KR20150018902A - 석시네이트 생성을 위한 경로의 엔지니어링 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 석신산 및/또는 재생 가능한 생물학적 공급 원료의 다른 생성물의 효율적인 생성을 위한 생체 촉매에 관한 것이다. 생체 촉매는 유전자 조작(genetic manipulation) 및 대사 진화(metabolic evolution)의 결과로서 석신산 및/또는 카르보히드레이트 공급 원료의 다른 생성물의 성장-결합된 생성(growth-coupled production)에 매우 높은 효율을 갖는다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 소정의 생체 촉매는 높은 역가의 석신산을 생성하고, 임의의 외생의 유전 물질(exogenous genetic material)의 첨가 없이, 단순한 pH-제어된, 배치 발효 동안 무기질 염 배지에서 얻어진다. 본 발명의 유전자 조작은 석신산 생성을 위한 경로 외에 NADH 산화를 위한 다른 경로의 제거와 결합된 에너지-전환 전략과 관련된다. 생체 촉매는 유전자 변형 및 유전적으로 불활성인 포스포트랜스페라아제 시스템에 의해 활성화된 글루코오스-억제된 글루코네오제닉 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제(pck)를 함유한다. 석신산 생성 효율의 관점에서, 본 발명의 생체 촉매는 석시네이트 생성 반추위세균(rumen bacteria), 예컨대 엑티노바실러스 석시노젠스(Actinobacillus succinogens ) 및 생체 촉매가 반추위세균에 의해 생성되는 석신산의 고농도 배치의 필요 조건과는 달리 카르보히드레이트 원료를 갖는 무기질 염 배지내에 생성되는 고농도의 석신산을 얻을 수 있는 것이 한가지 다른 만헤이미아 석시니프로두센스(Mannheimia succiniproducens )와 기능적으로 동등하다.

Description

석시네이트 생성을 위한 경로의 엔지니어링{ENGINEERING THE PATHWAY FOR SUCCINATE PRODUCTION}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2009년 4월 2일에 출원한 미국 가출원 일련번호 61/166,093의 우선권을 주장한다. 또한, 본 출원은 2009년 9월 3일에 출원한 미국 출원 일련번호 12/529,826의 일부 계속 출원이고, 이는 2009년 3월 19일에 출원한 PCT/US2008/057439의 미국 국내 단계 출원이고, 이는 2007년 3월 20일에 출원한 미국 가출원 일련번호 60/895,806의 이익을 주장하고 있으며, 이들 각각의 설명은 모든 도면, 표 및 아미노산 또는 핵산 시퀀스를 포함하는 전체로서 여기에 참조로서 인용된다.
본 발명은 미국 에너지국 승인번호 USDOE-DE FG02-96ER20222 및 미국 에너지국과 미국 농무부 승인번호 USDA & DOE Biomass RDI DE FG36-04GO14019로부터 승인된 보조금 하에 정부의 후원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명의 소정의 권리를 갖는다.
본 발명은 미생물의 생체 촉매를 사용하여 재생 가능한 생물학적 공급 원료로부터 석신산의 제조 분야에 있다. 본 발명은 석신산 제조를 위해 높은 효능을 나타내는데 유용한 생체 촉매로의 유전자 변형을 기재하고 있다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 상업적으로 중요한 양으로 재생 가능한 공급 원료로부터 석신산의 제조에 적합한, 유전적으로 변형된 생체 촉매를 제공한다.
"Top value added chemicals from biomass"라는 2004년 미국 에너지국 리포트는, 재생 가능한 공급 원료로부터 생성될 수 있는 12개의 빌딩 블럭 화학물질(building block chemical)을 확인했다. 12개의 당-기반의 빌딩 블럭(sugar-based building block)은 1,4-이염기산 (석신산(succinic), 푸마르산(fumaric) 및 말산(maleic)), 2,5-푸란 디카르복실산(furan dicarboxylic acid), 3-히드록시 프로피온산(hydroxy propionic acid), 아스파르산(aspartic acid), 글루카르산(glucaric acid), 글루탐산(glutamic acid), 이타콘산(itaconic acid), 레불린산(levulinic acid), 3-히드록시부티로락톤(hydroxybutyrolactone), 글리세롤(glycerol), 소르비톨(sorbitol), 및 자일리톨(xylitol)/아라비니톨(arabinitol)이다. 재생 가능한 공급 원료로부터의 이러한 빌딩 블럭 화학물질의 발효적 생성은 석유 값이 증가함에 따라 경쟁력이 증가하게 될 것이다.
이러한 빌딩 블럭 화학물질은 유용한 분자의 새로운 패밀리(families)로 형질 전환될 가능성을 갖는 다수의 관능기를 갖는 분자이다. 이어서, 이들 12개의 빌딩 블럭 화학물질은 많은 고가의 바이오-기반의(bio-based) 화학물질 또는 물질로 전환될 수 있다. 예컨대, 석시네이트는 현재 석유로 만들어지고 있는 플라스틱, 용매, 및 다른 화학물질로의 전환을 위한 기질로서 작용할 수 있다(Lee et al., 2004; Lee et al ., 2005; McKinlay et al ., 2007; Wendisch et al ., 2006; Zeikus et al ., 1999). 많은 세균은 주요 발효 프러덕트로서 석시네이트를 생성하기 위한 본래의 능력을 갖는 것으로 기재되어 있다(표 1). 그러나, 석신산을 자연스럽게 생성하는 미생물로부터 석신산을 생산하기 위해 복잡한 절차, 비싼 성장 배지 및 긴 배양 시간이 요구되었다.
성공의 정도를 변화시키는 석시네이트 생성을 위해 대장균 균주를 엔지니어링하는데 다양한 유전적 접근법이 사용되어 왔다(표 1). 대부분의 연구에서, 행해진 역가는 낮고, 복합 배지 성분(complex medium ingredient), 예컨대 효모 추출물 또는 옥수수 침지액이 요구되었다. 대장균 균주 NZN111은 대사 작용한 글루코오스(metabolized glucose)의 몰당 0.98몰 석시네이트의 몰 수율을 갖는 108 mM 석시네이트를 생성했다(Chatterjee et al., 2001; Millard et al., 1996; Stols and Donnelly, 1997). 이 균주는 2개의 유전자(피루베이트-포르메이트 리아제(pyruvate-formate lyase)를 인코딩하는 pflB 및 락테이트 탈수소효소를 인코딩하는 ldhA)를 불활성화(inactivating), 및 다복제 플라스미드로부터, 2개의 대장균 유전자, 말레이트 탈수소효소(malate dehydrogenase) (mdh) 및 포스포에놀 피루베이트 카르복시라아제(phosphoenol pyruvate carboxylase) (ppc)를 오버-발현(over-expressing)시킴으로써 엔지니어링했다. 대장균 균주 HL27659k는 석시네이트 탈수소효소(succinate dehydrogenase) (sdhAB), 포스페이트 아세틸트랜스페라아제(phosphate acetyltransferase) (pta), 아세테이트 키나아제(acetate kinase) (ackA), 피루베이트 옥시아다제(pyruvate oxidase) (poxB), 글루코오스 수송체(glucose transporter) (ptsG), 및 the 이소시트레이트 리아제 리프레서(isocitrate lyase repressor) (iclR)를 돌연변이함으로써 엔지니어링했다. 이들 균주는 100 mM 이하의 석시네이트를 생성하고, 산소-제한된 발효 조건을 요구했다(Cox et al ., 2006; Lin et al ., 2005a, 2005b, 2005c; Yun et al ., 2005). 인실리코 대사 분석은 만헤이미아 석시니프로두센스(Mannheimia succiniciproducens )에서 본래의 석시네이트 경로와 유사한 대장균에서의 경로를 생성하기 위해 유전자 녹아웃(knockouts)을 고안하는데 사용되었다(Lee et al., 2005 and 2006). 그러나, 생성된 균주는 매우 적은 양의 석시네이트를 생성했다. 앤덜슨 등은(2007) 본래의 유전자만을 함유하는 대장균(339 mM)을 엔지니어링함으로써 최고 레벨의 석시네이트 생성을 보고했다.
다른 연구자들은 대장균에서 이종의 유전자를 발현하는 다른 접근법을 추구했다. 리조비움 에테로티(Rhizobium eteloti ) 피루베이트 카르복실라아제(pyruvate carboxylase) (pyc)는 다복제 플라스미드로부터 직접적인 카본 플로우로 석시네이트까지 오버-발현(over-expressed)된다(Gokarn et al., 2000; Vemuri et al ., 2002a, 2002b). 균주 SBS550MG는 이소시트레이트 리아제 리프레서(isocitrate lyase repressor) (iclR), adhE, ldhA, 및 ackA의 불활성화, 및 다복제 플라스미드로부터 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis ) citZ (시트레이트 생성 효소(citrate synthase) 및 R. etli pyc를 오버-발현시킴으로써 형성된다. 이러한 균주 내에서, 160 mM 석시네이트는 몰 수율 1.6을 갖는 글루코오스로부터 생성된다.
또한, 석시네이트 생성을 위해 더욱 복잡한 프로세스가 연구되었다(표 1). 이들 프로세스의 다수는 호기성 성장 단계 후 혐기성 생성 단계를 포함한다. 혐기성 단계는 이산화탄소, 수소, 또는 둘다가 공급되었다(Andersson et al ., 2007; Sanchez et al ., 2005a and 2005b; Sanchez et al ., 2006; U.S. Patent 5,869,301; Vemuri et al ., 2002a and 2002b). 본래의 석시네이트 생성자, A. 석시니프로두센스(succiniciproducens)를 사용하는 최근의 연구에서, 전기 투석, CO2 살포, 세포 재활용(recycle), 및 배치 공급(batch feeding)은 높은 수율, 역가 및 생산성으로 글루코오스로부터 석신산의 제조를 위해 조합되었다(Meynial-Salles et al ., 2007).
대장균의 과학적 지식의 대부분은 여기에 보고되는 연구에서 사용되는 5%(w/v) 글루코오스(278 mM) 및 10%(w/v) 글루코오스(555 mM)보다 당 기질(sugar substrates)의 낮은 농도(일반적으로 0.2% w/v; 11 mM)를 사용하는 무기질 염 배지(mineral salts medium)보다 복합 배지(complex medium), 예컨대 루리아 브로스(Luria broth)의 연구로부터 유래되었다. 많은 양의 당은 프러덕트의 상업적으로 중요한 레벨의 프러덕트를 생성하기 위해 많은 양의 당이 요구되었다. 이전의 연구자들은 복합 배지에서 석시네이트 생성을 위한 많은 대장균 유도체의 형성을 기재했다(표 1). 복합 배지를 사용하여, 초기 경로에 기초한 합리적인 고안은 대사 엔지니어링의 학술적 설명에 성공적이었다. 그러나, 세균 발효 프러덕트의 생성을 위한 복합 영양분의 사용은 물질의 비용, 정제의 비용, 및 폐기물 처리와 관련된 비용을 증가시켰다. 복합 배지 성분 없는 무기질염 배지의 사용은 더욱 비용 효율적이어야 한다.
대장균 C는 글루코오스를 함유하는 NBS 무기질염 배지에서 잘 성장하고, 발효 프러덕트로서 락테이트, 아세테이트, 에탄올 및 석시네이트의 혼합물을 생성한다(도 1A; 표 4). 대장균을 사용한 다른 연구와는 달리(표 1), 여기에 보고된 연구들은 물질, 석시네이트 정제, 및 폐기물 처리 비용을 최소화하기 위해 무기질염 배지를 사용하여 높은 레벨의 당을 석시네이트로 전환시킬 수 있는 균주의 발전에 초점을 맞추었다.
본 발명의 하나의 실시형태는 높은 역가(titer) 석시네이트를 생성하고, 이종 유전자 또는 플라스미드를 필요로 하지 않고, 단순하고, pH-제어된, 배치 발효(batch fermentations) 동안 무기질 염 배지에서 생성되는 대장균의 다양한 균주를 제공한다. 본 발명자들은 석신산의 제조에 높은 효율을 나타내는 생체 촉매의 유전자 변형에 유용한 많은 타겟 유전자(target genes)를 확인했다.
본 발명의 목적은 생물학적 공급 원료(biological feedstock)를 사용하여 석신산을 제조하기 위한 생체 촉매(biocatalyst)를 얻는 방법을 제공하는 것이다. 생물학적 공급 원료로부터 석신산의 제조를 위한 생체 촉매를 얻는 방법은 합리적인 유전자 조작(genetic manipulations) 및 대사 진화의 프로세스(process of metabolic evolution)가 조합된다.
생물학적 공급 원료로부터 석신산 생성을 위한 생체 촉매의 생성에 있어서, 미생물 대사 경로에 대해 존재하는 지식으로부터 유래된 합리적인 고안을 사용하여, 세균 크로모좀(bacterial chromosome) 내에서 유전자 세트는 불활성화된 후, 바람직한 표현형(phenotype)을 갖는 균주를 선택하기 위해 대사 진화의 프로세스를 한다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 세균 크로모좀에서 유전자의 돌연변이(mutation of the genes)는 외생의 유전 물질(exogenous genetic material)을 도입하지 않고 실행된다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 내생의 유전자(endogenous gene)의 돌연변이는 점 돌연변이를 도입함으로써 또는 내생의 유전자의 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 내에서 종결 코돈(stop codon)을 도입함으로써 실행된다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 내생의 유전자의 전체 오픈 리딩 프레임은 염색체의 DNA로부터 제거된다.
본 발명의 소정의 바람직한 실시형태에 있어서, 소정의 내생의 유전자의 발현은 현저히 증가되었다. 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 내생의 유전자의 전사(transcription)는 내생의 유전자의 프로모터 영역(promoter region)에 소정의 돌연변이를 도입함으로써 증가되었다. 본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 내생의 유전자의 전사는 타겟 유전자의 억압적인 제어를 함으로써 강화된다.
본 발명의 소정의 실시형태에 있어서, 외생의 뉴클레오티드 시퀀스(exogenous nucleotide sequence)는 바람직한 표현형(phenotype)을 갖는 돌연변이된 유전자를 갖는 세균 균주를 선택하기 위해, 타겟 유전자를 불활성화시키기 위해서 도입될 수 있다. 본 발명의 가장 바람직한 실시형태에 있어서, 미생물 게놈(microbial genome)으로 도입되는 외생의 뉴클레오티드 시퀀스는 임의의 잔여 외생의 뉴클레오티드 시퀀스를 남겨두지 않고 심리스 방식(seamless fashion)으로 제거된다.
합리적으로 고안된 유전자 조작은 단일 단계 또는 한번의 유전자 변화가 한번에 이루어지는 다수의 단계들로 행해질 수 있다. 유전자 조작에 기인하는 미생물 균주는 수율(yield), 역가(titer) 및 바람직한 유기산의 체적 생산성(volumetric productivity)을 개선하기 위해 대사 진화가 행해질 수 있다. 본 발명의 가장 바람직한 실시형태에 있어서, 합리적인 유전자 조작은 단계 내에서 행해지고, 대사 진화의 프로세스는 유전자 조작의 단계들 사이에 행해진다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 대사 진화 동안 발생하는 자연 변이(spontaneous mutation)는 염색체의 DNA의 적당한 영역을 시퀀싱함으로써 확인되었다. 본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 대사 진화 동안 발생하는 돌연변이는 혐의가 있는 효소(suspect enzyme)의 활성을 측정함으로써 확인했다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 합리적인 고안에 기초한, 발효 경로에서 기능이 알려진 프로테인을 인코딩하는 하나 이상의 유전자는 하나 이상의 돌연변이를 통해 불활성화되었다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 발효 경로에서 기능하는 프로테인을 코딩(coding)하는 유전자의 관능적 동족체(functional homologues )인 유전자는, 발효 경로와 직접적으로 관련되는 프로테인을 코딩하는 유전자에 비해 불활성화된다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, TCA 사이클 내에서 기능하는 유전자는 유전자 조작되어 석신산 생성을 향해 탄소의 흐름이 증가된다. 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, TCA 사이클의 환원적인(reductive) arm을 통한 탄소 흐름이 강화된다. 본 발명의 다른 실시형태에 있어서, TCA 사이클의 산화적인(oxidative) arm을 통한 탄소 흐름은 유전자 조작된다. 본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 석신산으로의 탄소 흐름(carbon flow to succinic acid)은 TCA 사이클과 밀접히 관련되는 글리옥살레이트 우회 경로(glyoxalate bypass pathway)의 유전자 조작(genetic manipulation)을 통해 개선된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 세포 내에서 TCA로부터 다른 대사 경로까지의 탄소 흐름은 억제되어, 세포 내에서 탄소 풀(carbon pool)은 석신산 생성을 향해 이동시킨다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, TCA 사이클로의 탄소 흐름은 세포 내에서 하나 이상의 카르복실화 효소(carboxylating enzymes)를 야기하는 유전자 조작(genetic manipulation)을 통해 강화된다. 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 하나 이상의 카르복실화 효소의 발현은 프로모터 영역(promoter region)의 유전자 조작을 통해 또는 유전자 발현의 억제를 행함으로써(by relieving the repression of the gene expression) 행해진다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 세포 내에서 포스포에놀 피루베이트 풀(phosphoenol pyruvate pool)은 포스포에놀 피루베이트를 요구하는 탄소 흡수 경로와 관련되는 유전자를 돌연변이함으로써 전환된다. 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 탄소 흡수를 위한 포스포트랜스페라아제 시스템(phosphotransferase system)은 TCA 사이클의 작동에 유용한 포스포에놀 피루베이트를 전환하기 위해 불활성화된다.
본 발명은 석신산 생성을 증가시키기 위해 유전자 조작될 수 있는 많은 타겟(target)을 설명한다. 본 발명에 기재되는 다양한 타켓 모두는 석신산 생성을 개선하기 위해 유전자 조작될 수 있다. 가장 바람직한 실시형태에 있어서, 최소의 타겟은 석신산 생성 속도를 바람직하게 하기 위해 유전자 조작을 위해 선택된다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 생체 촉매는 높은 역가, 수율 및 체적 생산성으로 석신산을 생성하기 위한 능력을 위해 선택된다. 본 발명의 가장 바람직한 실시형태에 있어서, 소비되는 탄소 원료(carbon source)의 1몰에 대한 적어도 1.0몰의 석신산을 생성할 수 있는 생체 촉매가 바람직하다.
본 발명의 다른 가장 바람직한 실시형태에 있어서, 생체 촉매는 무기질 염 배지 내에 소비되는 탄소 원료(carbon source)의 각몰에 대한 적어도 1.0몰의 석신산을 생성하기 위한 능력을 위해 대사 진화 동안 선택되고, 석신산 생성과 미생물 성장이 결합된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 공급 원료로서 글리세롤을 사용하는 석신산을 생성할 수 있는 생체 촉매가 제공되었다.
본 발명의 다른 이점은 본 발명의 상세한 설명 및 제공되는 실시예를 확인함으로써 쉽게 명백해질 것이다.
도 1A-1B. 글루코오스의 석시네이트로의 발효. 도 1A는 대장균에 의한 글루코오스의 발효의 표준 경로를 나타낸다. 이 경로는 Unden 및 Kleefeld (2004)로부터 변경되었다. Bold arrows는 중앙의 발효 경로를 나타냈다. Crosses는 KJ012 (ldhA, adhE , ackA)를 엔지니어링하기 위해 본 연구에서 행해진 유전자 제거를 나타냈다. 유전자 및 효소: ldhA, 락테이트(lactate) 탈수소효소; pflB, 피루베이트-포르메이트 리아제(pyruvate-formate lyase); focA, 포르메이트 수송체(formate transporter); pta, 포스페이트 아세틸트랜스페라아제(phosphate acetyltransferase); ackA , 아세테이트 키나아제(acetate kinase); adhE , 알콜(alcohol) 탈수소효소; ppc , 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylase); pdh , 피루베이트(pyruvate) 탈수소효소 복합체(complex); gltA , 시트레이트 생성 효소(citrate synthase); mdh , 말레이트(malate) 탈수소효소; fumA , fumB , 및 fumC , 푸마라아제 동질 효소(fumarase isozymes); frdABCD , 푸마레이트 환원 효소(fumarate reductase); fdh , 포르메이트(formate) 탈수소효소; icd, 이소시트레이트(isocitrate) 탈수소효소; acs, 아세틸(acetyl)~CoA synthetase; mgsA, methylglyoxal synthase; poxB, pyruvate oxidase; aldA, aldehyde 탈수소효소; and aldB, aldehyde 탈수소효소. 도 1B는 글루코오스 발효를 위한 표준 경로에 대한 대장균의 엔지니어링된 균주(engineered strain)에서 ATP 생성 및 성장과 석시네이트 생성의 결합을 나타낸다. 실선 화살표는 NADH 풀을 연결한다. 점선 화살표는 NAD+ 풀을 연결한다. 혐기성 조건하에서 해당 과정(glycolysis) 동안, 성장(growth)은 ATP의 생성과 NADH의 산화가 강제적으로 결합되었다.
도 2A-2D. 대장균에 의한 석시네이트 생성을 위한 잠재적인 카르복실화 반응 경로. 주요한 카르복실화 효소를 인코딩하는 유전자를 볼드체로 나타냈다. 도 2A는 포스포에노피루베이트(phosphoenolpyruvate)(PEP) 카르복실라아제 효소(carboxylase enzyme)(PPC)에 의해 촉마화된 반응을 나타낸다. PPC 효소에 의해 포스포에노피루베이트(PEP)의 카르복실화 반응으로부터 어떠한 ATP로 생성되지 않았다. 이것은 글루코오스 발효 동안 대장균에 의한 석시네이트 생성을 위한 최초 경로로서 간주되었다. 도 2B는 NADH-의존 말산 효소를 나타낸다. 피루베이트 키나아제에 의해 ADP 및 PEP로부터 ATP의 생성 동안 에너지가 전환되었다(pykA 또는 pykF). 말산 효소(sfcA)는 말레이트를 생성하기 위해 NADH-연결된(NADH-linked), 환원적 카르복실화 반응(reductive carboxylation)을 촉진시킨다. 도 2C는 NADPH-의존 말산 효소를 나타낸다. 피루베이트 키나아제에 의해 ADP 및 PEP로부터 ATP의 생성 동안 에너지가 전환되었다(pykA 또는 pykF). 말산 효소(maeB)는 말레이트를 생성하기 위해 NADH-연결된(NADH-linked), 환원적 카르복실화 반응(reductive carboxylation)을 촉진시킨다. 도 2D는 PEP 카르복시키나아제(PCK)에 의해 촉매화된 반응을 나타낸다. 옥살로아세트산을 생성하기 위해 PEP의 카르복실화 동안 ATP의 생성에 의해 에너지가 전환되었다.
도 3A-3B. KJ017, KJ032, 및 KJ060을 생성하기 위한 KJ012의 대사 진화 동안의 성장. 균주 KJ012는 KJ017를 생성하기 위해 5% (w/v) (도 3A) 및 10% (w/v) (도 3B) 글루코오스를 각각 함유하는 NBS 배지에 차례로 이식했다. focA and pflB의 제거 후, 얻어진 균주(KJ032)를 아세테이트로 보완된 배지에 최초로 계대배양(subculture)했다(도 3C). 아세테이트 레벨을 감소시키고, KJ060를 생성하기 위해 더 이식하는 동안 제거했다. 파선은 비교를 위해 첨가된, 아세테이트 없이 KJ017에 의한 발효를 나타냈다. 기호●=OD550nm에서 광학 밀도.
도 4A-4F. 석시네이트 생성을 위한 균주의 대사 진화 동안 발효 프러덕트의 요약. 배양액(Cultures)은 나타낸 바와 같이 소듐 아세테이트(sodium acetate)로 보충되었다. 흑색 화살표는 텍스트에 의해 나타낸 바와 같이 발효 조건들 사이의 이행을 나타낸다. 포르메이트는 포함하지 않고, 소량의 락테이트만이 KJ032의 대사 진화 동안 검출되었다. 포르메이트와 락테이트가 KJ070 및 KJ072의 대사 진화 동안 검출되지 않았다. 5% w/v 글루코오스(도 4A)를 함유하는 배지에서, 10% w/v 글루코오스(도 4B)를 함유하는 배지에서 KJ012 내지 KJ017의 대사 진화. 5% w/v 글루코오스(도 4C)를 함유하는 배지에서, 10% w/v 글루코오스(도 4D)를 함유하는 배지에서 KJ032 내지 KJ060의 대사 진화. 10% 글루코오스(도 4E)를 함유하는 배지에서 KJ070 내지 KJ071의 대사 진화. 10% 글루코오스(도 4F)를 함유하는 배지에서 KJ072 내지 KJ073의 대사 진화. 도 4A-4F의 기호: ■, 석시네이트; □, 포르메이트; △, 아세테이트; ▲, 말레이트; ◆, 락테이트; 및 ▽, 피루베이트.
도 5. 석시네이트 생성을 위한 생체 촉매로서 대장균 C의 유전적 엔지니어링 및 대사 진화에서의 단계를 요약한 도표. 이 프로세스는 성장 기반의 선택(growth-based selection)의 2000 세대(generations)를 제공하는 261 시리얼 수송체(serial transfer)를 나타낸다. 복제물은 표 4에 나타낸 바와 같이, 각각의 요법(regimen)의 최종 배양약으로부터 분리하고, 균주 지정이 할당되었다(assigned strain designations).
도 6. 석시네이트 생성을 위해 엔지니어링된 구조에서 의도적으로 제거된 유전자를 나타내는 경로와 관련된 글루코오스-6-포스페이트의 발효에 대한 표준 경로. 실선 화살표는 중앙 발효적 경로를 나타낸다. 점선 화살표는 피루베이트의 아세테이트로의 산화의 미세 호기성 경로를 나타낸다. 점선 화살표는 호기성 대사 동안 일반적으로 기능하는 글리옥실레이트 우회를 포함하는 경로를 나타낸다. 박스에 X자 표시는 KJ012 및 KJ017을 구성하는데 사용되는 3개의 초기 유전자 제거(ldhA, adhE , ackA)를 나타낸다. 보통의 X자 표시는 KJ017 유도체의 구성 동안 제거되는 추가적인 유전자를 표시한다: KJ032 (ldhA , adhE , ackA , focA , pflB), 및 KJ070 (ldhA , adhE , ackA , focA , pflB , mgsA), 및 KJ072 (ldhA , adhE , ackA , focA , pflB, mgsA , poxB). 유전자 및 효소: ldhA, 락테이트(lactate) 탈수소효소; focA, 포르메이트(formate) 수송체(transporter); pflB, 피루베이트-포르메이트 리아제(pyruvate-formate lyase); pta, 포스페이트 아세틸트랜스페라아제(phosphate acetyltransferase); ackA , 아세테이트 키나아제(acetate kinase); adhE , 알콜(alcohol) 탈수소효소; ppc , 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylase); pdh , 피루베이트(pyruvate) 탈수소효소 복합체(complex); gltA , 시트레이트 생성 효소(citrate synthase); mdh , 말레이트(malate) 탈수소효소; fumA , fumB , 및 fumC , 푸마라아제 동질 효소(fumarase isozymes); frdABCD , 푸마레이트 환원 효소(fumarate reductase); fdh , 포르메이트(formate) 탈수소효소; mgsA, 메틸글리옥살 생성 효소(methylglyoxal synthase); gloAB, 글리옥실라아제(glyoxylase) I 및 II; poxB, 피루베이트 옥시다아제(pyruvate oxidase); aceA , 이소시트레이트 리아제(isocitrate lyase); aceB , 말레이트 생성 효소(malate synthase); acnAB, 아코니타제(aconitase); 및 acs, 아세틸~CoA 합성 효소(synthetase).
도 7A-7C. 대장균 C의 유도체에 의한 10% 글루코오스 (w/v)를 갖는 무기질 염 배지 내에서 석시네이트 및 말레이트의 생성. 도 7A는 AM1 배지 내에서 KJ060에 의한 석시네이트 생성을 나타낸다. 도 7B는 AM1 배지 내에서 KJ073에 의한 석시네이트 생성을 나타낸다. 도 7C는 NBS 배지 내에서 KJ071에 의한 말레이트의 생성을 나타낸다. 발효(Fermentation)는 33 mg DCW l-1의 레벨로 접종되었다(inoculated). 도 7A-7C의 기호: ○, 글루코오스; ●, 석시네이트; ■, 말레이트; △, 세포량.
도 8. 플라스미드 pLOI4162의 구성과 관련된 단계. pEL04 및 pLOI4152와 관련된 짧은 실선 화살표는 DNA 증폭(amplification)에 사용되는 프라이머(primer)를 나타낸다.
도 9. KJ073에서 글루코오스-6-포스페이트로부터 석시네이트의 생성. 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 인코딩하는 pck 유전자, 본 연구에서 석시네이트 생성과 관련된 초기 카르복실화 효소는 역 형태(reverse type)로 보여진다. 실선 화살표는 글루코오스의 혐기성 발효 동안 기능한다고 기대되는 반응을 나타낸다. 실선 X자 표시는 제거된 유전자를 나타낸다. 박스에 X자 표시는 석시네이트 생성을 위한 초기 균주, KJ017 (ldhA , adhE , ackA)를 구성하는데 사용되는 주요한 제거(key deletion)를 나타낸다. 점선은 PoxB에 의한 피루베이트의 아세테이트로의 산화, 미세 호기 조건하에서 일반적으로 기능하는 프로세스를 나타낸다. 도트선은 주로 호기 대사와 관련된 반응을 나타낸다. 유전자 및 효소: ldhA, 락테이트(lactate) 탈수소효소; pflB, 피루베이트-포르메이트 리아제(pyruvate-formate lyase); focA, 포르메이트(formate) 수송체; pta, 포스페이트 아세틸트랜스페라아제(phosphate acetyltransferase); ackA , 아세테이트 키나아제(acetate kinase); adhE, 알콜(alcohol) 탈수소효소; pck , 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(phosphoenolpyruvate carboxykinase); pdh , 피루베이트(pyruvate) 탈수소효소 복합체(complex); gltA , 시트레이트 생성 효소(citrate synthase); mdh , 말레이트(malate) 탈수소효소; fumA , fumB , 및 fumC , 푸마라아제 동질효소(fumarase isozymes); frdABCD , 푸마레이트 환원 효소(fumarate reductase); fdh , 포르메이트(formate) 탈수소효소; icd, 이소시트레이트(isocitrate) 탈수소효소; acs, 아세틸~CoA 합성 효소(synthetase); mgsA, 메틸글리옥살 생성 효소(methylglyoxal synthase); poxB, 피루베이트 옥시다아제(pyruvate oxidase); aldA, 알데히드(aldehyde) 탈수소효소; 및 aldB, 알데히드(aldehyde) 탈수소효소. tdcE 유전자(피루베이트 포르메이트-리아제, pflB에 상응함) 및 tcdD 유전자(프로피오네이트 키나아제, ackA에 상응함)는 둥근 괄호로 나타내고, 트레오닌 열화(threonine degradation) 동안 일반적으로 발현된다.
도 10. 제거되는 추가적인 유전자의 경로를 나타내는 대사의 확장된 부분(실선 X자 표시). 석시네이트 및 아세테이트는 KJ073 발효로부터 주요한 프러덕트(박스로된 것)이다. 유전자 및 효소: citDEF, 시트레이트 리아제(citrate lyase); gltA, 시트레이트 생성 효소(citrate synthase); aspC, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspartate aminotransferase); pck, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(phosphoenolpyruvate carboxykinase); sfcA, NAD+-연결된 말산 효소; fumA & fumB, 푸마라아제(fumarase); frdABCD, 푸마레이트 환원 효소(fumarate reductase); pykA & pykF, 피루베이트 키나아제(pyruvate kinase); tdcE, 피루베이트 포르메이트-리아제(pyruvate formate-lyase) (pflB에 상응함); pta , 포스페이트 트랜스아세틸라아제(phosphate transacetylase); tcdD, 아세테이트 키나아제(acetate kinase) (ackA에 상응함).
도 11. 석시네이트 생성을 위해 엔지니어링된 대장균 균주에서 글루코오스 발효. 5개의 실선의 별은 제거를 구성함으로써 블록킹되는 대사 단계(metabolic steps)를 나타낸다. 2개의 하얀색 별은 대사 진화(metabolic evolution) 동안 얻은 돌연변이에 의해 블록킹되는(blocked) 대사 단계를 나타낸다. 도트 화살표는 석시네이트-생성 돌연변이체(KJ060 및 KJ073)에서의 비기능적(non-functional) 또는 약한 기능적(weakly functional) 활성을 나타낸다. 수직 방향으로 볼드체의 화살표는 KJ060 및 KJ073으로 석시네이트 생성을 위한 주된 경로를 나타낸다. 이 경로는 석시네이트-생성 반추위 세균(rumen bacteria)의 것과 기능적으로 동일한 것이다. 2개의 유전자 galP 및 pck는 균주 발전(strain development) 동안 전사적으로 활성이다. ptsI에서의 제거(deletion)는 흡수(uptake) 및 인산화반응(phosphorylation)을 위한 본래의 글루코오스 포스포트랜스페라아제 시스템을 불활성화시키는, 성장 기반의 선택(하얀색 별) 동안 얻어진다. GalP는 글루코키나아제(glk)에 의해 ATP-의존 인산화반응으로 글루코오스에 대한 주요한 수송체로서 작용하는 것이 발견되었다.
도 12A-12C. 엔지니어링된 석시네이트-생성 균주의 전사물 존재비(transcript abundance)의 비교. 도 12A는 대장균의 ATCC8739, KJ012, KJ017, KJ060, KJ071 및 KJ073 균주에서 유전자 pck , ppc , sfcA 및 maeB에 대한 전사물의 상대적 존재비(relative abundance)를 보여준다. 도 12B는 글루코오스 이용에 관련된 유전자, 즉 대장균의 ATCC8739, KJ012, KJ017, KJ060, KJ071 및 KJ073 균주에서 cyaA , crp , ptsG , galP 및 glk에 대한 전사물의 상대적인 존재비(relative abundance)를 보여준다. 도 12C는 대장균의 ATCC8739, KJ012, KJ017, KJ060, KJ071 및 KJ073 균주에서 유전자 ptsI 및 crr 유전자에 대한 전사물의 상대적인 존재비(relative abundance)를 보여준다.
도 13. 혼합산(mixed acid) 발효 경로를 사용한 대장균의 혐기성 대사(Bock & Sawers, 1996). 본래의 혼합산 경로는 흑색 화살표로 나타냈다. 글루코오스 흡수, 카르복실화 반응, 및 아세틸-CoA 합성의 추가적인 반응은 도트 화살표로 나타냈다. 볼드체의 도트 화살표는 대장균 돌연변이체(E. coli mutant)에서 석시네이트 생성을 위해 구성된 새로운 대사 단계(new metabolic step)를 나타낸다. 유전자 제거 또는 점 돌연변이에 의해 블럭킹되는 반응은 X로 표시했다. pck*는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 활성화시키고, 활성을 증가시키고, 이러한 효소가 옥살로아세테이트 생성을 위한 주요한 경로로서 작용하게 하는 새로운 돌연변이를 나타낸다. 피루베이트(박스 내에)는 도표에서 2부분에 나타내지만, 단일 세포내의 풀(single intracellular pool)로서 존재한다.
도 14. 야생형(wild type) 대장균에서 혼합산 발효(혐기성(anaerobic))로 조합된 글리세롤 이화 작용(catabolism)을 위한 일반적으로 인정된 경로. 이러한 경로는 EcoSal, Ecocyc에 이용가능한 데이터의 최근 리뷰, 및 주요 문헌의 리뷰의 조합에 기초한다(Bachler et al., 2005; Berman and Lin, 1971; Bock and Sawers, 1996; Erni et al., 2006; Gutknecht et al., 2001; Jin et al.,1983; Keseler et al., 2005; Lin, 1996; Tang et al., 1982). 볼드체의 화살표는 글리세롤 이화 작용 및 혼합산 발효를 위한 우위종(dominant)으로 일반적으로 간주되는 경로를 나타낸다. 얇은 화살표는 중간체(intermediate)로서 디히드록시아세톤(dihydroxyacetone)을 포함하는 야생형 대장균(Jin et al., 1983; Tang et al., 1982)에 확실하지 않고, 비기능적인 것으로 간주되는 경로는 나타낸다. 이 경로는 glpK가 불활성인 돌연변이체에서 단지 기능하는 것으로 생각된다(Jin et al., 1983; Tang et al., 1982). 또한, 얇은 화살표는 glpABC의 대체물(replacement)로서 호기성 대사 동안 기능하는 것으로 생각되는 탈수소효소(dehydrogenase), glpD를 나타낸다(혐기성 대사(anaerobic metabolism)). 약자: DHA, 디히드록시아세톤(dihydroxyacetone); DHAP, 디히드록시아세톤 3- 포스페이트(dihydroxyacetone 3- phosphate); PEP, 포스포에놀피루베이트(phosphoenolpyruvate); G3P, 글리세롤 3-포스페이트(glycerol 3-phosphate); 및 GA3P, 글리세르알데히드 3-포스페이트(glyceraldehydes 3-phosphate). PEP는 일반적인 풀(common pool)을 나타내기 위해 박스로 표시했다.
도 15. 무기질염 배지에 글리세롤로부터 석시네이트의 혐기성 생성을 위한 새로운 대장균 경로. 볼드체의 화살표는 균주, 예컨대 석시네이트 생성을 위한 3개의 코어 돌연변이(core mutation)를 함유하는 XZ721에 글리세롤의 혐기성 이화 작용(anaerobic catabolism)에 대한 주요 경로를 나타냈다. 도트 화살표는 pflB 및 ptsI로 돌연변이됨으로써 블록킹되는 경로는 보여준다. 이 경로에 있어서, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(phosphoenolpyruvate carboxykinase)의 돌연변이 활성(mutational activation)(pck*)은 이러한 효소가 옥살로아세테이트(oxaloacetate)의 생성을 위한 우세한 카르복실화 단계로서 작용하게 한다. 다른 카르복실화 효소(carboxylating enzyme)와는 달리, 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제(PPC), PCK는 생합성을 위한 다른 ATP를 생성하기 위해 에너지를 전환한다.
본 발명에 사용되는, "역가(titer)"란 발효액(fermentation broth) 내에서 특정 화합물의 몰 농도를 의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 석신산의 생성을 위한 발효 프로세스에 있어서, 100 mM의 석신산 역가는 측정시 발효액은 발효액의 역가 당 석신산이 100 mMoles 함유되는 것을 의미한다.
본 발명에 사용되는, "수율(yield)"이란 발효 프로세스 동안 소모되는 공급 원료(feedstock)의 몰당 생성되는 특정 화합물의 몰을 의미한다. 따라서, 공급원료로서 글루코오스를 사용하여 석신산의 생성을 위한 발효 프로세스에 있어서, 수율이란 소모된 글루코오스 몰 당 생성되는 석신산의 몰의 수를 의미한다.
본 발명에 사용되는, "체적 생산량(Volumetric productivity)"이란 단위 시간 당 단위 체적 당 생성되는 세균 중 특정 화합물의 양을 의미한다. 따라서, 석신산의 체적 생산량 0.9 g L-1 h-1이란, 0.9gram의 석신산이 성장 1시간 동안 발효액의 1리터 중 축적되는 것을 의미한다.
또한, 본 발명에 사용되는 "역가(titer)", "수율(yield)" 및 "체적 생산량(volumetric productivity)"은 "노르말화된 역가(normalized titer)", "노르말화된 수율(normalized yield)" 및 "노르말화된 체적 생산량(normalized volumetric productivity)"를 포함한다. "노르말화된 역가(normalized titer)", "노르말화된 수율(normalized yield)" 및 "노르말화된 체적 생산량"의 결정에 있어서, 성장 배지의 pH를 유지하기 위해서, 발효 용기에 첨가된 중성화 시약(neutralizing reagent)의 체적이 고려된다.
여기에 사용된 "유전적으로 엔지니어링된(genetically engineered)" 또는 "유전적으로 변형된(genetically modified)"이란 미생물의 게놈 DNA(genomic DNA)를 조작함으로써 미생물 중 하나 이상의 효소의 발현을 변화시키는 실행(practice)을 의미한다.
본 발명은 유전자 변형된 세균 균주(GMBS)에 의한 탄소 화합물로부터 상업적으로 현저한 양으로(commercially significant quantities) 석신산을 생성하기 위한 방법을 제공한다. 발효 프로세스를 통한 석신산의 생성에 적합한 미생물이 본 발명에 기재되어 있다.
본 발명에 사용되는, "유전자(gene)"이란 유전자의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)과 업스트림 및 다운스트림 조절 서열(upstream and downstream regulatory sequences)을 포함한다. 또한, 업스트림 조절 영역(upstream regulatory region)은 유전자의 프로모터 영역(promoter region)을 말한다. 또한, 다운스트림 조절 영역(downstream regulatory region)은 터미네이터 시퀀스 영역(terminator sequence region)을 말한다.
본 발명에 사용되는, 돌연변이(mutation)란 오픈 리딩 프레임, 업스트림 조절 영역 및 다운스트림 조절 영역을 포함하는 유전자에 행해지는 유전자 변형을 의미한다. 유전자 돌연변이는 업 조절(up regulation) 또는 다운 조절(down regulation) 또는 유전자의 오픈 리딩 프레임의 전사(transcription)의 완전한 억제를 야기한다. 유전자 돌연변이는 유전자의 전체 코딩 영역 또는 코딩 뉴클레오티드 시퀀스(coding nucleotide sequence)의 부분을 제거(deleting)함으로써, 또는 프레임 시프트 돌연변이(frame shift mutation), 미센스 돌연변이(missense mutation)를 도입(introducing)함으로써, 및 삽입(insertion), 또는 정지 코돈(stop codon) 또는 이들의 조합에 의해 행해진다.
본 발명에 사용되는, "외인성(exogenous)"이란 세포의 외부로부터 유래되는 분자 또는 활성이 호스트 미생물(host microbial organism)에 도입되는 것을 의미한다. 외인성 핵산 분자(exogenous nucleic acid molecule)가 미생물 균체에 도입되는 경우에는, 도입된 핵산은 독립적인 플라스미드에 존재하거나, 호스트 염색체 DNA(host chromosomal DNA)로 통합될 수 있다. 프로테인을 코딩하는 외인성 핵산은 자신의 조절 시퀀스(regulatory sequences), 예컨대 프로모터 및 터미네이터 시퀀스를 갖는 표현 형태(expressible form)로 미생물 균체에 도입될 수 있다. 또한, 외인성 핵산 분자는 호스트 염색체 DNA로 통합될 수 있고, 호스트 조절 시퀀스의 조절하에 있을 수 있다.
"내인성(endogenous)"이란 호스트 세포 내에 존재하는 분자 및 활성을 의미한다. 생합성 활성에 관련하여 사용되는 경우에는, "내인성"이란 호스트 리퍼런스 유기체(host reference organism)에 도입되는 활성을 말한다. 예컨대, 참조된 활성을 발현한 후 호스트 미생물 유기체로 도입하는 동종 또는 이종 인코딩 핵산(a homologous or heterologous encoding nucleic acid that expresses the referenced activity following introduction into the host microbial organism)일 수 있다. 프로테인을 코딩하는 핵산이 미생물 유기체의 동일한 종으로부터 얻어지는 경우에, 이는 동종의 DNA를 의미한다. 핵산이 다른 미생물 종으로부터 유래된 경우에, 이는 이종의 DNA를 의미한다. DNA의 본성(nature)이 동종인지 이종인지에 관계 없이, 호스트 세포에 도입되는 경우에, DNA와 DNA에 도입되는 활성 유래 형태(the activity derived form)는 외인성을 말한다. 따라서, 본 발명의 인코딩 핵산의 외인성 발현(exogenous expression)은 동종 및 이종 인코딩 핵산(heterologous and homologous encoding nucleic acid) 중 하나 또는 둘다를 사용할 수 있다.
본 발명은 발효 프로세스에 있어서 기질로서 탄소 원료를 함유하는 최소의 염 배지 중 발효 조건 하에서 배양되는 경우에, 석신산에 있어서 역가가 우수하고, 수율이 높고, 현저한 체적 생산량을 나타내는 GMBS를 제공한다. 본 발명의 미생물은 각종 당, 예컨대 헥소오스(hexoses), 펜토오스(pentoses), 디사카라이드(disaccharides) 및 다른 탄소 화합물, 예컨대 글리세롤을 사용하여 단일 단계 제조에 채용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 유전자 돌연변이의 특이하고, 유용한 조합은 석신산 제조로의 탄소 흐름을 지시하는데 채용될 수 있다. 또한, 석신산 제조는 미생물 성장과 결합되고, 결국 세포의 ATP 레벨 및 산화 환원 반응의 균형을 차례로 결합시킨다.
"산화 환원 반응의 균형(redox balance)"이란 NAD+에 대한 NADH의 적절한 비율을 유지하기 위한 세포의 능력을 의미한다. 다시 말해, 세포는 NADH로 산화될 수 있어, 혐기성 발효 성장 동안에 카보히드레이트 기질을 산화시키기 위해 충분한 NAD+가 있다. 호기성 성장 동안, NAD+ 풀(pool)은 NADH를 포함하는 산화성 인산화 반응(oxidative phosphorylation)을 통해 재생된다. 그러나, 혐기성 성장 조건 하에서, NAD+ 풀(pool)의 재생(regeneration)은 NADH를 산화시킬 수 있는 세포 내에 각종 대사 경로를 통해 탄소의 흐름을 조작함으로써 행해진다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 유전자 변형은 미생물의 본래의 게놈 내의 유전자의 조작만을 포함한다. 본 발명의 실시형태에 있어서, 외인성 유전 물질(exogenous genetic material), 예컨대 항생제 저항성 유전자(antibiotic resistance genes)를 견디는 플라스미드 또는 소정의 효소 프로테인을 코딩하는 다른 외인성 뉴클레오티드 시퀀스(exogenous nucleotide sequences)는 석신산 제조를 위한 생체 촉매로서 사용되는 세균 균주에 도입되지 않는다.
본 발명에 적합한 재조합 미생물(recombinant microorganism)은 다양한 박테리아 과, 바람직하게는 엔테로박테리아세애 과(Enterobacteriaceae family)로부터 유래된 것이다. 적합한 미생물은 속(genera) 대장균(Escherichia), 에르위니아(Erwinia), 프로비덴시아(Providencia), 및 셀라티아(Serratia)로부터 선택된다. 속(genus) 대장균은 특히 바람직하다. 속 대장균 중에, 종 대장균(Escherichia coli)가 특히 바람직하다. E. coli의 균주, 예컨대 E. coli B, E. coli C, E. coli W, 등은 본 발명에 유용하다.
현저한 양으로 유기산을 생성할 수 있는 E. coli 균주는 공지 기술에 잘 알려져 있다. 예컨대, 미국 특허 공개 2009/0148914는 화학적으로 순수한 아세테이트 및/또는 피루베이트의 생성을 위한 생체 촉매로서 E. coli의 균주를 제공한다. 미국 특허공개 2007/0037265 및 미국 특허 7,629,162는 젖산의 생성을 위해 구성된 E. coli K011 균주의 유도체를 제공한다. 특허 협력 조약 하에 출원된 국제 특허 WO 2008/115958는 pH-조절 배치 발효(pH-controlled batch fermentation)에서 탄소의 원료로서 글루코오스를 함유하는 최소의 무기질 염 배지 중 석시네이트 및 말레이트를 생성하기 위해 엔지니어링된 미생물을 제공한다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 본 발명에 따라 변형될 수 있는 세균은, 그것에 한정되지 않지만, 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans), 글루코노박터 아사이(Gluconobacter asaii), 아크로모박터 델마르베(Achromobacter delmarvae), 아크로모박터 비스코서스(Achromobacter viscosus), 아크로모박터 락티컴(Achromobacter lacticum), 아그로박테리움 투미펙션즈(Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter), 알칼리제니즈 페칼리스(Alcaligenes faecalis), 아트로박터 시트레우스(Arthrobacter citreus), 아트로박터 투메센스(Arthrobacter tumescens), 아트로박터 파라피너스(Arthrobacter paraffineus), 아트로박터 히드로카르보글루타미커스(Arthrobacter hydrocarboglutamicus), 아트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxydans), 아우레오박테리움 사퍼르데(Aureobacterium saperdae), 아조박터 인디서스(Azotobacter indicus), 브레비박테리움 암모니아제네스(Brevibacterium ammoniagenes), 디바리카툼(divaricatum), 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 글로보섬(Brevibacterium globosum), 브레비박테리움 퍼스컴(Brevibacterium fuscum), 브레비박테리움 케토글루타미컴(Brevibacterium ketoglutamicum), 브레비박테리움 헬콜럼(Brevibacterium helcolum), 브레비박테리움 퍼실륨(Brevibacterium pusillum), 브레비박테리움 테스타세움(Brevibacterium testaceum), 브레비박테리움 로세움(Brevibacterium roseum), 브레비박테리움 임마리오필리움(Brevibacterium immariophilium), 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens), 브레비박테리움 프로토파미애(Brevibacterium protopharmiae), 코리네박테리움 아세토필럼(Corynebacterium acetophilum), 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 칼루네(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 아세토애시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 아세토글루타미컴(Corynebacterium acetoglutamicum), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 에르위니아 카로토보라(Erwinia carotovora), 에르위니아 헤르비콜라(Erwinia herbicola), 에르위니아 크리산테미(Erwinia chrysanthemi), 플라보박테리움 페레그리넘(Flavobacterium peregrinum), 플라보박테리움 퍼카툼(Flavobacterium fucatum), 플라보박테리움 아우란티넘(Flavobacterium aurantinum), 플라보박테리움 레나넘(Flavobacterium rhenanum), 플라보박테리움 세워넨스(Flavobacterium sewanense), 플라보박테리움 브레베(Flavobacterium breve), 플라보박테리움 메닌고셉티컴(Flavobacterium meningosepticum), 마이크로코쿠스(Micrococcus) sp. CCM825, 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii), 노카디아 오파카(Nocardia opaca), 노카디아 루고사(Nocardia rugosa), 플라노코커스 유시나터스(Planococcus eucinatus), 프로테우스 레테게리(Proteus rettgeri), 프로피오니박테리움 스헤르만니(Propionibacterium shermanii), 슈도모나스 신젠타(Pseudomonas synxantha), 슈도모나스 아조토포르만스(Pseudomonas azotoformans), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis), 슈도모나스 스터트제리(Pseudomonas stutzeri), 슈도모나스 애시도볼란스(Pseudomonas acidovolans), 슈도모나스 무시도렌스(Pseudomonas mucidolens), 슈도모나스 테스토스테로니(Pseudomonas testosteroni), 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 로도코커스 에리스로폴리스(Rhodococcus erythropolis), 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous), 로도코커스(Rhodococcus) sp. ATCC 15592, 로도코커스(Rhodococcus) sp. ATCC 19070, 스포로사르시나 우레에(Sporosarcina ureae), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 비브리오 메치니코비(Vibrio metschnikovii), 비브리오 티로제네스(Vibrio tyrogenes), 악티노마두라 마두레(Actinomadura madurae), 악티노미세스 비오라세오크로모제네스(Actinomyces violaceochromogenes), 키타사토스포리아 파루로사(Kitasatosporia parulosa), 스트렙토미세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor), 스트렙토미세스 플라벨러스(Streptomyces flavelus), 스트렙토미세스 그리설러스(Streptomyces griseolus), 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토미세스 올리바세우스(Streptomyces olivaceus), 스트렙토미세스 타나시엔시스(Streptomyces tanashiensis), 스트렙토미세스 버지니에(Streptomyces virginiae), 스트렙토미세스 안티바이오티커스(Streptomyces antibioticus), 스트렙토미세스 카카오이(Streptomyces cacaoi), 스트렙토미세스 라벤둘레(Streptomyces lavendulae), 스트렙토미세스 비리도크로모제네스(Streptomyces viridochromogenes), 아에로모나스 살로모니시다(Aeromonas salmonicida), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 아밀로리퀴페시엔스(Bacillus amyloliquifaciens), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 퍼밀러스(Bacillus pumilus), 바실러스 서컬란스(Bacillus circulans), 바실러스 티아미놀리티커스(Bacillus thiaminolyticus), 에세리키아 프레운디(Escherichia freundii), 마이크로박테리움 암모니아필럼(Microbacterium ammoniaphilum), 세라티아 마르세스센스(Serratia marcescens), 살모넬라 티피무리엄(Salmonella typhimurium), 살모넬라 스코트물레리(Salmonella schottmulleri), 또는 잔토모나스 시트리(Xanthomonas citri) 등이다.
본 발명의 실행헤 적합한 미생물은 호기성(산소의 존재하) 또는 혐기성(산소의 완전한 부재하) 또는 미세 호기성(최소량의 산소가 공급됨)으로 성장될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 석신산의 생성을 위해 선택된 미생물은 혐기성 조건에서 성장된다. 또한, 본 발명에 적합한 미생물은 이중-단계 성장(dual-phase growth) 체계에서 성장될 수 있고, 미생물은 상업적으로 현저한 양으로 석신산 생성을 실행하기 위해 혐기성 성장 조건에 그것을 옮기기 전에 세포 성정의 소정의 레벨에 도달하기 위해 호기성 성장 조건에서 초기에 성장시킨다. 본 발명의 미생물에 의한 석신산의 생성을 위한 이중-단계 성장(dual-phase growth) 동안, 석신산의 생성 및 축적(accumulation)은 혐기성 발효 성장 단계 동안 발생한다.
본 발명은 특정 유전자 변형 기술과 카르보히드레이트 기질을 갖는 무기질염 배지에 혐기성 성장 조건하에서 석신산 생성을 위한 높은 수율, 역가 및 체적 생산량을 나타내는 균주를 얻기 위한 대사 진화(metabolic evolution)의 프로세스를 조합한다.
유전자 조작으로부터 얻어진 미생물 균주는 석신산의 생성을 위한 예상되는 유전자형을 가질 수 있다. 그러나, 최소의 무기질염 배지 중 성장 속도 또는 요구되는 수율, 역가 및 체적 생산량에서 석신산을 생성하기 위한 능력은 대규모의 발효 프로세스를 통해 석신산의 상업적 생성을 위한 생체 촉매로서 유전자 변형된 미생물을 사용하지 않도록 할 수 있다. 따라서, 유전자 변형으로부터 얻어진 유전적으로 변형된 미생물 균주는 석신산 생성을 위한 매우 높은 수율을 갖는 복제물을 선택하기 위해 몇 세대의 카르보히드레이트 원료(carbohydrate source)를 갖는 무기질염 배지에서 연속적으로 성장된다. 가장 바람직한 유전자형을 갖는 복제물의 성장 기반의 선택(growth-based selection)의 프로세스는 대사 진화(metabolic evolution)라고도 한다. 대사 진화 동안, 유전자 변형된 균주는 복제물을 얻기 위한 기간 동안 새로운 최소 배지로 반복해서 옮겨지고, 대사 진화 동안 발생하는 동시 돌연변이(spontaneous mutation)는 빠른 세포 성장, 다른 탄소 원료의 급격한 소비, 동시에 다중의 당(multiple sugar)을 사용하는 능력, 탄소 원료에서 독성의 화학물질을 내성시키는(tolerate) 능력 및 높은 생산 수율 및 다른 유기산의 낮은 생성과 결합되는 바람직한 유기산의 생산성을 보여주는 복제물을 야기한다.
대사 진화(metabolic evolution) 동안, 바람직한 유전자형을 갖는 복제물을 선택하는데 주의를 기울여야 한다. 탄소 원료로 보충된 무기질 배지 중 매우 우수한 성장률을 보여주는 대사 진화에 기인하지만, 바람직한 유기산의 수율이 개선되지 않는 복제물(clone)은 바람직한 복제물이 아니다.
소정의 바람직한 유전자형을 얻기 위한 유기체에 가하는 소정의 선택적인 압력을 사용하는 대사 진화 프로세스 동안에, 2가지 가능한 변화가 일어날 수 있다. 유기체는 선택적인 압력에 단순히 순응될 수 있고, 변화된 유전자형을 나타낼 수 있다. 또한, 유기체는 선택적인 압력하에 소정의 유전적 변화를 겪고, 변화된 유전자형을 보여줄 수 있다. 순응만이 있고, 유전적 변화가 없는 경우에는, 선택 압력이 완화되면 유기체는 본래의 유전자형으로 되돌아간다. 이러한 유기체를 "순응된(adapted)" 유기체라고 한다. 이러한 "순응된(adapted)" 미생물은 선택 압력이 제거되는 경우에 본래의 유전자형으로 돌아온다. "순응된(adapted)" 미생물은 변화된 유전자형을 나타내기 위해 선택 압력하에서 대사 진화의 다른 새로운 라운드를 겪어야만 한다. 반면에, 유전적 변화를 동반하는 경우에는, 변화된 유전자형은 선택 압력이 없는 경우에도 계속 존재할 것이다. 소정의 유전적 변화에 의해 동반되는 대사 진화는 바람직하다. 대사 진화 동안 안정한 유전적 변화를 얻은 미생물은, 선택적 압력으로 새로운 배지로 그것을 옮기기 전에 어떠한 선택 압력 없이 본래의 성장 배지 내에서 미생물의 성장에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 이들 유기체가 우수한 성장 및 어떠한 지연 기간 없이 기대된 유전자형을 보여줄 수 있는 경우에, 유기체는 대사 진화 동안 변화된 유전자형을 얻는 것이 고려된다.
대사 진화 동안 증가되는 유전적 변화의 기초는 유기체의 염색체 DNA 내에 적합한 영역을 시퀀싱하고, 모균주(parent strain)의 것과 시퀀스 데이터(sequence data)를 비교함으로써 결정될 수 있다. DNA 시퀀스 데이터는 공지 기술을 따름으로써 얻어질 수 있다. 예컨대, 대사적으로 진화된 균주의 염색체 DNA의 적합한 영역은 중합 효소 쇄 반응을 통해 얻어질 수 있고, 중합 효소 쇄 반응을 통해 얻어진 프러덕트는 적당한 시퀀싱 프라이머를 사용함으로써 시퀀싱될 수 있다.
컬쳐 컬렉션(culture collections), 예컨대 ATCC(American Type Culture Collection)으로부터 얻어진 야생형 E. coli 균주는 상업적으로 현저한 양으로 석신산을 생성하기 위해 강화된 능력을 갖는 균주를 얻기 위해 유전적으로 엔지니어링되고, 이어서 대사적으로 진화될 수 있다.
유전자 변형은 유전자 변형의 단계들(stages of genetic manipulations) 사이에서 대사 진화(metabolic evolution)에 의해 동반되는 몇개의 다른 단계들로 행해질 수 있다. 유전자 조작은 외인성 DNA 시퀀스를 바꾸거나 게놈의 DNA로부터 특이적 DNA 시퀀스를 완전히 제거하는 것을 포함한다. 또한, 유전자 조작은 미생물의 게놈의 DNA 시퀀스 내에 외래종의 DNA 시퀀스를 삽입하는 것을 포함한다. 본 발명의 소정의 실시형태에 있어서, 유전자 조작은 임의의 외래종의 DNA를 도입하지 않은 미생물의 게놈의 DNA로부터 특이적 DNA 시퀀스를 제거함으로써 수행된다. 특정 프로테인 프러덕트를 코딩하는 유전자의 발현을 불활성화시키는데 필요한 소정의 유전자 변형은 바람직한 유전자 변형을 갖는 복제물을 선택하기 위해 미생물의 게놈에 외래종의 DNA 시퀀스를 삽입하는 것을 필요로한다. 예컨대, 외인성 항생 마커 유전자(exogenous antibiotic marker genes)는 내인성의 유전자를 삽입적으로 불활성화시키고, 바람직한 유전자형을 갖는 복제물을 선택하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 도입된 외인성 DNA 시퀀스는 미생물의 게놈의 DNA로부터 제거되어, 유전적 엔지니어링 프로세스의 마지막에서 미생물은 원래의 게놈의 DNA 내에 외인성의 DNA를 갖지 않는다. 본 발명의 바람직한 실시형태의 대상을 완성하기 위해 필요한 다양한 유전적 엔지니어링 기술은 2개의 다른 과학 공보에 상세히 기재되어 있다(Jantama et al., 2008a; Jantama et al., 2008b). 또한, 공개된 미국 특허 US 2007/0037265 및 US 2009/0148914 및 국제 특허 협력 조약하에 출원된 국제 특허 WO 2008/115958은 본 발명의 각종 실시형태를 실행하는데 유용한 유전적 엔지니어링 기술을 기재하고 있다. 이러한 과학 공보와 특허 문헌은 본 발명에 유용한 유전적 엔지니어링 기술의 상세를 제공하기 위해 여기에 참조로 사용되었다.
미생물을 현저한 양의 석신산으로 생성시키기 위해서, 해당 경로를 포함하는 다수의 미생물의 대사 경로에 관련된 각종 효소, 트리카르복실산 사이클(Krebs 사이클 또는 TCA 사이클로도 알려짐) 및 글리옥실레이트 사이클(glyoxylate shunt)은 상기 문단에서 참조로 인용되고 포함된 과학 및 특허 문헌에 기재된 각종 유전적 엔지니어링 기술을 사용하여 조작될 수 있다. 각종 미생물 대사 경로에 관한 상세는 Lubert Stryer의 Principles of Biochemistry와 같은 표준 생화학 텍스트북에서 발견할 수 있다. 또한, 미국 미주리주 루이스 스트리트의 시그마 화학 회사의 G. Michael의 생화학적 경로 포스터(Biochemical pathways poster)는 세균 세포 내에 각종 생화학적 경로에 대해 제공한다.
호기성 성장 동안에, 미생물 탄소 대사는 해당 과정(glycolysis), 트리카르복실산 사이클 및 산화성 인산화반응과 관련된다. 환원된 효소 보조 인자(co-factor), 예컨대 NADPH 및 NADH는 세포 성장에 요구되는 ATP 생성에 의해 동반되는 산화성 인산화 반응의 작용에 의해 재생된다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서 석신산의 생성을 위한 혐기성 성장 조건 하에서, 환원된 보조 인자(cofactor) NADPH 및 NADH는 트리카르복실산 사이클로 탄소 흐름을 지시하고, NADP+ 및 NAD+의 재생을 위한 발효적 경로 모두를 제거함으로써 실행된다.
바람직한 유기산의 형태에 따라, 대사 경로는 특이적으로 엔지니어링되어, 미생물은 우리가 선택한 특정 유기산을 생성한다. 미생물은 락트산, 아세트산, 말산, 피루브산, 포름산 및 석신산을 포함하는 다양한 유기산을 합성할 수 있다. 따라서, 석신산의 생성을 위한 생체 촉매를 발전(developing)시키는데 있어서, 아세트산, 락트산, 피루브산, 및 포름산의 생성 경로는 차단되고, 석신산 생성으로의 탄소 흐름은 세포 내에서 탄소 대사와 관련되는 하나 이상의 효소를 조작함으로써 가능해진다. 공지의 유전적 엔지니어링 기술을 사용하여 조작할 수 있는, 미생물 발효 경고에서 활성인, 효소의 목록은 이것에 한정되지 않지만, 이소시트레이트(isocitrate) 합성효소 (aceA), 말레이트(malate) 생성효소 (aceB), 글리옥시레이트 션트 오페론(glyoxylate shunt operon) (aceBAK), 아세테이트 키나아제-인산아세틸기전달효소(acetate kinase-phosphotransacetylase) (ackA - pta); 아코니타제 수화효소(aconitase hydratase) 1 및 2 (acnA and acnB); 아세틸-CoA 합성효소 (acs); 시트레이트 리아제(citrate lyase) (citDEF); 알콜 탈수소효소 (adhE); 시트레이트(citrate) 생성효소 (citZ); 푸마레이트(fumarate) 환원효소 (frd); 락테이트(lactate) 탈수소효소 (ldh); 말레이트 탈수소효소 (mdh); aceBAK 오페론 리프레서 (iclR); 포스포에놀 피루베이트(phosphoenol pyruvate) 카르복실라아제 (pepC); 피루베이트 포르메이트 리아제(pyruvate formate lyase) (pfl); 피루베이트 옥시다아제(pyruvate oxidase) (poxB); 피루베이트 카르복시 키나아제(pyruvate carboxy kinase) (pck ); 및 피루베이트(pyruvate) 카르복실라아제 (pyc) (도 1, 6, 및 9)를 들 수 있다.
탄소 원료의 해당은 포스포에놀 피루베이트(PEP)의 생성을 야기한다. PEP는 혼합산 경로에 의해 더 대사된다. 본 발명에 사용되는, "혼합산 경로(mixed acid pathway)"란 트리카르복실산 사이클과 혐기성 조건하에서 작용하는 각종 발효적 경로를 통해 PEP로부터 탄소의 흐름을 말한다. 혐기성 조건 하에서, 피루베이트 대사를 위한 적어도 4가지 다른 발효 경로가 알려져 있다. 피루베이트는 NADH를 사용하여 락테이트로 환원될 수 있어 탄소 원료의 연속적인 대사를 위해 필요한 세포의 산화 환원 반응의 균형을 유지하기 위해 NAD+를 생성한다. 또한, 피루베이트로부터 유도된 아세틸-CoA는 NAD+를 생성하기 위해 NADH의 산화에 의해 동반되는 에탄올을 생성하기 위해 환원될 수 있다. 또한, 피루베이트는 도 1A에 나타낸 바와 같이 포르메이트 또는 아세테이트로 전환될 수 있다.
TCA 사이클 내에서, 2개의 다른 부문(arm)이 알려져 있다. 이소시트레이트를 통해 옥살로아세테이트로부터 석신산까지의 탄소 흐름을 포함하는 산화적 부문(oxidative arm)이라고도 하는 TCA 사이클의 하나의 부문에 있어서, NADP+는 NADPH의 생성물을 갖는 이소시트레이트를 산화하는데 사용된다. 말레이트 및 푸마레이트를 통해 옥살로아세테이트로부터 석신산까지의 탄소의 흐름을 포함하는 TCA 사이클의 환원적 부문(reductive arm)이라고도 하는 TCA 사이클의 다른 부문에 있어서, NADH는 NAD+를 생성하기 위해 산화되어 산화환원 반응의 균형을 유지하기 위해 세포를 돕는다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 발효 경로를 통한 PEP로부터의 탄소 흐름은 발효 경로와 관련되는 효소를 코딩하는 유전자를 불활성화시킴으로써 억제된다. 발효 경로를 통한 탄소 흐름을 차단하는데 적합한 효소는 ldhA , pflB , adhE, pta , ackA, 및 poxB를 들 수 있다. 이들 유전자의 하나 이상의 제거는 발효 경로를 통해 PEP로부터 탄소 흐름을 감소시키는 것이 예상된다. 이들 6개의 유전자 모두의 불활성은 발효 경로 전체를 통해 탄소 흐름을 차단하는 것이 예상된다. 본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 메틸글리옥살의 젖산으로의 전환을 야기하는 메틸글리옥살 생성효소(mgsA)를 코딩하는 mgsA 유전자는 발효 경로와 관련되는 6개의 다른 유전자의 불활성에 비해 불활성화된다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 발효 경로와 관련되는 유전자의 기능적 유사성은 하나 또는 다른 발효적 경로와 관련된 공지의 유전자를 불활성화시키는 것에 비해 불활성화된다. 프로피오네이트 키나아제와 아세테이트 키나아제 활성은 트레오닌의 열화를 위해 생성되는, tdcD 유전자에 의해 인코딩된다. 그러나, 10% (w/v) 글루코오스를 갖는 혐기성 성장 동안, tdcD의 발현은 기능적으로 ackA로 교체할 수 있다. 또한, 동일한 오페론 내에 근접한 tdcE 유전자는 피루베이트 포르메이트-리아제 활성을 갖는 케토부티레이트 포르메이트 리아제를 인코딩한다. 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, tdcDE 유전자는 발효 경로로의 탄소의 출입을 막고, TCA 사이클로의 탄소의 흐름을 확인하기 위해 불활성화된다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 발효 경로를 통한 탄소 흐름을 차단하는 것에 비해, TCA 사이클 내에 탄소의 흐름은 변화되어 석신산의 생성을 향해 지시되는 탄소의 흐름이 있다. 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, TCA 사이클 내에 탄소 흐름의 조작은 하나 이상의 유전자의 발현을 업-레귤레이팅(up-regulating)을 사용하여 행해진다. 본 발명의 다른 실시형태에 있어서, TCA 사이클 내에서 기능하는 하나 이상의 유전자는 석신산으로의 증가되는 탄소 흐름을 가능하게 하기 위해 불활성화될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 말레이트 탈수소효소를 인코딩하는 유전자 mdh는 말레이트의 푸마레이트 및 석시네이트로의 전환을 개선하기 위해 업 레귤레이팅된다. 말레이트 및 푸마레이트를 통해 옥살로아세테이트로부터 석신산으로의 탄소의 흐름은 TCA 사이클의 환원적 부문이라고도 한다. 옥살로 아세트산으로부터 석신산까지의 TCA 사이클의 환원전 부문을 통한 탄소의 흐름은 생성되는 석신산의 몰 모두에 대한 2몰의 NADH를 소비하여 혐기성 조건하에서 세포의 산화 환원 반응의 균형을 유지하는 것을 돕는다. 다시 말해, mdh의 업-레귤레이션은 세포의 산화 환원 반응의 균형을 유지하기 위해 요구되는 NAD+의 재생을 돕는다. mdh 유전자 발현의 업-레귤레이션(up regulation)은 mdh 유전자의 본래의 프로모터를 다른 강력한 프로모터 시퀀스로 교체시킴으로써 또는 mdh 유전자의 프로모터 영역을 돌연변이 시킴으로써 행해질 수 있고, 이는 mdh 유전자의 전사를 증가시킨다. 또한, mdh 유전자의 추가적인 복제물은 균주에 첨가될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, mdh 유전자 발현의 업 레귤레이션(up regulation)은 프로모터 영역을 유전자 조작함으로써 행해진다.
TCA 사이클의 정기적 작용에 있어서, 석신산은 TCA 사이클의 부문의 산화적 작용을 통해 생성된다. 시트레이트, 시스-아코니테이트, 이소시트레이트, α-케토글루타레이트, 및 석시닐 CoA을 통해 옥살로아세테이트로부터 석신산까지 탄소의 흐름은 TCA 사이클의 산화적 부문이라고도 한다. 또한, 석신산은 글리옥실레이트 우회 작용을 통해 생성될 수 있다. 글리옥실레이트 우회 작용 동안, 이소시트레이트 리아제의 작용에 의해, 석시네이트 및 글리옥실레이트는 이소시트레이트로부터 생성된다. 따라서, TCA 사이클의 산화적 부문의 작용 또는 글리옥실레이트 우회 작용으로부터 생성되는 석시네이트는 석시네이트 탈수소효소에 의해 작용되어 푸마르산 및 말산을 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 유전자 불활성화는 세포간 석신산 생성을 증가시키기 위해 석시네이트의 탈수소효소를 억제하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 글리옥실레이트 우회를 통한 탄소의 흐름은 석신산 생성을 증가시키기 위해 조작될 수 있다. 이소시트레이트 리아제 효소는 이소시트레이트의 글리옥실레이트 및 석시네이트로의 분열을 촉진시킨다. 이소시트레이트 리아제는 aceBAK 오페론에 의해 코딩된다. 이소시트레이트 리아제 활성은 iclR 유전자에 의해 억제된다. 다시 말해, iclR 유전자의 발현은 글리옥실레이트 션트의 작용을 억제한다. 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, iclR 유전자는 발효 대사와 관련되는 유전자의 불활성화와 비교하여 불활성화된다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 발효 경로의 작용을 억제하고, 유전자 조작을 통한 석신산 생성을 향한 TCA 사이클 내에 탄소의 흐름을 증가시키는 것 이외에, TCA 사이클로부터 다른 대사 경로까지 표면상의 탄소 흐름은 석신산 생성을 증가시키기 위한 유전적 수단을 통해 차단될 수 있다. 예컨대, TCA 사이클로부터 아미노산 대사까지 탄소의 흐름은 석신산을 향한 탄소 흐름을 개선하기 위해 차단될 수 있다. 아스파르테이트 아미노트랜스페라아제 유전자(aspC)는 아스파르트산의 합성시 글루탐산으로부터 옥살로아세트산까지 아미노기를 이동시켜, TCA 사이클로부터 탄소의 표면상의 흐름을 가능하게 한다. 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, aspC 유전자의 불활성화는 TCA 사이클의 산화적 또는 환원적 부문을 통해 석신산 생성을 향한 옥살로아세테이트로부터 탄소 흐름을 개선하기 위해서, TCA 사이클로부터 탄소의 표면상의 흐름이 차단된다.
TCA 사이클로부터 탄소의 다른 표면상의 흐름은 말레이트로부터 발생한다. 말산 효소(sfcA)에 의한 말레이트의 탈카르복실화 반응은 피루베이트의 생성을 야기한다. 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, sfcA 유전자를 코딩하는 유전자는 TCA 사이클로부터 탄소의 표면상의 흐름을 축소시키기 위해 불활성화된다. 본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, aspC 및 sfcA 유전자는 석신산 축적을 향상시키기 위해 TCA 사이클로부터 탄소의 표면상의 흐름을 억제하기 위해 불활성화된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, TCA 사이클로부터 탄소의 표면상 흐름은 시트르산의 옥살로아세테이트 및 아세테이트로의 분열을 야기하는 시트레이트 리아제 유전자(citDEF)를 불활성화시킴으로써 억제된다.
발효적 경로와 관련되는 유전자 및 이의 기능적 유사체를 불활성화시키고, TCA 사이클 중 탄소 흐름을 억제하고, TCA 사이클 내에 석신산을 향한 탄소 흐름을 조절(regulating)하는 것은 미생물 발효 중 석신산 수율을 개선시킬 수 있는 것 이외에, 본 발명은 석신산 수율이 결합된 성장은 미생물 세포 내에 카르복실화 효소의 유전자 조작에 의해 더 개선될 수 있다는 것을 놀랍게도 발견했다. 유전자 및 효소 분석을 행함으로써 대사 진화 동안 발생하는 변화를 특성화하면서, 본 발명의 발명자는 세포 내에 카르복실화 효소가 개선된 석신산 수율을 행하기 위해 유전자 조작을 위한 다른 표적일 수 있다는 것을 발견했다.
당분해 중간체 포스포에놀 피루베이트(PEP) 및 피루브산은 TCA 사이클로 탄소 흐름을 개선하기 위해 카르복실화될 수 있다. 보통의 조건하에서, TCA 사이클로의 탄소의 출입은 시트르산을 생성하기 위해, TCA 사이클 내에서 중간체, 옥살로아세테이트로 피루베이트로부터 유래된 아세틸-CoA 를 결합하는 시트레이트 합성의 활성에 의해 행해진다. 세포내에 존재하는 하나 이상의 카르복실화 효소의 효능을 개선함으로써, 포스포에놀 피루베이트 및 피루베이트를 옥살로아세테이트, TCA 사이클 중간체로 카르복실화할 수 있다(도 2). 카르복실화 반응으로부터 생성된 옥살로아세테이트는 석신산을 생성하기 위해 TCA 사이클의 환원적 부문을 통해 더 환원될 수 있다.
본 발명은 혐기성 효소 성장 동안 석신산 수율을 증가시키는 방법으로서, 세포 내에 존재하는 카르복실화 효소를 조작하는 방법을 제공한다. 외인성 원료로부터 피루베이트 카르복실라아제(pyc)를 도입함으로써, 피루베이트를 옥살로아세트산으로 카르복실화할 수 있다는 것은 공지 기술에 잘 알려져 있다. 유전자 변형에 적합한 미생물 균주, 예컨대 E. coli 는 pyc 유전자를 갖지 않는다. 다른 세균 종, 예컨대 Rhizopium elti 및 Lactobacillus lacti로부터 유래된 pyc 유전자는 석신산 생성을 개선하기 위해 유전자 변형된 E. coli 균주에 도입될 수 있다.
4개의 다른 내인성 카르복실화 효소는 E. coli로 알려져 있다. 이들 중 2개의 효소는 포스포에놀 피루베이트의 카르복실화를 야기하고, 다른 효소는 피루베이트 키나아제 효소의 작용에 의해 포스포에놀 피루베이트로부터 유도된 피루베이트의 카르복실화를 야기한다. 효소 포스포에놀 피루베이트 카르복실라아제(ppc)는 석시네이트를 생성하기 위해 TCA 사이클의 환원적 부문으로 들어갈 수 있는 옥살로아세테이트로 포스포에놀 피루베이트를 카르복실화한다. 또한, 제2 카르복실화 효소 포스포에놀 피루베이트 카그복시키나아제(pck)는 옥살로아세테이트를 생성하기 위해 포스포에놀 피루베이트를 카르복실화하지만, 이는 글루코오스의 존재하에 발현되지 않기 때문에 역반응을 촉진시킨다. 2개의 다른 카르복실화 효소, NADH-연결 말산 효소(NADH-linked maleic enzyme) (maeB) 및 NADPH-연결 말산 효소(NADPH-linked maleic enzyme) (maeA / sfcA)는 피루브산을 말산으로 카르복실화한다. maeB and sfcA 효소는 피루베이트 키나아제의 작용에 의해 포스포에놀 피루베이트로부터 유래된 피루베이트를 카르복실화한다.
세포 내에 존재하는 4개의 카르복실화 효소 중 어느 하나는 해당 사이클 중간체로부터 TCA 사이클로의 탄소 흐름을 개선하기 위해 효소적 활성을 증가시키기 위해 유전자 조작될 수 있다. E . coli 내에 존재하는 본래의 카르복실화 효소 중, PPC-촉매 반응은 매우 유용하다. PEP 내에 함유되는 에너지는 무기 포스페이트의 방출로 이 반응에서 상실된다. 다른 3개의 카르복실화 효소, pck, maeA 및 sfcA (maeB)는, 이들 3개의 카르복실화 효소는 글루코오스에 의해 억제되기 때문에, 기질로서 글루코오스를 사용하여 발효 성장 동안 기능하는 것으로 예측되지 않는다. 이들 3개의 카르복실화 효소는, 세포가 유기산을 산화적으로 대사하는 경우에 글루코오스 생성 동안 역방향으로 작용하는 것으로 생각된다.
본 발명에 있어서, 발명자들은 글루코네오제닉 PEP 카르복시키나아제(gluconeogenic PEP carboxykinase) (PCK)가 TCA 사이클로 탄소의 흐름을 개선하기 위해 유전자 조작될 수 있다는 것을 발견했다. E . coli에 있어서 석신산 프러덕트의 주요 경로로서 pck의 보충은 놀랍고, pck의 기능적 역할에 대한 현재의 이해와 현저히 다르다. E . coli 및 Actinobacillus . succinogenes pck의 증가된 발현은 석시네이트 생성에 효과가 없다는 것이 이전 연구에 나타났다(Kim et al., 2004; Millard et al., 1996). E . coli pck의 증가된 발현은 최소의 배지에서의 성장에 해롭고, 성장률, 글루코오스 대사의 비율, 및 석시네이트의 수율을 감소시킨다[Kwon et al., 2008). pck의 활성을 개선하는 이점은, 포스포에놀 피루베이트를 옥살로아세테이트로 카르복실화할 때, 이러한 효소는 생성되는 옥살로아세테이트의 각 몰에 대한 ATP의 분자의 생성을 야기한다는 사실에 있다. ATP 수율의 증가는 세포의 성장률을 증가시킨다.
본 발명에 구성되는 다수의 E. coli 균주에 있어서 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제 활성의 비교 분석은, 대사 진화 동안 PCK 효소 활성의 증가가 pck 유전자의 전사적 활성의 증가를 야기하는 것을 밝혀냈다. 세포 성장-결합된 석시네이트 성장에서의 개선을 나타내는 이들 균주에 있어서, 풍부한 pck 전사물이 증가된다. 사실, 본 발명의 결과는 PCK 전사물 레벨의 증가 및 PCK 효소 활성의 증가 및 성장-결합된 석신산 생성 사이의 포지티브한 상호 연관성을 설립했다.
발효적 석시네이트 생성을 위한 본래 글루코네오제닉(gluconeogenic) pck의 모집(recruitment)은 pck 유전자의 전사에 긍정적인 영향을 미치는 돌연변이에 의해 행해질 수 있다. PCK 활성 레벨의 증가는, 유전자의 발현을 증가한다고 알려진 본래의 프로모터 또는 임의의 다른 프로모터 시퀀스를 갖는 다복제 플라스미드 내에 pck 유전자를 발현함으로써 행해질 수 있다. 세포내에서 pck 유전자의 발현을 증가시키는 다른 방법은 트랜스포슨을 사용하여 pck 유전자의 추가적인 복제물을 통합하는 것이다. 본 발명의 다른 실시형태에 있어서, pck 유전자의 본래의 프로모터는 활성 레벨을 증가시킨다고 알려진 다른 프로모터 성분에 의해 교체될 수 있다. 또한, pck 유전자의 증가된 발현은 pck 유전자의 프로모터 영역과 상호작용한다고 알려진 조절 성분의 유전자 조작 또는 유전자의 프로모터 영역에서의 돌연변이에 의해 행해질 수 있다. pck 유전자의 조절 프로테인을 코딩하는 유전자는 pck 유전자의 발현을 증가시키기 위해 다른 방법으로 오버 발현되거나 제거되거나 돌연변이될 수 있다. 본 발명의 결과물은, 단일 점 돌연변이(pck 유전자의 ATG 개시 코돈에 대한 위치 -64에서 G 내지 A 전이)가 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제 효소 활성의 대응하는 증가에 의해 동반되는 pck 유전자의 전사를 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, pck 유전자 발현의 유사한 증가는 pck 유전자의 발현을 조절한다고 알려진 프로테인을 코딩하는 유전자를 유전자 조작함으로써 행해질 수 있다. 예컨대, Cra 프로테인은 E. coli 에서 pck 유전자의 발현을 활성화시키는 것을 보여준다(Saier and Ramseier, 196). 마찬가지로, csrA 시스템(csrA, csrB, csrC, csrD, uvrY 또는 barA를 포함함)은 mRNA 안정성을 변화시킴으로써 글루코오스 대사와 관련되는 pck 및 다른 유전자의 레벨을 조잘하는 것이 알려져 왔다(Babitzke and Romeo, 2007; Pernestig et al., 2003; Suzuki K et al., 2002).
혐기성 발효 프로세스 동안 성장-결합된 석신산 생성을 증가시키기 위한 본 발명의 다른 유전적 접근은 생체 촉매에 의한 당 흡수에서 확장되는 에너지의 전환과 관련된다.
미생물은 사이토플라즈마 맴브레인 상에 위치한 수송자 프로테인(transporter protein)의 세트를 통해 당을 흡수한다(Jojima et al., 2010). 미생물 당 수송자는 3개의 주요 카테고리에 속한다. 세균의 당 수송자의 가장 큰 그룹은 ATP 결합 카셋(ABC) 수송자로 알려져 있다. 이름으로 추론할 수 있듯이, ABC 수송자는 세균 세포로 수송되는 당 분자에 대한 ATP 분자를 필요로 한다. XylFGH는 세포로 자일로오스의 트랜스포트(transport), 펜토오스 당에 대한 ABC 수송자이다. AraFGH는 아라비노오스, 다른 펜토오스 당의 트랜스포트에 대한 ABC 수송자이다.
세균 당 수송자의 제2 형태는 MFS(Major Facilitator Super family) 하에 그룹핑되었다. MFS 당 수송자 내에서, 수송자의 2개의 다른 카테고리가 인지되었다. MFS는 H+- 결합된 공수송체(linked symporters), Na+ - 결합된 공수송체-역수송체 및 유니포터(linked symporters-antiporters and uniporters)를 포함한다. 유니포터는 당 수송자에 대한 촉진제이고, 단순한 세포로 수송된 당 분자에 대한 ATP 분자를 필요로 한다. E . coli 내에 트랜스-멤브레인 프로테인 Glf는 유니포터의 예이다. H+ -공수송체는 세포로 수송되는 당 분자에 대한 ATP 분자 및 프로톤을 필요로 한다. E . coli 내에 있는 GalP 프로테인은 세포로, 갈락토오스, 헥소오스 당의 수송자의 공수송체이다. GalP는 12 트랜스-멤브레인 루프(12 trans-membrane loops)를 갖는 공수송체를 특징으로 한다. 또한, GalP는 세포 멤브레인을 가로지르는 글루코오스를 수송하는 능력을 갖는다. AraE는 세포 멤브레인을 가로지르는 아라비노오스의 트랜스포트의 프로톤-결합된 공수송체(proton-linked symporter)이다. 마찬가지로, XylE 프로테인은 자일로오스의 트랜스포트에 대한 프로톤-결합 공수송체(proton-linked symporter)이다.
헥소오스 당의 흡수를 주로 야기하는 제3 당 수송체, 예컨대 글루코오스는 포스포에놀피루베이트(phosphoenolpyruvate): 카르보히드레이트 포스포트랜스페라아제 시스템(carbohydrate phosphotransferase system)(PTS)로 알려져 있다. PTS에 의해 촉진되는 포스포에놀피루베이트(PEP)로부터 포스포릴기의 이동은 글루코오스의 인산화 반응을 구동시키고, 세포 내에서 글루코오스 6-포스페이트 및 피루브산의 형성을 야기한다. PTS 생성된 피루브산(PTS generated pyruvic acid)은 글루코오스가 탄소의 원료인 경우, 호기성 배양 조건 하에서 PEP로 명백히 리사이클(recycled)되지 않는다. 대신, 피루베이트는 트리카르복실산 사이클의 방법으로 이산화탄소로 산화된다. 따라서, 글루코오스의 단 분자의 트랜스포트에 있어서, PEP의 분자는 소비된다. 세포의 생물 에너지학에 있어서, PTS를 통한 당의 트랜스포트는 에너지 인텐시브 프로세스이다. 따라서, 혐기성 조건에서 성장하는 세포에 있어서, 상업적으로 유용한 화학물질의 생성을 위해 세포내에서 포스포에놀피루베이트 함량을 전환할 필요가 있는 경우에는, 세포로 수송되는 당 분자에 대한 PEP 분자를 필요로 하지 않는 다른 일부 당 수송체로 PTS를 대체하는 것이 바람직하다.
해당 작용(glycolysis), 트리카르복실산 사이클(tricarboxylic acid cycle) 및 미생물 대사 경로의 글리옥실레이트 션트(glyoxylate shunt)와 직접적으로 관련된 이들 유전자 이외에도, 석신산 합성을 위한 에너지의 원천으로서 유용한 탄소 화합물의 흡수와 관련된 유전자의 유전자 조작은 탄소 흡수를 향상시키거나 유기산 생성의 에너지 이용의 효율을 향상시키기 위해 조작될 수 있다. 예컨대, 포스포트랜스페라아제 시스템(PTS)에 의한 글루코오스 흡수의 제거는 미생물 세포로 글루코오스 흡수에 소모되는 에너지를 줄이는데 도움을 줄 수 있다. PTS를 조작함으로써 전환되는 에너지는 유기산 생성의 효율을 개선하기 위해 보낼 수 있다. 포스포트랜스페라아제 시스템 유전자 ptsH 및 ptsG는 글루코오스 흡수로 에너지를 전환시키기 위해 조작될 수 있어 미생물에 의한 석신산 생성의 효율을 개선할 수 있다. 따라서, 미생물 대사 경로 영역에서 이용가능한 데이터를 채굴(mining)함으로써, 대부분의 대사 경로를 차단하고, 큰 효율을 갖는 석신산의 생성으로 탄소 흐름을 보내기 위해 유전자의 셋트를 제거할 수 있다.
PTS는 2개의 세포질 성분, E1 및 HPr 및 멤브레인-바운드 성분 EII로 이루어진다. E . coli는 적어도 15개의 다른 EII 복합체를 함유한다. 각각의 EII 성분은 전달될 당 형태로 특이적이고, 2개의 소수성 완전한 멤브레인 도메인(C 및 D) 및 2개의 친수성 도메인(A 및 B)을 함유한다. 이들 4개의 도메인은 함께 당 분자의 인산화 및 트랜스포트를 야기한다. EI 프로테인은 PEP에서 HPr 프로테인까지 포스페이트기를 이동시킨다. EII 프로테인은 인산화 HPr 프로테인에서 당 분자까지 포스페이트기를 이동시킨다.
EI는 ptsI 유전자에 의해 인코딩된다. HPr은 ptsH 유전자에 의해 인코딩된다. 장내 세균의 글루코오스-특이적 EII는 2개의 분명한 프로테인, 유전자 crr에 의해 인코딩된 EIIAGlc 및 유전자 ptsG에 의해 인코딩되는 멤브레인-관련 프로테인 EIICBGlc으로 이루어진다. PTS 매개된 당 트랜스포트(PTS mediated sugar transport)는 PTS와 관련된 프로테인을 인코딩하는 유전자 중 하나를 제거함으로써 억제될 수 있다. 다른 포스포에놀피루베이트-의존 흡수(alternative phosphoenolpyruvate-independent uptake) 및 인산화 활성(phosphorylation activities)에 의한 PTS의 기능적 대체(Functional replacement)는 대사의 일부 속(classes)에 대한 생산성 및 글루코오스로부터의 생산 수율의 현저한 개선을 행하기 위한 유전적 접근(genetic approaches) 중 하나이다.
PTS-매개된 글루코오스 흡수(PTS-mediated glucose uptake)가 억제되는, 글루코오스 흡수를 위한 다른 시스템은 산업적으로 유용한 화학물질의 생성을 위해 세포 내에서 글루코오스의 계속적인 이용가능성을 보증하기 위해 활성화될 수 있다. 예컨대, 글루코오스 투과효소, 글루코오스 유니포터를 코딩하는 glf 유전자는 PTS 중재된 글루코오스 흡수의 손실을 대체하는 것으로 보인다. 마찬가지로, galP and glk 유전자의 오버 발현은 E. coli의 pts - 균주 내에서 글루코오스 흡수 및 인산화를 향상시킨다고 보고되었다. GalP는 갈락토오스, 헥소오스 당의 흡수를 위한 공수송체이다. GalP는 pts - 균주 내에서 글루코오스를 이동시킨다고 보고되었다. GalP 매개된 글루코오스 흡수의 현저성은 pts - 돌연변이체 내에 galP 유전자의 불활성화는 치명적이라는 것이 발견되었다는 사실에 의해 반증되었다(Yi et al., 2003). Glk는 해당 과정으로 들어갈 수 있기 전에 글루코오스 분자의 인산화를 행하는 것이 필요하다. pts - 균주 내에 GalP 프로테인의 발현은, 구성요소인 프로모터(constitutive promoter) 하에서 외인성의 유전자(exogenous gene)를 발현시킴으로써, 또는 galS 및 galR와 같은 galP 유전자의 리프레서(repressor)를 코딩하는 유전자 내에 돌연변이를 통해 galP 발현 억제를 완화(relieving)함으로써 행해질 수 있다.
상기에 기재된 바와 같이, 미생물 촉매를 사용하는 석신산 생성은 대사 진화에 의해 동반되는 유전자 조작을 사용함으로써 행해질 수 있다. 대사 진화 동안 발생하는 유전자 변화는 생화학적 및 유전적 분석을 통해 확인될 수 있다. 본 발명은 세포내에 존재하는 포스포트랜스페라아제 시스템(phosphotransferase system) 및 카르복실화 효소(carboxylating enzymes)의 유전자에서 발생하는 돌연변이는 석신산 생성을 증가시키기 위해 긍정적으로 기여할 수 있다는 사실을 발견했다. 유전자 변이에 대해 새롭게 발견된 표적은 석신산 생성을 위한 고효율을 갖는 생체 촉매를 생성하기 위한 다른 방법으로 해당, 트리카르복실산 및 발효 경로에서의 다른 표적과 조합될 수 있다. 또한, 최고의 석신산 생성 균주를 실행하기 위해 유전자 조작을 위한 표적 유전자의 최소수의 셋트를 정의하는 것이 매우 바람직하다.
또한, 본 발명은 석신산 생성에서 글리세롤 사용을 향상시키려는 유전적 접근을 제공한다. 글리세롤 흡수는 glpF 유전자에 의해 코딩되는 프로테인에 의해 산화되어 디히드록시 아세톤(DHA)을 생성한다. DHA는 dhaKLM 오페론에 의해 코딩되는 프로테인에 의해 디히드록시 아세톤 포스페이트(DHAP)로 인산화된다. dhaKLM에 의해 코딩된 프로테인에 의해 DHAP로의 DHA의 인산화는 포스포에놀 피루베이트(PEP) 풀의 이용가능성에 의존한다. DHA의 인산화가 PEP를 필요로 하기 때문에, 높은 수율의 석신산을 얻기 위해 요구되는 적당한 산화 환원 반응의 균형을 보증하기 위해 TCA 사이클로 PEP로부터의 탄소의 흐름을 지시하는 PCK에 이용가능한 PEP를 감소시킨다(it depletes the PEP available for PCK which directs the flow of carbon from PEP into the TCA cycle in order to assure proper redox balance required to achieve high succinic acid yield). 본 발명은 증가된 PCK 효소적 활성을 갖는 세균 세포 내에 gldA 및 dhaKLM 경로를 통해 글리세롤 흐름의 억제는 탄소 원료로서 글리세롤을 사용하여 석신산 수율을 향상시킬 수 있다는 것을 발견했다. 또한, 본 발명은, 탄소 원료로서 글리세롤을 사용하여 석신산 수율의 향상이 gldA 유전자 및 dhaKLM 오페론 내에서 개선된 PCK 효소 활성 및 제거를 갖는 세균 세포 내에서 발효적 경로를 통해 탄소의 흐름을 억제함으로써 행해질 수 있다는 것을 발견했다.
이하 실시예는 본 발명을 설명하는 방법으로서 제공되었다. 이들 발명은 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 당업자는 본 발명의 정신을 위반하지 않고, 다양한 실시형태로 본 발명을 실행할 수 있다.
실험 부분
일반 적요
균주, 배지 및 성장 조건
E. coli C 의 새로운 유도체(ATCC 8739)는 성장 기반 선택과 조합된 유전자 제거의 특이 조합을 사용하여 석시네이트 생성을 위해 성장시켰다. 본 발명에 성장된 E. coli 의 각종 균주는 표 2에 나타낸 바와 같이 고유 번호로 ARS 컬쳐 컬렉션에서 기탁받았다.
본 발명의 미생물 유기체는 미생물학 분야에서 잘 알려진 다양한 배양 배지에서 성장시킬 수 있다. 예컨대, E. coli의 야생형 및 돌연변이 균주는 1% (w/v) 트립톤(tryptone), 0.5% (w/v) 효모 추출물, 및 0.5% (w/v) NaCl을 함유하는 LB(Luria-Bertani) 배지에서 성장시켰다. 생체 촉매로서 유전자 변형된 미생물을 포함하는 발효 프로세스를 사용하여 유기산의 상업적 생성을 위해, 탄소 원료로 보충된 최소의 무기질염 배지가 바람직하다. LB 배지와 같은 리치한 배지(rich medium)와는 반대로 무기질 염 배지의 사용은 상업적 규모에서 유기산의 생성 비용을 감소시킨다.
본 발명에 적합한 최소의 무기질 배지는 NBS 배지(Causey et al., 2007) 및 AMI 배지(Martinez et al., 2007)를 포함한다. NBS 배지는 1 mM 베타인(betaine), 25.72 mM KH2PO4, 28.71 mM K2HPO4, 26.50 mM (NH4)2HPO4, 1 mM MgSO4.7H2O, 0.1 mM CaCl2.2H20, 0.15 mM 티아민(Thiamine) HCl, 5.92 mM FeCl36H20, 0.84 mM COCl2.6H2O, 0.59 mM CuCl2. 2H2O, 1.47 mM ZnCl2, 0.83 mM Na2MoO4 2H2O, 및 0.81 mM H3BO3을 함유한다. AM1 배지는 1 mM 베타인, 19.92 mM (NH4)2HPO4, 7.56 mM NH4H2PO4, 1 .5 mM MgSO4.7H2O, 1.0 mM Betaine-KCl, 8.88mM FeCl36H20, 1,26 mM COCl2.6H2O, 0.88 mM CuCl2.2H2O, 2.20 mM ZnCl2, 1.24 mM Na2MoO42H2O, 1.21 mM H3BO3 및 2,50 mM MnCl24H2O을 함유한다. 미량 원소는 1000X 스톡(stock)으로서 제조되고, 이하 성분: 1.6 g/L FeCl3 , 0.2 g/L CoCl2 ·H2O, 0.1 g/L CuCl2 , 0.2 g/L ZnCl2·H2O, 0.2 g/L NaMoO4, 0.05 g/L H3BO3, and 0.33 g/L MnCl2·H2O를 함유한다.
유기산의 미생물 생성을 위한 무기질 배지는 탄소 원료로 보충된다. 본 발명에 유용한 탄소 원료는 그것에 한정되지 않지만, 자일로오스(xylose)와 같은 펜토오스 당(pentose sugars), 글루코오스, 프룩토오스(fructose), 및 갈락토오스(galactose) 및 글리세롤과 같은 헥소오스 당(hexose sugar)을 들 수 있다. 또한, 탄소 원료는 글루코오스와 자일로오스의 조합과 같은 다른 당의 조합을 제공함으로써 만족될 수 있다. 또한, 탄소 원료는 전분 또는 리그노셀룰로오스(lignocellulose)의 가수분해로부터 유도될 수 있다. 전분 및 리그노셀룰로오스와 같은 복합 탄수화물의 가수분해는 공지 기술에 알려진 열-화학적 전환 프로세스 또는 효소적 방법을 사용함으로써 행해질 수 있다. 미생물 발효를 사용하여 유기산의 산업적 생성을 위한 바람직한 탄소 원료는 농업적 또는 임업적 폐기물의 가수분해로부터 유래된 리그노셀룰로오스 가수분해물이다. 리그노셀룰로오스 가수분해물은 헥소오스-농축된(hexose-enriched), 펜토오스 농축된 분율(pentose-enriched fraction)을 얻기 위해 더 분별될 수 있고, 이들 분획은 미생물 발효 프로세스를 사용하여 유기산의 상업적 생성을 위한 탄소의 원료로서 작용할 수 있다. 리그노셀룰로오스 가수분해물은, 소정의 농도 이상에서 다수의 미생물 유기체에 독성이 되는 것으로 발견되는 소정의 화학물질, 예컨대 푸르푸랄(furfural)을 제거하기 위해 더 해독될 수 있다.
본 연구에 사용되는 세균 균주, 플라스미드, 및 프라이머는 표 3, 7, 9, 14 및 15에 나열했고, 이하 상세한 설명에 적절한 위치에 상세히 설명했다. 균주 구성 동안, 배양액은 2% (w/v) 글루코오스 또는 5% (w/v) 아라비노오스(arabinose)를 함유하는 루리아 브로스(Luria broth)(10 g l-1 Difco 트립톤(tryptone), 5 g l-1 Difco 효모 추출액(yeast extract) 및 5 g l-1 NaCl) 내에서 30, 37, 또는 39℃에서 호기적으로 배양했다. 항생제 내성을 인코딩하는 유전자, 플라스미드, 또는 외래 유전자(foreign gene)가 석시네이트 생성을 위해 성장되는 최종 균주 내에 존재하지 않는다. 그러나, 다른 균주의 구성의 초기 단계 동안, 각종 항생제 내성 마커(marker)가 사용되었다. 항생제, 예컨대 암피실린(ampicillin) (50 mg l-1), 카나마이신(kanamycin) (50 mg l-1), 또는 클로르암페니콜(chloramphenicol) (40 mg l-1)이 항생제 선택 프로세스에 필요한 만큼 첨가되었다.
발효
종균 배양(Seed culture) 및 발효는 글루코오스, 100 mM KHCO3 및 1 mM 베타인(betaine) HCl을 함유하는 NBS 또는 AM1 무기질염 배지 내에서 100rpm, 37℃에서 배양되었다. 일부 실험에 있어서, 옥수수 침지액(corn steep liquor)이 사용되었다. 이는 옥수수 웨트-밀링(wet-milling) 산업으로부터의 부산물이다. 효모 추출액 및 펩톤(peptone)과 비교하는 경우에, 이는 비타민 및 미량 원소의 저렴한 원료이다.
발효적 석시네이트 생성에 있어서, 균주는 달리 언급하지 않으면 10% (w/v) 글루코오스 및 100 mM 포타슘 비카보네이트(potassium bicarbonate)로 보충된 NBS 무기질염 배지(Causey et al., 2004) 내에서 37℃에서 항생제 없이 배양된다. 발효의 예비-접종원(Pre-inocula)은 새로운 군집을 250 ml 플라스크 (100 ml NBS 배지, 2% 글루코오스)에 옮김으로써 배양한다. 16시간 후(37℃, 120rpm), 이 배양액을 300 ml NBS 배지 (10% 글루코오스, 100 mM 포타슘 비카보네이트)를 함유하는 작은 발효 용기에서 희석하여, 0.033 g cell dry wt (CDW) l-1의 접종원을 제공했다.
성장 배지 내에서 유기산의 축적이 배지의 pH를 감소시키는 경향이 있기 때문에, 배양 배지에 필요한 만큼 적절한 중성화제를 첨가하는 것이 필요하다. 배양 용기의 pH는 pH 프로브(probe)를 사용하여 계속적으로 모니터링될 수 있고, 적당한 염기는 중성 근처의 pH로 성장 배지의 pH를 유지하기 위해 첨가될 수 있다. 미생물 배양액의 pH를 유지하기에 적합한 염기는, 이것에 한정되지 않지만, NaOH, KOH, NH4SO4, Na2CO3, NaHCO3, 및 NH4CO3을 들 수 있다. 이 목적에 적합한 염기는 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
소정의 실험에 있어서, 발효는 추가적인 CO2 (1.2 M 포타슘 히드록시드 중 2.4 M 포타슘 카보네이트)를 함유하는 염기를 첨가함으로써 pH 7.0으로 자동 유지된다. 이어서, pH는 3M K2CO3 및 6N KOH의 1:1 혼합물을 첨가함으로써 유지된다. 발효 용기는 시료 제거용 벤트(vent)로서 작용하는 16게이지 니들(needle)을 제외하고 밀봉된다. 혐기 생활(Anaerobiosis)은 CO2 분위기를 보증하기 위해 비카보네이트를 첨가하는 배양 동안 급속히 행해진다.
유전적 방법
염색체 제거, 통합, 및 항생제 저항성 유전자의 제거 방법은 이전에 설명되어 왔다(Datsenko and Wanner, 2000; Grabar et al., 2006; Posfai et al., 1997; Zhou et al., 2006).
본 발명에 사용되는 세균 균주의 구성에 있어서, 염색체 유전자는 이전에 설명된 바와 같이 외래 DNA의 부분을 이탈시키지 않고 균일하게 제거했다(Jantama et al., 2008a, 2008b; Zhang et al., 2007). 적색 재조합효소 기술(Gene Bridges GmbH, Dresden, Germany)은 염색체 통합을 가능하게 하는데 사용되었다. 구성 동안 사용되는 플라스미드 및 프라이머는 표 3, 7, 9, 14 및 15에 나열되었다. 균주 KJ012, KJ017, KJ032, KJ060, KJ070, KJ071, KJ072, KJ073, 및 SZ204의 구성에 사용되는 플라스미드 및 프라이머는 표 3에 요약했다. 센스 프라이머는 각각의 표적 유전자(볼드체 활자 형태)의 N-말단에 대응하는 시퀀스에 이어 FRT-kan -FRT 카셋에 대응하는 20 bp(밑줄침)를 함유한다. 안티-센스 프라이머는 각각의 표적 유전자(볼드체 활자 형태)의 C-말단에 대응하는 시퀀스에 이어 카셋에 대응하는 20 bp(밑줄침)를 함유한다. 증폭된 DNA 단편은 적색 재조합 효소(pKD46)가 잠복된 E. coli 균주로 전기 침공된다(electroporated). 얻어진 재조합체(recombinant)에 있어서, FRT-kan-FRT 카셋은 상동 재조합(homologous recombination)에 의해 표적 유전자의 제거된 영역을 대체한다. 저항성 유전자(resistance gene)(FRT- kan -FRT)를 FRT 부위를 함유하는 스카 영역(scar region)을 이탈하는, 플라스미드 pFT-A를 사용하여 FLP 재조합 효소를 갖는 염색체로부터 잘라냈다. 염색체 제거 및 통합은 항생제 마커의 시험, PCR 분석, 및 발효 프러덕트의 분석에 의해 입증된다. 일반화된 P1 파지 도입(phage transduction)(Miller, 1992)은 KJ032를 생성하기 위해 균주 SZ204에서 균주 KJ017로 DfocA - pflB ::FRT- kan -FRT 돌연변이를 이동시키는데 사용되었다.
adhE, ldhA, 및 focA-pflB 부위에서 FRT 마커의 제거
순차적인 유전자를 제거하고, adhE , ldhA and focA - pflB loci로부터 FRT 마커를 제거하는데 사용되는 방법은 이전에 설명되어 왔다(Datsenko and Wanner, 2000; Grabar et al., 2006; Jantama et al., 2008b; Zhang et al., 2007). 플라스미드 pLOI4151은 cat - sacB 카셋의 원료소서 사용되고, 적색 재조합 효소(pKD46)는 더블-크로스오버(double-crossover), 상동 재조합을 가능하게 하는데 사용되었다. 클로람페니콜 내성은 통합의 선택에 사용된다(Chloramphenicol resistance was used to select for integration). 슈크로오스로의 배양은 sacB.의 손실을 선택하는데 사용되었다(Growth with sucrose was used to select for loss of sacB). 이러한 접근법으로, 연속적인 제거는 모든 FRT 부위가 제거되는 KJ079의 유도체를 생성하기 위해 구성되었다. adhE , ldhA 및 focA - pflB loci로부터 FRT의 제거에 사용되는 프라이머 및 플라스미드는 표 3에 나타냈다.
DadhE 영역에서 FRT 부위를 제거하기 위해서, 하이브리드 프라이머(WMadhEA/C) for DadhE ::FRT 표적 영역은 DadhE ::FRT 부위의 5' 및 3' 영역에 상동의 약 50bp 및 pLOI4151로부터 cat - sacB 유전자에 대응하는 20bp를 함유하도록 고안된다. 이들 프라이머는 펨플레이트로서 pLOI4151를 사용하여 cat - sacB 카셋의 PCR 증폭에 사용되었다. 얻어진 PCR 프러덕트는 TG200을 생성하기 위해 클로람페니콜(chloramphenicol)에 대한 내성을 선택하는 상동 재조합, 더블-크로스오버(double-crossover)에 의해 cat - sacB 카셋을 갖는 DadhE 영역에서의 FRT 부위를 대체하는데 사용된다.
adhE 유전자 및 주변 시퀀스는 up/downadhE 프라이머를 사용하여 E. coli C로부터 증폭된다. ychE'adhE-ychG'(3.44 kb)를 함유하는 PCR 프러덕트는 pCR2.1-TOPO로 클로닝되고, pLOI4413를 얻었다. 프라이머의 제2 셋트(IO-adhEup/down)는 템플레이트(template)로서 pLOI4413와 adhE 시퀀스의 2.6 kb 내부 부분이 제거되는, 블런트-엔드 프러덕트(blunt-ended product)를 얻기 위한 Pfu 중합 효소를 갖는 인사이드-아웃 프러덕트(inside-out product)를 증폭하는데 사용되었다. 이러한 인사이드-아웃 PCR 프러덕트는 키나아제-처리되고, 셀프-라이게이션되어 pLOI4419를 얻는다. pLOI4419 (up/downadhE 프라이머)로부터 증폭된 PCR 프러덕트는 sacB의 손실에 대한 슈크로오스 선택으로, 다른 더블, 상동 재조합에 의해 바람직한 염색체 시퀀스(chromosomal sequence)를 갖는 TG200에서 cat - sacB 카셋을 대체하는데 사용되었다. 생성된 균주는 TG201 (DadhE 영역으로부터 제거된 FRT를 갖는 KJ079)로 지정되었다.
DldhA 및 D(focA - pflB) 영역에 FRT 부위는 adhE::FRT 부위를 제거하는데 사용되는 것과 동일한 방법으로 제거된다. DldhA 에 FRT 부위를 제거하는데 사용되는 추가적인 프라이머 세트(ldhAA/C and IO-ldhAup/down)는 대응하는 플라스미드(pLOI4430 및 pLOI4432)와 함께 표 7에 포함된다. 균주 TG202는 TG201 중 이 영역을 pLOI4151 (WMldhAA/C primers)로부터 PCR 프러덕트로 대체함으로써 생성된다. TG202 중 cat - sacB 카셋은 TG203을 생성하기 위해 sacB의 손실을 위한 슈크로오스 선택으로 pLOI4432 (ldhAA/C primers)로부터 PCR 프러덕트로 교체된다(The cat -sacB cassette in TG202 was replaced with the PCR product from pLOI4432 (ldhAA/C primers) with sucrose selection for loss of sacB to produce TG203).
D(focA - pflB) 중 FRT 부위를 제거하는데 사용되는 프라이머 세트(upfocA/MidpflA and IO-ycaOup/IO-midpflAdown) 및 대응하는 플라스미드(pLOI4415 and pLOI4421)는 표 7에 열거되었다. 균주 TG204는 TG203 중 이 영역을 pLOI4151 (WMpflBA/C primers)로부터 PCR 프러덕트로 대체함으로써 생성된다. TG204 중 cat - sacB 카셋은 KJ091을 생성하기 위한 sacB의 손실을 위한 슈크로오스 선택으로 pLOI4421 (upfocA /MidpflA 프라이머)로부터 PCR 프러덕트로 교체된다. KJ091는 FRT 부위 모두가 크로모좀(chromosome)의 DadhE, DldhA 및 DfocA - pflB 영역으로부터 제거되는, KJ073의 유도체이다.
ackA 영역 중 FRT의 제거 및 citF, sfcA, 및 pta - ackA 유전자 제거의 구성(Removal of FRT site in ackA region and construction of citF, sfcA, and pta-ackA gene deletions)
KJ073의 ackA 영역 중 FRT 부위를 제거하기 위해서, 바람직한 돌연변이의 플라스미드 함유 시퀀스는 이하와 같이 구성되었다. E . coli C 게놈 DNA는 ackA 유전자의 약 200bp 업스트림 및 다운스트림을 결합하는 JMackAF1/R1 프라이머를 갖는 ackA의 PCR 증폭용 템플레이트로서 사용되었다. 선형 프러덕트(linear product)는 pLOI4158를 생성하기 위해 pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 클로닝되었다. 플라스미드 pLOI4158은 ackA의 808-bp 내부 부분이 없는 블런트-엔드 프러덕트를 얻기 위해 JMackAup1/down1 프라이머 및 Pfu 중합 효소를 갖는 인사이드 아웃 PCR용 템플레이트로서 사용되었다. PacI-flanked cat-sacB 카셋 (pLOI4162로부터의 SmaI/SfoI 단편)은 pLOI4159를 생성하기 위해 블런트 PCR 프러덕트로 라이게이션되었다. 플라스미드 pLOI4159는 PCR 증폭(JMackAF1/R1 primers)용 템플레이트로서 작용한다. 이 PCR 프러덕트는 클로람페니콜 내성을 위한 선택으로, 더블-크로스오버 상동 재조합에 의한 KJ073의 ackA 영역을 대체하는데 사용되었다. 생성된 복제물은 KJ076으로 지정되었다.
또한, 플라스미드 pLOI4159는 cat - sacB 카셋을 제거하기 위해 PacI로 소화되고, 18-bp 번역적 정지 시퀀스를 유지하는, pLOI4160을 생성하기 위해 셀프-라이게이션되었다. 플라스미드 pLOI4160은 PCR 템플레이트(JMackAF1/R1 프라이머)로서 작용한다. 이 증폭 단편은 sacB의 손실을 위한 선택으로 더블-크로스오버 상동 재조합에 의해 KJ076 중 cat - sacB 카셋을 교체하는데 사용되었다(This amplified fragment was used to replace the cat - sacB cassette in KJ076 by double-crossover homologous recombination with selection for loss of sacB). 증가된 온도에서 배양에 의한 pKD46의 제거 후, 생성된 균주는 KJ079로 지정되었다. 이 균주에 있어서, 제거된 영역은 18-bp 번역적 정지 시퀀스에 의해 교체되었다.
ackA 영역으로부터 FRT 부위를 제거하기 위해 상기에 사용되는 방법은, citF, sfcA 및 pta - ackA를 순차적 제거하고, 제거된 영역을 18-bp 번역적 정지 시퀀스로 대체하기 위해 채용되었다. citF 제거를 구성하는데 사용되는 추가적인 프라이머 세트(itFup/down and citF2/3)는 대응하는 플라스미드(pLOI4629, pLOI4630, 및 pLOI4631)와 함께 표 7에 포함되었다. 생성된 균주는 KJ104로 지정되었다.
sfcA 유전자는 균주 KJ104 및 KJ110으로부터 제거되어, 각각 KJ119 및 KJ122로 지정된 균주를 얻는다. sfcA 제거를 구성하는데 사용되는 추가적인 프라이머 세트(sfcAup/down and sfcA1/2)는 대응하는 플라스미드(pLOI4283, pLOI4284, and pLOI4285)와 함께 표 7에 포함되었다.
ackA - pta 오페론(합성 번역의 정지 시퀀스(synthetic translational stop sequence)를 포함함)은 균주 KJ134를 생성하기 위해 KJ122로부터 제거되었다. 이 제거(deletion)를 구성하기 위해 사용되는 추가적인 프라이머 세트(ackAup/ptadown 및 ackA2/pta2)는 대응하는 플라스미드(pLOI4710, pLOI4711, 및 pLOI4712)와 함께 표 7에 포함되었다. 균주 KJ134는 FRT 부위 또는 외래 유전자를 포함하지 않는다.
마커가 없는 유전자 제거용 cat-sacB 카셋을 함유하는 pLOI4162의 구성
염색체 DNA의 순차적 제거를 가능하게 하기 위해서, 플라스미드 pLOI4162 (도 8)는 모든 리딩 프레임 내에 정지 코돈을 갖는 합성 DNA의 18-bp를 포함하기 위한 옵션 및 제거 가능한 cat - sacB 카셋으로 구성된다(plasmid pLOI4162 (Fig. 8) was constructed with a removable cat - sacB cassette and the option to include an 18-bp segment of synthetic DNA with stop codons in all reading frames). 이 플라스미드는 합성 시퀀스 및 플라스미드 pLOI2228 (Martinez-Morales et al., 1999), pLOI2511 (Underwood et al., 2002), 및 pEL04 (Lee et al., 2001; Thomason et al, 2005)의 부분으로 이루어진다. 템플레이트로서 pEL04를 사용하여, 인사이드-아웃 PCR은 cat와 sacB 유전자 사이에 원하지 않는 SmaI 및 BamHI 부위를 제거하기 위해 JMpEL04F1/R1 프라이머로 행해진다. 증폭 프러덕트는 pLOI4152를 생성하기 위해 BglII (프라이머들 내에)로 소화되고, 셀프-라이게이션된다. 플라스미드 pLOI4131은 pLOI2511 (Klenow-treated NheI, ClaI)의 양립될 수 있는 부위에 pLOI2228로부터 FRT-cat-FRT 단편(Klenow-treated BanI, ClaI)의 라이게이션에 의해 구성된다. 플라스미드 pLOI4131은 EcoRI로 소화되고, 단일 KasI 및 XmaI 부위를 보유하는 pLOI4145를 생성하기 위해 FRT-cat-FRT 단편을 제거하기 위해 셀프-라이게이션되었다. 다중 연결자 부분(SfPBXPS)은 상보적 올리고뉴클레오티드(SfPBXPSsense 및 SfPBXPScomp)를 어닐링함으로써 제조되었다. KasI 및 XmaI로 소화된 후, 이 부분은 pLOI4153을 생성하기 위해 pLOI4145의 대응 부위로 라이게이션했다. pLOI4152 중 변형된 cat-sacB 카셋은 JMcatsacBup3/down3 프라이머 세트를 사용하여 PCR함으로써 증폭된다. BamHI 및 XhoI로 소화된 후, 이 카셋은 pLOI4146를 생성하기 위해 pLOI4153의 대응 부위에 라이게이션되었다. 6개의 리딩 프레임 모두에서 정지 코돈을 갖는 18-bp 영역(5'GCCTAATTAATTAATCCC3') (SEQ ID NO: 1)을 생성하기 위해서, pLOI4146은 PacI로 소화되고, cat - sacB 카셋을 제거하는 pLOI4154 (도시하지 않음)를 생성하기 위해 셀프-라이게이션되었다. 2개의 추가적인 염기(T 및 A)는 pLOI4161를 생성하기 위해 돌연변이 프라이머(JM4161sense/comp)와 선형 플라스미드 증폭을 사용하여 pLOI4154의 SfoI와 PacI 부위 사이에 삽입된다. 마지막으로, cat - sacB 카셋을 함유하는 pLOI4146으로부터 PacI 소화된 단편은 pLOI4162 (GenBank accession EU531506)를 생성하기 위해 pLOI4161의 PacI-소화된 부위로 라이게이션(ligated)되었다.
mgsA 및 poxB 유전자의 제거(Deletion of mgsA and poxB genes)
변형 방법은 2단계 상동 재조합 프로세스(Thomason et al., 2005)를 사용하여 E. coli 염색체 유전자를 제거하는 것으로 발전되었다. 이러한 방법으로 사용하여, 유전자 제거 후 염색체 상에 존재하는 항생제 유전자 또는 스카 시퀀스(scar sequences)가 남아 있지 않다. 제1 재조합에 있어서, 표적 유전자의 부분은 클로람페니콜 내성 유전자(chloramphenicol resistance gene) (cat) 및 레반슈크라제 유전자(levansucrase gene) (sacB)를 함유하는 DNA 카셋에 의해 대체된다. 제2 재조합에 있어서, cat - sacB 카셋은 제거 영역을 생략하는 본래의 시퀀스로 대체된다. sacB 유전자를 함유하는 세포는 슈크로오스로 배양되는 동안 레반(levan)을 축적하고, 희생된다. 살아남은 재조합체는 cat-sacB 카셋의 손실을 위해 고농축된다.
카셋은 유전자 제거를 가능하도록 구성된다. cat - sacB 영역은 NheI로 소화되고, pLOI4151을 생성하기 위해 pLOI3421의 대응 부위를 라이게이션하는, JMcatsacB 프라이머 세트(표 3)를 사용하여 PCR에 의해 pEL04 (Lee et al., 2001; Thomason et al., 2005)로부터 증폭된다. cat - sacB 카셋은 EcoRV로 소화되고, 이어지는 라이게이션에 사용되는, cat-up2/sacB-down2 프라이머 세트(각 프라이머에 포함되는 EcoRV 부위) 및 pLOI4151(템플레이트)를 사용하여 PCR에 의해 증폭된다.
mgsA 유전자 및 근처의 500 bp 영역(yccT'mgsA - helD ', 1435 bp)은 프라이머 세트 mgsA-up/down을 사용하여 증폭되고, 플라스미드 pLOI4228를 생성하기 위해 pCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen)로 클로닝되었다. 플라스미드 DNA의 1000배 희석 제조는 mgsA-1/2 프라이머 세트(mgsA 유전자 내의 프라이머와 바깥쪽을 향하는 프라이머)를 사용하여 인사이드-아웃 증폭을 위한 템플레이트(template)로서 작용한다. 리플리콘을 함유하는 생성된 4958 bp 단편은 pLOI4229를 생성하기 위해 pLOI4151로부터 증폭된 EcoRV-digested cat - sacB 카셋으로 라이게이션된다. 또한, 4958 bp 단편은 제2 플라스미드, pLOI4230 (phosphorylation and self-ligation)를 구성하는데 사용되었다. pLOI4230에 있어서, mgsA의 중앙 영역은 없다(yccT '- mgsA '-mgsA"-hel).
XmnI (벡터 내에)를 갖는 pLOI4229 및 pLOI4230의 소화(digestion) 후, 각각은 단계 I(yccT '- mgsA '- cat - sacB - mgsA "- helD ') 및 단계 II (yccT '- mgsA '- mgsA "- helD')의 통합을 위해 선형 DNA 단편을 생성하기 위해 mgsA-up/down 프라이머 세트를 사용하여 증폭용 템플레이트로서 작용한다. pKD46 (Red recombinase)를 함유하는 KJ060로 단계 I 단편의 전기 천공하고, 30℃에서 2시간 배양하여 발현 및 분리한 후, 재조합체는 플레이트(30℃, 18시간) 상에서 클로람페니콜(40 mg l-1) 및 암피실린(20 mg l-1)로 선택된다. 암피실린 및 5% w/v 아라비노오스를 함유하는 루리아 브로스에서 배양되고, 전기 천공으로 제조되는 3개의 복제물이 선택되었다. 단계 II 단편으로 전기 천공 후, 세포는 4시간 동안 37℃에서 배양되고, 10% 슈크로오스를 함유하는 변형된 LB(100 mM MOPS buffer added and NaCl omitted) 100ml를 함유하는 250-ml 플라스크에 옮겨졌다. 밤새 배양한 후(37℃), 복제물을 6% 슈크로오스(39℃, 16시간)를 함유하는 변형된 LB 플레이트(NaCl 없음; 100 mM MOPS 첨가됨) 상에 선택되었다. 생성된 복제물은 암피실린 및 클로람페니콜 내성의 손실을 테스트했다. PCR 분석에 의해 구성을 더 확인했다. mgsA 유전자가 부족한 복제물이 선택되고 KJ070로 지정되었다.
poxB 유전자는 mgsA 유전자를 제거하는데 사용되는 것과 동일한 방법으로 KJ071로부터 제거했다. poxB 제거를 구성하는데 사용되는 추가적인 프라이머 세트(poxB-up/down and poxB-1/2)는 대응하는 플라스미드(pLOI4274, pLOI4275, 및 pLOI4276)과 함께 표 3에 열거되었다. 생성된 균주는 KJ072로 지정되었다.
tdcDE, 및 aspC 중 유전자 제거의 구성(Construction of gene deletions in tdcDE, and aspC)
tdcDE 유전자 및 주변의 1000 bp 영역 (tdcG '- tdcFED - tdcC ', 5325 bp)은 tdcDEup/down 프라이머를 사용하여 증폭되고, 플라스미드 pLOI4515를 생성하기 위해 pCR2.1-TOPO 벡터로 클로닝했다. 이 플라스미드 DNA의 1000배 희석 제조는 tdcDEF7/R7 프라이머 (tdcDE 유전자 내의 프라이머와 바깥쪽을 향하는 프라이머)를 사용하여 인사이드-아웃 증폭을 위한 템플레이트(template)로서 작용한다. 리플리콘을 함유하는 생성된 6861 bp 단편은 pLOI4516을 생성하기 위해 pLOI4162 (JMcatsacBup3/down3 프라이머)로부터, 증폭된 SmaI/ SfoI-digested cat - sacB 카셋으로 라이게이션된다. 또한, 6861 bp 단편은 tcdD 및 tdcE의 제거를 함유하는, 제2 플라스미드, pLOI4517 (키나아제 처리됨, 셀프-라이게이션)를 구성하는데 사용되었다. pLOI4516 및 pLOI4517 (tdcDEup/down 프라이머)로부터 증폭된 PCR 단편은 KJ091 중 tdcDE 영역을 대체하는데 사용되었다. 생성된 복제물은 암피실린 및 클로람페니콜 내성의 손실을 테스트했다.
aspC 유전자는 tdcDE 유전자를 제거하는데 사용되는 것과 동일한 방법으로 KJ104로부터 제거되었다. aspC 제거를 구성하는데 사용되는 추가적인 프라이머 세트(aspCup/down 및 aspC1/2))는 대응하는 플라스미드(pLOI4280, pLOI4281, 및 pLOI4282)와 함께 표 7에 열거했다. 생성된 균주는 KJ110로 지정되었다. KJ098과 KJ110 모두 상대적으로 제거된 영역 내에(tdcDE 및 aspC) 임의의 껴있는 시퀀스를 포함하지 않는다.
gldA 및 dhaKLM 에서 유전자 제거의 구성(Construction of gene deletions in gldA and dhaKLM)
E. coli 균주 XZ464, XZ465, 및 XZ466은 상기 기재된 유전적 방법을 사용하여 E. coli 균주 XZ632 로부터 유래되었다. E . coli 균주 XZ464, XZ465, 및 XZ466의 적합한 특성은 표 15에 제공되었다.
실시간 RT-PCR 분석
실시간 RT-PCR은 이전에 기재된 바와 같이 메시지 RNA 레벨을 측정하는데 사용되었다(Jarboe et al., 2008). 세포는 5% 또는 10% 글루코오스를 함유하는 NBS 배지에서 배양되었고, 드라이 아이스/에탄올 베스 내에서 교반에 의한 미드-로그 성장(mid-log growth) 동안 수확한(harvested) 후 정제될 때까지 원심분리 및 RNALater (Qiagen, Valencia CA)에서 -80℃에서 저장했다. RNA 정제는 RNeasy Mini column(Qiagen)으로 행해진 후 DNaseI (Invitrogen)로 소화되었다. 상첨자 II가 붙은 역전사(Invitrogen, Carlsbad CA)는 템플레이트로서 총 RNA 50 ng이 사용되었다. 실시간 PCR은 SYBR Green RT-PCR mix를 구비한 Bio-Rad iCycler(Bio-Rad, Hercules CA)에서 행해졌다. RNA는 역전사의 부재시 RT-PCR을 작동시킴으로써 유전적 DNA 오염을 체크했다. 전사물 풍도(Transcript abundance)는 표준으로서 유전적 DNA를 사용하여 측정하고, 발효 레벨은 birA 유전자, 전사 리프레서에 의해 노르말화되었다(Jarboe et al., 2008). pck 및 birA로 사용되는 RT-PCR 프라이머는 표 3에 나타냈다.
pck 영역의 시퀀싱
KJ073의 pck 유전자 내에서 임의의 돌연변이가 있는지를 알기 위해서, KJ012 및 KJ073 내에 pck 유전자의 코딩 영역 및 프로모터 영역(코딩 영역 앞에 약 800 bp)은 PfuUltra High Fidelity DNA 중합 효소(Stratagene; Wilmington, DE)에 의해 증폭되었다. 프라이머 세트 pck-F/R은 프로모터 영역을 증폭시키기 위해 사용되었다. DNA 시퀀싱은 플로리다 대학 바이오테크놀러지 연구 학제 센터(바이오세스템 오토시퀀서를 구비함)에 의해 제공되었다.
*대사 진화
pH 제어된 발효로부터 세포는 성장 기반 선택을 통해 대사 진화를 조장하기 위해 24시간 연속적으로 전이된다. 접종원, 약 1/100 체적의 새로운 배지는, 개시 OD550 0.05로 미리 데워진, 프레시한 배지에 직접적으로 첨가했다. 개선된 발효 특성을 갖는 복제물이 분리되었다. 대사 진화 방법은 석시네이트 생성의 수율을 증가시키기 위해 채용되었다.
분석
세포 성장: 세포량은 Bausch & Lomb Spectronic 70 분광 광도계를 사용하여 550 nm (OD 1.0 = 333 mg of cell dry weight l- 1)에서 광학 밀도로부터 측정되었다.
유전적으로 엔지니어링된 미생물에 의한 유기산의 생성은 적당한 공지 기술을 사용함으로써 확인되고 정량화될 수 있다. 예컨대, HPLC 기술은 선택된 복제물에 의해 생성된 유기산의 양을 측정함으로써 사용될 수 있다. 또한, HPLC 기술은 선택된 복제물에 의해 생성된 유기산의 순도를 측정하는데 유용하다. 유기산 및 당은 고성능 액체 크로마토그래피를 사용함으로써 측정되었다(Grabar et al., 2006; Zhang et al., 2007).
발효 브로스에 존재하는 석신산 및 다른 유기산은 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼을 구비하는 Agilent 1200 HPLC 기기에서 분석되었다. BioRad Microguard Cation H+ 는 가드 컬럼(guard column)으로서 사용되었다. HPLC 분석용 표준은 0.008N 황산으로 제조되었다. HPLC 컬럼 온도는 50℃로 유지되었다. 0.008N 농도에서 황산은 0.6 ml/min의 유량에서 이동상으로서 사용되었다. 각종 성분의 정량화는 210 nm에서 흡광도를 측정함으로써 행해졌다.
*효소 분석
세포는 미드-로그 성장 동안 원심분리(4℃에 5분 동안 8,000 x g)에 의해 수확하고, 냉장한 100 mM Tris-HCl (pH 7.0) 완충액으로 세정하고, 동일한 완충액(1 ml)으로 재현탁했다. Fast Prep-24 (MP Biomedicals, Solon, OH)를 사용하여 세포의 붕괴(cellular disruption) 후, 조제물을 원심분리(13,000 x g for 15 min)에 의해 정화했다. 표준으로서 소 혈청 알부민을 사용하여 BCA 방법(Pierce, Rockford, IL)에 의해 프로테인을 측정했다.
PEP 카르복실라아제 활성은 Canovas 및 Kornberg (1969)에 의해 설명된 바와 같이 측정되었다. 반응 혼합물은 100 mM Tris-HCl buffer (pH8.0), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25 mM NaHCO3, 0.2 mM NADH, 20 U 말레이트 탈수소효소, 및 조 추출액(crude extract)을 함유한다. 반응을 10 mM PEP의 첨가에 의해 개시한 후, 분석 혼합물을 37℃에서 15분 동안 배양하여 효소를 활성화시켰다.
PEP 카르복시키나아제 활성은 Van der Werf et al, (1997)에 의해 설명되었다. 반응 혼합물은 100 mM MES 완충액 (pH6.6), 10 mM MgCl2, 75 mM NaHCO3, 5 mM MnCl2, 50 mM ADP, 1 mM DTT, 0.2 mM NADH, 20 U 말레이트 탈수소효소, 및 조추출액을 함유한다. 반응을 10 mM PEP의 첨가에 의해 개시했다.
말산 효소 활성(카르복실화 방향)은 Stols 및 Donnelly (1997)에 의해 설명된 바와 같이 측정되었다. 반응 혼합물은 100 mM Tris-HCl 완충액 (pH7.5), 25 mM NaHCO3, 1 mM MnCl2, 1 mM DTT, 0.2 mM NADH, 및 조추출액을 함유한다. 반응은 25 mM 피루베이트의 첨가에 의해 개시되었다. 이 분석 방법은 락테이트 탈수소화효소의 존재에 기인하여 야생형 E. coli 에서 SfcA 활성의 측정에 적합하지 않다.
β-갈락토시다아제의 활성은 Miller (1992)에 의해 설명된 바와 같이 측정되었다. 모든 분석에 있어서, 활성의 1 단위는 분당 기판 1 nmol을 산화 또는 환원하는데 필요한 효소의 양을 나타낸다.
실시예 1
석시네이트 생성을 위한 KJ073 균주의 구성
5% 글루코오스를 함유하는 최소의 배지내에 석신산 생성에 적합한 균주의 구성에 있어서, 합리적 고안 접근 및 대사 진화를 이후에 설명한다. E . coli의 일반적으로 허용되는 표준 발효 경로를 설명하는 도 1의 검토에 의해, 석시네이트를 생성하는 균주의 대사 엔지니어링을 위한 합리적 고안(rational design)은 창안되었고, 삽입 불활성화(insertional inactivation)는 모든 다른 프러덕트: 락테이트(lactate) (ldhA), 에탄올(ethanol) (adhE) 및 아세테이트(acetate) (ackA)에 대한 마지막 단계를 인코딩하는 유전자에서 만들어진다. 합리적 고안에 의한 이러한 대사 엔지니어링의 결과는 완전히 예측되지 않았다. ldhA, adhE and ack 유전자의 삽입 불활성화로 생성된 KJ012 (DldhA ::FRT DadhE ::FRT DackA ::FRT) 균주는 5% 글루코오스 (278 mM)를 함유하는 무기질염 배지에서 혐기성 조건하에서 잘 성장하지 못하고, 주요 발효 프러덕트로서 석시네이트 대신에 아세테이트가 생성된다. 합리적 고안으로부터의 예상과는 반대로, 석시네이트는 주요 프러덕트로서 남아있다. 대사 글루코오스에 기초한 석시네이트의 몰 수율은 이러한 돌연변이의 결과로 변화되지 않는다. 석시네이트 수율은 5% 글루코오스를 함유하는 NBS 무기질 염 배지에서 발효 동안 친주 및 KJ012 균주에 대한 글루코오스 몰당 0.2몰 석시네이트로 확인되었다. NBS 무기질 염은 호기성 조건(호기성 교반 플라스크; 5% 글루코오스) 하에서 배양됨으로써 KJ012의 성장에 필요한 모든 무기질 영양 성분을 함유한다는 것을 확인했다. 호기성 교반 플라스크에 있어서, KJ012의 세포 수율은 혐기성 성장 동안보다 5배 높아졌고, 혐기성 성장 동안 E. coli C (친주)의 75%이다. 또한, 이러한 결과는 모든 중앙의 생합성 경로가 KJ012에서 기능으로 남아있다는 것이 확인되었다.
복합 영양 성분이 존재하는 경우에(루리아 브로스), KJ012에 의한 발효적 석시네이트 생성은 무기질 염에서 KJ012와 비교하여 20배 증가되었고, 석시네이트의 몰 수율은 3.5배 증가되었다. 명백히, 주요 경로에 기초한 합리적 고안은 학술적 증명에 더욱 적합하고, 복합 영양 성분을 사용하기 위해 의도된 프로세스를 고안하기에 적합하다.
우수하지 못한 성장, 우수하지 못한 석시네이트 생성, 및 무기질 염 배지 내에 혐기성 대사 동안 KJ012에 의한 아세테이트 성장의 증가는 알려지지 않았다. 이들은 표준 경로 차트에 기초한 합리적 고안을 사용하여 대사 엔지니어링으로부터 얻어진 예측되지 않은 결과이다. 무기질 배지에 있어서, 대사 엔지니어링에 대한 합리적 고안은 명백히 예측 불가능하다. 생성된 균주, KJ012는 성장에서 친주보다 열등하고, 석시네이트 생성을 위한 친주(parent)보다 우수하지 않다. 친주 E. coli C와 비교하여 성장이 우수하지 못한 KJ012(DldhA ::FRT DadhE ::FRT DackA::FRT)는 석시네이트 생성의 낮은 비율을 보여주고, 우수하지 못한 몰 수율을 제공한다(표 4).
이러한 결과에도 불구하고, 이 균주의 연속적 전이는 개선된 성장 및 이하 이유에 기초한 석시네이트 성장을 공동-선택(co-select)하는 방법으로서 시도되었다. 석시네이트로의 글루코오스 발효의 주요 경로(도 1a 및 도 2a)는 카르복실화 단계에 있어서 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제(ppc)의 사용이 일반적으로 고려되었다(Unden and Kleefeld, 2004; Fraenkel 1996; Keseler et al., 2005; Millard et al., 1996; Gottschalk, 1985; Karp et al., 2007). 카르복실화 효소는 포스포에놀피루베이트 중 고에너지의 포스페이트를 보존하지 못하고, 성장에 이용가능한 전체 ATP를 감소시킨다. 석시네이트 생성을 위한 다른 경로는 ATP 수율을 증가시킬 수 있고, 성장을 증가시킬 수 있는 공지의 E. coli 유전자의 레퍼토리를 사용하여 예상될 수 있다(도 1A; 도 2B, 2C 및 2D). 그러나, 어떠한 다른 경로도 E. coli의 본래 균주로 발효하는 동안 석시네이트 생성에 대한 기능을 보여주지 못한다. 이들 다른 경로에서의 주요 효소는 글루코오스에 의해 억제되고, 글루코오스 신생합성(gluconeogenesis) 동안 보통의 활성이다. 일반적으로, 이들 글루코오스 신생합성 효소(gluconeogenic enzyme)의 레벨은 글루코오스 및 다른 대사물질의 이용가능성(Goldie and Sanwal, 1980a; Wright and Sanwal, 1969; Sanwal and Smando, 1969a) 및 역방향에서의 기능, 탈카르복실화 반응(Keseler et al., 2005; Oh et al., 2002; Kao et al., 2005; Stols and Donnelly, 1997; Samuelov et al., 1991; Sanwal, 1970a; Delbaere et al., 2004; Goldie and Sanwal, 1980b; Sanwal and Smando, 1969b; Sanwal 1970b)에 따라 반대로 달라진다.
이들 중 하나에 대한 주요 효소, NADH-결합된 말산 효소(sfcA) (도 2B)는 E. coli 의 석시네이트 생성을 증가시킬 수 있다고 설명되지만, 그렇게 하는데 플라스미드로부터 오버 발현(overexpression)되는 것이 요구된다(Stols and Donnelly, 1997). 그러나, 어떠한 다른 경로도 고 레벨의 글루코오스를 사용하여 혐기성 성장 동안 E. coli 또는 KJ012의 본래의 균주의 기능이 예상되지 않는다. 개선된 성장을 위한 선택으로 KJ012의 일련의 전이는 산화 환원반응의 균형을 유지하고, ATP 수율을 증가시키는 석시네이트 생성(도 1b)에 대한 다른 경로의 돌연변이 활성을 선택하기 위한 기회를 제공한다.
KJ012의 대사 진화(Metabolic evolution)는 성장을 개선하기 위한 작은 pH-조절 발효기(pH-controlled fermentor)를 사용하여 각종 요법하에서 순차적으로 계대배양(subculturing)함으로써 행해졌다. KJ012는 가능한 성장만큼 빠르게 발효 조건 하에서 NBS 글루코오스 배지 내에서 순차 전이되었다(도 3A; 도 4A; 도 5). 성장은 처음 9 전이들 사이에 요구되는 배양의 4-5일로 천천히 유지된 후, 전이가 24시간 인터벌이 되도록 급격히 증가되었다. 이러한 일은 석시네이트 생성을 거의 개선하지 않고 아세테이트를 증가시킴으로써 행해진다(도 4). 27 전이 후(60일), KOH를 3M K2CO3 및 6N KOH의 1:1 혼합물로 대체하여 추가적인 이산화탄소를 제공하였다(NBS 무기질 염 배지 모두에 최초로 100 mM 첨가되었음). 계속적인 전이는 석시네이트 생성을 개선시킨다. 총 40 전이는 5% 글루코오스(227 mM)에서 행해진 후, 다른 40 전이는 10% 글루코오스(555 mM)에서 행해진다. 10% 글루코오스에서 전이 동안, 석시네이트 수율은 공동-프러덕트로서 락테이트, 아세테이트, 및 포르메이트로 대사되는 글루코오스의 몰당 약 0.7몰로 유지되었다(표 4). 이 수율은 E. coli C 및 KJ012 균주보다 3배 높다. 복제물은 분리되고 KJ017로 지정되었다. KJ017을 생성하기 위해 KJ012의 성장의 개선을 위한 선택은 석시네이트 생성의 향상을 위한 공동-선택되었다(속도, 역가, 및 몰 수율).
포스포에놀피루베이트 카르복실라아제(ppc)에 기초한 본래의 발효 경로로 일반적으로 간주되는 경로를 사용하여 E . coli udp 의해 생성되는 석시네이트는 무기 포스페이트를 생성함으로써 포스포에놀피루베이트의 에너지를 낭비한다. 이 경로에 의해 생성된 석시네이트 당 1ATP가 소실된다(도 1; 도 6). 다른 효소 시스템을 사용함으로써 ATP로서 이러한 에너지의 보존은 세포 성장을 증가시키고, 석시네이트 생성을 증가시키기 위한 공동-선택할 기회를 나타낸다. E . coli,의 공지의 유전자에 기초하여, 석시네이트 생성을 위한 3개의 다른 효소 경로는 ATP를 보존하고, 성장을 증가시킬 수 있는 것이 예상된다(도 1; 도 6). 그러나, 이러한 다른 경로에서 모든 카르복실화 단계는 기질, 예컨대 유기산에서의 성장 동안 주로 글루코오스신생합성에 대한 역방향(탈카르복실화 반응)으로 기능하는 것으로 생각된다(Keseler et al., 2005; Oh et al., 2002; Kao et al., 2005; Stols and Donnelly, 1997; Samuelov et al., 1991; Sanwal, 1970a; Delbaere et al., 2004; Goldie and Sanwal, 1980b; Sanwal and Smando, 1969b; Sanwal, 1970b). KJ017을 개선하기 위한 성장-기반 선택이 하나 이상의 이들 다른 경로를 활성화시킨다는 가설을 시험하기 위해서, 4개의 카르복실화 효소의 활성을 야생형 균주 ATCC 8739, KJ012 (주요 발효 경로에서 제거됨), 및 대사적으로 진화된 균주 KJ017로 비교했다(표 5). PEP 카르복실라아제 활성은 모두 20 내지 30 U (mg protein)-1로 유사하게 낮았다. 또한, NADH-결합 말산 효소 활성(SfcA; carboxylation direction)은 낮고, NADPH-결합 말산 효소 활성(MaeB; carboxylation direction)은 검출 불가능했다. 반대로, PEP 카르복시키나아제 활성은 KJ012와 비교하여 KJ017에서 4배 증가되었고, 개선된 성장을 위한 선택은 ATP 수율을 증가시키고, 석시네이트 생성을 위한 에너지-보존 경로의 발현을 증가시킴으로써 석시네이트의 증가된 생성을 위해 공동-선택된다는 가설과 일치한다.
또한, 성장-기반 선택(growth-based selection) 및 추가적인 유전자 제거(additional gene deletion)는 성장 및 석시네이트 생성의 더 나은 개선으로 추가적인 많은 균주를 구성하는데 사용되었다(도 3 및 도 4).
10% (w/v) 글루코오스로의 성장 동안, 불필요한 부산물(아세테이트, 포르메이트, 및 아세테이트)은 주요 락테이트 탈수소효소(ldhA) 및 아세테이트 키나아제(ackA) 활성을 인코딩하는 유전자의 제거에도 불구하고 KJ017 (DldhA ::FRT DadhE::FRT DackA ::FRT)를 갖는 발효에서 풍부했다(표 4). 또한, 락테이트 및 아세테이트의 생성은 높은 ATP 수율, 성장 기반 선택에 대한 기반을 형성할 수 있다(도 1A).
피루베이트 포르메이트 리아제(pflB)를 인코딩하는 유전자는 KJ017로부터 제거되어 포르메이트 및 아세테이트의 잠재적인 원료인 과잉의 아세틸~CoA로서 환원제의 손실을 제거하였다. 오페론에서 업스트림 포르메이트 수송자 또한 제거되었다. 예상한 바와 같이, 이 제거된 균주(KJ032)는, 이것이 KJ017의 아세틸~CoA 생성을 위한 주요 경로라는 것을 확인시켜 주는 아세테이트 없이 성장할 수 없다(도 3C). pflB의 제거는 혐기 조건하에서 아세테이트 영양요구성(auxotrophy)을 야기하는 것으로 잘 알려져 있다(Sawers and Bock, 1988). KJ032에 의한 성장 및 석시네이트 생성은 20 mM 아세테이트의 첨가에 의해 복구되었다(도 3c, 도 4c, 및 도 5). 포르메이트 및 아세테이트의 생성은 pflB (및 focA) 제거의 결과로서 순차적으로 제거되었다. 이 균주는 성장에 아세테이트가 필요함에도 불구하고, 추가적인 아세테이트 또한 발효 동안 생성되었다. 동일한 현상은 피루베이트 생성에 대한 E. coli K-12 생체 촉매의 구성 동안 pflB-제거된 균주에 대해 이전에 보고되었다(Causey et al., 2004). 또한, 락테이트 레벨은 KJ032을 감소시킨다(표 4; 도 3c). 이후 전이는 성장 및 석시네이트 생성의 개선에 의해 동반된다. 첨가된 아세테이트는 감소되고, 접종원 크기는 감소되고, 글루코오스 농도는 이후 전이 동안 2배(10% w/v)가 되었다(도 3d 및 4d). 전이 후, 아세테이트는 소멸되고, 균주는 짐작컨대 다른 유전자의 증가된 발현에 기인하여 아세테이트에 대해 더 이상 영양요구성이 아니도록 발달되었다. 그러나, 말레이트 및 아세테이트의 레벨이 증가한 반면에, 첨가된 아세테이트의 제거시, 석시네이트의 수율은 감소된다. 복제물은 마지막 전이로부터 분리되고, KJ060 (DldhA ::FRT DadhE ::FRT DackA ::FRT DfocA -pflB::FRT)로 지정되었다. 이 균주는 10% 글루코오스를 함유하는 NBS 무기질 염 배지에서 대사되는 글루코오스의 몰당 석시네이트 1몰이 생성된다.
각종 균주의 발효 브로스에 존재하는 락테이트의 소량은 메틸글리옥살 합성 경로로부터 기원하는 것으로 추측된다(도 6; Grabar et al., 2006). 이는 수율의 소량의 손실을 나타내지만, 이 경로에 의한 락테이트 생성은 메틸글리옥살 축적(accumulation), 성장 및 해당 과정(glycolysis)의 억제를 나타낸다(Egyud and Szent-Gyorgyi, 1966; Grabar et al., 2006; Hopper and Cooper, 1971). 메틸글리옥살 및 락테이트의 생성은 KJ060 중 mgsA 유전자를 제거함으로써(메틸글리옥살 합성) 제거되어 KJ070를 생성한다(DldhA::FRT DadhE::FRT DackA::FRT DfocA-pflB::FRT DmgsA). 균주 KJ070은 5% (w/v) 글루코오스 내에 초기 계대배양(subcultured)되었다(도 3e, 도 4e 및 도 5). mgsA의 제거는 배지 내에 피루베이트의 축적에 의해 반증되는 바와 같이 해당 과정의 흐름(glycolytic flux)을 증가시키는 것으로 추측된다(표 4). 또한, 해당 과정의 흐름의 이러한 증가는, 옥살로아세테이트의 증가된 생성, 푸마레이트 환원효소의 입체성 다른 자리(allosteric) 억제에 기인하여 석시네이트/말레이트 비율을 더 감소시킬 수 있다(Iverson et al., 2002; Sanwal, 1970c).
전이 21에서, 글루코오스는 10% (w/v)로 두배가 되고, 전이는 계속된다. 글루코오스의 이러한 높은 레벨 및 이후 전이는 마지막 계대배양으로부터 분리되고, KJ071 (DldhA ::FRT DadhE ::FRT DackA ::FRT DfocA - pflB ::FRT DmgsA)로 지정된 새로운 균주를 야기한다. 이러한 균주는 말레이트 생성에 유용할 수 있다.
아세테이트로의 글루코오스의 전환이 산화 환원 반응 중립(redox neutral)이지만, 아세테이트로의 탄소의 분회는 석시네이트 및 말레이트의 수율을 감소시킨다. 피루베이트 산화효소(poxB)는 미세 호기성 조건하에서 배양동안 아세테이트 및 CO2 의 잠재적인 원료를 나타낸다(Causey et al., 2004). 혐기성 조건하에서 피루베이트를 산화시키는 것으로 기능하지 않지만, poxB는 유전자 제거를 표적으로 한다(도 6). 예상되는 바와 같이, KJ072 (DldhA ::FRT DadhE ::FRT DackA ::FRT DfocA-pflB::FRT DmgsA DpoxB)를 생성하기 위한 poxB의 제거는, 다른 경로가 아세테이트 생성과 관련된다는 것을 나타내는 아세테이트 생성을 감소시키지 않는다. 그러나, poxB의 제거는 석시네이트의 증가를 포함하는, 발효 프러덕트의 예상하지 않은 변화를 야기한다(표 4, 도 4f). 석시네이트 생성의 이러한 개선에 대한 메카니즘은 알려져 있지 않지만, 아세토인(acetoin) 생성, 탈카르복실화 반응 및 카르보라이게이션(carboligation)과 같은 피루베이트 산화효소의 다른 활성(activities)과 관련될 것이다(Ajl and Werkman, 1948; Chang and Cronan, 2000).
균주 KJ072는 10% (w/v) 글루코오스를 함유하는 저염 배지, AM1 배지 내에 대사 진화의 40 라운드를 더 행했다(표 4, 도 3f, 도 4f, 및 도 5). 성장의 개선, 세포 수율 및 석시네이트 생성은 이러한 전이 동안 관찰되었다. 말레이트, 피루베이트 및 아세테이트 레벨 또한 증가되었다. 복제물은 최종 전이로부터 분리되고, KJ073 (DldhA::FRT DadhE::FRT DackA::FRT DpflB::FRT DmgsA DpoxB)로 지정되었다.
KJ073 균주는 카르복실화에 있어서 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제 경로를 유지한다(표 5). 이 균주의 생체외(In vitro) 활성은, 에너지 보존과 석시네이트 생성의 단단한 결합의 증거를 더 제공하고, 선택(selection)에 사용되는 기반을 더 확립함으로써, KJ012보다 45배 높고, KJ017보다 10배 높다.
PEP 카르복시키나아제 활성에서의 큰 증가는 세포 수율 및 석시네이트 생성에서의 개선과 상호 연관된다(표 5). KJ012에서 KJ017까지(대사 진화), PEP 카르복시키나아제 활성은 4.3배 증가되고, 세포 수율은 5.7배 증가되고, 석시네이트 생성은 8.8배 증가된다. KJ017에서 KJ060까지(pflB 제거 후 대사 진화), PEP 카르복시키나아제 활성은 12배 증가되고, 세포 수율은 1.3배 증가되고, 석시네이트 생성은 2.6배 증가된다. KJ060에서 KJ071까지(mgsA 제거 후 대사 진화), PEP 카르복시키나아제 활성은 92% 감소되고, 세포 수율은 45% 감소되고, 석시네이트 생성은 63% 감소된다. KJ071에서 KJ073까지(poxB의 제거 후 대사 진화), PEP 카르복시키나아제 활성, 세포 수율, 및 석시네이트 생성은 KJ060과 동등한 레벨로 복구된다.
pck 및 주변 영역은 KJ012 및 KJ073으로부터 클로닝되고, 시퀀스된다. 코딩 영역에 있어서 어떠한 변화도 발견하지 못했다. 번역후변형(post-translational modifications) 없이, 효소의 촉매 특성은 변화되지 않아야 한다. 단독 변이는 번역 개시 부위(start site)에 대하여 -64bp 부위에서 G to A인, pck 프로모터 영역(pck promoter region)에서 검출된다. 이 돌연변이는 번역 개시 부위(translational start site)에 대하여 -139bp 부위인 전사 개시 부위(transcription start site) 뒤에 있다.
이전 조사관은 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제(ppc) 및 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(pck)는 카르복실화 및 석시네이트 생성에 중요한 영향을 미친다는 것을 주목했다(Millard et al., 1996; Kim et al., 2004). E. coli 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제(ppc)에 있어서 비카보네이트에 대한 Km은 0.15mM이고(Morikawa et al., 1980), E. coli 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(pck)보다 9배(13 mM) 낮았다(Krebs and Bridger, 1980). 다복제 플라스미드를 사용하는 E. coli로부터의 pck의 오버발현이 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제 활성을 50배 증가시키지만, 이는 석시네이트 생성에 어떠한 영향도 주지 않는다고 보고되었다(Millard et al., 1996). 언에어로비오스피리룸 숙시니시프로더센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens )로부터의 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제가 E. coli K12로 오버발현되는 경우에, 석시네이트 생성은 또한 증가된다(Kim et al., 2004). 또한, 이 효소는 비카보네이트의 높은 Km (30 mM)을 갖는다(Laivenieks et al., 1997). 그러나, A. succiniciproducens pck가 E. coli K12의 ppc 돌연변이체에서 오버발현된다(Kim et al., 2004). KJ017 및 이후 유도체에 있어서, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제는 본래의 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제의 기능이 존재하면서도 우세한 카르복실화 활성을 보여준다.
E. coli C의 효소 측정 결과는 매우 놀랍다. 성장(Unden and Kleefeld, 2004; Fraenkel, 1996; Keseler et al, 2005; Millard et al., 1996; Gottschalk, 1985; Karp et al., 2007) 동안 본래의 E. coli (phosphoenolpyruvate carboxylase; ppc)에 의한 석시네이트 생성을 위한 카르복실화 활성이 일반적으로 우세하다고 여겨지는 효소는 E. coli C에 있어서의 생체외 가장 활성인 효소가 아니다. 따라서, 대사 엔지니어링의 합리적 고안 및 대사 흐름의 견적이 일반적으로 기반이 되는 때에, E. coli (Unden and Kleefeld, 2004; Fraenkel, 1996; Sanchez et al., 2006; Cox et al., 2006; Vemuri et al., 2002a; Wang et al., 2006; Sanchez et al., 2005ab; Gokarn et al., 2000; Karp et al., 2007)에 대해 일반적으로 허용되는 대사 경로는 모든 균주에서 대사에 정확히 반영되지 않을 수 있다. 생체외 기질-포화 조건(substrate-saturating condition)하에서, 포스포에톨피루베이트 카르복시키나아제 활성으 가장 활성적이다. E . coli K12에 있어서, 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제와 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제의 활성은 석시네이트로의 주요 경로로서 작용하는 전자와 생체외에서 동등한 것으로 보고되었다(140 nm min-1 mg-1 세포 프로테인; Van der Werf et al., 1997).
이전 연구는 E. coli 내에서 본래의 ppc 유전자의 오버발현은 높은 특이적 석시네이트 생성(Millard et al., 2000), 높은 특이적 성장률, 및 TCA 사이클 중간체를 다시 보충하기 위해 PEP의 카르복실화에 기인한 낮은 특이적 아세테이트 생성(Farmer and Liao, 1997)을 야기한다는 것을 보여준다. 그러나, PEP가 글루코오스 전달 시스템을 필요로 하기 때문에, ppc의 오버발현은 동일 유전적 제어(isogenic control)와 비교하여 석시네이트 수율(글루코오스 당)의 현저한 증가 없이 15-40% 글루코오스 흡수가 감소한다(Chao and Liao, 1993; Gokarn et al., 2000). 석시네이트 수율을 증가시키기 위한 본래의 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제의 이러한 실패는 새로운 대사 고안, E. coli 유전자의 본래의 레퍼토리로 더 작용하는 것을 추구하는 것보다, 카르복실화 단계(Vemuri et al., 2002ab; Gokarn et al., 2000; Lin et al., 2005a, 2005b, 2005c)로서 Lactobacillus lactis 또는 Rhizobium etli 로부터 PYC (피루베이트 카르복실라아제(pyruvate carboxylase))의 오버 발현,에 주목하는 대부분의 연구를 우회시켰다.
반추위세균, 예컨대 악티노바실러스 석시노제네스(Actinobacillus succinogenes)는 카르복실화를 위한 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제의 에너지 보존을 사용하여 글루코오스 발효 동안 주요 프러덕트로서 석시네이트를 생성한다(Kim et al., 2004; McKinlay et al., 2005; McKinlay and Vieille, 2008). 유기체의 보고된 활성은 KJ017의 것의 5배이고, KJ073의 계속되는 성장 기반 선택(대사 진화)에 의해 얻어지는 것의 반이다. 따라서, 대사 엔지니어링(ldhA adhE ackA) 및 대사 진화(ATP 생성의 증가된 효능에 대한 성장 기반 선택)의 조합을 사용함으로써, 여기에 언급된 연구는 E. coli 유전자의 본래의 레퍼토리만을 사용함으로써 A. succinogenes 와 같은 반추위 유기체와 비슷한 E. coli의 석시네이트-생성 균주(succinate-producing strains)의 발전을 설명한다. E . coli 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(pck)의 오버 발현이 포스포에놀피루베이트 합성 중 돌연변이의 부재시 석시네이트 생성에 유용하지 않다는 이전 보고에도 불구하고(Chao and Liao, 1993; Kim et al., 2004; Gokarn et al., 2000; Millard et al., 1996), KJ017 및 유도체는 석시네이트 및 말레이트 생성을 위한 주요 경로로서 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 사용하기 위해 대사 진화되었다.
도 7은 석시네이트 생성을 위한 2개의 최고 생체촉매, KJ060 및 KJ073으로의 배치 발효를 나타냈다. 성장은 배양 최초 48시간 내에 완료되었고, 석시네이트 생성은 96시간 동안 계속되었다. 석시네이트 생성의 1/3은 세포 성장의 부재시에 발생되었다. 이 균주는 대사된 글루코오스에 기초해 1.2-1.6의 몰수율을 갖는 668-733 mM의 석시네이트 역가를 생성했다. AM1 배지를 사용하여, 수율은 NBS 무기질 염 배지보다 일반적으로 높다. 아세테이트, 말레이트, 및 피루베이트는 바람직한 부산물(co-product)로서 축적되고, 석시네이트의 잠재적인 수율로부터 감소된다(표 4). 글루코오스 및 CO2 (과잉)로부터 석시네이트의 최대 이론 수율은 이하 방정식에 기초하여 글루코오스 몰당 1.71몰이다:
C 6 H 12 O 6 + 6 CO 2 → 12 C 4 H 6 O 4 + 6 H 2 O. 그러나, 이 수율을 얻는, E. coli 의 직접적 석시네이트 경로는 없다(도 6).
이 연구는 석시네이트로 글루코오스의 전환에 주로 초점을 맞추었다. E . coli 는 식물 세포벽의 구성 요소인 모든 헥소오스 및 펜토오스를 대사하는 본래의 능력을 갖는다는 것이 잘 알려져 있다(Asghari et al., 1996; Underwood et al., 2004). 또한, E. coli 의 일부 균주는 슈크로오스를 대사할 수 있다(Moniruzzaman et al., 1997). 균주 KJ073은 혈청 튜브내에 헥소오스 및 펜토오스의 2% 당의 이용을 시험했다. 모든 경우에 있어서, 이러한 당은 주로 석시네이트로 전환되었다. 또한, 균주 KJ073은 석시네이트로 글리세롤을 대사했다. 2% 글리세롤로 배양하는 동안, 143 mM 글리세롤은 대사되어 몰 수율 0.89, 또는 세균 성장용 탄소 원료로서 글리세롤을 사용하여 석신상에 대한 최대 이론 수율의 89%을 갖는 127 mM 석시네이트를 생성했다.
E. coli 의 발효 대사는 현저히 적용가능한 것으로 보여진다. 유도체는 엔지니어링되고, 본래의 발효 경로와 관련된 유전자의 많은 제거를 피하기 위해 진화되고, 산화 환원 반응의 균형을 유지하기 위해 효소를 유지함으로써 흐름을 증가시키고, ATP 생성의 효율을 증가시키고, 성장을 증가시킨다. 많은 도전에도 불구하고, 세포는 모든 생합성적 요구를 제공하기 위해 분획하는 탄소의 균형을 맞추는 반면에, 무기질 염 배지에서 이러한 적응적 변화를 만들 수 있다. NADH 산화(락테이트 탈수소화, 알콜 탈수소화) 및 아세테이트 생성(아세테이트 키나아제)을 위한 주요 경로를 제거한 후, 성장 및 ATP 생성은 산화 환원 반응의 균형을 위한 말레이트 또는 석시네이트의 생성 및 NADH 산화와 연결되도록 유지된다(도 1b). 혐기성 성장 기반 선택은 산화 환원 반응의 균형을 보증하고, 증가된 효율 및 증가된 ATP 생성률, 증가된 성장에 대한 기반을 선택한다. 산화 환원 반응 균형 및 ATP 생성에 대한 이러한 선택은, 말레이트와 석시네이트의 전구체가 전자 억셉터로서 작용하기 때문에, 종결 프러덕트로서 말레이트와 석시네이트 사이에서 쉽게 구별할 수 없다.
pflB의 제거, 혐기성 성장 동안 아세틸~CoA의 주요 원료는 아세테이트에 대한 영양요구성 조건을 야기한다(Sawers and Bock, 1988). 이러한 조건은 짐작컨대 피루베이트 탈수소화와 같은 다른 경로에 의해 아세틸~CoA의 증가된 생성에 기인하여, 대사 진화를 통해 제거되었다(de Graef et al., 1999). 이러한 영양요구성 요구를 대체하는 아세테이트 또는 아세틸~CoA의 대사 원료는 알려지지 않았다. 또한, poxB 제거 후 높은 석시네이트 생성으로의 이동은 놀랍다. 아세테이트 레벨의 약간의 변화는, 이 효소는 아세테이트의 주요하지 않은 원료이거나 아세테이트 생성을 위한 다른 경로에 의해 기능적으로 대체된다는 점을 나타내는 것이 발견되었다. poxB의 제거 후, 석시네이트는 우세한 디카르복실산으로 다시 생성되었다. poxB 제거를 동반하는 대사 프러덕트의 이러한 이동은 예측되지 않았다.
석시네이트 생성을 위한 최고 균주, KJ060 및 KJ073을 사용하여, 말레이트 및 아세테이트는 풍부한 부산물로서 남았다(표 4, 도 4d 및 4f). 이들의 제거는 수율을 증가시키기 위한 또 다른 기회를 나타낸다.
석시네이트 생성을 위해 개선된 이전에 엔지니어링된 모든 E. coli는 사용되는 복합 배지 및 유지를 위한 항생제를 갖는 플라스미드를 갖는다. 대부분은 단순 배치 발효에서 석시네이트의 낮은 역가로도 행해지고, 높은 역가를 행하기 위해 더욱 복합 프로세스를 필요로 한다(표 1). 또한, 다른 조사관은 가스(CO2, H2, O2 또는 공기)를 분사하고, 이중 호기성 및 혐기성 프로세스 단계를 포함하는 복잡한 프로세스 및 이종 유전자를 사용해왔다. 다양한 유전적 접근은 복합 배지 중 재조합 E. coli에 의해 글루코오스로부터 석시네이트 생성을 증가시키는 것이 보고되었다. 이러한 프로세스 및 영양성분의 복잡성은 구조, 물질, 정제, 및 폐기물 처리의 비용을 증가시킬 것으로 예상된다. 비타민, 아미노산, 및 다른 고분자 화합물 전구체를 함유하는 복합 배지는 대사 엔지니어링에 의해 생성되는 대사 및 생합성에서 잠재적인 조절 문제를 마스킹할 수 있다. 초기 구성에 있어서, 성장 및 당 대사는 무기질 염 배지에서 우수하지 못하지만, 복합 배지 중 매우 강하다(루리아 브로스). 반면에, 균주 KJ060 및 KJ073은 임의의 복합 영양성분 또는 외래 유전자 없이 무기질 염 배지를 사용하여 단순 배치 발효(10% 당)에서 석시네이트(600-700 mM)의 높은 역가를 생성한다.
실시예 2
석시네이트 생성을 위한 KJ134 균주의 구성
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이, E. coli C 야생형에서 중앙 혐기성 발효 유전자는 PCR 프러덕트 및 제거가능한 항생제 마커를 사용하여 Datsenko & Wanner (2000)의 방법에 의해 순차적으로 제거된다(FRT 인식 부위 및 FLP 재조합효소를 사용함으로써). 대사 진화(ATP 생성의 증가된 효율의 성장-기반 선택)와의 조합된 이러한 구성은 성장 및 석시네이트 생성을 증가시키기 위한 에너지 전환, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(pck)를 채용하는 돌연변이 균주를 선택하는데 사용되었다(도 9). 생성된 균주, KJ073은 대사된 글루코오스 몰당 석시네이트 1.2몰이 생성되고(Jantama et al., 2008a), 반추위세균(rumen bacteria), 악티노바실러스 석시노제네스(Actinobacillus succinogenes ) (van der Werf et al., 1997) 및 만헤이미아 석시니시프로두센스(Mannheimia succiniciproducens ) (Song et al., 2007)와 완전히 동일한 석시네이트 경로를 사용한다. 그러나, 이러한 유전자 제거를 구성하는데 사용되는 방법은 각각의 제거된 유전자(ackA , ldhA , adhE , ackA , focA -pflB)의 영역내에 단일 82 내지 85 뉴클레오티드 길이의 유전자 스카(scar) 또는 FRT 부위를 남긴다. 이들 FRT 부위는 항생제 유전자의 제거 동안 FLP 재조합효소(Storici et al., 1999)의 인식 부위로서 작용한다. 이러한 관련없는 시퀀스 모두는 KJ073로부터 순차적으로 제거되고, 이전에 기재된 방법을 사용하여 바람직한 유전자 제거만으로 본래의 DNA를 대체한다(Grabar et al., 2006; Zhang et al.. 2007; Jantama et al., 2008b). 생성된 균주, KJ091은 ackA , ldhA , adhE , focA -pflB, ackA , mgsA , 및 poxB 내에서 특이적 제거를 함유하고, KJ073 균주에 존재하는 모든 FRT 부위가 부족하다. KJ091 균주는 ackA 내에서 18-bp 번역 정지 시퀀스를 제외하고 모든 외래 및 합성 DNA가 없다. 균주 KJ091에 의한 석시네이트 생성은 KJ073 균주와 동일하다(표 8). 이러한 균주는 석시네이트 생성의 더 나은 개선을 위해 친주(parent)로서 사용되었다.
*KJ091 균주의 더한 개선을 위한 제1 단계에 있어서, 아세테이트 생성을 감소시키는 것이 주목해야한다. E . coli에 의한 글루코오스의 혐기성 발효 동안, 피루베이트 포르메이트-리아제(pflB)는 아세틸~CoA의 주요 원료, 아세틸~P의 전구체로서 작용하고, 아세테이트 키나아제(ackA)는 아세틸~P로부터 아세테이트 생성을 위한 주요 경로로서 작용한다(Karp et al., 2007; Kessler & Knappe, 1996). 이들 균주가 ackA와 pflB에서 제거를 함유하기 때문에, 균주 KJ073 및 KJ091에서 발효 프러덕트로서 아세테이트의 풍도(abundance)는 놀랍다(도 9). 발효의 마지막에 잔여 아세테이트는 개선된 석시네이트 수율을 위해 대사를 더 전용(redirect)하는 잠재적인 기회를 나타낸다.
아세테이트 키나아제(및 프로프리오네이트 키나아제) 활성을 갖는 관련 효소는 tdcD 에 의해 인코딩되지만, 트레오닌의 열화를 위해 일반적으로 생성된다(Hesslinger et al., 1998; Reed et al., 2003). 선택 동안 발생하는 돌연변이는 도 10에 나타낸 바와 같이 tdcD의 발현을 증가시키는 것이 가능하다. 10% (w/v) 글루코오스를 사용하는 혐기성 성장 동안, tdcD 의 발현은 ackA를 기능적으로 대체할 수 있고, 아세틸~P로부터 아세테이트의 생성을 증가시킨다. 동일한 오페론에서 인접한 tdcE 유전자는 pflB와 유사하고, 트레오닌 열화 동안 공동-발현되는 피루베이트(및 α-케토부티레이트) 포르메이트리아제 활성을 인코딩한다(Hesslinger et al., 1998). 10% (w/v) 글루코오스를 사용하는 혐기성 성장 동안 이러한 유전자의 증가된 발현은 아세틸~CoA, 아세틸~P의 가까이에 있는 전구체, 및 포르메이트로서 폐기물 환원제의 생성을 증가시킬 수 있는 것이 가능하다(도 10). tdcD과 tdcE (인접한)는 KJ098를 생성하기 위해 KJ091로부터 동시에 제거되었다. 이들 2개의 유전자의 제거는 KJ091과 비교하여 KJ098에서 석시네이트 수율이 10% 증가되었고, 석시네이트로부터 탄소 흐름을 우회하는 예측되지 않은 경로의 중요성을 확립한다(Deletion of these two genes reduced acetate production by half and increased succinate yield by 10% in KJ098 in comparison to KJ091, establishing the importance of this unexpected pathway in diverting carbon flow away from succinate). 또한, KJ098에 의해 생성되는 피루베이트의 레벨은, 피루베이트 대사의 2가지 다른 경로의 제거시, 피루베이트 포르메이트-리아제 활성(tdcD) 및 아세테이트 키나아제 활성(tdcE)을 증가시키는 것으로 예측되는 중간체에 40% 감소한다. 피루베이트 생성의 현저한 감소는 tdcD / tdcE 유전자 제거의 예측되지 않은 결과이다. 피루베이트의 감소에 기인한 메카니즘, 및 tdcD 및 tdcE의 동시 제거를 야기하는 석시네이트의 증가는 알려지지 않았다.
KJ098은 KJ091의 현저한 개선을 나타내지만, 아세테이트 레벨의 더한 감소 및 석시네이트 수율의 더한 증가는 가능할 수 있다. 혐기성 조건하에서, 옥살로아세테이트는 환원된 프러덕트(말레이트) 및 산화된 중간체(시트레이트)로 분화되었다(도 9). 시트레이트는 시트레이트 리아제(citDEF)에 의해 옥살로아세테이트 및 아세테이트로 다시 전환되어 다른 대사 기능에 대한 세포간 OAA 풀(pool)을 리사이클링할 수 있다(Nilekani et al., 1983). 시트레이트 리아제의 현저한 양의 발현은 시트레이트에 대한 성장과 관련된다(Lutgens and Gottschalk, 1980; Kulla and Gottschalk, 1977). 시트레이트 리아제는 3개의 다른 폴리펩티드쇄로 이루어진 다효소 복합체(multi-enzyme complex)이다. α 또는 큰 서브유닛은 제1 단계를 촉매화하는 시트레이트-ACP 트랜스퍼라아제이다. β 또는 중간 서브유닛은 제2 단계를 촉매화하는 시트릴-ACP 리아제이다. γ 또는 작은 서브유닛은 아실-캐리어 프로테인(acyl-carrier protein)으로서 작용하고, 또한 보결 분자단(prosthetic group) 성분을 나를 수 있다. 3개의 서브유닛 모두는 발생하기 위한 반응을 필요로 한다(Quentmeier et al., 1987). 하나 이상의 이들 서브유닛을 인코딩하는 유전자의 제거는 시트레이트 리아제 활성을 제거하고, 석시네이트 생성 동안 아세테이트의 레벨을 더 감소시킬 수 있다. citF 유전자는 KJ104를 생성하기 위해 KJ098로부터 제거되었다. 그러나, 이 제거는 아세테이트 생성 또는 다른 석시네이트 수율에 영향을 주지 않는다(표 8). citF의 제거가 아세테이트에 어떠한 환원을 야기하지 않기 때문에, 이 중간체는 다른 경로로부터 발생하는 것으로 추측된다. 미지의 이유에 대해서, citF의 제거는 KJ104의 성장에 반대로 영향을 미치고(세포 수율이 22% 감소됨), 발효의 마지막에 피루베이트의 레벨이 KJ098과 비교하여 거의 50% 증가했다. 그러나, 석시네이트 수율, 역가, 평균 생산성, 및 KJ104를 갖는 아세테이트 레벨은 KJ098의 것과 비교할 만하다(표 8).
아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(Aspartate aminotransferase)(aspC)는 아스파르테이트, 페닐알라닌 및 아미노기 전이(transamination)에 의한 다른 화합물을 촉매화 하는 다기능성 효소(multifunctional enzyme)이다. 반응에 있어서, L-아스파르테이트는 L-글루타메이트와의 아미노기 전이에 의해, 옥살로아세테이트, PEP 카르복실화로부터 생성된 중간체로부터 합성된다. 또한, 프로테인 구성성분이 되는, 아스파르테이트는 일부 다른 생합성 경로에 참여한다. 세포 질소의 약 27퍼센트는 아스파르테이트를 통해 흐르는 것으로 추정된다(Reitzer, 2004). 아스파르테이트 생합성 및 석시네이트 생성은 옥살로아세테이트의 공통의 세포간 풀(pool)을 공유한다. aspC의 제거는 증가된 석시네이트 생성을 야기할 수 있지만, AM1과 같은 무기질 염 배지 내에 혐기성 성장을 억제하는 영양요구성 조건(auxotrophic requirement)을 만들 수 있다.
이러한 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 유전자(aspC)는 KJ110을 생성하기 위해 KJ104로부터 제거된다. 예상외로, aspC의 제거는 KJ104와 비교하여 KJ110의 석시네이트 수율 또는 세포 수율에 영향을 미치지 않는다(표 8). 따라서, 아스파르타아제는 균주 내에 석시네이트 생성으로부터 옥살로아세테이트의 현저한 레벨을 우회시키는 것이 나타나지 않는다. 다른 효소는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제에 의해 이전에 촉매화된 생합성적 필요를 대체하는 것이 이용가능한 것으로 나타난다(Alternative enzymes appear to be available that replace the biosynthetic needs formerly catalyzed by aspartate aminotransferase.).
현저한 양의 피루베이트는 석시네이트 생성을 위해 엔지니어링되는 E. coli 의 다른 균주 및 KJ104를 사용한 발효의 마지막에 존재한다(표 8). 이 피루베이트는 불필요한 프러덕트 및 석시네이트 수율을 증가시키는 다른 기회를 나타낸다. 발효 브로스에서 이러한 고레벨의 피루베이트는 도 10에 나타낸 바와 같이 말산 효소(sfcA)에 의해 피루베이트로 말레이트의 탈카르복실화를 야기할 수 있다. 이 효소는 글루코오스의 혐기성 대사 동안보다 글르코오스신생합성(Unden and Kleefeld, 2004; Stols and Donnelly, 1997; Oh et al., 2002) 동안 주로 기능하는 것으로 생각된다. 말레이트를 형성하기 위해 피루베이트의 환원적 카르복실화가 열역학적으로 유용하지만, 이러한 효소의 동역학 변수는 생리적 조건하에서 탈수소화 및 탈카르복실화가 유용하다(Stols and Donnelly, 1997). 피루베이트를 카르복실화하기 위한 이러한 효소의 오버-발현은 E. coli 의 석시네이트 생성을 위한 균주를 구성하기 위한 기반으로서 이전에 사용되어 왔다(Stols and Donnelly 1997).
말산 효소(sfcA)가 KJ104(및 관련 균주)에서 카르복실화되고, 석시네이트 생성에 기여하는 경우에는, 이러한 유전자의 제거는 석시네이트 수율울 감소시키고, 피루베이트와 같은 다른 프러덕트의 레벨을 증가시킬 것으로 예상된다. 또한, 말산(scfA)은 KJ104에서 탈카르복실화하고, 말레이트를 피루베이트로 우회시키는 경우에는, 이러한 효소를 인코딩하는 유전자의 제거는 석시네이트 수율을 증가시키고, 피루베이트의 레벨을 감소시킬 것으로 예상된다. 예상외로, KJ119를 생성하기 위해 KJ104로부터 sfcA 유전자의 제거는 KJ104와 비교하여 석시네이트 생성, 성장, 피루베이트 레벨, 등에 주목할만한 효과를 미치지 않는다. 이러한 결과는 말산 효소(sfcA)는 KJ104 및 관련 균주의 석시네이트 생성에 중요하지 않다는 것을 명백히 설명한다. 이러한 결과는 Stols 및 Donnelly (1997)에 의해 발전된 석시네이트-생성 균주와 반대이고, 말산 효소의 증가된 생성은 석시네이트 생성의 주요 경로로서 사용된다(This result is in sharp contrast to the succinate-producing strains developed by Stols and Donnelly (1997) in which increased production of malic enzyme was used as the primary route for succinate production.).
KJ104에서 sfcA 제거 또는 aspC 제거로부터 현저한 이점이 관측되지 않지만, 조합된 유전자들을 제거하는 효과를 시험하기 위한 연구가 행해졌다. KJ122를 생성하기 위한 KJ110에서 sfcA 유전자를 제거함으로써 행해지고, 어떠한 이점도 확인할 수 없었다. 그러나, sfcA 및 aspC (균주 KJ122)의 조합된 제거는 친주 KJ110 및 관련 균주(KJ104 및 KJ119)와 비교하여, 아세테이트의 적은 환원으로 석시네이트 수율 및 역가의 예상외의 증가를 야기한다(표 8). KJ122에서 조합된 제거(aspC and sfcA)는 석시네이트 수율의 18% 증가, 석시네이트 역가의 24% 증가, 및 KJ104와 비교하여 평균 생산량의 24% 증가를 야기한다. 메카니즘이 알려져 있지 않지만, 잠재적 이익을 꺾는(dampening any potential benefit), 잔여 효소 활성, 말산 효소 또는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제를 통해 증가된 흐름에 의해 부분적으로 보완되기 때문에 단일 돌연변이는 비효과적인 것이 가능하다(도 10). 석시네이트 수율 및 역가의 증가는 큰 분율이 석시네이트로 진행되도록 옥살로아세테이트의 이용가능성의 증가로부터 발생되는 것으로 추정된다. 또한, 말레이트 레벨은 매우 낮게 유지된다.
균주 KJ122 (표 8)는 최대 이론적 수율의 88%(글루코오스 몰당 1.71몰), 글루코오스의 몰당 1.5몰 석시네이트를 생성한다. 고레벨의 석시네이트를 생성하고, 말레이트 생성을 감소시키기 위해서, 추가적인 환원제가 필요하다. 추가적인 환원제의 원료는 알려져 있지 않지만, 이들 결과는 피루베이트 탈수소효소를 통한 피루베이트 흐름의 증가와 일치한다. 이들 효소는 주로 호기성 대사 동안 기능하는 것으로 생각되지만(Guest et al., 1989), 발효 동안 낮은 레벨로 기능하는 것으로 보고되었다(de Graef et al., 1999).
KJ122는 우수한 석시네이트 수율(1.5 mol mol-1 글루코오스)과 소량의 아세테이트 및 피루베이트를 생성했다. 석시네이트의 최대 이론적 수율은 1.71 mol mol-1 글루코오스이고, 3-탄소 중간체는 수율을 더 증가시키는 기회를 나타낸다. 피루베이트는 대사 오버플로우(metabolic overflow)로서 해당 과정으로부터 축적될 것으로 추정되고, 아세테이트 축적과 관련될 것이다. 아세틸~CoA는 많은 효소의 입체성 다른 자리 제어인자(allosteric regulator)이다. 아세테이트 키나아제의 2가지 주요 활성(tdcD 및 ackA)을 인코딩하는 유전자가 제거되어 왔기 때문에, 아세테이트의 원료 및 아세테이트 키나아제 활성은 알려지지 않았다(도 9 및 도 10). 아세테이트가 아세틸~P, 포스포트랜스아세틸라아제의 프러덕트로부터 생성되는 것을 가정하면, 다른 제거가 pta 유전자를 불활성화하기 위해 KJ122에 구성되었다. 생성된 균주, KJ134는 석시네이트의 이론적 레벨에 가깝게 생성되었다(표 8). 이 균주에 있어서, 피루베이트 및 아세테이트 레벨은 실질적으로 감소되었다. 체적 생산량 또한 17% 감소되었다. 균주 KJ134를 갖는 석시네이트 수율은 발효 공정, 배지, 또는 성장 조건의 복잡성과 관계 없이 다른 모든 균주 이상이다.
실시예 3
석시네이트 생성을 위한 글루코네오제닉 PEP 카르복시키나아제(pck)의 채용(Recruitment of gluconeogenic PEP carboxykinase (pck) for succinate production)
E. coli 는 석시네이트를 생성하는데 사용될 수 있는 4개의 본래의 카르복실화 경로의 대사 가능성이 있다(도 2A-D). 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제(ppc)에 의한 옥살로아세테이트(OAA)로의 포스포에놀피루베이트(PEP)의 카르복실화는 E. coli 에서 석시네이트의 발효적 생성을 위한 주요 경로로서 인식되었다(도 2A). (Fraenkel DG, 1996; Unden & Kleefeld, 2004; Karp et al., 2007). 이 반응은 무기 포스페이트의 해리(release)와 관련된 에너지 손실에 기인하여 필수적으로 비가역적이다. 3개의 다른 카르복실화 반응은 배지에서 글루코오스의 고농도에 의해 보통 억제되고, 글루코오스신생합성의 역방향에서 기능이 보고되었다(Samuelov et al ., 1991; Oh et al ., 2002; Stols & Donnelly, 1997). 제2 및 제3 카르복실화 경로(도 2B 및 2C)는 말레이트로 피루베이트의 가역 카르복실화를 촉매화하기 위해 NADH-결합 및 NAPDH-결합 말산 효소(NAPDH-linked malic enzymes) (sfcA 및 maeB)를 각각 사용한다. 두 경로는 PEP로부터 피루베이트 형성 동안 ATP로서 에너지를 보존시킨다. 네번째 경로는 ATP와 같은 에너지의 보존으로 OAA로 PEP의 가역적 카르복실화의 PEP 카르복시키나아제(pck)를 사용한다(도 2D). PEP 카르복시키나아제 (PCK)는 E. coli의 글리코오스신생합성 동안에만 보통 기능하지만, 유사 PEP 카르복시키나아제는 석시네이트-생성 반추위세균에서 매우 높은 레벨로 존재하고, 이는 주요 PEP 카르복실화 활성으로 작용한다(Van der Werf et al.,1997).
E. coli 균주 KJ073은 표적 유전자 제거와 높은 성장률 및 석시네이트 생성에 대한 진화에 의해 대사적으로 엔지니어링된다(Jantama et al.,2008a). 4개의 카르복실화 효소(ppc, sfcA, maeB and pck) 각각을 인코딩하는 유전자는 엔지니어링된 균주 KJ073에서 석시네이트 생성을 위한 주요 경로를 확인하기 위해 각각 제거되었다(표 10). 본래의 E. coli (XZ320)에서 주요 카르복실화 단계를 인코딩하는 ppc 유전자의 제거는 석시네이트 생성을 변화시키지 않는다. 또한, XZ341 및 XZ396을 생성하기 위한 말산 효소(sfcA 및 maeB)를 인코딩하는 유전자의 제거는 각각 글루코오스신생합성의 주요 기능과 일치하는 석시네이트 생성에 어떠한 효과도 미치지 않는다. 그러나, PEP 카르복시키나아제(XZ332)를 인코딩하는 pck의 제거는 세포 성장, 당 대사, 석시네이트 생성 및 석시네이트 수율을 급격히 감소시킨다. 균주 XZ332에서 제거 돌연변이와 균주 KJ073(플라스미드 pLOI4677)으로부터 전체 pck 유전자의 상보성은 KJ073에 가깝게 석시네이트 생성을 실질적으로 개선시킨다(표 10).
*아울러, 이러한 결과는 글루코네오제닉 PEP 카르복시키나아제가 KJ073에서 발효적 석시네이트 생성을 위한 주요 카르복실화 반응으로 작용하기 위해 대사 진화 동안 채용된다는 것을 설명한다. PEP 카르복실라아제와는 달리(도 2a), PEP 카르복시키나아제는 추가적인 ATP를 제공하는 에너지를 보존한다(도 2d). 발효적 성장 및 ATP 생성이 밀접히 연관되어 있기 때문에, ATP 수율과 PEP 카르복시키나아제의 증가(도 2d)는 균주 KJ073을 야기하는 대사 진화 단계에서 성장-기반 선택(growth-based selection) 동안 경쟁적인 이점을 제공한다.
PEP 카르복시키나아제 활성의 증가는 pck mRNA 풍도(abundance)의 증가와 상호연관된다(표 11; 도 12a). pck 전사물 풍도는, 향상된 PEP 카르복시키나아제 활성과 일치하여, 야생형과 비교하여 KJ073에서 증가되지만, ppc , sfcA 및 maeB에 대한 전사물 레벨은 필수적으로 변화되지 않는다(표 11).
pck 유전자를 시퀀싱하는 것은 KJ073으로부터 pck 유전자의 코딩 또는 터미네이터 영역에서의 차이점을 나타내지 않는다. 그러나, 단일 점 돌연변이(ATG 개시 코돈과 비교하여 위치 -61에서 G to A 전이)는 KJ073에서 pck 유전자의 업스트림 프로모터 영역에서 발견되었다(표 11). 6개의 균주 모두는 균주 향상 동안 이 돌연변이의 기원을 확인하기 위해 시퀀스되었다. PEP 카르복시키나아제 활성이 KJ012에서 보다 KJ017에서 4배 높고, G to A 돌연변이는 없었다. KJ073 균주에서 pck 유전자의 프로모터 영역에서의 이러한 점 돌연변이는 pck* 돌연변이로 간주되었다(높은 PEP 카르복시키나아제 활성). 이 pck* 돌연변이는 높은 PEP 카르복시키나아제 활성을 보여주는 KJ060 및 KJ073 균주에만 존재하고, KJ071는 없다. KJ071에서 이러한 돌연변이의 손실은 KJ017과 동등한 레벨로 PEP 카르복시키나아제 활성이 10배 감소하는 것을 동반한다.
KJ017, 및 KJ071로의 pck* 점 돌연변이(G to A)의 도입은 PEP 카르복시키나아제 활성이 9배 증가된다(표 11). 균주 KJ060 및 KJ073에서 야생형 pck 유전자 (A to G)의 복원은 균주 XZ622 및 XZ624를 각각 얻는다. XZ622 및 XZ624는 PEP 카르복시키나아제 활성을 거의 8배 감소시킨다(표 12). 더불어, 이들 결과는, KJ060를 생성하기 위한 KJ017의 대사 진화 동안 발생되는 PCK 활성의 증가는 pck (ATG 개시부에 대해 -64에서 G to A)의 단일 뉴클레오티드 변화에 기인한 것이라는 점을 설명했다. KJ017에서 이러한 돌연변이의 부재는, 이러한 균주에서 관찰되는 PEP 카르복시키나아제 활성의 초기 4배 증가는 아직 정의되지 않은 변화에 기인한 것이라는 점을 시사한다. 명백히, 발효적 석시네이트 생성을 위한 본래의 글루코네오제닉 PCK의 채용은 pck 유전자의 전사에 영향을 주는 다중 돌연변이로부터 발생한다.
KJ012로부터 KJ017의 발전 동안 발생되는 PEP 카르복시키나아제 활성의 4배 증가는 pck에서 돌연변이로부터 발생하지 않고, 전사 제어인자(transcriptional regulator)에서 돌연변이를 포함할 수 있다. Cra 프로테인은 E. coli에서 pck의 발현을 활성화하는 것을 나타낸다(Saier & Ramseier, 1996). 그러나, cra 유전자 또는 업스트림 영역에서 어떠한 돌연변이도 발견되지 않았다. KJ017 (XZ626) 및 KJ060 (XZ627)에서 cra의 제거는 PEP 카르복시키나아제 활성에 영향을 주지 않는다(표 12).
csrA 시스템은 pck 및 mRNA 안정성을 변화시킴으로써 글루코오스 대사와 관련되는 다른 유전자의 레벨을 조절하는 것으로 알려져 있다(Pernestig et al ., 2003). 그러나, 이러한 조절 시스템(csrA , csrB , csrC , csrD, uvrY 또는 barA)과 관련되는 유전자의 시퀀스에서 어떠한 돌연변이도 발견되지 않았다.
E. coli PEP 카르복시키나아제 활성은 글루코오스 이화대사 억제(catabolite repression)를 행한다(Goldie 1984). 2개의 Crp-결합 부위는 KJ060 및 KJ073에서의 점 돌연변이로부터 꽤 떨어져 있는 프로모터(Ramseier et al 1995)에서 확인되었다. 이화대사 억제(cyaA , crp) 및 포스포트랜스페라아제 시스템에 의한 글루코오스 흡수(ptsH , ptsI , crr , ptsG)와 관련되는 유전자는 시퀀스된다(터미네이터를 통한 업스트림 영역). 균주 KJ060, KJ071, 및 KJ073에서 ptsI (위치 1,673에서 단일 염기 제거(single base deletion))의 카르복시-터미널 영역(carboxy-terminal region)에서, 오직 하나의 돌연변이, 프레임-시프트 돌연변이(frame-shift mutation)가 발견되었다. 이러한 제거가 KJ017에 없기 때문에, 이러한 균주에서 PEP 카르복시키나아제 활성의 최초 4배 증가를 야기할 수 없다(표 12). KJ017 (XZ613) 및 KJ060 (XZ615)에서 ptsI 의 제거는 PEP 카르복시키나아제 활성에 영향을 미치지 않는다.
pck의 이화대사 억제의 잠재적인 변화는 5% 글루코오스를 갖고, 갖지 않는 LB 배지에서 호기적으로 E. coli ATCC 8739, KJ012, KJ017, 및 KJ060 성장시킴으로써 더 연구되었다(표 13). PEP 카르복시키나아제 활성은 성장의 늦은 증식기(exponential phase) 동안 최대인 것으로 보고되었고(Goldie, 1984), 이는 균주에서 확인되었다. ATCC 8739와 대사 진화에 대한 개시 균주(KJ012)에 있어서, PEP 카르복시키나아제 활성은 글루코오스의 존재에 의해 더 억제되었다(>70%). 글루코오스-조절된 억제는 환상-AMP(cyclic-AMP)의 첨가에 의해 반대로 된다. 반면에, PEP 카르복시키나아제 활성은 KJ017 (KJ012에서 보다)에서 4배 높고, 이화대사 억제의 손실을 나타내는 글루코오스의 첨가에 의해 영향받지 않는다. PEP 카르복시키나아제 활성은 글루코오스의 부재시 성장 동안 KJ060 (KJ017의 5배)에서도 높고, 글루코오스가 포함되는 경우에 더 증가되었다. KJ060 (및 KJ073)에 있어서, pck의 글루코오스 이화대사 억제는 글루코오스 활성으로 교체된다(표 13). cyaA, crp , ptsG, ptsI 및 crr 의 전사물 풍도(Transcript abundance)는 이들 균주들 사이에서 비교된다(도 12b 및 12c). cyaA, crp, 및 ptsG의 전사물은 KJ012 및 ATCC 8739에서보다 KJ017, KJ060, KJ071, 및 KJ073에서 일반적으로 높다. 이들 프로테인의 증가된 레벨은 환상-AMP의 레벨을 증가시킴으로써 이화대사 억제를 마스킹(mask)할 수 있다.
이들 돌연변이에서 이화대사 억제의 손실은 pck 발현을 제한하지 않는다. β-갈락토시다아제 활성은 글루코오스가 있는 성장 동안 ATCC 8739 및 KJ012의 반만큼 감소한다(표 13). 이러한 활성은 글루코오스에 의해 보통 억제되지만, Crp-조절된 글루코오스 조절(Crp-mediated glucose regulation)의 일반적인 손실과 일치하여, KJ017 및 KJ060에서 상대적으로 영향받지 않는다.
KJ012 및 KJ017에서 crp 유전자의 제거는 글루코오스-억제된 친주, ATCC 8739에 대한 생성되는 균주(각각 XZ642 및 XZ643)에서 PEP 카르복시키나아제 활성의 레벨을 감소시킨다(표 13). 이들 crp-제거된 균주에 있어서, PEP 카르복시키나아제 활성은 글루코오스 또는 환상 AMP의 첨가에 의해 영향받지 않는다. 따라서, Crp는 잠재적으로 KJ017 및 이들의 유도체에서 관찰되는 pck 발현의 4배 증가를 위한 필수적인 조절 성분일 수 있다. pck 발현에 있어서 이러한 Crp-조절된 4배 증가와 업스트림 pck 돌연변이와 관련된 발현에 있어서 10배 증가는 KJ060 및 KJ073의 성장 동안 관찰되는 PEP 카르복시키나아제 활성의 레벨의 증가를 설명할 수 있다.
또한, cAMP-CRP 조절과 관련된 다른 유전자는 예상된 아데닐 산고리화효소(the predicted adenylate cyclase) ygiF, Crp sxy의 전사 공동-활성제(transcriptional co-activator), cAMP 포스포디에스테라아제(phosphodiesterase) cpdA 및 탄수화물 대사 mlc의 글로발 제어인자(global regulator)와 같이 시퀀스된다(표 13)(Keseler et a., 2005; Cameron & Redfield, 2006; Imamura et al., 1996; Plumbridge, 2002). 그러나, cAMP=CRP 조절과 관련된 이들 유전자 중 어느 것도 업스트림, 코딩 또는 터미네이터 영역에서 어떠한 돌연변이를 갖는 것이 발견되지 않았다.
유전자 ptsI 는 포스포에놀피루베이트-의존 당 포스포트랜스페라아제 시스템(phosphoenolpyruvate-dependent sugar phosphotransferase system)의 일반적인(비당-특이적) 성분, PEP-프로테인 포스포트랜스페라아제(PEP-protein phosphotransferase)를 인코딩한다. 이러한 주요 탄수화물 활성-전달 시스템은 세포 멤브레인을 가로지르는 전좌(translocation)를 수반하는 인커밍 당 기질(incoming sugar substrates)의 인산화반응을 촉진시킨다. PEP-프로테인 포스포트랜스페라아제는 포스포릴 캐리어 프로테인(phosphoryl carrier protein)(HPr)으로 포스포에놀피루베이트(PEP)로부터 포스포릴기를 전달한다(예컨대, UniProtKB, Accession Number P08839 참조).
ptsI (single base-pair deletion of position 1673 bp)에서 프레임-시프트 돌연변이는 KJ017로부터 KJ060의 대사 진화 동안 발생하는 것으로 발견되었다. 이 돌연변이의 중요성을 조사하기 위해, ptsI의 카르복시-터미널 175 bp는 XZ613 및 XZ615를 각각 생성하기 위해 KJ017 및 KJ060에서 제거되었다. KJ060 (XZ615)에서 ptsI 제거는 예측된 바와 같이 성장 및 PEP 카르복시키나아제 활성에 어떠한 영향도 미치지 않는다. XZ613을 생성하기 위해 KJ017에서 ptsI 카르복시-터미너스의 제거는 글루코오스의 주요 흡수 시스템의 손실과 일치하여, 글루코오스를 함유하는 NBS 무기질염에서 배양하는 무능에 기인한다(PEP-의존 포스포트랜스페라아제 시스템). 배양 며칠 후, XZ613의 배양은 다른 글루코오스 전달 시스템을 활성화시키는 유도체가 될 것으로 추측되는 것을 배양하기 시작했다(Karp et al ., 2007).
KJ060, KJ071, 및 KJ073에서 발견되는 ptsI 돌연변이는 글루코오스의 PEP-의존 포스포트랜스페라아제 시스템을 불활성화시킬 것으로 예상된다. GalP와 같은 다른 글루코오스 흡수 시스템은 pts 돌연변이에서 글루코오스 흡수를 복원하는 것으로 보인다(Wang et a.l, 2006; Yi et al., 2003). galP의 발현은 글루코키나아제(glk)의 적은 증가와 함께, KJ012 및 ATCC 8739와 비교하여 개선된 균주(도 12b)에서 5배 내지 20배 증가되었다. 기능적 야생형 유전자(XZ616)를 갖는 KJ060에서 돌연변이 ptsI 유전자를 대체하는 것은 해롭고, NBS-글루코오스 배지에서 급격히 성장을 감소시킨다. 이러한 역효과는 PEP, 야생형 글루코오스 전달을 위한 요구된 기질로부터 발생할 수 있다. 기능적 PEP-의존 포스포트랜스페라아제 시스템은 PEP 카르복시키나아제와 경쟁하고, 산화 환원 반응 균형, ATP 생성, 및 석시네이트 생성에 이용가능한 PEP 풀을 감소시킨다. 따라서, 글루코오스의 PEP-의존 포스포트랜스페라아제 시스템은, GalP(및 글루코키나아제(glucokinase))와 같은 다른 전달 시스템이 이용가능한 경우에, 균주 성장 동안 유용한 일로서 보일 수 있다.
PEP 노드에서 탄소 흐름(fluxes)은 글루코오스의 혐기성 발효 동안 산화 환원 반응으로 생성된 석시네이트의 양을 제한하기 위해 제공한다(도 13). 또한, 이들 흐름은 생합성을 위한 성장, 유지, 및 전구체에 충분한 에너지(ATP)를 제공해야 한다. 우세한 프러덕트로서 석시네이트를 생성하는 반추위세균은 OAA 생성을 위한 에너지-보존 PEP 카르복시키나아제를 사용한다(도 2d)(Van der Werf et al., 1997; Kim et al ., 2004). E . coli의 본래의 균주는 부생성물로서 석시네이트를 생성하고, PEP 카르복실라아제(ppc)를 사용한다(도 2a). PEP 카르복시키나아제와는 달리, PEP 카르복실라아제는 무기 포스페이트의 해리와 관련된 에너지 손실에 기인하여 필수적으로 비가역적이다. 이전 연구는 E. coli 에서 본래의 ppc 유전자는 높은 특이적 석시네이트 생성(Millard et al ., 1996) 및 옥살로아세테이트로의 PEP의 증가된 카르복실화에 기인한 높은 특이적 성장률(Farmer & Liao, 1997)을 야기한다는 것을 보여준다. 그러나, PEP가 본래의 글루코오스 전달 시스템에 필요하고, ppc의 오버발현은 석시네이트 수율의 현저한 증가 없이 글루코오스 흡수율을 감소시킨다(Chao & Liao, 1993; Gokarn et al ., 2000). 석시네이트 수율을 증가시키기 위한 본래의 PEP 카르복실라아제의 실패는 새로운 대사 고안에 주목하는 대부분의 연구를 우회시키고, 더 추구하는 것보다, 카르복실화 단계로 Lactobacillus lactis 또는 Rhizobium etli 로부터 피루베이트 카르복실라아제의 오버 발현(Sanchez et al.,2005b; Gokarn et al ., 2000) 및 산업적 생체 촉매의 발전을 위한 Actinobacillus succinogenes (Kim et al ., 2004)로부터 PEP 카르복시키나아제의 오버 발현은 E. coli 유전자의 본래의 레퍼토리와 작용한다.
본래의 E. coli 균주는 글루코오스신생합성을 위한 역방향으로만 보통 기능하는 3개의 다른 카르복실화 경로(도 2b-d)를 갖는다(Samuelov et al., 1991; Kao et al ., 2005; Oh et al ., 2002; Stols & Donnelly, 1997). 3개 모두는 ATP로서 PEP로부터 에너지를 보존시킬 것이다. NADH 산화의 단독 경로로서 석시네이트를 사용하여, 성장-기반 선택(대사 진화)은 성장(세포 수율) 및 석시네이트 성장이 개선된 균주 KJ017, KJ060, KJ071, 및 KJ073을 야기한다. 이러한 균주에 있어서, 글루코네오제닉 PEP 카르복시키나아제(pck)는 전사 활성에 의해 주요 카르복실화 활성으로 작용하기 위해 채용되었다. E . coli 의 석시네이트 생성을 위한 주요 경로로서 PEP 카르복시키나아제의 채용은 놀랍다. 다수의 연구는, E. coli pck 의 증가된 발현은 석시네이트 생성에 어떠한 영향도 미치지 않는다는 것을 보여준다(Gokarn, et al ., 2001; Vemuri et al ., 2002; Millard et al ., 1996; Gokarn et al., 2000; Hong & Lee, 2001). 최근 연구는, E. coli pck 의 증가된 발현은 최소 배지에서 성장이 해롭고, 성장률, 글루코오스 대사율, 및 석시네이트 수율을 감소시킨다(Kwon et al ., 2008).
E. coli에서 pck의 증가된 발현은 석시네이트 생성(산화 환원 반응 균형)을 위한 4-탄소 중간체로 증가된 탄소 흐름, 증가된 석시네이트 생성, 및 증가된 성장과 유지를 위한 ATP의 전체 생성을 야기한다. 적어도 3개의 경우는 pck의 증가된 전사에 기여한다: 1) Crp-조절된 글루코오스-억제의 손실 2) 글루코오스-활성의 증가; 및 3) pck의 업스트림 영역에서 단일 염기 변화(single base change). 이들 경우의 각각은 PEP 카르복시키나아제의 레벨을 증가시키고, 석시네이트로 탄소의 흐름을 증가시키고, ATP로서 대사 에너지의 보존을 증가시킴으로써 대사 진화를 통한 선택의 기반을 제공한다. 이들 유전적 경우의 조합된 작용은 주요 발효 프러덕트로서 석시네이트를 생성하도록 진화된 반추위세균과 동등하게, KJ060 및 KJ073에서 높은 레벨의 PEP 카르복시키나아제(>7000 U (mg protein)- 1)를 야기한다(VanderWerf et al,. 1997).
추가적인 에너지-보존 변화(energy-conserving changes)는 발효적 석시네이트 생성을 위한 주요 경로로서 PEP 카르복시키나아제의 채용을 잠재적으로 도울 수 있는 균주 KJ060, KJ071, 및 KJ073에서 발견되었다. PEP-의존 포스포트랜스페라아제 시스템은 E. coli의 본래의 균주에서 주요 글루코오스 흡수 시스템이다. 전달 동안, 글루코오스로부터 생성된 PEP의 반은 산화 환원 반응의 균형 및 ATP 생성의 대사 옵션을 한정하면서, 흡수 및 인산화반응에 사용되었다. 증가된 균주는 이러한 흡수 시스템을 불활성화시키는 ptsI 에서 프레임-시프트 돌연변이가 함유된다. 글루코오스를 전달할 수 있는 양성자 공수송체를 인코딩하는 galP의 발현은 20배까지 증가되었다. GalP 및 본래의 글루코키나아제의 증가된 발현은 PEP 인산화반응보다 ATP를 사용함으로써 글루코오스 포스포트랜스페라아제 시스템을 기능적으로 대체할 수 있다(Wang et al., 2006; Yi et al., 2003; Flores et al., 2007). 이러한 교환은 석시네이트를 사용하여 카르복실화 및 산화 환원 반응의 균형에 이용가능한 PEP의 풀 사이즈(pool size)를 증가시키기 위한 에너지-효율 방법을 준수한다(도 11). 개선된 균주 모두는 4-탄소 프러덕트(말레이트와 석시네이트)로 글루코오스 탄소의 반 이상을 가리키고, 산화 환원 반응의 균형을 위한 PEP의 반 이상을 필요로 한다. 피루베이트는 PPi 및 AMP의 형성으로 ATP에 의해 PEP로 전환될 수 있지만, 에너지는 이러한 프로세스에 의해 낭비된다. 따라서, ptsI 돌연변이 및 galP의 발현은, 대사 진화 동안 성장 이익을 제공하는, 석시네이트로 글루코오스를 대사하는 에너지 효율이 증가된다.
성장의 개선을 위한 선택으로 대사 진화와 석시네이트를 제외하고 NADH 산화를 위한 다른 경로의 제거는 악티노바실러스 석시노제네스(Actinobacillus succinogenes) 및 만헤이미아 석시니프로두센스(Mannheimia succiniciproducens )와 같은 석시네이트-생성 반추위세균(succinate-producing rumen bacteria)과 기능적으로 동일한 E. coli의 석시네이트-생성 균주를 야기한다(VanderWerf et al., 1997; Kim et al ., 2007; Martin, 1994; McKinlay et al ., 2008). OAA는 에너지-보존 PEP-카르복시키나아제를 사용하여 생성한다. PEP는 글루코오스 흡수를 위한 PEP-의존 포스포트랜스페라아제 시스템(PEP-dependent phosphotransferase system)보다 글루코오스 투과 효소(permeases)(및 글루코키나아제)를 사용함으로써 에너지-소비 재생(2-ATP 등가물(equivalents))을 위한 요구를 없애기 위해 보존되었다. 다른 발효 프러덕트를 생성하기 위한 반추위세균 중, 포스포트랜스페라아제 시스템은 글루코오스 흡수에 널리 사용된다는 것을 주목해야 한다(Martin, 1994). 석시네이트 생성을 위한 가장 유망한 E. coli 균주, KJ060 및 KJ073은 가장 본래의 석시네이트-생성 반추위세균, 악티노바실러스 석시노제네스(Actinobacillus succinogenes)와 비교하여, 글루코오스(Jantama et al ., 2008a) 몰당 1.2몰 석시네이트의 수율로 약 700 mM 석시네이트를 생성했다(Guettler et al., U.S. Pat. No. 5,505,004).
E. coli에서 글루코오스로부터 석시네이트 생성이 개선된 에너지 보존 방법은 균주 엔지니어링에서 다른 중요한 문제점이 적용될 수 있다. 글리세롤은 바이오-디젤(bio-diesel) 생성의 글로발 증가에 기인한 저렴한 공급이 적절하다. 글루코오스보다 더욱 감소된, 각각의 글리세롤은 석시네이트로 전환되고, 산화 환원 반응의 균형을 유지할 수 있다. 그러나, 본래의 에너지-소비 카르복실화 활성, PEP 카르복실라아제를 사용하여 석시네이트로의 글리세롤 대사 동안 생성되는 전체 ATP는 없다. 이러한 문제점은 에너지-보존 PEP 카르복시키나아제를 사용함으로써 해결해야 하고, 석시네이트 당 1 ATP의 전체를 형성시켜야 한다. 또한, 카르복실화 프러덕트, OAA는 다수의 다른 중요한 발효 프러덕트, 예컨대 말산, 푸마르산, 아스파르트산, 리신, 트레오닌, 메티오닌, 등의 전구체로서 작용하는, 세포 대사에서 중요한 중간체이다. 당업자는, 여기에 설명되는 에너지 보존 방법은 산업적으로 매우 중요한 화학물질의 프러덕트를 위한 생체 촉매를 개발하고 개선하는데 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
실시예 4
무기질 염 배지에서 석시네이트 생성을 위한 리엔지니어링 E. coli
본 연구에 사용되는 균주는 표 16에 나타냈다. 본 발명의 경로 동안 발달되는 각종 균주의 구성동안 사용되는 플라스미드 및 프라이머는 표 15에 나타냈다.
E. coli에서 혼합산 경로의 조사는 석시네이트, 락테이트, 및 에탄올을 야기하는 NADH 산화를 위한 3가지 주요 경로를 나타낸다(도 14). NADH 산화를 위한 이들 경쟁적 경로가 제거된 유전자 제거는 석시네이트로의 직접적인 탄소 흐름에 불충분하다(표 16). adhE의 제거 후 작은 증가를 제외하고, 이들 유전자 각각의 제거는 친주(ATCC 8739)와 비교하여 세포 수율에 거의 영향을 미치지 않는 NBS 무기질 염 배지에서 발효 동안 석시네이트 생성 및 수율이 감소한다. 다른 NADH 경로(ldhA 와 adhE 또는 ldhA 와 pflB)의 제거는 NBS 무기질 염 배지에서 성장, 석시네이트 수율, 및 석시네이트 생성을 실질적으로 감소시킨다.
매우 다른 결과가 루리아 브로스(Luria broth)에서 관찰되었다(표 16). 석시네이트 수율의 보통의 증가는 ldhA 에서 제거를 함유하는(단독으로 또는 조합으로) 모든 균주에서 발견되었다. 또한, 성장은 이중 돌연변이체 및 삼중 돌연변이체에서 감소되었다. 이들 제거 중 어느 것도 무기질 염 배지 또는 복합 배지에서 석시네이트로 글루코오스 탄소의 충분한 양을 전용(redirect)하기에 충분하지 않다. E . coli 에서 본래의 혼합산 경로의 관찰 분석에 기초한 석시네이트 생성을 위해 구성된 제거된 균주는 복합 배지에서 예상된 것보다 덜 생산적이고, NBS 무기질 염 배지에서 성공적이지 못하다.
이전 조사(Jantama et al, 2008a; Jantama et al, 2008b)에서는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK) 활성이 증가되고, 많은 추가적인 돌연변이의 존재하에 글루코오스로부터 석시네이트 생성이 증가된 프로모터 돌연변이(ATG 개시부에 대해 -64에서 G to A; pck *로 나타냄)가 발견되었다. pck는 글루코오스에 의해 보통 억제되고, 유기산의 호기성 대사 동안 주로 글루코오스신생합성으로 작용하는 것으로 보이기 때문에 놀랍다(Kao et al., 2005; Keseler et al., 2005; Oh et al.. 2002; Unden & Kleefeld, 2004; Wu et al ., 2007). 이것을 더 조사하기 위해, pck 유전자(리보솜 결합 부위, 코딩 및 터미네이터 영역)를 lac 프로모터의 제어하에 pck 발현으로 pLOI4677을 생성하기 위해 pCR2.1-TOPO로 증폭하고 클로닝했다. 이 플라스미드는 ATCC 8739로 형질전환되었다. 또한, ATCC 8739에서 본래의 pck 유전자는 XZ632를 구성하기 위해 돌연변이 pck * 유전자로 대체된다. 글루코오스 발효는 NBS 무기질 염 배지를 사용하여 균주들에서 조사되었다.
pck * 의 도입은 본래의 pck 유전자를 함유하는 동질 유전자 균주와 비교하여 석시네이트 수율 및 생성이 보통의 증가를 야기한다(표 16). PCK 활성은 친주와 비교하는 경우에 IPTG-유도된 프로모터 하에서 pck * 유전자를 함유하는 플라스미드를 갖는 친주 및 XZ632 균주에서 8배 증가된 것이 발견되었다. 염색체 통합시, 단복제 pck* 는 IPTG-유도된 프로모터 하에서 pck * 유전자를 함유하는 다복제 플라스미드만큼 PCK 생성에 거의 효과적이다. 석시네이트 수율 및 생성의 보통의 개선은 친주 ATCC 8739 균주와 비교하여 PCK 활성이 증가된 균주들에서 관측되었다(표 17). 그러나, 증가된 PCK 활성만으로 석시네이트로 글루코오스 탄소를 전용(redirect)하는 것은 불충분하다.
pck * 돌연변이는 NADH 산화의 경로가 제거된 다른 돌연변이와 비교하여 시험되었다(표 18). 또한, NADH 산화 및 증가된 PCK 활성에 대한 경쟁적인 경로를 제거하기 위한 돌연변이의 조합된 작용은 석시네이트로 글루코오스 탄소를 실질적으로 전용하기에 불충분하다.
포스포에놀피루베이트-의존 포스포트랜스페라아제 시스템은 E. coli 에서 글루코오스 흡수를 위한 주요 메카니즘 및 글루코오스 이화대사 억제 시스템의 통합 부분이다(Keseler et al., 2005; Postma et al., 1996). 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이, ptsI (1673 bp 위치에서 단독 염기쌍 제거(single base-pair deletion))의 카르복실 말단 내에 프레임-시프트 돌연변이는 대사 진화의 결과로 균주 KJ060, KJ071 및 KJ073을 생성하는 석시네이트에서 발견되었다. 이 돌연변이는 포스포트랜스페라아제 시스템의 기능을 억제할 것으로 예상된다(Postma et al., 1996). 이 돌연변이에 있어서, 글루코오스 흡수는 galP (galactose permease) 및 glk (glucokinase)에 의해 기능적으로 대체된다(Hernandez-Montalvo et al., 2003; Keseler et al ., 2005). 석시네이트 생성에 대한 ptsI 의 억제 효과를 조사하기 위해, ptsI의 카르복시-터미널 175bp는 균주 XZ650을 얻기 위해 야생형 E. coli ATCC 8739에서 제거된다. 놀랍게도, 석시네이트 생성 및 수율은 친주와 비교하여 돌연변이에 의해 감소된다(표 18).
2개의 접근법은 lac 프로모터 (플라스미드 pLOI4677)로부터 오버 발현된 본래의 pck 또는 pck * 돌연변이를 사용하여 고레벨의 PCK와 ptsI 절단의 조합의 효과를 조사하는데 사용되었다. ptsI 절단과의 조합에 있어서, 접근법 모두는 석시네이트 생성을 급격히 증가시킨다(표 18). 균주 XZ647 (pck*, DptsI)는 글루코오스 몰당 석시네이트 수율이 0.89몰인, 5% 글루코오스를 함유하는 NBS 무기질 염 배지 내에서 216mmol 석시네이트를 생성했고, 이는 야생형 E. coli ATCC 8739보다 4.7배 높다(표 18). XZ647 및 XZ650 (pLOI4677)을 사용하여, 포르메이트, 에탄올 및 소량의 락테이트가 부산물로서 남아있다. 이들 두가지 변화, 포스포에놀피루베이트-의존 포스포트랜스퍼라제 시스템의 불활성화 및 PCK 활성의 증가된 레벨은 발효적 산화 환원 반응의 균형에 직접적으로 관련된 임의의 유전자를 변형시키지 않고, NBS 무기질 염 배지에서 석시네이트로 글루코오스 대사를 효과적으로 전용할 필요가 있는 코어 변화(core changes)를 나타낸다.
또한, 실험에서는 포스포트랜스페라아제 시스템에서 각종 돌연변이는 pck * 배경에서 석시네이트를 증가시킨다는 것을 확인했다. 임의의 단계에서 글루코오스의 PEP-의존 포스포트랜스페라아제 시스템의 억제는 석시네이트로 탄소의 흐름을 증가시키고, 역가 및 수율을 증가시킨다.
PEP-의존 포스포트랜스페라아제 시스템은 글루코오스 6-포스페이트를 형성하기 위해 PEP에서 PtsI, 그 후 PtsH, 그 후 PtsG, 및 그 후 글루코오스로 포스페이트를 나른다(shuttles). 표 19는, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제의 레벨을 증가시키는 pck* 돌연변이를 함유하는 균주에 있어서, 이러한 포스페이트 릴레이 시스템(ptsI , ptsH 또는 ptsG)에 관련되는 Pts 유전자 중 어느 하나에서 제2 돌연변이는 우세한 발효 프러덕트로서 석시네이트로 탄소의 흐름을 유사하게 급격한 이동을 야기한다는 것을 보여준다. 이러한 점에서, 전체 ptsI 유전자의 제거 또는 ptsI 유전자의 카르복시터미너스(carboxyterminus)의 절단은 ptsG 및 ptsH 제거보다 우수하다. ptsI 카르복시터미너스(carboxyterminus)의 절단은 ptsI의 완전한 절단보다 조금 우수하고, 최고의 석시네이트의 역가 및 수율을 형성한다. 불활성 유전자 프러덕트를 야기하는 삽입(insertions), 제거(deletions), 및 프레임-시프트(frame-shift)와 같은 다른 돌연변이는 유사한 효과를 갖는 것으로 예상된다.
균주 XZ647 (pck* △ptsI)은 우세한 발효 프러덕트로서 석시네이트를 생성하지만, 현저한 레벨의 불필요한 부산물(락테이트, 에탄올, 포르메이트, 및 아세테이트) 또한 생성된다(표 18). adhE (XZ723) 또는 pflB (XZ721)의 제거는 에탄올의 생성을 제거한다. 아세테이트 및 포르메이트의 생성은 pflB의 제거에 의해서만 현저히 감소되거나 제거된다. 생성된 균주, (XZ721)는 글루코오스 몰당 석시네이트의 몰 수율이 1.2몰인 고레벨의 석시네이트가 생성되었다.
석시네이트는 일반적으로 E. coli의 글루코오스 발효의 부산물을 나타낸다. 글루코오스 탄소의 대부분은 다른 NADH-산화 경로를 사용하여 더 적은 양의 포르메이트 및 아세테이트와 에탄올 및 락테이트로 전환된다(표 14). E . coli의 유도체는 10년 이상 동안 각종 성공으로 석시네이트 생성을 개선하기 위해 구성되었다(Donnelly et al., U.S. Pat. No. 5,770,435; Gokarn et al ., 2000; Gokarn et al., U.S. Pat. No. 6,455,284; Millard et al ., 1996; San et al., U.S. Pat. No. 7,223,567; Sanchez et al, 2005b; Sanchez et al, 2005a; Stols & Donnelly, 1997; Vemuri et al ., 2002a; Wu et al ., 2007). 이들 균주를 구성하는데 사용되는 방법은 NADH 산화를 위한 경쟁적 경로의 제거에 일반적으로 초점을 맞춘다(Donnelly et al., U.S. Pat. No. 5,770,435; Gokarn et al., U.S. Pat. No. 6,455,284; San et al., U.S. Pat. No. 7,223,567; Sanchez et al ., 2005b; Sanchez et al . 2005a; Vemuri et al ., 2002a; Wu et al ., 2007). 제거용 표적 유전자는 경로의 조사에 기초하여 주로 선택된다(도 14). 그러나, 이러한 방법의 성공은 복합 배지 및 2단계(호기성 성장 단계 후 혐기성 생성 단계) 프로세스에 한정된다(Donnelly et al., U.S. Pat. No. 5,770,435; Gokarn et al., U.S. Pat. No. 6,455,284; Millard et al ., 1996; San et al., U.S. Pat. No. 7,223,567; Sanchez et al ., 2005b; Sanchez et al ., 2005a; Vemuri et al ., 2002a; Wu et al ., 2007).
루리아 브로스와 같은 복합 배지에 있어서, 성장의 생합성적 필요의 대부분은 영양성분(효모 추출액 및 트립톤)에서 중간체 및 빌딩 블럭 분자에 의해 공급된다. 이 배지에 있어서, 발효 경로의 관찰에 기초한 유전자의 제거는 일반적으로 석시네이트 생성을 개선한다(도 14; 표 16). (ldhA) 및 ldhA를 포함하는 표적 유전자의 모든 조합의 제거는 석시네이트 생성을 증가시키고, 루리아 브로스에서 발효 동안 글루코오스 당 석시네이트 수율을 증가시킨다(표 16).
NBS 또는 AM1 브로스와 같은 무기질 염 배지를 사용하여, 그러나 혼합산 발효 경로에서 동일한 표적 유전자의 제거는 유용하지 못하다. 대부분의 제거는 석시네이트 생성 및 석시네이트 수율에 해롭다. adhE의 제거 후 작은 증가를 제외하고, 단일 유전자 제거 및 혼합산 발효 경로에서 유전자 제거의 조합은 NBS 무기질 염 배지에서 석시네이트 생성 및 수율을 감소시킨다(표 17). 복합 배지(San et al., U.S. Pat. No. 7,223,567)에서 2단계(호기성 성장 단계 후 혐기성 생성 단계) 석시네이트 생성을 위해 창안된 균주의 유전적 등가물, KJ012 (ATCC 8739 △ldhA △adhE △ackA)는 NBS 무기질 염 배지에서 야생형 친구보다 석시네이트를 덜 생성한다. 이러한 결과에 기초하여, 무기질 염 배지를 사용하는 경우에, 경로의 관찰에 기초한 제거용 표적 유전자의 합리적 선택은 석시네이트 생성의 개선의 성공의 믿을 수 없는 예측 변수라고 결론내었다. 무기질 염 배지에 있어서, 탄소는 에너비 재생, 발효, 및 세포 성장에 필요한 빌딩 블럭 분자(building block molecules)의 생합성에서 정확히 분할되어야 한다.
상기 나타낸 결과가 가리키는 바와 같이, 본 발명은 무기질 염 배지에서 석시네이트 생성을 위한 균주를 구성하는 새로운 방법을 제공한다. 석시네이트로 글루코오스 탄소를 실질적으로 전용(redirect)하기 위한 E. coli 혼합산 발효 경로(도 14)를 인코딩하는 유전자에서 어떠한 돌연변이도 요구되지 않는다. 본 발명에 있어서, 주변 경로에서 2개의 코어 변화(core changes)의 조합은 석시네이트 수율을 5배 증가시킨다. 석시네이트 생성에 필요한 2개의 코어 변화는: 1) 본래의 발효적 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제(에너지 소비)를 대체하기 위해 에너지 보존(글루코네오제닉) 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제의 발현의 증가, 2) galP 및 ATP-의존 인산화 반응 (glk)과 같은 다른 투과 효소로 글루코오스 포스포에놀피루베이트-의존 포스포트랜스페라아제 시스템의 대체이다. 아울러, 이러한 변화는 성장을 위한 전체 ATP 생성이 증가되고, 카르복실화에 이용가능한 포스포에놀피루베이트의 풀(pool)이 증가되고, 석시네이트 생성이 증가되었다.
혼합산 발효 경로에서 유전자의 추가적인 돌연변이, 예컨대 pflB의 제거 및 기타는 석시네이트 수율 및 생성을 더 증가시킬 수 있는 기회를 나타낸다. 아세틸-CoA는 발효적 성장 동안 pflB에 의해 주로 생성되는 생합성에서 필수적인 대사물질임을 주목해야 한다. 이 기능은 피루베이트 탈수소효소 복합체(aceEF , lpd), 산화적 대사 동안 아세틸-CoA 생성의 우세한 경로로 일반적으로 작용하는 효소의 본래의 발현에 의해 pflB 돌연변이체에서 대체되는 것으로 추정된다(Kim et al., 2007). 무기질 염 배지에서 석시네이트 생성을 위해 최적으로 엔지니어링되는 E. coli 균주에서 생성되는 석시네이트 경로(도 14)는 석시네이트 생성 반추위세균에서 진화되는 본래의 경로와 기능적으로 유사하다(Kim et al ., 2004; Lee et al ., 2002; Lee et al ., 2006; Samuelov et al ., 1991; VanderWerf et al ., 1997).
실시예 5
글리세롤로부터 석시네이트 생성
산화 환원 반응의 특성과 글리세롤 및 글루코오스의 전달 메카니즘의 차이에도 불구하고, 무기질 염 배지에서 석시네이트로 글루코오스의 전환을 가능하게 하는 동일한 돌연변이는 석시네이트로 글리세롤의 전환의 최대 효율의 80%로 석시네이트 생성으로 글리세롤 대사를 효율적으로 전용하는데 사용될 수 있다는 것을 발견했다(소모된 글리세롤 몰당 생성된 0.8몰 석시네이트).
본 연구의 경로 동안, 이전에 아리송한 것으로 간주되던 gldA 및 PEP-의존 포스포트랜스페라아제 경로는 글리세롤 이화작용을 위한 중요한 기능적 루트를 포함한다는 것이 발견되었다(도 15). 두 경로에 있어서, 글리세롤은 확산을 용이하게 함으로써 세포로 들어간다. 세포내에서, 글리세롤의 부분은 즉시 인산화 반응 후, E. coli에서 글리세롤 대사를 위한 표준 경로로 널리 간주되는 경로, DHAP로 산화되었다. 글리세롤의 적어도 1/3은 DHAP을 얻기 위해 DHA로 gldA에 의해 우선 환원되고, 이어서 세포질 내에 작용하는 PEP-의존 포스포트랜스페라아제 시스템(ptsH, ptsI)에 의해 인산화된다는 것을 발견했다. DHAP는 흡수 및 활성 시스템에 대한 중추 대사의 공통 입구(common entry point)로 작용한다.
표 20은 석시네이트 생성을 위해 확인된 코어 돌연변이와 복합 영양성분의 첨가 없이 무기질 염 배지(NBS)에서 글리세롤로부터 석시테이트 생성을 위한 글루코오스를 조합하는 효과적임을 명백히 설명한다. pflB의 제거는 야생형 친주보다 석시네이트 생성이 감소하지만, pflB 제거와 pck (pck *; 전사 활성(transcriptional activation))에서 프로모터 돌연변이의 조합은 석시네이트 수율이 0.25 mol/mol 글리세롤에서 0.5 mol/mol 글리세롤로 두배가 되었다. 이어서 ptsI 에서 돌연변이의 첨가는 최대 이론적 수율의 80%만큼, 석시네이트 수율이 0.8몰 석시테이트/몰 글리세롤로 더 증가되었다. 또한, 유사한 결과는 인산화를 위한 인산전달 시스템의 사용을 억제하는 다른 주요 유전자(gldA , ptsH , ptsI , dhaKL , dhaM)의 제거에서 발견되었다(표 20). 이러한 결과는 예측되지 않았다. 글리세롤 전환의 얻어진 경로는 도 15에 나타냈다.
도 15는 야생형 E. coli에서 글리세롤 대사(Lin, 1996))로 일반적으로 허용되는 경로 및 혼합산 발효 경로(Bock and Sawers, 1996)의 조합을 나타낸다. 이러한 경로에 있어서, 모든 ATP는 석시네이트가 단독 프러덕트로 생성되는 경우에 글리세롤 인산화 반응에 의해 소모된다. 성장에 이용가능한 ATP는 없다. 도 15에 기초하여, pflB 의 제거는 환원제 및 중간체의 이용가능성을 증가시킴으로써 석시네이트 생성을 증가시킬 것으로 예상된다. 이러한 예상과는 반대로, 석시네이트 생성의 감소는 pflB 유전자의 제거로 발견되었다(표 20). 이러한 경로에 기초하여, 글루코오스신생합성 동안에만 보통 기능하는 pck 유전자의 돌연변이적 활성은, 예측되지 않은 것과는 달리 PCK 발현에서 이러한 증가가 석시네이트로의 당 발효에 유용하다는 특허 출원에서의 이전 발견에 기초하여 피루베이트 키나아제와 경쟁함으로써 석시네이트로 포스포에놀피루베이트의 흐름을 증가시킬 것이 예상될 수 있다. 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제(ppc) 대신에 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(pck)의 사용은 생합성에 사용될 수 있는 추가적인 ATP로서 포스포에놀피루베이트로부터 에너지를 보존하는 추가적인 이점을 갖는다.
ptsI 에서 돌연변이가 석시테이트로 글루코오스로부터 탄소의 전환(diversion)에 유용하지만, 야생형 E. coli (glpF)에서 기능적으로 인식되는 글리세롤 흡수 시스템만이 포스포에놀피루베이트 포스포트랜스페라아제 시스템을 포함하지 않기 때문에, 어떠한 이점이 예상될 수 없다(Keseler et al., 2005; Lin, 1996.). 글리세롤 대사에 있어서 포스포트랜스페라아제 시스템의 오직 알려진 관련성은 야생형 E. coli에서 불활성인 것으로 생각되는 부 경로내이다(The only known involvement of the phosphotransferase system in glycerol metabolism is within a minor pathway thought to be inactive in wild type E. coli(Jin et al., 1983:; Lin, 1996; Tang et al ., 1982)). 이 부 경로(minor pathway)는 우선 GldA을 갖는 디히드록시아세톤(DHA)을 세포간 글리세롤을 환원한 후, 디히드록시아세톤-포스페이트(DHAP)를 생성하기 위해 세포간 DHA의 인산화 반응과 포스포에놀피루베이트를 결합하는 포스페이트 캐리어로서 PtsH (ptsH) 및 EI (ptsI)를 사용한다. 이 경로는 돌연변이체 균주에서만 기능하는 것으로 생각되고, glpK는 불활성이다(Gutknecht et al ., 2001; Keseler et al ., 2005). 글리세롤 대사를 위해 일반적으로 허용되는 경로에 기초한 모든 기대와는 반대로, ptsI의 돌연변이는 글리세롤로부터 석시네이트의 생성이 현저히 증가된다. 이러한 결과는 글리세롤 탈수소효소(gldA) 및 PTS 포스포-릴레이 시스템(포스포에놀피루베이트, PtsH , PtsI)은 NBS 무기질 염 배지 내에서 글리세롤의 혐기성 발효 동안 디히드록시아세톤 포스페이트(DHAP)로 글리세롤의 이화작용에 대한 중요성이 예측되지 않는다는 것을 가리킨다. 석시네이트 수율의 큰 증가에 기초하여, 이러한 디히드록시아세톤(DHA) 경로는 해당과정으로 글리세롤 흐름의 적어도 1/3을 설명하는 것이 예측될 수 있다. ptsI의 제거는 이러한 경로를 불활성화시키고, 석시네이트 생성을 위한 포스포에놀피루베이트의 이용가능성을 증가시킨다. 아울러, 이들 3개의 코어 돌연변이(pck*, ptsI, pflB))는 무기질 염 배지에서 혐기성 발효 동안 최대 이론적 수율의 80%에서, 석시네이트로 글리세롤로부터의 탄소 흐름을 효율적으로 및 예상외로 전용했다(도 15). 또한, 이러한 경로의 사용은 ATP 생성을 중요하게 증가시키고, 성장을 가능하게 하였다.
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SEQUENCE LISTING <110> University of Florida Research Foundation, Inc. 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SfPBXPS sense/comp <400> 41 atagtcccgg gattaattaa tctcgagata gtggatccat taattaatgg cgcctacat 59 <210> 42 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for WMadhE A/C <400> 42 atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtcggca cgtaagaggt 60 tccaa 65 <210> 43 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for WMadhE A/C <400> 43 ttaagcggat tttttcgctt ttttctcagc tttagccgga gcagcacact gcttccggta 60 gtcaa 65 <210> 44 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for WMldhA A/C <400> 44 atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacggcac gtaagaggtt 60 ccaa 64 <210> 45 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for WMldhA A/C <400> 45 ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgctacact gcttccggta 60 gtcaa 65 <210> 46 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for WMpflB A/C <400> 46 ttactccgta tttgcataaa aaccatgcga gttacgggcc tataacggca cgtaagaggt 60 tccaa 65 <210> 47 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<220> <223> Primer set for citF-2/3 <400> 54 ggtgatcgat gttgtgcatc 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for citF-2/3 <400> 55 cccgttcttg tcgttgagat 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for IO-adhE-up/down <400> 56 gctgctccgg ctaaagctga 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for IO-adhE-up/down <400> 57 acgctctacg agtgcgttaa 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for up-focA/Mid-pflB <400> 58 agatcgccag ccgctgcaat 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for up-focA/Mid-pflB <400> 59 aaccgttggt gtccagacag 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for IO-ycaO-up/IO-midpflB-down <400> 60 gcctacattg cgtaggctat 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for IO-ycaO-up/IO-midpflB-down <400> 61 gcagcaggac gttattactc 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for ldhA-A/C <400> 62 atgaaactcg ccgtttatag 20 <210> 63 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for ldhA-A/C <400> 63 ttaaaccagt tcgttgccc 19 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for IO/ldhA-up/down <400> 64 cgttcgatcc gtatccaagt 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for IO-ldhA-up/down <400> 65 aggctggaac tcggactact 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for aspC-up/down <400> 66 tccatcgctt acaccaaatc 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for aspC-up/down <400> 67 tgggggatga cgtgatattt 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for aspC-1/2 <400> 68 agataacatg gctccgctgt 20 <210> 69 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for aspC-1/2 <400> 69 aggagcggcg gtaatgttc 19 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for sfcA-up/down <400> 70 ctatgcttga tcggcaacct 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for sfcA-up/down <400> 71 acgatcgcct ggttttaatg 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for sfcA-1/2 <400> 72 taccgccgta cctccatcta 20 <210> 73 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for sfcA-1/2 <400> 73 cgtaagggat ataaagcgaa cg 22 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for ackA-up/pta-down <400> 74 cgggacaacg ttcaaaacat 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for ackA-up/pta-down <400> 75 attgcccatc ttcttgttgg 20 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for ackA-2/pta-2 <400> 76 aactaccgca gttcagaacc a 21 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for ackA-2/pta-2 <400> 77 tctgaacacc ggtaacacca 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> pck-Pro-up <400> 78 cacggtagca acaacattgc 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pck-Pro-down <400> 79 agaaagcgtc gacaacgaac 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pck-Pro-1 <400> 80 atgcgcgtta acaatggttt 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pck-Pro-2 <400> 81 atggataacg ttgaactttc 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ptsI-D-up <400> 82 cgcattatgt tcccgatgat 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ptsI-D-down <400> 83 gcctttcagt tcaacggtgt 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ptsI-D-1 <400> 84 cggcccaatt tactgcttag 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ptsI-D-2 <400> 85 atccccagca acagaagtgt 20 <210> 86 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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crp-S-down <400> 131 aatcgtaatt cgccaagcat 20 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cpdA-S-up <400> 132 gaagtgtgtt caagccagca 20 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cpdA-S-down <400> 133 aggacaatgg attccagcag 20 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ygiF-S-up <400> 134 atcagtgtcg ctacgcaaag 20 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ygiF-S-down <400> 135 gctgtcctgc acaaaatcac 20 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sxy-S-up <400> 136 tttacttgct gcggatgaga 20 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sxy-S-down <400> 137 tatctcagcc ctcggtgctc 20 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> csrA-up <400> 138 cagcgttagc cagtgtgaaa 20 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> csrA-down <400> 139 acgcctctta cgagtgcttc 20 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> csrB-S-up <400> 140 ctgtaggaga tcgccaggaa 20 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> csrB-S-down <400> 141 tctaacaaat cgtgcattcg 20 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> csrC-S-up <400> 142 gccatacgct ttgtgagaca 20 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> csrC-S-down <400> 143 agtcacgccc aatggaatag 20 <210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> csrD-S-up1 <400> 144 atgtgcatga tggattggaa 20 <210> 145 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> csrD-S-down1 <400> 145 cggtatcctg accactacgc 20 <210> 146 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> csrD-S-up2 <400> 146 gtgattttgc tgcgctgtta 20 <210> 147 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> csrD-S-down2 <400> 147 acaaggcgca aaaatcatct 20 <210> 148 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> uvrY-s-up1 <400> 148 cctcgtcatg ttgcaatgaa 20 <210> 149 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> uvrY-s-down1 <400> 149 tatcatcgcg tagcaaaacg 20 <210> 150 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> barA-s-up1 <400> 150 ttttgcttcg ctgctgtaaa 20 <210> 151 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> barA-s-down1 <400> 151 tcaggcacgt cgcttttaat 20 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> barA-s-up2 <400> 152 cgcgatcacc tgaatacgat 20 <210> 153 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> barA-s-down2 <400> 153 ctggctggac gttcgataac 20 <210> 154 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> barA-s-up3 <400> 154 tggcctatgt cgaaccaaac 20 <210> 155 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mlc-s-up1 <400> 155 ctggcaaata acccgaatgt 20 <210> 156 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mlc-s-down1 <400> 156 ccagggcatc tttattacgc 20 <210> 157 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mlc-s-up2 <400> 157 tgaaactgaa gcctggcact 20 <210> 158 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XZ-ldhA-up <400> 158 gataacggag atcgggaatg 20 <210> 159 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XZ-ldhA-down <400> 159 ctttggctgt cagttcacca 20 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XZ-ldhA-1 <400> 160 tctggaaaaa ggcgaaacct 20 <210> 161 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XZ-ldhA-2 <400> 161 tttgtgctat aaacggcgag t 21 <210> 162 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PflB-up2 <400> 162 tgtccgagct taatgaaaag tt 22 <210> 163 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PflB-down2 <400> 163 cgagtaataa cgtcctgctg ct 22 <210> 164 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PflB-5 <400> 164 aaacgggtaa caccccagac 20 <210> 165 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PflB-6 <400> 165 cggagtgtaa acgtcgaaca 20 <210> 166 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adhE-up <400> 166 catgctaatg tagccaccaa a 21 <210> 167 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adhE-down <400> 167 ttgcaccacc atccagataa 20 <210> 168 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adhE-1 <400> 168 tccggctaaa gctgagaaaa 20 <210> 169 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adhE-2 <400> 169 gtgcgttaag ttcagcgaca 20 <210> 170 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pck-Pro-up <400> 170 cacggtagca acaacattgc 20 <210> 171 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pck-Pro-down <400> 171 agaaagcgtc gacaacgaac 20 <210> 172 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pck-Pro-1 <400> 172 atgcgcgtta acaatggttt 20 <210> 173 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pck-Pro-2 <400> 173 atggataacg ttgaactttc 20 <210> 174 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pck-P-2 <400> 174 ttcactgctc cttagccaat 20 <210> 175 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ptsI-D-up <400> 175 cgcattatgt tcccgatgat 20 <210> 176 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ptsI-D-down <400> 176 gcctttcagt tcaacggtgt 20 <210> 177 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ptsI-D-1 <400> 177 cggcccaatt tactgcttag 20 <210> 178 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ptsI-D-2 <400> 178 atccccagca acagaagtgt 20 <210> 179 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ptsG-up <400> 179 gaagaactgg cgcaggtaac 20 <210> 180 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ptsG-down <400> 180 aaggaaacgc cgttaatcct 20 <210> 181 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ptsG-1 <400> 181 cctgaaaacc gagatggatg 20 <210> 182 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ptsG-2 <400> 182 catcagcgat ttaccgacct 20 <210> 183 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ptsH-D-up <400> 183 atgttccagc aagaagttac cattaccgct ccgaacggtc tgcacgtgta ggctggagct 60 gcttc 65 <210> 184 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ptsH-D-down <400> 184 ttactcgagt tccgccatca gtttaaccag atgttcaacc gctttcatat gaatatcctc 60 cttag 65 <210> 185 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ptsI-D-up <400> 185 atgatttcag gcattttagc atccccgggt atcgctttcg gtaaagtgta ggctggagct 60 gcttc 65 <210> 186 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ptsI-D-down <400> 186 ttagcagatt gttttttctt caatgaactt gttaaccagc gtcatcatat gaatatcctc 60 cttag 65 <210> 187 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gldA-up <400> 187 tgtatatagc gccgcacaag 20 <210> 188 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gldA-down <400> 188 gatggcaagg ttggtattgg 20 <210> 189 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gldA-1 <400> 189 accagtacgg tcagcgtttc 20 <210> 190 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gldA-2 <400> 190 acccggtgat tgaataatgc 20 <210> 191 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dhaKL-D-up <400> 191 atgaaaaaat tgatcaatga tgtgcaagac gtactggacg aacaatgtag gctggagctg 60 cttc 64 <210> 192 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dhaKL-D-down <400> 192 ttactctttt gcggctaacg ccaacatttg catcataaac atcaccatat gaatatcctc 60 cttag 65 <210> 193 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dhaM-D-up <400> 193 gtgatggtaa acctggtcat agtttcacat agcagccgac tgggatgtag gctggagctg 60 cttc 64 <210> 194 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dhaM-D-down <400> 194 ttaaccctga cggttgaaac gttgcgtttt aacgtccagc gttagatatg aatatcctcc 60 ttag 64

Claims (45)

  1. 증가된 레벨의 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제(phosphoenol pyruvate carboxykinase)(pck) 유전자 전사물(transcripts)을 포함하는 세균 세포(bacterial cell)로서:
    상기 전사물은 활성 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제(PCK)를 인코딩하고, 상기 세포는 증가된 PCK 활성을 나타내는, 세균 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세균 세포는 비반추동물 세균 세포(non-ruminant bacterial cell)인, 세균 세포.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세균은 대장균(Escherichia coli), 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans), 글루코노박터 아사이(Gluconobacter asaii), 아크로모박터 델마르베(Achromobacter delmarvae), 아크로모박터 비스코서스(Achromobacter viscosus), 아크로모박터 락티컴(Achromobacter lacticum), 아그로박테리움 투미펙션즈(Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter), 알칼리제니즈 페칼리스(Alcaligenes faecalis), 아트로박터 시트레우스(Arthrobacter citreus), 아트로박터 투메센스(Arthrobacter tumescens), 아트로박터 파라피너스(Arthrobacter paraffineus), 아트로박터 히드로카르보글루타미커스(Arthrobacter hydrocarboglutamicus), 아트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxydans), 아우레오박테리움 사퍼르데(Aureobacterium saperdae), 아조박터 인디서스(Azotobacter indicus), 브레비박테리움 암모니아제네스(Brevibacterium ammoniagenes), 디바리카툼(divaricatum), 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 글로보섬(Brevibacterium globosum), 브레비박테리움 퍼스컴(Brevibacterium fuscum), 브레비박테리움 케토글루타미컴(Brevibacterium ketoglutamicum), 브레비박테리움 헬콜럼(Brevibacterium helcolum), 브레비박테리움 퍼실륨(Brevibacterium pusillum), 브레비박테리움 테스타세움(Brevibacterium testaceum), 브레비박테리움 로세움(Brevibacterium roseum), 브레비박테리움 임마리오필리움(Brevibacterium immariophilium), 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens), 브레비박테리움 프로토파미애(Brevibacterium protopharmiae), 코리네박테리움 아세토필럼(Corynebacterium acetophilum), 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 칼루네(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 아세토애시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 아세토글루타미컴(Corynebacterium acetoglutamicum), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 에르위니아 카로토보라(Erwinia carotovora), 에르위니아 헤르비콜라(Erwinia herbicola), 에르위니아 크리산테미(Erwinia chrysanthemi), 플라보박테리움 페레그리넘(Flavobacterium peregrinum), 플라보박테리움 퍼카툼(Flavobacterium fucatum), 플라보박테리움 아우란티넘(Flavobacterium aurantinum), 플라보박테리움 레나넘(Flavobacterium rhenanum), 플라보박테리움 세워넨스(Flavobacterium sewanense), 플라보박테리움 브레베(Flavobacterium breve), 플라보박테리움 메닌고셉티컴(Flavobacterium meningosepticum), 마이크로코쿠스(Micrococcus) sp. CCM825, 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii), 노카디아 오파카(Nocardia opaca), 노카디아 루고사(Nocardia rugosa), 플라노코커스 유시나터스(Planococcus eucinatus), 프로테우스 레테게리(Proteus rettgeri), 프로피오니박테리움 스헤르만니(Propionibacterium shermanii), 슈도모나스 신젠타(Pseudomonas synxantha), 슈도모나스 아조토포르만스(Pseudomonas azotoformans), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis), 슈도모나스 스터트제리(Pseudomonas stutzeri), 슈도모나스 애시도볼란스(Pseudomonas acidovolans), 슈도모나스 무시도렌스(Pseudomonas mucidolens), 슈도모나스 테스토스테로니(Pseudomonas testosteroni), 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 로도코커스 에리스로폴리스(Rhodococcus erythropolis), 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous), 로도코커스(Rhodococcus) sp. ATCC 15592, 로도코커스(Rhodococcus) sp. ATCC 19070, 스포로사르시나 우레에(Sporosarcina ureae), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 비브리오 메치니코비(Vibrio metschnikovii), 비브리오 티로제네스(Vibrio tyrogenes), 악티노마두라 마두레(Actinomadura madurae), 악티노미세스 비오라세오크로모제네스(Actinomyces violaceochromogenes), 키타사토스포리아 파루로사(Kitasatosporia parulosa), 스트렙토미세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor), 스트렙토미세스 플라벨러스(Streptomyces flavelus), 스트렙토미세스 그리설러스(Streptomyces griseolus), 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토미세스 올리바세우스(Streptomyces olivaceus), 스트렙토미세스 타나시엔시스(Streptomyces tanashiensis), 스트렙토미세스 버지니에(Streptomyces virginiae), 스트렙토미세스 안티바이오티커스(Streptomyces antibioticus), 스트렙토미세스 카카오이(Streptomyces cacaoi), 스트렙토미세스 라벤둘레(Streptomyces lavendulae), 스트렙토미세스 비리도크로모제네스(Streptomyces viridochromogenes), 아에로모나스 살로모니시다(Aeromonas salmonicida), 바실러스 퍼밀러스(Bacillus pumilus), 바실러스 서컬란스(Bacillus circulans), 바실러스 티아미놀리티커스(Bacillus thiaminolyticus), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리퀴페시엔스(Bacillus amyloliquifaciens), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 에세리키아 프레운디(Escherichia freundii), 마이크로박테리움 암모니아필럼(Microbacterium ammoniaphilum), 세라티아 마르세스센스(Serratia marcescens), 살모넬라 티피무리엄(Salmonella typhimurium), 살모넬라 스코트물레리(Salmonella schottmulleri), 또는 잔토모나스 시트리(Xanthomonas citri)인, 세균 균주(bacterial strain).
  4. 제1항에 있어서,
    상기 증가된 레벨의 pck 전사물은, 본래의 조절 서열(native regulatory sequences)에서 pck 전사를 증가시키는 pck 유전자의 변화된 조절 서열(altered regulatory sequences)로의 대체에 의한 것인, 세균 세포.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 조절 서열은 상기 pck 유전자의 프로모터 영역(promoter region)내에 있는, 세균 세포.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 증가된 레벨의 pck 전사물은, pck 유전자의 프로모터 영역(promoter region)내에서 하나 이상의 돌연변이에 기인한 것인, 세균 세포.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 하나 이상의 변이는 pck 유전자 개시 코돈(start codon)의 위치 68 업스트림(position 68 up stream)에서 뉴클로티드 A가 뉴클레오티드 G로 대체되는 것을 포함하는 점 돌연변이(point mutation)인, 세균 세포.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 증가된 레벨의 pck 전사물은, 본래의 프로모터 시퀀스에서 외인성 프로모터 시퀀스(exogenous promoter sequence)로의 대체에 의한 것인, 세균 세포.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 외인성 프로모터는 항시 발현 프로모터(constitutive promoter)인, 세균 세포.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 외인성 프로모터는 유도성 프로모터(inducible promoter)인, 세균 세포.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 유도성 프로모터는 lac 프로모터인, 세균 세포.
  12. 제1항에 있어서,
    PEP-의존 포스포트랜스페라아제 시스템(phosphotransferase system)의 기능을 저해하는 하나 이상의 유전자 변형(genetic modification)을 더 포함하는, 세균 세포.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 유전자 변형은 PEP-의존 포스포트랜스페라아제 시스템의 구조적 성분을 코딩하는 하나 이상의 유전자 내에 있는, 세균 세포.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 유전자 변형은 PEP-의존 포스포트랜스페라아제 시스템의 발현을 조절하는 프로테인을 코딩하는 하나 이상의 유전자 내에 있는, 세균 세포.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 유전자 변형은 ptsG, ptsH, ptsI, crr 및 crp로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 내에 있는, 세균 세포.
  16. 제1항에 있어서,
    (a) PEP-의존 포스포트랜스페라아제 시스템의 기능을 저해하는 하나 이상의 유전자 변형; 및 (b) 당 수송체(sugar transporter)를 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 하나 이상의 유전자 변형을 더 포함하는, 세균 세포.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 당 수송체는 ATP 결합 카셋 수송체(ATP binding cassette transporter)의 구성 요소인, 세균 세포.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 당 수송체는 MFS(major facilitator super family)의 구성 성분인, 세균 세포.
  19. 제1항에 있어서,
    발효적 경로(fermentative pathway)에 관련되는 하나 이상의 유전자에서 유전자 발현의 불활성(inactivation)을 야기하는 유전자 변형(genetic modification)을 더 포함하는, 세균 세포.
  20. 제1항에 있어서,
    adhE, ldhA, focA, pflA, ack, pta, pdh, mgsA, tdcD, tdcE 및 poxB로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에서 유전자 발현의 불활성을 야기하는 유전자 변형을 더 포함하는, 세균 세포.
  21. 제1항에 있어서,
    (a) PEP-의존 포스포트랜스페라아제 시스템의 기능을 저해하는 하나 이상의 유전자 변형; 및 (b) 발효적 경로에 관련되는 하나 이상의 유전자에서의 돌연변이(mutation)를 더 포함하는, 세균 세포.
  22. 제1항에 있어서,
    (a) ptsG, ptsH, ptsI, crr 및 crp로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자에서의 유전자 변형; 및 (b) adhE, ldhA, focA, pflA, ack, pta, pdh, mgsA, tdcD, tdcE 및 poxB로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자에서 유전자 발현의 불활성을 야기하는 유전자 변형을 더 포함하는, 세균 세포.
  23. 제1항에 있어서,
    TCA 사이클의 작동과 관련된 하나 이상의 유전자에서의 유전자 변형을 더 포함하는, 세균 세포.
  24. 제1항에 있어서,
    mdh, fumA, fumB, fumC, frdABCD, acceAB, acnAB, icd, iclR, aspC, 및 scfA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자에서의 유전자 변형을 더 포함하는, 세균 세포.
  25. 제1항에 있어서,
    (a) ptsG, ptsH, ptsI, crr 및 crp로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자에서의 유전자 변형; (b) adhE, ldhA, focA, pflA, ack, pta, pdh, mgsA, tdcD, tdcE 및 poxB로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자에서 유전자 발현의 불활성을 야기하는 유전자 변형; 및 (c) mdh, fumA, fumB, fumC, frdABCD, acceAB, acnAB, icd, iclR, aspC, 및 scfA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자에서의 유전자 변형을 더 포함하는, 세균 세포.
  26. 제1항에 있어서,
    포스포에놀 피루베이트 카르복실라아제(phosphoenol pyruvate carboxylase), NADH 의존 말산 효소(malic enzyme) 및 NADPH 의존 말산 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자에서의 유전자 변형을 더 포함하는, 세균 균주(bacterial strain).
  27. 제1항에 있어서,
    외인성 피루베이트 카르복실라아제(exogenous pyruvate carboxylase)를 더 포함하는, 세균 균주(bacterial strain).
  28. 제27항에 있어서,
    상기 피루베이트 카르복실라아제는 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis) 또는 소르구엄 불가레(Sorghum vulgare) 또는 리코피엄 에틀리(Rhizopium etli) 유래인, 세균 균주(bacterial strain).
  29. 유전자 변형된 세균 세포(genetically modified bacterial cell)로서:
    상기 유전자 변형된 세균 세포는 XZ320, XZ332, XZ3431, XZ468, XZ469, XZ470, XZ613, XZ615, XZ616, XZ618, XZ620, XZ647, XZ7121, 또는 XZ723인, 유전자 변형된 세균 세포.
  30. (a) 불활성 ldhA; (b) 불활성 focA; (c) 불활성 pflB; (d) 불활성 ackA; (e) 불활성 mgsA; (f) 불활성 adhE; (g) 불활성 tdcD; (h) 불활성 tdcE; (i) 불활성 aspC; (j) 불활성 sfcA; (k) 불활성 ptsH; (l) 불활성 citD 및 (m) 증가된 pck를 포함하는 대장균 세균 균주(bacterial strain).
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서,
    상기 세균 균주는 2% 내지 20%(w/v) 글루코오스를 포함하는 최소의 염 배지 내에서, 글루코오스의 몰당 적어도 0.1몰의 석신산을 생성하는, 세균 세포.
  32. 이하 단계를 포함하는 석신산을 생성하는 방법:
    (a) 제1항의 세균 세포를 배양(Culturing)하는 단계;
    (b) 탄소 원료(carbon source)를 제공하는 단계;
    (c) 상기 세균이 상기 탄소 원료를 대사 작용을 하도록(metabolize) 하는 단계; 및
    (d) 석신산을 분리(Isolating)시키는 단계.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 세균 균주는 혐기성 조건(anaerobic condition), 호기성 조건(aerobic condition), 미세 호기성 조건(microaerobic condition) 또는 이들의 조합에서 배양되는, 방법.
  34. 제32항에 있어서,
    상기 세균 균주는 최소의 염 성장 배지(minimal salt growth medium) 내에서 배양되는, 방법.
  35. 제32항에 있어서,
    상기 최소의 염 성장 배지는 2% 내지 20% (w/v) 탄소 원료를 포함하는, 방법.
  36. 제32항에 있어서,
    상기 탄소 원료는 글루코오스(glucose), 프룩토오스(fructose), 자일로오스(xylose), 알비노오스(arbinose), 갈락토오스(galactose), 만노오스(mannose), 람노오스(rhamnose), 수크로오스(sucrose), 셀로비오스(cellobiose), 헤미셀룰로오스(hemicelluloses), 글리세롤(glycerol) 또는 이들의 조합인, 방법.
  37. 제32항에 있어서,
    상기 배양은 배치식(batch process) 또는 유가식(fed batch process)인, 방법.
  38. 제32항에 있어서,
    상기 배양은 연속법(continuous process)인, 방법.
  39. 제1항에 있어서,
    gldA 유전자에서 돌연변이를 더 포함하는, 세균 세포.
  40. 제1항에 있어서,
    dhaKLM 오페론(operon)에서 돌연변이를 더 포함하는, 세균 세포.
  41. 제1항에 있어서,
    (a) gldA에서의 돌연변이; 및 (b) dhaKLM 오페론(operon)에서의 돌연변이를 더 포함하는, 세균 세포.
  42. 제1항에 있어서,
    (a) gldA에서의 돌연변이; (b)dhaKLM 오페론에서의 돌연변이; 및 (c) 포스포트랜스페라아제 시스템(phosphotransferase system)에서 프로테인을 코딩하는 하나 이상의 유전자에서의 돌연변이를 더 포함하는, 세균 세포.
  43. 제1항에 있어서,
    (a) gldA에서의 돌연변이; (b) dhaKLM 오페론에서의 돌연변이; (c) 포스포트랜스페라아제 시스템에서 프로테인을 코딩하는 하나 이상의 유전자에서의 돌연변이; 및 (d) 발효적 경로와 관련되는 프로테인을 코딩하는 하나 이상의 유전자에서의 돌연변이를 더 포함하는, 세균 세포.
  44. 제1항 내지 제30항 또는 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 pck 전사물은 내생의(endogenous) pck 전사물인, 세균 세포.
  45. 친주와 비교하여 증가된 레벨의 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제(phosphoenol pyruvate carboxykinase)(pck) 유전자 전사물(transcripts) 및 a) ptsI; b) ptsI 및 pflB ; c) ptsI 및 adhE ; d) ptsI -W; e) ptsH ; f) ptsG ; g) pflB ; h) gldA ; i) dhaKL; 또는 j) dhaM의 불활성을 이끄는 하나 이상의 유전자 변형을 포함하는 세균 세포(bacterial cell).
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