ES2343010T3 - Proceso para preparacion de l-aminoacidos que utiliza cepas de la familia enterobacteriaceas. - Google Patents
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Abstract
Un microorganismo recombinante de la familia Enterobacteriáceas que contiene un ORF yaaU sobreexpresado que codifica un polipéptido que está apostillado como un transportador de azúcar supuesto, en el cual la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica al menos en un 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo SEQ ID NO. 4, SEQ ID No. 6 y SEQ ID No. 8.
Description
Proceso para preparación de
L-aminoácidos que utiliza cepas de la familia
Enterobacteriáceas.
Esta invención se refiere a un proceso para
preparación de L-lisina, L-valina y
L-treonina, que utiliza cepas recombinantes de
microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en la cual el marco
de lectura abierto (ORF) designado yaaU está sobreexpresado, y a
dichos microorganismos.
Los L-aminoácidos, en particular
L-treonina, se utilizan en medicina humana y en la
industria farmacéutica, en la industria alimentaria y, muy
particularmente, en nutrición animal.
Es sabido que los L-aminoácidos
se pueden preparar por fermentación de cepas de Enterobacteriáceas,
en particular Escherichia coli (E. coli) y Serratia
marcescens. Debido a su gran importancia, están realizándose
continuamente esfuerzos para mejorar los métodos de preparación.
Las mejoras metodológicas pueden referirse a medidas relacionadas
con la tecnología de la fermentación, tales como la agitación o el
suministro de oxígeno, o a la composición de los medios nutrientes,
tales como la concentración de azúcar durante la fermentación, o el
acabado de la forma del producto, por ejemplo por medio de
cromatografía de intercambio iónico, o las propiedades intrínsecas
de eficiencia del microorganismo propiamente dicho.
Para la mejora de las propiedades de eficiencia
de estos microorganismos se utilizan métodos de mutagénesis,
selección y elección de mutantes. Esto da por tanto como resultado
cepas que son resistentes a antimetabolitos, tales como el análogo
de treonina ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico
(AHV), o auxótrofas para metabolitos de importancia reguladora, y
producen L-aminoácidos tales como
L-treonina.
Desde hace unos cuantos años, se han utilizado
también métodos de DNA recombinante para la mejora de las cepas
productoras de L-aminoácidos de la familia
Enterobacteriáceas por amplificación de genes individuales de
biosíntesis de aminoácidos e investigación del efecto sobre la
producción. Información recopilada sobre la biología celular y
biología molecular de Escherichia coli y Salmonella puede
encontrarse en Neidhardt (ed): Escherichia coli and
Salmonella, Cellular and Molecular Biology, 2nd edition, ASM Press,
Washington, D.C., USA, (1996).
\vskip1.000000\baselineskip
Los documentos D1-D3 describen
las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de acuerdo con SEQ
ID NO: 4, 6 y 8 de la presente solicitud, respectivamente.
- D1
- DATABASE UNI-PROT YAAU_ECOLI, 1 de noviembre de 1997 (1997-11-01),
- \quad
- XP 002321166
- \quad
- Acceso a la base de datos No. P31679
- \quad
- Resumen
- \quad
- abarca una proteína hipotética yaaU de transporte de metabolitos de Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
- D2
- DATABASE UNI-PROT Q83Q5_SHIFL
- \quad
- 1 de junio de 2003 (2003-06-01),
- \quad
- XP002321167
- \quad
- Acceso a la base de datos No. Q83SQ5
- \quad
- Resumen
- \quad
- comprende una proteína supuesta de transporte de Shigella flexneri
\vskip1.000000\baselineskip
- D3
- DATABASE UNI-PROT Q8ZRW7_SALTY
- \quad
- 1 de octubre de 2003 (2003-10-01),
- \quad
- XP002321168
- \quad
- Acceso a la base de datos no. Q8ZRW7
\newpage
- \quad
- Resumen
- \quad
- comprende una proteína supuesta de transporte de la familia MFS de Salmonella typhimurium.
\vskip1.000000\baselineskip
Los documentos D4 WO 03/076637A y (D5) WO
03/008600A describen métodos para la producción de
L-treonina por medio de sobreexpresión o deleción
de ciertos genes.
El problema a resolver en (D4) está considerado
como la provisión de un método para preparación de
L-treonina por fermentación de microorganismos de
la familia Enterobacteriáceas que comprenden un gen pepB
sobreexpresado.
El objeto de esta invención es proporcionar
nuevas medidas para mejorar la preparación de
L-aminoácidos, en particular
L-treonina.
La invención se refiere a microorganismos
recombinantes de la familia Enterobacteriáceas que contienen un ORF
yaaU sobreexpresado, que codifica un polipéptido que está
apostillado como un transportador de azúcar supuesto, y que
producen L-lisina, L-valina o
L-treonina, de una manera mejorada.
En cada caso, se utilizan como punto de partida
para la comparación los microorganismos que no son recombinantes
para el ORF yaaU, y que no contienen cantidad alguna de ORF yaaU
sobreexpresado.
Estos microorganismos recombinantes incluyen, en
particular, microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en los
cuales un polinucleótido que codifica un polipéptido cuya secuencia
de aminoácidos es al menos 90%, en particular al menos 95%,
preferiblemente al menos 98%, al menos 99%, de modo particularmente
preferible 99,7% y de modo muy particular preferible 100%, idéntico
a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo SEQ ID No. 4,
SEQ ID No. 6 y SEQ ID No. 8 está sobreexpresado.
Se da preferencia a secuencias de aminoácidos
que son idénticas a las de SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 o SEQ ID No.
8.
Dichos microorganismos contienen polinucleótidos
sobreexpresados seleccionados del grupo:
- a)
- polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7;
- b)
- polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que corresponde a SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7 dentro de los límites de la degeneración del código genético;
- c)
- secuencia de polinucleótidos que tiene una secuencia que se hibrida, en condiciones severas, con la secuencia que es complementaria a la secuencia SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7;
- d)
- polinucleótido que tiene una secuencia SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7 que contiene mutantes sentido funcionalmente neutros,
codificando los polinucleótidos un transportador
de azúcar supuesto.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere también a un proceso
para preparar por fermentación L-lisina,
L-valina o L-treonina, utilizando
microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriáceas que,
en particular, producen ya dichos L-aminoácidos y
en los cuales al menos el marco de lectura abierto (ORF) que tiene
la designación yaaU, o secuencias de nucleótidos que codifican su
producto génico, está o están sobreexpresados.
Se da preferencia a la utilización de los
microorganismos que se describen.
Cuando se mencionan
L-aminoácidos o aminoácidos en lo que sigue, esto
significa uno o más aminoácidos, con inclusión de sus sales,
seleccionados del grupo L-asparagina,
L-treonina, L-serina,
L-glutamato, L-glicina,
L-alanina, L-cisteína,
L-valina, L-metionina,
L-prolina, L-isoleucina,
L-leucina, L-tirosina,
L-fenil-alanina,
L-histidina, L-lisina,
L-triptófano, L-arginina and
L-homoserina. Se prefiere particularmente
L-treonina.
En este contexto, el término
"intensificación" describe el aumento, en un microorganismo, de
la actividad o concentración intracelular de una o más enzimas o
proteínas que están codificadas por el DNA correspondiente, estando
incrementado, por ejemplo, el número de copias del gen o genes, o
del ORF o los ORFs, al menos en una (1) copia, haciéndose uso de un
promotor fuerte enlazado operativamente al gen o de un gen o alelo u
ORF que codifica una enzima o proteína correspondiente que tiene
una actividad alta, y combinándose estas medidas en caso
apropiado.
Un segmento de una secuencia de nucleótidos que
codifica, o puede codificar, una proteína y/o un polipéptido o
ácido ribonucleico al cual ha sido incapaz de asignar función alguna
la técnica anterior se designa como un marco de lectura abierto
(ORF). Después que se ha asignado una función al segmento de
secuencia nucleotídica en cuestión, se hace referencia generalmente
a este segmento como un gen. Los alelos se entienden generalmente
como formas alternativas de un gen dado. Las formas se distinguen
por diferencias en la secuencia de nucleótidos.
En general, la proteína, o el ácido
ribonucleico, codificado por una secuencia de nucleótidos, es decir,
un ORF, un gen o un alelo, se designa como un producto génico.
Las medidas de intensificación, en particular de
sobreexpresión, aumentan generalmente la actividad o concentración
de la proteína correspondiente al menos en un 10%, 25%, 50%, 75%,
100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500%, como máximo hasta 1000% o
2000%, basada en la de la proteína de tipo salvaje o en la actividad
o concentración de la proteína en la cepa o microorganismo parental
que no es recombinante para la enzima o proteína correspondiente.
El microorganismo o cepa parental no recombinante se entiende como
el microorganismo sobre el cual se realizan las medidas de acuerdo
con la invención.
La invención se refiere a un proceso para
preparación de L-lisina, L-valina o
L-treonina por fermentación de microorganismos
recombinantes de la familia Enterobacteriáceas, caracterizado
porque
- a)
- dichos microorganismos reivindicados productores de L-aminoácidos se cultivan en un medio en condiciones en las cuales el L-aminoácido deseado está enriquecido en el medio o en las células, y
- b)
- dicho L-aminoácido se aísla, manteniéndose opcionalmente los constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o en porciones (desde \geq 0 a 100%) en el producto aislado o eliminándose por completo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los microorganismos que tienen un marco de
lectura abierto (ORF) sobreexpresado designado yaaU, y que son en
particular recombinantes, son análogamente parte de la materia que
constituye el objeto de la presente invención, pueden producir
dichos L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa,
lactosa, fructosa, maltosa, melazas, en caso apropiado almidón y en
caso apropiado celulosa, o a partir de glicerol y etanol. Los
microorganismos son representativos de la familia
Enterobacteriáceas y se seleccionan de los géneros Escherichia,
Erwinia, Providencia y Serratia. Se prefieren los géneros
Escherichia y Serratia. La especie Escherichia coli puede
mencionarse, en particular, en el caso del género Escherichia,
mientras que la especie Serratia marcescens puede mencionarse, en
particular, en conexión con el género Serratia.
En general, los microorganismos recombinantes se
generan por medio de transformación, transducción o conjugación, o
una combinación de estos métodos, con un vector que contiene el ORF
deseado, el gen deseado, un alelo de este ORF o gen, o partes de
los mismos, y/o un promotor que aumenta la expresión del ORF o gen.
Este promotor puede ser el promotor que se ha producido por
intensificación de la mutación de la secuencia reguladora endógena
localizada aguas arriba del gen u ORF; alternativamente, un promotor
eficiente se ha fusionado al gen u
ORF.
ORF.
Ejemplos de cepas adecuadas, que producen en
particular L-treonina, del género Escherichia, en
particular de la especie Escherichia coli son
- -
- Escherichia coli H4581 (EP 0 301 572)
- -
- Escherichia coli KY10935 (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61(11):1877-1882 (1997)
- -
- Escherichia coli VNIIgenetica MG442 (US-A-4.278.765)
- -
- Escherichia coli VNIIgenetica M1 (US-A-4.321.325)
- -
- Escherichia coli VNIIgenetica 472T23 (US-A- 5.631.157)
- -
- Escherichia coli BKIIM B-3996 (US-A-5.175.107)
- -
- Escherichia coli cat 13 (WO 98/04715)
- -
- Escherichia coli KCCM-10132 (WO 00/09660)
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos de cepas productoras de
L-treonina del género Serratia, en particular de la
especie Serratia marcescens, son
- -
- Serratia marcescens HNr21 (Applied and Environmental Microbiology 38(6): 1045-1051 (1979))
- -
- Serratia marcescens TLr156 (Gene 57(2-3): 151-158 (1987))
- -
- Serratia marcescens T-2000 (Applied Biochemistry and Biotechnology 37(3): 255- 265 (1992))
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas productoras de
L-treonina de la familia Enterobacteriáceas poseen
preferiblemente, entre otras cosas, una o más de las
características genéticas o fenotípicas seleccionadas del grupo:
resistencia a ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico,
resistencia a tialisina, resistencia a etionina; resistencia a
\alpha-metilserina, resistencia a ácido
diaminosuccínico, resistencia a ácido
\alpha-aminobutírico, resistencia a borrelidina,
resistencia a ácido ciclopentanocarboxílico, resistencia a
rifampicina, resistencia a análogos de valina tales como valina
hidroxamato, resistencia a análogos de purina, tales como
6-dimetilaminopurina, requerimiento de
L-metionina, posible requerimiento parcial y
compensable de L-isoleucina, requerimiento de ácido
mesodiaminopimélico, auxotrofia en relación con dipéptidos que
contienen treonina, resistencia a L-treonina,
resistencia a refinado de treonina, resistencia a
L-homoserina, resistencia a
L-lisina, resistencia a L-metionina,
resistencia a ácido L-glutámico, resistencia a
L-aspartato, resistencia a
L-leucina, resistencia a
L-fenilalanina, resistencia a
L-serina, resistencia a L-cisteína,
resistencia a L-valina, sensibilidad a
fluoropiruvato, deficiencia en
treonina-deshidrogenasa, posible aptitud para
utilizar sacarosa, intensificación del operón treonina,
intensificación de homoserina deshidrogenasa
I-aspartato-quinasa I,
preferiblemente de la forma resistente a la realimentación,
intensificación de homoserina-quinasa,
intensificación de treonina-sintasa,
intensificación de aspartato-quinasa, posiblemente
de la forma resistente a la realimentación, intensificación de
aspartato-semialdehído-deshidrogenasa,
intensificación de fosfoenolpiruvato-carboxilasa,
posiblemente de la forma resistente a la realimentación,
intensificación de fosfoenolpiruvato-sintasa,
intensificación de transhidrogenasa, intensificación del producto
del gen RhtB, intensificación del producto del gen RhtC,
intensificación del producto del gen YfiK, intensificación de una
piruvato-carboxilasa y atenuación de la formación
de ácido acético.
Se ha encontrado que, después de la
sobreexpresión del gen o el marco de lectura abierto (ORF) yaaU, o
sus alelos, los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas
producen L-lisina, L-valina o
L-treonina, de una manera incrementada.
Las secuencias de nucleótidos de los genes o
marcos de lectura abiertos (ORFs) de Escherichia coli
pertenecen a la técnica anterior y pueden obtenerse de la secuencia
del genoma de Escherichia coli publicada por Blattner et
al. (Science 277: 1453-1462 (1997)). Se sabe que
las enzimas endógenas (metionina-aminipeptidasa) son
capaces de escindir el aminoácido N-terminal
metionina.
Las secuencias de nucleótidos para el ORF yaaU
de Shigella flexneri y Salmonella typhimurium, que
pertenecen análogamente a la familia Enterobacteriáceas, han sido
también descritas.
El ORF yaaU de Escherichia coli K12 se
describe, entre otras cosas, por los datos siguientes:
- Designación:
- marco de lectura abierto
- Función:
- apostillado como una proteína supuesta de transporte, un transportador de membrana de la MFS (superfamilia facilitadora principal). Los sustratos transportados varían notablemente; la familia MFS contiene transportadores de monosacáridos, disacáridos y oligosacáridos, transportadores de potasio y aminoácidos, transportadores de compuestos intermedios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, así como transportadores que bombean antibióticos al exterior de las células.
- Descripción:
- el marco de lectura abierto yaaU codifica una proteína de 48,7 KDa; el punto isoeléctrico es 8,8; cuando está localizado en el cromosoma, yaaU está presente, por ejemplo en el caso de Escherichia coli K12 MG1655, en la región intergénica de los genes carB, que codifican la cadena larga de carbamoil-fosfato-sintasa, y kefC, que codifica una proteína del sistema de eflujo de potasio regulado por (K(+)/H(+) glutatión);
- Referencia:
- Blattner et al., Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)
- No. de Acceso:
- AE000114
- Nombre de gen alternativo:
- B0045
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de ácido nucleico pueden
obtenerse de las bases de datos pertenecientes al National Center
for Biotechnology Information (NCBI) de la National Library de
Medicine (Bethesda, MD, EE.UU.), la base de datos de secuencias de
ácido nucleico de los European Molecular Biology Laboratories (EMBL,
Heidelberg, Alemania o Cambridge, Reino Unido) o la base de datos
de DNA japonesa (DDBJ, Mishima, Japón).
Para mayor claridad, la secuencia de nucleótidos
conocida del ORF yaaU de Escherichia coli se da en SEQ ID
No. 3 y las secuencias conocidas para el ORF yaaU de Shigella
flexneri (AE015041) y Salmonella typhimurium (AE008697)
se dan bajo SEQ ID No. 5 y, respectivamente, SEQ ID No. 7. Las
secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas por estos
marcos de lectura se representan como SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 y,
respectivamente, SEQ ID No. 8.
Los marcos de lectura abiertos descritos en los
pasajes indicados pueden utilizarse de acuerdo con la invención.
Adicionalmente, es posible utilizar alelos de los genes o marcos de
lectura abiertos, que son resultado de la degeneración del código
genético o como consecuencia de mutaciones sentido funcionalmente
neutras. Se da preferencia a la utilización de genes endógenos o
marcos de lectura abiertos endógenos.
"Genes endógenos" o "secuencias
nucleotídicas endógenas" deben entenderse como los genes o marcos
de lectura abiertos o alelos o secuencias de nucleótidos que están
presentes en una población de especie.
Los alelos adecuados del ORF yaaU, que contienen
mutaciones sentido funcionalmente neutras incluyen, entre otras,
aquéllas que conducen a, como máximo, 50 o como máximo 40 o como
máximo 30 o como máximo 20, preferiblemente a, como máximo, 10 o a
como máximo 5, y de modo muy particularmente preferible a como
máximo 3 o a
como máximo 2, o a al menos una, sustitución conservadora de aminoácido en la proteína que codifican los mismos.
como máximo 2, o a al menos una, sustitución conservadora de aminoácido en la proteína que codifican los mismos.
En el caso de los aminoácidos aromáticos, se
dice que las sustituciones son conservadoras cuando fenilalanina,
triptófano y tirosina se sustituyen uno por otro. En el caso de los
aminoácidos hidrófobos, se dice que las sustituciones son
conservadoras cuando leucina, isoleucina y valina se sustituyen uno
por otro. En el caso de los aminoácidos polares, se dice que las
sustituciones son conservadoras cuando se sustituyen glutamina y
asparagina uno por otro. En el caso de los aminoácidos básicos, se
dice que las sustituciones son conservadoras cuando se sustituyen
arginina, lisina e histidina uno por otro. En el caso de los
aminoácidos ácidos, se dice que las sustituciones son conservadoras
cuando se sustituyen ácido aspártico y ácido glutámico uno por otro.
En el caso de los aminoácidos que contienen grupos hidroxilo, se
dice que las sustituciones son conservadoras cuando se sustituyen
serina y treonina uno por otro.
De igual manera, es asimismo posible utilizar
secuencias de nucleótidos que codifican variantes de dichas
proteínas, variantes que contienen adicionalmente una extensión o
truncación de al menos un (1) aminoácido en el término N o el
término C. Esta extensión o truncación asciende a no más de 50, 40,
30, 20, 10, 5, 3 ó 2 aminoácidos o residuos de aminoácidos.
Los alelos adecuados incluyen también aquéllos
que codifican proteínas en las cuales al menos un (1) aminoácido ha
sido insertado o delecionado. El número máximo de tales cambios,
denominados indels, puede afectar a 2, 3, 5, 10, 20, pero en ningún
caso más de 30 aminoácidos.
Los alelos adecuados incluyen adicionalmente
aquéllos que pueden obtenerse por medio de hibridación, en
particular en condiciones severas, utilizando SEQ ID No. 3, SEQ ID
No. 5 o SEQ ID No. 7 o partes de las mismas, en particular las
regiones codificantes o las secuencias que son complementarias a
ellas.
La persona experta puede encontrar instrucciones
para la identificación de secuencias de DNA por medio de
hibridación, entre otros lugares, en el manual "The DIG System
Users Guide for Filter Hybridization" suministrado por
Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y Liebl et
al. (International Journal de Systematic Bacteriology 41:
255-260 (1991)). La hibridación tiene lugar en
condiciones severas, es decir, que los únicos híbridos formados son
aquéllos en los cuales la sonda y la secuencia diana, es decir los
polinucleótidos tratados con la sonda, son idénticos al menos en un
80%. Es sabido que la severidad de la hibridación, con inclusión de
los pasos de lavado, está influenciada y/o determinada por variación
de la composición de los tampones, la temperatura y la
concentración de sales. En general, la reacción de hibridación se
lleva a cabo a una severidad que es relativamente baja comparada
con la de los pasos de lavado (Hybaid Hybridization Guide, Hybaid
Limited, Teddington, Reino Unido, 1996).
Por ejemplo, un tampón correspondiente al tampón
5x SSC puede utilizarse para la reacción de hibridación a una
temperatura de aprox. 50ºC-68ºC. En estas
condiciones, las sondas pueden hibridarse también con
polinucleótidos que poseen menos de 70% de identidad con la
secuencia de la sonda. Estos híbridos son menos estables y se
eliminan por lavado en condiciones severas. Esto puede conseguirse,
por ejemplo, por disminución de la concentración de sal hasta por
debajo de 2 x SSC y, en caso apropiado, subsiguientemente a 0,5 x
SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridization,
Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania, 1995), ajustándose la
temperatura a aprox. 50ºC-68ºC, aprox.
52ºC-68ºC, aprox. 54ºC-68ºC, aprox.
56ºC-68ºC, aprox. 58ºC-68ºC, aprox.
60ºC-68ºC, aprox. 62ºC-68ºC, aprox.
64ºC-68ºC, o aprox. 66ºC-68ºC. Se
prefieren intervalos de temperatura de aprox.
64ºC-68ºC, o aprox. 66ºC-68ºC. Es
posible, en caso apropiado, reducir la concentración de sales hasta
una concentración correspondiente a 0,2 x SSC o 0,1 x SSC. Por medio
del aumento gradual de la temperatura de hibridación, en escalones
de aprox. 1-2ºC, desde 50ºC a 68ºC, es posible
aislar fragmentos polinucleotídicos que, por ejemplo, poseen al
menos 80%, o al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos
93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al
menos 98%, o al menos 99%, de identidad con la secuencia de la
sonda empleada o con las secuencias de nucleótidos que se muestran
en SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7. Instrucciones
adicionales para la hibridación pueden obtenerse comercialmente en
forma de lo que se denominan kits (tales como DIG width Easy Hyb,
de Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, No. de Catálogo
1603558). Las secuencias de nucleótidos que se obtienen de este modo
codifican polipéptidos que poseen al menos 90%, en particular al
menos 95%, preferiblemente al menos 98% o al menos 99%, de modo
muy particularmente preferible 99,7%, de identidad con las
secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID No. 4, SEQ ID No.
6 o SEQ ID No. 8.
A fin de lograr la intensificación, es posible,
por ejemplo, aumentar la expresión de los genes o marcos de lectura
abiertos o alelos, o aumentar las propiedades catalíticas de la
proteína. Ambas medidas pueden combinarse, en caso apropiado.
Para conseguir la sobreexpresión, puede
aumentarse el número de copias de los genes o marcos de lectura
abiertos correspondientes, por ejemplo, o pueden mutarse la región
promotora y la región reguladora o el sitio de fijación de ribosoma
que está localizado aguas arriba del gen estructural. Casetes de
expresión que se incorporan aguas arriba del gen estructural actúan
del mismo modo. Es asimismo posible aumentar la expresión durante el
curso de la producción fermentativa de L-treonina
por incorporación de promotores inducibles; adicionalmente, la
utilización de promotores para la expresión de genes que permite una
expresión cronológica diferente de los genes puede ser también
ventajosa. La expresión se mejora análogamente por medio de medidas
para ampliar la duración de vida del mRNA. Adicionalmente, la
actividad enzimática puede mejorarse también impidiendo que la
enzima proteínica se descomponga. Los ORFs, genes o constructos
génicos pueden o bien estar presentes en plásmidos que tienen
números de copias diferentes, o estar integrados, y amplificados, en
el cromosoma. Alternativamente, la sobreexpresión de los genes en
cuestión puede conseguirse también por alteración de la composición
de los medios y la realización del cultivo.
Métodos para sobreexpresión se describen
adecuadamente en la técnica anterior, por ejemplo en Makrides et
al. (Microbiological Reviews 60(3),
512-538 (1996)). La utilización de vectores aumenta
el número de copias al menos en una (1) copia. Los vectores
utilizados pueden ser plásmidos como ha sido descrito, por ejemplo,
en US 5.538.873. Los vectores utilizados pueden ser también fagos,
por ejemplo el fago Mu, como ha sido descrito en EP 0332448, o el
fago lambda (\lambda). El número de copias puede aumentarse
también por incorporación de una copia adicional en otro sitio del
cromosoma, por ejemplo, en el sitio att del fago \lambda (Yu y
Court, Gene 223, 77-81 (1998)). US 5.939.307 informa
que fue posible aumentar la expresión por incorporación de casetes
o promotores de expresión, tales como el promotor tac, el promotor
trp, el promotor lpp, o el promotor P_{L} o el promotor P_{R}
del fago lambda (\lambda), aguas arriba, por ejemplo, del operón
cromosómico treonina. De igual manera, es posible utilizar los
promotores de fago T7, los promotores "gearbox" o el promotor
nar. Tales casetes de expresión o promotores pueden utilizarse
también, como ha sido descrito en EP 0 593 792, para sobreexpresar
genes unidos a plásmidos. La utilización del alelo lacI^{Q} hace
posible a su vez controlar la expresión de genes unidos a plásmidos
(Glascock y Weickert, Gene 223, 221-231 (1998)). Es
adicionalmente posible aumentar la actividad de los promotores por
modificación de su secuencia por medio de una o más sustituciones
de nucleótidos, por medio de una o más inserciones y/o por medio de
una o más deleciones. Puede conseguirse una expresión génica
cronológica diferente, por ejemplo, como ha sido descrito en Walker
et al. (Journal de Bacteriology 181: 1269-80
(1999)), por utilización del promotor fis dependiente de la fase de
crecimiento.
La persona experta puede encontrar instrucciones
generales a este respecto, entre otros lugares, en Chang y Cohen
(Journal de Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)),
Hartley y Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), Amann
and Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), de Broer
et al. (Proceedings de the National Academy de Sciences de
the United States de America 80: 21-25 (1983)),
LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11: 187-193
(1993)), en PCT/US97/13359, Llosa et al. (Plasmid 26:
222-224 (1991)), Quandt y Klipp (Gene 80:
161-169 (1989)), Hamilton et al. (Journal de
Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), Jensen y Hammer
(Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195
(1998)) y libros de texto conocidos de genética y biología
molecular.
Pueden utilizarse vectores plasmídicos que se
pueden replicar en Enterobacteriáceas, tales como vectores de
clonación derivados de pACYC184 (Bartolomé et al.; Gene 102:
75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene
69: 301-315 (1988)) o derivados de pSC101 (Vocke y
Bastia; Proceedings de the National Academy de Sciences USA
80(21): 6557-6561 (1983)). En un proceso de
acuerdo con la invención, es posible utilizar una cepa que se
transforma con un vector plasmídico que lleva al menos una secuencia
de nucleótidos, o alelo, que codifica el ORF yaaU o su producto
génico.
El término "transformación" debe entenderse
con el significado de la captura de un ácido nucleico aislado por
un hospedador (microorganismo).
Es asimismo posible utilizar intercambios de
secuencia (Hamilton et al., Journal de Bacteriology 171:
4617-4622 (1989)), conjugación o transducción para
transferir mutaciones, que afectan a la expresión de los genes o
marcos de lectura abiertos dados, en cepas diferentes.
Explicaciones más detalladas de los conceptos de
genética y biología molecular pueden encontrarse en libros de texto
conocidos de genética y biología molecular tales como el libro de
texto de Birge (Bacterial and Bacteriophage Genetics, 4ª edición,
Springer Verlag, Nueva York (EE.UU.), 2000) o el libro de texto de
Berg, Tymoczko y Stryer (Biochemistry, 5ª edición, Freeman and
Company, Nueva York (EE.UU.), 2002) o el manual de Sambrook et
al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (Serie de 3
volúmenes), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor
(EE.UU.), 2001).
Adicionalmente, cuando se utilizan cepas de la
familia Enterobacteriáceas para producir L-lisina,
L-valina o L-treonina, puede ser
ventajoso, además de sobreexpresar el marco de lectura abierto yaaU,
sobreexpresar una o más enzimas del camino conocido de la
biosíntesis de la treonina, o enzimas del metabolismo anaplerótico,
o enzimas para producir
nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato
reducido, o enzimas de la glucólisis, o enzimas PTS o enzimas de
metabolismo del azufre. Se prefiere generalmente la utilización de
genes endógenos.
Así, es posible, por ejemplo, sobreexpresar
simultáneamente, uno o más de los genes seleccionados del grupo
- \bullet
- al menos un gen del operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa (US-A-4.278.765),
- \bullet
- el gen pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica piruvato-carboxilasa (WO 99/18228),
- \bullet
- el gen pps que codifica fosfoenolpiruvato-sintasa (Molecular and General Genetics 231(2), 332-336 (1992)),
- \bullet
- el ppc gen que codifica fosfoenolpiruvato carboxilasa (WO 02/064808),
- \bullet
- los genes pntA y pntB que codifican las subunidades de piridina-transhidrogenasa (European Journal de Biochemistry 158, 647-653 (1986)),
- \bullet
- el gen rhtB que codifica la proteína que confiere resistencia a homoserina (EP-A-0 994 190),
- \bullet
- el gen rhtC que codifica la proteína que confiere resistencia a treonina (EP-A-1 013 765),
- \bullet
- el gen thrE de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína del portador de exportación de treonina (WO 01/92545),
- \bullet
- el gdhA gen que codifica glutamato-deshidrogenasa (Nucleic Acids Research 11, 5257-5266 (1983); Gene 23, 199-209 (1983)),
- \bullet
- el gen pgm que codifica fosfoglucomutasa (WO 03/004598),
- \bullet
- el gen fba que codifica fructosa-bifosfato-aldolasa (WO 03/004664),
- \bullet
- el gen ptsH del operón ptsHIcrr que codifica la proteína fosfohistidina-hexosa-fosfotransferasa del sistema PTS de fosfotransferasa (WO 03/004674),
- \bullet
- el gen ptsI del operón ptsHIcrr que codifica la enzima I del sistema PTS de fosfotransferasa (WO 03/004674),
- \bullet
- el gen crr del operón ptsHIcrr que codifica el componente IIA específico de glucosa del sistema PTS de fosfotransferasa (WO 03/004674),
- \bullet
- el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico de glucosa (WO 03/004670),
- \bullet
- el gen lrp que codifica el regulador del regulón leucina (WO 03/004665),
- \bullet
- el gen fadR que codifica el regulador del regulón fad (WO 03/038106),
- \bullet
- el gen iclR que codifica el regulador del metabolismo central intermedio (WO 03/038106),
- \bullet
- el gen ahpC del operón ahpCF que codifica la subunidad pequeña de alquil-hidroperóxido-reductasa (WO 03/004663),
- \bullet
- el gen ahpF del operón ahpCF que codifica la subunidad grande de alquil-hidroperóxido-reductasa (WO 03/ 004663),
- \bullet
- el gen cysK que codifica cisteína-sintasa A (WO 03/006666),
- \bullet
- el gen cysB que codifica el regulador del regulón cys (WO 03/006666),
- \bullet
- el gen cysJ del operón cysJIH que codifica la flavoproteína NADPH- sulfito-reductasa (WO 03/006666),
- \bullet
- el gen cysI del operón cysJIH que codifica la hemoproteína NADPH-sulfito-reductasa (WO 03/006666),
- \bullet
- el gen cysH del operón cysJIH que codifica adenilil-sulfato-reductasa (WO 03/006666),
- \bullet
- el gen rseA del operón rseABC que codifica una proteína de membrana que posee actividad anti-sigmaE (WO 03/008612),
- \bullet
- el gen rseC del operón rseABC que codifica un regulador global del factor sigmaE (WO 03/008612),
\newpage
- \bullet
- el gen sucA del operón sucABCD que codifica la subunidad descarboxilasa de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa (WO 03/008614),
- \bullet
- el gen sucB del operón sucABCD que codifica la subunidad dihidrolipoil-transsuccinasa E2 de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa (WO 03/008614),
- \bullet
- el gen sucC del operón sucABCD que codifica la subunidad \beta de succinil-CoA-sintetasa (WO 03/008615),
- \bullet
- el gen sucD del operón sucABCD que codifica la subunidad \alpha de succinil-CoA-sintetasa (WO 03/008615),
- \bullet
- el gen aceE que codifica el componente E1 del complejo piruvato-deshidrogenasa (WO 03/076635),
- \bullet
- el gen aceF que codifica el componente E2 del complejo piruvato-deshidrogenasa (WO 03/076635),
- \bullet
- el gen rseB que codifica el regulador de la actividad del factor sigmaE (Molecular Microbiology 24(2), 355-371 (1997)),
- \bullet
- el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yodA de Escherichia coli (Número de Acceso AE000288 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.), DE10361192.4).
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, para el propósito de producción
de L-aminoácidos, en particular
L-treonina, puede ser ventajoso, además de
intensificar el marco de lectura abierto yaaU, atenuar, en
particular eliminar o reducir la expresión de uno o más de los
genes seleccionados del grupo
- \bullet
- el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa (Journal de Bacteriology 169, 4716-4721 (1987)),
- \bullet
- el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa (E.C.1.1.1.37) (Archives in Microbiology 149: 36-42 (1987)),
- \bullet
- el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yjfA de Escherichia coli (Número de Acceso AAC77180 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU. WO 02/29080)),
- \bullet
- el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) ytfP de Escherichia coli (Número de Acceso AAC77179 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU. WO 02/29080)),
- \bullet
- el gen pckA que codifica la enzima fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa (WO 02/29080),
- \bullet
- el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa (WO 02/36797),
- \bullet
- el gen dgsA (WO 02/081721), que es conocido también como el gen mlc, que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa,
- \bullet
- el gen fruR (WO 02/081698), que es conocido también como el gen cra, que codifica el represor fructosa,
- \bullet
- el gen rpoS (WO 01/05939), que es conocido también como el gen katF, que codifica el factor sigma^{38}, y
- \bullet
- el gen aspA que codifica aspartato-amonio-liasa (WO 03/008603).
\vskip1.000000\baselineskip
En este contexto, el término "atenuación"
describe la disminución o desactivación, en un microorganismo, de
la actividad o concentración intracelular de una o más enzimas o
proteínas que son codificadas por el DNA correspondiente, por
ejemplo utilizando un promotor más débil que en el microorganismo o
cepa parental no recombinante para la enzima o proteína
correspondiente, o un gen o alelo que codifica una enzima o proteína
correspondiente que tiene actividad menor, o por desactivación de
la enzima o proteína correspondiente, o el marco de lectura abierto
o gen y en caso apropiado, combinación de estas medidas.
En general, las medidas de atenuación reducen la
actividad o concentración de la proteína correspondiente desde 0 a
75%, desde 0 a 50%, desde 0 a 25%, desde 0 a 10% o desde 0 a 5% de
la actividad o concentración de la proteína de tipo salvaje o de la
actividad o concentración de la proteína para la cepa parental o
microorganismo que no es recombinante para la enzima o proteína
correspondiente. La cepa o microorganismo parental que no es
recombinante se entiende como el microorganismo sobre el cual se
realizan las medidas de acuerdo con la invención.
Con objeto de conseguir una atenuación, por
ejemplo la expresión de los genes o marcos de lectura abiertos, o
las propiedades catalíticas de las proteínas enzimáticas, pueden
reducirse o anularse. En caso apropiado, pueden combinarse ambas
medidas.
La expresión de los genes puede reducirse por
realización del cultivo de una manera adecuada, por modificación
genética (mutación) de las estructuras señal para la expresión
génica o bien por la técnica del RNA antisentido. Estructuras señal
para la expresión génica son tales como genes represores, genes
activadores, operadores, promotores, atenuadores, sitios de
fijación de ribosoma, el codón de partida y los terminadores. Los
expertos encontrarán información a este respecto, inter alia, por
ejemplo en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58,
191-195 (1998)), en Carrier y Keasling
(Biotechnology Progress 15, 58-64 (1999)), en Franch
y Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3,
159-164 (2000)) y en libros de texto bien conocidos
de genética y biología molecular, tales como el libro de texto de
Knippers ("Molekulare Genetik [Molecular Genetics"], 6ª
edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995) o el de
Winnacker ("Gene und Klone [Genes and Clones]", VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990).
Mutaciones que dan como resultado una
modificación o reducción en las propiedades catalíticas de las
proteínas enzimáticas son conocidas por la técnica anterior.
Ejemplos que pueden mencionarse son los artículos de Qiu y Goodman
(Journal de Biological Chemistry 272: 8611-8617
(1997)), Yano et al. (Proceedings de the National Academy de
Sciences de the United States de America 95:
5511-5515 (1998)) y Wente y Schachmann (Journal de
Biological Chemistry 266: 20833-20839 (1991)).
Pueden encontrarse revisiones en libros de textos bien conocidos de
genética y biología molecular, por ejemplo el publicado por Hagemann
("Allgemeine Genetik [General Genetics]", Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1986).
Mutaciones que entran en consideración son
transiciones, transversiones, inserciones y deleciones de al menos
un (1) par de bases o nucleótido. Dependiendo del efecto de la
sustitución de aminoácido causada por la mutación sobre la
actividad enzimática, se hace referencia a mutaciones de sentido
erróneo o mutaciones sin sentido. Una mutación de sentido erróneo
da como resultado un cambio de un aminoácido dado en una proteína
por un aminoácido diferente, siendo dicho cambio de aminoácido
particularmente no conservador. Esto deteriora por tanto la aptitud
o actividad funcional de la proteína y reduce la misma a un valor de
0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% o 0 a 5%. Una mutación sin
sentido da como resultado un codón de parada en la región
codificante del gen y por tanto una terminación prematura de la
traducción. Inserciones o deleciones de al menos un par de bases en
un gen conducen a mutaciones de desplazamiento de marco, que dan a
su vez como resultado la incorporación de aminoácidos incorrectos o
la terminación prematura de la traducción. Si se forma un codón de
parada en la región codificante como consecuencia de la mutación,
esto conduce también a la terminación prematura de la traducción.
Deleciones de al menos uno (1) o más codones conducen también
típicamente a la pérdida completa de la actividad enzimática.
Instrucciones acerca de la generación de estas
mutaciones pertenecen a la técnica anterior y pueden encontrarse en
libros de texto bien conocidos de genética y biología molecular,
tales como el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik
[Molecular Genetics]", 6ª edición, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Alemania, 1995), el de Winnacker ("Gene und Klone
[Genes and Clones]", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania,
1990) o el de Hagemann ("Allgemeine Genetik [General
Genetics]", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Mutaciones adecuadas en los genes pueden
incorporarse en cepas adecuadas por cambio de genes o alelos. Un
método habitual es el método descrito por Hamilton et al.
(Journal de Bacteriology 171. 4617-4622 (1989)) de
cambio de gen utilizando un derivado de pSC101, pMAK705, que se
replica condicionalmente. Pueden utilizarse también otros métodos
descritos en la técnica anterior, por ejemplo el de
Martínez-Morales et al (Journal de
Bacteriology 181: 7143-7148 (1999)) o el de Boyd
et al. (Journal de Bacteriology 182: 842-847
(2000)).
Es asimismo posible transferir mutaciones en los
genes relevantes, o mutaciones que afectan a la expresión de los
genes o marcos de lectura abiertos relevantes, a cepas diferentes
por conjugación o transducción.
Adicionalmente, para el propósito de producción
de L-lisina, L-valina o
L-treonina, puede ser ventajoso, además de
intensificar el marco de lectura abierto yaaU, eliminar reacciones
secundarias indeseables (Nakayama: "Breeding de Amino Acid
Producing Microorganisms", en: Overproduction de Microbial
Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press,
Londres, Reino Unido, 1982).
Los microorganismos que se preparan de acuerdo
con la invención pueden cultivarse en un proceso de lotes, en un
proceso de lote alimentado ("fed batch"), en un proceso de lote
alimentado repetido, o en un proceso continuo (DE 102004028859.3 o
US 5.763.230). Métodos de cultivo conocidos se proporcionan en el
libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die
Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1. Introduction to
bioprocess technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o
en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere
Einrichtungen [Bioreactors and peripheral installations] (Vieweg
Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo a utilizar debe satisfacer
los requerimientos de las cepas particulares de manera apropiada.
El manual de la American Society for Bacteriology "Manual de
Methods for General Bacteriology" (Washington DC, EE.UU., 1981)
contiene descripciones de medios de cultivo para diversos
microorganismos.
Como fuente de carbono se pueden utilizar
azúcares y carbohidratos, tales como glucosa, sacarosa, lactosa,
fructosa, maltosa, melazas, almidón y en caso apropiado celulosa,
aceites y grasas, tales como aceite de soja, aceite de girasol,
aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos, tales como ácido
palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes, tales como
glicerol y etanol, y ácidos orgánicos, tales como ácido acético.
Estas sustancias pueden utilizarse individualmente o en forma de
mezcla.
\newpage
Como fuente de nitrógeno se pueden utilizar
compuestos orgánicos nitrogenados tales como peptonas, extracto de
levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de maceración
de maíz, harina de soja y urea, o compuestos inorgánicos tales como
sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato
de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden
utilizarse individualmente o en forma de mezcla.
Como fuente de fósforo se pueden utilizar ácido
fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato
dipotásico, o las sales de sodio correspondientes. El medio de
cultivo tiene que contener además sales metálicas, tales como
sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el
crecimiento. Finalmente, pueden utilizarse promotores esenciales
del crecimiento tales como aminoácidos y vitaminas, además de las
sustancias arriba mencionadas. Pueden añadirse también al medio de
cultivo precursores adecuados. Dichos ingredientes pueden añadirse
al cultivo en forma de una mezcla única, o dosificarse adecuadamente
durante el cultivo.
La fermentación se lleva a cabo generalmente a
un pH de 5,5 a 9,0, particularmente de 6,0 a 8,0. Para controlar el
pH del cultivo se utilizan de manera adecuada compuestos básicos
tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o
agua amoniacal, o compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o
ácido sulfúrico. Para controlar la formación de espuma pueden
utilizarse antiespumantes tales como poliglicolésteres de ácidos
grasos. La estabilidad de los plásmidos puede mantenerse por
adición al medio de sustancias de acción selectiva adecuadas, por
ejemplo antibióticos. Para el mantenimiento de condiciones aerobias
se introducen en el cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que
contienen oxígeno, por ejemplo aire. La temperatura del cultivo es
normalmente de 25ºC a 45ºC y preferiblemente 30ºC a 40ºC. El
cultivo se continúa hasta que la formación de
L-aminoácidos o L-treonina ha
alcanzado un máximo. Este objetivo se alcanza normalmente dentro de
10 horas a 160 horas.
Los L-aminoácidos pueden
analizarse por cromatografía de intercambio aniónico seguida por
derivatización con ninhidrina, como ha sido descrito por Spackman
et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206
(1958)), o por medio de HPLC en fase inversa, como ha sido descrito
por Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51:
1167-1174 (1979)).
El proceso de acuerdo con la invención puede
utilizarse para preparar L-aminoácidos tales como
L-treonina, L-valina y
L-lisina, particularmente
L-treonina, por fermentación.
El microorganismo siguiente ha sido depositado
en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
[German collection de microorganisms and cell cultures] (DSMZ,
Brunswick, Alemania) de acuerdo con el Convenio de Budapest:
- \bullet
- Escherichia coli, cepa E. coli MG442 como DSM 16574.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se ilustra a continuación
con mayor detalle con ayuda de ejemplos de implementación.
El medio mínimo (M9) y el medio completo (LB)
utilizados para Escherichia coli han sido descritos por J.H.
Miller, (A short course in bacterial genetics (1992), Cold Spring
Harbor Laboratory Press). El aislamiento de DNA plasmídico a partir
de Escherichia coli, así como todas las técnicas para
restricción, ligación y tratamiento con fosfatasa Klenow y
fosfatasa alcalina se llevan a cabo como se describe en Sambrook
et al. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989), Cold
Spring Harbor Laboratory Press). A no ser que se indique otra cosa,
la transformación de Escherichia coli se lleva a cabo como se
describe en Chung et al. (Proceedings de the National
Academy de Sciences de the United States de America 86:
2172-2175 (1989)).
La temperatura de incubación en la preparación
de cepas y transformantes es 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El ORF yaaU de E. coli K12 se amplifica
utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y
oligonucleótidos sintéticos. Los iniciadores para la PCR se
sintetizan (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania) sobre la base de la
secuencia de nucleótidos del ORF yaaU en E. coli K12 MG1655
(Número de Acceso AE000114), Blattner et al. (Science 277:
1453-1474 (1997)). Las secuencias de los iniciadores
se modifican a fin de formar sitios de reconocimiento para las
enzimas de restricción. La secuencia de reconocimiento de EcoRI se
selecciona para el iniciador yaaU-ex1, y la
secuencia de reconocimiento de BamHI se selecciona para el iniciador
yaaU-ex2, subrayándose estas secuencias en las
secuencias de nucleótidos que se muestran a continuación:
yaaU-exl:
5'-GATCTGAATTCTAAGGAATAACCATGCAACCGTC-3'
(SEQ ID No. 1)
\newpage
yaaU-ex2:
5'-GATCTAGGATCCCAATTTACCCCATTCTCTGC-3'
(SEQ ID No. 2)
\vskip1.000000\baselineskip
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655
utilizado para la PCR se aísla utilizando "Qiagen
Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Alemania)
de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un fragmento de DNA
de tamaño aproximado 1371 pb (SEQ ID No. 3) puede amplificarse en
condiciones estándar de PCR (Innis et al. (1990) PCR
Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic
Press) using Vent DNA polymerase (New England Biolabs GmbH,
Frankfurt, Alemania) y los iniciadores específicos.
El fragmento amplificado yaaU se liga al vector
pCR-Blunt II-TOPO (Zero TOPO TA
Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Holanda) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante, y se transforma en la cepa TOP10 de
E. coli. Se seleccionan células que albergan plásmidos en
agar LB que contiene 50 \mug de kanamicina/ml. Después que se ha
aislado el DNA plasmídico, el vector se escinde con las enzimas
EcoRV y EcoRI y, después que se ha comprobado la escisión en un gel
de agarosa al 0,8%, se designa pCRBluntyaaU.
El vector pCRBluntyaaU se escinde luego con las
enzimas EcoRI y BamHI y el fragmento yaaU se separa en un gel de
agarosa al 0,8%; se aísla luego del gel (QIAquick Gel Extraction
Kit, QIAGEN, Hilden, Alemania) y se liga al vector pTrc99A
(Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) que se ha digerido con las
enzimas BamHI y EcoRI. La cepa de E. coli XL1Blue MRF'
(Stratagene, La Jolla, EE.UU.) se transforma con la mezcla de
ligación y las células que albergan los plásmidos se seleccionan en
agar LB que contiene 50 \mug de ampicilina/ml.
El hecho de que la clonación ha tenido éxito
puede demostrarse, después de aislamiento del DNA plasmídico, por
realización de una escisión de control utilizando las enzimas
EcoRI/BamHI y EcoRV.
El plásmido se designa pTrc99AyaaU (Figura
1).
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa de E. coli MG442 productora de
L-treonina se describe en la memoria descriptiva de
patente US-A-4.278.765 y ha sido
depositada en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos
Industriales (VKPM, Moscú, Rusia) como CMIM B-1628
y en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
[German collection de microorganisms and cell cultures] (DSMZ,
Brunswick, Alemania), de acuerdo con el Tratado de Budapest, como
DSM 16574).
La cepa MG442 se transforma con el plásmido de
expresión pTrc99AyaaU descrito en el Ejemplo 1, y con el vector
pTrc99A, y las células que albergan el plásmido se seleccionan en
agar LB que contiene 50 \mug de ampicilina/ml. Esto da como
resultado las cepas MG442/pTrc99AyaaU y MG442/pTrc99A. Las colonias
individuales seleccionadas se propagan luego adicionalmente en
medio mínimo que tiene la composición siguiente: 3,5 g de
Na_{2}HPO_{4}*2H_{2}O/l, 1,5 g de KH_{2}PO_{4}/l, 1 g de
NH_{4}Cl/l, 0,1 g de MgSO_{4}*7H_{2}O/l, 2 g de glucosa/l, 20
g de agar/l, 50 mg de ampicilina/l.
La formación de L-treonina se
comprueba en cultivos de lotes de 10 ml que están contenidos en
matraces Erlenmeyer de 100 ml. Para ello, se inocula un medio de
precultivo de 10 ml de la composición siguiente: 2 g de extracto de
levadura/10 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}/l, 1 g de
KH_{2}PO_{4}/l, 0,5 g de MgSO_{4}*7H_{2}O/l, 15 g de
CaCO_{3}/l, 20 g de glucosa/l, 50 mg de ampicilina/l, y se
incuba, a 37ºC y 180 rpm durante 16 horas, en una incubadora Kühner
AG ESR (Birsfelden, Suiza). En cada caso, se inoculan 250 \mul de
este cultivo preliminar en 10 ml de medio de producción (25 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4}/l, 2 g de KH_{2}PO_{4}/l, 1 g
de MgSO_{4}*7H_{2}O/l, 0,03 g de FeSO_{4}*7H_{2}O/l,
0,018 g de MnSO_{4}*1H_{2}O/l, 30 g de CaCO_{3}/1,
20 g de glucosa/l, 50 mg de ampicilina/l) y se incuban a 37ºC
durante 48 horas. La formación de L-treonina por la
cepa MG442 de partida se comprueba de igual manera excepto que no se
añade cantidad alguna de ampicilina al medio. Después de la
incubación, se determina la densidad óptica (DO) de la suspensión
de cultivo a una longitud de onda de medición de 660 nm utilizando
un fotómetro Dr. Lange LP2W (Düsseldorf, Alemania).
Se utiliza luego un analizador de aminoácidos
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) para
determinar, por medio de cromatografía de intercambio iónico y
reacción post-columna que implica detección con
ninhidrina, la concentración de la L-treonina
resultante en el sobrenadante de cultivo, que se ha esterilizado por
filtración.
\newpage
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla 1.
Figura 1: Mapa del plásmido pTrc99AyaaU que
contiene el gen yaaU
Las especificaciones de longitud deben
considerarse como aproximadas. Las abreviaturas y designaciones
empleadas tienen los significados siguientes:
- \bullet bla:
- gen que codifica resistencia a ampicilina
- \bullet lac Iq:
- gen para la proteína represora del promotor trc
- \bullet trc:
- región promotora de trc, inducible por IPTG
- \bullet yaaU:
- región codificante del gen yaaU
- \bullet 5S:
- región de rRNA 5S
- \bullet rrnBT:
- región terminadora del rRNA
\vskip1.000000\baselineskip
Las abreviaturas para las enzimas de restricción
tienen el significado siguiente:
- \bullet BamHI:
- endonucleasa de restricción de Bacillus amyloliquefaciens H
- \bullet EcoRI:
- endonucleasa de restricción de Escherichia coli RY13
- \bullet EcoRV:
- endonucleasa de restricción de Escherichia coli B946.
<110> Degussa AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso para preparación de
L-aminoácidos que utiliza cepas de la familia
Enterobacteriáceas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 030321 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> yaaU-ex1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatctgaatt ctaaggaata accatgcaac cgtc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> yaaU-ex2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatctaggat cccaatttac cccattctct gc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1372
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> producto PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1372)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> producto PCR yaaU
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> lniciador_unión
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
yaaU-ex1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(1356)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región codificante yaaU
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador_unión
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1341)..(1372)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
yaaU-ex2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 443
\vskip0.400000\baselineskip
<222> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Escherichia coli
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1395
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Shigella flexneri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1395)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región codificante yaaU
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 464
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Shigella flexneri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1341
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella typhimurium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1341)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región codificante yaaU
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 446
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella typhimurium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
Claims (18)
1. Un microorganismo recombinante de la familia
Enterobacteriáceas que contiene un ORF yaaU sobreexpresado que
codifica un polipéptido que está apostillado como un transportador
de azúcar supuesto, en el cual la secuencia de aminoácidos del
polipéptido es idéntica al menos en un 90% a una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo SEQ ID NO. 4, SEQ ID No. 6 y SEQ
ID No. 8.
2. Un microorganismo de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque contiene un
polinucleótido sobreexpresado yaaU que se selecciona del grupo:
- a)
- polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7;
- b)
- polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que corresponde a SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7 dentro de los límites de la degeneración del código genético;
- c)
- secuencia de polinucleótidos que tiene una secuencia que se hibrida, en condiciones severas, con la secuencia que es complementaria a la secuencia SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un microorganismo de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido posee
una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 95% a
una de las secuencias seleccionadas del grupo SEQ ID No. 4, SEQ ID
No. 6 y SEQ ID No. 8.
4. Un microorganismo de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido posee
la secuencia de aminoácidos que es idéntica en un 100% a la de SEQ
ID No. 4, SEQ ID No. 6 o SEQ ID No. 8.
5. Un microorganismo de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se produce por
transformación, transducción o conjugación, o una combinación de
estos métodos, con un vector que contiene dicho ORF yaaU, un alelo
de este ORF, o partes del mismo, y/o un promotor.
6. Un microorganismo de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 5, en el cual el número de copias del ORF yaaU o
los alelos se ha incrementado al menos en 1.
7. El microorganismo de acuerdo con la
reivindicación 6, caracterizado porque el aumento en el
número de copias de dicho ORF yaaU en al menos 1 se consigue por
integración de dicho ORF o los alelos del mismo en el cromosoma del
microorganismo.
8. El microorganismo de acuerdo con la
reivindicación 6, caracterizado porque el aumento en el
número de copias de dicho ORF yaaU en al menos 1 se consigue por
medio de un vector que se replica extracromosómicamente.
9. El microorganismo de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque:
- a)
- la región promotora y reguladora o el sitio de fijación de ribosoma está mutada(o) aguas arriba de dicho ORF yaaU, o
- b)
- están incorporados casetes de expresión o promotores aguas arriba del ORF yaaU.
\vskip1.000000\baselineskip
10. El microorganismo de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicho
polinucleótido yaaU se halla bajo el control de un promotor que
intensifica la expresión del gen.
11. El microorganismo de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la
intensificación del ORF yaaU aumenta la concentración o actividad
del producto (proteína) del gen yaaU al menos en un 10%, basada en
la actividad o concentración del producto del gen en la cepa o
microorganismo parental no recombinante para el ORF yaaU.
12. El microorganismo de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque otros genes del
camino metabólico para la biosíntesis del
L-aminoácido deseado están presentes también en
forma sobreexpresada.
13. El microorganismo de acuerdo con la
reivindicación 12, caracterizado porque el microorganismo se
selecciona de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia y
Serratia.
14. El microorganismo de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque produce
L-treonina.
15. Un proceso para preparar
L-aminoácidos seleccionados del grupo
L-treonina, L-valina y
L-lisina por fermentación de microorganismos
recombinantes de la familia Enterobacteriáceas, caracterizado
porque
- a)
- dichos microorganismos productores de L-aminoácidos de acuerdo con las reivindicaciones 1-14, se cultivan en un medio en condiciones en las cuales dicho L-aminoácido se enriquece en el medio o en las células, y
- b)
- dicho L-aminoácido se aísla, quedando los constituyentes del caldo de fermentación, y/o la biomasa restante en su totalidad o en porciones (desde \geq 0 a 100%) en el producto aislado o eliminándose por completo.
\vskip1.000000\baselineskip
16. El proceso de acuerdo con la reivindicación
15, caracterizado porque, para el propósito de preparación
de L-treonina, se fermentan microorganismos de la
familia Enterobacteriáceas en los cuales uno o más de los genes
seleccionados del grupo:
- a)
- al menos un gen del operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa,
- b)
- el gen pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica piruvato-carboxilasa,
- c)
- el gen pps que codifica fosfoenolpiruvato-sintasa,
- d)
- el ppc gen que codifica fosfoenolpiruvato carboxilasa,
- e)
- los genes pntA y pntB que codifican las subunidades de piridina-transhidrogenasa,
- f)
- el gen rhtB que codifica la proteína que confiere resistencia a homoserina,
- g)
- el gen rhtC que codifica la proteína que confiere resistencia a treonina,
- h)
- el gen thrE de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína del portador de exportación de treonina,
- i)
- el gdhA gen que codifica glutamato-deshidrogenasa,
- j)
- el gen pgm que codifica fosfoglucomutasa,
- k)
- el gen fba que codifica fructosa-bifosfato-aldolasa,
- l)
- el gen ptsH que codifica la proteína fosfohistidina-hexosa-fosfotransferasa,
- m)
- el gen ptsI que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa,
- n)
- el gen crr que codifica el componente IIA específico de glucosa,
- o)
- el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico de glucosa,
- p)
- el gen lrp que codifica el regulador del regulón leucina,
- q)
- el gen fadR que codifica el regulador del regulón fad
- r)
- el gen iclR que codifica el regulador del metabolismo central intermedio,
- s)
- el gen ahpF del operón ahpCF que codifica la subunidad pequeña de alquil-hidroperóxido-reductasa,
- t)
- el gen ahpF del operón ahpCF que codifica la subunidad grande de alquil-hidroperóxido-reductasa,
- u)
- el gen cysK que codifica cisteína-sintasa A,
- v)
- el gen cysB que codifica el regulador del regulón cys,
- w)
- el gen cysJ que codifica la flavoproteína NADPH-sulfito-reductasa,
- x)
- el gen cysI que codifica la hemoproteína NADPH-sulfito-reductasa,
- y)
- el gen cysH que codifica adenilil-sulfato-reductasa,
- z)
- el gen rseA que codifica una proteína de membrana que posee actividad anti-sigmaE,
- a1)
- el gen rseC que codifica un regulador global del factor sigmaE,
- b1)
- el gen sucA que codifica la subunidad descarboxilasa de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa,
- c1)
- el gen sucB que codifica la subunidad dihidrolipoil-transsuccinasa E2 de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa,
- d1)
- el gen sucC que codifica la subunidad \beta de succinil-CoA-sintetasa,
- e1)
- el gen sucD que codifica la subunidad \alpha de succinil-CoA-sintetasa,
- f1)
- el gen aceE que codifica el componente E1 del complejo piruvato-deshidrogenasa,
- g1)
- el gen aceF que codifica el componente E2 del complejo piruvato-deshidrogenasa,
- h1)
- el gen rseB que codifica el regulador de la actividad del factor sigmaE, y
- i1)
- el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yodA de Escherichia coli,
está(n) adicionalmente sobreexpresados al mismo
tiempo.
\vskip1.000000\baselineskip
17. El proceso de acuerdo con las
reivindicaciones 15 a 16, caracterizado porque se hace uso de
microorganismos en los cuales los caminos metabólicos que reducen
la formación de dicho L-aminoácido están al menos
parcialmente atenuados.
18. El proceso de acuerdo con la reivindicación
17, caracterizado porque, para el propósito de preparación
de L-treonina, se fermentan microorganismos de la
familia Enterobacteriáceas en los cuales uno o más de los genes
seleccionados del grupo:
- a)
- el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa,
- b)
- el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa,
- c)
- el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yjfA de Escherichia coli,
- d)
- el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) ytfP de Escherichia coli,
- e)
- el gen pckA que codifica fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa,
- f)
- el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa,
- g)
- el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa,
- h)
- el gen fruR que codifica el represor fructosa,
- i)
- el gen rpoS que codifica el factor sigma^{38}, y
- j)
- el gen aspA que codifica aspartato-amonio-liasa,
está/están atenuados adicionalmente al mismo
tiempo, en particular eliminados, o su expresión está reducida.
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