana compreende uma cutícula “córnea” externa, chamada de estrato córneo, que reveste a epiderme. Por debaixo desta epiderme está uma camada chamada derme, que por sua vez reveste o tecido subcutâneo. Pesquisadores têm mostrado que a injeção de uma vacina na pele e em particular na derme, estimula uma resposta imune, que também pode estar associada com várias vantagens adicionais. A vacinação intradérmica com as vacinas aqui descrita forma uma característica opcional da presente invenção. A técnica convencional de injeção intradérmica, o “procedimento Mantoux”, compreende as etapas de limpar a pele e depois esticar com uma mão e com o chanfro de uma agulha de calibre estreito (calibre 26 a 31) voltando para cima a agulha é inserida em um ângulo entre 10 e 15°. Uma vez que o chanfro da agulha é inserido, o corpo da agulha é abaixado e avançado ainda mais enquanto se fornece uma leve pressão para elevá-la sob a pele. O líquido é depois injetado muito lentamente formando deste modo uma bolha ou inchação na superfície da pele, seguida pela retirada lenta da agulha.
Mais recentemente, os dispositivos que são especificamente planejados para administrar agentes líquidos na ou através da pele foram descritos, por exemplo os dispositivos descritos na WO99/34850 e EP 1092444, também os dispositivos de injeção de jato descritos por exemplo na WOOl/13977, US 5.480.381, US 5.599.302, US 5.334.144, US 5.993.412, US 5.649.912, US 5.569.189, US 5.704.911, US 5.383.851, US 5.893.397, US 5.466.220, US 5.339.163, US 5.312.335, US 5.503.627, US 5.064.413, US 5.520, 639, US 4.596.556, US 4.790.824, US 4.941.880, US 4.940.460, WO97/37705 e WO97/13537. Métodos alternativos de administração intradérmica das preparações de vacina podem incluir seringas e agulhas convencionais ou dispositivos planejados para a liberação balística de vacinas sólidas (WO99/27961) ou emplastros transdérmicos (WO97/48440; WO98/28037); ou aplicadas à superfície da pele (liberação transdérmica ou transcutânea WO98/20734; WO98/28037).
Quando as vacinas da presente invenção devam ser administradas à pele ou mais especificamente na derme, a vacina está em um volume de líquido baixo, particularmente um volume entre cerca de 0,05ml e 0,2ml. O teor de antígenos nas vacinas na pele ou intradérmicas da presente invenção pode ser similar às doses convencionais como encontrado nas vacinas intramusculares (ver acima). Entretanto, é uma característica das vacinas na pele ou intradérmicas que as formulações podem ser de “dose baixa”. Consequentemente os antígenos de proteína em vacinas de “dose baixa” estão preferivelmente presentes em tão pouco quanto 0,1 a 10 pg ou preferivelmente 0,1 a 5 mg por dose; e os antígenos de sacarídeo (preferivelmente conjugados) podem estar presentes na faixa de 0,01 a 1 pge preferivelmente entre 0,01 e 0,5 pg de sacarídeo por dose.
Como aqui usado, o termo “liberação intradérmica” significa liberação da vacina à região da derme na pele. Entretanto, a vacina necessariamente não será localizada exclusivamente na derme. A derme é a camada na pele localizada entre cerca de 1,0 e cerca de 2,0 mm da superfície na pele humana, mas existe uma certa quantidade de variação entre os indivíduos e em partes diferentes do corpo. No geral, pode ser esperado atingir a derme indo-se 1,5 mm abaixo da superfície da pele, a derme está localizada entre o estrato córneo e a epiderme na superfície e na camada subcutânea abaixo. Dependendo do modo de liberação, a vacina pode por fim estar localizada única ou primariamente dentro da derme ou pode por fim ser distribuída dentro da epiderme e da derme. A presente invenção fornece ainda uma vacina melhorada para a prevenção ou melhora da Otite média causada pela Haemophilus influenzae pela adição de proteínas da Haemophilus influenzae, por exemplo proteína D na forma conjugada. Além disso, a presente invenção fornece ainda uma vacina melhorada para a prevenção ou melhora da infecção pneumocócica em crianças (por exemplo, Otite média), contando-se com a adição de uma ou duas proteínas pneumocócicas como proteína livre ou conjugada às composições de conjugado de 5. pneumoniae da invenção. As ditas proteínas pneumocócicas livres podem ser as mesmas ou diferentes a qualquer proteína de S. pneumoniae usada como proteínas carreadoras. Um ou mais antígenos de proteína de Moraxella catarrhalis também podem ser incluídos na vacina de combinação em uma forma livre ou conjugada. Assim, a presente invenção é um método melhorado para evocar uma resposta imune (protetora) contra a Otite média em crianças.
Em uma outra forma de realização, a presente invenção é um método melhorado para evocar uma resposta imune (protetora) em crianças (definidas como de 0 a 2 anos de idade no contexto da presente invenção) pela administração de uma quantidade segura e eficaz da vacina da invenção [uma vacina pediátrica]. Outras formas de realização da presente invenção incluem o fornecimento das composições de conjugado de S. pneumoniae antigênicas da invenção para o uso na medicina e o uso dos conjugados de S. pneumoniae da invenção na fabricação de um medicamento para a prevenção (ou tratamento) de doença pneumocócica.
Em uma outra forma de realização, a presente invenção é um método melhorado para evocar uma resposta imune (protetora) na população idosa (no contexto da presente invenção um paciente é considerado idoso se ele têm 50 anos ou acima em idade, tipicamente acima de 55 anos e mais no geral acima de 60 anos) pela administração de uma quantidade segura e eficaz da vacina da invenção, preferivelmente em conjunção com uma ou das proteínas de S. pneumoniae presentes como proteína livre ou conjugada, proteínas de S. pneumoniae livres estas que podem ser as mesmas ou diferentes como qualquer proteínas de S. pneumoniae usadas como proteínas carreadoras.
Um outro aspecto da invenção é um método de imunizar um hospedeiro humano contra a doença causada pela infecção pela S. pneumoniae e opcionalmente Haemophilus influenzae que compreende administrar ao hospedeiro uma dose imunoprotetora da composição imunogênica ou vacina ou kit da invenção.
Um outro aspecto da invenção é uma composição imunogênica da invenção para o uso no tratamento ou prevenção de doença causada pela infecção pela S. pneumoniae e opcionalmente Haemophilus influenzae.
Um outro aspecto da invenção é o uso da composição imunogênica ou vacina ou kit da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doenças causadas pela infecção pela S. pneumoniae e opcionalmente Haemophilus influenzae.
Os termos “compreendendo”, “compreendem” e “compreende” são aqui intencionados pelos inventores a serem opcionalmente substituíveis com os termos “consistindo de”, “consistem de” e “consiste de”, respectivamente, em cada caso.
As formas de realização que aqui dizem respeito às “composições de vacina” da invenção também são aplicáveis às formas de realização que dizem respeito às “composições imunogênicas” da invenção e vice versa.
Todas as referências ou pedidos de patente citadas dentro deste relatório descritivo de patente são aqui incorporados por referência.
De modo que esta invenção possa ser melhor entendida, os seguintes exemplos são apresentados. Estes exemplos são apenas para os propósitos de ilustração e não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção de nenhuma maneira.
Exemplos Exemplo 1 :EXPRESSÃO DA PROTEÍNA D
Proteína D de Haemophilus influenzae Construção genética para a expressão da proteína D
Materiais de partida O DNA que codifica a proteína D A Proteína D é altamente conservada entre H influenzae de todos os sorotipos e cepas não tipáveis. O vetor pHIC348 contendo a sequência de DNA que codifica o gene da proteína D inteiro foi obtido do Dr. A. Forsgren, Department of Medical Microbiology, University of Lund, Malmo General Hospital, Malmo, Suécia. A sequência de DNA da proteína D foi publicada por Janson et al. (1991) Infect. Immun. 59:119125. O vetor de expressão vector p MG1 O vetor de expressão p MG1 é um derivado de pBR322 (Gross et al., 1985) em que os elementos de controle derivados do bacteriofago A para a transcrição e tradução de genes inseridos estranhos foram introduzidos (Shatzman et al., 1983). Além disso, o gene de resistência à Ampicilina foi trocado com o gene da resistência à Canamicina. A cepa AR58 da E. coli A cepa AR58 da E. coli foi gerada pela transdução de N99 com um estoque de fago Pl previamente cultivada em um derivado de SA500 (galE::TN10, lambdaKif cl857 AH1). N99 e SA500 são cepas K12 da E. coli derivada do laboratório do Dr. Martin Rosenberg no National Institute of Health. O vetor de expressão p MG1 Para a produção de proteína D, o DNA que codifica a proteína foi clonado no vetor de expressão p MG 1. Este plasmídeo utiliza sinais de DNA de fago lambda para direcionar a transcrição e tradução de genes estranhos inseridos. O vetor contém o promotor PL, operador OL e dois sítios de utilização (NutL e NutR) para aliviar os efeitos de polaridade transcricional quando a proteína N é fornecida (Gross et al., 1985). Os vetores contendo o promotor PL, são introduzidos em um hospedeiro lisogênico da E. coli para estabilizar o DNA plasmídico. As cepas hospedeiras lisogênicas contêm DNA de fago lambda defeituoso na replicação integrado no genoma (Shatzman et al., 1983). O DNA de fago lambda cromossômico direciona a síntese da proteína repressora cl que se liga ao repressor OL do vetor e impede a ligação da RNA polimerase ao promotor PL e por meio deste a transcrição do gene inserido. O gene cl da cepa de expressão AR58 contém um mutante sensível à temperatura de modo que a transcrição direcionada a PL pode ser regulada pela mudança de temperatura, isto é, um aumento na temperatura da cultura inativa o repressor e a síntese da proteína estranha é iniciada. Este sistema de expressão permite a síntese controlada de proteínas estranhas especialmente daquelas que podem ser tóxicas para a célula (Shimataka & Rosenberg, 1981). A cepa AR58 da E. coli A cepa da E. coli AR58 lisogênica usada para a produção do carreador da proteína D é um derivado da NIH E. coli Kl2 cepa N99 padrão (F su' galK2, lacZ' thr'). Ela contém um fago lambda lisogênico defeituoso (galE::TN10, lambdaKil' cl857 AH1). O fenótipo Kil' impede a parada da síntese macromolecular do hospedeiro. A mutação cl857 confere uma lesão sensível à temperatura ao repressor ci. A deleção de 8.H1 remove o operon direito de fago lambda e os locais bio, uvr3 e chlA hospedeiros. A cepa AR58 foi gerada pela transdução de N99 com um estoque de fago Pl previamente cultivado em um derivado de SA500 (galE::TN10, lambdaKil' cl857 AH1). A introdução do lisogênio defeituoso em N99 foi selecionado com tetraciclina em virtude da presença de um transposon TN10 que codifica a resistência à tetraciclina no gene galE adjacente.
Construção de vetor p MGMDPPrD O vetor p MG 1 que contém o gene que codifica a proteína S1 não estrutural do vírus da influenza (p MGNSI) foi usado para construir p MGMDPPrD. O gene da proteína D foi amplificado pela PCR a partir do vetor pHIC348 (Janson et al. 1991 Infect. Immun. 59:119-125) com os preparadores da PCR contendo os sítios de restrição Ncol e Xbal nas extremidades 5’ e 3’, respectivamente. O fragmento Ncol/Xbal foi depois introduzido em p MGNSI entre Ncol e Xbal criando assim uma proteína de fusão contendo os 81 aminoácidos do terminal N da proteína NS1 seguida pela proteína PD. Este vetor foi rotulado p MGNSI PrD. Com base na construção descrita acima a construção final para a expressão da proteína D foi gerada. Um fragmento BamHI/BamHI foi removido da p MGNSI PrD. Esta hidrólise de DNA remove a região codificadora NS1, exceto para os primeiros três resíduos de terminal N. Na religa do vetor um gene que codifica uma proteína de fusão com a sequência mostrada na WO07/71711, exemplo 1, página 44 é gerada. A proteína D não contém um peptídeo líder ou a cisteína de terminal N à qual as cadeias de lipídeo são normalmente ligadas. A proteína portanto não é excretada nem no periplasma nem lipidada e permanece no citoplasma em uma forma solúvel. A construção final p MG-MDPPrD foi introduzida na cepa hospedeira AR58 pelo choque térmico a 37°C. O plasmídeo contendo bactérias foi selecionado na presença de Canamicina. A presença do inserto de DNA que codifica a proteína D foi demonstrada pela digestão de DNA plasmídeo isolado com endonucleases selecionadas. A cepa da E. coli recombinante é indicada como ECD4. A expressão da proteína D está sob o controle do promotor PL lambda / Operador OL. A cepa hospedeira AR58 contém um gene cl sensível à temperatura no genoma que bloqueia a expressão de PL lambda na temperatura baixa pela ligação a OL. Uma vez que a temperatura é elevada cl é liberado de Ol e a proteína D é expressada.
Preparação em escala pequena No final da fermentação as células são concentradas e congeladas. A extração das células colhidas e a purificação da proteína D foi realizada como segue. A pelota da cultura de célula congelada é descongelada e recolocada em suspensão em uma solução de rompimento de célula (tampão de Citrato pH 6,0) a uma OD650 final 60. A suspensão é passada duas vez através de um homogeneizador de alta pressão em P = 1000 barra. O homogeneizado de cultura de célula é clarificado pela centrifugação e os fragmentos de célula é removido pela filtração. Na primeira etapa de purificação o lisado filtrado é aplicado a uma coluna de cromatografia de troca de cátion (SP Sepharose Fast Flow). PD liga-se à matriz de gel pela interação iônica e é eluído por um aumento escalonado da concentração iônica do tampão de eluição.
Em uma segunda etapa de purificação as impurezas são retidas em uma matriz de troca aniônica (Q Sepharose Fast Flow). PD não se liga no gel e pode ser coletado no fluxo.
Em ambas as etapas de cromatografia de coluna a coleta de fração é monitorada pela OD. O fluxo da cromatografia de troca aniônica contendo a proteína D purificada é concentrado pela ultrafiltração. A proteína D contendo o retido da ultrafiltração é finalmente passada através de uma membrana de 0,2 pm.
Preparação em larga escala A extração das células colhidas e a purificação da proteína D foi realizada como segue. O caldo de colheita é esfriado e diretamente passado duas vezes através de um homogeneizador de alta pressão a uma pressão em tomo de 800 bar.
Na primeira etapa de purificação o homogeneizado de cultura de célula é diluído e aplicado a uma coluna de cromatografia de troca de cátion (pérolas SP Sepharose Big). PD liga-se à matriz do gel pela interação iônica e é eluído por um aumento escalonado da concentração iônica do tampão de eluição e filtrado.
Em uma segunda etapa de purificação as impurezas são retidas em uma matriz de troca aniônica (Q Sepharose Fast Flow). PD não se liga no gel e pode ser coletado no fluxo.
Em ambas as etapas de cromatografia de coluna a coleta de fração é monitorada pela OD. O fluxo através da cromatografia de coluna de troca aniônica contendo a proteína D purificada é concentrada e diafiltrada pela ultrafiltração. A proteína D contendo o retido da ultrafiltração é finalmente passada através de uma membrana de 0,2 pm.
Exemplo 1 b: EXPRESSÃO DE PhtD A proteína PhtD é um membro da família de proteína da tríade da histidina pneumocócica (Pht) caracterizada pela presença de tríades de histidina (motivo HXXHXH). PhtD é uma molécula de 838 aminoácidos e carrega 5 tríades de histidina (ver Medlmmune WOOO/37105 SEQ ID NO:4 para a sequência de aminoácido e SEQ ID NO:5 para a sequência de DNA). PhtD também contém uma região rica em prolina no centro (posição de aminoácido 348-380). PhtD tem uma sequência de sinal de terminal N de 20 aminoácidos com um motivo LXXC.
Construção genética A sequência de gene da proteína Medlmmune PhtD madura (do aminoácido 21 ao aminoácido 838) foi transferida recombinantemente para a E. coli usando o vetor pTCMP14 caseiro que carrega o promotor pX. A cepa hospedeira da E. coli é AR58, que carrega o repressor termossensível cI857, que permite a indução de calor do promotor.
A reação da cadeia da polimerase foi realizada para amplificar o gene phtD de um plasmídeo Medlmmune (que carrega o gene phtD da cepa Norway 4 de Streptococcus. pneumoniae (sorotipo 4) - SEQ ID NO:5 como descrito na WOOO/37105). Os preparadores, específicos apenas para o gene phtD, foram usados para amplificar o gene phtD em dois fragmentos. Os preparadores carregam os sítios de restrição Ndel e Kpnl ou o Kpnl e Xbal. Estes preparadores não hibridizam com nenhum nucleotídeo do vetor mas apenas com sequências de gene específicas de phtD. Um códon de partida ATG artificial foi inserido usando o primeiro preparador que carrega o sítio de restrição NdeL Os produtos de PCR gerados foram depois inseridos no vetor de clonagem pGEM-T (Promega) e a sequência de DNA foi confirmada. A subclonagem dos fragmentos no vetor de expressão TCMP14 foi depois realizado usando técnicas padrão e o vetor foi transformado ná E. coli AR58. Purificação de PhtD A purificação de PhtD é obtido como segue: α Cultivo de células de E. coli na presença de Canamicina: cultivar 30 horas a 30°C depois da indução por 18 horas a 39,5°C D Ruptura das células de E. coli da cultura inteira na OD ±115 na presença de EDTA 5mM e PMSF 2mM como inibidores da protease: Rannie, 2 passagens, 1000 bar.
D Captura de antígeno e remoção de fragmentos de células na cromatografia Streamline Q XL no modo de leito expandido na temperatura ambiente (20°C); a coluna é lavada com NaCl 150mM + Empigen 0,25% pH 6,5 e eluída com NaCl 400mM ± Empigen 0,25% em tampão de fosfato de potássio 25mM pH 7,4. ° Filtração em cartucho Sartobran 150 (0,45 ± 0,2 pm) ° Ligação do antígeno na cromatografia de Sepharose FF IMAC de Quelação de Zn/ ’ no pH 7,4 na presença de 5mM de imidazol a 4°C; a coluna é lavada com Imidazol 5mM e Empigen 1% e eluída com 50mM de imidazol, ambos em tampão de fosfato de potássio a 258mM pH 8,0. ° Cromatografia de troca de ânion fraco no modo positivo em Fractogel EMD DEAE no pH 8,0 (fosfato de potássio 25mM) a 4°C; a coluna é lavada com 140mM de NaCl e eluída em 200mM de NaCl enquanto os contaminantes (proteínas e DNA) permanecem absorvidos no trocador. D Concentração e ultrafiltração com 2mM de fosfato de Na/K pH 7,15 em membrana de 50kDa. ° Filtração de esterilização do grosso purificado em um cartucho de filtração de 0,2 pm Millipak-20.
Exemplo lc: EXPRESSÃO DE PNEUMOLISINA A pneumolisina pneumocócica foi preparada e destoxificada como descrito na W02004/081515 e W02006/032499.
Exemplo 2: Preparação de conjugados É bem conhecido na técnica como fabricar polissacarídeos pneumocócicos purificados. Para os propósitos destes exemplos os polissacarídeos foram fabricados essencialmente como descrito na EP072513 ou pelos métodos intimamente relacionados. Antes da conjugação os polissacarídeos podem ser dimensionados pela microfluidização como descrito abaixo.
As condições de ativação e ligação são específicas para cada polissacarídeo. Estas são dadas na Tabela 1. O polissacarídeo classificado (exceto para PS5, 6B e 23F) foi dissolvido em NaCl 2 M, NaCl 0,2 M ou em água para injeção (WFI). A concentração de polissacarídeo ótimo foi avaliada para todos os sorotipos. Todos os sorotipos exceto sorotipo 18C foram conjugados diretamente com a proteína carreadora como detalhado abaixo. Dois conjugados de sorotipo 22F alternativos foram fabricados; um diretamente conjugado, um através de um ligador ADH. A partir de uma solução de estoque de 100 mg/ml em acetonitrila ou solução de acetonitrila/água 50%/50%, CDAP (razão de CDAP/PS 0,5 a 1,5 mg/ mg de PS) foi adicionado à solução de polissacarídeo. 1,5 minuto mais tarde, NaOH 0,2 M a 0,3 M foi adicionado para se obter o pH de ativação específico. A ativação do polissacarídeo foi realizada neste pH durante 3 minutos a 25°C. A proteína purificada (proteína D, PhtD, pneumolisina ou DT) (a quantidade depende da razão de PS inicial/proteína carreadora) foi adicionada ao polissacarídeo ativado e a reação de ligação foi realizada no pH específico por até 2 horas (dependendo do sorotipo) sob regulagem de pH. De modo a extinguir grupos de éster de cianato não reagidos, uma solução 2 M de glicina foi depois adicionada à mistura. O pH foi ajustado ao pH de extinção (pH 9,0). A solução foi agitada por 30 minutos a 25°C e depois durante a noite de 2 a 8°C com agitação lenta contínua. Preparação de 18C: 18C foi ligada com a proteína carreadora por intermédio de um ligador - Diidrazida de Ácido Adípico (ADH). O polissacarídeo sorotipo 18C foi microfluidizado antes da conjugação.
Derivação de toxóide do tétano com EDAC
Para a derivação do toxóide do tétano, TT purificada foi diluída a 25 mg/ml em NaCl 0,2 Meo espaçador ADH foi adicionado de modo a atingir uma concentração final de 0,2 M. Quando a dissolução do espaçador foi completa, o pH foi ajustado a 6,2. EDAC (l-etil-3-(3- dimetil-aminopropil) carbodiimida) foi depois adicionado para atingir uma concentração final de 0,02 Mea mistura foi agitada por 1 hora sob regulagem de pH. A reação de condensação' foi interrompida pelo aumento do pH até 9,0 por pelo menos 30 minutos a 25°C. O TT derivado foi depois diafiltrado (membrana CO de lOkDa) de modo a remover ADH e reagente EDAC residuais. O grosso de TTah foi finalmente filtrado estéril até a etapa de ligação e armazenado a -70°C.
Ligação química de TTah ao PS 18C
Os detalhes dos parâmetros de conjugação podem ser encontrados na Tabela 1. 2 gramas de PS microfluidizado foram diluídos na concentração definida em água e ajustado para NaCl 2 M pela adição de pó de NaCl. A solução de CDAP (100 mg/ml recém preparados em 50/50 v/v acetonitrila/WFI) foi adicionada para atingir a razão de CDAP/PS apropriada. O pH foi elevado até a ativação no pH 9,0 pela adição de 0,3 M de NaOH e foi estabilizado neste pH até a adição de TTAH.
Depois de 3 minutos, TTah derivada (20 mg/ml em NaCl 0,2 M) foi adicionada para atingir uma razão de TTah/PS de 2; o pH foi regulado para o pH de ligação de 9,0. A solução foi deixada uma hora sob a regulagem do pH.
Para extinguir, uma solução 2 M de glicina, foi adicionada à mistura de PS/TTAH/CDAP. O pH foi ajustado ao pH de extinção (pH 9,0). A solução foi agitada por 30 min a 25°C e depois deixada durante a noite de 2 a 8°C com agitação lenta contínua.
Conjugado PS22FAH-PhtD
Em um segundo método de conjugação para este sacarídeo (o primeiro sendo o método de conjugação de PS22-PhtD direto mostrado na Tabela 1), 22F foi ligado com a proteína carreadora por intermédio de um ligador - Diidrazida de Ácido Adípico (ADH). O polissacarídeo sorotipo 22F foi microfluidizado antes da conjugação.
Derivação de PS 22F A ativação e ligação são realizadas a 25°C sob agitação contínua em um banho de água controlado na temperatura. PS22F microfluidizado foi diluído para se obter uma concentração de PS final de 6 mg/ml em NaCl 0,2 M e a solução foi ajustada ao pH 6,05 ± 0,2 com HCl 0,1 N. A solução de CDAP (100 mg/ml recém preparados em acetonitrila/WFI, 50/50) foi adicionada para atingir a razão de CDAP/PS apropriada (1,5/1 p/p). O pH foi elevado até o pH de ativação de 9,00 ± 0,05 pela adição de NaOH 0,5 M e foi estabilizado neste pH até a adição de ADH.
Depois de 3 minutos, ADH foi adicionado para atingir a razão de ADH/PS apropriada (8,9/1 p/p); o pH foi regulado ao pH de ligação de 9,0. A solução foi deixada por 1 hora sob a regulagem do pH. O derivado de PSah foi concentrado e diafiltrado.
Ligação PhtD a 10 mg/ml em NaCl 0,2 M foi adicionado ao derivado de PS22Fah de modo a atingir uma razão de PhtD/PS22FAH de 4/1 (p/p). O pH foi ajustado a 5,0 ± 0,05 com HCl. A solução de EDAC (20 mg/ml em Tris-HCl 0,1 M pH 7,5) foi adicionada manualmente em 10 min (250 μΐ / min) para atingir 1 mg de EDAC/ mg de PS22Fah· A solução resultante foi incubada por 150 min (embora 60 mins também fosse usado) a 25°C sob agitação e regulagem do pH. A solução foi neutralizada pela adição de Tris-HCl 1 M pH 7,5 (1/10 do volume final) e deixado 30 min a 25°C.
Antes da eluição em Sephacril S400HR, o conjugado foi clarificado usando um filtro Minisart de 5 pm. O conjugado resultante tem uma razão de PhtD/PS final de 4,1 (p/p), um teor de PS livre abaixo de 1% e uma antigenicidade (α-PS/a-PS) de 36,3% e antigenicidade anti-PhtD de 7,4%. A razão de proteína e polissacarídeo foi medida usando os métodos de Lowry e Resorcinol e a antigenicidade foi determinada usando ELISA intercalado.
Purificação dos conjugados: Os conjugados foram purificados pela filtração em gel usando uma coluna de filtração em gel Sephacril S400HR equilibrada com NaCl 0,15 M (S500HR para 18C) para remover moléculas pequenas (incluindo DMAP) e PS não conjugada e proteína. Com base nos tamanhos moleculares diferentes dos componentes de reação, os conjugados PS-PD, PS-TT, PS-PhtD, PS-pneumolisina ou PS-DT são eluídos primeiro, seguidos pelo PS livre, depois pelo PD livre ou DT livre e finalmente DMAP e outros sais (NaCl, glicina).
As frações contendo conjugados são detectadas pela UV2so nm· As frações são reunidas de acordo com seu kD, filtrados estéril (0,22 μιη) e armazenada a +2 a 8°C. As razões de PS/Proteína nas preparações de conjugado foram determinadas.
Condições de ativação/ligação/extinção específicas de conjugados de PS de S. pneumoniae-Proteínas D/TT/DTZPhtD/Ply Onde “qfluid” aparece em um cabeçalho de coluna, o mesmo indica que o sacarídeo foi dimensionado pela microfluidização antes da conjugação. Os tamanhos de sacarídeos a seguir da microfluidização são dados na tabela 2.
Tabela 1 Condições de ativação/ligação/extinção específicas de conjugados de PS de S. pneumoniae-Proteínas D/TT/DT/PhtD/Ply Nota:pHa,c,q corresponde ao pH para ativação, ligação e extinção, respectivamente Caracterização: Cada conjugado foi caracterizado e atinge as especificações descritas na Tabela 2. O teor de polissacarídeo (pg/ml) foi medido pelo teste do Resorcinol e o teor de proteína (pg/ml) pelo teste de Lowry. A razão PS/PD final (p/p) é determinada pela razão das concentrações.
Teor de polissacarídeo livre (%): O teor de polissacarídeo livre de conjugados mantidos a 4°C ou armazenados 7 dias a 37°C foi determinado no sobrenadante obtido depois da incubação com anticorpos da proteína carreadora α e sulfato de amônio saturado, seguida por uma centrifugação.
Um ELISA α-PS/a-PS foi usado para a quantificação de polissacarídeo livre no sobrenadante. A ausência de conjugado foi também controlada por um ELISA de proteína carreadora α/α-PS.
Antigenicidade: The antigenicidade nos mesmos conjugados foi analisada em um ELISA tipo intercalado em que a captura e a detecção de anticorpos foram α-PS e α-Proteína respectivamente.
Teor de proteína livre (%): A proteína carreadora não conjugada pode ser separada da conjugada durante a etapa de purificação. O teor de proteína residual livre foi determinado usando a cromatografia de exclusão de tamanho (TSK 5000-PWXL) seguida pela detecção UV (214 nm). As condições de eluição permitiram separar a proteína carreadora livre e o conjugado. O teor de proteína livre nos volumes conjugados foi depois determinado versus uma curva de calibração (de 0 a 50 pg/ml de proteína carreadora). A proteína carreadora livre em % foi obtida como segue: % de carreador livre = (carreador livre (pg/ml)/ (Concentração total de proteína carreadora correspondente medida por Lowry (pg/ml) * 100%). Estabilidade: A distribuição de peso molecular (Kav) e estabilidade foram medidos em uma filtração em gel HPLC-SEC (TSK 5000-PWXL) para os conjugados mantidos a 4°C e armazenados por 7 dias a 37°C. A caracterização 10/11/13/14-valentes é dada na Tabela 2 (ver comentário abaixo desta).
Os conjugados de proteína podem ser absorvidos em fosfato de alumínio e reunidos para formar a vacina final. TABELA 2 - Características dos conjugados_______________________________________ * tamanho do PS a seguir da microfluidização do PS nativo *** polissacarídeo não dimensionado ND - não determinado Uma vacina 10 valente foi fabricada misturando-se conjugados de sorotipo 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F (por exemplo em uma dose de 1,3, 1, 1, 1, 1, 1,3, 3, 1 pg de sacarídeo, respectivamente por dose humana). Uma vacina 11 valente foi fabricada pela adição adicional do conjugado de sorotipo 3 da Tabela 5 (por exemplo a 1 pg de sacarídeo por dose humana). Uma vacina 13 valente foi feita pela adição adicional dos conjugados de sorotipos 19A e 22F acima (com 22F diretamente ligado ao PhtD ou alternativamente através de um ligador ADH) [por exemplo a uma dose de 3 pg cada um de sacarídeo por dose humana]. Uma vacina 14 valente pode ser feita pela adição adicional do conjugado de sorotipo 6A acima [por exemplo em uma dose de 1 pg de sacarídeo por dose humana.
Exemplo 3: Evidência de que a inclusão da proteína D de Haemphilus influenzae em uma composição imunogênica da invenção pode fornecer proteção melhorada contra otite média aguda (AOM).
Planejamento de estudo. O estudo usou uma vacina llPn-PD - que compreende sorotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F cada uma conjugada à proteína D de H. influenzae (refere-se à Tabela 5 no Exemplo 4). Os pacientes foram randomizados em dois grupos para receber quatro doses da vacina llPn-PD ou Havrix em aproximadamente 3, 4, 5el2al5 meses de idade. Todos os pacientes receberam a vacina Infanrix-hexa (DTPa-HBV-IPV/Hib) da GSK Biologicals concomitantemente a 3, 4 e 5 meses de idade. A Infanrix-hexa é uma combinação de Pediarix e Hib misturadas antes da administração. O seguimento da eficácia para a análise “De Acordo Com o Protocolo” começou 2 semanas depois da administração da terceira dose de vacina e continuou até 24 a 27 meses de idade. A portabilidade nasofaríngea de S1. pneumoniae e H influenzae foi avaliado em um subconjunto selecionado de pacientes.
Os pais foram alertados para consultarem o investigador se a sua criança estivesse doente, tivesse dor de ouvido, perfuração espontânea da membrana timpânica ou descarga de ouvido espontânea. Se o investigador suspeitasse de um episódio de AOM, a criança era imediatamente encaminhada a um especialista de Ouvido, Nariz e Garganta (ENT) para a confirmação do diagnóstico.
Um diagnóstico clínico de AOM foi com base no aspecto visual da membrana timpânica (isto é, vermelhidão, protuberante, perda de reflexo de luz) ou a presença de efusão de líquido do ouvido médio (como demonstrado pelo otoscópio simples ou pneumático ou pelo microscópio). Além disso, pelo menos dois dos seguintes sinais ou sintomas tiveram que estar presentes: dor de ouvido, descarga de ouvido, perda de audição, febre, letargia, irritabilidade, anorexia, vômito ou diarréia. Se o especialista de ENT confirmou o diagnóstico clínico, um espécimen do fluído do ouvido médio foi coletado pela timpanocentese para os testes bacteriológicos.
Para pacientes com vistas doentes repetidas, um novo episódio de AOM foi considerado ter começado se mais do que 30 dias se passaram desde o começo do episódio anterior. Além disso, um episódio de AOM foi considerado ser um novo episódio bacteriano se a bactéria/sorotipo isolados diferiram do isolado anterior qualquer que seja o intervalo entre os dois episódios consecutivos.
Resultados de Teste Um total de 4968 crianças foram alistadas, 2489 no grupo llPn-PD e 2479 no grupo de controle. Não houve diferença maior nas características demográficas ou fatores de risco entre os dois grupos.
Episódios Clínicos e definição de caso AOM
Durante o período de seguimento por protocolo, um total de 333 episódios de AOM clínica foram registrados no grupo 1 lPn-PD e 499 no grupo de controle. A Tabela 3 apresenta a eficácia protetora da vacina e ambas as vacinas 7-valentes anteriormente testadas na Finlândia (Eskola et al N Engl J Med 2001; 344:403 - 409 e Kilpi et al Clin Infect Dis 2003 37:1155-64) contra qualquer episódio de AOM e AOM causado pelos sorotipos pneumocócicos diferentes, H. influenzae, NTHi e M. catarrhalis.
Uma redução estatisticamente significante e clinicamente relevante em 33,6% da carga de doença de AOM global foi obtida com 1 lPn-PD, independente da etiologia (tabela 3). A eficácia global contra episódios de AOM devido a qualquer um dos sorotipos 11 pneumocócicos contidos na vacina llPn-PD foi de 57,6% (tabela 3).
Uma outra descoberta importante no estudo corrente é a proteção de 35,6% fornecida pela vacina 1 lPn-PD contra AOM causada pela H. influenzae (e especificamente 35,3% de proteção fornecida por NTHi). Esta descoberta é de maior significância clínica, dada a importância aumentada da H. influenzae como uma causa maior de AOM na era da vacina de conjugado pneumocócico. Em linha com a proteção fornecida contra AOM, a vacina 1 lPn-PD também reduziu a portabilidade nasofaríngea da H. influenzae a seguir da dose de reforço no segundo ano de vida. Estas descobertas estão em contraste com observações anteriores na Finlândia onde, para ambas as vacinas de conjugado pneumocócico 7-valente, um aumento nos episódios de AOM devido à H. influenzae foi observado, (Eskola et al e Kilpi et al) como evidência de substituição etiológica.
Uma clara correlação entre a proteção contra episódios de AOM devido aos níveis de Hi e anticorpo contra a Proteína D carreadora não pôde ser estabelecida, visto que as concentrações de anticorpo de IgG anti-PD pós-primárias em vacinados com llPn-PD, que permaneceram livres de episódios Hi AOM, foram essencialmente as mesmas como os níveis de anticorpo de IgG anti-PD pós-primárias medidos em vacinados llPn-PD que desenvolveram pelo menos um episódio Hi AOM durante o período de acompanhamento de eficácia. Entretanto, embora nenhuma correlação pudesse ser estabelecida entre o impacto biológico da vacina e a imunogenicidade anti-PD de IgG pós-primária, é razoável assumir que a proteína carreadora PD, que é altamente conservada entre as cepas da H. influenzae, tenham contribuído em um grande grau na indução da proteção contra Hi. O efeito sobre a doença de AOM foi acompanhada por um efeito sobre a portabilidade nasofaríngea que foi de magnitude similar para pneumococos e H influenzae de sorotipo de vacina (Figura 1). Esta redução da portabilidade nasofaríngea de H. influenzae nos vacinados com PD-conjugado sustenta a hipótese de um efeito protetor direto da vacina de PD-conjugado contra H. influenzae, mesmo se a eficácia protetora não pudesse ser correlacionada com as resposta imunes de IgG anti-PD como medidas pelo ELISA.
Em um experimento seguinte um modelo de otite média de chinchila foi usado com reuniões de soro de crianças imunizadas com a formulação 11 valente deste exemplo ou com a vacina 10 valente do Exemplo 2 (ver também as Tabelas 1 e 2 e comentários sob elas). Ambas as reuniões induzem uma redução significante da porcentagem de animais com otite média versus a reunião de soro pré-imune. Não existe nenhuma diferença significante entre as reuniões imunes 10 e 11 valentes. Isto demonstra que ambas as vacinas têm um potencial similar para induzir proteção contra otite média causada pela H influenzae não tipável neste modelo. NP = Não publicada; N = número de pacientes no grupo de eficácia em ATP; n = número de episódios ♦Sorotipos de Vacina Pneumocócica; para 1 lPn-PD = 11 sorotipos, para Prevnar e 7v-0MP = 7 sorotipos MEF = Fluido do ouvido médio Exemplo 4: Seleção de proteína carreadora para o sorotipo 19F
Ensaio de ELISA usado O método de ELISA de inibição de 22F foi essencialmente fundamentado em um ensaio proposto em 2001 por Concepcion e Frasch e foi relatado por Henckaerts et al., 2006, Clinicai and Vaccine Immunology 13:356-360. Em resumo, polissacarídeos pneumocócicos purificados foram misturados com albumina sérica humana metilada e absorvidos em placas de microtítulo de ligação alta Nunc Maxisorp® (Roskilde, DK) durante a noite a 4°C. As placas foram bloqueadas com 10% de soro bovino fetal (FBS) em PBS por 1 hora na temperatura ambiente com agitação. As amostras séricas foram diluídas em PBS contendo 10% de FBS, 10 pg/ml de polissacarídeo de parede celular (SSI) e 2 pg/ml de polissacarídeo pneumocócico de sorotipo 22F (ATCC) e diluídos ainda mais nas placas de microtítulo com o mesmo tampão. Uma referência interna calibrada contra o soro padrão 89-SF usando as concentrações de IgG específica de sorotipo em 89-SF foi tratado do mesmo modo e incluídas em cada placa. Depois de lavar, os anticorpos ligados foram detectados usando anticorpo monoclonal de IgG anti-ser humano conjugado à peroxidase (Stratech Scientific Ltd., Soham, UK) diluído em 10% de FBS (em PBS) e incubados por 1 hora na temperatura ambiente com agitação. A cor foi desenvolvida usando kit de substrato de imunoensaio de tetrametilbenzidina peroxidase de componente único pronto para o uso (BioRad, Hercules, CA, US) no escuro na temperatura ambiente. A reação foi interrompida com H2SO4 0,18 M e a densidade óptica foi lida a 450 nm. As concentrações de IgG específicas de sorotipo (em pg/ml) nas amostras foram calculadas por referência aos pontos de densidade óptica dentro de limites definidos para a curva sérica de referência interna, que foi modelizada por uma equação de log logístico de 4 parâmetros calculada com o software SofitMax Pro® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). O corte para o ELISA foi de 0,05 pg/ml de IgG para todos os sorotipos levando-se em conta o limite de detecção e o limite de quantificação.
Ensaio de Opsonofagocitose Na WHO consultation meeting em Junho de 2003, foi recomendado usar um ensaio de OPA como demonstrado em Romero-Steiner et al Clin Diagn Lab Immunol 2003 10 (6):ppl019-1024. Este protocolo foi usado para testar a atividade OPA dos sorotipos nos seguintes testes. Preparação de conjugados Nos estudos 1 lPn-PD&Di-OOl e 1 lPn-PD&Di-007, três formulações de vacina 11-valente (Tabela 4) foram incluídas em que 3 pg do polissacarídeo 19F foi conjugado ao toxóide da difteria (19F-DT) ao invés 1 pg de polissacarídeo conjugado à proteína D (19F-PD). Os parâmetros de conjugação para os estudos llPn-PD, llPn-PD&Di-OOl e 1 lPnPD&Di-007 são divulgados nas Tabelas 5, 6 e 7 respectivamente.
As respostas de anticorpo anti-pneumocócica e atividade de OPA contra sorotipo 19F um mês a seguir da vacinação primária com estas formulações 19F-DT são mostradas na Tabela 8 e 9 respectivamente. A Tabela 10 mostra concentrações de anticorpo de 22F-ELISA e as porcentagens de pacientes que atingem o limiar de 0,2 pg/ml antes e depois da vacinação de reforço de polissacarídeo 23-valente simples. A atividade opsonofagocítica foi mostrada ser claramente melhorada para os anticorpos induzidos com estas formulações de 19F-DT como demonstrado pelas taxas de soropositividade mais alta (títulos opsonofagocíticos 1:8) e GMTs de OPA um mês a seguir da vacinação primária (Tabela 9). Um mês depois da vacinação de reforço de polissacarídeo simples 23-valente, a atividade opsonofagocítica de anticorpos 19F permaneceram significantemente melhor para crianças preparadas com formulações de 19F-DT (Tabela 11). A Tabela 12 apresenta os dados de imunogenicidade a seguir de uma dose de reforços de llPn-PD em crianças entre um e três anos previamente preparadas com conjugados 19F-DT ou 19F-PD comparadas com uma 4a dose consecutiva de Prevnar®. Dados os avanços de casos relatados depois da introdução de Prevnar® nos US, a atividade opsonofagocítico melhorada contra o sorotipo 19F quando conjugado à proteína carreadora DT pode ser uma vantagem para a vacina candidata. A Tabela 13 fornece os dados de ELISA e OPA para o conjugado 19F-DT com respeito ao sorotipo 19a reativo cruzado. Foi descoberto que 19F-DT induz atividade OPA baixa mas significante contra 19A.
Tabela 4 Formulações de vacina conjugada a Pneumocócica usadas em estudos clínicos.
Tabela 5 Condições de ativação/ligação/extinção específicas de conjugados de PS S. pneumoniae-Proteínas D/TT/DT
Tabela 6 Condições de ativação/ligação/extinção específicas de conjugados de PS S. pneumoniae-Proteínas D/DT para o estudo 1 lPn-PD&Di-OOl Tabela 7 Condições de ativação/ligação/extinção específicas de conjugados de PS 5. pneumoniae-Pxoternas, D/DT para o estudo 1 lPn-PD&Di-007 Tabela 8 Porcentagem de pacientes com concentração de anticorpo 19F 0,20 pg/mL e concentrações de anticorpo médias geométricas do anticorpo 19F (GMCs com 95% de CI; pg/ml) um mês a seguir da vacinação primária com 1 pg de 19F-PD, 3 pg de 19F-DT ou Prevnar (2 pg de 19F-CRM) (Grupo Total) A composição das formulações diferentes é fornecida na tabela 4.
Tabela 9 Percentagem de pacientes com título de OPA de 19F 1:8 e GMTs de OPA de 19F um mês a seguir da vacinação primária com 1 pg 19F-PD, 3 pg 19F-DT ou Prevnar (2 pg 19F-CRM) (Grupo Total)______________________________ Γ A composição das formulações diferentes é fornecida em Erro! Fonte de referência não encontrada.4.
Tabela 10 Porcentagem de pacientes com concentração de anticorpo 19F > 0,20 pg/ml e GMCs de anticorpo 19F (pg/ml) antes e um mês a seguir do reforço de polissacarídeo simples 23-valente em crianças preparadas com 1 pg de 19F-PD, 3 pg de 19F-DT ou Prevnar (2 pg de 19F-CRM) (Grupo Total) 1 A composição das formulações diferentes é fornecida em Erro! Fonte de Referência não encontrada.4.
Tabela 11 Porcentagem de pacientes com título de OPA de 19F 1:8 e GMTs de OPA de 19F antes e um mês a seguir do reforço de polissacarídeo simples 23-valente on crianças preparadas com 1 pg de 19F-PD, 3 pg de 19F-DT ou Prevnar (2 pg de 19F-CRM) (Grupo total) 1 A composição das formulações diferentes é fornecida na Tabela 4.
Tabela 12 Porcentagem de pacientes com concentrações de anticorpo 0,2 pg/ml, OPA 1:8 e GMCs/GMTs contra 19F pneumococos um mês a seguir do reforço com llPn-PD ou Prevnar em crianças preparadas com 1 pg de 19F-PD, 3 pg de 19F-DT ou Prevnar (2 pg de 19F-CRM) (Grupo total)_____________________ Γ A composição das formulações diferentes é fornecida na Tabela 4.
Tabela 13 Porcentagem de pacientes com concentrações de anticorpo de 0,2 pg/ml, OPA 1:8 e GMCs/GMTs contra pneumococos 19A um mês a seguir da vacinação primária com 1 pg de 19F-PD, 3 pg de 19F-DT ou Prevnar (2 pg de 19F-CRM) (Grupo total) Γ A composição das formulações diferentes é fornecida na Tabela 4 Exemplo 5: Experimentos com adjuvante em modelos pré-clínicos: impacto na imunogenicidade de conjugados de polissacarídeo 11-valente pneumocócico em macacos Rhesus idosos Para otimizar a resposta eliciada para vacinas pneumocócicas conjugadas na população idosa, GSK formulou uma vacina conjugada de polissacarídeo (PS) 11-valente com um novo adjuvante, o Adjuvante C - ver abaixo.
Grupos de 5 macacos Rhesus idosos (14 a 28 anos de idade) foram imunizados intramuscularmente (IM) nos dias 0 e 28 com 500 pl de cada um dos conjugados de PS 11-valente absorvidos em 315 pg de AIPO4 ou conjugados de PS 11-valente misturados com Adjuvante C.
Em ambas as formulações de vacina, os conjugados de PS 11-valente foram cada um compostos dos seguintes conjugados PSI-PD, PS3-PD, PS4-PD, PS5-PD, PS7F-PD, PS9V-PD, PS14- PD, PS18C-PD, PS19F-PD, PS23F-DT e PS6B-DT. A vacina usada foi 1/5 da dose da dose humana da vacina (5 pg de cada sacarídeo por dose humana exceto para 6B [10 pg]) conjugado de acordo com as condições da Tabela 6 (Exemplo 4), exceto 19F foi feito de acordo com as seguintes condições de processo CDAP:sacarídeo dimensionado a 9 mg/ml, PD a 5 mg/ml, uma razão de PD/PS inicial de 1,2/1, uma concentração CDAP de 0,75 mg/ mg de PS, pHa=pHc=pHq 9,0/9,0/9,0 e um tempo de ligação de 60 min.
Os níveis de IgG de ELISA Anti-PS e os títulos de opsono-fagocitose foram dosados em soros coletados no dia 42. As frequências de célula B de memória anti-PS3 foram medidas pelo Elispot a partir de células sanguíneas periféricas coletadas no dia 42.
De acordo com os resultados mostrados aqui abaixo, o Adjuvante C significantemente melhorou a imunogenicidade de conjugados de PS 11-valente versus conjugados com A1PO4 em macacos idosos. O novo adjuvante realçou as respostas de IgG para PS (Figura 1) e os títulos de anticorpo de opsono-fagocitose (Tabela 14). Houve também evidência sustentativa de que a frequência das células B de memória específicas de PS3 é aumentada pelo uso de Adjuvante C (Figura 2).
Tabela 14 Imunogenicidade de conjugado em macacos Rhesus idosos (títulos de opsono-fagocitose pós-III) Elispot de Célula B O princípio do ensaio conta com o fato de que as células B de memória maduras em células plasmáticas in vitro a seguir do cultivo com CpG por 5 dias. As células plasmáticas específicas de antígeno geradas in vitro podem ser facilmente detectados e portanto ser enumerados usando o ensaio de elispot de célula Β. O número de células plasmáticas específicas refletem a frequência de células B de memória no início da cultura.
Em resumo, as células plasmáticas geradas in vitro são incubadas em placas de cultura revestidas com antígeno. As células plasmáticas específicas de antígeno formam manchas de anticorpo/ antígeno, que são detectadas pelo procedimento imuno-enzimático convencional e enumeradas como células B de memória.
No presente estudo, os polissacarídeos foram usados para revestir placas de cultura de modo a enumerar as respectivas células B de memória. Os resultados são expressados como uma frequência de células B de memória específicas de PS dentro de um milhão de células B de memória.
Os estudos mostram que o Adjuvante C pode ser capaz de aliviar o problema conhecido de reforçabilidade de PS3 (ver 5a International Symposium on Pneumococci and Pneumococcal Diseases, 2 a 6 de abril de 2006, Alice Springs, Austrália Central.
As especificidades de respostas imunes contra um conjugado pneumocócico de sorotipo 3. Schuerman L, Prymula R, Poolman J. Abstract book p 245, PO 10.06).
Exemplo 6 Eficácia de Pneumolisina destoxificada (dPly) como uma proteína carreadora para realçar a imunogenicidade de PS 19F em camundongos Balb/C jovens Grupos de 40 camundongos Balb/C fêmeas (4 semanas de idade) foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 50 μΐ de conjugado de PS simples 4-valente ou conjugado de PS dPly 4-valente, ambos misturados com Adjuvante C.
Ambas as formulações de vacina foram compostas de 0,1 pg (quantidade de sacarídeo) de cada um dos seguintes PS:PS8, PS12F, PS19F e PS22F.
Os níveis de IgG em ELISA Anti-PS foram dosados em soros coletados no dia 42. A resposta anti-PS 19F, mostrada como um exemplo na Figura 3, foi fortemente realçada em camundongos administrados com conjugados de dPly 4-valente comparado com os camundongos imunizados com o PS simples. A mesma melhora foi observada para as respostas de IgG anti-PS8, 12F e 22F (dados não mostrados).
Exemplo 7 Eficácia de Proteína D da Tríade de Histidina Pneumocócica (PhtD) como uma proteína carreadora para realçar a imunogenicidade de PS 22F em camundongos Balb/C jovens Grupos de 40 camundongos Balb/C fêmeas (4 semanas de idade) foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 50 μΐ de PS simples 4-valente ou PS conjugado a PhtD 4-valente, ambos misturados com Adjuvante C.
Ambas as formulações de vacina foram compostas de 0,1 pg (quantidade de sacarídeo) de cada um dos seguintes PS:PS8, PS12F, PS19F e PS22F.
Os níveis de IgG em ELISA anti-PS foram dosados em soros coletados no dia 42. A resposta anti-PS22F, mostrada como um exemplo na Figura 4, foi fortemente realçada em camundongos administrados com conjugados PhtD 4-valente e comparados com camundongos imunizados com o PS simples. A mesma melhora foi observada para as respostas de IgG anti-PS8, 12F e 19F (dados não mostrados).
Exemplo 8 Imunogenicidade em camundongos C57BI idoso de conjugados de PS 13-valente contendo 19A-dPly e 22F-PhtD
Grupos de 30 camundongos C57B1 velhos (> 69 semanas de idade) foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 50 pl de conjugados de PS 11-valente ou conjugados de PS 13-valente, ambos misturados com Adjuvante C (ver abaixo). A formulação de vacina 11-valente foi composta de 0,1 pg de sacarídeo de cada um dos seguintes conjugados:PSl-PD, PS3-PD, PS4-PD, PS5-PD, PS6B-PD, PS7F-PD, PS9VPD, PS14-PD, PS18C-TT, PS19F-DT e PS23F-PD (ver Tabela 1 e comentário sobre a vacina 11 valente debatido sob a Tabela 2). A formulação de vacina 13-valente conteve além de 0,1 pg de conjugados PS19A-dPly e PS22F-PhtD (ver Tabela 1 e comentário sobre a vacina 13 valente debatido sob a Tabela 2 [usando 22F diretamente conjugado]). Nos grupos 2 e 4 o carreador da pneumolisina foi destoxificado com tratamento de GMBS, nos grupos 3 e 5 isto foi feito com formaldeído (métodos descritos na WO04/81515). Nos grupos 2 e 3 PhtD foi usado para conjugar PS 22F, nos Grupos 4 e 5 uma fusão PhtDJE (a construção VP147 da W003/054007) foi usada. No Grupo 6 19A foi conjugado ao toxóide da difteria e 22F à proteína D.
Os níveis de IgG em ELISA Anti-PS19A e 22F foram avaliados em soros individuais coletados no dia 42 usando o seguinte procedimento. A resposta de IgG de ELISA gerada para o outro PS foi medida em soros reunidos.
Procedimentos sorológicos em Camundongo: Os níveis de IgG em ELISA anti-PS 19A foram avaliados em soros coletados no dia 42 usando o procedimento aqui descrito abaixo: As microplacas foram revestidas por 2 horas a 37°C com PS tipo 19A pneumocócico purificado (10 pg/ml) em tampão de PBS. As placas foram lavadas quatro vezes com NaCl 0,9%mM-Tween 20 0,05%. Os soros foram incubados por 1 hora a 37°C com 50 pg/ml de CPS (V/V) em PBS 0,05% de Tween 20. Os soros foram adicionados aos micro-reservatórios e diluídos em série (etapa de diluição de duas vezes) em PBS-BSA 0,05% de Tween 0,05%. As placas foram incubadas sob agitação por 30 minutos na temperatura ambiente. As placas foram lavadas como acima e um conjugado de IgG anti-camundongo-peroxidase (diluído 1/2500) foi adicionado e as placas foram incubadas por 30 minutos na temperatura ambiente. Depois da lavagem, o substrato (4 mg de OPDA em 1 Oml de citrato 0,1 M pH 4,5 e 5 pl de H2O2) foi adicionado a cada reservatório por 15 minutos. A reação foi interrompida pela adição de HCI 1 N. A absorbância foi lida de 490 a 620 nm usando um espectrofotômetro. A cor desenvolvida é diretamente proporcional à quantidade de anticorpo presente no soro. O nível da IgG presente nas amostras de soros é determinada pela comparação com a curva de referência e expressada em pg/ml. Uma curva de referência foi gerada para cada resultado de placa de ELISA para a quantidade conhecida de soro adicionada.
Os níveis de IgG em ELISA anti-PS22F foram avaliados em soros coletados no dia 42 usando o procedimento descrito aqui abaixo: As microplacas foram revestidas por 2 horas a 37°C com PS tipo 22F pneumocócico purificado (10 pg/ml) em tampão de PBS. As placas foram lavadas quatro vezes com NaCl 0,9%mM-Tween 20 0,05%. Os soros foram incubados por 1 hora a 37°C com 50 pg/ml de CPS (V/V) em PBS 0,05% de Tween 20. Os soros foram adicionados aos micro-reservatórios e diluídos em série (etapa de diluição de duas vezes) em PBS-BSA 0,05% de Tween 0,05%. As placas foram incubadas sob agitação por 30 minutos na temperatura ambiente. As placas foram lavadas como acima e um conjugado de peroxidase de anticorpos de IgG anti-camundongo (diluído 1/2500) foi adicionado e as placas foram incubadas por 30 minutos na temperatura ambiente. Depois da lavagem, o substrato (4 mg de OPDA em lOml de citrato 0,1 M pH 4,5 e 5 pl de H2O2) foi adicionado a cada reservatório por 15 minutos. A reação foi interrompida pela adição de HCl IN. A absorbância foi lida a de 490 a 620 nm usando um espectrofotômetro. A cor desenvolvida é diretamente proporcional à quantidade de anticorpo presente no soro. O nível da IgG anti-PS22F presente nos soros desconhecidos é determinado pela comparação à curva de referência de soro adicionado em cada placa e expressada em pg/ml.
As respostas imunes direcionadas contra todos os outros sorotipos foram realizados de acordo com os mesmos procedimentos exceto que os soros de camundongos foram reunidos. 19A-dPly e 22F-PhtD administradas dentro da formulação de vacina conjugada 13-valente foram mostradas imunogênicas em camundongos C57BI velhos (Tabela 15). A resposta imune induzida contra outro PS não foi negativamente impactado em camundongos administrados com a formulação 13-valente comparados com aqueles imunizados com a formulação 11-valente.
Tabela 15, Imunogenicidade de PS em camundongos C57BI velhos (níveis de IgG pós-III) NR - nenhum resultado experimental determinado Procedimento OPA em Camundongo: As amostras de soro foram aquecidas por 45 min a 56°C para inativar qualquer complemento endógeno remanescente. Alíquotas de vinte e cinco microlitros de cada amostra de soro diluída 1:2 foram diluídas duas vezes em série em 25 μΐ de tampão OPA (HBSS-14,4% de FBS inativado) por reservatório de uma placa de microtítulo de fundo redondo de 96 reservatórios. Subsequentemente, 25 μΐ de uma mistura de células HL-60 ativado (1 x 10 células/ml), semente de trabalho pneumocócica recém descongelada e complemento de coelho bebê recém descongelado em uma razão por exemplo de 4/2/1 (v/v/v) foram adicionados aos soros diluídos para produzir um volume final de 50 μΐ. A placa de ensaio foi incubada por 2 h a 37°C com agitação orbital (210 rpm) para promover o processo fagocítico. A reação foi interrompida depositando-se a microplaca sobre gelo por pelo menos 1 min. Uma alíquota de 20 μΐ de cada reservatório da placa foi depois transferida no reservatório correspondente de uma microplaca de fundo chato de 96 reservatórios e 50 μΐ de Caldo de Todd-Hewitt - 0,9% de ágar foram adicionados a cada reservatório. Depois da incubação durante a noite a 37°C e 5% de CO2, as colônias pneumocócicas que aparecem no ágar foram contadas usando um sistema de análise de imagem automatizada (KS 400, Zeiss, Oberkochen, Alemanha). Oito reservatórios sem amostra de soro foram usados como controles bacterianos para determinar o número de pneumococos por reservatório. O número médio de CFU dos reservatórios de controle foi determinado e usado para o cálculo da atividade de morte para cada amostra de soro. O título de OPA para as amostras de soro foi determinado pela diluição recíproca de soro capaz de facilitar a morte de 50% dos pneumococos. O título opsonofagocítico foi calculado usando-se uma análise de ajuste de curva de 4 parâmetros.
Os resultados de ensaios de opsono-fagocitose são mostrados nas Figuras 13 e 14.
Exemplo 9 Imunogenicidade em camundongos Balb/C jovens de conjugados de PS 13-valente contendo 19A-dPly e 22F-PhtD
Grupos de 30 camundongos Balb/C jovens (4 semanas de idade) foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 50 pl de conjugados de PS 11-valente ou conjugados de PS13-valente, ambos misturados com Adjuvante C (ver abaixo). A formulação de vacina 11-valente foi composta de 0,1 pg de sacarídeo de cada um dos seguintes conjugados:PSl-PD, PS3-PD, PS4-PD, PS5-PD, PS6B-PD, PS7F-PD, PS9VPD, PS14-PD, PS18C-TT, PS19F-DT e PS23F-PD (ver Tabela 1 e comentários sobre vacina 11 valente debatida sob a Tabela 2). A formulação de vacina 13-valente conteve além de 0,1 pg de conjugados PS19A-dPly e PS22F-PhtD (ver a Tabela 1 e comentários sobre vacina 13 valente debatidos sob a Tabela 2 [usando 22F diretamente conjugado]). Nos grupos 2 e 4 o carreador de pneumolisina foi destoxificado com tratamento de GMBS, nos grupos 3 e 5 isto foi feito com formaldeído (métodos descritos na WO04/81515). Nos grupos 2 e 3 PhtD foi usado para conjugar PS 22F, nos grupos 4 e 5 uma fusão PhtDE (a construção VP147 da W003/054007) foi usada. No grupo 6 19A foi conjugado ao toxóide da difteria e 22F à proteína D.
Os níveis de IgG de ELISA Anti-PS 19A e 22F foram dosados em soros individuais coletados no dia 42. A resposta de IgG em ELISA gerada para o outro PS foi medida em soros reunidos. 19A-dPly e 22F-PhtD administradas dentro da formulação de vacina conjugada com 13-valente foram mostradas imunogênicas em camundongos Balb/C jovens (Tabela 16). A resposta imune induzida contra outro PS não foi negativamente impactada em camundongos administrados com a formulação 13-valente comparados com aqueles imunizados com a formulação 11-valente. ELISAa foram realizados como descrito no exemplo 8. Tabela 16, Imunogenicidade de PS em camundongos Balb/C Jovens (níveis de IgG pós-III) NR - nenhum resultado experimental determinado Procedimento de OPA camundongo: As amostras de soro foram aquecidas por 45 min a 56°C para inativar qualquer complemento endógeno remanescente. Alíquotas de vinte e cinco microlitros de cada amostra de soro diluída 1:2 foram diluídas duas vezes em série em 25 μΐ de tampão OPA (HBSS-14,4% de FBS inativado) por reservatório de uma placas de microtítulo de fundo redondo de 96 reservatórios. Subsequentemente, 25 μΐ de uma mistura de células HL-60 ativadas (1 x 10 células/ml), sementes de trabalho pneumocócicas recém descongeladas e complemento de bebê coelho recém descongelado em uma razão por exemplo de 4/2/1 (v/v/v) foram adicionados aos soros diluídos para produzir um volume final de 50 μΐ. A placa de ensaio foi incubada por 2 h a 37°C com agitação orbital (210 rpm) para promover o processo fagocítico. A reação foi interrompida pela deposição da microplaca em gelo por pelo menos 1 min. Uma alíquota de 20 μΐ de cada reservatório da placa foi depois transferida no reservatório correspondente de uma microplaca de fundo chato de 96 reservatórios e 50 μΐ de Caldo de Todd-Hewitt-0,9% de ágar foram adicionados a cada reservatório. Depois da incubação durante a noite a 37°C e 5% de CO2, as colônias pneumocócicas que aparecem no ágar foram contadas usando um sistema de análise de imagem automatizada (KS 400, Zeiss, Oberkochen, Alemanha). Oito reservatórios sem amostra de soro foram usados como controles bacterianos para determinar o número de pneumococos por reservatório. O número médio de CFU dos reservatórios de controle foi determinado e usado para o cálculo da atividade de morte para cada amostra de soro. O título de OPA para as amostras de soro foi determinada pela diluição recíproca de soro capaz de facilitar 50% de morte do pneumococo. O título opsonofagocítico foi calculado usando-se uma análise de ajuste de curva de 4 parâmetros.
Os resultados são mostrados nas Figuras 15 e 16.
Resultados em formulações de alúmen: A imunogenicidade em camundongos Balb/C jovens de conjugados de PS 13-valentes contendo 19AdPly e 22F-PhtD
Grupos de 40 camundongos Balb/C jovens (4 semanas de idade) foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 50 μΐ de conjugados de PS 11-valente ou conjugados de PS 13-valente, ambos absorvidos em A1PO4. Infanrix Hexa foi co-administrado. A formulação de vacina 11-valente foi composta de 0,1 pg de sacarídeo de cada um dos seguintes conjugados:PSl-PD, PS3-PD, PS4-PD, PS5-PD, PS6B-PD, PS7F-PD, PS9V-PD, PS14-PD, PS18C-TT, PS19F-DT e PS23F-PD (ver a Tabela 1 e comentários sobre a vacina llvalente debatida sob a Tabela 2). A formulação de vacina 13-valente conteve além da adição de 0,1 pg de conjugados de PS19A-dPly e PS22F-PhtD (ver a Tabela 1 e os comentários sobre a vacina 13 valente debatidos sob a Tabela 2 [usando 22F diretamente conjugado]). Nos grupos 2 e 4 o carreador de pneumolisina foi destoxificados com tratamento de GMBS, nos grupos 3 e 5 isto foi feito com formaldeído. Nos grupos 2 e 3 PhtD foi usado para conjugar PS 22F, nos Grupos 4 e 5 uma fusão PhtD_E (a construção VP147 da W003/054007) foi usada. No grupo 6, 19A foi conjugado ao toxóide da difteria e 22F à proteína D.
Os níveis de IgG de ELISA Anti-PS 19A e 22F e títulos de opsono-fagocitose foram medidos em soros individuais coletados no dia 42. A resposta de IgG em ELISA gerada para o outro PS foi medida em soros reunidos. 19A-dPly e 22F-PhtD administradas dentro da formulação de vacina de conjugado 13-valente mostraram-se imunogênicas e induziram títulos opsonofagocíticos em camundongos Balb/C jovens (Tabela 17 e figuras 19-20). A resposta imune induzida contra o outro PS não foi negativamente impactado em camundongos administrados com a formulação 13-valente comparados com aqueles imunizados com a formulação 11-valente.
Os ensaios de opsonofagocitose foram usados para avaliar os soros e os resultados são mostrados nas Figuras 19 e 20.
Tabela 17. Imunogenicidade de PS em camundongos Balb/C jovens (níveis de IgG Pós-III) Imunogenicidade em camundongos OF1 jovens de conjugados PS 13-valente contendo 19A-dPly e 22F-PhtD
Grupos de 40 camundongos OF1 jovens (4-semanas de idade) foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 50 μΐ de conjugados de PS 11-valente ou conjugados de PS 13-valente, ambos absorvidos em A1PO4. Infanrix Hexa foi co-administrada. A formulação de vacina 11-valente foi composta de 0,1 pg de sacarídeo de cada um dos seguintes conjugados:PSl-PD, PS3-PD, PS4-PD, PS5-PD, PS6B-PD, PS7F-PD, PS9VPD, PS14-PD, PS18C-TT, PS19F-DT e PS23F-PD (ver a Tabela 1 e comentários sobre a vacina 11 valente debatidos sob a Tabela 2). A formulação de vacina 13-valente conteve além disso 0,1 pg de conjugados PS19A-dPly e PS22F-PhtD (ver a Tabela 1 e comentários sobre a vacina 13 valente debatidos sob a Tabela 2 [usando 22F diretamente conjugado]). Nos grupos 2 e 4 o carreador de pneumolisina foi destoxificado com tratamento de GMBS, nos grupos 3 e 5 isto foi feito com formaldeído (métodos descritos na WO04/81515). Nos grupos 2 e 3 PhtD foi usado para conjugar PS 22F, nos grupos 4 e 5 uma íusão PhtDJE (a construção VP147 da WO03/054007) foi usada. No grupo 6, 19A foi conjugado ao toxóide da difteria e 22F à proteína D. Níveis de IgG anti-PS 19A e 22F e títulos de opsono-fagocitose foram medidos em soros individuais coletados no dia 42. A resposta de IgG em ELISA gerada para o outro PS foi medida em soros reunidos. 19A-dPly e 22F-PhtD administradas dentro da formulação de vacina de conjugado 13-valente foram mostradas imunogênicas e induziram títulos opsonofagocíticos em camundongos OF1 jovens (Tabela 18 e figuras 21-22). A resposta imune induzida contra o outro PS não foi negativamente impactada em camundongos administrados com a formulação 13-valente comparados com aqueles imunizados com a formulação 11-valente.
Os soros também foram avaliados pelos ensaios de opsonofagocitose e os resultados são mostrados nas Figuras 21 e 22.
Tabela 18. Imunogenicidade de PS em camundongos OF1 jovens (níveis IgG Pós-III) Exemplo 10 Imunogenicidade em Porquinhos da índia de conjugados de PS 13-valente contendo 19A-dPly e 22F-PhtD
Os grupos de 20 Porquinhos da índia jovens (Cepa Hartley; 5 semanas de idade) foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 125 μΐ de conjugados de PS 11-valente ou conjugados de PS 13-valente, ambos misturados com Adjuvante C (ver abaixo). A formulação de vacina 11-valente foi composta de 0,25 pg de sacarídeo de cada um dos seguintes conjugados:PSl-PD, PS3-PD, PS4-PD, PS5-PD, PS6B-PD, PS7F-PD, PS9VPD, PS14-PD, PS18C-TT, PS19F-DT e PS23F-PD (ver a Tabela 1 e comentários sobre a vacina 11 valente debatidos sob a Tabela 2). A formulação de vacina 13-valente conteve além disso 0,1 pg de conjugados PS19A-dPly e PS22F-PhtD (ver a Tabela 1 e comentários sobre vacina 13 valente debatidos sob a Tabela 2 [usando 22F diretamente conjugado]). Nos grupos 2 e 4 o carreador de pneumolisina foi destoxificado com tratamento de GMBS, nos grupos 3 e 5 isto foi feito com formaldeído. Nos grupos 2 e 3 PhtD foi usado para conjugar PS 22F, nos grupos 4 e 5 uma fusão PhtD_E (a construção VP147 da W003/054007) foi usada. No grupo 6 19A foi conjugado ao toxóide da difteria e 22F à proteína D.
Os níveis de IgG em ELISA Anti-PS 19A e 22F foram avaliados em soros individuais coletados no dia 42 usando o seguinte protocolo. A resposta de IgG de ELISA gerada para o outro PS foi medida em soros reunidos.
Procedimentos de sorologia de Porquinho da índia: Os níveis de IgG em ELISA anti-PS 19A foram avaliados em soros coletados no dia 42 usando o procedimento descrito aqui abaixo: Microplacas foram revestidas por 2 horas a 37°C com PS tipo 19A pneumocócico purificado (10 pg/ml) em tampão de PBS. As placas foram lavadas quatro vezes com NaCl 0,9%mM-Tween 20 0,05%. Os soros foram incubados por 1 hora a 37°C com 50 pg/ml de CPS (V/V) em PBS 0,05% de Tween 20. Os soros foram adicionados aos micro-reservatórios e diluídos em série (etapa de diluição de duas vezes) em PBS-BSA 0,05% de Tween 0,05%. As placas foram incubadas sob agitação por 30 minutos na temperatura ambiente. As placas foram lavadas como acima e um conjugado de peroxidase IgG anti-porquinho da índia (diluído 1/1000) foi adicionado e as placas foram incubadas por 30 minutos na temperatura ambiente. Depois de lavar, o substrato (4 mg de OPDA em lOml de citrato 0,1 M pH 4,5 e 5 μΐ de H2O2) foi adicionado a cada reservatório por 15 minutos. A reação foi interrompida pela adição de HCI 1 N. A absorbância foi lida de 490 a 620 nm usando um espectrofotômetro. A cor desenvolvida é diretamente proporcional à quantidade de anticorpo presente no soro. O nível da IgG anti-PS 19A presente nos soros desconhecidos é determinado pela comparação com o soro da curva de referência adicionada em cada placa e expressada em pg/ml.
Os níveis de IgG em ELISA anti-PS22F foram dosados em soros coletados no dia 42 usando o procedimento descrito aqui abaixo: Microplacas foram revestidas por 2 horas a 37°C com PS tipo 22F pneumocócico purificado (10 pg/ml) em tampão de PBS. As placas foram lavadas quatro vezes com NaCl 0,9%mM-Tween 20 0,05%. Os soros foram incubados 1 hora a 37°C com 50 pg/ml de CPS (V/V) em PBS 0,05% de Tween 20. Os soros foram adicionados aos micro-reservatórios e diluídos em série (etapa de diluição de duas vezes) em PBS-BSA 0,05% Tween 0,05%. As placas foram incubadas sob agitação por 30 minutos na temperatura ambiente. As placas foram lavadas como acima e um conjugado de peroxidase IgG anti-porquinho da índia (diluído 1/1000) foi adicionado e as placas foram incubadas por 30 minutos na temperatura ambiente. Depois da lavagem, o substrato (4 mg de OPDA em lOml de citrato 0,1 M de pH 4,5 e 5 μΐ de H2O2) foi adicionado a cada reservatório por 15 minutos. A reação foi interrompida pela adição de HCI IN. A absorbância foi lida a 490-620 nm usando um espectrofotômetro. A cor desenvolvida é diretamente proporcional à quantidade de anticorpo presente no soro. O nível da IgG anti-PS22F presente nos soros desconhecidos é determinado pela comparação com a curva de referência do soro adicionado em cada placa e expressado em pg/ml.
As respostas imunes direcionadas contra todos os outros sorotipos foram realizadas de acordo com os mesmos procedimentos exceto que os soros de porquinhos da índia foram reunidos.
Tabela 19, Imunogenicidade de PS em Porquinhos da índia (níveis de IgG pós-III) _______________________________Porquinhos da índia Ensaios de opsonofagocitose também foram usados para testar os soros e os resultados são mostrados nas Figuras 17 e 18.
Exemplo 1 l:Formulações que são feitas e testadas a) As seguintes formulações são feitas (usando a vacina 13 valente da tabela 1 e sorotipo 3 da tabela 5 - ver comentários sobre a vacina 14 valente debatidos sob a Tabela 2 [usando 22F diretamente conjugado ou através de um ligador ADH]). Os sacarídeos são formulados com fosfato de alumínio e 3D-MPL como mostrado abaixo. b) A mesma formulação de sacarídeo é adjuvantada com cada um dos seguindo adjuvantes: - Na tabela aqui abaixo a concentração dos componentes de emulsão por dose de 500 μΐ é mostrada.
Adjuvante Al Adjuvante A2 Adjuvante A3 Ingredientes 250 μΐ óleo em água 125 μΐ óleo em água 50 μΐ óleo em água emulsão emulsão emulsão alfa ll,88mg 5,94mg 2,38mg Tocoferol Esqualeno 10,7mg 5,35mg 2,14mg Tween 80 4,85mg 2,43mg 0,97mg Adjuvante A4 Adjuvante A5 Adjuvante A6 Adjuvante A7 T x 250 μΐ óleo em 250 μΐ óleo em 1250 μΐ óleo em 50μ1 óleo em Ingredientes , , 7 , agua agua agua agua emulsão emulsão emulsão emulsão alfa ll,88mg ll,88mg 5,94mg 2,38mg Tocoferol Esqualeno 10,7mg 10,7mg 5,3 5mg 2,14mg Tween 80 4,85mg 4,85mg 2,43mg 0,97mg 3D-MPL 50μg 25 μg 25 qg 10 qg c) Os sacarídeos também são formulados com dois adjuvantes com base me lipossoma: Composição de Adjuvante Bl Qualitativo Quantitativo (por dose de 0,5ml) Lipossomas: - DOPC 1 mg - colesterol 0,25 mg 3DMPL 50 pg QS21 50 pg KH2PO4 1 3,124 mg Tampão de Na2HPO4 1 0,290 mg Tampão de NaCl 2,922 mg (lOOmM) WFI q.s. ad 0,5ml de Solvente pH 6,1 1. concentração de PO4 Total = 50mM
Composição de Adjuvante B2 Qualitativo Quantitativo (por dose de 0,5ml) Lipossomas: - DOPC 0,5 mg - colesterol 0,125 mg 3DMPL 25 pg QS21 25 pg KH2PO4 1 3,124 mg Tampão de Na2HPO4 10,290 mg Tampão de NaCl 2,922 mg (lOOmM) WFI q.s. ad 0,5ml de Solvente pH6,l d) Os sacarídeos também são formulados com Adjuvante C (ver acima para outras composições onde este adjuvante foi usado): Qualitativo Quantitativo (por dose de 0,5ml) Emulsão de óleo em água: 50 pl - esqualeno 2,136 mg - a-tocoferol 2,372 mg - Tween 80 0,97 mg - colesterol 0,1 mg 3DMPL 50 pg QS2150 pg KH2PO4 1 0,470 mg Tampão de Na2HPO4 1 0,219 mg Tampão de NaCl 4,003 mg (137mM) KC1 0,101 mg (2,7mM) WFI q.s. ad 0,5ml de Solvente pH 6,8 Exemplo 12. Impacto da conjugação química sobre a imunogenicidade de conjugado 22F-PhtD em camundongos Balb/C
Grupos de 30 camundongos Balb/C fêmeas foram imunizados pela via intramuscular (IM) nos dias 0, 14 e 28 com formulações de PS 13-valente contendo PS 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F e 23F (dose:0,3 pg de sacarídeo / conjugado para PS 4, 18C, 19A, 19F e 22F e 0,1 pg de sacarídeo / conjugado para os outros PS). O PS 18C foi conjugado ao Toxóide do Tétano, 19F ao Toxóide da Difteria, 19A ao Ply destoxificado com formol, 22F à PhtD e os outros PS à PD.
Duas formulações, constituídas de 22F-PhtD preparado pela química direta de CDAP ou 22F-AH-PhtD (PS derivado por ADH), foram comparados. Ver o Exemplo 2, Tabela 1 e comentários sob a Tabela 2 quanto as características da vacina 13 valente feita com 22F diretamente conjugado ou por intermédio de um espaçador de ADH. As formulações de vacina foram suplementadas com adjuvante C.
Os níveis de IgG de ELISA Anti-PS22F e os títulos de opsonofagocitose foram medidos em soros coletados no dia 42. 22F-AH-PhtD mostrou-se muito mais imunogênico do que 22F-PhtD em termos tanto dos níveis de IgG (figura 5) quanto dos títulos opsonofagocíticos (figura 6).
Exemplo 13 impacto de novos adjuvantes sobre a imunogenicidade de conjugados de PS em cápsula de StreptoccoccuS. pneumoniae Grupos de 40 camundongos C57B1 jovens foram imunizados pela via IM nos dias 0, 14 e 28 com formulações de PS 13-valente contendo PS 1,3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F e 23F (dose:0,3 pg / conjugado para PS 4, 18C, 19A, 19F e 22F e 0,1 pg / conjugado para os outros PS). PS 18C foi conjugado ao Toxóide do Tétano, 19F ao Toxóide da Difteria, 19A à Ply destoxificada com formol, 22F à PhtD e os outros PS à PD. Ver o Exemplo 2, Tabela 1 e comentários sob a Tabela 2 quanto as características de vacina 13 valente feita com 22F diretamente conjugado.
Quatro formulações, suplementadas com AIPO4, adjuvante Al, adjuvante A4 ou adjuvante A5, foram comparadas.
Os níveis de IgG em ELISA Anti-PS, Ply, PhtD e PD foram medidos nos soros coletados no dia 42 e reunidos por grupo. A seguinte razão foi calculada para cada antígeno:Nível de IgG induzido com o novo adjuvante testado / nível de IgG induzido com AIPO4.
Todos os novos adjuvantes testados melhoraram pelo menos 2 vezes as respostas imunes aos conjugados de sorotipo 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 22F comparados com a formulação com AJPO4 clássica (figura 7). Nenhuma resposta confiável foi obtida para sorotipo 23F neste experimento.
Exemplo 14, Eficácia protetora de um combo PhtD/Ply destoxificada em um modelo de pneumonia de macaco pneumocócico Grupos de 6 macacos Rhesus (3 a 8 anos de idade), selecionados como aqueles tendo os níveis de anticorpo anti-19F pré-existentes mais baixos, foram imunizados intramuscularmente nos dias 0 e 28 com conjugados de PS 11-valente (isto é, 1 pg de PS 1,3,5, 6B, 7F, 9V, 14 e 23F e 3 pg de PS 4, 18C e 19F [de sacarídeo]) ou PhtD (10 pg) + Ply destoxificado em formol (10 pg) ou proteína de fusão PhtD/E (10 pg) e Ply destoxificado em formol (10 pg) ou o adjuvante sozinhos. PS 18C foi conjugado ao Toxóide do Tétano, 19F ao Toxóide da Difteria e os outros PS à PD. Ver o Exemplo 2, Tabela 1 e comentários sob a Tabela 2 quanto as características de vacinai 1 valente. Todas as formulações foram suplementadas com adjuvante C.
Pneumococos Tipo 19F (5,108 cfu) foram inoculados no pulmão direito no dia 42. As colônias foram contadas nas lavagens bronco-alveolares coletadas nos dias 1, 3 e 7 após a inoculação. Os resultados foram expressados como o número de animais por grupo mortos, colonizados no pulmão ou reabilitado no dia 7 depois da inoculação.
Como mostrado na figura 8, uma boa proteção próxima à significância estatística (a despeito do número baixo de animais usados) foi obtido com conjugados 11-valentes e o combo PhtD + dPly (p < 0,12, teste Exato de Fisher) comparado com o grupo do adjuvante sozinho.
Exemplo 15, Impacto da conjugação química sobre as respostas de anticorpo anti-PhtD e a eficácia protetora contra uma inoculação tipo 4 induzida pelos conjugados 22F-PhtD
Grupos de 20 camundongos OF1 fêmeas foram imunizados pela via intramuscular nos dias 0 e 14 com 3 pg de 22F-PhtD (preparados pela química direta de CDAP) ou 22F-AH-PhtD (PS derivado de ADH) ou o adjuvante sozinho. Ambos os conjugados 22F monovalentes foram fabricados pelos processos do Exemplo 2 (ver também a Tabela 1 e Tabela 2). Cada formulação foi suplementada com adjuvante C.
Os níveis de IgG em ELISA Anti-PhtD foram medidos em soros coletados no dia 28.
Os camundongos foram inoculados intranasalmente com 5.106 cfu de pneumococos tipo 4 no dia 29 (isto é, um sorotipo pneumocócico não potencialmente abrangido pelos PS presentes na formulação de vacina testada). A mortalidade induzida foi monitorada até o dia 10 após a inoculação.
Os resultados mostrados na figura 9 demonstram que 22F-AH-PhtD induziu uma resposta de IgG anti-PhtD significantemente mais alta comparada a 22F-PhtD. Isto foi refletida em melhor proteção contra a inoculação tipo 4 comparada com 22F-PhtD como mostrado na Figura 10. Exemplo 16, Benefício de Combinar Polissacarídeo e Proteína na Geração de uma resposta imuno protetora. A sinergia potencial entre as respostas imunes direcionadas contra PhtD e polissacarídeos capsulares foi avaliada no modelo de inoculação de S. pneumoniae letal em camundongo. Os camundongos foram intramuscularmente imunizados três vezes (DO, 14 e 28) com PhtD. Uma hora antes da inoculação bacteriana, anticorpos anti-polissacarídeos foram passivamente transferidos para os camundongos (IP, 200 μΐ). A letalidade induzida pela S. pneumoniae foi seguida até 8 ou 11 dias depois da inoculação. A sinergia de proteção é apresentada aqui para duas cepas de S. pneumoniae (sorotipo 3 e sorotipo 1).
Modelo de inoculação da cepa 3/43 de S. pneumoniae: Neste experimento, camundongos OF1 foram imunizados com PhtD absorvidos em AIPO4 e 1,25 pg de anticorpos anti-PS3 de porquinho da índia foram passivamente transferidos 1 hora antes da inoculação com S. pneumoniae sorotipo 3 (Spn 3/43).
Os resultados são mostrados na Figura 11. 70% de letalidade foi observada nos camundongos que receberam apenas PBS. Uma proteção moderada foi observada no grupo de camundongos que receberam anticorpos anti-PS3 ou camundongos imunizados com PhtD. Uma sinergia, levando a uma proteção quase completa, foi obtida nos camundongos que combinaram imunização ativa e passiva contra PhtD e PS3, respectivamente.
Modelo de inoculação de sorotipo 1/57 de S. pneumoniae: Neste experimento, camundongos OF 1 foram imunizados com PhtD adjuvantado com um adjuvante TH1 e anticorpos anti-PS 1 de porquinho da índia foram passivamente transferidos uma hora antes da inoculação com S. pneumoniae sorotipo 1 (Spn 1/57).
Os resultados são mostrados na Figura 12. Uma alta letalidade foi observada no grupo de controle em que os camundongos receberam adjuvante TH1 (imunização ativa) e apenas PBS (imunização passiva). Uma proteção moderada foi observada no grupo de camundongos que receberam anticorpos anti-PS 1 (55% de sobrevivência) ou camundongos imunizados com PhtD (25% de sobrevivência). Uma sinergia, levando a uma proteção quase completa, foi obtida em camundongos que combinaram imunização ativa e passiva contra PhtD e PS 1, respectivamente.
Estes dados sustentam o efeito sinergístico das respostas imunes direcionadas contra uma proteína pneumocócica (isto é, PhtD) e polissacarídeos capsulares no mecanismo de proteção contra a infecção pela S. pneumoniae.
Exemplo 17 Impacto de conjugados PS-TT e PS-DT pneumocócicos sobre a resposta imune direcionada contra os conjugados PS-PD pneumocócicos remanescentes em uma formulação 11-valente.
Uma formulação de contendo 11 conjugados de PS-PD foi comparada a uma formulação contendo 7 conjugados PS-PD, 2 PS-TT (PS 6B e 23F) e 2 PS-DT (PS 18C e 19F) tanto em modelos de imunogenicidade de camundongo quanto de porquinho da índia.
Os camundongos foram intramuscularmente imunizados três vezes com 1/10 de uma dose humana das vacinas (0,1 pg de PS). As amostras de sangue foram coletadas no dia 42 e a resposta imune direcionada contra cada polissacarídeo foi medida pelo ELISA.
Porquinhos da índia foram intramuscularmente imunizados três vezes com 1/4 de uma dose humana das vacinas (0,25 pg de PS). Infanrix Hexa foi co-administrada de modo a imitar a situação humana. As amostras de sangue foram coletadas no dia 42 e a resposta imune direcionada contra cada polissacarídeo foi medida pelo ELISA.
Uma resposta imune aumentada direcionada contra a maioria dos polissacarídeos conjugados ao PD foi observada tanto em camundongos quanto em porquinhos da índia na formulação contendo dois polissacarídeos conjugados à TT (PS 6B e 23F) e DT (PS 18C e 19F) quando comparada com a formulação 11-V PD. Estas diferenças foram estatisticamente significantes contra PS 1, 4, 5, 9V e 14 assim como contra PS 1, 7F e 14 em camundongos e porquinhos da índia, respectivamente.
REIVINDICAÇÕES

Claims (17)

1. Composição imunogênica de Streptococcus. pneumoniae, caracterizada pelo fato de que compreende 12 ou mais sacarídeos capsulares de sorotipos de S. pneumoniae diferentes conjugados a 2 ou mais proteínas carreadoras diferentes, em que a composição compreende sorotipo sacarídeo capsular 19F conjugado ao toxóide da difteria (DT) ou CRM197 e 2-8 sacarídeos capsulares conjugados à proteína D de Haemophilus influenzae que representa uma minoria dos conjugados de sacarídeo capsular presentes na composição.
2. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que 19F é o único sacarídeo na composição conjugada ao toxóide da difteria (DT).
3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que 3, 4 ou 5 dos sacarídeos capsulares são conjugados à proteína D.
4. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de que um sacarídeo do sorotipo 4 é conjugado à proteína D.
5. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de que um sacarídeo do sorotipo 5 é conjugado à proteína D.
6. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de que um sacarídeo do sorotipo 7F é conjugado à proteína D.
7. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizada pelo fato de que um sacarídeo do sorotipo 9V é conjugado à proteína D.
8. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo fato de que um sacarídeo do sorotipo 14 é conjugado à proteína D.
9. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que um sacarídeo do sorotipo 22F é conjugado à proteína D.
10. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizada pelo fato de que um sacarídeo do sorotipo 23F é conjugado à proteína D.
11. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que compreende 2, 3, 4, 5 ou 6 proteínas carreadoras diferentes.
12. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que cada sacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae é conjugado a uma proteína carreadora em que cada uma é selecionada do grupo que consiste em: toxóide tetânico (TT), toxóide diftérico (DT), CRM197, fragmento C do toxóide tetânico, PhtD, fusões PhtDE, pneumolisina detoxificada (dPly) e proteína D de Haemophilus influenzae.
13. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma ou mais proteínas de S. pneumoniae não conjugadas ou conjugadas.
14. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende a composição imunogênica como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 13 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
15. Processo para fabricar uma vacina como definida na reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de misturar a composição imunogênica como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 13 com um excipiente farmaceuticamente aceitável.
16. Uso da composição imunogênica como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 13 ou vacina como definida na reivindicação 14, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doenças causadas pela infecção pela Streptococcus. pneumoniae.
17. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a doença é uma ou ambas dentre pneumonia ou doença pneumocócica invasiva (DPI) de humanos idosos, exacerbação de doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) de humanos idosos, meningite e/ou bacteriemia de humanos infantis, otite média de humanos infantis ou pneumonia e / ou conjuntivite de humanos infantis.
BRPI0813644A 2007-06-26 2008-06-24 composição imunogênica, vacina, processo para fabricar a mesma, e, uso da composição imunogênica ou vacina BRPI0813644B8 (pt)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0712420A GB0712420D0 (en) 2007-06-26 2007-06-26 Vaccine
GB0712435A GB0712435D0 (en) 2007-06-26 2007-06-26 Vaccine
GB0712435.7 2007-06-26
GB0712428A GB0712428D0 (en) 2007-06-26 2007-06-26 Vaccine
GB0712420.9 2007-06-26
GB0712428.2 2007-06-26
PCT/EP2008/057999 WO2009000826A1 (en) 2007-06-26 2008-06-24 Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates

Publications (3)

Publication Number Publication Date
BRPI0813644A2 BRPI0813644A2 (pt) 2014-12-23
BRPI0813644B1 true BRPI0813644B1 (pt) 2020-03-10
BRPI0813644B8 BRPI0813644B8 (pt) 2021-05-25

Family

ID=39816570

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0813307A BRPI0813307C1 (pt) 2007-06-26 2008-06-24 composição imunogênica, vacina, e, processo para fabricar a vacina
BRPI0813644A BRPI0813644B8 (pt) 2007-06-26 2008-06-24 composição imunogênica, vacina, processo para fabricar a mesma, e, uso da composição imunogênica ou vacina

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0813307A BRPI0813307C1 (pt) 2007-06-26 2008-06-24 composição imunogênica, vacina, e, processo para fabricar a vacina

Country Status (20)

Country Link
US (3) US20100183662A1 (pt)
EP (4) EP2687228B1 (pt)
JP (4) JP2010531330A (pt)
KR (2) KR20100045445A (pt)
CN (3) CN104873965B (pt)
AU (2) AU2008267208B2 (pt)
BR (2) BRPI0813307C1 (pt)
CA (3) CA2690710C (pt)
CY (1) CY1116901T1 (pt)
DK (1) DK2167121T3 (pt)
EA (3) EA201391788A1 (pt)
ES (2) ES2552366T3 (pt)
HR (1) HRP20151122T1 (pt)
HU (1) HUE026853T2 (pt)
MX (1) MX2009013949A (pt)
PL (1) PL2167121T3 (pt)
PT (1) PT2167121E (pt)
RS (1) RS54349B1 (pt)
SI (1) SI2167121T1 (pt)
WO (3) WO2009000824A2 (pt)

Families Citing this family (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1296715E (pt) * 2000-06-29 2012-01-19 Smithkline Beecham Biolog Composição vacinal multivalente
CN102716480B (zh) 2005-04-08 2023-03-21 惠氏有限责任公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物
KR101408113B1 (ko) 2005-06-27 2014-06-16 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신 제조 방법
CA2808919C (en) 2005-12-22 2016-04-19 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Streptococcus pneumoniae capsular saccharide vaccine
EP2687228B1 (en) 2007-06-26 2017-07-19 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates
AU2009335824B2 (en) * 2008-12-18 2013-07-04 Wyeth Llc Method for controlling Streptococcus pneumoniae polysaccharide molecular weight using carbon
WO2010125480A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pneumococcal vaccine and uses thereof
ES2670576T3 (es) 2009-09-03 2018-05-31 Pfizer Vaccines Llc Vacuna de PCSK9
EP2515940A4 (en) * 2009-12-22 2013-10-09 Sanofi Pasteur Ltd IMMUNOGENIC COMPOSITIONS AND CORRESPONDING METHODS
TW201136603A (en) * 2010-02-09 2011-11-01 Merck Sharp & Amp Dohme Corp 15-valent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine composition
GB201003924D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
GB201003922D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
CA2798331C (en) 2010-05-14 2022-03-15 Baxter International Inc. Ospa chimeras and use thereof in vaccines
WO2012131504A1 (en) 2011-03-02 2012-10-04 Pfizer Inc. Pcsk9 vaccine
CN103648489A (zh) 2011-05-11 2014-03-19 儿童医疗中心有限公司 多抗原提呈免疫原性组合物及其方法和用途
WO2012163289A1 (zh) * 2011-06-01 2012-12-06 厦门大学 包含白喉毒素无毒突变体crm197或其片段的融合蛋白
WO2013078172A1 (en) * 2011-11-23 2013-05-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Tempo-mediated glycoconjugation of an immunogenic composition against campylobacter jejuni
KR102057217B1 (ko) 2012-06-20 2020-01-22 에스케이바이오사이언스 주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
CN102759618A (zh) * 2012-07-18 2012-10-31 成都欧林生物科技股份有限公司 用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法
WO2014045621A1 (ja) * 2012-09-19 2014-03-27 国立大学法人大阪大学 肺炎球菌表面タンパク質ａを含む肺炎球菌ワクチン
GB201218660D0 (en) 2012-10-17 2012-11-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
KR20150072444A (ko) * 2012-10-17 2015-06-29 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 하나 이상의 스트렙토코커스 뉴모니애 캡슐 사카라이드 컨쥬게이트 및 해모필루스 인플루엔자로부터의 단백질 Ｅ 및／또는 ＰｉｌＡ를 포함하는 단백질 성분을 포함하는 면역원성 조성물
KR20140075196A (ko) * 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
KR20140075201A (ko) * 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
WO2014097099A2 (en) 2012-12-20 2014-06-26 Pfizer Inc. Glycoconjugation process
CA2900008A1 (en) 2013-02-07 2014-08-14 Children's Medical Center Corporation Protein antigens that provide protection against pneumococcal colonization and/or disease
US11708411B2 (en) 2013-12-20 2023-07-25 Wake Forest University Health Sciences Methods and compositions for increasing protective antibody levels induced by pneumococcal polysaccharide vaccines
PL3096785T3 (pl) * 2014-01-21 2021-03-08 Pfizer Inc. Kompozycje immunogenne zawierające skoniugowane antygeny sacharydów otoczkowych i ich zastosowania
RU2710393C2 (ru) 2014-01-21 2019-12-26 Пфайзер Инк. Способ получения иммуногенного конъюгата капсульный полисахарид Streptococcus pneumoniae-белок-носитель
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
PL3583947T3 (pl) 2014-01-21 2024-04-02 Pfizer Inc. Polisacharydy otoczkowe streptococcus pneumoniae i ich koniugaty
EP3443983B1 (en) 2014-02-14 2022-07-20 Pfizer Inc. Immunogenic glycoprotein conjugates
CN103893751B (zh) * 2014-03-26 2016-04-20 天津康希诺生物技术有限公司 一种肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗及其制备方法
WO2015183676A1 (en) * 2014-05-29 2015-12-03 Kapre Subhash V Synthetic peptides as carriers for conjugation with polysaccharides
US10220083B2 (en) 2014-09-26 2019-03-05 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Vaccines against Streptococcus pneumoniae serotype 8
EP3000820A1 (en) * 2014-09-26 2016-03-30 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Synthetic vaccines against Streptococcus pneumoniae serotype 8
US9815886B2 (en) 2014-10-28 2017-11-14 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
CN104306965B (zh) * 2014-10-31 2017-05-10 康希诺生物股份公司 预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物及制备方法
EP3244917B1 (en) 2015-01-15 2023-04-19 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
IL297740A (en) 2015-05-04 2022-12-01 Pfizer Protein-polysaccharide conjugates of group b streptococcus, methods for preparing the conjugates, immunogenic preparations containing conjugates and their uses
WO2016198170A1 (en) * 2015-06-08 2016-12-15 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Vaccines against streptococcus pneumoniae serotype 5
BR112017026343A2 (pt) * 2015-06-08 2019-11-19 Serum Inst Of India Private Ltd métodos para aperfeiçoar a adsorção de conjugados de proteína-polissacarídeo e formulação de vacina multivalente assim obtida
DK3313436T3 (da) 2015-06-23 2021-03-08 Biological E Ltd Multivalent pneumokok-konjugatvaccine
MY192183A (en) 2015-07-21 2022-08-05 Pfizer Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
MY177587A (en) * 2015-09-10 2020-09-22 Inventprise Llc Multivalent vlp conjugates
GB201518684D0 (en) * 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
JP6884145B2 (ja) 2015-11-20 2021-06-09 ファイザー・インク 肺炎連鎖球菌ワクチンにおいて用いるための免疫原性組成物
CN106110317A (zh) * 2016-06-30 2016-11-16 武汉博沃生物科技有限公司 肺炎球菌‑百白破联合疫苗
AU2017306708B2 (en) 2016-08-05 2021-08-26 Sk Bioscience Co., Ltd. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
SG11201900794PA (en) * 2016-08-05 2019-02-27 Sanofi Pasteur Inc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EP3518965A1 (en) 2016-09-30 2019-08-07 Biological E Limited Multivalent pneumococcal vaccine compositions comprising polysaccharide-protein conjugates
KR102083973B1 (ko) * 2016-10-28 2020-04-23 주식회사 엘지화학 향상된 IgG 역가를 갖는 다가면역원성 조성물 및 이의 용도
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
WO2018126229A2 (en) 2016-12-30 2018-07-05 Sutrovax, Inc. Polypeptide-antigen conjugates with non-natural amino acids
CN110198735A (zh) 2017-01-20 2019-09-03 辉瑞公司 用于肺炎球菌疫苗中的免疫原性组合物
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
AU2018243910A1 (en) 2017-03-28 2019-11-14 The Children's Medical Center Corporation A multiple antigen presenting system (MAPS)-based staphylococcus aureus vaccine, immunogenic composition, and uses thereof
BR112019026192B1 (pt) * 2017-06-10 2022-05-10 Inventprise, Llc Vacinas de conjugado multivalente com polissacarídeos de conjugado bivalente ou multivalente que fornecem imunogenicidade e avidez melhoradas
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
KR20200041311A (ko) 2017-06-23 2020-04-21 노소코미얼 백신 코포레이션 면역원성 조성물
GEP20227420B (en) 2017-12-06 2022-10-10 Merck Sharp & Dohme Llc Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
CN108003225A (zh) * 2017-12-11 2018-05-08 北京北生研生物制品有限公司 一种破伤风类毒素的精制方法
AU2019215216A1 (en) 2018-02-05 2020-07-23 Sk Bioscience Co., Ltd. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
MX2020007939A (es) 2018-02-05 2020-09-03 Sanofi Pasteur Inc Composicion del conjugado proteina-polisacarido multivalente nuemococica.
BR112020021296A2 (pt) 2018-04-18 2021-01-26 Sk Bioscience Co., Ltd. polissacarídeo capsular de streptococcus pneumoniae e conjugado imunogênico do mesmo
CN108524926B (zh) * 2018-06-29 2021-06-29 康希诺生物股份公司 一种多价肺炎球菌结合疫苗的制剂组合及其应用
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
JP2021535921A (ja) 2018-09-12 2021-12-23 アフィニバックス、インコーポレイテッド 多価肺炎球菌ワクチン
JP2022512345A (ja) 2018-12-12 2022-02-03 ファイザー・インク 免疫原性多重ヘテロ抗原多糖－タンパク質コンジュゲートおよびその使用
JOP20210148A1 (ar) 2018-12-19 2023-01-30 Merck Sharp & Dohme تركيبات تشتمل على متقارنات بولي سكاريد-بروتين للمكورات العقدية الرئوية وطرق استخدامها
JP7239509B6 (ja) 2019-02-22 2023-03-28 ファイザー・インク 細菌多糖類を精製するための方法
CA3136278A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
KR20220042378A (ko) 2019-07-31 2022-04-05 사노피 파스퇴르 인코포레이티드 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물 및 그 사용 방법
KR20220092572A (ko) 2019-11-01 2022-07-01 화이자 인코포레이티드 에스케리키아 콜라이 조성물 및 그 방법
CA3171864A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Pfizer Inc. Purification of saccharides
CN115605498A (zh) 2020-02-23 2023-01-13 辉瑞公司（Us） 大肠杆菌组合物及其方法
CN111304816B (zh) 2020-02-24 2022-01-14 刘舞 一种牵拉机构
EP4232593A1 (en) 2020-10-22 2023-08-30 Pfizer Inc. Methods for purifying bacterial polysaccharides
MX2023004912A (es) 2020-10-27 2023-05-16 Pfizer Composiciones de escherichia coli y metodos de las mismas.
KR20230097160A (ko) 2020-11-04 2023-06-30 화이자 인코포레이티드 폐렴구균 백신에 사용하기 위한 면역원성 조성물
US20220202923A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Pfizer Inc. E. coli fimh mutants and uses thereof
WO2022234416A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Pfizer Inc. Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections
CA3218544A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Pfizer Inc. Vaccination against bacterial and betacoronavirus infections
BR112023023671A2 (pt) 2021-05-28 2024-02-06 Pfizer Composições imunogênicas compreendendo antígenos de sacarídeo capsular conjugados e usos dos mesmos
TW202306969A (zh) 2021-05-28 2023-02-16 美商輝瑞大藥廠 包含結合之莢膜醣抗原的免疫原組合物及其用途
CN115721709A (zh) * 2021-08-27 2023-03-03 康希诺生物股份公司 一种肺炎球菌结合疫苗制备方法
WO2023135515A1 (en) 2022-01-13 2023-07-20 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2023161817A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Pfizer Inc. Methods for incorporating azido groups in bacterial capsular polysaccharides
WO2023218322A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Pfizer Inc. Process for producing of vaccine formulations with preservatives
WO2024084397A1 (en) 2022-10-19 2024-04-25 Pfizer Inc. Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections
WO2024110827A1 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Pfizer Inc. Methods for preparing conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024110839A2 (en) 2022-11-22 2024-05-30 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024116096A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Pfizer Inc. Pneumococcal conjugate vaccine formulations

Family Cites Families (163)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4057685A (en) 1972-02-02 1977-11-08 Abbott Laboratories Chemically modified endotoxin immunizing agent
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
DE3071552D1 (en) 1979-09-21 1986-05-22 Hitachi Ltd Semiconductor switch
BE889979A (fr) 1981-08-14 1982-02-15 Smith Kline Rit Procede de preparation de polysaccharides bacteriens capsulaires antigeniques purifies, produits obtenus et leur utilisation
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
SE8205892D0 (sv) 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
US4459286A (en) 1983-01-31 1984-07-10 Merck & Co., Inc. Coupled H. influenzae type B vaccine
US4695624A (en) 1984-05-10 1987-09-22 Merck & Co., Inc. Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency
US4808700A (en) 1984-07-09 1989-02-28 Praxis Biologics, Inc. Immunogenic conjugates of non-toxic E. coli LT-B enterotoxin subunit and capsular polymers
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4709017A (en) 1985-06-07 1987-11-24 President And Fellows Of Harvard College Modified toxic vaccines
IT1187753B (it) 1985-07-05 1987-12-23 Sclavo Spa Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente
US5173294A (en) 1986-11-18 1992-12-22 Research Foundation Of State University Of New York Dna probe for the identification of haemophilus influenzae
US4950740A (en) 1987-03-17 1990-08-21 Cetus Corporation Recombinant diphtheria vaccines
JP2851288B2 (ja) 1987-06-05 1999-01-27 アメリカ合衆国 癌診断および管理における自己分泌運動性因子
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5785973A (en) 1988-02-01 1998-07-28 Praxis Biologics, Inc. Synthetic peptides representing a T-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
DE3841091A1 (de) 1988-12-07 1990-06-13 Behringwerke Ag Synthetische antigene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
JP3237842B2 (ja) 1988-12-16 2001-12-10 オランダ国 ニューモリシンミュータント及びそれから製造されたニューモコッカルワクチン
EP0378881B1 (en) 1989-01-17 1993-06-09 ENIRICERCHE S.p.A. Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
EP0382271B1 (en) 1989-02-04 1994-12-21 Akzo Nobel N.V. Tocols as adjuvant in vaccine
CA2017507C (en) 1989-05-25 1996-11-12 Gary Van Nest Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
FR2649012B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Emulsions multiphasiques injectables
FR2649013B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Vaccins et vecteurs de principes actifs fluides contenant une huile metabolisable
AU651949B2 (en) 1989-07-14 1994-08-11 American Cyanamid Company Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
IL98715A0 (en) 1990-08-13 1992-07-15 American Cyanamid Co Filamentous hemaglutinin of bodetella pertussis as a carrier molecule for conjugate vaccines
US5153312A (en) 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
CA2059693C (en) 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
CA2059692C (en) 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
DK0571538T5 (da) 1991-02-15 2002-03-04 Uab Research Foundation Strukturgen for pneumokokprotein
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
GB9105992D0 (en) 1991-03-21 1991-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US5552146A (en) 1991-08-15 1996-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
CA2129899C (en) 1992-02-11 2011-01-04 James J. Mond Dual carrier immunogenic construct
IT1262896B (it) 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
MA22842A1 (fr) 1992-03-27 1993-10-01 Smithkline Beecham Biolog Procede de preparation de compositions de vaccin.
AU4230493A (en) 1992-05-06 1993-11-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin receptor-binding region
JP3428646B2 (ja) 1992-06-18 2003-07-22 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバードカレッジ ジフテリア毒素ワクチン
ATE188613T1 (de) 1992-06-25 2000-01-15 Smithkline Beecham Biolog Adjuvantien enthaltende impfstoffzusammensetzung
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
GB9224584D0 (en) 1992-11-23 1993-01-13 Connaught Lab Use of outer membrane protein d15 and its peptides as vaccine against haempohilus influenzae diseases
HU219056B (hu) 1993-03-23 2001-02-28 Smithkline Beecham Biologicals Sa 3-O-Dezacilezett monofoszforil-lipid A-t tartalmazó vakcinakészítmény
EP1300156A3 (en) 1993-05-18 2003-05-07 The Ohio State University Research Foundation Otitis media vaccine
JP3828145B2 (ja) 1993-09-22 2006-10-04 ヘンリー エム．ジャクソン ファウンデイション フォー ザ アドバンスメント オブ ミリタリー メディスン 免疫原性構成物の製造のための新規シアン化試薬を使った可溶性炭水化物の活性化方法
DK0729473T3 (da) 1993-11-17 2000-10-30 Deutsche Om Arzneimittel Gmbh Glucosamin-disaccharider, fremgangsmåde til deres fremstilling farmaceutisk sammensætning deraf og deres anvendelse
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6455673B1 (en) 1994-06-08 2002-09-24 President And Fellows Of Harvard College Multi-mutant diphtheria toxin vaccines
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain
ATE420171T1 (de) 1994-07-15 2009-01-15 Univ Iowa Res Found Immunomodulatorische oligonukleotide
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
ATE241384T1 (de) 1995-03-22 2003-06-15 Jackson H M Found Military Med Herstellung von immunogenen konstrukten unter verwendung von löslichen kohlehydraten, die durch organische cyanylierungs-reagenzien aktiviert wurden
GB9620795D0 (en) 1996-10-05 1996-11-20 Smithkline Beecham Plc Vaccines
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US5695768A (en) 1995-06-07 1997-12-09 Alberta Research Council Immunostimulating activity of Streptococcus pneumoniae serotype 8 oligosaccharides
GB9513074D0 (en) 1995-06-27 1995-08-30 Cortecs Ltd Novel anigen
US5666153A (en) 1995-10-03 1997-09-09 Virtual Shopping, Inc. Retractable teleconferencing apparatus
US6290970B1 (en) 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
US6090576A (en) 1996-03-08 2000-07-18 Connaught Laboratories Limited DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
ATE323721T1 (de) 1996-05-01 2006-05-15 Univ Rockefeller Cholin-bindendes protein, welches als gegen pneumokokken gerichtetes vakzin verwendet wird
US7341727B1 (en) 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
AR008242A1 (es) 1996-06-18 1999-12-29 Alza Corp Dispositivo para atravesar el estrato corneo de una superficie corporal
JP2000514308A (ja) 1996-08-16 2000-10-31 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 新規原核生物ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびそれらの使用
EP0941335A2 (en) 1996-10-31 1999-09-15 Human Genome Sciences Streptococcus pneumoniae polynucleotides and sequences
US6291654B1 (en) 1996-11-12 2001-09-18 Regents Of The University Of Minnesota Method for isolating a C3 binding protein of streptococcus pneumoniae
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
AU722574B2 (en) 1996-12-20 2000-08-10 Alza Corporation Device and method for enhancing transdermal agent flux
DE19708537A1 (de) 1997-03-03 1998-09-10 Biotechnolog Forschung Gmbh Neues Oberflächenprotein (SpsA-Protein) von Streptococcus pneumoniae etc.
US6299881B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
US6303347B1 (en) 1997-05-08 2001-10-16 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6764840B2 (en) 1997-05-08 2004-07-20 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
FR2763244B1 (fr) 1997-05-14 2003-08-01 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition vaccinale multivalente a porteur mixte
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
AU739129B2 (en) 1997-06-03 2001-10-04 Connaught Laboratories Limited Lactoferrin receptor genes of moraxella
GB9711990D0 (en) 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9713156D0 (en) 1997-06-20 1997-08-27 Microbiological Res Authority Vaccines
KR100619350B1 (ko) 1997-07-21 2006-09-05 박스터 헬쓰케어 에스.에이. 변형 면역성 뉴멀리신 백신조성물
DE69838992T2 (de) 1997-09-05 2008-12-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A., Rixensart Öl-in-Wasser Emulsionen mit Saponinen
GB9718901D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US6224880B1 (en) 1997-09-24 2001-05-01 Merck & Co., Inc. Immunization against Streptococcus pneumoniae using conjugated and unconjugated pneumoccocal polysaccharide vaccines
EP1017828A1 (en) 1997-09-24 2000-07-12 Regents Of The University Of Minnesota HUMAN COMPLEMENT C3-DEGRADING PROTEINASE FROM $i(STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE)
US5965714A (en) 1997-10-02 1999-10-12 Connaught Laboratories, Inc. Method for the covalent attachment of polysaccharides to protein molecules
AU756828B2 (en) 1997-12-02 2003-01-23 Powderject Vaccines, Inc. Transdermal delivery of particulate vaccine compositions
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
US7018637B2 (en) 1998-02-23 2006-03-28 Aventis Pasteur, Inc Multi-oligosaccharide glycoconjugate bacterial meningitis vaccines
TR200003498T2 (tr) 1998-04-07 2001-10-22 St. Jude Children's Research Hospital Amino asit sekansından oluşan bir polipetit, bunun aşıları ve kullanımları
EP1067962B1 (en) 1998-04-07 2010-03-24 MedImmune, LLC Derivatives of pneumococcal choline binding proteins for vaccines
AU770378B2 (en) 1998-04-23 2004-02-19 Uab Research Foundation Pneumococcal surface protein C(PspC), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor
EP1089913A1 (fr) 1998-06-08 2001-04-11 SCA Emballage France Emballage a remise a plat rapide
GB9812613D0 (en) 1998-06-11 1998-08-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
AU761396B2 (en) 1998-06-30 2003-06-05 Om Pharma Novel acyl pseudodipeptides, preparation method and pharmaceutical compositions containing same
CN1263510C (zh) 1998-08-19 2006-07-12 巴克斯特健康护理股份有限公司 多糖－蛋白质缀合物或寡糖－蛋白质缀合物、其制备方法及其应用
GB9818548D0 (en) 1998-08-25 1998-10-21 Microbiological Res Authority Treatment of mucas hypersecretion
IL142017A0 (en) 1998-09-24 2002-03-10 Univ Minnesota Human complement c3-degrading polypeptide from streptococcus pneumoniae
US6541616B1 (en) 1998-10-01 2003-04-01 Antex Biologics Inc. Moraxella catarrhalis protein, gene sequence and uses thereof
DE69935606T9 (de) 1998-10-16 2021-03-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Adjuvanzsysteme und impfstoffe
GB2359228A (en) 1998-11-17 2001-08-15 Schlumberger Technology Corp Transmitting information over a communication link
AU2027400A (en) 1998-11-19 2000-06-05 St. Jude Children's Research Hospital Identification and characterization of novel pneumococcal choline binding proteins, cbpg and cbpd, and diagnostic and therapeutic uses thereof
JP4689044B2 (ja) 1998-12-21 2011-05-25 メディミューン，インコーポレーテッド ワクチン用の肺炎連鎖球菌タンパク質と免疫原断片
KR100802198B1 (ko) 1998-12-23 2008-02-11 샤이어 바이오켐 인코포레이티드 신규한 스트렙토코커스 항원
CZ303653B6 (cs) * 1999-03-19 2013-01-30 Smithkline Beecham Biologicals S. A. Imunogenní prostredek
WO2000061761A2 (en) 1999-04-09 2000-10-19 Techlab, Inc. Recombinant clostridium toxin a protein carrier for polysaccharide conjugate vaccines
US6558670B1 (en) 1999-04-19 2003-05-06 Smithkline Beechman Biologicals S.A. Vaccine adjuvants
WO2000062800A2 (en) 1999-04-19 2000-10-26 Smithkline Beecham Biologicals Sa Adjuvant composition comprising saponin and an immunostimulatory oligonucleotide
JP2003501110A (ja) 1999-06-10 2003-01-14 メディミューン，インコーポレーテッド 肺炎連鎖球菌タンパク質とワクチン
US6319224B1 (en) 1999-08-20 2001-11-20 Bioject Medical Technologies Inc. Intradermal injection system for injecting DNA-based injectables into humans
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
US20040191834A1 (en) 1999-10-28 2004-09-30 Laferriere Craig Antony Joseph Novel method
AU1581400A (en) 1999-12-22 2001-07-03 Om Pharma Acyl pseudopeptides bearing a functionalised auxiliary spacer
FR2806304B1 (fr) 2000-03-17 2002-05-10 Aventis Pasteur Conjugues polysaccharidiques du pneumocoque a usage vaccinal contre le tetanos et la diphterie
GB0007432D0 (en) 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Proteins for use as carriers in conjugate vaccines
WO2001098334A2 (en) 2000-06-20 2001-12-27 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
PT1296715E (pt) * 2000-06-29 2012-01-19 Smithkline Beecham Biolog Composição vacinal multivalente
GB0108364D0 (en) 2001-04-03 2001-05-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine composition
GB0103170D0 (en) 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
ES2261453T3 (es) 2000-08-04 2006-11-16 Corixa Corporation Nuevos compuestos inmunoefectores.
GB0022742D0 (en) 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
ES2298269T3 (es) 2000-09-26 2008-05-16 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulacion de la actividad inmunoestimulante de analogos oligonucleotidicos inmunoestimulantes mediante cambios quimicos posicionales.
WO2002078673A1 (fr) 2001-03-29 2002-10-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Procede de production d'un medicament sous forme de granules fins
US20030035806A1 (en) 2001-05-11 2003-02-20 D'ambra Anello J. Novel meningitis conjugate vaccine
GB0123580D0 (en) * 2001-10-01 2001-11-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
GB0130215D0 (en) * 2001-12-18 2002-02-06 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
AU2002351623A1 (en) 2001-12-20 2003-07-09 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
KR100885008B1 (ko) 2002-02-04 2009-02-20 코릭사 코포레이션 신규 면역효과기 화합물
KR101239242B1 (ko) 2002-08-02 2013-03-11 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 항원 조합물을 포함하는 나이세리아 백신 조성물
US8084235B2 (en) 2003-03-13 2011-12-27 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Purification process for bacterial cytolysin
US20060251675A1 (en) 2003-03-17 2006-11-09 Michael Hagen Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
GB0408977D0 (en) 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
BRPI0510315A (pt) 2004-04-30 2007-10-16 Chiron Srl integração de vacinação com conjugado meningocócico
JP5174457B2 (ja) 2004-05-11 2013-04-03 デ スタート デール ネーダーランデン， フェルテヘンウォールディヒィト ドール デ ミニステール ファン フォルクスヘーゾンドハイド， フェルザイン アン スポルト アジュバントとしての髄膜炎菌ｌｇｔＢＬＯＳ
GB0421083D0 (en) 2004-09-22 2004-10-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Purification process
CN102716480B (zh) * 2005-04-08 2023-03-21 惠氏有限责任公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物
KR101408113B1 (ko) * 2005-06-27 2014-06-16 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신 제조 방법
BRPI0615420A2 (pt) * 2005-09-01 2011-05-17 Novartis Vaccines & Diagnostic vacinação múltipla que inclui meningococo do sorogrupo c
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
GB0607088D0 (en) * 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
CA2808919C (en) 2005-12-22 2016-04-19 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Streptococcus pneumoniae capsular saccharide vaccine
EP2687228B1 (en) 2007-06-26 2017-07-19 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0813307C1 (pt) 2021-05-25
EP2687228B1 (en) 2017-07-19
AU2008267210B2 (en) 2012-01-19
AU2008267208B2 (en) 2012-01-19
EP2170379B1 (en) 2017-03-22
CA2690708A1 (en) 2008-12-31
HRP20151122T1 (hr) 2015-11-20
CN101883583A (zh) 2010-11-10
MX2009013949A (es) 2010-05-24
KR20100045445A (ko) 2010-05-03
BRPI0813307B8 (pt) 2020-02-04
CN101784282B (zh) 2015-07-08
JP5848790B2 (ja) 2016-01-27
US20100239604A1 (en) 2010-09-23
WO2009000825A2 (en) 2008-12-31
BRPI0813644B8 (pt) 2021-05-25
EP2167121A1 (en) 2010-03-31
EP2170379A2 (en) 2010-04-07
SI2167121T1 (sl) 2015-12-31
US9610340B2 (en) 2017-04-04
CA2690710C (en) 2016-10-18
US20100183662A1 (en) 2010-07-22
JP2010531330A (ja) 2010-09-24
BRPI0813307B1 (pt) 2020-01-21
EA201391788A1 (ru) 2014-08-29
KR20100045446A (ko) 2010-05-03
PT2167121E (pt) 2015-12-02
AU2008267210A1 (en) 2008-12-31
CN101883583B (zh) 2017-05-17
JP2010531329A (ja) 2010-09-24
BRPI0813644A2 (pt) 2014-12-23
EP2687228A3 (en) 2014-04-30
WO2009000825A3 (en) 2009-06-25
EP2167120A2 (en) 2010-03-31
WO2009000824A2 (en) 2008-12-31
EP2687228A2 (en) 2014-01-22
ES2626662T3 (es) 2017-07-25
KR101579947B1 (ko) 2015-12-28
US20100209450A1 (en) 2010-08-19
EA200901578A1 (ru) 2010-08-30
CN104873965A (zh) 2015-09-02
EP2167121B1 (en) 2015-09-02
US9610339B2 (en) 2017-04-04
CA2690707A1 (en) 2008-12-31
AU2008267208A1 (en) 2008-12-31
CN101784282A (zh) 2010-07-21
EA200901576A1 (ru) 2010-06-30
JP2010531331A (ja) 2010-09-24
PL2167121T3 (pl) 2016-01-29
WO2009000824A3 (en) 2009-03-05
CA2690710A1 (en) 2008-12-31
JP5489993B2 (ja) 2014-05-14
EA020817B1 (ru) 2015-02-27
HUE026853T2 (en) 2016-08-29
RS54349B1 (en) 2016-02-29
WO2009000826A1 (en) 2008-12-31
ES2552366T3 (es) 2015-11-27
JP5476295B2 (ja) 2014-04-23
EA200901576A8 (ru) 2014-09-30
DK2167121T3 (en) 2015-11-23
CN104873965B (zh) 2018-09-11
BRPI0813307A2 (pt) 2014-12-23
JP2014139192A (ja) 2014-07-31
CY1116901T1 (el) 2017-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9884113B2 (en) Pneumoccal polysacchride conjugate vaccine
JP5848790B2 (ja) 肺炎連鎖球菌莢膜多糖コンジュゲートを含むワクチン
AU2013200552B9 (en) Conjugate vaccines
MX2008008139A (en) Pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B06T Formal requirements before examination [chapter 6.20 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 10/03/2020, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.

B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 24/06/2008 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF