CN109554415B

CN109554415B - 提高thaxtomin发酵产量的方法

Info

Publication number: CN109554415B
Application number: CN201710886608.2A
Authority: CN
Inventors: 娄春波; 赵学金
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2017-09-27
Filing date: 2017-09-27
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2037-09-27
Also published as: CN114875094B; CN109554415A; CN114875094A

Abstract

本发明涉及一种通过异源表达thaxtomin生物合成基因簇发酵生产thaxtomin A、thaxtomin B或thaxtomin D的方法。在优选的实施方式中，进一步应用合成生物学策略，使用基因簇编辑技术对thaxtomin生物合成途径进行重新设计，将组成型强启动子元件插入到基因簇中的txtAB、txtED和/或txtC操纵子转录起始位点的上游，进而提高thaxtomin的产量。

Description

提高thaxtomin发酵产量的方法

技术领域

本发明涉及微生物工程领域。更具体而言，本发明涉及利用合成生物学方法对thaxtomin表达菌株的thaxtomin生物合成基因簇进行异源表达，提高thaxtomin的产量。

背景技术

thaxtomin是由植物病原体链霉菌产生的一类植物毒素，可造成植物块根或块茎发生木栓化疮痂状病变。已经发现thaxtomin抑制正在发育的植物细胞合成纤维素，因此能够将其作为天然除草剂，控制农田杂草生长而不对作物产生毒性(CN104284583A)。此外，还可将thaxtomin用于控制藻类污染(CN101677561A)。目前已知产生thaxtomin的链霉菌有4种，分别是疮痂链霉菌(Streptomyces scabies)、酸性疮痂链霉菌(Streptomycesacidiscabies)、番薯链霉菌(Streptomyces ipomoea)以及肿痂链霉菌(Streptomycesturgidiscabies)。

已报道制备包括thaxtomin A、thaxtomin B、thaxtomin C和thaxtomin D在内的多种thaxtomin类化合物的化学合成方法(J.Gelin等，J.Org.Chem.58，1993，第3473-3475页；J.Moyroud等，Tetrahedron 52，1996，第8525-8543页；US20140275541)。另外，加拿大已经批准将灭活的酸性疮痂链霉菌RL-110^T菌株直接用作除草剂。然而目前，发酵生产thaxtomin类化合物的工艺仍存在发酵周期长(需要7-10天)以及产量低(天然产thaxtomin菌株的发酵产量一般为约20μg/mL)等缺陷。虽然本领域已预测出thaxtomin生物合成通路中的功能基因(Appl.Microbio.Biotechmol.，2013，97:8439-8453；Nature ChemicalBiology，8:814-816，2012；Antonie van Leeuwenhoek，2008，94:3-10；Francis IM等，2015，doi:10.1128/mBio.02018-14)，然而，本领域还没有能够有效改进thaxtomin合成通路从而提高thaxtomin产量的方法。

发明内容

在第一方面，本发明提供了一种生产thaxtomin的方法，所述方法包括在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)的thaxtomin基因簇中的thaxtomin非核糖体肽合成酶A(TxtA)、thaxtomin非核糖体肽合成酶B(TxtB)、细胞色素P450型单加氧酶(TxtC)、NO合酶加氧酶(TxtD)以及4-硝基色氨酸合成酶(TxtE)，以及对所述异源链霉菌进行发酵；其中，所述异源链霉菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、白色链霉菌(Streptomyces albus)以及委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)。

在第二方面，本发明提供了一种提高thaxtomin产量的方法，所述方法包括将编码酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的片段转化至异源链霉菌；其中，所述异源链霉菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌、白色链霉菌以及委内瑞拉链霉菌。

在第三方面，本发明提供了一种细菌，所述细菌表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE；其中，所述细菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌、白色链霉菌或委内瑞拉链霉菌。

附图说明

图1为目前预测的thaxtomin A体内合成途径。图1a显示thaxtomin基因簇结构。其中，txtA-txtE和txtR的转录产物分别是TxtA-TxtE和TxtR。txtA和txtB位于同一操纵子且转录偶联(合称为txtAB)。txtD和txtE之间间隔很短，推测也为同一操纵子(合称为txtED)。未标注部分推测与转座酶相关。TxtA-TxtE和TxtR序列在疮痂链霉菌、酸性疮痂链霉菌和肿痂链霉菌中保守。图1b显示thaxtomin体内合成途径。其中，化合物1为thaxtomin D。化合物2为L-4-硝基色氨酸。

图2显示根据实施例1，构建pSET156-thax质粒的原理图。pSET156-thax为带有酸性疮痂链霉菌thaxtomin基因簇的重组质粒。在体外利用sgRNA介导的Cas9对酸性疮痂链霉菌基因组thaxtomin基因簇的上下游进行切割，并将其连入线性化的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pSET156质粒，得到带有酸性疮痂链霉菌thaxtomin基因簇的重组质粒pSET156-thax。

图3显示根据实施例2，对天然宿主和各异源链霉菌宿主发酵液中thaxtomin A进行检测的结果。图3a为发酵液的HPLC检测结果。检测在380nm紫外光下进行。Thaxtomin Astandard为thaxtomin A标准样品(Sigma)，指示thaxtomin A的出峰时间在4.6min。S.acidiscabies为野生型酸性疮痂链霉菌发酵液的HPLC结果，S.lividans/Thax、S.venezuelae/Thax、S.coelicolor/Thax以及S.albus/Thax分别为带有pSET156-thax质粒的变铅青链霉菌、委内瑞拉链霉菌、天蓝色链霉菌以及白色链霉菌发酵液的HPLC结果。图3b为对图3a的定量分析，显示不同异源宿主的thaxtomin A发酵产量。图3c为对带有pSET156-thax质粒的天蓝色链霉菌(S.coelicolor/Thax)的发酵液进行LC-MS测试的结果；“Thaxtomin A”表示作为对照的thaxtomin A标准品的LC-MS测试结果。

图4显示根据实施例3，对thaxtomin基因簇进行优化。图4a为改造的示意图。thax为酸性疮痂链霉菌的野生型thaxtomin基因簇。thax-pAE为针对酸性疮痂链霉菌野生型thaxtomin基因簇，在txtA的上游插入启动子SPL42，在txtE的上游插入启动子SPL43，并删除SPL42与SPL43之间的片段，该片段包含txtR和与产生thaxtomin A无关的基因。thax-pAEC为在进行thax-pAE改造的基础上，进一步在txtC的上游插入启动子SPL30。图4b为野生型和经改造的各天蓝色链霉菌发酵液中thaxtomin A的浓度。图4c为野生型和经改造的各委内瑞拉链霉菌发酵液中thaxtomin A的浓度。

图5为根据实施例4，对txtAB、txtED和txtC操纵子的启动子进行组合优化。图5a为针对各操纵子的候选启动子的示意图。图5c为各菌株对应的启动子组合。图5b为各菌株的thaxtomin A发酵产量。

具体实施方式

本发明通过异源表达thaxtomin生物合成基因簇，使得对缺少其背景研究的天然宿主进行基因通路改造成为可能。通过在背景清晰的异源宿主中对基因簇功能模块进行重构和优化，避免了天然宿主内源的复杂调控的限制。

在一些实施方式中，通过在天蓝色链霉菌、白色链霉菌或委内瑞拉链霉菌中表达TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE，重构thaxtomin A合成通路的功能。在一些实施方式中，通过将酸性疮痂链霉菌的thaxtomin基因簇整体转化异源链霉菌宿主，实现所述异源表达。在另一些实施方式中，可将编码TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的各片段转化异源链霉菌宿主，实现所述异源表达。

thaxtomin生物合成通路在不同种的致病链霉菌中高度保守，催化各步骤的酶均位于链霉菌染色体的致病岛(pathogenicity island)。在本领域中，致病岛也被称为thaxtomin基因簇或thaxtomin生物合成基因簇。虽然致病岛在不同的链霉菌中有可能自发水平转移，但研究表明，这种自发水平转移后致病岛的基因在新宿主中几乎不表达。仅有极少数的突变株由于发生基因组水平(特别是调控元件和顺式作用元件)的突变而出现基因转录。有报道表明，致病岛外的其它基因也参与对thaxtomin生物合成的调控。例如，通过敲除编码纤维二糖感应蛋白的基因cebR，酸性疮痂链霉菌的thaxtomin A产量能够提高约10倍(The Cellobiose Sensor CebR is the Gatekeeper of Streptomyces scabiespathogenicity，mBio，2015)。

目前已知的能够由链霉菌产生的thaxtomin类化合物包括thaxtomin A、thaxtomin B、thaxtomin C和thaxtomin D。其中，thaxtomin A为由疮痂链霉菌、酸性疮痂链霉菌和肿痂链霉菌天然产生。thaxtomin B和thaxtomin D是thaxtomin A合成的中间产物。Thaxtomin C由番薯链霉菌天然产生。疮痂链霉菌、酸性疮痂链霉菌和肿痂链霉菌的thaxtomin基因簇非常相似。如图1a所示出的，上述三种链霉菌的thaxtomin基因簇均包含txtA-txtE的保守的编码序列和调控基因txtR，以及位于txtA和txtE之间除了txtR外的不保守序列。该不保守序列包含例如与基因簇的定植和转移相关的转座酶等序列。一般认为酸性疮痂链霉菌的thaxtomin基因簇包含其染色体片段(NZ_BCMK01000007.1)的第132205bp-156019bp的序列。

thaxtomin属于二酮哌嗪类化合物，它是由两个氨基酸衍生物通过肽键缩合而成的环二肽。二酮哌嗪类化合物的生物合成通常藉由非核糖体肽合成酶(NRPS)途径进行。NRPS多为以模块化形式存在的多功能复合酶系。基本的NRPS至少包括三个催化功能域：缩合结构域(Condensation domain，C域)、腺苷化结构域(Adenylation domain，A域)和肽酰载体蛋白结构域(Peptide carrier protein，PCP域)，其中A域负责底物氨基酸的识别与活化，并将活化后的氨基酸转移至PCP域上形成氨酰化硫酯，C域催化PCP域上的氨酰化硫酯的氨基与上游模块中PCP上的氨酰化硫酯的羧基缩合形成肽键。此外，经NRPS途径合成的二酮哌嗪类化合物的修饰主要包括异戊烯基化、甲基化或羟基化等。负责催化这些反应的修饰酶基因通常与非核糖体肽合成酶基因成簇存在，反应可能发生在NRPS组装之前或之后。

在thaxtomin A合成通路中，NRPS酶是TxtA和TxtB。TxtA和TxtB除具有NRPS酶的A-PCP-C基本结构域外，在A-PCP之间还存在一个甲基化酶结构域(M域)。TxtA和TxtB催化以ATP和Mg²⁺作为辅因子，从L-4-硝基色氨酸、L-苯丙氨酸和S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)组装为N,N’-二甲基二酮哌嗪骨架的反应(图1)。其中，L-4-硝基色氨酸为以L-色氨酸作为底物并以NO和O₂作为共同底物，以菠菜铁氧还蛋白(spinach ferredoxin)和铁氧还蛋白还原酶(ferredoxin reductase)作为替代电子供体反应生成。催化该NRPS组装之前L-Trp中芳香环C4位硝基化反应的酶是TxtE。TxtE对底物具有很强的立体选择性。序列比对表明TxtE是一类独特的P450氧化酶，其功能域不同于其它P450的相应区域。作为上述色氨酸硝化反应底物的NO由L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)的催化下产生。该NOS为txtD编码。本领域也将TxtD称为NO合酶加氧酶。此外，TxtC编码催化环二肽组装后对二酮哌嗪六元环进行羟基化的细胞色素P450型单加氧酶(Appl Microbiol Biotechnol 2013，97：8439-8453；二酮哌嗪类化合物生物合成研究进展，微生物学通报，2014)。

本领域已知晓的是，TxtA、TxtB、TxtC、TxtD和TxtE催化从基本氨基酸(L-色氨酸和L-苯丙氨酸)合成thaxtomin A的全路径。此外，研究发现，TxtC催化羟基化步骤之前的中间体thaxtomin D和thaxtomin B也具有除草剂活性。本领域已经知晓能够发酵生产thaxtomin A、thaxtomin B和thaxtomin D的方法(CN 103339251 B)。

如上所述，Thaxtomin合成簇还包括编码调控蛋白TxtR和一些具有转座酶功能的蛋白的序列。TxtR是AraC/XylS家族转录调控因子，TxtR与纤维二糖的相互作用能够激活thaxtomin合成通路的开启。研究表明，txtR基因的敲除减少TxtA、TxtB和TxtC的积累(Thaxtomin biosynthesis:the path to plant pathogenicity in the genusStreptomyces，Antonie van Leeuwenhoek，2008)。在本发明优选的实施方式中，通过敲除txtR并添加链霉菌组成型强启动子，能够使得TxtA-TxtE的表达不再需要纤维二糖或其它纤维素衍生物的诱导。

本领域已经对酸性疮痂链霉菌的基因组(NZ_BCMK01000007.1)进行了注释，标注了txtA-txtE和txtR的编码序列(CDS)。TxtA-TxtE和TxtR及其相应的基因序列txtA-txtE和txtR在表1中列出。根据Genbank的注释以及blast能够知晓的是，酸性疮痂链霉菌TxtA-TxtE和TxtR的蛋白序列与疮痂链霉菌的上述蛋白的序列同源性非常高。

表1

在一些实施方式中，对txtAB、txtC、txtD以及txtE基因中一个或多个的启动子进行改造，利用链霉菌通用的强启动子控制上述基因的表达，能够进一步增强thaxtomin的产量。此外，对酸性疮痂链霉菌内源启动子的改造能够避免使用纤维二糖作为诱导剂，因此无需表达TxtR。

在优选的实施方式中，所述在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的步骤进一步包括：在txtAB和txtED操纵子的上游添加链霉菌组成型强启动子。在更优选的实施方式中，所述在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的步骤进一步包括：在txtAB、txtED和txtC操纵子的上游添加链霉菌组成型启动子。也可在txtA-txtE中的一个或多个基因CDS的上游添加组成型启动子。

优选地，通过在txtA的CDS上游第1bp-1000bp的任一位置、更优选30-100bp处的任一位置处添加链霉菌组成型强启动子，实现在txtAB操纵子上游添加链霉菌组成型启动子。优选地，通过在txtE的CDS上游第1bp-1000bp的任一位置、更优选30-100bp处的任一位置添加链霉菌组成型强启动子，实现在txtED操纵子上游添加链霉菌组成型启动子。优选地，通过在txtC的CDS上游第1bp-1000bp的任一位置、更优选30-100bp处的任一位置添加链霉菌组成型强启动子，实现在txtC操纵子上游添加链霉菌组成型启动子。

本领域已知多种可用于天蓝色链霉菌、白色链霉菌或委内瑞拉链霉菌的强启动子，例如如如表2所列出的ermEp系列启动子、SF14P系列启动子、kasOP系列启动子，但并不限于此。上述启动子系列中各启动子名称及序列为本领域所知晓。

表2

定义

本文使用的术语thaxtomin具有本领域公知的含义，其为哌嗪2,5-二酮环的天然衍生物，在3位具有4-硝基吲哚-3-基甲基取代且在2位具有苄基取代，该苄基进一步任选地被OH取代。thaxtomin均具有环-(L-4-硝基色氨酰-L-苯丙氨酰)基本结构，可通过如式I所示的通式表示：

thaxtomin A：R1是甲基，R2是羟基，R3是甲基，R4是H，R5是羟基，R6是H。

thaxtomin B：R1是甲基，R2是羟基，R3是甲基，R4是H，R5是H，R6是H。

thaxtomin D：R1是甲基，R2是氢，R3是甲基，R4是H，R5是H，R6是H。

在本发明中，thaxtomin可为thaxtomin A、thaxtomin B或thaxtomin D，其结构分别如式II-式IV所示。

本发明所使用的异源链霉菌为常用的工业菌种天蓝色链霉菌、白色链霉菌以及委内瑞拉链霉菌。优选地，可使用的天蓝色链霉菌(S.coelicolor)包括M512、M1146和M1154菌株；可使用的白色链霉菌(S.albus)包括J1074菌株；可使用的委内瑞拉链霉菌(S.venezuelae)包括ATCC10712、ATCC 15439等菌株。

本领域所知晓的是，异源表达的基因可存在于质粒或被整合入异源宿主的基因组。本领域知晓在天蓝色链霉菌、白色链霉菌以及委内瑞拉链霉菌中表达异源蛋白所使用的质粒以及转化和表达方法。特别地，就转化而言，可使用大片段整体转化方法(例如catch方法^[6]等)或对各片段进行单独转化(例如使用传统的酶切连接、Gibson组装等方法)。本发明中使用的术语“组成型启动子”具有本领域公知的含义，指的是无需外源诱导即可开启下游基因转录的顺式作用元件。不希望被理论所限地，也可使用链霉菌通用的诱导型启动子进行本发明的启动子改造。

由实施例可以看出，根据本发明的一些实施方式，通过变更宿主，thaxtomin的发酵产量能够提高36％以上。在一些优选的实施方式中，在变更宿主的基础上进一步地对启动子进行改造，与野生型相比，改造菌株的thaxomin产量可提高3-20倍以上。

本文所述各方面的实施方式可由如下编号的段落说明：

1.一种生产thaxtomin的方法，所述方法包括在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE，以及对所述异源链霉菌进行发酵；其中，所述异源链霉菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌、白色链霉菌以及委内瑞拉链霉菌。

2.如段落1所述的方法，其中，所述thaxtomin选自于由如下化合物所组成的组中的一种：thaxtomin A、thaxtomin B以及thaxtomin D。

3.如段落1或2所述的方法，其中，将酸性疮痂链霉菌的thaxtomin基因簇整体转化入所述异源链霉菌，实现在所述异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE。

4.如段落3所述的方法，其中，所述thaxtomin基因簇包含酸性疮痂链霉菌染色体的132205bp-156019bp的序列。

5.如段落1或2所述的方法，其中，将编码TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的各片段转化入所述异源链霉菌，实现在所述异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE。

6.如段落5所述的方法，其中，所述异源链霉菌不表达TxtR。

7.如段落1-6中任一项所述的方法，其中，所述在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的步骤进一步包括：在txtAB和txtED操纵子的上游添加链霉菌组成型启动子。

8.如段落1-6中任一项所述的方法，其中，所述在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的步骤进一步包括：在txtAB、txtED和txtC操纵子的上游添加链霉菌组成型启动子。

9.如段落1-6中任一项所述的方法，其中，所述在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的步骤进一步包括：在所述酸性疮痂链霉菌的txtA、txtB、txtC、txtD以及txtE的CDS的上游添加链霉菌组成型启动子。

10.如段落7-9中任一项所述的方法，其中，在txtA的CDS上游第1bp-1000bp处的任一位置、优选30-100bp处的任一位置添加链霉菌组成型启动子。

11.如段落7-10中任一项所述的方法，其中，在txtE的CDS上游第1bp-1000bp处的任一位置、优选30-100bp处的任一位置添加链霉菌组成型启动子。

12.如段落8-11中任一项所述的方法，其中，在txtC的CDS上游第1bp-1000bp处的任一位置、优选30-100bp处的任一位置添加链霉菌组成型启动子。

13.如段落7-12中任一项所述的方法，其中，所述链霉菌组成型启动子选自于由如下启动子所组成的组：ermEp系列启动子、SF14P系列启动子、kasOP系列启动子。

14.如段落7-12中任一项所述的方法，其中，所述链霉菌组成型启动子选自于如下的启动子：ermE、21、ermE*、A9、A3、B10、57、ermEp1*、ermEp1、B4、61、81、C5、Tcp、SF14P、KasOP*、gapdhp(SG)^a、rpsLp(SG)^a、gapdhp(KR)^a、gapdhp(TP)^a、rpsLp(CF)^a、rpsLp(TP)^a、gapdhp(EL)^a、gapdhp(RE)^a、rpsLp(RE)^a、gapdhp(SA)^a、rpsLp(SA)^a、gapdhp(SV)^a、以及SP1-SP44。

15.一种提高thaxtomin产量的方法，所述方法包括将编码酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的片段转化至异源链霉菌；其中，所述异源链霉菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌、白色链霉菌以及委内瑞拉链霉菌。

16.如段落15所述的方法，其中，所述thaxtomin选自于由如下化合物所组成的组中的一种：thaxtomin A、thaxtomin B以及thaxtomin D。

17.如段落15或16所述的方法，其中，将酸性疮痂链霉菌的thaxtomin基因簇整体转化入所述异源链霉菌。

18.如段落17所述的方法，其中，所述thaxtomin基因簇包含酸性疮痂链霉菌染色体的132205bp-156019bp的序列。

19.如段落15或16所述的方法，其中，将编码TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的片段各自转化入所述异源链霉菌。

20.如段落19所述的方法，其中，所述异源链霉菌不表达TxtR。

21.如段落15-20中任一项所述的方法，其中，所述将编码酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的片段转化至异源链霉菌进一步包括：在所述转化之前，在txtAB和txtED操纵子的上游添加链霉菌组成型启动子。

22.如段落15-20中任一项所述的方法，其中，所述将编码酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的片段转化至异源链霉菌进一步包括：在所述转化之前，在txtAB、txtED和txtC操纵子的上游添加链霉菌组成型启动子。

23.如段落15-20中任一项所述的方法，其中，所述将编码酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的片段转化至异源链霉菌进一步包括：在所述转化之前，在所txtA、txtB、txtC、txtD以及txtE的CDS的上游添加链霉菌组成型启动子。

24.如段落21-23中任一项所述的方法，其中，在txtA的CDS上游第1bp-1000bp的任一位置、优选30-100bp处的任一位置处添加链霉菌组成型启动子。

25.如段落21-24中任一项所述的方法，其中，在txtE的CDS上游第1bp-1000bp的任一位置、优选30-100bp处的任一位置添加链霉菌组成型启动子。

26.如段落22-25中任一项所述的方法，其中，在txtC的CDS上游第1bp-1000bp的任一位置、优选30-100bp处的任一位置添加链霉菌组成型启动子。

27.如段落21-26中任一项所述的方法，其中，所述链霉菌组成型启动子选自于由如下启动子所组成的组：ermEp系列启动子、SF14P系列启动子、kasOP系列启动子。

28.如段落21-26中任一项所述的方法，其中，所述链霉菌组成型启动子选自于如下的启动子：ermE、21、ermE*、A9、A3、B10、57、ermEp1*、ermEp1、B4、61、81、C5、Tcp、SF14P、KasOP*、gapdhp(SG)^a、rpsLp(SG)^a、gapdhp(KR)^a、gapdhp(TP)^a、rpsLp(CF)^a、rpsLp(TP)^a、gapdhp(EL)^a、gapdhp(RE)^a、rpsLp(RE)^a、gapdhp(SA)^a、rpsLp(SA)^a、gapdhp(SV)^a、以及SP1-SP44。

29.一种细菌，所述细菌表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE；其中，所述细菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌、白色链霉菌或委内瑞拉链霉菌。

30.如段落29所述的细菌，其中，所述thaxtomin选自于由如下化合物所组成的组中的一种：thaxtomin A、thaxtomin B以及thaxtomin D。

31.如段落29或30所述的细菌，其中，将酸性疮痂链霉菌的thaxtomin基因簇整体转化入所述异源链霉菌，使得所述细菌表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE。

32.如段落31所述的细菌，其中，所述thaxtomin基因簇包含酸性疮痂链霉菌染色体的132205bp-156019bp的序列。

33.如段落29或30所述的细菌，其中，将编码TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的各片段转化入所述异源链霉菌，使得所述细菌表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE。

34.如段落33所述的细菌，其中，所述细菌不表达TxtR。

35.如段落29-35中任一项所述的细菌，其中，所述细菌的txtAB和txtED操纵子的上游添加有链霉菌组成型启动子。

36.如段落29-35中任一项所述的细菌，其中，所述细菌的txtAB、txtED和txtC操纵子的上游添加有链霉菌组成型启动子。

37.如段落29-35中任一项所述的细菌，其中，所述细菌的txtA、txtB、txtC、txtD以及txtE的CDS的上游添加有链霉菌组成型启动子。

38.如段落35-37中任一项所述的细菌，其中，所述细菌的txtA的CDS上游第1bp-1000bp处的任一位置、优选30-100bp处的任一位置添加有链霉菌组成型启动子。

39.如段落35-38中任一项所述的细菌，其中，所述细菌的txtE的CDS上游第1bp-1000bp处的任意任一位置、优选30-100bp处的任一位置添加有链霉菌组成型启动子。

40.如段落36-39中任一项所述的细菌，其中，所述细菌的txtC的CDS上游第1bp-1000bp处的任意任一位置、优选30-100bp处的任一位置添加有链霉菌组成型启动子。

41.如段落35-40中任一项所述的细菌，其中，所述链霉菌组成型启动子选自于由如下启动子所组成的组：ermEp系列启动子、SF14P系列启动子、kasOP系列启动子。

42.如段落35-40中任一项所述的细菌，其中，所述链霉菌组成型启动子选自于如下的启动子：ermE、21、ermE*、A9、A3、B10、57、ermEp1*、ermEp1、B4、61、81、C5、Tcp、SF14P、KasOP*、gapdhp(SG)^a、rpsLp(SG)^a、gapdhp(KR)^a、gapdhp(TP)^a、rpsLp(CF)^a、rpsLp(TP)^a、gapdhp(EL)^a、gapdhp(RE)^a、rpsLp(RE)^a、gapdhp(SA)^a、rpsLp(SA)^a、gapdhp(SV)^a、以及SP1-SP44。

实施例

试剂和培养基

如无特别说明，全部试剂来自于Fisher Scientific。

LB固体和液体培养基、2×YT培养基以及YPD液体和固体培养基、SC培养基、酵母转化用缓冲液请参见《分子克隆实验指南》下册(第三版，科学出版社，2002年)附录2的培养基部分。酵母选择培养基SC-Ura请参见CN105624146A。

MS固体培养基：将10g豆粉、10g甘露醇、20g琼脂溶于1L纯水，121℃高压灭菌20min。

TSB液体培养基：购自BD公司。

燕麦培养基，将20g燕麦煮沸过滤后溶于1L纯水，调pH 7.0-7.2。

实施例1-4中使用的引物序列如表3所示。

表3

实施例中使用的出发载体为pSET156(SEQ.ID.NO：33)。该载体为大肠杆菌-链霉菌穿梭载体。thaxtomin基因簇克隆自酸性疮痂链霉菌CGMCC 4.1789(中国普通微生物菌种保藏中心)。利用大肠杆菌(Escherichia coli)EPI300菌株(Epicentre公司)作为克隆菌株。使用大肠杆菌ET12567(PUZ8002)菌株^[7]作为大肠杆菌-链霉菌接合转移用菌株，基因簇编辑所用宿主为高转化率的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)VL6-48菌株(购自American Type Culture Collection，ATCC编号MYA-3666)。

在本发明的各定量测量中，对于每个菌株的发酵实验独立进行三次，每次发酵实验对发酵液进行三次测量，将平均值作为该次实验的测量值，利用三次实验的测量值计算平均值和标准差。

实施例1制备带有thaxtomin基因簇的质粒pSET156-thax

如图2所示，利用Catch方法^[6]克隆thaxtomin基因簇。

(1)sgRNA的制备：设计针对thaxtomin基因簇(NCBI gene ID：NZ_BCMK01000007.1的132205bp-156019bp)上游和下游约1kb的sgRNA-thaxF和sgRNA-thaxR。sgRNA-thaxF和sgRNA-thaxR的体外转录模板为利用重叠PCR的方法制备。以表3中的引物guide RNA-F、guide RNA-R和thax-gF-P进行重叠PCR，获得sgRNA-thaxF体外转录模板；以表3中的引物guide RNA-F、guide RNA-R和thax-gR-P进行重叠PCR，获得sgRNA-thaxR体外转录模板。利用PCR纯化试剂盒(Omega-D6492)纯化回收sgDNA体外转录模板。利用NEB商用试剂盒实施利用T7RNA聚合酶的体外转录，获得针对所述thaxtomin基因簇的上下游位点的sgRNA(sgRNA-thaxF、sgRNA-thaxR)，将获得的全部sgRNA在-20℃保存。

(2)酸性疮痂链霉菌基因组的提取及酶切：在28℃、MS固体培养基上活化酸性疮痂链霉菌。7天后刮取孢子，将孢子接入50ml TSB液体培养基，28℃培养48h。离心收集菌丝，按照链霉菌提取手册^[11]提取基因组。

在体外利用Cas9核酸酶和步骤(1)得到的sgRNA-thaxF和sgRNA-thaxR对酸性疮痂链霉菌基因组进行酶切，所述酶切体系为：

其中所述5×缓冲液成分为(100mM HEPES(pH 7.5)；750mM KCl；0.5mM EDTA；50mMMgCl₂)。

该反应在37℃进行2h。通过琼脂糖凝胶电泳进行产物检测，利用乙醇沉淀法回收thaxtomin基因簇片段，该thaxtomin基因簇片段为NCBI gene ID：NZ_BCMK01000007.1的第132205bp-第156019bp。

(3)制备带有thaxtomin基因簇两端同源臂的载体片段：分别以引物thax-156-F和thax-156-R为上下游引物，以原始载体pSET156为模板通过PCR扩增获得带有同源臂序列的载体片段。利用PCR纯化试剂盒(Omega-D6492)纯化回收上述带有同源臂的载体片段。

(4)连接和转化：取50ng带有同源臂的载体片段和1μg基因组酶切片段进行Gibson组装，50℃反应1h。取2μl反应产物电转化至大肠杆菌EPI300菌株，37℃摇床复苏1h。将菌液涂布在含有安普霉素抗生素(50μg/mL)的LB平板上，培养过夜。

(5)转化子的鉴定及重组克隆的提取：通过菌落PCR反应鉴定阳性克隆。对阳性菌落进行培养，提取质粒，将该质粒命名为pSET156-thax，其带有thaxtomin基因簇NCBI geneID：NZ_BCMK01000007.1的第132205bp-第156019bp。

实施例2thaxtomin基因簇在多种异源链霉菌宿主中的表达

分别将pSET156-thax质粒转入如下的链霉菌：白色链霉菌(Streptomyces albusJ1074)^[8]；变铅青链霉菌(Streptomyces lividans TK24)^[9]；委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae ISP5230)(ATCC10712)；天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor M1154)^[10]。

(1)pSET156-thax质粒的接合转移^[11]：

首先利用CaCl₂法将pSET156-thax质粒转化至大肠杆菌ET12567(PUZ8002)菌株，在含有安普霉素(50μg/mL)、氯霉素(15μg/mL)以及卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上培养。长出转化子后，挑取转化子单菌落接种于含有上述三种抗生素的2mL LB液体培养基中，37℃培养过夜；将过夜培养物以10％的比例接种到4mL相同抗性的新鲜的LB液体培养基中，37℃摇床培养4～5h后(OD值为0.4～0.6)6000rpm离心2min，收集菌体；用新鲜的LB培养基洗涤菌体两次。

分别将白色链霉菌、变铅青链霉菌、委内瑞拉链霉菌和天蓝色链霉菌接种于MS平板，28℃培养6～7天后刮取孢子，用2×YT培养基悬浮。每个接合转移样品使用约10⁸个孢子/500μL。将孢子悬浮液50℃热激10分钟，室温冷却；将等体积的大肠杆菌菌体(含pSET156-thax质粒)及链霉菌孢子在1.5mL离心管中轻弹混匀，均匀涂布于含有10mM MgCl₂的MS平板上。28℃孵育6h(委内瑞拉链霉菌)或16～20h(白色链霉菌、变铅青链霉菌或天蓝色链霉菌)后，用溶有1mg萘啶酮酸和1.5mg安普霉素的1mL无菌水均匀覆盖。28℃培养5-7天长出单菌落后，在含有安普霉素(50μg/mL)和萘啶酮酸(25μg/mL)的MS平板上划线进行培养。通过菌落PCR反应验证阳性克隆。通过这样的方式获得带有pSET156-thax质粒的白色链霉菌、变铅青链霉菌、委内瑞拉链霉菌和天蓝色链霉。

(2)各异源宿主的thaxtomin A表达量检测。

对步骤(1)获得的含有pSET156-thax质粒的各异源宿主以及野生型酸性疮痂链霉菌进行发酵培养，首先将各链霉菌接种到TSB培养基，28℃、200rpm培养2d(装量为50mL/250mL)后，将1mL培养物转接到燕麦培养基中，28℃、200rpm培养8d(装量为50mL/250mL)后，吸取1mL发酵液加入1mL甲醇中，振荡6小时后静置30分钟。取1mL发酵液的甲醇提取液，12000rpm离心10min。取上清液，经0.2μm滤膜过滤后进行HPLC分析和LC-MS分析(图3)。HPLC分析使用SHIMADZU超高压液相色谱LC-30A，波长为380nm；条件为：C18反相柱，柱长250mm，柱内径4.6mm；流动相为乙腈:水＝40:60；流速为1.0mL/min；进样体积为2μL。thaxtomin A标准品(Sigma，产品编号SML1456)浓度为100μg/mL。LC-MS分析仪器为Agilent1260/ABQtrap 4500MS，采用正/负离子模式全扫描方式检测，质荷比(m/z)范围设定为100～1000。

如图3a所示。在HPLC色谱图中，测试样品中可能含有的thaxtomin A应在与标准品对应的保留时间出峰，峰的面积表明thaxtomin A的表达量。可以看出，在所检测的各宿主中，酸性疮痂链霉菌内源表达thaxtomin A。带有pSET156-thax质粒的白色链霉菌和天蓝色链霉菌表达thaxtomin A，其表达量高于天然宿主酸性疮痂链霉菌(作为对照，含有空载体pSET156质粒的异源宿主均无thaxtomin A对应峰，数据未示出)。如图3b所示，针对HPLC图谱的定量分析表明，白色链霉菌和天蓝色链霉菌中thaxtomin A的产量分别为33.75μg/mL和54.55μg/mL。与酸性疮痂链霉菌中thaxtomin A的内源表达量相比，thaxtomin基因簇在白色链霉菌和天蓝色链霉菌中的异源表达分别将产量提高了36％和120％。进一步地，对天蓝色链霉菌的异源表达产物进行LC-MS分析，结果如图3c所示，通过分析与标准品对应峰的质谱结果，可以看到明显的正离子峰m/z 439[M+H]⁺以及明显的负离子峰436.5[M-H]^-，推测化合物分子量为438，这个结果与标准品的质谱结果基本吻合。

实施例3对thaxtomin基因簇中的txtED、txtAB和txtC基因进行启动子优化

利用CN105624146A的方法，将thaxtomin基因簇中的txtED、txtAB和txtC操纵子的启动子改造为链霉菌的组成型强启动子，进一步提高thaxtomin A的异源表达产量。如图4a所示，将酸性疮痂链霉菌的野生型基因簇片段Thax改造为Thax-pAE以及Thax-pAEC。其中，片段Thax-pAE为将强启动子SPL42和SPL43分别插入至酸性疮痂链霉菌的thaxtomin基因簇(Thax)基因txtA和txtE上游；片段Thax-pAEC为将强启动子SPL42、SPL43和SPL30分别插入至酸性疮痂链霉菌的thaxtomin基因簇基因txtA、txtC和txtE的上游。上述启动子为工业链霉菌菌株通用的启动子，序列请参见表2或文献^[5]。此外，对于txtA和txtE之间包含的txtR以及在对于各thaxtomin基因簇而言不保守的序列，txtR编码纤维二糖应答性激活蛋白，而不保守序列据推测与基因簇的转移和维持相关，在改造时去除txtA和taxE基因中间的片段。改造后的片段Thax-pAE和Thax-pAEC仅包含txtA、txtB、txtC、txtD和txtE。另外，为便于连接操作，在pSET156-thax质粒基因簇的上游插入酵母复制子和筛选标记。

需要说明的是，在实施例3和实施例4中，以“SPL”命名的各启动子对应于参考文献[5]中以“SP”命名的各启动子。例如，本发明实施例中使用的启动子“SPL42”即为参考文献[5]中的启动子“SP42”。

(1)thaxtomin基因簇编辑位点的选取

在thaxtomin基因簇的txtE基因CDS上游36bp处、txtA基因CDS上游43bp处、txtC基因CDS的上游40bp处以及thaxtomin基因簇上游p1位置(SEQ.ID.NO：33序列6003bp处)设计sgRNA，该p1位置用于酵母元件的插入。

(2)sgRNA的制备：利用重叠PCR的方法制备各sgRNA(sgRNA-thaxE、sgRNA-thaxA、sgRNA-thaxC和sgRNA-p1)体外转录模板。重叠PCR所使用的引物参见表3。sgRNA-thaxE体外转录模板制备所用引物为guide RNA-F、guide RNA-R和thax-txtE-P；sgRNA-thaxA体外转录模板制备所用引物为guide RNA-F、guide RNA-R和thax-txtA-P；sgRNA-thaxC体外转录模板制备所用引物为guide RNA-F、guide RNA-R和thax-txtC-P；sgRNA-p1体外转录模板制备所用引物为guide RNA-F、guide RNA-R和thax-P1。方法如实施例1，将获得的全部sgRNA在-20℃保存。

(3)pSET156-thax质粒的cas9酶切：

在体外利用Cas9核酸酶和获得的sgRNA对pSET156-thax质粒进行两组酶切。第一组：利用sgRNA-thaxE、sgRNA-thaxA和sgRNA-p1切割pSET156-thax质粒(针对图4a的Thax-pAE)；第二组：利用sgRNA-thaxE、sgRNA-thaxA、sgRNA-thaxC和sgRNA-p1切割pSET156-thax质粒(针对图4a的Thax-pAEC)；所述酶切体系为：

该反应在37℃进行2h。通过琼脂糖凝胶电泳进行产物检测，利用乙醇沉淀法回收酶切后的所有片段。

(4)组成型启动子片段制备

制备如下带有启动子和侧翼的片段：

txtE-spl43：以表3中的引物spl43F和spl43R进行overlap PCR。

txtA-spl42：以表3中的引物spl42F和spl42R进行overlap PCR。

txtC-spl30：以表3中的引物spl30F和spl30R进行overlap PCR。

其中，各片段的启动子两端分别带有40bp与Thax上相应的cas9酶切位点上下游序列一致的同源臂。

分别以引物URA-F和URA-R，以及引物CEN/ARS F和CEN/ARS R制备供重组质粒在酵母菌进行筛选标记和复制子片段URA(SEQ.ID.NO：34)和CEN/ARS(SEQ.ID.NO：35)。利用PCR纯化试剂盒(Omega-D6492)纯化回收上述带有同源臂的各片段。

(5)连接和转化：利用醋酸锂转化的方法分别将如下的两组片段转化入酵母细胞：

(i)txtE-spl43(即，带有txtE处同源臂的SPL43)、txtA-spl42(即，带有txtA处同源臂的SPL42)、酵母筛选标记URA片段及复制子CEN/ARS片段以及步骤(3)的第一组酶切产物；(ii)txtE-spl43、txtA-spl42、txtC-spl30(即，带有txtC处同源臂的spl30)、酵母筛选标记URA片段及复制子CEN/ARS片段以及步骤(3)的第二组酶切产物；

步骤如下：a：将酵母宿主VL6-48从甘油管活化至YPD固体平板上，30℃培养48h。挑取单菌落到1～2mL YPD培养基中，过夜培养测OD₆₀₀，根据OD值按比例用YPD稀释至OD₆₀₀＝0.1。继续培养2.5h，此时OD达到0.4。每份转化需OD值0.4的菌液5mL。若OD值大于0.4，需用YPD稀释至0.4。b：2500rcf室温离心菌液5min，用醋酸锂溶液(1体积10×TE，pH7.5、1体积10×醋酸锂、8体积无菌超纯水，终浓度100mM)洗涤两次，轻柔吹打。每5mL收集的菌体用30μL醋酸锂(100mM)进行悬浮，在离心菌体的同时处理鲑鱼精DNA(ssDNA)，煮沸5min后迅速放在冰上，避免双链DNA退火。c：准备如下的转化缓冲体系。将该体系于30℃孵育30min，随后42℃热休克15min。d：2500rcf室温离心1min，弃去上清。用150μL YPD液体培养基温柔重悬细胞，在30℃摇床上复苏2～3h。最后将菌液涂布在SC-Ura营养缺陷固体培养基上，培养48h。

转化缓冲体系为

(6)筛选和获得重组载体：对在选择性培养基上生长的菌落进行菌落PCR，挑选Thax-pAE质粒(第i组片段的连接产物)或Thax-pAEC质粒(第ii组片段的连接产物)的阳性克隆，提取质粒进行保存。Thax-pAE质粒和Thax-pAEC质粒的基因簇基因型如图4a。

利用与实施例2相同的方法，将Thax-pAE或Thax-pAEC质粒转化入异源宿主天蓝色链霉菌或委内瑞拉链霉菌，并进行发酵培养。如图4b所示，引入强启动子后，天蓝色链霉菌的thaxtomin A的产量大幅度提高。带有Thax-pAE质粒(txtED和txtAB操纵子前分别插入SPL43和SPL42)的天蓝色链霉菌(S.coelicolor/Thax-pAE)产thaxtomin A的产量达到281.25μg/mL。带有Thax-pAEC质粒(txtED、txtAB和txtC操纵子前分别插入SPL43、SPL42和SPL30)的天蓝色链霉菌(S.coelicolor/Thax-pAEC)产thaxtomin A的产量达到298μg/mL。可见，能够通过引入链霉菌的组成型强启动子进一步增加thaxtomin A的产量。此外，如图4c所示，引入强启动子后，原本在委内瑞拉链霉菌中沉默的thaxtomin基因簇被激活，带有Thax-pAE质粒的委内瑞拉链霉菌(S.venezuelae/Thax-pAE)产thaxtomin A的产量达到73μg/mL。带有Thax-pAEC质粒的委内瑞拉链霉菌(S.venezuelae/Thax-pAEC)产thaxtominA的产量达到60μg/mL。可见，能够通过引入链霉菌组成型强启动子激活thaxtomin基因簇。实施例4应用不同强度的启动子库优化thaxtomin A生物合成

在发明人之前筛选的链霉菌启动子库^[5]中挑选了多组不同强度的启动子对txtED、txtAB和txtC的转录进行组合优化。如图5a所示，针对txtED挑选了SPL11、SPL24和SPL43；针对txtAB挑选了SPL12、SPL23和SPL42；针对txtC挑选了SPL10、SPL22和SPL30。对这些启动子进行如图5c的组合，将上述启动子组合分别插入txtED、txtAB和txtC上游各位点，并将改造的质粒转化至天蓝色链球菌，构建菌株M1-M27。启动子优化的方法同实施例3，所用的引物请参见表3(例如，带有侧翼的SPL10为以表3中的引物spl10F和spl10R进行overlap PCR获得)。在图5c中，例如，菌株M1具有的启动子组合为E11A12C10，表示在txtED前插入启动子SPL11，在txtAB前插入启动子SPL12，在txtC前插入启动子SPL10；菌株M27具有的启动子组合为E43A42C30，表示在txtED前插入启动子SPL43，在txtAB前插入启动子SPL42，在txtC前插入启动子SPL30。其它菌株的启动子以相同的方式给出。启动子插入位点、质粒和方法均与实施例3相同。菌株M1-M27发酵生产thaxtomin A的产量如图5b所示。经改造的菌株产thaxtomin A的产量在254μg/mL-505μg/mL。可见，与在天然宿主中的产量相比，本实施例的方法能够将thaxtomin A的含量提高20倍以上。

参考文献

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序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 提高thaxtomin发酵产量的方法

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 1

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 40

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 2

aaaagcaccg actcggtgcc actttttcaa gttgataacg gactagcctt attttaact 59

<210> 3

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 3

taatacgact cactataggt ccgcgtccgt catgtccgag ttttagagct agaaatagca 60

a 61

<210> 4

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 4

taatacgact cactataggc gatcgagagc gtgaacgcag ttttagagct agaaatagca 60

a 61

<210> 5

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 5

taatacgact cactataggg gaattcctgc cgcgatcccg ttttagagct agaaatagca 60

a 61

<210> 6

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 6

taatacgact cactatagga tcggcttgag cgcgcccacg ttttagagct agaaatagca 60

a 61

<210> 7

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 7

taatacgact cactataggg acgccgtcac gacgccgcag ttttagagct agaaatagca 60

a 61

<210> 8

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 8

taatacgact cactataggg gaacgaaaac tcacgttaag ttttagagct agaaatagca 60

a 61

<210> 9

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 9

acgcgctgga cgcgttcttc acccggcgta gatccttttg gttcatgtgc agctc 55

<210> 10

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 10

cacttcaaga actctgtagc accgcctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatg 56

<210> 11

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 11

tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtg caccacgctt ttcaattca 59

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 12

tggccgcatc ttctcaaata tgcttcccag cctgcttttc t 41

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 13

agaaaagcag gctgggaagc atatttgaga agatgcggcc a 41

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 14

gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatccctta 39

<210> 15

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 15

cttccttggg gtagtcgaaa agggatgcgg agccggggtg gccacgactt tacaccatag 60

cgcttgtccg tgtcaa 76

<210> 16

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 16

aatgtgaaca cggatcttta gacagaacgc tgttcacatt cgaaccgtct ctgctttgac 60

acggacaagc gctat 75

<210> 17

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 17

aatgtgaaca gcgttctgtc taaagatccg tgttcacatt cgaaccgtct ctgctttgac 60

aacatgctgt gcggt 75

<210> 18

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 18

acaggtatcc gttcctctct gtcgtcgagc cgcccgtgtt cacccgactt tacaacaccg 60

cacagcatgt tgtcaa 76

<210> 19

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 19

cttccttggg gtagtcgaaa agggatgcgg agccggggtg gccacgactt tacattagat 60

gtgccttggt tgtcaa 76

<210> 20

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 20

aatgtgaaca cggatcttta gacagaacgc tgttcacatt cgaaccgtct ctgctttgac 60

aaccaaggca catct 75

<210> 21

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 21

aatgtgaaca gcgttctgtc taaagatccg tgttcacatt cgaaccgtct ctgctttgac 60

aacatgctgt gcggt 75

<210> 22

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 22

acaggtatcc gttcctctct gtcgtcgagc cgcccgtgtt agcaggactt tacaacaccg 60

cacagcatgt tgtcaa 76

<210> 23

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 23

cttccttggg gtagtcgaaa agggatgcgg agccggggtg gccacgactt tacaccccaa 60

ttcaagccat tgtcaa 76

<210> 24

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 24

aatgtgaaca cggatcttta gacagaacgc tgttcacatt cgaaccgtct ctgctttgac 60

aatggcttga attgg 75

<210> 25

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 25

aatgtgaaca gcgttctgtc taaagatccg tgttcacatt cgaaccgtct ctgctttgac 60

aggtccatac acgcg 75

<210> 26

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 26

acaggtatcc gttcctctct gtcgtcgagc cgcccgtgtg gccacgactt tacaagcgcg 60

tgtatggacc tgtcaa 76

<210> 27

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 27

tcgaccaggc ggtatgacgc gagacgccgt cacgacgcct gttcacattc gaaccgtctc 60

tgctttgaca tgttcttacg 80

<210> 28

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 28

gtgtcgtttc ctttccaaga ccgcaggcct gggccgtgct ggccacgact ttacatgtga 60

ccgtaagaac atgtcaaagc a 81

<210> 29

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 29

tcgaccaggc ggtatgacgc gagacgccgt cacgacgcct gttcacattc gaaccgtctc 60

tgctttgaca agtcgcaaaa 80

<210> 30

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 30

gtgtcgtttc ctttccaaga ccgcaggcct gggccgtgct ggccacgact ttacaggttg 60

ttttgcgact tgtcaaagca 80

<210> 31

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 31

tcgaccaggc ggtatgacgc gagacgccgt cacgacgcct gttcacattc gaaccgtctc 60

tgctttgaca tcgtgtggcg 80

<210> 32

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 32

gtgtcgtttc ctttccaaga ccgcaggcct gggccgtgct ggccacgact ttacacccaa 60

gcgccacacg atgtcaaagc a 81

<210> 33

<211> 6045

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 33

tagatccttt tggttcatgt gcagctccat cagcaaaagg ggatgataag tttatcacca 60

ccgactattt gcaacagtgc cgttgatcgt gctatgatcg actgatgtca tcagcggtgg 120

agtgcaatgt cgtgcaatac gaatggcgaa aagccgagct catcggtcag cttctcaacc 180

ttggggttac ccccggcggt gtgctgctgg tccacagctc cttccgtagc gtccggcccc 240

tcgaagatgg gccacttgga ctgatcgagg ccctgcgtgc tgcgctgggt ccgggaggga 300

cgctcgtcat gccctcgtgg tcaggtctgg acgacgagcc gttcgatcct gccacgtcgc 360

ccgttacacc ggaccttgga gttgtctctg acacattctg gcgcctgcca aatgtaaagc 420

gcagcgccca tccatttgcc tttgcggcag cggggccaca ggcagagcag atcatctctg 480

atccattgcc cctgccacct cactcgcctg caagcccggt cgcccgtgtc catgaactcg 540

atgggcaggt acttctcctc ggcgtgggac acgatgccaa cacgacgctg catcttgccg 600

agttgatggc aaaggttccc tatggggtgc cgagacactg caccattctt caggatggca 660

agttggtacg cgtcgattat ctcgagaatg accactgctg tgagcgcttt gccttggcgg 720

acaggtggct caaggagaag agccttcaga aggaaggtcc agtcggtcat gcctttgctc 780

ggttgatccg ctcccgcgac attgtggcga cagccctggg tcaactgggc cgagatccgt 840

tgatcttcct gcatccgcca gaggcgggat gcgaagaatg cgatgccgct cgccagtcga 900

ttggctgagc tcatgagcgg agaacgagat gacgttggag gggcaaggtc gcgctgattg 960

ctggggcaac acgtggagcg gatcggggat tgtctttctt cagctcgctg atgatatgct 1020

gacgctcaat gccgtttggc ctccgactaa cgaaaatccc gcatttggac ggctgatccg 1080

attggcacgg cggacggcga atggcggagc agacgctcgt ccgggggcaa tgagatatga 1140

aaaagcctga actcaccgcg acgtatcggg ccctggccag ctagctagag tcgacctgca 1200

ggtccccggg gatcggtctt gccttgctcg tcggtgatgt acttcaccag ctccgcgaag 1260

tcgctcttct tgatggagcg catggggacg tgcttggcaa tcacgcgcac cccccggccg 1320

ttttagcggc taaaaaagtc atggctctgc cctcgggcgg accacgccca tcatgacctt 1380

gccaagctcg tcctgcttct cttcgatctt cgccagcagg gcgaggatcg tggcatcacc 1440

gaaccgcgcc gtgcgcgggt cgtcggtgag ccagagtttc agcaggccgc ccaggcggcc 1500

caggtcgcca ttgatgcggg ccagctcgcg gacgtgctca tagtccacga cgcccgtgat 1560

tttgtagccc tggccgacgg ccagcaggta ggccgacagg ctcatgccgg ccgccgccgc 1620

cttttcctca atcgctcttc gttcgtctgg aaggcagtac accttgatag gtgggctgcc 1680

cttcctggtt ggcttggttt catcagccat ccgcttgccc tcatctgtta cgccggcggt 1740

agccggccag cctcgcagag caggattccc gttgagcacc gccaggtgcg aataagggac 1800

agtgaagaag gaacacccgc tcgcgggtgg gcctacttca cctatcctgc ccggctgacg 1860

ccgttggata caccaaggaa agtctacacg aaccctttgg caaaatcctg tatatcgtgc 1920

gaaaaaggat ggatataccg aaaaaatcgc tataatgacc ccgaagcagg gttatgcagc 1980

ggaaaagatc cgtcgacctg caggcatgca agctctagcg attccagacg tcccgaaggc 2040

gtggcgcggc ttccccgtgc cggagcaatc gccctgggtg ggttacacga cgcccctcta 2100

tggcccgtac tgacggacac accgaagccc cggcggcaac cctcagcgga tgccccgggg 2160

cttcacgttt tcccaggtca gaagcggttt tcgggagtag tgccccaact ggggtaacct 2220

ttgagttctc tcagttgggg gcgtagggtc gccgacatga cacaaggggt tgtgaccggg 2280

gtggacacgt acgcgggtgc ttacgaccgt cagtcgcgcg agcgcgagag ttcgagcgca 2340

gcaagcccag cgacacagcg tagcgccaac gaagacaagg cggccgacct tcagcgcgaa 2400

gtcgagcgcg acgggggccg gttcaggttc gtcgggcatt tcagcgaagc gccgggcacg 2460

tcggcgttcg ggacggcgga gcgcccggag ttcgaacgca tcctgaacga atgccgcgcc 2520

gggcggctca acatgatcat tgtctatgac gtgtcgcgct tctcgcgcct gaaggtcatg 2580

gacgcgattc cgattgtctc ggaattgctc gccctgggcg tgacgattgt ttccactcag 2640

gaaggcgtct tccggcaggg aaacgtcatg gacctgattc acctgattat gcggctcgac 2700

gcgtcgcaca aagaatcttc gctgaagtcg gcgaagattc tcgacacgaa gaaccttcag 2760

cgcgaattgg gcgggtacgt cggcgggaag gcgccttacg gcttcgagct tgtttcggag 2820

acgaaggaga tcacgcgcaa cggccgaatg gtcaatgtcg tcatcaacaa gcttgcgcac 2880

tcgaccactc cccttaccgg acccttcgag ttcgagcccg acgtaatccg gtggtggtgg 2940

cgtgagatca agacgcacaa acaccttccc ttcaagccgg gcagtcaagc cgccattcac 3000

ccgggcagca tcacggggct ttgtaagcgc atggacgctg acgccgtgcc gacccggggc 3060

gagacgattg ggaagaagac cgcttcaagc gcctgggacc cggcaaccgt tatgcgaatc 3120

cttcgggacc cgcgtattgc gggcttcgcc gctgaggtga tctacaagaa gaagccggac 3180

ggcacgccga ccacgaagat tgagggttac cgcattcagc gcgacccgat cacgctccgg 3240

ccggtcgagc ttgattgcgg accgatcatc gagcccgctg agtggtatga gcttcaggcg 3300

tggttggacg gcagggggcg cggcaagggg ctttcccggg ggcaagccat tctgtccgcc 3360

atggacaagc tgtactgcga gtgtggcgcc gtcatgactt cgaagcgcgg ggaagaatcg 3420

atcaaggact cttaccgctg ccgtcgccgg aaggtggtcg acccgtccgc acctgggcag 3480

cacgaaggca cgtgcaacgt cagcatggcg gcactcgaca agttcgttgc ggaacgcatc 3540

ttcaacaaga tcaggcacgc cgaaggcgac gaagagacgt tggcgcttct gtgggaagcc 3600

gcccgacgct tcggcaagct cactgaggcg cctgagaaga gcggcgaacg ggcgaacctt 3660

gttgcggagc gcgccgacgc cctgaacgcc cttgaagagc tgtacgaaga ccgcgcggca 3720

ggcgcgtacg acggacccgt tggcaggaag cacttccgga agcaacaggc agcgctgacg 3780

ctccggcagc aaggggcgga agagcggctt gccgaacttg aagccgccga agccccgaag 3840

cttccccttg accaatggtt ccccgaagac gccgacgctg acccgaccgg ccctaagtcg 3900

tggtgggggc gcgcgtcagt agacgacaag cgcgtgttcg tcgggctctt cgtagacaag 3960

atcgttgtca cgaagtcgac tacgggcagg gggcagggaa cgcccatcga gaagcgcgct 4020

tcgatcacgt gggcgaagcc gccgaccgac gacgacgaag acgacgccca ggacggcacg 4080

gaagacgtag cggcgtagcg agacacccgg gaagcctgat ctacgtctgt cgagaagttt 4140

ctgatcgaaa agttcgacag cgtctccgac ctgatgcagc tctcgcaggg cgaagaatct 4200

cgtgctttca gcttcgatgt aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa tagctgcgcc 4260

gatggtttct acaaagatcg ttatgttgat cgttttgaga cacaacgtgg ctttgttgaa 4320

taaatcgaac ttttgctgag ttgaaggatc agctctagta gttacattgt cgatctgttc 4380

atggtgaaca gctttgaatg caccaaaaac tcgtaaaagc tctgatgtat ctatcttttt 4440

tacaccgttt tcatctgtgc atatggacag ttttcccttt gatatgtaac ggtgaacagt 4500

tgttctactt ttgtttgtta gtcttgatgc ttcactgata gatacaagag ccataagaac 4560

ctcagatcct tccgtattta gccagtatgt tctctagtgt ggttcgttgt ttttgcgtga 4620

gccatgagaa cgaaccattg agatcatact tactttgcat gtcactcaaa aattttgcct 4680

caaaactggt gagctgaatt tttgcagtta aagcatcgtg tagtgttttt cttagtccgt 4740

tatgtaggta ggaatctgat gtaatggttg ttggtatttt gtcaccattc atttttatct 4800

ggttgttctc aagttcggtt acgagatcca tttgtctatc tagttcaact tggaaaatca 4860

acgtatcagt cgggcggcct cgcttatcaa ccaccaattt catattgctg taagtgttta 4920

aatctttact tattggtttc aaaacccatt ggttaagcct tttaaactca tggtagttat 4980

tttcaagcat taacatgaac ttaaattcat caaggctaat ctctatattt gccttgtgag 5040

ttttcttttg tgttagttct tttaataacc actcataaat cctcatagag tatttgtttt 5100

caaaagactt aacatgttcc agattatatt ttatgaattt ttttaactgg aaaagataag 5160

gcaatatctc ttcactaaaa actaattcta atttttcgct tgagaacttg gcatagtttg 5220

tccactggaa aatctcaaag cctttaacca aaggattcct gatttccaca gttctcgtca 5280

tcagctctct ggttgcttta gctaatacac cataagcatt ttccctactg atgttcatca 5340

tctgagcgta ttggttataa gtgaacgata ccgtccgttc tttccttgta gggttttcaa 5400

tcgtggggtt gagtagtgcc acacagcata aaattagctt ggtttcatgc tccgttaagt 5460

catagcgact aatcgctagt tcatttgctt tgaaaacaac taattcagac atacatctca 5520

attggtctag gtgattttaa tcactatacc aattgagatg ggctagtcaa tgataattac 5580

atgtcctttt cctttgagtt gtgggtatct gtaaattctg ctagaccttt gctggaaaac 5640

ttgtaaattc tgctagacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 5700

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 5760

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct 5820

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 5880

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 5940

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 6000

cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacc 6045

<210> 34

<211> 1062

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 34

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgtgcac cacgcttttc aattcaattc 60

atcatttttt ttttattctt ttttttgatt tcggtttcct tgaaattttt ttgattcggt 120

aatctccgaa cagaaggaag aacgaaggaa ggagcacaga cttagattgg tatatatacg 180

catatgtagt gttgaagaaa catgaaattg cccagtattc ttaacccaac tgcacagaac 240

aaaaacctgc aggaaacgaa gataaatcat gtcgaaagct acatataagg aacgtgctgc 300

tactcatcct agtcctgttg ctgccaagct atttaatatc atgcacgaaa agcaaacaaa 360

cttgtgtgct tcattggatg ttcgtaccac caaggaatta ctggagttag ttgaagcatt 420

aggtcccaaa atttgtttac taaaaacaca tgtggatatc ttgactgatt tttccatgga 480

gggcacagtt aagccgctaa aggcattatc cgccaagtac aattttttac tcttcgaaga 540

cagaaaattt gctgacattg gtaatacagt caaattgcag tactctgcgg gtgtatacag 600

aatagcagaa tgggcagaca ttacgaatgc acacggtgtg gtgggcccag gtattgttag 660

cggtttgaag caggcggcag aagaagtaac aaaggaacct agaggccttt tgatgttagc 720

agaattgtca tgcaagggct ccctatctac tggagaatat actaagggta ctgttgacat 780

tgcgaagagc gacaaagatt ttgttatcgg ctttattgct caaagagaca tgggtggaag 840

agatgaaggt tacgattggt tgattatgac acccggtgtg ggtttagatg acaagggaga 900

cgcattgggt caacagtata gaaccgtgga tgatgtggtc tctacaggat ctgacattat 960

tattgttgga agaggactat ttgcaaaggg aagggatgct aaggtagagg gtgaacgtta 1020

cagaaaagca ggctgggaag catatttgag aagatgcggc ca 1062

<210> 35

<211> 712

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 35

agaaaagcag gctgggaagc atatttgaga agatgcggcc agcaaaacta aaaaactgta 60

ttataagtaa atgcatgtat actaaactca caaattagag cttcaattta attatatcag 120

ttattaccca taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tatcccgggt accgagctcg 180

aattcgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg aataatttgg gaatttactc 240

tgtgtttatt tatttttatg ttttgtattt ggattttaga aagtaaataa agaaggtaga 300

agagttacgg aatgaagaaa aaaaaataaa caaaggttta aaaaatttca acaaaaagcg 360

tactttacat atatatttat tagacaagaa aagcagatta aatagatata cattcgatta 420

acgataagta aaatgtaaaa tcacaggatt ttcgtgtgtg gtcttctaca cagacaagat 480

gaaacaattc ggcattaata cctgagagca ggaagagcaa gataaaaggt agtatttgtt 540

ggcgatcccc ctagagtctt ttacatcttc ggaaaacaaa aactattttt tctttaattt 600

ctttttttac tttctatttt taatttatat atttatatta aaaaatttaa attataatta 660

tttttatagc acgtgattaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg at 712

Claims

1.一种生产thaxtomin的方法，所述方法包括在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE，以及对所述异源链霉菌进行发酵；其中，所述异源链霉菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌以及白色链霉菌；

所述thaxtomin选自于由如下化合物所组成的组中的一种：thaxtomin A、thaxtomin B以及thaxtomin D。

2.如权利要求1所述的方法，其中，将酸性疮痂链霉菌的thaxtomin基因簇整体转化入所述异源链霉菌，实现在所述异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述thaxtomin基因簇包含酸性疮痂链霉菌染色体的132205bp-156019bp的序列。

4.如权利要求1所述的方法，其中，将编码TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的各片段转化入所述异源链霉菌，实现在所述异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的步骤进一步包括：在txtAB和txtED操纵子的上游添加链霉菌组成型启动子，其中，txtA和txtB合称为txtAB，txtD和txtE合称为txtED。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的步骤进一步包括：在txtAB、txtED和txtC操纵子的上游添加链霉菌组成型启动子，其中，txtA和txtB合称为txtAB，txtD和txtE合称为txtED。

7.如权利要求1所述的方法，其中，所述在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的步骤进一步包括：在所述酸性疮痂链霉菌的txtA、txtB、txtC、txtD以及txtE的CDS的上游添加链霉菌组成型启动子。

8.如权利要求5-7中任一项所述的方法，其中，在txtA的CDS上游第1bp-1000bp处的任一位置添加链霉菌组成型启动子。

9.如权利要求8所述的方法，其中，在txtA的CDS上游第30-100bp处的任一位置添加链霉菌组成型启动子。

10.如权利要求5-7中任一项所述的方法，其中，在txtE的CDS上游第1bp-1000bp处的任一位置添加链霉菌组成型启动子。

11.如权利要求10所述的方法，其中，在txtE的CDS上游第30-100bp处的任一位置添加链霉菌组成型启动子。

12.如权利要求6或7所述的方法，其中，在txtC的CDS上游第1bp-1000bp处的任一位置添加链霉菌组成型启动子。

13.如权利要求12所述的方法，其中，在txtC的CDS上游第30-100bp处的任一位置添加链霉菌组成型启动子。

14.如权利要求5-7中任一项所述的方法，其中，所述链霉菌组成型启动子选自于由如下启动子所组成的组：ermEp系列启动子、SF14P启动子、kasOP系列启动子。

15.如权利要求5-7中任一项所述的方法，其中，所述链霉菌组成型启动子选自于如下的启动子：ermE、21、ermE*、A9、A3、B10、57、ermEp1*、ermEp1、B4、61、81、C5、Tcp、SF14P、KasOP*、gapdhp(SG)^a、rpsLp(SG)^a、gapdhp(KR)^a、gapdhp(TP)^a、rpsLp(CF)^a、rpsLp(TP)^a、gapdhp(EL)^a、gapdhp(RE)^a、rpsLp(RE)^a、gapdhp(SA)^a、rpsLp(SA)^a、gapdhp(SV)^a、以及SP1-SP44。

16.一种提高thaxtomin产量的方法，所述方法包括将酸性疮痂链霉菌编码TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的片段转化至异源链霉菌；其中，所述异源链霉菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌以及白色链霉菌；

17.如权利要求16所述的方法，其中，将酸性疮痂链霉菌的thaxtomin基因簇整体转化入所述异源链霉菌。

18.如权利要求17所述的方法，其中，所述thaxtomin基因簇包含酸性疮痂链霉菌染色体的132205bp-156019bp的序列。

19.如权利要求16所述的方法，其中，将编码TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的各片段各自转化入所述异源链霉菌。

20.如权利要求16所述的方法，其中，所述将酸性疮痂链霉菌编码TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的片段转化至异源链霉菌进一步包括：在所述转化之前，在txtAB和txtED操纵子的上游添加链霉菌组成型启动子，其中，txtA和txtB合称为txtAB，txtD和txtE合称为txtED。

21.如权利要求16所述的方法，其中，所述将酸性疮痂链霉菌编码TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的片段转化至异源链霉菌进一步包括：在所述转化之前，在txtAB、txtED和txtC操纵子的上游添加链霉菌组成型启动子，其中，txtA和txtB合称为txtAB，txtD和txtE合称为txtED。

22.如权利要求16所述的方法，其中，所述将酸性疮痂链霉菌编码TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的片段转化至异源链霉菌进一步包括：在所述转化之前，在txtA、txtB、txtC、txtD以及txtE的CDS的上游添加链霉菌组成型启动子。

23.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其中，在txtA的CDS上游第1bp-1000bp的任一位置处添加链霉菌组成型启动子。

24.如权利要求23所述的方法，其中，在txtA的CDS上游第30-100bp处的任一位置处添加链霉菌组成型启动子。

25.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其中，在txtE的CDS上游第1bp-1000bp的任一位置添加链霉菌组成型启动子。

26.如权利要求25所述的方法，其中，在txtE的CDS上游第30-100bp处的任一位置添加链霉菌组成型启动子。

27.如权利要求21或22所述的方法，其中，在txtC的CDS上游第1bp-1000bp的任一位置添加链霉菌组成型启动子。

28.如权利要求27所述的方法，其中，在txtC的CDS上游第30-100bp处的任一位置添加链霉菌组成型启动子。

29.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其中，所述链霉菌组成型启动子选自于由如下启动子所组成的组：ermEp系列启动子、SF14P启动子、kasOP系列启动子。

30.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其中，所述链霉菌组成型启动子选自于如下的启动子：ermE、21、ermE*、A9、A3、B10、57、ermEp1*、ermEp1、B4、61、81、C5、Tcp、SF14P、KasOP*、gapdhp(SG)^a、rpsLp(SG)^a、gapdhp(KR)^a、gapdhp(TP)^a、rpsLp(CF)^a、rpsLp(TP)^a、gapdhp(EL)^a、gapdhp(RE)^a、rpsLp(RE)^a、gapdhp(SA)^a、rpsLp(SA)^a、gapdhp(SV)^a、以及SP1-SP44。

31.一种细菌，所述细菌表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE；其中，所述细菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌或白色链霉菌。

32.如权利要求31所述的细菌，其中，将酸性疮痂链霉菌的thaxtomin基因簇整体转化入所述细菌，使得所述细菌表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE。

33.如权利要求32所述的细菌，其中，所述thaxtomin基因簇包含酸性疮痂链霉菌染色体的132205bp-156019bp的序列。

34.如权利要求31所述的细菌，其中，将编码TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的各片段转化入所述细菌，使得所述细菌表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE。

35.如权利要求31所述的细菌，其中，所述细菌的txtAB和txtED操纵子的上游添加有链霉菌组成型启动子，txtA和txtB合称为txtAB，txtD和txtE合称为txtED。

36.如权利要求31所述的细菌，其中，所述细菌的txtAB、txtED和txtC操纵子的上游添加有链霉菌组成型启动子，txtA和txtB合称为txtAB，txtD和txtE合称为txtED。

37.如权利要求31所述的细菌，其中，所述细菌的txtA、txtB、txtC、txtD以及txtE的CDS的上游添加有链霉菌组成型启动子。

38.如权利要求35-37中任一项所述的细菌，其中，所述细菌的txtA的CDS上游第1bp-1000bp处的任一位置添加有链霉菌组成型启动子。

39.如权利要求38所述的细菌，其中，所述细菌的txtA的CDS上游第30-100bp处的任一位置添加有链霉菌组成型启动子。

40.如权利要求35-37中任一项所述的细菌，其中，所述细菌的txtE的CDS上游第1bp-1000bp处的任一位置添加有链霉菌组成型启动子。

41.如权利要求40所述的细菌，其中，所述细菌的txtE的CDS上游第30-100bp处的任一位置添加有链霉菌组成型启动子。

42.如权利要求36或37所述的细菌，其中，所述细菌的txtC的CDS上游第1bp-1000bp处的任一位置添加有链霉菌组成型启动子。

43.如权利要求42所述的细菌，其中，所述细菌的txtC的CDS上游第30-100bp处的任一位置添加有链霉菌组成型启动子。

44.如权利要求35-37中任一项所述的细菌，其中，所述链霉菌组成型启动子选自于由如下启动子所组成的组：ermEp系列启动子、SF14P启动子、kasOP系列启动子。

45.如权利要求35-37中任一项所述的细菌，其中，所述链霉菌组成型启动子选自于如下的启动子：ermE、21、ermE*、A9、A3、B10、57、ermEp1*、ermEp1、B4、61、81、C5、Tcp、SF14P、KasOP*、gapdhp(SG)^a、rpsLp(SG)^a、gapdhp(KR)^a、gapdhp(TP)^a、rpsLp(CF)^a、rpsLp(TP)^a、gapdhp(EL)^a、gapdhp(RE)^a、rpsLp(RE)^a、gapdhp(SA)^a、rpsLp(SA)^a、gapdhp(SV)^a、以及SP1-SP44。