ES2327430T3 - Proceso para la preparacion de l-aminoacidos utilizando cepas de la familia enterobacteriaceas. - Google Patents
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Abstract
Proceso para la preparación de L-aminoácidos seleccionados del grupo constituido por L-treonina, L-valina, Llisina y L-homoserina por la fermentación de microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriáceas, en donde a) los microorganismos que producen el L-aminoácido deseado, en los cuales el marco de lectura abierto yibD está sobreexpresado, se cultivan en un medio en condiciones en las cuales el L-aminoácido deseado se enriquece en el medio o en las células, y b) el L-aminoácido deseado se aísla, quedando los constituyentes del caldo de fermentación, y/o la totalidad o una parte (>= 0 a 100%) de la biomasa, en el producto aislado o eliminándose completamente, en donde el marco de lectura abierto yibD codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 6 y que tiene la actividad de una glicosiltransferasa supuesta.
Description
Proceso para la preparación de
L-aminoácidos utilizando cepas de la familia
enterobacteriáceas.
La presente invención se refiere a un proceso
para la preparación de L-aminoácidos, especialmente
L-treonina, utilizando microorganismos
recombinantes de la familia Enterobacteriáceas en la cual el marco
de lectura abierto (ORF) designado por yibD está sobreexpresado, y
a dichos microorganismos.
Los L-aminoácidos, especialmente
L-treonina, se utilizan en medicina humana y en la
industria farmacéutica, en la industria alimentaria y muy
particularmente en nutrición animal.
Es conocida la preparación de
L-aminoácidos por la fermentación de cepas de
Enterobacteriáceas, especialmente Escherichia coli (E. coli)
y Serratia marcescens. Debido a su gran importancia, están
realizándose constantemente intentos para mejorar los procesos de
preparación. Las mejoras en los procesos pueden referirse a
medidas que implican la tecnología de la fermentación, v.g.
agitación y suministro de oxígeno, o la composición de los medios
nutrientes, v.g. la concentración de azúcar durante la
fermentación, o la elaboración hasta la forma del producto, v.g.
por cromatografía de intercambio iónico, o las características
intrínsecas de productividad del microorganismo propiamente
dicho.
Las características de productividad de estos
microorganismos se mejoran utilizando métodos de mutagénesis,
selección y elección de mutantes para producir cepas que sean
resistentes a antimetabolitos, v.g. el análogo de treonina ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico
(AHV), o auxotróficas para metabolitos de importancia reguladora,
y producir L-aminoácidos, v.g.
L-treonina.
WO 02/077183 describe (véase SEQ ID No 20560,
56744, 39197, 75381 y las reivindicaciones 457, 471)
microroganismos recombinantes de la familia Enterobacteriáceas, en
particular Escherichia coli, que contienen un "ORF yibD"
sobreexpresado.
Métodos de la tecnología de DNA recombinante han
sido utilizados también desde hace algunos años para mejorar las
cepas productoras de L-aminoácidos de la familia
Enterobacteriáceas por amplificación de genes individuales de la
biosíntesis de los aminoácidos y estudio del efecto sobre la
producción. Una revisión de la biología celular y molecular de
Escherichia coli y Salmonella puede encontrarse en Neidhardt
(ed.): Escherichia coli and Salmonella, Cellular and
Molecular Biology, 2nd edition, ASM Press, Washington DC,
EE.UU.(1996).
WO 03/076637 describe un proceso para la
preparación de L-aminoácidos, especialmente
L-treonina, por fermentación de microorganismos
recombinantes de la familia Enterobacteriáceas que producen el
L-aminoácido deseado y en las cuales el gen pepB
está intensificado o sobreexpresado.
El objetivo que se fijaron los inventores fue
proporcionar nuevos procedimientos para mejorar la preparación de
L-aminoácidos, especialmente
L-treonina, por fermentación.
La descripción proporciona microorganismos
recombinantes de la familia Enterobacteriáceas que contienen un
marco de lectura abierto yibD sobreexpresado que codifica un
polipéptido denominado glicosil-transferasa
supuesta, o secuencias de nucleótidos que codifican su producto
génico, y que producen L-aminoácidos, especialmente
L-treonina, de un modo intensificado.
Los microorganismos que no son recombinantes
para el ORF yibD y no contienen ORF yibD intensificado sirven en
todos los casos como el punto de partida para la comparación.
Estos microorganismos incluyen especialmente los
de la familia Enterobacteriáceas en los cuales está intensificado
un polinucleótido que codifica un polipéptido cuya secuencia de
aminoácidos es al menos 90%, especialmente al menos 95%,
preferiblemente al menos 98% o al menos 99%, de modo
particularmente preferible 99,7% y de modo muy particularmente
preferible 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo que comprende SEQ ID No. 4 y SEQ ID No.
6.
Se prefieren secuencias de aminoácidos idénticas
a las de SEQ ID No. 4 o SEQ ID No. 6.
Dichos microorganismos contienen polinucleótidos
sobreexpresados seleccionados del grupo:
- a)
- polinucleótido con la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5;
- b)
- polinucleótido con una secuencia de nucleótidos correspondiente a SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5 dentro de la degeneración del código genético;
- c)
- polinucleótido con una secuencia que se hibrida en condiciones severas con la secuencia complementaria a la secuencia SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5;
- d)
- polinucleótido con una secuencia SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5 que contiene mutantes sentido neutros,
codificando los polinucleótidos una
glicosil-transferasa
supuesta.
La invención proporciona un proceso de
fermentación para la preparación de L-aminoácidos,
especialmente L-treonina, que utiliza
microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriáceas que,
en particular, producen ya L-aminoácidos y en los
cuales al menos el marco de lectura abierto (ORF) denominado yibD,
o secuencias de nucleótidos que codifican su producto génico, está
(están) sobreexpresados.
Es preferible utilizar los microorganismos
descritos.
El término "L-aminoácidos"
o "aminoácidos" mencionado de aquí en adelante debe entenderse
con el significado de uno o más aminoácidos, con inclusión de sus
sales, seleccionados del grupo constituido por
L-treonina, L-valina,
L-lisina y L-homoserina. Es
particularmente preferida L-treonina.
En este contexto, el término
"intensificación" describe el aumento, en un microorganismo,
de la actividad o concentración intracelular de una o más enzimas o
proteínas codificadas por el DNA apropiado, por ejemplo por aumento
del número de copias del o de los genes u ORF(s) en al
menos una (1) copia, que enlaza funcionalmente un promotor fuerte
al gen, o la utilización de un gen, alelo u ORF que codifica una
enzima/proteína apropiada con una actividad alta, y opcionalmente
combinación de estas medidas.
El marco de lectura abierto (ORF) se entiende
con el significado de un segmento de una secuencia de nucleótidos
que codifica o puede codificar una proteína/polipéptido o ácido
ribonucleico al cual no puede asignarse función alguna de acuerdo
con la técnica anterior.
Después que se ha asignado una función al
segmento de secuencia nucleotídica en cuestión, se hace referencia
generalmente al mismo como un gen. Los alelos se entienden
generalmente con el significado de formas alternativas de un gen
dado. Las formas se distinguen por diferencias en la secuencia de
nucleótidos.
Un producto génico se entiende generalmente con
el significado de la proteína codificada por una secuencia de
nucleótidos, es decir un ORF, un gen o un alelo, o el ácido
ribonucleico codificado.
Por las medidas de mejora, especialmente
sobreexpresión, la actividad o concentración de la proteína
apropiada se aumenta generalmente al menos en 10%, 25%, 50%, 75%,
100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500%, y como máximo hasta 1000% o
2000%, basada en la actividad o concentración de la proteína de
tipo salvaje o la de la proteína en el microorganismo o cepa
parental que no es recombinante para la enzima/proteína apropiada.
Microorganismo o cepa parental no recombinante se entiende con el
significado del microorganismo sobre el cual se realizan las
medidas de acuerdo con la invención.
La invención proporciona un proceso para la
preparación de L-aminoácidos seleccionados del
grupo constituidos por L-treonina,
L-valina, L-lisina y
L-homoserina por la fermentación de microorganismos
recombinantes de la familia Enterobacteriáceas, en donde
- a)
- los microorganismos que producen el L-aminoácido deseado, en los cuales el marco de lectura abierto yibD está sobreexpresado, se cultivan en un medio en condiciones en las cuales el L-aminoácido deseado se enriquece en el medio o en las células, y
- b)
- el L-aminoácido deseado se aísla, quedando los constituyentes del caldo de fermentación, y/o la totalidad o una parte (\geq 0 a 100%) de la biomasa, en el producto aislado o eliminándose completamente,
en donde el marco de lectura
abierto yibD codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos
es al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo que comprende SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 6 y
que tiene la actividad de una glicosiltransferasa
supuesta.
Los microorganismos recombinantes, con un marco
de lectura abierto (ORF) sobreexpresado denominado yibD,
proporcionados también por la presente invención, pueden producir
L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa,
lactosa, fructosa, maltosa, melazas, opcionalmente almidón u
opcionalmente celulosa, o a partir de glicerol y etanol. Dichos
microorganismos son representativos de la familia
Enterobacteriáceas seleccionada de los géneros Escherichia,
Erwinia, Providencia y Serratia. Se prefieren los géneros
Escherichia y Serratia. Las especies Escherichia coli y
Serratia marcescens pueden mencionarse en particular entre
los géneros Escherichia y Serratia respectivamente.
\newpage
Los microorganismos recombinantes se producen
generalmente por transformación, transducción o conjugación, o una
combinación de estos métodos, con un vector que contiene el ORF
deseado, el gen deseado, un alelo de este ORF o gen o partes del
mismo, y/o un promotor que intensifica la expresión del ORF o el
gen. Este promotor puede ser el promotor que se origina por
mutación intensificadora de la secuencia reguladora inherente
localizada aguas arriba del gen u ORE, o un promotor eficiente que
se ha fusionado con el gen u ORF.
Ejemplos de cepas adecuadas, particularmente
cepas productoras de L-treonina, del género
Escherichia, y especialmente de la especie Escherichia coli
son:
- -
- Escherichia coli H4581 (EP 0 301 572)
- -
- Escherichia coli KY10935 (Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 61(11), 1877-1882 (1997))
- -
- Escherichia coli VNIIgenetika MG442 (US-A-4,278,765)
- -
- Escherichia coli VNIIgenetika M1 (US-A-4,321,325)
- -
- Escherichia coli VNIIgenetika 472T23 (US-A-5,631,157)
- -
- Escherichia coli BKIIM B-3996 (US-A-5,175,107)
- -
- Escherichia coli kat 13 (WO 98/04715)
- -
- Escherichia coli KCCM-10132 (WO 00/09660)
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos de cepas adecuadas productoras de
L-treonina del género Serratia, y especialmente de
la especie Serratia marcescens, son:
- -
- Serratia marcescens HNr21 (Applied and Environmental Microbiology 38(6), 1045-1051 (1979))
- -
- Serratia marcescens TLr156 (Gene 57(2-3), 151-158 (1987))
- -
- Serratia marcescens T-2000 (Applied Biochemistry and Biotechnology 37(3), 255-265 (1992))
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas productoras de
L-treonina de la familia Enterobacteriáceas poseen
preferiblemente, inter alia, una o más características genéticas o
fenotípicas seleccionadas del grupo que comprende resistencia a
ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico,
resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a
\alpha-metilserina, resistencia a ácido
diaminosuccínico, resistencia a ácido
\alpha-aminobutírico, resistencia a borrelidina,
resistencia a ácido ciclopentano-carboxílico,
resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina tales
como hidroxamato de valina, resistencia a análogos de purina tales
como 6-dimetilaminopurina, necesidad de
L-metionina, opcionalmente necesidad parcial y
compensable de L-isoleucina, necesidad de ácido
meso-diaminopimélico, auxotrofia con respecto a
dipéptidos que contienen treonina, resistencia a
L-treonina, resistencia a refinado de treonina,
resistencia a L-homoserina, resistencia a
L-lisina, resistencia a
L-metionina, resistencia a ácido
L-glutámico, resistencia a
L-aspartato, resistencia a
L-leucina, resistencia a
L-fenilalanina, resistencia a
L-serina, resistencia a L-cisteína,
resistencia a L-valina, sensibilidad a
fluoropiruvato, treonina-deshidrogenasa deficiente,
opcionalmente capacidad para utilización de sacarosa,
intensificación del operón treonina, intensificación de la
homoserina-deshidrogenasa
I-aspartato-quinasa I,
preferiblemente de la forma resistente a la realimentación,
intensificación de homoserina-quinasa,
intensificación de treonina-sintasa,
intensificación de aspartato-quinasa, opcionalmente
de la forma resistente a la realimentación, intensificación de
aspartato-semialdehído-deshidrogenasa,
intensificación de fosfoenolpiruvato-carboxilasa,
opcionalmente de la forma resistente a la realimentación,
intensificación de fosfoenolpiruvato-sintasa,
intensificación de transhidrogenasa, intensificación del producto
del gen RhtB, intensificación del producto del gen RhtC,
intensificación del producto del gen YfiK, intensificación de una
piruvato-carboxilasa y atenuación de la formación
de ácido acético.
Se ha encontrado que la producción de
L-aminoácidos, especialmente
L-treonina, por microorganismos de la familia
Enterobacteriáceas se mejora después de sobreexpresión del gen o
marco de lectura abierto (ORF) yibD o sus alelos.
Las secuencias de nucleótidos de los genes o
marcos de lectura abiertos (ORFs) de Escherichia coli
pertenecen a la técnica anterior y pueden tomarse de la secuencia
genómica de Escherichia coli publicada por Blattner et
al (Science 277, 1453-1462 (1997)). Se sabe que
el aminoácido metionina N-terminal puede ser
escindido por enzimas específicas del hospedador
(metionina-aminopeptidasa).
La secuencia de nucleótidos para el ORF yibD es
conocida análogamente de Salmonella typhimurium, que
pertenece también a la familia Enterobacteriáceas.
\newpage
El ORF yibD de Escherichia coli K12 se
describe inter alia por los datos siguientes:
- Nombre:
- marco de lectura abierto
- Función:
- glucosil-transferasa supuesta
- Descripción:
- el marco de lectura abierto yibD codifica una proteína de 40,5 kDa; el punto isoeléctrico es 9,4; el ORF yibD está localizado en un cromosoma v.g. en el caso de Escherichia coli K12 MG1655 en la región intergénica del marco de lectura abierto yibQ que codifica una proteína hipotética, y el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa
- Referencia:
- Blattner et al., Science 277 (5331), 1453-1474 (1997)
- No. de acceso:
- AE000439
- Nombre alternativo del gen:
- b3615
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de ácido nucleico pueden tomarse
de los bancos de datos del National Center for Biotechnology
Information (NCBI) de la National Library of Medicine (Bethesda,
MD, EE.UU.), el banco de datos de secuencias de nucleótidos de los
European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg,
Alemania, o Cambridge, Reino Unido) o el banco de datos de DNA de
Japón (DDBJ, Mishima, Japón).
Para mayor claridad, la secuencia conocida del
ORF yibD de Escherichia coli se muestra como SEQ ID No. 3 y
la secuencia conocida del ORF yibD de Salmonella typhimurium
se muestra como SEQ ID No. 5. Las proteínas codificadas por estos
marcos de lectura se muestran como SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 6.
Los marcos de lectura abiertos descritos en las
referencias bibliográficas citadas pueden utilizarse de acuerdo
con la invención. Es asimismo posible utilizar alelos de los genes,
o marcos de lectura abiertos, que resultan de la degeneración del
código genético o de mutaciones sentido neutras. Se prefiere el uso
de genes endógenos o marcos de lectura abierta endógenos.
El término "genes endógenos" o
"secuencias de nucleótidos endógenas" debe entenderse con el
significado de los genes, marcos de lectura abiertos o alelos, o
secuencias de nucleótidos, presentes en la población de una
especie.
Los alelos del ORF yibD que contienen mutaciones
sentido neutras incluyen, inter alia, aquéllos que dan como máximo
40, como máximo 30 o como máximo 20, preferiblemente como máximo 10
o como máximo 5, de modo muy particularmente preferible como máximo
3 o como máximo 2 o al menos un cambio conservador de aminoácido en
la proteína codificada por ellos.
En el caso de aminoácidos aromáticos, se hace
referencia a cambios conservadores cuando se cambian unos por
otros fenil-alanina, triptófano y tirosina. En el
caso de aminoácidos hidrófobos, se hace referencia a cambios
conservadores cuando se cambian unos por otros leucina, isoleucina
y valina. En el caso de aminoácidos polares, se hace referencia a
cambios conservadores cuando se cambian una por otra glutamina y
aspargina. En el caso de aminoácidos básicos, se hace referencia a
cambios conservadores cuando se cambian unos por otros arginina,
lisina e histidina. En el caso de aminoácidos ácidos, se hace
referencia a cambios conservadores cuando se cambian uno por otro
ácido aspártico y ácido glutámico. En el caso de aminoácidos que
contienen grupos hidroxilo, se hace referencia a cambios
conservadores cuando se cambian una por otra serina y treonina.
Análogamente, es también posible utilizar
secuencias de nucleótidos que codifican variantes de dichas
proteínas que comprenden adicionalmente un alargamiento o
acortamiento en al menos un (1) aminoácido en el término N o C.
Este alargamiento o acortamiento asciende a no más de 50, 40, 30,
20, 10, 5, 3 ó 2 aminoácidos o residuos de aminoácidos.
Alelos adecuados incluyen también aquéllos que
codifican proteínas en las cuales se ha insertado (inserción) o
delecionado (deleción) al menos un (1) aminoácido. El número máximo
de tales cambios, denominados indels, puede afectar a 2, 3, 5, 10 ó
20 aminoácidos, pero en ningún caso más de 30 aminoácidos.
Alelos adecuados incluyen también aquéllos que
pueden obtenerse por hibridación, especialmente en condiciones
severas, utilizando SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5 o porciones de las
mismas, especialmente las regiones codificantes o las secuencias
complementarias a las mismas.
Los expertos en la técnica encontrarán
instrucciones acerca de la identificación de secuencias de DNA por
medio de hibridación en, inter alia, el manual "The DIG System
User's Guide for Filter Hybridization", de Boehringer Mannheim
GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl et al.
(International Journal of Systematic Bacteriology 41,
255-260 (1991)). La hibridación tiene lugar en
condiciones severas, es decir, los únicos híbridos formados son
aquéllos en los cuales la sonda y la secuencia diana, es decir los
polinucleótidos tratados con la sonda, son al menos 80% idénticos.
Es sabido que la severidad de la hibridación, con inclusión de los
pasos de lavado, se ve influida o determinada por variación de la
composición del tampón, la temperatura y la concentración de sales.
La reacción de hibridación se lleva a cabo generalmente a
severidad relativamente baja comparada con los pasos de lavado
(Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, Reino
Unido, 1996).
La reacción de hibridación puede llevarse a cabo
utilizando v.g. un tampón correspondiente a 5x tampón SSC a una
temperatura de aprox. 50ºC-68ºC. Es también posible
en este caso hibridar sondas con polinucleótidos que son menos de
80% idénticos a la secuencia de la sonda. Tales híbridos son menos
estables y se separan por lavado en condiciones severas. Esto puede
realizarse v.g. por disminución de la concentración de sales a 2x
SSC y opcionalmente 0,5x SSC posteriormente (The DIG System User's
Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim,
Alemania, 1995), ajustándose la temperatura a aprox.
50ºC-68ºC; aprox. 52ºC-68ºC, aprox.
54-68ºC, aprox. 56ºC-68ºC, aprox.
58ºC-68ºC, aprox. 60ºC-68ºC, aprox.
62ºC-68ºC, aprox. 64ºC-68ºC o
aprox. 66ºC-68ºC. Se prefieren intervalos de
temperatura de aprox. 64ºC-68ºC o aprox.
66ºC-68ºC. Opcionalmente es posible rebajar la
concentración de sales hasta un valor correspondiente a 0,2x SSC o
0,1x SSC. Por aumento gradual de la temperatura de hibridación
desde 50ºC a 68ºC en pasos de aprox. 1-2ºC, es
posible aislar fragmentos de polinucleótidos que son v.g. al menos
80%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al
menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o
al menos 99% idénticos a la secuencia de la sonda utilizada o a las
secuencias de nucleótidos que se muestran en SEQ ID No. 3 o SEQ ID
No. 5. Instrucciones adicionales sobre hibridación están
disponibles comercialmente en forma de kit (v.g. DIG Easy Hyb de
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, catálogo no.
1603558).
La intensificación puede realizarse por ejemplo
por aumento de la expresión de los genes, marcos de lectura
abiertos o alelos o intensificación de las propiedades catalíticas
de la proteína. Ambas medidas pueden combinarse opcionalmente.
La sobreexpresión puede realizarse por ejemplo
por aumento del número de copias de los genes o marcos de lectura
abiertos apropiados o mutación del promotor y la región reguladora
o el sitio de fijación de ribosoma localizado aguas arriba del gen
estructural. Las casetes de expresión incorporadas aguas arriba del
gen estructural actúan del mismo modo. Promotores inducibles hacen
adicionalmente posible aumentar la expresión en el curso de la
producción de L-treonina por fermentación; el uso de
promotores para expresión génica que permite la expresión de otros
genes transitorios puede ser también ventajoso. Medidas para
prolongación de la vida del mRNA mejoran también la expresión.
Adicionalmente, la actividad enzimática se intensifica también por
prevención de la degradación de la proteína enzimática. Los ORFs,
genes o constructos génicos pueden estar localizados en plásmidos
de número de copias variable o estar integrados y amplificados en
el cromosoma. Alternativamente, es también posible conseguir la
sobreexpresión de los genes en cuestión por cambio de la
composición de los medios y la técnica de cultivo.
Métodos de sobreexpresión se describen
adecuadamente en la técnica anterior, por ejemplo en Makrides et
al. (Microbiological Reviews 60(3),
512-538 (1996)). El uso de vectores aumenta el
número de copias al menos en una (1) copia. Plásmidos tales como
los descritos v.g. en US 5.538.873 pueden utilizarse como vectores.
Fagos, por ejemplo el fago mu, como se describe en EP 0332448, o el
fago lambda (\lambda), pueden utilizarse también como vectores.
El número de copias puede aumentarse también por incorporación de
otra copia en otro sitio del cromosoma, por ejemplo en el sitio att
del fago \lambda (Yu y Court, Gene 223, 77-81
(1998)). El documento US 5.939.307 describe que la expresión podría
incrementarse por incorporación de casetes de expresión o
promotores tales como el promotor tac, el promotor trp, el promotor
lpp o el promotor P_{L} y el promotor P_{R} del fago \lambda,
por ejemplo aguas arriba del operón cromosómico de treonina. Los
promotores del fago T7, los promotores de "caja de cambios"
(sic) o el promotor nar pueden utilizarse análogamente. Tales
casetes de expresión o promotores pueden utilizarse también para
sobreexpresar genes unidos a plásmidos, como se describe en EP 0
593 792. La expresión de genes unidos a plásmidos puede controlarse
a su vez por utilización del alelo lacIº (Glascock y Weickert, Gene
223, 221-231 (1998)). Adicionalmente, es posible
aumentar la actividad de los promotores por modificación de su
secuencia por uno o más cambios de nucleótidos, por una o más
inserciones y/o por una o más deleciones. Otra expresión de genes
transitorios puede lograrse por utilización del promotor fis
dependiente de la fase de crecimiento, por ejemplo como se
describe en Walker et al (Journal of Bacteriology 181,
1269-80 (1999)).
Los expertos en la técnica encontrarán
instrucciones generales relevantes inter alia en Chang y Cohen
(Journal of Bacteriology 134, 1141-1156 (1978)),
Hartley y Gregori (Gene 13, 347-353 (1981)), Amann
y Brosius (Gene 40, 183190 (1985)), de Broer et al.
(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America 80, 21-25 (1983)), LaVallie et
al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187-193 (1993)),
PCT/US97/13359, Liosa et al. (Plasmid 26,
222-224 (1991)), Quandt y Klipp (Gene 80,
161-169 (1989)), Hamilton et al. (Journal of
Bacteriology 171, 4617-4622 (1989)); Jensen y
Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195
(1998)) y libros de texto bien conocidos sobre genética y biología
molecular.
Pueden utilizarse vectores plasmídicos
replicables en Enterobacteriáceas, v.g. vectores de clonación
derivados de pACYC184 (Bartolomé et al., Gene 102,
75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al., Gene
69, 301-315 (1988)) o derivados de pSC101 (Vocke y
Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences USA
80(21), 6557-6561 (1983)). En un proceso de
acuerdo con la invención, es posible utilizar una cepa transformada
con un vector plasmídico, llevando dicho vector plasmídico al menos
una secuencia de nucleótidos que codifica el ORF yibD o su producto
génico, o alelo.
El término "transformación" debe entenderse
con el significado de la absorción de un ácido nucleico aislado
por un hospedador (microorganismo).
Asimismo, mutaciones que afectan a la expresión
de los genes o marcos de lectura abiertos apropiados pueden
transferirse a cepas diferentes por cambio de secuencia (Hamilton
et al., Journal of Bacteriology 171,
4617-4622 (1989)), conjugación o transducción.
Detalles adicionales sobre los conceptos de
genética y biología molecular pueden encontrarse en libros de texto
bien conocidos sobre genética y biología molecular, por ejemplo el
libro de texto de Birge (Bacterial and Bacteriophage Genetics, 4th
ed., Springer Verlag, Nueva York (EE.UU.), 2000), el libro de texto
de Berg, Tymoczko y Stryer (Biochemistry, 5th ed., Freeman and
Company, Nueva York (EE.UU.), 2002) o el libro de texto de Sambrook
et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual (conjunto de
3 volúmenes), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor (EE.UU.), 2001).
Adicionalmente, para la producción de
L-aminoácidos, especialmente
L-treonina, con cepas de la familia
Enterobacteriáceas, puede ser ventajoso no sólo intensificar el
marco de lectura abierto yibD, sino también intensificar una o más
enzimas del camino conocido de biosíntesis de la treonina, o enzimas
del metabolismo anaplerótico, o enzimas para la producción de
nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato
reducido, o enzimas glicolíticas, o enzimas PTS, o enzimas del
metabolismo del azufre. Generalmente se prefiere el uso de genes
endógenos.
Así, por ejemplo, uno o más genes seleccionados
del grupo que comprende:
- \bullet
- al menos un gen del operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa (US-A-4.278.765),
- \bullet
- el gen pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica piruvato-carboxilasa (WO 99/18228),
- \bullet
- el gen pps que codifica fosfoenol-piruvato-sintasa (Molecular and General Genetics 231(2), 332-336 (1992)),
- \bullet
- el ppc gen que codifica fosfoenolpiruvato carboxilasa (WO 02/064808),
- \bullet
- los genes pntA y pntB que codifican las subunidades de transhidrogenasa (European Journal of Biochemistry 158, 647-653 (1986)),
- \bullet
- el gen rhtB que codifica la proteína que confiere resistencia a homoserina (EP-A-0 994 190),
- \bullet
- el gen rhtC que codifica la proteína que confiere resistencia a treonina (EP-A-1 013 765),
- \bullet
- el thrE gen de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína portadora de la exportación de treonina (WO 01/92545),
- \bullet
- el gdhA gen que codifica glutamato-deshidrogenasa (Nucleic Acids Research 11, 5257-5266 (1983); Gene 23, 199-209 (1983)),
- \bullet
- el gen pgm que codifica fosfoglucomutasa (WO 03/004598),
- \bullet
- el gen fba que codifica fructosa-bisfosfato-aldolasa (WO 03/004664),
- \bullet
- el gen ptsH del operón ptsHlcrr que codifica fosfohistidina-protein-hexosa-fosfotransferasa del sistema de fosfotransferasa PTS (WO 03/004674),
- \bullet
- el gen ptsI del operón ptsHlcrr que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa PTS (WO 03/004674),
- \bullet
- el gen crr del operón ptsHlcrr que codifica el componente IIA específico de glucosa del sistema de fosfotransferasa PTS (WO 03/004674),
- \bullet
- el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico de glucosa (WO 03/004670),
- \bullet
- el gen lrp que codifica el regulador del regulan leucina (WO 03/004665),
- \bullet
- el gen fadR que codifica el regulador del regulan fad (WO 03/038106),
- \bullet
- el gen ic1R que codifica el regulador del metabolismo central intermedio (WO 03/038106),
- \bullet
- el gen ahpC del operón ahpCF que codifica la subunidad pequeña de alquil-hidroperóxido-reductasa (WO 03/004663),
\newpage
- \bullet
- el gen ahpF del operón ahpCF que codifica la subunidad grande de alquil-hidroperóxido-reductasa (WO 03/004663),
- \bullet
- el gen cysK que codifica cisteina-sintasa A (WO 03/006666),
- \bullet
- el gen cysB que codifica el regulador del regulón cys (WO 03/006666),
- \bullet
- el gen cysJ del operón cysJIH que codifica la flavo-proteína de la NADPH-sulfito-reductasa (WO 03/006666),
- \bullet
- el gen cysI del operón cysJlH que codifica la hemo-proteína de la NADPH-sulfito-reductasa (WO 03/006666),
- \bullet
- el gen cysH del operón cysJIH que codifica adenilil-sulfato-reductasa (WO 03/006666),
- \bullet
- el gen rseA del operón rseABC que codifica una proteína de membrana con actividad anti-sigmaE (WO 03/008612),
- \bullet
- el gen rseC del operón rseABC que codifica un regulador global del factor sigmaE (WO 03/008612),
- \bullet
- el gen sucA del operón sucABCD que codifica la subunidad descarboxilasa de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa (WO 03/008614),
- \bullet
- el gen sucB del operón sucABCD que codifica la subunidad dihidrolipoil-transsuccinasa E2 de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa (WO 03/008614),
- \bullet
- el gen sucC del operón sucABCD que codifica la subunidad \beta de succinil-CoA-sintetasa (WO 03/008615),
- \bullet
- el gen sucD del operón sucABBD que codifica la subunidad \alpha de succinil-CoA-sintetasa (WO 03/008615),
- \bullet
- el gen aceE que codifica el componente El del complejo piruvato-deshidrogenasa (WO 03/076635),
- \bullet
- el gen aceF que codifica el componente E2 del complejo piruvato-deshidrogenasa (WO 03/076635),
- \bullet
- el gen rseB que codifica el regulador de la actividad del factor sigmaE (Molecular Microbiology 24(2), 355-371 (1997)),
- \bullet
- el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yodA de Escherichia coli (Número de Acceso AE000288 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.), DE 10361192.4),
- \bullet
- el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yaaU de Escherichia coli (Número de Acceso AE005181 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.), DE 10361268.8),
- \bullet
- el gen malT para el activador positivo de la transcripción del regulón maltosa (Gene 42, 201-208 (1986)) y
- \bullet
- el gen eno que codifica enolasa (The Journal of Biological Chemistry 246(22), 6797-6802 (1971)) pueden sobreexpresarse simultáneamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, para la producción de
L-treonina, puede ser ventajoso no sólo
intensificar el marco de lectura abierto yibD, sino también
desactivar uno o más genes seleccionados del grupo que
comprende:
- \bullet
- el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa (Journal of Bacteriology 169, 4716-4721 (1987)),
- \bullet
- el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa (E.C.1.1.1.37) (Archives in Microbiology 149, 36-42 (1987)),
- \bullet
- el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yjfA de Escherichia coli (Número de Acceso AAC77180 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.), WO 02/29080),
- \bullet
- el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) ytfP de Escherichia coli (Número de Acceso AAC77179 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.), WO 02/29080),
- \bullet
- el gen pckA que codifica la enzima fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa (WO 02/29080),
- \bullet
- el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa (WO 02/36797),
- \bullet
- el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa (WO 02/081721), que es conocido también como el gen mlc,
- \bullet
- el gen fruR que codifica el represor fructosa (WO 02/081698), que es conocido también como el gen cra,
- \bullet
- el gen rpoS que codifica el factor sigma3B (WO 01/05939), que es conocido también como el gen katF, y
- \bullet
- el gen aspA que codifica aspartato-amonio-liasa (WO 03/008603),
o reducir la expresión de los
mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
En este contexto, el término "atenuación"
describe la disminución o desactivación de la actividad o
concentración intracelular, en un microorganismo, de una o más
enzimas/proteínas codificadas por el DNA apropiado, por ejemplo
por utilización de un promotor más débil que en el microorganismo o
cepa parental que no es recombinante para la enzima/proteína
apropiada, o un gen o alelo que codifica una enzima/proteína
apropiada con una actividad baja, o desactivación de la
enzima/proteína, el marco de lectura abierto o el gen apropiados, y
opcionalmente combinación de estas medidas.
Las medidas de atenuación reducen generalmente
la actividad o concentración de la proteína apropiada en un 0 a
75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% o 0 a 5% de la actividad o
concentración de la proteína de tipo salvaje o de la actividad o
concentración de la proteína en el microorganismo o cepa parental
que no es recombinante para la enzima/proteína apropiada.
Microorganismo o cepa parental no recombinante debe entenderse con
el significado del microorganismo sobre el cual se realizan las
medidas de acuerdo con la invención.
La atenuación puede realizarse por ejemplo por
reducción o desactivación de la expresión de los genes o marcos de
lectura abiertos o las propiedades catalíticas de las proteínas
enzimáticas. Ambas medidas pueden combinarse opcionalmente.
La expresión de los genes puede reducirse por
una técnica de cultivo apropiada, por modificación genética
(mutación) de las estructuras señal de la expresión génica o bien
por una técnica de RNA antisentido. Estructuras señal de la
expresión génica son v.g. genes represores, genes activadores,
operadores, promotores, atenuadores, sitios de fijación de
ribosoma, el codón inicial y los terminadores. Los expertos en la
técnica encontrarán información relevante inter alia en v.g. Jensen
y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58,
191-195 (1998)), Carrier y Keasling (Biotechnology
Progress 15, 58-64 (1999)), Franch y Gerdes
(Current Opinion in Microbiology 3, 159-164 (2000))
y libros de texto bien conocidos sobre genética y biología
molecular, tales como el libro de texto de Knippers ("Molekulare
Genetik", 6ª edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania,
1995) o el de Winnacker (From Genes to Clones, VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990).
Mutaciones que dan como resultado una
modificación o reducción de las propiedades catalíticas de las
proteínas enzimáticas son conocidas por la técnica anterior.
Ejemplos que pueden mencionarse son los documentos de Qiu y
Goodman (Journal of Biological Chemistry 272,
8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America
95, 5511-5515 (1998)) y Wente y Schachmann (Journal
of Biological Chemistry 266, 20833-20839 (1991)).
Pueden encontrarse revisiones en libros de textos bien conocidos
sobre genética y biología molecular, por ejemplo el publicado por
Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag,
Stuttgart, 1986).
Mutaciones posibles son transiciones,
transversiones, inserciones y deleciones de al menos un (1) par de
bases/nucleótido. Dependiendo del efecto del cambio de aminoácido
causado por la mutación de la actividad enzimática, se utiliza el
término "mutaciones de sentido erróneo" o "mutaciones sin
sentido". Una mutación de sentido erróneo da como resultado un
cambio de un aminoácido dado en una proteína por otro aminoácido,
siendo dicho cambio de aminoácido particularmente no conservador.
Esto deteriora la aptitud o actividad funcional de la proteína y
reduce la misma a un valor de 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% o
0 a 5%. Una mutación sin sentido da como resultado un codón de
parada en la región codificante del gen y por tanto una terminación
prematura de la traducción. Inserciones o deleciones de al menos un
par de bases en un gen dan como resultado mutaciones de
desplazamiento de marco, cuya consecuencia es que se incorporan
aminoácidos falsos o se termina prematuramente la traducción. Si se
produce un codón de parada en la región codificante como
consecuencia de la mutación, esto da también como resultado una
terminación prematura de la traducción. Deleciones de al menos uno
(1) o varios codones dan como resultado también típicamente una
pérdida completa de la actividad enzimática.
Instrucciones acerca de la producción de tales
mutaciones pertenecen a la técnica anterior y pueden encontrarse
en libros de texto bien conocidos sobre genética y biología
molecular, tales como el libro de texto de Knippers ("Molekulare
Genetik", 6a edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania,
1995), el de Winnacker (From Genes to Clones, VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o el de Hagemann
("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,
1986).
Mutaciones adecuadas en los genes pueden
incorporarse en cepas adecuadas por cambio de genes o alelos.
Un método común es el de cambio de gen con ayuda
de un derivado pMAK705 de pSC101 que se replica condicionalmente,
como ha sido descrito por Hamilton et al. (Journal of
Bacteriology 171, 4617-4622 (1989)). Pueden
utilizarse análogamente otros métodos descritos en la técnica
anterior, por ejemplo el de Martínez-Morales et
al(Journal of Bacteriology 181, 7143-7148
(1999)) o el de Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182,
842-847 (2000)).
Son asimismo posibles mutaciones en los genes
particulares, o mutaciones que afectan a la expresión de los genes
o marcos de lectura abiertos particulares, que son transferidas a
cepas diferentes por conjugación o transducción.
Adicionalmente, para la producción de
L-aminoácidos, especialmente
L-treonina, puede ser ventajoso no sólo intensificar
el marco de lectura abierto yibD, sino también desactivar
reacciones secundarias indeseables (Nakayama: "Breeding of Amino
Acid Producing Microorganisms", en: Overproduction of Microbial
Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press,
Londres, Reino Unido, 1982).
Los microorganismos preparados de acuerdo con la
invención pueden cultivarse por el proceso de lotes, el proceso de
lote alimentado ("fed batch"), el proceso de lote alimentado
repetido, o un proceso continuo (DE 102004028859.3 o US 5.763.230).
Un sumario de métodos de cultivo conocidos se proporciona en el
libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die
Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en
el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere
Einrichtungen (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo a utilizar debe cumplir
adecuadamente las exigencias de las cepas particulares.
Descripciones de medios de cultivo para diversos microorganismos
se contienen en "Manual of Methods for General Bacteriology"
de la American Society for Bacteriology (Washington DC, EE.UU.,
1981).
Fuentes de carbono que pueden utilizarse son
azúcares y carbohidratos, v.g. glucosa, sacarosa, lactosa,
fructosa, maltosa, melazas, almidón y opcionalmente celulosa,
aceites y grasas, v.g. aceite de soja, aceite de girasol, aceite de
cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos, v.g. ácido palmítico,
ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes, v.g. glicerol y
etanol, y ácidos orgánicos, v.g. ácido acético. Estas sustancias
pueden utilizarse individualmente o en forma de mezcla.
Fuentes de nitrógeno que pueden utilizarse son
compuestos orgánicos nitrogenados tales como peptonas, extracto de
levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de maceración
de maíz, harina de semilla de soja y urea, o compuestos inorgánicos
tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio,
carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno
pueden utilizarse individualmente o en forma de mezcla.
Fuentes de fósforo que pueden utilizarse son
ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato
dipotásico, o las sales de sodio correspondientes. El medio de
cultivo debe contener también sales metálicas, v.g. sulfato de
magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el
crecimiento. Finalmente, pueden utilizarse sustancias esenciales
promotoras del crecimiento tales como aminoácidos y vitaminas
además de las sustancias arriba mencionadas. Pueden añadirse
también al medio de cultivo precursores adecuados. Dichos
materiales de alimentación pueden añadirse al medio de cultivo en
una sola vez o dosificarse adecuadamente durante el cultivo.
La fermentación se lleva a cabo generalmente a
un pH de 5,5 a 9,0, especialmente de 6,0 a 8,0. El pH del cultivo
se controla por el uso apropiado de compuestos básicos tales como
hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o amoníaco
acuoso, o compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido
sulfúrico. La formación de espuma puede controlarse utilizando
antiespumantes tales como ésteres poliglicólicos de ácidos grasos.
La estabilidad de los plásmidos pueden mantenerse por adición al
medio de sustancias de acción selectiva adecuadas, v.g.
antibióticos. Se mantienen condiciones aerobias por introducción de
oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno, v.g. aire, en el
cultivo. La temperatura del cultivo es normalmente de 25ºC a 45ºC y
preferiblemente 30ºC a 40ºC. El cultivo se continúa hasta que la
formación de L-aminoácidos o
L-treonina ha alcanzado un máximo. Este objetivo se
consigue normalmente dentro de 10 horas a 160 horas.
Los L-aminoácidos pueden
analizarse por cromatografía de intercambio aniónico seguida por
derivatización con ninhidrina, como se describe por Spackman et
al. (Analytical Chemistry 30, 1190-1206
(1958)), o por HPLC en fase inversa, como se describe por Lindroth
et al. (Analytical Chemistry 51, 1167-1174
(1979)).
El proceso de acuerdo con la invención se
utiliza para preparar los L-aminoácidos
L-treonina, L-valina,
L-homoserina y L-lisina,
especialmente L-treonina, por fermentación. El
microorganismo siguiente ha sido depositado en la German Collection
of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Brunswick, Alemania) de
acuerdo con los términos del Convenio de Budapest:
- \bullet
- cepa de Escherichia coli E. coli MG442 como DSM16574.
La presente invención se ilustra a continuación
con mayor detalle con ayuda de ejemplos.
El medio mínimo (M9) y el medio completo (LB)
utilizados para Escherichia coli han sido descritos por J.H.
Miller, A Short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold Spring
Harbor Laboratory Press). El aislamiento de DNA plasmídico a partir
de Escherichia coli y todas las técnicas para restricción,
ligación, tratamiento Klenow y tratamiento con fosfatasa alcalina
se llevan a cabo de acuerdo con Sambrook et al. (Molecular
Cloning - A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory
Press). A no ser que se indique otra cosa, la transformación de
Escherichia coli se lleva a cabo de acuerdo con Chung et
al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 86, 2172-2175 (1989)).
La temperatura de incubación en la preparación
de las cepas y los transformantes es 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen yibD de E. coli K12 se amplifica
utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y
oligonucleótidos sintéticos. La secuencia de nucleótidos del ORF
yibD en E. coli K12 MG1655 (Número de Acceso AE000439,
Blattner et al. (Science 277, 1453-1474
(1997))) se utiliza como material de partida para sintetizar los
iniciadores de la PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania). Las
secuencias de los iniciadores se modifican para proporcionar sitios
de reconocimiento para las enzimas de restricción. La secuencia de
reconocimiento para SacI se selecciona para el iniciador
yibD-ex1 y la secuencia de reconocimiento para
HindIII se selecciona para el iniciador yibD-ex2,
estando subrayadas dichas secuencias en las secuencias de
nucleótidos que se muestran a continuación:
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655
utilizando para la PCR se aísla con "Qiagen
Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Alemania)
de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un fragmento de
DNA de aproximadamente 1114 pb puede amplificarse con los
iniciadores específicos en condiciones PCR estándar (Innis et
al (1990), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications,
Academic Press) utilizando DNA polimerasa Vent (New England Biolabs
GmbH, Frankfurt, Alemania) (SEQ ID No. 3).
El fragmento yibD amplificado se liga con el
vector pCR-Blunt II-TOPO (Zero Topo
TA Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Países Bajos) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante y se transforma en la cepa TOP10
de E. coli. Las células portadoras de plásmido se
seleccionan en agar LB complementado con 50 \mug/ml de
kanamicina. Después de aislamiento del DNA plasmídico, el vector se
escinde con las enzimas PvuI y HindIII/SacI y, después que se ha
comprobado la escisión en gel de agarosa al 0,8%, se denomina
pCRBluntyibD.
El vector pCRBluntyibD se escinde luego con las
enzimas HindIII y SacI y, después de separación en gel de agarosa
al 0,8%, el fragmento yibD se aísla del gel
(QIA-quick Gel Extraction Kit, QIAGEN, Hilden,
Alemania) y se liga con el vector pTrc99A (Pharmacia Biotech,
Uppsala, Suecia) que se ha digerido con las enzimas HindIII y SacI.
La cepa de E. coli XL1Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, EE.
UU.) se transforma con la mezcla de ligación y se seleccionan las
células portadoras del plásmido en agar LB complementado con 50
\mug/ml de ampicilina.
El éxito de la clonación puede demostrarse,
después de aislamiento del DNA plasmídico, por escisión controlada
con la enzima PvuI.
El plásmido se denomina pTrc99AyibD (Figura
1).
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa de E. coli MG442 productora de
L-treonina se describe en la patente
US-A-4.278.765, y está depositada
en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms
(VKPM, Moscú, Rusia) como CMIM B-1628 y en la
Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos de Células (DSMZ,
Brunswick, Alemania) como DSM 16574 bajo los términos del Convenio
de Budapest.
La cepa MG442 se transforma con el plásmido de
expresión pTrc99AyibD, descrito en el Ejemplo 1, y con el vector
pTrc99A, y las células portadoras del plásmido se seleccionan en
agar LB complementado con 50 \mug/ml de ampicilina. Este
procedimiento produce las cepas MG442/pTrc99AyibD y MG442/pTrc99A.
Las colonias individuales seleccionadas se multiplican luego
adicionalmente en medio mínimo de la composición siguiente: 3,5 g/l
de Na_{2}HPO_{4}\cdot
2H_{2}O, 1,5 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1 g/l de NH_{4}Cl, 0,1 g/l de MgSO_{4}.7H_{2}O, 2 g/l de glucosa, 20 g/l de agar, 50 mg/l de ampicilina. La formación de L-treonina se verifica en cultivos lote de 10 ml contenidos en matraces cónicos de 100 ml. Esto se realiza por inoculación de 10 ml de medio de precultivo de la composición siguiente: 2 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/1 de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 15 g/l de CaCO_{3}, 20 g/l de glucosa, 50 mg/l de ampicilina, e incubación durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en una incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza). Se transfieren 250 \mul de cada uno de estos precultivos a 10 ml de medio de producción (25 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1 g/l de MgSO_{4}.7H_{2}O, 0,03 g/l de FeSO_{4}.7H_{2}O, 0,018 g/l de MnSO_{4}.1H_{2}O, 30 g/l de CaCO_{3}, 20 g/l de glucosa, 50 mg/l de ampicilina) y se incuban durante 48 horas a 37ºC. La formación de L-treonina por la cepa original MG442 se verifica del mismo modo excepto que no se añade cantidad alguna de ampicilina al medio. Después de la incubación, se determina la densidad óptica (DO) de la suspensión de cultivo utilizando un fotómetro LP2W del Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania) a una longitud de onda de medida de 660 nm.
2H_{2}O, 1,5 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1 g/l de NH_{4}Cl, 0,1 g/l de MgSO_{4}.7H_{2}O, 2 g/l de glucosa, 20 g/l de agar, 50 mg/l de ampicilina. La formación de L-treonina se verifica en cultivos lote de 10 ml contenidos en matraces cónicos de 100 ml. Esto se realiza por inoculación de 10 ml de medio de precultivo de la composición siguiente: 2 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/1 de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 15 g/l de CaCO_{3}, 20 g/l de glucosa, 50 mg/l de ampicilina, e incubación durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en una incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza). Se transfieren 250 \mul de cada uno de estos precultivos a 10 ml de medio de producción (25 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1 g/l de MgSO_{4}.7H_{2}O, 0,03 g/l de FeSO_{4}.7H_{2}O, 0,018 g/l de MnSO_{4}.1H_{2}O, 30 g/l de CaCO_{3}, 20 g/l de glucosa, 50 mg/l de ampicilina) y se incuban durante 48 horas a 37ºC. La formación de L-treonina por la cepa original MG442 se verifica del mismo modo excepto que no se añade cantidad alguna de ampicilina al medio. Después de la incubación, se determina la densidad óptica (DO) de la suspensión de cultivo utilizando un fotómetro LP2W del Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania) a una longitud de onda de medida de 660 nm.
La concentración de L-treonina
formada se determina luego en el sobrenadante de cultivo filtrado
en condiciones estériles utilizando un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por medio
de cromatografía de intercambio iónico y reacción poscolumna con
detección por ninhidrina.
La Tabla 1 muestra el resultado del
experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Mapa del plásmido pTrc99AyibD que
contiene el ORF yibD
Las longitudes indicadas deben entenderse como
aproximadas. Las abreviaturas y símbolos utilizados se definen como
sigue:
- \bullet bla:
- gen codificante de resistencia a ampicilina
- \bullet lac Iq:
- gen para la proteína represora del promotor trc
- \bullet trc:
- región promotora trc, inducible por IPTG
- \bullet yibD:
- región codificante del gen yibD
- \bullet 5S:
- región de rRNA 5S
- \bullet rrnBT:
- región del terminador rRNA
\vskip1.000000\baselineskip
Las abreviaturas para las enzimas de restricción
se definen como sigue:
- \bullet PvuI:
- endonucleasa de restricción de Proteus vulgaris
<110> Deguasa AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso de fermentación para la
preparación de L-aminoácidos utilizando cepas de la
familia Enterobacteriáceas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 030375 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> yibD-ex1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> yibD-ex2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1114
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Producto PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1114)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Producto PCR de yibD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (45)..(1079)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región codificante de yibD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador fijación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
yibD-ex1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador fijación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1083)..(1114)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
yibD-ex2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 344
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ART
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1035
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella typhimurium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1035)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> yibD-Orf
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 344
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella typhimurium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (63)
1. Proceso para la preparación de
L-aminoácidos seleccionados del grupo constituido
por L-treonina, L-valina,
L-lisina y L-homoserina por la
fermentación de microorganismos recombinantes de la familia
Enterobacteriáceas, en donde
- a)
- los microorganismos que producen el L-aminoácido deseado, en los cuales el marco de lectura abierto yibD está sobreexpresado, se cultivan en un medio en condiciones en las cuales el L-aminoácido deseado se enriquece en el medio o en las células, y
- b)
- el L-aminoácido deseado se aísla, quedando los constituyentes del caldo de fermentación, y/o la totalidad o una parte (\geq 0 a 100%) de la biomasa, en el producto aislado o eliminándose completamente,
en donde el marco de lectura
abierto yibD codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos
es al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo que comprende SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 6 y
que tiene la actividad de una glicosiltransferasa
supuesta.
2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde los microorganismos contienen un polinucleótido
sobreexpresado correspondiente al marco de lectura abierto yibD y
seleccionado del grupo:
- a)
- polinucleótido con la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5;
- b)
- polinucleótido con una secuencia de nucleótidos correspondiente a SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5 dentro de la degeneración del código genético;
- c)
- polinucleótido con una secuencia que se híbrida en condiciones severas con la secuencia complementaria a la secuencia SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5;
- d)
- polinucleótido con una secuencia SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5 que contiene mutantes sentido neutros.
3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que es
al menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que
comprende SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 6.
4. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos que es
100% idéntica a la de SEQ ID No. 4 o SEQ ID No. 6.
5. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1
a 4, en donde los microorganismos se producen por transformación,
transducción o conjugación, o una conjugación de estos métodos, con
un vector que contiene el marco de lectura abierto yibD, y/o un
promotor.
6. Proceso de acuerdo con la reivindicación 5 en
el cual el número de copias del marco de lectura abierto yibD se
incrementa al menos en 1.
7. Proceso de acuerdo con la reivindicación 6,
en donde el aumento en el número de copias del marco de lectura
abierto yibD de al menos 1 se consigue por integración del marco de
lectura abierto en el cromosoma de los microorganismos.
8. Proceso de acuerdo con la reivindicación 6,
en donde el aumento en el número de copias del marco de lectura
abierto yibD de al menos 1 se consigue por un vector de replicación
extracromosómico.
9. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde la sobreexpresión se realiza por
- a)
- mutación del promotor y la región reguladora o el sitio de fijación de ribosoma aguas arriba del marco de lectura abierto yibD, o
- b)
- incorporación de casetes de expresión o promotores aguas arriba del ORF yibD.
10. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde el marco de lectura abierto yibD se halla bajo el control
de un promotor que intensifica la expresión del gen.
11. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones
1 a 10, en donde la sobreexpresión del marco de lectura abierto
yibD aumenta la concentración del producto del gen yibD al menos en
un 10%, basado en la concentración del producto génico en el
microorganismo o cepa parental que no es recombinante para el marco
de lectura abierto yibD.
12. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones
1 a 11, en donde los microorganismos se seleccionan de los géneros
Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia.
13. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones
1 a 12, en donde, para preparar L-treonina, se
fermentan microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en los
cuales adicionalmente uno o más genes seleccionados del grupo que
comprende:
- 13.1
- al menos un gen del operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa,
- 13.2
- el gen pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica piruvato-carboxilasa,
- 13.3
- el gen pps que codifica fosfoenol-piruvato-sintasa,
- 13.4
- el ppc gen que codifica fosfoenolpiruvato carboxilasa,
- 13.5
- los genes pntA y pntB que codifican las subunidades de transhidrogenasa,
- 13.6
- el gen rhtB que codifica la proteína que confiere resistencia a homoserina,
- 13.7
- el gen rhtC que codifica la proteína que confiere resistencia a treonina,
- 13.8
- el thrE gen de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína portadora de la exportación de treonina,
- 13.9
- el gdhA gen que codifica glutamato-deshidrogenasa,
- 13.10
- el gen pgm que codifica fosfoglucomutasa,
- 13.11
- el gen fba que codifica fructosa-bisfosfato-aldolasa,
- 13.12
- el gen ptsH del operón ptsHlcrr que codifica fosfohistidina-protein-hexosa-fosfotransferasa del sistema de fosfotransferasa PTS,
- 13.13
- el gen ptsl del operón ptsHlcrr que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa PTS,
- 13.14
- el gen crr del operón ptsHlcrr que codifica el componente IIA específico de glucosa del sistema de fosfotransferasa PTS,
- 13.15
- el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico de glucosa,
- 13.16
- el gen lrp que codifica el regulador del regulón leucina,
- 13.17
- el gen fadR que codifica el regulador del regulón fad,
- 13.18
- el gen iclR que codifica el regulador del metabolismo central intermedio,
- 13.19
- el gen ahpC del operón ahpCF que codifica la subunidad pequeña de alquil-hidroperóxido-reductasa,
- 13.20
- el gen ahpF del operón ahpCF que codifica la subunidad grande de alquil-hidroperóxido-reductasa,
- 13.21
- el gen cysK que codifica cisteína-sintasa A,
- 13.22
- el gen cysB que codifica el regulador del regulón cys,
- 13.23
- el gen cysJ del operón cysJIH que codifica la flavoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa,
- 13.24
- el gen cysI del operón cysJIH que codifica la hemoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa,
- 13.25
- el gen cysH del operón cysJIH que codifica adenilil-sulfato-reductasa,
- 13.26
- el gen rseA del operón rseABC que codifica una proteína de membrana con actividad anti-sigmaE,
- 13.27
- el gen rseC del operón rseABC que codifica un regulador global del factor sigmaE,
- 13.28
- el gen sucA del operón sucABCD que codifica la subunidad descarboxilasa de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa,
- 13.29
- el gen sucB del operón sucABCD que codifica la subunidad dihidrolipoil-transsuccinasa E2 de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa,
- 13.30
- el gen sucC del operón sucABCD que codifica la subunidad \beta de succinil-CoA-sintetasa,
- 13.31
- el gen sucD del operón sucACBD codifica la subunidad \alpha de succinil-CoA-sintetasa,
- 13.32
- el gen aceE que codifica el componente El del complejo piruvato-deshidrogenasa,
- 13.33
- el gen aceF que codifica el componente E2 del complejo piruvato-deshidrogenasa,
- 13.34
- el gen rseB que codifica el regulador de la actividad del factor sigmaE,
- 13.35
- el producto génico del marco de lectura abierto yodA de Escherichia coli,
- 13.36
- el producto génico del marco de lectura abierto yaaU de Escherichia coli,
- 13.37
- el gen malT para el activador positivo de la transcripción del regulón maltosa, y
- 13.38
- el gen eno que codifica enolasa
Se sobreexpresan simultáneamente.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones
1 a 13, caracterizado porque, para preparar
L-treonina, se fermentan microorganismos de la
familia Enterobacteriáceas en los cuales adicionalmente uno o más
genes seleccionados del grupo que comprende:
- 14.1
- el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa,
- 14.2
- el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa,
- 14.3
- el producto génico del marco de lectura abierto yjfA de Escherichia coli,
- 14.4
- el producto génico del marco de lectura abierto ytfP de Escherichia coli,
- 14.5
- el gen pckA que codifica la enzima fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa,
- 14.6
- el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa,
- 14.7
- el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa,
- 14.8
- el gen fruR que codifica el represor fructosa,
- 14.9
- el gen rpoS que codifica el factor sigma^{38}, y
- 14.10
- el gen aspA que codifica aspartato-amonio-liasa, se desactivan simultáneamente, o se reduce la expresión de los mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Microorganismos recombinantes de la familia
Enterobacteriáceas que contienen un marco de lectura abierto yibD
sobreexpresado, en donde el marco de lectura abierto yibD codifica
un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 90%
idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que
comprende SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 6, y que tiene la actividad de
una glicosil-transferasa supuesta, y simultáneamente
un gen tdh, que codifica treonina-deshidrogenasa,
que está desactivado o cuya expresión se reduce.
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