ES2644820T3 - Evolución metabólica de cepas de Escherichia coli que producen ácidos orgánicos - Google Patents

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

imagen9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

genómico original. Varias técnicas necesarias para lograr los objetivos de la forma de realización preferida de la presente invención, se han descrito con detalle en Jantama et al (Biotechnology and Bioengineering 99:11401153 y Biotechnology and Bioengineering 101:881-893). La patente US nº 7.629.162 y la solicitud de patente US 2009/0148914 y las solicitudes de patente Internacional publicadas bajo el Tratado de Cooperación de Patentes con los números de publicación internacional WO 2008/115958 y WO 2010/115067, también describen las técnicas de genomanipulación útiles para practicar varias formas de realización de la presente invención.

Los microorganismos adecuados para la práctica de la presente invención, pueden cultivarse de manera aeróbica (en presencia de oxígeno) o anaeróbica (en ausencia completa de oxígeno) o microaeróbicamente (con una baja proporción de suministro de oxígeno). Alternativamente, los microorganismos adecuados para la presente invención, pueden cultivarse en un régimen de crecimiento de fase doble, en el que el microorganismo se cultiva inicialmente en una condición de cultivo aeróbico para alcanzar un cierto nivel de crecimiento celular antes de transferirlo con una condición de crecimiento anaeróbico, para lograr la producción de los ácidos orgánicos deseados en cantidades comercialmente significativas. Con el fin de realizar los microorganismos para producir un ácido orgánico particular, varias enzimas involucradas en varias rutas metabólicas microbianas, incluyendo la ruta glucolítica, el ciclo del ácido tricarboxílico (también llamado el ciclo de Krebs o el ciclo de TCA) y la atrofia del glioxilato pueden manipularse en una variedad de técnicas de genomanipulación descritas en la literatura científica y de patentes citada en el párrafo anterior. Los detalles sobre varias rutas metabólicas microbianas pueden encontrarse en los libros de texto de bioquímica estándar, tales como Principles of Biochemistry, por Lehninger y Bioquímica por Lubert Stryer.

Dependiendo del tipo de ácido orgánico preferido, las rutas metabólicas son diseñadas genéticamente, de manera que un microorganismo produzca un ácido orgánico particular de nuestra elección. Los microorganismos pueden sintetizar varios ácidos orgánicos, incluyendo ácido láctico, ácido acético y ácido succínico. El listado de las enzimas que son activas en la ruta de fermentación microbiana, que pueden manipularse utilizando las técnicas de genomanipulación conocidas incluyen, de manera no limitativa, la isocitrato sintetasa (aceA), malato sintasa (aceB), el operón de la atrofia de glioxilato (aceBAK), la acetato cinasa-fosfotransacetilasa (ackA-pta); aconitasa hidratasa 1 y 2 (acnA y acnB); acetil-CoA sintetasa (acs); alcohol deshidrogenasa (adhE); citrato sintasa (citZ); fumarato reductasa (frd); lactato deshidrogenasas (ldh); malato deshidrogenasas (mdh); represor del operón de aceBAK (iclR); fosfoenol piruvato carboxilasa (pepC); piruvato formiato liasa (pfl); piruvato oxidasa (poxB); y piruvato carboxilasa (pyc). Además de estos genes involucrados directamente en la glucólisis, el ciclo del ácido tricarboxílico y la atrofia del glioxilato de las rutas metabólicas microbianas, la manipulación genética de los genes involucrados en la captación de los compuestos de carbono útiles como una fuente de energía para la síntesis del ácido orgánico, también pueden manipularse para mejorar la captación del carbono o para mejorar la eficiencia de la utilización de energía en la producción del ácido orgánico. Por ejemplo, una disminución en la captación de la glucosa por un sistema de fosfotransferasa (PTS), ayudaría a reducir el gasto de energía en la captación de la glucosa en la célula microbiana. La energía conservada mediante la manipulación del PTS puede canalizarse para mejorar la eficiencia de la producción del ácido orgánico. Los genes del sistema de fosfotransferasa ptsH y ptsG, pueden manipularse para conservar la energía en la captación de la glucosa y, por lo tanto, mejorar la eficiencia de la producción del ácido orgánico por el microorganismo. Así, al buscar en los datos disponibles en el área de las rutas metabólicas microbianas, se puede suprimir un conjunto de genes, para bloquear la mayoría de las rutas metabólicas y canalizar el flujo de carbono a la producción de un ácido orgánico particular.

Además de las rutas metabólicas centrales y los mecanismos de captación del azúcar, las enzimas carboxilantes dentro de las células bacterianas también pueden manipularse para mejorar la producción de la fermentación del ácido orgánico. El papel de las enzimas carboxilantes en la producción de fermentación está actualmente bien establecido. Al menos cuatro diferentes tipos de enzimas carboxilantes son conocidas por resultar funcionales dentro de las células bacterianas. La fosfoenol piruvato carboxilasa (PEPcasa o PPC), carboxila el fosfoenol piruvato conduciendo a la formación de ácido oxaloacético. Las enzimas málicas carboxilan el ácido pirúvico, conduciendo a la formación de ácido málico y requiere cofactores reducidos, tales como NADH o NADPH. La tercera enzima carboxilante conocida como piruvato carboxilasa (PYC), carboxila el ácido pirúvico para producir ácido oxaloacético. La cuarta enzima carboxilante conocida como fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PCK), carboxila el fosfoenol piruvato a oxaloacetato con la producción de una molécula de ATP por cada molécula de oxaloacetato producida de la carboxilación de la molécula de fosfoenol piruvato. Cualquiera de estas enzimas carboxilantes puede también manipularse de manera apropiada en las cepas bacterianas, con la capacidad de utilizar azúcares de hexosa y pentosa de manera simultánea, para mejorar la producción de fermentación de los productos químicos industrialmente útiles.

La fosfoenolpiruvato carboxicinasa (pck) puede manipularse genéticamente para mejorar el flujo del carbono hacia el ciclo del ácido tricarboxílico. La ventaja de mejorar la actividad de la pck se debe a que esta enzima, mientras carboxila el fosfoenol piruvato a oxaloacetato, da como resultado la producción de una molécula de ATP por cada molécula de oxaloacetato producida. Un incremento en el rendimiento del ATP, incrementaría la velocidad de crecimiento de las células.

11

imagen10

imagen11

imagen12

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2